ES2238323T3 - Inmunoensayo de impurezas que contienen peptido c en insulina humana recombinante. - Google Patents
Inmunoensayo de impurezas que contienen peptido c en insulina humana recombinante.Info
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Abstract
Un procedimiento para detectar o determinar una impureza que contiene péptido C en una muestra de insulina humana producida de manera recombinante o un derivado suyo, por un ensayo no radiactivo, que comprende las etapas: (a) preparar una muestra de insulina humana producida de manera recombinante o un derivado suyo; (b) mezclar las muestras con tampón de dilución; (c) añadir un trazador de péptido C quimioluminiscente para competición con la muestra a la mezcla (b); (d) añadir anticuerpo específico para la impureza que contiene péptido C a la mezcla (c); (e) añadir bolas de poliestirol revestidas con anticuerpo secundario para capturar anticuerpos anti-péptido C de insulina de cabra, específico para la impureza que contiene péptido C, a la mezcla (d); y (f) detectar o determinar la presencia de la impureza que contiene péptido C, en el que el procedimiento se realiza a un pH de aproximadamente 8, 5 a aproximadamente 9, 0.
Description
Inmunoensayo de impurezas que contienen péptido C
en insulina humana recombinante.
Las insulinas recombinantes se producen por
procesado en dirección descendente de proteínas de fusión
expresadas por E. coli transformado. Después de la reacción
de plegado, los precursores de la insulina que contienen los puentes
disulfuro correctos de la insulina son escindidos de la
preproinsulina por tratamiento con tripsina, que libera el péptido
C por escisión sincrónica en las posiciones secuenciales
-Arg-Arg-(B31-B32) y
-Lis-Arg-(A1-A0). La secuencia de
aminoácidos del péptido C del mono difiere del péptido C humano en
sólo un aminoácido en la posición 37 (Pro contra Leu).
Después del procedimiento de purificación, en el
producto final, insulina humana, se debe analizar la presencia de
cantidades mínimas de prepropinsulina y sus derivados, derivados de
insulina que contienen péptido C, y péptido C aislado (denotados
colectivamente como actividad similar a la del péptido C). En lo
que sigue, la abreviatura "HI" se usa para "insulina
humana", "HIA1" se usa para
"Gli(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-insulina
humana", y "HIA2" se usa para
"Lis(B3),Glu(B29)-insulina
humana", respectivamente. Este análisis se realiza usualmente
por radioinmunoensayo ("RIA").
La desventaja del método RIA es que requiere un
trazador yodado recientemente y un periodo de incubación de 3 días,
con toda la desfavorable logística relacionada. Además, la
preparación de la muestra consume mucho tiempo, es sensible a los
cambios, y medidas previas han mostrado que el ensayo, en algunos
casos, no está libre de interferencias impredecibles por la calidad
del trazador, el manejo de la muestra, y precipitación durante la
incubación de 3 días. La consecuencia es el tiempo perdido, debido
a la necesidad de repeticiones.
Un inconveniente adicional del método RIA es que
no se puede aplicar en muestras de HIA1 ó HI de etapas de
purificación antes de la escisión con carboxipeptidasa B
("CPB") porque estas muestras precipitan al pH dado del método
de ensayo. Incrementar el pH del tampón del ensayo RIA mejora la
disolución de la muestra, pero disminuye el rendimiento del ensayo.
El objeto de la presente invención fue producir anticuerpos que
puedan ser aplicados en un inmunoensayo para cuantificar impurezas
de insulina que contienen péptido C en sondas terminales de
producción de HI (INSUMAN^{TM}), HIA1 (GLARGINE^{TM}), y HIA2,
así como en elementos de proceso de las tres variantes de
insulina.
Los anticuerpos deben mostrar afinidad al péptido
C de mono aislado y a la (pre)proinsulina ("PPI"), pero
también deben ser capaces de unirse a compuestos modelo, tales como
PPI, péptido C de mono y/o humano, HI reducida/alquilada, HI
escindida con endoproteinasa Asp-N en el EDP,
péptido C de HIA2, y PPI HIA2, que están diseñados para reflejar un
grupo de supuestos productos secundarios e impurezas que se pueden
prever en la producción industrial recombinante de insulina.
Se puede usar, en un formato de ensayo adecuado,
una preparación de anticuerpos que cumple los requerimientos
descritos anteriormente para cuantificar la inmunorreactividad
similar a la del péptido C de la insulina en sondas terminales de
purificación de insulina, así como en elementos de proceso
seleccionados.
Debido a las propiedades físicas de los elementos
de ensayo, los anticuerpos usados deben interactuar con los
antígenos con suficiente afinidad a un pH de alrededor de
8,5-9,0. La interacción no debe ser influenciada por
la matriz de la muestra, que se caracteriza por un contenido en
insulina de aproximadamente 1 mg/mL. El inmunoensayo debe ser capaz
de cuantificar impurezas que contienen péptido C
(inmunorreactividad similar a la del péptido C de la insulina) por
debajo de 10 ng/mL (10 ppm, comparado con la insulina humana).
En teoría, se pueden esperar varias impurezas que
contienen péptido C como productos secundarios de la producción de
insulina. Se muestran en la Figura 1A.
Un procedimiento para detectar o determinar una
impureza de péptido C en una muestra de insulina humana producida de
manera recombinante o un derivado suyo, por un ensayo no
radiactivo, que comprende las etapas:
- (a)
- preparar una muestra de insulina humana producida de manera recombinante o un derivado suyo;
- (b)
- mezclar las muestras con tampón de dilución;
- (c)
- añadir un trazador a la mezcla (b);
- (d)
- añadir anticuerpo a la mezcla (c);
- (e)
- añadir "bolas de segundo anticuerpo del péptido C" que tiene al menos un marcador a la mezcla (d); y
- (f)
- detectar o determinar la presencia de una impureza de péptido C.
La Figura 1A representa en diagramas supuestas
impurezas que contienen péptido C.
La Figura 1B proporciona una explicación de los
símbolos de la Figura A.
La Figura 2 representa el perfil de elución para
los calibradores citocromo C (C), aprotinina (A), y vitamina B1 (B)
con péptido Superdex (10/30). El trazador de péptido C se eluye en
un pico simétrico en una posición entre el citocromo C y la
aprotinina (línea gruesa).
La Figura 3 representa las curvas patrón
obtenidas en 6 diferentes ejecuciones de ensayos para detectar e
identificar impurezas de péptido C en preparaciones de insulina
humana semisintética.
La Figura 4B representa el perfil de elución de
una muestra de suero aislada que contiene anticuerpos
anti-péptido C de insulina de mono aplicada a una
columna EMD Fractogel de PPI.
La Figura 5 representa el perfil de elución del
eluato de glicina concentrado que contiene anticuerpos
anti-péptido C de insulina de mono obtenidos a
partir de la columna previa (columna EMD Fractogel de PPI). Este
eluato fue purificado por cromatografía en una columna de exclusión
Superdex 200 (26/60).
La Figura 6 representa el perfil de elución
obtenido de una segunda cromatografía de filtración en gel de las
fracciones 17-24 obtenidas de la columna de
exclusión Superdex 200 (26/60). Para conseguir una pureza más alta
se usó la misma columna.
La Figura 7 representa un gel SDS que analiza la
susceptibilidad de HI reducida/alquilada a la escisión con
endoproteinasa Asp-N. Las muestras contenían DTE
para reducir cualesquiera puentes disulfuro.
La Figura 8 representa el análisis de los
antígenos control PPI HI, péptido C humano, péptido C de mono, y
PPI reducida/alquilada usando el procedimiento de ensayo de bolas
revestidas de la presente invención. La preparación 99Ser9 sirvió
como antisuero.
La Figura 9 representa el análisis de los
antígenos control péptido C de mono, PPI de HI escindida con
endoproteinasa Asp-N, PPI de HIA2, y péptido C de
HIA2 usando el procedimiento de ensayo de bolas revestidas de la
presente invención. La preparación 99Ser9 sirvió como
antisuero.
La presente solicitud describe un nuevo
inmunoensayo no radiactivo que evita las desventajas del RIA
original descritas anteriormente. El nuevo ensayo se basa en:
- 1.
- Anticuerpos de oveja S95-11purificados por afinidad en PPI.
- 2.
- Un procedimiento simplificado de dilución de muestras en dos etapas sin control del pH ni ajuste del pH después de la disolución de muestras en cada muestra.
- 3.
- Un trazador de péptido C quimioluminiscente, que es estable durante largo tiempo, con lo que el ensayo se puede realizar con el idéntico trazador durante un largo periodo de tiempo.
- 4.
- Bolas de poliestirol revestidas con anticuerpos secundarios (Daiichi Radioisotope Labs. LTD) para capturar anticuerpos anti-péptido C de insulina de cabra con o sin antígenos unidos o trazador.
- 5.
- Una incubación simultánea en una sola etapa de todos los componentes, de sólo 5 horas de duración.
