ES2271674T3 - Inmunoensayo tipo sandwich para la determinacion de peptidos parciales proanp. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para la determinación en líquidos biológicos de proANP según SEQ ID NO:2 o péptidos parciales formados a partir de él, que no son el ANP C-terminal procedente de los aminoácidos 99-126 del proANP según SEQ ID NO:2, con fines de diagnóstico médico, pronóstico y control del curso acompañante de un tratamiento, mediante un inmunoensayo de tipo sándwich utilizando dos anticuerpos que se fijan específicamente a distintas secuencias parciales del proANP N-terminal según SEQ ID NO:1, caracterizado porque ambos anticuerpos se fijan a secuencias parciales en la zona de la región media del NT- proANP, que se extiende desde el aminoácido 50 hasta el aminoácido 90 del NT- proANP según SEQ ID NO:1.
Description
Inmunoensayo tipo sándwich para la determinación
de péptidos parciales proANP.
La invención se refiere a un procedimiento para
la determinación en líquidos biológicos de proANP o péptidos
parciales formados a partir de él con fines de diagnóstico médico,
pronóstico y control del curso acompañante de un tratamiento,
mediante un inmunoensayo de tipo sándwich (inmunoensayo de dos
caras). Dentro del marco de la presente invención se designan como
"péptidos parciales proANP" en especial el llamado
NT-proANP o proANP (1-98) y
péptidos parciales que contienen una secuencia parcial de la región
media de este NT-proANP. El procedimiento según la
invención se utilizará especialmente en el diagnóstico cardiaco y en
el diagnóstico de la septicemia, utilizándose además el concepto de
"diagnóstico" normalmente como concepto global simplificador
que incluye también pronóstico/diagnóstico precoz y controles del
curso acompañantes del tratamiento.
Se sabe desde hace mucho tiempo que en el marco
de las enfermedades cardiacas, en especial en las distintas fases
de la insuficiencia cardiaca y después de los infartos de miocardio,
la hormona designada como "péptido natriurético atrial" (ANP,
en ocasiones designado también como factor natriurético atrial, ANF)
se segrega en cantidades elevadas que, debido a numerosos efectos
fisiológicos tales como natriuresis, vasodilatación e inhibición de
la secreción de renina y aldosterona, desempeña un papel importante
en la homeostasis de la economía hídrica y la presión sanguínea. Se
considera que el estímulo más importante para la secreción de ANP
en las enfermedades cardiacas es la dilatación de la aurícula.
Se designa normalmente como la auténtica hormona
ANP un péptido (99-126), que comprende 28
aminoácidos, de la sección C-terminal de una
prohormona (pro-ANP; SEQ ID NO: 2) que comprende 128
aminoácidos. En la liberación del ANP desde la prohormona proANP,
junto a una disociación de dos aminoácidos (127/128) de su término
C, se cede a la circulación en cantidad equimolar también el
restante péptido parcial del proANP de mayor tamaño, el proANP
(NT-proANP; proANP (1-98))
N-terminal formado por 98 aminoácidos. Puesto que
este NT-proANP tiene un período de vida útil o
estabilidad claramente superiores al ANP, el
NT-proANF puede utilizarse como parámetro de
laboratorio para el diagnóstico y el control del curso y del
tratamiento en enfermedades cardiacas. Para profundizar se remite a
Lotear Thomas (editor), Labor und Diagnose, 5 edición ampliada,
subcapítulo 2.14 del capítulo 2., Kardiale Diagnostik, páginas
116-118, y la bibliografía allí citada.
Tanto para determinar el ANP mismo como también
para determinar el NT-proANP en líquidos biológicos
(suero, plasma, orina), en el pasado se desarrollaron distintos
inmunoensayos y se utilizaron en la práctica y en la investigación
clínicas. La parte predominante de los inmunoensayos de este tipo
para la determinación de ANP o NT-proANP se basa
en el conocido principio del inmunoensayo competitivo, cuyo
representante más conocido es a su vez el radioinmunoensayo (RIA).
Los inmunoensayos competitivos para la determinación de proANP o ANP
se describen o utilizan, por ejemplo, en las citas bibliográficas
1. a 13. y 22. (RIA) así como 14. y 15. (EIA) de la lista
bibliográfica adjunta.
Sin embargo, los inmunoensayos competitivos del
tipo RIA o EIA pueden tener diversas desventajas que afectan al
manejo práctico y a la precisión de medida, debiéndose enumerar como
desventajas especiales una sensibilidad no óptima, falta de
robustez, una mayor predisposición a reacciones cruzadas y a menudo
también tiempos de medición más largos. Ya que en los inmunoensayos
competitivos para determinar péptidos (que en el inmunoensayo
representan analíticos/reactivos del tipo antígeno) se procede de
tal manera que se trabaja con un anticuerpo (policlonal o
monoclonal) que reconoce específicamente una secuencia parcial del
péptido determinada, que está presente al mismo tiempo en
analíticos y en el inmunorreactivo utilizado como competidor o para
el marcaje, los ensayos competitivos convencionales reconocen como
"inmunorreactividad" sólo la presencia de las correspondientes
secuencias parciales de péptido, sin diferenciar fundamentalmente si
esta secuencia es parte de un péptido más corto o más largo. Sin
embargo, si se utilizan distintos inmunoensayos competitivos de este
tipo con anticuerpos que se fijan a distintas zonas parciales de
una secuencia conocida de un polipéptido más largo, a partir del
paralelismo o de la diferencia de los resultados de medición
obtenidos puede deducirse si con los distintos inmunoensayos
competitivos se midieron los mismos péptidos o si las secuencias de
péptidos reconocidos eran partes de distintas especies de péptidos
moleculares, por ejemplo de productos de degradación. Distintos
productos de degradación pueden ser por un lado el resultado de
diferentes reacciones de degradación concurrentes. Sin embargo,
incluso si se recorre un único caminio de degradación y todos los
productos de ésta proceden del mismo péptido precursor, pueden
observarse diferentes concentraciones de los distintos péptidos
parciales y fragmentos. Si las muestras medidas contienen
concretamente los productos de degradación que se forman a distinta
velocidad o los que presentan diferente estabilidad (duración), para
las diferentes especies se determinan concentraciones distintas,
aun cuando éstas puedan producirse debido a su origen a partir de un
único péptido de manera primaria sólo en cantidades
equimolares.
