JPS6225263A - Ｃ反応性蛋白測定用の螢光偏光免疫分析法とそのための試剤 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は液体特に血清、プラズマ、を髄液、羊膜液およ
び尿のような生物学的流体中のリガンドを測定する方法
および該方法に有用な試剤に関するものである。更に詳
しくは本発明はＣ反応性蛋白の新規な螢光偏光免疫分析
法および該分析に有用な新規な試剤に関するものである
。

〈従来の技術〉 リガンドを測定するための競合結合性免疫分析は周知で
あり、試験試料中のりガントと標識された試剤（トレー
サーと呼ぶ）との間の、該リガンドおよびトレーサーに
特異な抗体−ヒの限られた数の受容体結合のず１の競合
にもとづいている。試料中のりガントの濃度は抗体に特
異に結合するトレーサーの量を決定する。生成するトレ
ーサー・抗体の錯体の量は定量的に測定することができ
、試験試料中のりガントの濃度に逆比例する。。

螢光偏光免疫分析技術は、螢光標識された化合物が面偏
光によって励起されるときその回転速度に逆比例する偏
光度をもつ螢光を放出するという原理にもとづいている
。更に詐１−＜は、螢光標識をもつトレーサー・抗体の
錯体のような分子が面偏光によって励起されると、放出
光は螢光体が光を吸収する時間と光を放出する時間との
あいだ回転を拘引されるため高度に偏光された状態にと
どする。「遊離」のトレーサー化合物（すなわち抗体に
結合していない化合物）が面偏光によって励起されると
きけ、その回転は対応するトレーサー・抗体の錯体の回
転よりも遥かに速く、それ故に放出光はずっと大きな程
度まで脱偏光される。従って螢光偏光は競合結合性免疫
分析において生ずるトレーサー・抗体の量を測定するた
めの定量的手段を与える。

螢光偏光技術は米国特許第４．４２０，５６８号（発明
者ワングら）に記載されており、螢光体としてトリアジ
ニルアミノフルロレセイン部分が使用されている。極々
の他の螢光標識化合物が当業技術において知られている
。たとえば、米国特許第３，９９８，９４３号には螢光
標識としてフル第１／ナイン・インチアネート（ＦＩＴ
Ｃ）を使用する螢光標識インシュリン誘梼体および螢光
標識として４−アミノフルオレセイン塩酸塩を使用する
螢光標撮モルフイン誘導体の製造が記載されている。カ
ルボキシフルオレセインも分析測定用に使用された。了
−ル・シー・チェノ１、Ａｎａｌｙｔ　１ｃａｌｌｅｔ
ｔｅｒ、　　１０，７８７　（１９７７）にホスホリパ
ーゼの活性を示すだめのカルボキシフルオレセインの使
用を述べている。ボギシフルオレセインはレシチン・リ
ボゾーム中にカプセルされたものとし、及びレシチンの
加水分解によって放出されるときにのみ螢光を発するも
のとして記載されている。米国特許第４，４７６．２２
９号（発明者フイノら）にも螢光偏光免疫分析の試剤と
して有用なカルボキシ・フルオレセインの一連のアミノ
酸アミド訪専体が記載されている。

前述のように、螢光偏光技術は溶液中の螢光標識出自１
１ノが面偏光に、ｒつで励起されるときにその分子の回
転弛緩時間に関係する偏光度をもつ螢光５召・放出する
という原理にもとついている。この分子回転弛緩時間お
よび従って螢光偏光応答・り強度は、化合物の分子の大
きさに直接比例する。

従って、面偏光が比較的高分子量の螢光化合物金倉む溶
液全通運するとき、放出光の偏光度は面偏光が低分子量
螢光化合物を含む溶ｉを通過するときよりも一般に大き
い。

螢光偏光原理は通常は分析物を含む（または分析物を含
むと思わｔする）試料を「トレーサー」すなわち分析物
に類似しているが面偏光に対して螢光偏光応答を生じう
る標識付き化合物と混合することによって分析中に利用
さする。

便宜上、分ｖＴ物は比較的低分子量の化合物すなわちめ
２．０００ダルトン未満の化合物である。この分設ｆ物
１ヨ・・よびトレーサーに特巽の抗体も混合物中にへ−
まｈる。トシ・・−ザーお・よび分析Ｊ　！７１は抗体
上の限られた数の受容体結合の椙を・競合して取りあう
。分析物およおトレー゛す−日・」、−そオ［ぞＪｔ−
ぞ−の濃度に比例し、ご抗体に結合するので、結合する
）Ｌ−一−ザー量は試料中の分析物の良度に逆比例する
。