Dado que el ensayo se realza a un pH =
8,5-8,7, tanto los elementos de ensayo HI como HIA1
permanecen disueltos durante todo el periodo de incubación, y
pueden ser analizados usando el mismo ensayo sin ninguna
variación.
Dado que el péptido C de insulina recombinante HI
y HIA1 se toma de proinsulina de mono, se necesita un ensayo
adecuado que detecte péptido C de insulina de mono, para
cuantificar la inmunorreactividad similar a la del péptido C de la
insulina en sondas terminales de insulina recombinante HMR y en
elementos de proceso.
El péptido C de HIA2 está mutado y truncado en la
región C-terminal cuando se compara con el péptido C
de insulina humana, por lo que es un péptido artificial y no
aparece en la naturaleza.
Hay algunos inmunoensayos diagnósticos
disponibles comercialmente que se pueden aplicar para determinar la
concentración de péptido C insulínico en el suero. Todos los
ensayos muestran especificidad de especie al péptido C de la
insulina humana, algunos al de la rata, bovinos, y porcinos, pero
ninguno al péptido C de mono.
El propósito de los ensayos disponibles
comercialmente es hacerlos tan específicos como sea posible, bien
para el péptido C o bien para la proinsulina. La intención de los
autores de la invención, sin embargo, era obtener anticuerpos (un
ensayo) que interactuasen tanto con el péptido C como con la PPI
con casi la misma afinidad.
Los anticuerpos usados en el procedimiento de la
presente invención se obtienen inmunizando un mamífero,
preferiblemente una oveja, con la cadena C purificada de la
insulina, preferiblemente la cadena C de insulina de mono, como se
describe en la patente europea 0 032 675, seguido de purificación
por afinidad con insulina inmovilizada en un vehículo adecuado, en
el que la insulina es preferiblemente insulina humana semisintética
o PPI humana recombinante. La purificación de los anticuerpos se
describe en los ejemplos y anexos.
Los autores de la invención probaron tres ensayos
disponibles comercialmente para determinar si cumplían los
requerimientos necesarios. Los tres ensayos fueron (1)
"RIA-coat" de péptido C; (2) Kit RIA de péptido
C humano; y (3) Kit RIA de proinsulina humana.
Este ensayo no fue adecuado para cuantificar el
péptido C de insulina de mono en las muestras dadas. Esto puede ser
debido a:
- a)
- Una reactividad cruzada insuficiente con el péptido C de mono y/o la PPI (25% según el proveedor);
- b)
- Constituyentes inapropiados del tampón de las muestras, o
- c)
- Alteración por las altas concentraciones (1 mg/mL) de insulina humana en las muestras.
Este ensayo se basa en anticuerpos contra el
péptido C humano que muestran un 90% de reactividad cruzada al
péptido C de mono y < 4% de reactividad cruzada a la proinsulina
humana.
El ensayo de Linco se puede aplicar para analizar
las muestras de HI dadas. Sin embargo, debido al pH de los tampones
del kit, se produce la precipitación de elementos de proceso de la
producción de HI. En el caso de la HIA1, que no es soluble a pH
7,4, el ensayo no se puede aplicar. Una comparación con el ensayo
quimioluminiscente de bolas revestidas de la presente invención
muestra que, aunque los anticuerpos usados en el ensayo son más
potentes en la unión a péptido C aislado de origen humano y de
mono, no interactúan tan bien con HI, PPI o PPI escindida en el
sitio EDP como la preparación de anticuerpos de esta invención. Se
debe apuntar que el ensayo de bolas revestidas de la presente
invención se realiza a pH 8,7, mientras que el ensayo de Linco se
realiza a pH 7,4.
Este ensayo no es capaz de detectar péptido C de
mono, por lo que su especificidad no es suficiente para nuestras
necesidades.
En conclusión, nuestros requerimientos no pueden
ser cumplidos por ensayos basados en anticuerpos contra péptido C
humano o preinsulina humana que se realizan a pH neutro.
Los requerimientos para el ensayo son:
- \bullet
- pH del ensayo > 8,5;
- \bullet
- Especificidad suficiente para la PPI;
- \bullet
- Suficiente afinidad de unión por los compuestos modelo de ensayo;
- \bullet
- La presencia de 1 mg/mL de HI no interfiera con la afinidad de unión del anticuerpo;
- \bullet
- Sin radiactividad; y
- \bullet
- Tiempos de ensayo cortos.
Estrategia para obtener el ensayo necesitado:
- \bullet
- Inmunización con péptido C de insulina de mono no acoplado a un vehículo;
- \bullet
- Purificación por afinidad con una columna de PPI;
- \bullet
- Eliminar por inmunoadsorción cualesquiera anticuerpos que interactúen específica o no específicamente con la insulina humana;
- \bullet
- Cribar anticuerpos de diferentes tomas de sangre investigando su unión al trazador de péptido C quimioluminiscente a pH 8,5
- \bullet
- Generar compuestos modelo de ensayo; y
- \bullet
- Establecer un ensayo a pH > 8,5 usando un tampón con alta capacidad amortiguadora a ese pH.
La invención será descrita ahora por los
ejemplos, sin estar limitada a ellos.
En los siguientes ejemplos, se usaron algunos o
todos los materiales y equipos siguientes:
Agua doblemente destilada
Fosfato monosódico, Riedel (04269)
Cloruro sódico, Merck
Azida sódica, Merck
Albúmina sérica bovina, Behringwerke (ORHD
20/21)
Gammaglobulina bovina, Sigma
(G-5009)
Glicina, Riedel (33226)
Polietilenglicol-20%
("PEG-20"), Biodata
Hidróxido sódico-Fixanal, Riedel
(38210)
Hidróxido sódico-2M, Riedel
(35254)
Acetato sódico trihidrato, Merck (6267)
Ácido fosfórico, 85% Riedel (30417)
Insulina humana semisintética (Hiet), Lote: A48
U114 y A48 U118
Tubos de poliestireno para RIA, 12x75 mm,
Sarstedt (55476)
Bolas de segundo anticuerpo del péptido C, CPIII,
Daiichi Radioisotope Labs; LTD, Tokyo Proclin 300, Supelco
(4-8127)
Suero salino tamponado con fosfato ("PBS")
de Dulbecco, Sigma (D-5652) Disoluciones Berilux R1
y R2,
Behring
Behring
Chips sensores CM5, Pharmacia BIAcore
Kit de acoplamiento de carbodiimida, Pharmacia
BlAcore
Ensayo BCA para cuantificar la concentración de
proteínas, Pierce (disolución A: No. 23223 disolución B:23224)
Patrón IgG para la determinación de la
concentración de proteínas, Pierce (31204) Fractogel EMD Azlacton
650 (S), Merck (1.10087)
Sistema de electroforesis en gel SDS que usa
NuPAGE 4-12% y tampón de ejecución MES, Novex
Kit de tinción de plata Plus One, Pharmacia
Biotech (Code # 17-1150-01) (Todos
los demás productos químicos se adquirieron de Sigma, Merck, o
Riedel de Haen.)
\newpage
Multipette, Eppendorf
Pipetas de microlitros, Abimed, Gilson
Microlab M, Hamilton
Matraces de medida y cilindros graduados
Whirlymixer Reax 2000, Heidolph
Medidor de pH digital, Knick
AutoCliniLumat LB 952 T/16, Berthold
Contador gamma multidetector Wallac Wizard 1470
(con software RIA-Calc,
Multi-Calc), Wallac
BIAcore 1000, Pharmacia BIAcore
Centrífuga fría (GS-6),
Beckmann
Suprafuge 22, Heraeus Sepatech
Biogfuge 13 R, Megafuge 1.0 R, Heraeus
Sepatech
Sistema de electroforesis en gel SDS que incluye
fuentes de energía Modelo 3540, Novex
Incubador de tubos Eppendorf, Eppendorf
Tintador de geles automatizado Hoefer,
Pharmacia
Balanzas PM400, PM4000, Mettler
AT261 Delta Range, Mettler
Ultrafree-1510 kDa, Millipore
(UFV2BGC)
Prefiltro de vidrio de 47 mm de diámetro,
Schleicher & Schüll (421026)
Filtro de membrana de 50 mm de diámetro, 5
\mum, Schieicher & Schüll (400214)
Filtro de membrana de 50 mm de diámetro, 0.2
\mum, Schleicher Schüll (404114)
FPLC 1 (Pharmacia) para cromatografía de
afinidad:
Controlador LCC-500 Plus
2 x Bombas P-500
Bomba P50
Bomba P-1
Uvicord Sll y detectores de conductividad
Desgasificador ERC 3312
Colector de fracciones 2211 Superrac
4 x Válvulas MV-8
1 x Válvula MV-7
\newpage
Controlador LCC-500 Plus
2 x Bombas P-500
Bomba P-1
Detector Uvicord S
Desgasificador ERC 3612
Colector de fracciones 2211 Superrac
1 x Válvula MV-7
Interruptor de flujo
Válvula manual SRV-4
- BSA:
- albúmina de suero bovino
- CV:
- coeficiente de variación
- ELISA:
- ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
- Hlet:
- insulina humana semisintética
- PBS:
- suero salino tamponado con fosfato
- PPI:
- preproinsulina
- QC:
- control de calidad
- RIA:
- radioinmunoensayo
Los anticuerpos se obtuvieron inmunizando una
oveja (S95-11) con péptido C de insulina purificado.