Al utilizarse en la determinación de
NT-proANP con ayuda de inmunoensayos competitivos
diferentes anticuerpos que reconocían distintas secuencias del
NT-proANP (proANP 1-98; SEQ ID NO:
1), se constató que en líquidos biológicos, en especial sangre o
también orina, aparecen distintos péptidos que corresponden a los
productos de desintegración del NT-proANP (proANP
1-98). Se constató en especial que a partir de
NT-proANP se forman fragmentos de bajo peso
molecular, en especial aquellos a los que, debido a su
inmunorreactividad, se asignan las secuencias de aminoácidos
1-30, 31-67 y 79-98
del proANP (véase por ejemplo las citas bibliográficas 3., 6., 7.,
8., 9., 13., 14., y 15. de la lista bibliográfica adjunta).
Los inmunoensayos competitivos que reconocen
específicamente las citadas secuencias - si no se tienen en cuenta
las influencias de diferentes avideces o eventuales influencias
conformativas - de la misma manera también reconocen siempre el
NT-proANP completo y, por consiguiente, no
diferencian entre éste y sus correspondientes fragmentos.
Los inmunoensayos tipo sándwich (inmunoensayos
de dos caras) no competitivos tienen toda una serie de ventajas
frente a los inmunoensayos competitivos, entre las que se cuentan
que pueden prepararse mejor que los ensayos en fase sólida (ensayos
heterogéneos), que pueden ser más robustos en cuanto a
manejabilidad, que pueden proporcionar resultados de medición de
mayor sensibilidad y que también son más adecuados para una
automatización y una medición en serie. Además, en comparación con
los inmunoensayos competitivos que funcionan sólo con un tipo de
anticuerpo, proporcionan también otra información ya que los
inmunoensayos tipo sándwich reconocen sólo aquellas moléculas o
péptidos en los que sobre la misma molécula existen los dos puntos
de enlace para los anticuerpos utilizados para la formación del
sándwich. Si los puntos de enlace se encuentran, por ejemplo, en
péptidos parciales (productos de desintegración, fragmentos)
distintos, el enlace de los anticuerpos a fragmentos de este tipo
no da lugar a una señal de medición típica del "sándwich"
completo.
Debido a las ventajas conocidas de los
inmunoensayos tipo sándwich en general y a la posibilidad de medir
selectivamente sólo el NT-proANP completo, sin que
los productos de desintegración y los fragmentos influyan sobre la
medición, se han descrito también inmunoensayos tipo sándwich para
la determinación de NT-proANP y se han utilizado en
la práctica y la investigación clínicas. Así, en EP 721 105 B1 se
describe un inmunoensayo para la determinación de proANP, y en
concreto especialmente en el marco del diagnóstico de enfermedades
cardiacas y de las insuficiencias renales crónicas en la que se
utilizan dos anticuerpos monoclonales, de los cuales uno se fija a
los aminoácidos 1-25 del proANP (véase EP 350 218
B1) y el otro a los aminoácidos 43-66 del proANP.
Con un inmunoensayo sándwich de este tipo se registran sólo los
péptidos parciales proANP o junto a
proANP(1-98) que contengan los 25 primeros
aminoácidos de la secuencia proANP.
Otro inmunoensayo tipo sándwich similar a este
respecto se describe en la memoria (Stridsberg) señalada como No.
18 en la bibliografía adjunta. También este inmunoensayo tipo
sándwich funciona con dos anticuerpos monoclonales, de los cuales
uno se fija a los aminoácidos 1-30 del proANP
mientras que el otro se fija a los aminoácidos
79-98. Debido a la elección de los puntos de enlace
en los extremos del proANP (1-98), se parte de que
con este inmunoensayo tipo sándwich sólo se registra el proANP
intecto (1-98).
En WO 00/19207 se describe además un
procedimiento para la determinación del proANP 1-98
en el que se trabaja con dos de tres anticuerpos policlonales, que
se fijan a las secuencias de aminoácidos 8-27,
31-64 y 79-98 de la secuencia del
proANP (1-98). El ensayo ofrecido comercialmente por
el solicitante de WO 00/19207 para la determinación de proANP
(1-98) es un inmunoensayo en el que se tratan un par
de anticuerpos policlonales de oveja depurados por afinidad, de los
cuales el anticuerpo usado inmovilizado reconoce los aminoácidos
10-19 del proANP, mientras que para la detección se
utiliza un segundo anticuerpo policlonal que reconoce los
aminoácidos (85-90) (véase las instrucciones de
trabajo sobre el ensayo tipo sándwich proANP (1-98)
de la empresa BIOMEDICA; A-1210 Wien). Por lo
tanto, también este ensayo sólo registra aquellas especies de
péptidos que contienen las secciones finales del proANP completo
(1-98), es decir, el NT-proANP
completo.