分析浴液の面偏光にχ」する螢光１扁光応答ζ′、ｉ遊
離トシ一一す−と結合トレーサーとの間の分子の大きさ
の相違のために遊離および結合トレーサーの相対量の定
量的指標を与えることが知られていたので、螢光偏光の
原理は成功裡に利用された。遊離トレーサー（すなわち
抗体に結合していない溶液中のトレーサー）にトレーサ
ー抗体の錯体に比べて一般に分子量が比較的小さく、従
って短い回転弛緩時間を示す傾向があるので、入射する
面偏光は脱偏光される。これに対して結合トレーサーと
相互作用する面偏光に大きな抗体−トレーサーが光の吸
収時間と光の放出時間との間にごく僅かしか回転しない
ために高度に偏光した状態を保つ傾向がある。

然しなから、螢光偏光技術は比較的低分子量の分析物の
測定に対してのみ合理的な成功を伴なって利用されたに
すぎなかった。抗体の受容体の場を有効に競合させるた
めに、使用するトレーサーは分析物にはぼ類似していな
ければならないので、このような場合のトレーザーそれ
自体は比較的大きく、そして面偏光の偏光を保持する傾
向がある。トレーサーと１〜でフルオレセイン標識の化
合物を使用して競合結合性免疫分析を行なうとの試みは
、トレーサーが遊離状態であるときと特異抗体に結合し
ているときとの観察される偏光の実質的相違のために一
般によく行なわれる。

０．０２（遊離）から０２０（結合）への偏光単位の変
化が多くのこのようなトレーサーの代表例と考えられる
。

大きなトレーサー分子が抗体に結合しているときは、遊
離トレーサーによって生じる応答に比べて螢光偏光応答
には目だった相違ンま一般に存在せず、従って比較的大
きな分子量の分析物すなわち約Ｚｏｏ、０００ダルトン
より大きい程度の分析物を測定することが従来望１れて
いた場合には、別の分析技術たとえば比濁分析を考える
ことが必要であった。高分子値（約ｉｏ、ｏｏｏダルト
ンより大きい）物質の定量化に螢光偏光免疫分析金利用
したいくつかの例を見出すことができる。このよ・うな
分析を実証しているいくつかの文献はＨ，−＜エダのＣ
１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　　２４　：　２１３９（１９７
８）；Ｗ、Ｂ、ダンドライカーらのＩｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｉ−ｓｔｒｙ　　　１０：２１９（１９７３）；、お
よびＳ、Ａ−レピソンらのＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
９９　：　１１２９　（１９７６）である。然しなから
、比較的低い分子量の蛋白（１００，０００ダルトン未
満）の偏光分析についてのこれらの記載の注目すべき特
徴はトレーサーが抗体に結合しているときに比べて遊離
の状態にあるときには小さい偏光変化が観察されたこと
である。代表的には０．０１５〜０．０４５の偏光単位
においてのみ偏光の変化が観察された。

これに対して、この記載中に述べられているＣＲＰ／フ
ルオレセイン結合体（Ｍ、Ｗ、　１２０，０００ダルト
ン）は０．１０偏光単位よりや＼大きい偏光変化を示す
。

比濁分析技術は大きな分子を含む溶液または懸濁粒子か
ら散乱する光を測定するための満足すべき手段を提供す
ることが見出された。これらの技術によれば、入射光は
溶液を通過１〜、入射光の一部が散乱し、次いで散乱光
が測定される。これらの技術はたとえば免疫沈殿分析を
行なうときに利用された。このような分析において、抗
体は分析物にまで高められ、しばしば大きな三次元格子
を形成する。とれらの格子は溶液の光散乱性を増大させ
る。

たとえば米国イリノイ州アボット・パークのアボット・
ラボラトリーズから商業的に入手しつるＴＤＫ■螢光偏
光分析器は螢光偏光分析の自動化能力を与え、そして機
器のわづかな変更で比濁分析ならひに他の分析系の自動
化能力も与える。然しなから、大きな分子を測定するの
にも螢光偏光技術を実施しうるようになし、とりわけて
比濁分析ならびに螢光偏光分析を併せ行なえるようにす
るために必然的になすべき変更を不必要にすること、す
なわち比較的容易に入手しうる変更していない分析機器
を使用して大きな分子量の分析種の分析を行ないうるよ
うにすること、が望１しく且つ有用である。

Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）は大きな分子量の分析種であっ
て、その測定を螢光偏光技術で行なうことができこれに
よって比濁分析その他の複雑な分析系を必要としなくな
れば有利である。ＣＲＰは肝臓細胞によって合成される
プラズマ蛋白であり、健康な人体の血清中に痕跡量で存
在する。このものは急性相蛋白であり、急性のけがの数
時間に、あるいはほとんどの種類の感染または炎症のは
じめにその合成速度および人体中の蓄積は著るしく増大
し、その結果として血清中の濃度が上昇する。その上昇
量は組織損傷のひどさと良く相関することがわかってい
る。