La muestra de suero obtenida tomando sangre del animal fue
purificada según el protocolo de purificación en el Ejemplo 1. Los
anticuerpos purificados por afinidad resultantes se pueden usar en
el presente ensayo a una dilución de
1:1500.
1:1500.
Se obtuvieron los siguientes anticuerpos:
Z2127, 99Ser1_SD2/F17-22
Z94, 99Ser2_SD2/P3
S95-11,
99Ser7/SD2-650/F17-22
S95-11,
99Ser8/SD2-651/F17-21
S95-11,
99Ser9/SD2-652/F17-24
S95-11,
99Ser10/SD2-680/F15-25
S95-11,
99Ser11/SD2-881/F15-24
S95-11,
99Ser12/SD2-682/F15-24
Se usa Péptido C aislado (secuencia de mono en
lugar de humana) de insulina HI humana recombinante como patrón y
trazador. La pureza es 99%.
Tampón de
muestras
El tampón de muestras se prepara disolviendo
0.326 g de Bicina (Sigma B-3876) en 100 mL de
H_{2}O destilada. El pH se ajusta a 8,7 usando NaOH 1 N.
Se disuelve insulina humana semisintética (Hlet,
véase Materiales) en HCl 10 mM, dando como resultado una disolución
de 10 mg/mL. Esta disolución de insulina se diluye adicionalmente
1:10 usando tampón de muestra.
El PBS en polvo disponible comercialmente (Sigma
D-5652) se disuelve en aproximadamente 980 mL de
agua, el pH se ajusta a 7,7 añadiendo NaOH 1 N. Se añade
TWEEN-20® para dar una concentración final de este
detergente de 0,05%. El volumen del tampón se ajusta exactamente a
1 L en un cilindro graduado. Finalmente, se disuelve BSA para dar
1.5% (peso/volumen).
Se disolvieron aproximadamente 0,5 - 0,8 mg de la
muestra en HCl 10 mM para dar como resultado una disolución de 10
mg/mL. Posteriormente, el material completamente disuelto fue
diluido adicionalmente 1:10 usando tampón de muestra.
Usando el derivado de acridiniumacilsulfonamida
Ki 256 (patentes alemanas DE 3805318 y DE 3628573,
respectivamente), se puede producir un trazador de péptido C por su
conjugación covalente directa con un resto éster de acridinio
luminiscente. La quimioluminiscencia se puede inducir por adición de
H_{2} O_{2} alcalina (McCarpa, F. (1976) Acc. Chem. Res. 9: 201
en adelante).
Para preparar este trazador de péptido C
quimioluminiscente, se mezclaron las siguientes disoluciones y se
incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente:
- 1.
- 255 \mul de un tampón que contenía 8,17 g de KH_{2}PO_{4}, 7,12 g de Na_{2}HPO_{4}, 8,77 g de NaCl, y 0,5 g de NaN_{3} en 1 L de H_{2}O. El pH se ajustó a 8,0 usando NaOH 1 N.
- 2.
- 125 \mul de péptido C a una concentración de 2 mg/mL en H_{2}O,
- 3.
- 120 \mul de marcador Ki 256 (10 mg en 1 mL de acetonitrilo).
La reacción covalente del marcador con grupos
funcionales en el péptido C fue interrumpida por adición de
100 \mul de L-lisina (10 mg/mL). El péptido C marcado fue purificado por cromatografía en gel de exclusión de tamaños usando una columna Superdex Peptide 10/30 (Pharmacia) integrada en un sistema FPLC. El tampón de ejecución fue PBS, Proclin 0,04%. El caudal fue 0,2 mL/min.
100 \mul de L-lisina (10 mg/mL). El péptido C marcado fue purificado por cromatografía en gel de exclusión de tamaños usando una columna Superdex Peptide 10/30 (Pharmacia) integrada en un sistema FPLC. El tampón de ejecución fue PBS, Proclin 0,04%. El caudal fue 0,2 mL/min.
La proteína eluida en la posición entre la
aprotinina y el citocromo C se recogió, se reunió, y se congeló en
alícuotas (Lote 2). La reproducibilidad de la producción del
trazador había sido probada antes. La dilución óptima de la
disolución patrón concentrada del trazador para la aplicación en el
ensayo fue determinada empíricamente.
La elución de los calibradores, citocromo C, (C),
aprotinina (A),.y vitamina B1 (B) se representa en la Figura 2. El
marcador sin reaccionar, lisina, y otros componentes amortiguadores
pueden ser eliminados del trazador, que eluye en un pico simétrico
en una posición entre el citocromo C y la aprotinina (línea
gruesa).
Se prepara una disolución patrón concentrada de 1
mg/mL de péptido C de insulina (según el párrafo 2 más adelante) en
agua. De este patrón concentrado se toma una alícuota y se diluye
adicionalmente 1:100 en tampón de dilución.
Ambas muestras se almacenan congeladas hasta su
uso.
Los patrones se preparan de la última muestra (10
\mug/mL) diluyendo una alícuota con tampón de dilución a 1:100 y
posteriormente 4 veces por 1:4, dando como resultado patrones de
100 ng/mL, 25 ng/mL (S4), 6,25 ng/mL (S3), 1,563 ng/mL (S2) y 0,39
ng/mL (S1). Todas las diluciones se realizan en tampón de dilución
que contiene 1 mg/mL de Hlet con el fin de imitar las condiciones en
muestras de insulina desconocidas de la producción. Sólo se usan
los patrones S1- S4 en el ensayo.
- 1.
- Los patrones se preparan en triplicados usando 200 \mul de cada concentración patrón por tubo.
- 2.
- Las muestras se analizan en duplicados usando 200 \mul de las muestras disueltas.
- 3.
- Se usa tampón de dilución puro (3 x 200 \mul) para obtener valores SO.
- 4.
- El trazador (Lote 2) se diluye a 1:40,000 en tampón de muestra. Se añaden 100 \mul de esta disolución del trazador a cada tubo.
- 5.
- La preparación de anticuerpo 99Ser9 se diluye a 1:1500 en tampón de anticuerpos y se añaden 100 \mul a cada tubo.
- 6.
- Se mezclan los contenidos de los tubos. Después se añaden "bolas de segundo anticuerpo del péptido C".
- 7.
- Después de una agitación de 5 horas a temperatura ambiente, se retira el líquido por succión. Las bolas se lavan 5 veces con aproximadamente 0,8 mL de agua usando una cabeza de lavado manual de 10 puntas conectada a una bomba de vacío. Posteriormente, las muestras se analizan en el luminómetro. La quimioluminiscencia en la muestra es estimulada por dispersión sucesiva automatizada de 0,3 mL de disolución R1 (H_{2}O_{2}) y R2 (NaOH), cada una. La luz que se emite se mide durante 1 segundo y se visualiza como RLU (unidades de luz relativas).
- 8.
- El cálculo de los resultados es realizado automáticamente por el software basado en el propio analizador usando una transformación logit/log de la curva patrón.
El propósito del ensayo es identificar PPI,
péptido C de insulina, y supuestas impurezas de insulina que
contienen partes del péptido C enlazadas covalentemente a la cadena
A o la B de la insulina humana. Estas estructuras antigénicas
tienen que ser determinadas en presencia de un exceso de insulina
elaborada correctamente. Para analizar la variación inducida por
este fondo de insulina, se analizó repetidamente insulina
semisintética (a concentraciones de 1 mg/mL). Se debe usar insulina
semisintética para este propósito para asegurar que no contiene
impurezas de péptido C de mono, y además, es un componente del
tampón patrón/de dilución.
Se disolvió insulina semisintética 10 veces a una
concentración de 1 mg/mL como se describe en la disolución de
muestras anteriormente. Estas muestras de insulina se analizaron en
el ensayo en el mismo día. Los resultados obtenidos con las
muestras de insulina se muestran en la Tabla 1.
\hskip2cm* todas las muestras fueron determinadas por duplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que la insulina humana
semisintética, en promedio, no altera la unión del trazador al
anticuerpo. Sin embargo, hay una cierta variabilidad que da como
resultado valores máximos de B/BO de 106% y valores mínimos de
91%.
La consecuencia de este hallazgo es que los
valores de B/BO por encima de 90% (=valor medio menos 3 veces la
desviación estándar) obtenidos en muestras desconocidas no deben
ser calculados y se interpretaron como fondo (límite de detección).
Una muestra que da un B/BO > 90% lo más probable es que contenga
< 0,4 ppm de actividad similar al péptido C.
La repetibilidad (variabilidad intraensayo),
analizada con estas muestras de Hlet (fondo), es 4%.