Todos los ensayos competitivos o que funcionan
por el principio del sándwich según el estado actual de la técnica
se desarrollaron esencialmente como ensayos destinados al
diagnóstico cardiaco o utilizados en el marco del diagnóstico
cardiaco, citándose como una posibilidad de utilización diagnóstica
adicional también la insuficiencia renal crónica (véase EP 721 105
B1 y la cita bibliográfica 29 de la lista de bibliografía
adjunta).
En WO 00/22439 del solicitante se describe por
primera vez que también en los sueros o plasmas de pacientes de
septicemia aparecen concentraciones significativamente elevadas.
Para la determinación de proANP en el marco de los ensayos
orientativos descritos se utilizó un kit RIA que puede adquirirse en
el mercado, en el que según el principio de medición competitivo se
determinó la fijación a un anticuerpo que reconocía los aminoácidos
26-55 del llamado preproANP, que con respecto al
proANP está prolongado en el extremo N en un péptido señal de 25
aminoácidos.
La(s) especie(s) de péptido(s) detectada(s) en las determinaciones descritas en WO 00/22439 no se caracterizó(zaron) con más detalles. No se analizó en especial si la especie reconocida era un péptido parcial más corto del extremo N del proANP o si era el NT-proANP completo, o si bien, en analogía a la aparición observada más veces en la septicemia de la procalcitonina no detectable en la circulación de las personas sanas, se midió una especie más larga que comprendía todo el proANP (1-128) o como mínimo partes esenciales del mismo.
La(s) especie(s) de péptido(s) detectada(s) en las determinaciones descritas en WO 00/22439 no se caracterizó(zaron) con más detalles. No se analizó en especial si la especie reconocida era un péptido parcial más corto del extremo N del proANP o si era el NT-proANP completo, o si bien, en analogía a la aparición observada más veces en la septicemia de la procalcitonina no detectable en la circulación de las personas sanas, se midió una especie más larga que comprendía todo el proANP (1-128) o como mínimo partes esenciales del mismo.
A partir de los estudios sobre la aparición de
la procalcitonina establecida entretanto como marcador de la
septicemia y de la inflamación (véanse EP 656 121 B1 ó US 5 639 615
o por ejemplo un trabajo de revisión de anteriores conocimientos de
W. Karzai et al. en Infection, Vol. 25 (1997), pág.
329-334; DE 101 19 804 A1 y una serie de otras
solicitudes de patente del solicitante acerca del tema del
diagnóstico de la septicemia y no publicadas todavía en el momento
de la solicitud de la presente invención) se sabe que en la
septicemia, que puede considerarse como infección sistémica o
proceso inflamatorio sistémico, se producen de forma muy modificada
muchos procesos fisiológicos, especialmente también numerosas
actividades enzimáticas, y que en la septicemia pueden encontrarse
en la circulación numerosas biomoléculas que no son detectables en
las personas sanas y que tampoco se forman en el marco de otros
sucesos patológicos, o no en esta forma. Así, por ejemplo, la
procalcitonina es normalmente un antecesor de la hormona calcitonina
que no llega a la circulación. Sin embargo, en el caso de la
septicemia se constatan concentraciones de procalcitonina muy
elevadas en suero y plasma, sin que al mismo tiempo puedan
observarse también aumentos en la concentración de calcitonina.
Frente al fondo de los conocimientos de este tipo, cuando en la
septicemia los procedimientos de detección responden a
biomarcadores que son ya conocidos en sí a partir de otros
contextos, se brindan interpretaciones de analogía rápidas de los
hallazgos del laboratorio médico. Hay que contar siempre con que en
la septicemia siempre llegan a la circulación otras especies y que
se activan otros mecanismos de desintegración proteolítica a como en
los casos de otras enfermedades, en especial las no infecciosas y
no
inflamatorias.
inflamatorias.
Recientemente se ha publicado otros trabajos que
confirman la detección de proANP en la septicemia (véase las citas
biblográficas 24. y 25. de la lista adjunta de bibliografía). La
aparición de proANP se interpreta fundamentalmente como una
consecuencia de la actividad cardiocirculatoria, alterada en la
septicemia. Sin embargo, resulta interesante el hecho de que en
otros trabajos más recientes (véanse las citas 26. a 28. de la
lista adjunta de bibliografía) se informa de que la hormona ANP
parece ejercer también funciones importantes en el sistema
inmunológico y que la ANP se encarga de funciones reguladoras dentro
de la cascada de reacciones de un suceso inflamatorio.
Para poder analizar con mayor profundidad la
relevancia clínica del aumento de las concentraciones de proANP y
NT-proANP en la septicemia basándose en datos de
medición más fiables, el solicitante consideró deseable disponer de
un procedimiento de detección inmunodiagnóstico que no esté lastrado
con las desventajas conocidas de los procedimientos de detección
competitivos, y que dependa menos que los inmunoensayos tipo
sándwich conocidos de que la especie detectada en el líquido
corporal de los pacientes sea el NT-proANP completo
o presente el extremo N completo del NT-proANP.