Se encontró el mismo valor de 4% en una muestra
que contiene aproximadamente 1 ng/mL de inmunorreactividad similar
a la del péptido C (muestra HIA1 055 AKR 01 + 02, véase la Tabla 1).
Como la sonda de Hlet, el elemento de la prueba se disolvió 10
veces a una concentración de 1 mg/mL y se analizó en el mismo
día.
Se ha aplicado el mismo método estadístico en
productos finales de la producción de HI y HIA1. Para este
propósito, se analizaron en el mismo día 23 muestras diferentes de
HI y 6 muestras diferentes de HIA1. Los resultados se muestran en
la Tabla 2.
* todas las muestras fueron determinadas por
duplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos muestran claramente que los productos
finales de HI, en promedio, no contienen actividad similar a la del
péptido C, porque la variación alrededor de las determinaciones
únicas es similar a la obtenida con insulina humana semisintética.
No hay diferencia significativa entre el grupo de HI (de 24
muestras individuales) y de Hlet (una muestra analizada 10 veces en
el mismo ensayo). Los valores mínimo y máximo en las muestras de HI
(89,8% ó 109%, respectivamente) también están cercanos a los
valores obtenidos con Hlet (91% ó 106%, respectiva-
mente).
mente).
Considerando las muestras de HIA1, se puede
concluir que está presente inmunorreactividad similar a la del
péptido C en el producto final. Sin embargo, el contenido está en
el intervalo de 0,5 - 1 ppm (cuando se cuantifica con la ayuda de
una curva patrón, véase más adelante).
En la Figura 3 se ilustran las curvas patrón
obtenidas en 6 ensayos diferentes. Los valores numéricos de estas
curvas expresados como B/BO (%) se resumen en la Tabla 3. Las
estadísticas de la curva se dan en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Los parámetros de las curvas son:
- ED20 = 14,44 \pm 0,99 ng/mL (CV = 6,86%)
- ED50 = 3,21 \pm 0,23 ng/mL (CV = 7,21%)
- ED8O = 0,91 \pm 0,10 ng/mL (CV = 10,71%)
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos presentados anteriormente muestran:
- 1.
- La curva patrón es altamente reproducible.
- 2.
- La insulina humana semisintética no es reconocida por el anticuerpo.
- 3.
- La actividad similar a la del péptido C no está determinada en el lote de HI C038.
- 4.
- El análisis de las muestras es altamente reproducible con el ensayo dado, como indican los valores CV obtenidos, 3,9% en el caso de Hlet y 2,97 en el caso del lote HI C038.
Los datos presentados anteriormente muestran
claramente que cuando se usa el método explicado en términos
generales, el ensayo es influenciado sólo mínimamente por la
insulina humana pura, lo cual es el requisito previo para la
determinación de inmunorreactividad similar a la del péptido C en
preparaciones farmacéuticas de insulina.
Con la ayuda de compuestos modelo que contienen
péptido C, los autores de la invención investigaron la especificidad
de su anticuerpo en el formato de ensayo dado. Se da una
descripción de compuestos modelo en las siguientes secciones.
- 1.
- HI PPI
- 2.
- Péptido C humano
- Se obtuvo, de Sigma, cadena C de insulina humana sintética (Cat. Nº C-5051). Se informa de que la pureza es 97%, el contenido en péptido es 84%.
- 3.
- HI reducida/alquilada
- El objeto es analizar un péptido C lineal con extremos N- y C-terminales protegidos. Este control imita una PPI no desplegada y muestra que los anticuerpos que se unen a las partes centrales contribuyen a la especificidad de la preparación de antisuero purificada por afinidad. La preparación de esta muestra de control se describe en el Ejemplo 4.
- 4.
- HI escindida con endoproteinasa Asp-N en el sitio EDP (C6 - - C7) del péptido C. El propósito es analizar una insulina humana con secuencias de péptido C conectadas covalentemente en el término C de la cadena B y/o el término N de la cadena A. Este control imita las impurezas que proceden de la escisión ácida del sitio EDP en el péptido C. También imita supuestas impurezas que proceden de una escisión incompleta con tripsina. La preparación de esta muestra de control se describe en el Ejemplo 5.
- 5.
- Péptido C de HIA2 (carga HD/19, 21.07.99: pureza > 99%):
- Este péptido C está truncado en la parte N-terminal, cuando se compara con péptido C de HI, y por consiguiente ha perdido epítopos en el término N. El péptido C de HIA2 puede servir como modelo para impurezas escindidas o modificadas N-terminalmente del péptido C de HI aislado.
- 6.
- PPI de HIA2 (carga: UB11/30-HP2; pureza 96%):
- Como el péptido de HIA2, esta PPI mutada puede servir como un antígeno modelo que ayuda a verificar inmunorreactividades del anticuerpo con PPI que tenga una parte C-peptídica alterada drásticamente, cuando se compara con PPI de HI.
Los resultados de los ensayos de control que usan
los compuestos modelo descritos, así como su interpretación, se dan
en el Ejemplo 7.
El panel de compuestos modelo delineó de manera
excelente las especificidades de la preparación del antisuero
purificado por afinidad 99Ser9 de los autores de la invención.
A la vista de todos los resultados mostrados, se
puede concluir que el ensayo de bolas descrito en esta solicitud es
muy adecuado para medir la inmunorreactividad similar a la del
péptido C en muestras de producción de insulina. Como la
preparación de anticuerpos en el diseño de ensayo dado reconoce
todos los compuestos modelo, se puede concluir que todas las
impurezas principales y supuestas de péptido C en muestras de
producción de insulina recombinante pueden ser reconocidas, lo más
probablemente, por el ensayo.
El nuevo inmunoensayo ha sido aplicado para
investigar la eliminación de inmunorreactividad similar a la del
péptido C en 3 campañas de producción diferentes (UA114, UA0115,
UA116). Los elementos de ensayo de las etapas de purificación 12
(muestras SB), 13 (muestras KA y KB), y 14 (muestras UA) han sido
analizados en cuanto a inmunorreactividad similar a la del péptido C
de la insulina.
Los resultados obtenidos con el ensayo de bolas
según la presente invención ("Bolas") se comparan con el
resultado de los ensayos alternativos disponibles
comercialmente:
(1) HMR - RIA ("RIA"), (2) Kit RIA de
péptido C humano, de Linco Research Inc. ("RIA Linco"), y (3)
el método ELISA desarrollado por NewLab Diagnostic Systems GmbH
("NewLab").
- (1)
- RIA (original): Radioinmunoensayo, basado en anticuerpo 99Ser7 purificado por afinidad en PPI inmovilizada. Se usa péptido C de mono como trazador, se usa PPI de HI como patrón: Intervalo de la curva patrón: 0,39 - - 25 ng/mL (límite de detección: 0,5 ng/mL).
- (2)
- RIA Linco: Radioinmunoensayo disponible comercialmente basado en anticuerpos anti-péptido C humano. Este ensayo muestra buena reactividad cruzada al péptido C de mono y a PPI, sin embargo la unión a PPI de HI se reduce hasta un factor de 3 comparado con el ensayo de bolas (véase la Tabla 9 más adelante). Se usa péptido C humano como patrón y trazador. Intervalo de la curva patrón: 0,1 - 5,0 ng/mL (límite de detección: 0,1 ng/mL).
- (3)
- NewLab: ELISA Sándwich desarrollado por NewLab Diagnostic Systems GmbH, basado en suero monoclonal anti-péptido C humano (Fitzgerald) y policlonal anti- péptido C de mono. Este ensayo muestra una fuerte preferencia por péptido C aislado (anti-péptido C humano monoclonal y anti-péptido C de mono policlonal sin purificación por afinidad en resinas de PPI). Se usa péptido C de mono como patrón. Intervalo lineal de la curva patrón: 0,5 - 10 ng/mL (límite de detección: 0,5 ng/mL).
- (4)
- Bolas: El ensayo según la presente invención. El ensayo no radiactivo de bolas revestidas se basa en anticuerpos 99Ser9 obtenidos después de purificación por afinidad en una columna de afinidad de PPI de HI (como los anticuerpos en el RIA). Se usa péptido C de mono como patrón y trazador. Intervalo de la curva patrón: 0,39 - 25,0 ng/mL (límite de detección: 0,4 ng/mL).
En las tablas siguientes, se aplican las
siguientes definiciones de las abreviaturas:
- SB: Elementos de ensayo después de la etapa de purificación 12 (cromatografía iónica);
- KA y KB: Elementos de ensayo después de la etapa de purificación 13 (Cromatografía RP);
- UA: Elementos de ensayo después de la etapa de purificación 14 (cristalización final);
- ND - no realizado.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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- 1.
- El nuevo inmunoensayo de la presente invención determina la eliminación de la inmunorreactividad del péptido C en elementos de control de proceso del procedimiento de purificación de HI. (Véanse las Tablas 5-7, última columna - Bolas (4)). Como el péptido C se usa como patrón, los valores obtenidos de la presente invención son aproximadamente 2,5 - 3 veces más bajos que con el RIA original (Véase (1) anterior comparado con (4)). De hecho, se encontró una diferencia en cuatro veces (valor medio), que se correlaciona directamente con el drásticamente reducido tiempo de incubación cuando se compara con el RIA.
- 2.
- La inmunorreactividad similar a la del péptido C no es detectable en sondas terminales de HI con el ensayo de bolas revestidas de la presente invención. Las concentraciones calculadas están en el intervalo de los valores que se pueden medir para la Hlet. Los valores medios de las muestras KA/KB y UA son:
- 104,7 \pm 3,7 (CV = 3,5%) para muestras de KA/KB 114 (n = 8).
- 103,8 \pm 5,3 (CV = 5,1%) para muestras de KA/KB 115 (n = 8).
- 99,8 \pm 3,7 (CV = 3,7%) para muestras de KA/KB 116 (n = 8).
- 102,3 \pm 3,7 (CV = 3,6%) para muestras de UA 114 (n = 4).
- 100,3 \pm 3,2 (CV = 3,2%) para muestras de UA 115 (n = 4).
- 99,1 \pm 3,8 (CV = 3,8%) para muestras de UA 116 (n = 4).
- Todos estos valores se ajustan exactamente al intervalo de variación determinado por medición repetida de Hlet.
- 3.
- Los datos mostrados en la última columna de la Tabla 5 (Bolas (4)) dejan claro que el ensayo de la presente invención rinde resultados reproducibles.
- 4.
- El RIA original (1) adolece de desviaciones que no pueden ser explicadas por fallos obvios en el manejo de las muestras o en la realización del ensayo. Además, el ensayo se caracteriza por una deficiente reproducibilidad.
- 5.
- El RIA Linco (2) es mucho más robusto que el RIA original (1) y mejora la reproducibilidad. Como el RIA original, este ensayo también adolece del método de dilución de muestras, aunque no tan seriamente como el RIA original (Véanse las Tablas 5-7). Dado que el RIA Linco es la variante de ensayo más sensible probada, en algunas muestras de productos finales se puede detectar una cantidad en trazas de actividad similar a la del péptido C de la insulina en el intervalo de concentraciones entre 0,1 - 0,5 ng/mL.
- 6.
- En los ensayos RIA (1), Linco (2), y Bolas (4), se ha introducido rutinariamente Hlet como control (Véanse las Tablas 5-7).En teoría, el valor de Hlet puede ser sustraído de todos los resultados, mostrando que, en efecto, no hay presente, o sólo una mínima cantidad, inmunorreactividad similar a la del péptido C de la insulina en la mayoría de los elementos finales de la purificación de insulina.
- 7.
- El ELISA de NewLab no produce resultados claros, porque el fondo se determina con el propio elemento de ensayo (no con Hlet). Además, el ensayo es dominado por la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-péptido C de proinsulina humana (clon M607239; cat/lote no. FZ10-C65) para el que la extensión de reactividad cruzada a la PPI no se conoce. No hay datos que muestren cómo es de fuerte la interacción con la PPI en el ensayo de NewLab. En consecuencia, para el diseño del ensayo (diseñado principalmente para analizar péptido C) pueden ser medidos valores bajos - incluso más bajos que el ensayo de Linco - de inmunoreactividad del péptido C (si la hubiera) en "muestras fuente". Una explicación alternativa para este hecho podría ser que las muestras no se disuelven muy bien en el pH de trabajo. Sin embargo, no se exige una prueba de disolución total en el procedimiento de operación estándar específico del protocolo del ELISA NewLab.
El nuevo inmunoensayo descrito de la presente
invención es muy adecuado para analizar la eliminación de la
inmunoreactividad similar a la del péptido C en elementos de
control de proceso de la producción de insulina humana, con alta
sensibilidad, precisión, y buena reproducibilidad (CV < 5%).
La concentración mínima de actividad similar a la
del péptido C de la insulina que se puede detectar con el ensayo de
la presente invención es 0,4 ng/mL. Así, todos los valores por
debajo de este valor se consideran ruido de fondo y no deben ser
expresados numéricamente.
Los méritos del nuevo ensayo son:
- \bullet
- Es un ensayo no radiactivo que usa un marcador quimioluminiscente.
- \bullet
- El trazador es muy estable. Así, se puede usar material trazador idéntico durante largo tiempo (aproximadamente 20 semanas sin pérdida de calidad). Unas condiciones de ensayo comparables y estables durante periodos de tiempo largos son un requisito previo para aplicaciones de rutina y comparabilidad a largo plazo de los resultados.
- \bullet
- El tiempo total del ensayo es sólo 5 horas. No se necesita trabajo preparatorio específico. El ensayo se puede realizar dentro de 1-2 días después de la llegada de la muestra.
- \bullet
- Es un ensayo homogéneo, sin etapas secuenciales ni lavados intermedios. Se pueden analizar más de 50 sondas diferentes en el mismo día.
- \bullet
- No es necesario un equipo técnico sofisticado para realizar el ensayo.
- \bullet
- El ensayo es barato (sin marcado de rutina, sin equipo radiactivo, sin gasto radiactivo, sólo se necesita material de laboratorio estándar).
- \bullet
- El principio del ensayo es simple, por lo que se puede adiestrar a personal técnico sin experiencia específica para realizar el análisis muy rápidamente. La dilución de la muestra es un procedimiento simple en dos etapas sin la necesidad de posteriores mediciones y ajustes del pH. La muestra permanece disuelta durante todo el periodo de incubación. Esto es cierto para productos finales de HI, HIA1, y todos los elementos intermedios del procedimiento de dirección descendiente. Esto no se puede conseguir con ninguno de los ensayos alternativos.
- \bullet
- El ensayo es robusto, con una repetibilidad de 4% (véase la Tabla 1) y una variabilidad interensayo de 4% (véase la Tabla 4). Ambos valores están calculados en base a los datos B/BO brutos.
- \bullet
- Tanto las sondas HI como las HIA1 se pueden analizar usando el mismo protocolo de ensayo, ingredientes y tampones (véanse las Tablas 5-8).
- \bullet
- La inmunorreactividad similar a la del péptido C de la HIA2 se puede analizar con un corte de 10 ppm (límite de detección) usando el mismo protocolo de ensayo, ingredientes y tampones.
- \bullet
- El ensayo se puede convertir a un formato en tubo revestido o a formato de micropocillo, cuando se usan tubos especiales o microplacas. De esta manera, se puede evitar la adquisición de las bolas del segundo anticuerpo.
- \bullet
- La sensibilidad del ensayo puede ser mejorada incrementando el tiempo de incubación o usando anticuerpo y trazador más concentrados, permitiendo volúmenes reducidos de ambos.
- \bullet
- El único ensayo con una descripción exacta de su especificidad.
Se dejaron hincharse 7 g de Fractogel EMD
Azlacton 650 (S) durante 15 minutos en 140 mL de PBS, pH 7,4.
Después de esta incubación, se retiró el sobrenadante haciéndolo
pasar a través de un filtro de vidrio. El gel remanente
(aproximadamente 24 mL) se suspendió en 20 mL de PBS, pH 7,4.
Se disolvieron 120 mg de insulina humana
semisintética (insulina ET [insulina HPU, HGR, IE Sap. Nr.: 116312,
Muster A48, Ch: B.: U118]) en 3 mL de ácido fosfórico 50 mM. Se
dejó caer lentamente la disolución en 50 mL de PBS, pH 9,4, con
agitación. El pH cayó a 6,65 al final de este procedimiento.
Finalmente, el pH de la disolución de insulina se ajustó a 7,4 por
adición cuidadosa de NaOH 2M.
La disolución de insulina y el gel acondicionado
se mezclaron y se dejó proceder la reacción de acoplamiento por el
Azlacton funcional a temperatura ambiente. Se consiguió una
constante y cuidadosa mezcla por una rotación lentamente progresiva
del vaso de reacción. Después de 4 h a temperatura ambiente, el
sobrenadante con ligando sin reaccionar fue retirado por filtración,
y el gel se lavó con 120 mL de PBS. El análisis por HPLC dio como
resultado 67 mg de insulina humana no unida. En consecuencia, 53 mg
habían sido inmovilizados covalentemente en el Fractogel EMD.
Los grupos activos remanentes en la resina fueron
bloqueados por adición de 120 mL de glicina 0,2 M, pH 8,0. Se dejó
proceder la reacción a temperatura ambiente. De nuevo se consiguió
una mezcla constante y cuidadosa por rotación lentamente progresiva
del vaso de precipitados de reacción. Después de
16-20 h, el sobrenadante con glicina sin reaccionar
se retiró por filtración y el gel se lavó con tres ciclos de 120 mL
de PBS, pH 7,4, acetato sódico 0,1 M, glicina 0,2 M, pH 2,8, cada
uno.
La resina de afinidad resultante con insulina
humana acoplada covalentemente se suspendió en PBS, pH 7,4, con
Proclin 0,04% como conservante y se vertió en una columna de FPLC HR
16/15.