Por consiguiente, el solicitante decidió crear
un nuevo inmunoensayo tipo sándwich para determinar el proANP o
péptidos parciales derivados de él que, a diferencia de los
inmunoensayos de este tipo conocidos hasta la fecha, no trabaje con
anticuerpos que reconozcan los extremos del NTproANF sino con
anticuerpos que fijen ambos en una zona del
NT-proANP de la región media. Sorprendentemente, el
inmunoensayo de tipo sándwich obtenido no sólo resultó claramente
más sensible que los inmunoensayos de tipo sándwich comerciales
conocidos previamente en lo que respecta a la determinación del
proANP dentro del marco del diagnóstico de la septicemia, sin que
también en el campo del diagnóstico cardiaco mostró una clara mejora
de la sensibilidad. En la presente solicitud, tal como es habitual,
la sensibilidad se define de tal manera que con una sensibilidad del
100% se reconocen en una determinación correctamente como positivos
a todos los pacientes; la definición de especificidad equivale a
que para una especificidad del 100% todas las personas sanas se
reconocen correctamente como negativas o que ninguna persona sana
es reconocida erróneamente como positiva.
El objetivo de la presente invención es por
consiguiente, según la reivindicación 1, un procedimiento para la
determinación de proANP o de péptidos parciales formados a partir de
él, que no son el ANP C-terminal, en líquidos
biológicos con fines de diagnóstico médico, pronóstico y control del
curso acompañado de tratamiento por medio de un inmunoensayo de
tipo sándwich (inmunoensayo de dos caras) utilizando dos anticuerpos
que se fijan específicamente en secuencias parciales distintas del
NT-proANP, caracterizado porque los dos anticuerpos
se fijan en secuencias parciales en la zona de la región media del
NT-proANP que se extiende desde aproximadamente el
aminoácido 50 hasta el aminoácido 90, es especial desde el
aminoácido 53 al 83 del NT-proANP.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monoclonales y/o policlonales, aunque son preferentemente
anticuerpos policlonales depurados por afinidad.
Uno de los anticuerpos se obtiene de manera
especialmente preferente mediante inmunización de un animal, en
especial una oveja, con un antígeno que contiene una secuencia de
péptidos sintéticos que presenta los aminoácidos
53-72 del proANP así como un resto adicional de
cisteína en el extremo N, y el otro anticuerpo se obtiene de manera
correspondiente con un antígeno que contiene una secuencia de
péptidos sintética que presenta los aminoácios
73-90 ó 73-83 del proANP con un
resto adicional de cisteína en el extremo N. De este modo,
utilizando los citados péptidos sintéticos, que representan
conjuntamente una sección sin huecos de la región media de la
secuencia de proANP, los anticuerpos obtenidos reconocen sólo
lugares de fijación en la zona de los aminoácidos
53-83 del NT-proANP y en forma de
anticuerpos policlonales pueden registrar completa la zona
citada.
En una forma de realización preferida se lleva a
cabo el procedimiento como inmunoensayo de tipo sándwich
heterogéneo, en el que uno de los anticuerpos se inmoviliza en una
fase sólida cualquiera, por ejemplo las paredes de tubos de ensayo
revestidos (por ejemplo de poliestirol; "Coated Tubes"; CT) o
en placas de microtitulación, por ejemplo de poliestirol, o en
partículas, por ejemplo partículas imantadas, mientras que el otro
anticuerpo lleva un resto que constituye una etiqueta directamente
detectable o que permite una unión selectiva a una etiqueta y que
sirve para detectar las estructuras de tipo sándwich formadas.
También es posible una inmovilización retrasada temporalmente o
posterior utilizando fases sólidas adecuadas.
Pueden utilizarse fundamentalmente todas las
técnicas de marcaje utilizables en los ensayos del tipo descrito,
entre las que se cuentan marcajes con radioisótopos, enzimas,
etiquetas de fluorescencia, quimioluminiscencia o bioluminiscencia
y marcajes de color detectables ópticamente de manera directa, como
por ejemplo átomos de oro y partículas de colorante, tal como se
utilizan en especial para los llamados
Point-of-Care (POC) o test rápidos.
En el caso de inmunoensayos tipo sándwich heterogéneos los dos
anticuerpos pueden ser partes de un sistema de detección del tipo
descrito a continuación en relación con ensayos homogéneos.
Por lo tanto, dentro del marco de la presente
invención está configurar el procedimiento según la invención
también como test rápido.
El procedimiento según la invención puede
configurarse, además, como procedimiento homogéneo en el que los
complejos tipo sándwich formados a partir de los dos anticuerpos y
el proANP o péptido parcial de proANP que deben detectarse
permanecen suspendidos en la fase líquida. En un caso de este tipo
es preferible que ambos anticuerpos estén marcados con partes de un
sistema de detección que después, cuando ambos anticuerpos se
integran en un único sándwich, permite generar o desencadenar una
señal. Las técnicas de este tipo pueden configurarse especialmente
como procedimientos de detección por refuerzo o atenuación de la
fluorescencia. Un procedimiento de este tipo especialmente
preferido afecta a la utilización de reactivos de detección que
deben utilizarse por pares, tal como se describen por ejemplo en
US-A-4 822 733,
EP-B1-180 492 ó
EP-B1-539 477 y el estado actual de
la técnica allí citado. Permiten una medición que registra
selectivamente sólo productos de reacción que contienen ambos
componentes de marcaje en un único inmunocomplejo. Como ejemplo se
remite a la tecnología que se ofrece bajo las marcas TRACE® (Time
Resolved Cryptate Emission) o KRYPTOR® que ponen en práctica las
teorías de las solicitudes anteriormente citadas.
Se constató sorprendentemente que según la
invención utilizando los dos anticuerpos, en especial dos
anticuerpos policlonales depurados mediante afinidad, que se fijan
los dos en la zona de la región media, es decir, en la zona de los
aminoácidos desde aproximadamente 50 hasta 90, en especial
53-83, de la secuencia del
NT-proANP, se obtiene un ensayo con una
sensibilidad claramente mejorada frente a los ensayos de tipo
sándwich que se obtienen comercialmente. Tal como se indica a
continuación, esta afirmación no rige sólo para el diagnóstico de
la septicemia, sino también en el campo del diagnóstico
cardiaco.
Especialmente el último hallazgo es sorprendente
ya que se sabía de numerosas publicaciones que en la posterior
desintegración proteolítica del NT-proANP, junto a
un péptido parcial correspondiente a los aminoácidos
1-30 del NT-proANP, se forman
también otros dos péptidos parciales que se corresponden a los
aminoácidos 31-67 y 79-98. Los
anticuerpos utilizados en el marco del procedimiento según la
invención se fijan, por lo tanto, a varios de los productos de
desintegración del NT-proANP conocidos.
De ningún modo era de esperar que podría
conseguirse con los anticuerpos que hay que utilizar según la
invención una mejora frente a otros procedimientos tipo sándwich
con anticuerpos que se fijan a los extremos del
NT-proANP (proANP 1-98). No se han
descrito en la bibliografía péptidos parciales del
NT-proANP que contengan los dos puntos de enlace
para los anticuerpos según la invención, pero que no presentan el
extremo N utilizado para la fijación en todos los inmunoensayos de
tipo sándwich conocidos. Queda sin respuesta que los valores de la
sensibilidad del análisis claramente mejores obtenidos según la
presente invención deban atribuirse a la desintegración del
NT-proANP según un programa no descrito hasta ahora,
o que los puntos de enlace elegidos sean más accesibles y/o
permitan un enlace más firme y selectivo o un marcaje múltiple
reproducible y/o que se influyan en el mantenimiento de la
desintegración de la muestra. La interpretación de la mejora de los
resultados de medición demostrada experimentalmente de manera clara
no es parte de la presente invención.
Se parte de que el procedimiento de
determinación según la invención puede realizarse de manera
especialmente ventajosa también en el marco de un denominado
diagnóstico multiparámetros, y en concreto tanto en el campo del
diagnóstico cardiaco como también en el diagnóstico de la
septicemia. Otros parámetros determinados son, por ejemplo, el
parámetro cardiaco BNP o proBNP o el parámetro de la septicemia, que
se eligen del grupo formado por anticuerpos antigangliósidos, las
proteínas procalcitonina, CA 125, CA 19-9, S100B,
proteínas S100A, LASP-1, fragmentos solubles de
citoqueratina, en especial CYFRA 21, TPS y/o fragmentos solubles de
citoqueratina-1 (sCY1F), los péptidos inflamina y
CHP, otras prohormonas peptídicas, la
glicina-N-aciltransferasa (GNAT),
la carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1) y la proteína
C-reactiva (CRP) o fragmentos de ella. En las
determinaciones multiparámetros citadas está previsto determinar
simultánea o paralelamente los resultados de medición para varios
parámetros y evaluarlos, por ejemplo, con ayuda de un programa de
ordenador que utilice también correlaciones de parámetros
diagnósticamente significativas.
A continuación se explicará con más detalle la
invención mediante una descripción de la fabricación de los
componentes del ensayo, la realización de una forma de realización
preferida del ensayo y los resultados obtenidos, utilizando el
ensayo según la invención, de las determinaciones de proANP en
plasmas EDTA de personas de control y pacientes cardiacos y
septicémicos.
Se toman como referencia las figuras, que
muestran:
Fig. 1 la determinación de proANP en un
colectivo de control de personas sanas, un colectivo de pacientes
septicémicos y un colectivo de paciente de angina de pecho con ayuda
del ensayo proANP según la invención;
Fig. 2 resultados de medición equivalentes
para las mismas muestras que en la Figura 1, tal como se obtuvieron
con un ensayo tipo sándwich proANP que se puede adquirir
comercialmente, en el que se utilizan dos anticuerpos que se fijan
a los aminoácidos 10-19 ó 85-90 del
proANP;
Fig. 3 las llamadas curvas ROC (Receiver
Operating Characteristic Plots) que muestran, comparándolas, las
sensibilidades y especificidades de las determinación de proANP
según las Figuras 1 y 2. La representación permite una comparación
del valor de las determinaciones con los ensayos comparados en la
septicemia. En las curvas ROC, la superficie entre la curva en
cuestión y una recta que discurre con un ángulo de 45º ("area
under the ROC function", AUC) puede tomarse como magnitud para la
relevancia estadística de una determinación.
Fig. 4 una representación equivalente a la
de la Figura 3 que permite comparar el valor de las determinaciones
con los ensayos comparados en la angina de pecho.
Para obtener los anticuerpos se eligieron
inicialmente dos secciones de la secuencia de aminoácidos conocida
del proANP (SEQ ID NO: 2) o del NT-proANP humano
(SEQ ID NO: 1), que equivalían a las posiciones
53-72 y 73-90 respectivamente.