Se dejaron hincharse 14,5 g de Fractogel EMD
Azlacton 650 (S) durante 15 minutos en 290 mL de PBS, pH 7,4.
Después de esta incubación, se retiró el sobrenadante haciéndolo
pasar a través de un filtro de vidrio. El gel remanente
(aproximadamente 50 mL) se suspendió en 20 mL de PBS, pH 7,4.
Se disolvieron 250 mg de PPI en 6 mL de ácido
fosfórico 50 mM. La disolución se dejó caer lentamente en 100 mL de
PBS, pH 9,4, con agitación. El pH cayó a 6,60 al final de este
procedimiento. Finalmente, el pH de la disolución de PPI se ajustó
a 7,4 por adición cuidadosa de NaOH 2M.
La disolución de PPI y el gel acondicionado se
mezclaron y se dejo proceder la reacción de acoplamiento por el
Azlacton funcional a temperatura ambiente. Se consiguió una mezcla
constante y cuidadosa por rotación lentamente progresiva del vaso
de precipitados de reacción. Después de 4 h a temperatura ambiente,
el sobrenadante con ligando sin reaccionar fue retirado por
filtración y el gel se lavó con 120 mL de PBS. El análisis por
HPLC dio como resultado 67 mg de insulina humana no unida. En
consecuencia, 171 mg habían sido inmovilizados covalentemente en el
Fractogel EMD.
Los grupos activos remanentes en la resina fueron
bloqueados por adición de 250 mL de glicina 0,2 M, pH 8,0. Se dejó
proceder la reacción a temperatura ambiente. De nuevo, se consiguió
una mezcla constante y cuidadosa por rotación lentamente progresiva
del vaso de precipitados de reacción. Después de
16-20 h, el sobrenadante con glicina sin reaccionar
se retiró por filtración, y el gel se lavó con tres ciclos de 250
mL de PBS, pH 7,4, acetato sódico 0,1 M, glicina 0,2 M, pH 2,8,
cada uno.
La resina de afinidad resultante, con insulina
humana acoplada covalentemente, se suspendió en PBS, pH 7,.4, con
Proclin 0.04% como conservante, y se vertió en una columna de FPLC
XK 26/20.
La fuente para la purificación de anticuerpos fue
un suero de oveja S95-11, que fue inmunizada con
péptido C de insulina de mono. El suero había sido almacenado a
-20ºC hasta su descongelación. Después de descongelarse, se
determinó que el volumen total del suero fue 79 mL. Se dobló el
volumen añadiendo 65 mL de agua y 16 ml de PBS (10x concentrado,
más Proclin 0.4%) para ajustar las condiciones amortiguadoras para
la cromatografía. El suero diluido fue centrifugado posteriormente
a 26.000x g durante 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue filtrado
a través de membranas apiladas de 5 \mum y 0,2 \mum protegidas
por una capa de filtro de vidrio.
La base lógica para el esquema de purificación
fue retirar anticuerpos que se unen inespecíficamente a la resina
EMD Fractogel y a secuencias en la insulina humana, así como
supuestos anticuerpos anti-insulina de oveja, en una
primera etapa, haciendo pasar el suero a través de la resina de
afinidad de insulina humana.
En una segunda etapa, los anticuerpos
anti-péptido C de insulina de mono se pueden
purificar después de su unión al péptido C, que es una parte
integral de la PPI inmovilizada en el EMD Fractogel.
Se eligió la cromatografía de afinidad en PPI (en
lugar de cromatografía en péptido C inmovilizado), porque, con el
fin de usar los anticuerpos purificados en un inmunoensayo para la
cuantificación de inmunorreactividad similar a la del péptido C, es
un requisito previo la unión a péptido C y/o fragmentos de péptido
C aún conectados al resto de insulina.
El suero de oveja diluido fue bombeado a través
de las dos columnas de afinidad (flujo: 3,5 mL/min) en una sola
etapa, conectando directamente la columna EMD Fractogel HR16/11 de
insulina humana ("primera columna") a la columna EMD Fractogel
XK26/11 de PPI ("segunda columna"). La primera columna elimina
todos los aglutinantes no deseados, pero no interactúa con los
anticuerpos anti-péptido C de insulina humana. La
segunda columna se une específicamente a los anticuerpos
anti-péptido C de insulina de mono.
Los anticuerpos de oveja no específicos, así como
los componentes del suero, no pueden interactuar con la resina de
afinidad de la segunda columna, así que fluyen a través de la
columna en el eluato. La captura total de los anticuerpos
específicos por la columna de afinidad fue comprobada por análisis
del flujo que atravesó la columna haciendo uso del sistema
BIAcore®. En la fracción del flujo que atravesó la columna, no hubo
actividad de unión detectable.
Después del paso del suero, las dos columnas
fueron desconectadas y eluidas independientemente con glicina 0,1 M,
Proclin 0,04%, pH 2,7 (flujo: 5 mL/min).
En el caso de la primera columna, la elución
ácida da como resultado directamente la regeneración de la matriz
de afinidad, que puede ser acondicionada posteriormente por
equilibrado extenso con tampón PBS.
El perfil de elución de la columna EMD Fractogel
de PPI se muestra en la Figura 4B. Las fracciones
9-22 contienen anticuerpos
anti-péptido C de insulina de mono activos,
analizados con el sistema BIAcore®. Las fracciones indicadas fueron
reunidas y concentradas a 10 mL usando unidades Amicon
Ultrafree-15 (membranas de corte de pesos
moleculares de 10 kDa).
Para purificar adicionalmente los anticuerpos y
transferirlos a un tampón neutro, el eluato de glicina concentrado
fue sometido a cromatografía en una columna de exclusión de tamaños
Superdex 200 (26/60). El perfil de elución se muestra en la Figura
5. Las fracciones 17-24 contienen los anticuerpos
anti- péptido C de insulina de mono purificados. Para conseguir una
pureza más alta de los anticuerpos, se realizó una segunda
cromatografía de filtración en gel usando la misma columna Superdex
200 (26/60) (Figura 6). La proteína que eluye en las fracciones
17-21 fue reunida y almacenada como la preparación
final del anticuerpo "99Ser9-rechr".
El flujo que atraviesa el tándem de columnas de
afinidad, así como los eluantes de las columnas EMD Fractogel de
PPI y Superdex 200, fueron analizados usando el sistema BIAcore®.
Esta técnica permite la detección rápida de anticuerpos anti-
péptido C de insulina de mono por simulación de la cromatografía de
afinidad en una celda de flujo de 60 nL generada en la superficie
de un chip sensor. Los anticuerpos activos que se unen a PPI
inmovilizada en esta celda de flujo pueden ser detectados por
resonancia de plasmón superficial, con una alta sensibilidad.
El volumen de la preparación de anticuerpos fue
24 mL, según se determinó con un cilindro graduado. La concentración
de la proteína fue determinada por el método BCA en un formato en
micropocillo según las instrucciones del proveedor (Pierce). La DO
a 560 nm fue medida usando un lector Spectra 111 Elisa (SLT).
Se usó una curva patrón con IgG de
concentraciones conocidas para calcular la concentración desconocida
de la preparación del anticuerpo. El valor en mg/mL de la
desconocida fue leído directamente a partir de los datos
representados.
La preparación de anticuerpo descrita tuvo una
concentración de 0,454 mg/mL. El rendimiento total de anticuerpo fue
10,9 mg. La preparación de anticuerpo fue dividida en partes
alícuotas de 1 mL, marcada cada una con 99Ser
9/rechr.F17-22, y almacenadas a -70ºC.
La preparación de anticuerpos descrita
anteriormente (99Ser 9/rechr.F17-22) se puede usar
en inmunoensayos para cuantificar la inmunorreactividad similar a la
del péptido C de la insulina, especialmente en la variante de
ensayo del ensayo de quimioluminiscencia de bolas revestidas.
Se disolvieron 3,28 mg de PPI en 109 \muL de
H_{2}O y se diluyeron adicionalmente añadiendo 109 \mul de
tampón PBS concentrado 10 veces suplementado con Proclin 0,4%.
Finalmente, se preparó una disolución con un contenido en PPI de 3
mg/mL añadiendo 875 \muL de H_{2}O. A 990 \mul de esta
disolución de PPI, se le pipetearon 10 \muL de DTE 1 M (en agua).
La muestra fue incubada a 37ºC durante 5 horas. Después de un
tiempo de reacción de 1 h, la precipitación de proteína fue
detectable y aún presente después de elevar el pH a 9,0 durante el
tiempo restante.
Para detener la reducción de puentes
S-S en la PPI y proteger el sulfhidrilo libre de la
reoxidación y/o generación de nuevos enlaces S-S, se
añadieron 185 mg de iodoacetamida sólida y se incubó 4 horas en la
oscuridad a 4ºC.
La PPI alquilada resultante fue dializada después
dos veces frente a 400 mL de PBS, Proclin 0.04%, en un
Tube-O-Dialyser. La proteína
precipitada fue retirada por centrifugación. En el sobrenadante
transparente (1,3 mL), se pudieron determinar 23 \mug/mL de PPI
alquilada soluble por análisis de aminoácidos después de la
hidrólisis de la muestra.