Debido a los resultados de un mapeo de epitopos más tarde, en la
obtención definitiva de los anticuerpos, en lugar de la secuencia
73-90 se utilizó una secuencia 73-83
C-terminal acortada. Todas las secciones,
completadas en un resto de cisteína N-terminal, se
sintetizaron químicamente como péptidos solubles según
procedimientos estándar, se depuraron, se controló su calidad
mediante espectrometría de masas y Reversed Phase HPLC y se
liofilizaron en alícuotas (los trabajos los realizó, por encargo del
solicitante, la empresa JERINI AG, Berlín, Alemania). Las
secuencias de aminoácidos de los péptidos sintéticos son las
siguientes:
Péptido "MPCL21" (posiciones
53-72; SEQ ID NO: 3):
- CPEVPPWTGEVSPAQRDGGAL
Péptido "SPCL19" (posiciones
73-90; SEQ ID NO: 4):
- CGRGPWDSSDRSALLKSKL
Péptido "SPCL12" (posiciones
73-83; SEQ ID NO: 5):
- CGRGPWDSSDRS
Con fines de inmunización se conjugaron los
péptidos MPCL21 y SPCL19 mediante MBS
(m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
éster) en la proteína portadora KLH (Keyhole limpet hemocyanin),
siguiéndose las instrucciones de trabajo
"NHS-Esters-Maleimid
Crosslinkers" de la empresa PIERCE, Rockford, IL, USA.
Con los conjugados obtenidos se inmunizaron
ovejas según el siguiente programa: cada oveja recibió inicialmente
100 \mug de conjugado (los datos sobre masas se refieren a la
porción peptídica del conjugado) y a continuación, a intervalos de
4 semanas, otros 50 \mug de conjugado. Comenzando el cuarto mes
después del inicio de la inmunización se extrajeron 700 ml de
sangre a las ovejas a intervalos de 4 semanas y a partir de ella se
obtuvo antisuero mediante centrifugación.
Las conjugaciones, las inmunizaciones y la
obtención de antisueros los realizó, por encargo del solicitante,
la empresa MicroPharm, Carmarthenshire, UK.
En un procedimiento de 1 paso, a partir de los
antisueros obtenidos a partir del cuarto mes después de la
inmunización se prepararon los anticuerpos específicos del
péptido.
Para ello, conforme a las instrucciones de
trabajo del fabricante ("SulfoLink Kit", empresa PIERCE,
Rockford, IL, USA) se acoplaron al gel SulfoLink primero los
péptidos MPCL21 y SPCL19 y después, en lugar del último
aproximadamente el péptido SPCL12, más corto. Para el acoplamiento
se utilizaron 5 mg de péptido por cada 5 ml de gel.
La depuración por afinidad de los anticuerpos
específicos contra los dos péptidos MPCL21 y SPCL19 ó SPCL12
procedentes de los antisueros de oveja, se realizó de la siguiente
manera:
Se pusieron los geles SulfoLink correspondientes
en columnas separadoras. Las columnas de péptidos obtenidas se
lavaron primero 3 veces de manera alternante en 10 ml cada vez de
tampón de elución (50 mM ácido cítrico, pH 2,2) y tampón de
fijación (100 mM fosfato sódico, 0,1% Tween, pH 6,8). 100 ml de los
antisueros se filtraron a través de filtros de 0,2 \mum y se
mezclaron con el correspondiente gel acoplado a los péptidos, que
para este fin se enjuagaron cuantitativamente con 10 ml de tampón
de fijación procedente de la columna en la que se había lavado. La
incubación del gel acoplado al péptido con los antisueros se realizó
durante la noche a temperatura ambiente en matraces giratorios. Las
preparaciones se transfirieron después cuantitativamente a columnas
vacías (NAP 25, Pharmacia, vacias). El material sobrante se eliminó.
A continuación se lavó con 250 ml de tampón de fijación (véase
anteriormente) hasta dejarlo libre de proteínas (el contenido en
proteínas del eluado de lavado mostró una absorción de 280 nm de
menos de 0,02). A las columnas lavadas se les añadió después tampón
de elución y el eluado se recogió en fracciones de 1 ml. De cada
fracción se determinó el contenido en proteínas mediante el método
BCA (Bicinchoninic Acid; véase PIERCE Chemical Technical Library,
www.piercenet.com). Se hizo un pool con las fracciones
4-7 y al determinar las proteínas de las fracciones
del pool mediante el método BCA se obtuvieron rendimientos de 15,5
mg para el anticuerpo anti-MPCL21 y de 20,7 mg para
el anticuerpo anti-SPCL12.
En un mapeo de epitopos de los anticuerpos
obtenidos del modo descrito se constató que los anticuerpos
depurados por afinidad, que se obtuvieron con el péptido SPCL19,
formaban bandas casi exclusivamente en los epitopos de la zona de
los aminoácidos 78-83, en una sección
correspondiente al péptido SPLC12. Por lo tanto, el péptido SPLC19
fue sustituido por el péptido SPLC12 en la depuración por
afinidad.
Para fabricar un anticuerpo de detección se
modificó según las instrucciones de trabajo el tamponado de 500
\mul del anticuerpo anti-MPCL21 policlonal,
depurado por afinidad tal como se ha descrito, a través de una
columna de filtración en gel (Pharmacia) en 1 ml de tampón de
fosfato potásico 100 mM (pH 8,0). La determinación de la
concentración de proteína de la solución de anticuerpos dio un valor
de 1,5 mg/ml.