Una penetración ligeramente retardada en el
análisis de aminoácidos por electroforesis en gel SDS y una mejor
susceptibilidad a la degradación proteolítica con endoproteinasa
Asp-N (Véase el Ejemplo 6) probaron que la
derivatización fue eficaz. Obviamente, la endoproteinasa
Asp-N escinde la PPI reducida en las cisteínas
derivatizadas, además del sitio DP.
La endoproteinasa Asp-N es una
metaloproteasa que escinde específicamente enlaces peptídicos
N-terminalmente en el ácido aspártico y cisteico. La
PPI humana (PPI de HIA1) contiene sólo un ácido aspártico en su
secuencia. Está localizado en el péptido C, donde está situado
N-terminalmente respecto a un residuo de prolina,
creando el sitio lábil a ácidos DP (C6 - C7). Este sitio está
localizado presumiblemente en la superficie exterior de la molécula
de PPI, y debe, por consiguiente, ser accesible a la endoproteinasa
Asp-N. Todos los residuos de cisteína están
implicados en puentes S-S, enterrados dentro de la
molécula, y, por consiguiente, protegidos de un ataque proteolítico.
Dividiendo la PPI en el sitio EDP, se puede generar un valioso
compuesto modelo que ayude a delinear la especificidad de los
anticuerpos purificados por afinidad de los autores de la
invención.
Para escindir el sitio EDP dentro del péptido C
se mezclaron 50 \mul de PPI (0,7 mg/mL en agua) y 50 \mul de
Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía urea 0,2 M. La proteolisis se
inició por la adición de 25 \mul de endoproteinasa
Asp-N
(1 \mug disuelto en Tris-HCl 10 mM, pH7,5) y se incubó durante 32 horas a 37ºC. La reacción fue detenida congelando la muestra.
(1 \mug disuelto en Tris-HCl 10 mM, pH7,5) y se incubó durante 32 horas a 37ºC. La reacción fue detenida congelando la muestra.
La electroforesis en gel y una posterior tinción
de plata mostraron que la PPI fue escindida cuantitativamente en el
sitio EDP, porque se pueden separar dos bandas después de la
reducción de los enlaces disulfuro en la proteína escindida
enzimáticamente (véase el Ejemplo 6). No hay ninguna banda de
proteína remanente visible en la posición de PPI reducida sin
escindir (que sin embargo es una molécula de cadena única).
La PPI escindida por endoproteinasa
Asp-N puede servir como compuesto modelo (control)
que:
- \bullet
- imita una impureza que resulta de la escisión ácida del sitio EDP,
- \bullet
- imita un derivado de la insulina que resulta de la escisión incompleta con tripsina con partes del péptido C aún conectadas al extremo C de la cadena A y/o en el extremo N de la cadena B.
Las muestras fueron aplicadas a un gel de
electroforesis en tampón SDS que contenía DTE para reducir
completamente los puentes S-S. Véase la Figura
7.
- 1.
- Análisis de PPI de HI, péptido C (mono) de HI, PPI reducida/alquilada, y péptido C de HI usando el ensayo que se describe en esta solicitud (basado en la preparación 99Ser9). Todos los compuestos se diluyeron en tampón de dilución que contenía 1 mg/ML de Hlet. Para los resultados, véase la Figura 8.
- 2.
- Análisis de péptido C (mono) de HI, PPI de HI escindida con endoproteinasa Asp-N, PPI de HIA2, y péptido C de HIA2 usando el ensayo que se describe en esta solicitud (basado en la preparación 99Ser9). Todos los compuestos se diluyeron en tampón de dilución que contenía 1 mg/mL de Hlet. Para los resultados, véase la Figura 9.
- 1.
- El péptido C de HI y la PPI de HI son reconocidos igualmente por el anticuerpo, como indican las relaciones de dilución paralelas y un desplazamiento a la derecha (factor-6) de la curva que depende de la diferencia en los pesos moleculares y un tiempo de incubación reducido drásticamente (véase, más adelante, la Tabla 8).
- 2.
- El péptido C humano es reconocido por el ensayo, pero se necesitan aproximadamente 180 ng/mL para obtener 50% de inhibición. Esta es una concentración 55 veces más alta comparada con el péptido C de mono. Estos datos ilustran claramente la alta especificidad de la preparación de anticuerpos para el péptido C de mono, que difiere de la secuencia humana sólo en el aminoácido 37 (Pro contra Leu) (véase la Tabla 8).
- 3.
- Hay una nítida reactividad cruzada a la PPI escindida con endoproteinasa Asp-N. Sin embargo, la curva de dilución es ondulada y hay una pérdida de reactividad de \sim 10 veces comparada con la PPI nativa (véase la Tabla 8). Esto indica que se destruyen epitopos estructurales, introduciendo una división única en el péptido C, y que el sitio EDP es un epitopo inmunogénico principal que es reconocido por la preparación de anticuerpos 99Ser9.
- 4.
- La PPI alquilada es reconocida sin pérdida significativa de inmunorreactividad, lo que indica que los anticuerpos que reconocen específicamente los aminoácidos N- y C-terminales pudieron ser retirados por cromatografía de afinidad, por lo que no pueden influir en la especificidad de la preparación de anticuerpos. Como la PPI alquilada refleja un péptido C lineal con el tamaño de la PPI, las curvas de dilución de la PPI y de PPI reducida/alquilada son más o menos superponibles.
- 5.
- Se ve un aplanamiento pronunciado de las curvas de dilución con péptido C de HIA2 y PPI de HIA2, donde los epitopos en la parte N-terminal del péptido C están eliminados y mutados. El anticuerpo 99Ser9, sin embargo, aún se une a estos antígenos con una afinidad que está reducida aproximadamente 35 veces comparada con las estructuras respectivas de PPI de HI. El comportamiento ondulatorio de las curvas de dilución es típico para situaciones donde poblaciones diferentes de anticuerpos monoespecíficos (como en un suero policlonal) reaccionan con antígenos con epitopos relacionados pero no idénticos. La rápida declinación en la curva de inhibición a bajas concentraciones de antígeno representa la interacción de anticuerpos con la (no alterada) parte C-terminal del péptido C lineal. La rápida fase de la curva indica que una cantidad sustancial de anticuerpos se une con afinidad reducida a las partes central y N-terminal del péptido C de HIA2, que están mutadas y cambiadas estructuralmente, comparado con la PPI de HI. Estos antígenos relacionados no pueden desplazar al trazador (péptido C de HI marcado) del anticuerpo tan eficazmente como los antígenos de HI.
- 6.
- La PPI de HIA2 y la PPI de HI escindidas en el sitio EDP son reconocidas por el ensayo de manera casi igual, mostrando de nuevo la importancia del sitio EDP en el reconocimiento inmune por la preparación de anticuerpos 99Ser9. Se pueden detectar positivamente concentraciones \geq10 ng/mL de éstas o de antígenos relacionados usando el ensayo dado.
En el RIA original (1) y en el ensayo Linco (2)
(véase el Ejemplo 2 anterior), las concentraciones tienen que estar
en el orden de \geq20 ng/mL. No es posible dar datos respectivos
para el ELISA desarrollado por NewLab (3), porque no se realizaron
los controles y no hay datos acerca del límite de detección de PPI
usando este método. Según se deduce del diseño del ensayo, se puede
prever que el ELISA mostraría niveles más bajos de reactividad
cruzada a la PPI y a derivados de la PPI que el ensayo Linco.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| \; n.d.: no determinado |
| * \begin{minipage}[t]{148mm} Tiene que tenerse en consideración que la varianza en este método es > 5 veces más alta que en el ensayo de bolas o en el ensayo Linco, limitando así el valor de los datos dados en la Tabla. \end{minipage} |
Resumiendo todos los resultados obtenidos con los
compuestos modelo, se puede establecer claramente que los
anticuerpos obtenidos de oveja S95-11, preparación
99Ser9 (y 99Ser7, que se usa en el RIA) cumplen los requerimientos
para identificar positivamente diferentes clases de antígenos que
contiene péptido C, que pueden ser circunscritos con
"inmunorreactividad similar a la del péptido C".
Este ejemplo describe y documenta la inmunización
y muestreo de sueros de una oveja, que contiene anticuerpos
dirigidos contra péptido C de mono.
Se adquirió una oveja hembra de Gerhard
Mundschenk (Zwerggasse 2; 65468 Trebur-Astheim) y se
mantuvo a una dieta estándar normal para cabras en una granja
(Hermann Kettenbach, lm Birkenfeld 38, 65719
Hofheim-Langenhain). La oveja fue marcada como
S95/11.