Para dotar a estos anticuerpos de un marcaje de
quimioluminiscencia se mezclaron 132 \mul de la solución de
anticuerpos con 10 \mul de
MA70-acridinio-NHS-éster (1 mg/ml;
empresa HOECHST Behring) y se incubaron durante 15 min a
temperatura ambiente. Se mezclaron después con 358 \mul de 1 M
glicina y se incubó durante otros 10 min. A continuación se cambió
según instrucciones de trabajo el tamponado del preparado de marcaje
a través de una columna de filtración en gel NAP 5 (Pharmacia) en 1
ml de medio de paso A (1 mM fosfato potásico, 10% metanol, 0,1%
lubrol, 0,1% azida, pH 6,8) y se liberó así de componentes de bajo
peso molecular. Para separar los últimos restos de componentes de
etiquetas no ligadas a anticuerpos se realizó una HPLC en
hidroxilapatito (columna: Knauer, 10 cm x 8 mm ID, Ser. No. LF230
No. de lote 1250000A, Hydroxyapatite Bio Rad 10 \mum). Se
extendió la muestra y a una velocidad de flujo de 1 ml/min se
cromatografió mediante un gradiente lineal medio de paso A/medio de
paso B. Como medio de paso B se utilizó una solución de 500 mM de
fosfato potásico, 10% metanol, 0,1% lubrol, 0,1% azida, pH 6,8. Con
un fotómetro de flujo se midieron de manera continua las longitudes
de onda de 280 nm y 368 nm. La relación de absorción 368 nm/280 nm
refleja el grado de marcaje del anticuerpo y en el pico fue de
0,16.
Las fracciones conteniendo anticuerpo que se
eluyeron con aproximadamente 40% de medio de paso B, se recogieron
en 3 ml de 100 mM fosfato potásico, 150 mM NaCl, 5% de Bovines Serum
Albumin (BSA), 0,1% azida de sodio, pH 7,4.
Esta solución constituye un concentrado trazador
que se utilizará en las determinaciones descritas a
continuación.
Para fabricar una fase sólida para el
procedimiento de determinación según la invención se revistieron del
siguiente modo tubos de ensayo de poliestirol de 5 ml irradiados
(empresa Greiner), primero con anticuerpos anti-IgG
de oveja procedentes de asno (empresa Scantibodies).
Los anticuerpos se diluyeron en 50 mM fosfato
sódico, pH 6,5, hasta una concentración de 16,7 \mug/ml. Se
pipetearon en cada tubo de ensayo 300 \mul de esta solución. A
continuación se incubaron los tubos de ensayo durante 20 h a 22ºC.
Se aspiró la solución, tas lo cual se llenó cada tubo de ensayo con
4,2 ml de 10 mM fosfato sódico, 2% Karion FP, 0,3% BSA, pH 6,5. Al
cabo de 20 horas se aspiró también esta solución.
El anticuerpo de oveja purificado, que se fijó
al péptido SPCL12, se diluyó en 50 mM fosfato sódico, 50 mM NaCl,
0,1% azida de sodio, 0,05 BSA, pH 7,8 hasta una concentración de 4,3
\mug/ml. Se pipetearon en cada tubo de ensayo 300 \mul de esta
solución. A continuación se incubaron los tubos de ensayo 20 h a
22ºC, tras lo cual se volvió a aspirar la solución. Se llenó
después cada tubo de ensayo con 4,2 ml de 10 mM fosfato sódico, 2%
Karion FP, 0,3% BSA pH 6,5. Después de 20 h se aspiró la solución. A
continuación se secaron los tubos de ensayo en una secadora de
vacío.
Para las determinaciones se utilizó un tampón de
ensayo que presentaba la siguiente composición:
100 mM fosfato sódico, 150 mM NaCl, 5% BSA, 0,1%
IgG de oveja no específico, 0,1% azida de sodio, pH 7,4.
Como material estándar sirvió un extracto de una
cepa de E. coli que exprimió proANP recombinante
(1-128) (In Vivo GmbH, Henningsdorf,
Alemania). Este extracto se diluyó de manera seriada en suero normal
de caballo (empresa SIGMA) para fabricar soluciones estándar. A las
soluciones estándar así fabricadas se les asignaron concentraciones
de ProANP arbitrarias, correspondientes a las diluciones del
material estándar utilizadas.
Como muestras se midieron plasmas EDTA de
personas aparentemente sanas, de pacientes de septicemia y de
pacientes con angina de pecho.
En un primer paso de la determinación se
pipetearon en los tubos de ensayo revestidos 200 \mul de tampón de
ensayo y en determinaciones dobles 20 \mul del estándar o de las
muestras. A continuación se incubó durante la noche a 22ºC con
agitación. Se lavó entonces 4x con 1ml de solución de lavado (0,1%
Tween 20) por tubo cada vez y se dejó escurrir los tubos. Se
pipetearon después en cada tubo de ensayo 200 \mul de una dilución
1:1.000 del anterior concentrado de trazador en tampón de ensayo.
Se incubó 2 h a 22ºC con agitación. Se lavó después 4x con 1 ml de
la anterior solución de lavado por cada tubo de ensayo, se dejó
escurrir los tubos de ensayo y por cada medida a continuación se
midió la quimioluminiscencia ligada a cada tubo de ensayo en un
luminómetro (empresa BERTHOLD, LB952T; reactivos básicos BRAHMS AG).
Utilizando el software MultiCalc (Spline Fit) se leyeron las
concentraciones de proANP de las muestras en la curva estándar.
En la Figura 1 se representan los resultados
obtenidos con el ensayo según la invención para las determinaciones
de proANP en plasmas EDTA de personas sanas (muestras de control),
pacientes de septicemia y pacientes con angina de pecho. Como
"Cut-Offs" sirven dos valores umbral, elegidos
de tal manera que el 100% de todas las personas sanas o el 90% de
todas las personas sanas se registran como negativas (presentan
valores de medición por debajo del valor umbral elegido como
Cut-Off).
Según las instrucciones de trabajo del
fabricante (instrucciones de trabajo para el ensayo tipo sándwich
proANP (1-98) de la empresa BIOMEDICA;
A-1210 Wien), las mismas muestran se midieron además
con un ensayo de tipo sándwich disponible comercialmente. Los
resultados se representan en la Figura 2, estableciéndose los
Cut-Offs de la misma manera que anteriormente.
En la Figura 3 se comparan, utilizando curvas
ROC, los resultados de las determinaciones obtenidos con ambos
ensayos en pacientes septicémicos y en la Figura 4 los resultados en
pacientes cardiacos. En cada caso se orienta según los valores AUC
(véanse las explicaciones en la Figura 3) perceptibles directamente
de manera óptica de las correspondientes curvas ROC, observándose
de inmediato que el procedimiento según la invención proporciona
valores de medición claramente superiores en cuanto a su relevancia
estadística.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Inmunoensayo tipo sandwich para la
determinación de péptidos parciales proANP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 3901 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 10254149.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-11-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Synthetic fragment
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Synthetic fragment
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Pro Glu Val Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val
Ser Pro Ala Gln Arg}
\sac{Asp Gly Gly Ala Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Synthetic fragment
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg
Ser Ala Leu Leu Lys}
\sac{Ser Lys Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Synthetic fragment
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg
Ser}
Claims (13)
1. Procedimiento in vitro para
la determinación en líquidos biológicos de proANP según SEQ ID NO:
2 o péptidos parciales formados a partir de él, que no son el ANP
C-terminal procedente de los aminoácidos
99-126 del proANP según SEQ ID NO: 2, con fines de
diagnóstico médico, pronóstico y control del curso acompañante de
un tratamiento, mediante un inmunoensayo de tipo sándwich utilizando
dos anticuerpos que se fijan específicamente a distintas secuencias
parciales del proANP N-terminal según SEQ ID NO: 1,
caracterizado porque ambos anticuerpos se fijan a secuencias
parciales en la zona de la región media del
NT-proANP, que se extiende desde el aminoácido 50
hasta el aminoácido 90 del NT-proANP según SEQ ID
NO: 1.
2. Procedimiento según la
reivindicación 1, caracterizado porque ambos anticuerpos se
fijan a secuencias parciales en una zona de la región media del
NT-proANP, que se extiende desde el aminoácido 53
hasta el aminoácido 83 del NT-proANP.
3. Procedimiento según las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los anticuerpos
son anticuerpos monoclonales y/o policlonales.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque ambos
anticuerpos son anticuerpos policlonales depurados por
afinidad.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque uno de los
anticuerpos se obtiene mediante inmunización de un animal con un
antígeno que contiene una secuencia de péptidos sintética, que
comprende los aminoácidos 53-72 según SEQ ID NO: 3
del proANP, y el otro anticuerpo se obtiene mediante inmunización
con un antígeno que contiene una secuencia de péptidos sintética,
que comprende los aminoácidos 73-90 según SEQ ID
NO: 4.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque uno de los
anticuerpos está marcado y el otro anticuerpo está fijo a una fase
sólida o puede estar fijo selectivamente a una fase sólida.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque tanto el primero
como el segundo de los anticuerpos están presentes dispersos en la
mezcla de reacción líquida y porque al primer anticuerpo hay fijado
un primer componente de marcaje, que es parte de un sistema de
marcaje basado en la amortiguación o la intensificación de la
fluorescencia o la quimioluminiscencia y porque el segundo
componente de marcaje está unido al segundo anticuerpo, de tal
manera que después de la fijación de ambos anticuerpos al proANP
que hay que detectar se genera una señal medible que permite una
detección del complejo tipo sándwich formado en la solución de
medida.
8. Procedimiento según la
reivindicación 7, caracterizado porque el sistema de marcaje
comprende quelatos o criptatos de tierras raras combinados con un
colorante de fluorescencia o quimioluminiscencia, en especial del
tipo cianina.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se aplica en el
campo del diagnóstico cardiaco.
10. Procedimiento según la
reivindicación 9, caracterizado porque se realiza en el marco
de una determinación multiparámetros, en la que se determinan al
mismo tiempo otros parámetros relevantes para el diagnóstico
cardiaco, en especial BNP y proBNP.
11. Procedimiento según una de
las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se aplica
para el diagnóstico, para la determinación del grado de severidad y
el pronóstico, así como para el control del tratamiento que
acompaña al curso de la septicemia.
12. Procedimiento según la
reivindicación 11, caracterizado porque se realiza en el
marco de una determinación multiparámetros en la que se determina
al mismo tiempo como mínimo otro parámetro, relevante para el
diagnóstico de la septicemia.
13. Procedimiento según la
reivindicación 12, caracterizado porque el o los
otro(s) parámetro(s) relevante(s) para el
diagnóstico de la septicemia se eligen del grupo formado por
anticuerpos antigangliósidos, las proteínas procalcitonina, CA 125,
CA 19-9, S100B, proteínas S100A,
LASP-1, fragmentos solubles de citoqueratina, en
especial CYFRA 21, TPS y/o fragmentos solubles de
citoqueratina-1 (sCY1F), los péptidos inflamina y
CHP, otras prohormonas peptídicas, la
glicina-N-aciltransferasa (GNAT), la
carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1) y la proteína
C-reactiva (CRP) o fragmentos de ella.
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