En el comienzo de la inmunización, la oveja
(marcada como S95/11) fue inmunizada con antígeno (inicialmente, 2
mg de péptido C de mono) en volúmenes equivalentes (mezcla 1:1 de 1
mL de suero salino + 1 mL de adyuvante de Freund completo (cFA;
Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EE.UU.)). Esta emulsión se
preparó inmediatamente antes de su administración, y fue inyectada
por vía subcutánea en 2-3 sitios. Las inyecciones
de recuerdo a intervalos de 2-4 semanas consistieron
en la misma cantidad de antígeno (2 mg de péptido C) en una mezcla
1:1 de suero salino (1 mL) y 1 mL de adyuvante de Freund incompleto
(Sigma Chemicals, Heidelberg, Alemania). A intervalos de 2 semanas
a 2 meses, se tomaron muestras de sangre por punción de la vena
yugular. El antisuero fue dividido en alícuotas y almacenado a
-20ºC hasta su uso posterior. Se seleccionaron muestras
especificadas para el desarrollo de un ensayo para la detección de
PPI en el producto final de insulina.
La insulina humana recombinante se produce a
partir de una proteína de fusión expresada en E. coli
transfectado. Durante la elaboración de insulina humana a partir de
la proteína de fusión desnaturalizada, la llamada PPI se forma como
intermedio. Esta última es tratada adicionalmente por escisión
enzimática catalizada por tripsina. La insulina heterodimérica de
dos cadenas se forma a partir de la PPI de cadena única por
escisión sincrónica en las posiciones secuenciales
-Arg-Arg- (B31-32) y
-Lis-Arg- (A-1-A0).
La insulina se produce por procedimientos de purificación
adicionales. Para el desarrollo de un inmunoensayo para la
detección de impurezas de PPl (<10 ppm) en el producto final,
son particularmente adecuados anticuerpos policlonales dirigidos
contra el péptido C, porque no hay reactividad cruzada
interfiriente de la insulina. En contraste, en el caso de
inmunización con PPI como antígeno, la mayoría de los anticuerpos
se dirigiría contra la insulina. Esta última no sería adecuada para
detectar cantidades mínimas de <10 ppm de PPI en presencia de un
exceso de insulina de 10^{6} veces.
Para evitar determinantes inmunogénicos similares
a la insulina en el péptido C usado, como -Lis o
-Lis-Arg- en la posición 34 ó 34-35
del péptido C, se ha preparado y usado péptido C de mono sin estos
aminoácidos básicos Arg- como péptido C de mono.
El procedimiento de inmunización, que incluye el
cambio desde el uso inicial de cFA a iCA, y el esquema de tiempo
corresponden a métodos normalizados descritos en la bibliografía
para la producción de anticuerpos policlonales dirigidos contra
antígenos y péptidos especificados.
Se presenta la documentación para el esquema de
inmunización y el muestreo de sangre para la preparación de
antisueros con anticuerpos policlonales contra el péptido C de mono
en una oveja. La cantidad de antígeno (péptido C de mono) se
disolvió en una mezcla 1:1 de 1,0 mL de suero salino 0,9% y 1 mL de
adyuvante, respectivamente. Se enumeran las fechas del muestreo de
sangre. El antígeno usado en el siguiente estudio fue péptido C de
mono; Lote no.:DJIII,- S43. El adyuvante inicial usado fue KFA
(Difco) Lote 70052LA. El adyuvante de recuerdo fue IFA (Sigma) Lote
96H8950.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
1. CuBler, K., Hartinger, J.: Gibt
es Alternativen zum Einsatz von Freundschem Adjuvans bei der
Immunisierung von Labortieren? Tagungsabschnitt "lmmunisierung
und Adjuventien" des 4. Ósterreichischen Intemationalen
Kongresses über "Ersatzund Erganzungsmethoden zu Tierversuchen in
der biomedizinisdhen Forschung", 24-26.
Septiembre de 1995 (Linz).
2. Bennett. B., Check, U.,
Olsen, M.R., Hunter, R.L.: A comparison of
commercially available adjuvants for use in research. J.
Immunol. Meth. 153, 31-40, 1992.
3. Finger, H.: "Das Freundsche Adjuvans-
Wesen und Bedeutung". In: G. Heyman (Ed.): Arbeiten aus dem
Paul-Ehrlich-institut, dem
Georg-Speyer Haus und dem
Ferdinand-Blum-Institut zu Frankfurt
a.M., Heft 60, Gustav Fischer Veriag, Stuttgart,
1964.
4. Fineberg, S.E., Galioway, J.A.,
Fineber, N., Goidman, J.: Effects of species origin,
purification levels and formulation on insulin immunogenicity.
Diabetes 32, 592, 1983.
Es sabido que la insulina es relativamente
insoluble en disoluciones neutras después de su cristalización o
secado por congelación. Con el fin de obtener disoluciones de
insulina de altas concentraciones, las sondas de insulina deben,
por consiguiente, ser disueltas primero en ácido (p.ej., ácido
fosforoso diluido o HC, cualquiera de los dos) y después de eso se
tiene que ajustar un pH alcalino (9,0-10,5) por
adición rápida de la cantidad apropiada de NaOH. El pH de trabajo
se ajusta después por valoración o añadiendo los tampones
respectivos. Este procedimiento descrito en términos generales
consume mucho tiempo, es engorroso, y requiere un cuidado
individual para cada sonda.
Para evitar este ceremonioso procedimiento, los
autores de la invención ensayaron diferentes protocolos para la
disolución de insulina. El objetivo era obtener disoluciones
transparentes de insulina con una concentración de 1 mg/mL y un pH
de 8,6 - 9,0.
- \bullet
- Un pH > 9 es favorable para mantener en disolución HIA1 e insulina en elementos de proceso (especialmente aquellos después de la escisión con tripsina) (el IP de la HIA1 es 7,4).
- \bullet
- Un pH < 9,0 es favorable para permitir una alta afinidad e interacciones antígeno-anticuerpo estables.
Los autores de la invención ensayaron diferentes
tampones adecuados en el intervalo de pH 8,0-9,5
con el fin de cribar una unión estable antígeno (HI PPI)/anticuerpo
a pH 9,0. Los tampones ensayados fueron: Tris, TAPS, Bicina,
GlyGly, BisTrisPropano, Ches, Fosfato/EDTA (como se usa en el kit
RIA de péptido C humano de Linco Research Inc.).
Además, se han analizado diferentes
concentraciones de tampón, mostrando que incrementar las
concentraciones de tampón al pH 9,0 dado da como resultado una
alteración gradual de la unión antígeno/anticuerpo.
A la vista de la discusión previa, los autores de
la invención seleccionaron cuatro tampones a una concentración de
20 mM para una comparación final:
- 1.
- Tris* (Merck - -108382),
- 2.
- TAPS** (Sigma T-5130),
- 3.
- Bicina*** (Sigma B-3876)
- 4.
- GlyGly**** (Calbiochem 3630).
Los autores de la invención prepararon estos
tampones disolviendo la cantidad necesaria de sólido en agua y
ajustaron el pH a 9,0 añadiendo la cantidad apropiada de NaOH.
Todos muestran una buena unión antígeno/anticuerpo en el intervalo
de pH de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 9,0.
Se disolvieron aproximadamente 0,5 mg - 0,8 mg de
muestras de insulina en HCl 10 mM, dando como resultado una
disolución de 10 mg/mL. Posteriormente, el material transparente
disuelto se diluyó adicionalmente 1:10 usando uno de los tampones
anteriores. El resultado se muestra en la siguiente Tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
En todos los ejemplos, el pH no se altera o es
influenciado sólo mínimamente después de la adición de la
disolución ácida de insulina. Sin embargo, para sorpresa de los
autores de la invención, sólo en tampón de Bicina se pudo obtener
consistentemente una disolución transparente de HIA1 o elementos de
proceso.
Por consiguiente, elegir el sistema amortiguador
de Bicina representó un descubrimiento importante en el
establecimiento de un procedimiento simple de disolución de
muestras y en la obtención de condiciones analito/tampón estables
durante el periodo de incubación del inmunoensayo.
Claims (3)
1. Un procedimiento para detectar o determinar
una impureza que contiene péptido C en una muestra de insulina
humana producida de manera recombinante o un derivado suyo, por un
ensayo no radiactivo, que comprende las etapas:
- (a)
- preparar una muestra de insulina humana producida de manera recombinante o un derivado suyo;
- (b)
- mezclar las muestras con tampón de dilución;
- (c)
- añadir un trazador de péptido C quimioluminiscente para competición con la muestra a la mezcla (b);
- (d)
- añadir anticuerpo específico para la impureza que contiene péptido C a la mezcla (c);
- (e)
- añadir bolas de poliestirol revestidas con anticuerpo secundario para capturar anticuerpos anti-péptido C de insulina de cabra, específico para la impureza que contiene péptido C, a la mezcla (d); y
- (f)
- detectar o determinar la presencia de la impureza que contiene péptido C,
en el que el procedimiento se
realiza a un pH de aproximadamente 8,5 a aproximadamente
9,0.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la impureza que contiene péptido C es péptido C,
preproinsulina o un derivado suyo, o una insulina que contiene
péptido C o un derivado suyo.
3. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el anticuerpo específico para el péptido C reconoce péptido
C de mono.
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