血清ＣＲＰｎ度の正確な測定は多くの疾患の敏感な指揮
を臨床医に与える。これは疾患の初期判断と治療に対す
る応答の検査の双方に価値がある。然しながら、ＣＲＰ
分析は大多数の試験管内診断試験とは異なったカテゴリ
ーに入る。なんとなればＣＲＰ濃度は所定の疾患の状態
の指標を与えるよりはむしろ、有機体疾患のスクリーニ
ング試験および診断が知られているときの疾患活性の指
標を与えるものだからである。

ＣＲＰ分子（分子量１２０，０００）は５個の同じ非グ
リコジル化ポリペプチド・サブユニットから成る。広範
囲の穐々のリガンドに結合するＣＲＰの能力はその生体
内機能にとって恐らく重要である。従ってＣＲＰｆ′ｉ
、ｍ々の免疫学的方法によって検出し定量化するのが常
法である。ＣＲＰとニューモコツカルＣ多抛類との間の
相互反応にもとづく試験、および抗ＣＲＰ血清を使用す
る毛管沈殿法は周知である。最も簡単な最近の方法はラ
テックス膠着法であり、そこでは抗ＣＲＰ抗体を被覆し
たラテックス粒子を血清中のＣＲＰで膠着させる。非常
に感度がよく（検知限界約５ｍｑ／ｌ）且つ迅速である
けれども、このラテックス試験は定性的であるにすぎず
、技術的問題および干渉を受ける。

従ってこの試駆法は正確な定量的方法によって達成され
るような価値ある情報を提供するものではない。

放射免疫拡散および１に気免疫分析の古典的免疫化尊技
術はＣＲＰを正確に且つ好適な感度で測定するために使
用しつるけれども、これらの方法は日常作業に供するに
は遅くて技術的に問題がある。理想的には、ＣＲＰ分析
は迅速で技術的に簡単であり、正確な結果をもたらし、
大規模使用のだめの自動化を行ないうるものであるべき
である。多数のこのような装置は均一酵素、埜光免疫分
祈または等級免疫比濯分析のいづれかにも′とついて商
業的に入手しうる。

然しなから、従来は螢光偏光免疫分析によってＣＲＰを
経済的に、容易且つ簡単に定温゛することは、前述の如
＜ＣＲＰ分子の比較的大きい寸法のためにこのような技
術が拘束を受けるという理由で知られていなかった。

〈発明が解決しようとする間顆点とその解決手段〉本発
明は生物学的試料中のＣＲＰの存在量を検出するための
技術に進歩を与えるものである。本発明はＣＲＰの螢光
偏光免疫分析およびその分析に有用な試剤を包含する。

特に本発明は前述の螢光イ６１光免疫分析の牙１１点を
与λ、ＣＲＰ濃度の新規な測定法を提供するものであり
、次の（ａ）および（ｂ）の工程から成ることｒ特徴と
する試料中のＣＲＰの測定法を包含する： （ａ）ＣＲＰに対するリガンド類似体く該リガンド類似
体は共迫の抗体もしくは他の受容体の結合性の場によっ
て特異的に識別しうるように該リガンドと共通の最大１
個のエピトープをもつ）をもつ螢光トレーサーおよび該
リガンドおよび該トレーサーを特別に識別しうる抗体を
試料と混合してトレーサー・抗体錯体を生成させ、（ｂ
）　　工程（ａ）によって生成させたトレーサー・抗体
錯体の量を試料中のりガントの濃度の尺度として螢光偏
光技術によって測定する。

更に本発明は上記の方法に有用なある種の新規な試剤も
包含する。

定義 ここで使用するｌ’Ｊガント」とは受容体もしくは抗体
のような結合性蛋白かえられるか又は生成されうる分子
をいう。

本発明において興味のあるリガンドはＣＲＰである。こ
のようなハプテンは動物に注射したとき抗体生成を誘起
しないが、抗体に対しては反応性のある一般に低分子量
の蛋白非含有化合物である。ノ・ブテンに対する抗体は
該ノ・ブテンをまず蛋白と結合させ次いでこの結合生成
物と動物に注射することによって一般に生成される。

ここでいう「リガンド類似体」とけその実質的部分が該
リガンドと同じ空間的および極性の組織をもっていて受
容体の結合性の場についてリガンドと競合しうる１つ又
はそれ以上の決定因子もしくはエビトビツクの場を形成
している一価もしくは多価の基をいう。このようなりガ
ント類似体の特性はそれが関心のあるリガンドに対して
十分な構造上の類似性をもっていて該リガンドに対する
抗体によって識別されることである。大部分について、
リガンド類似体は分子表面の有意義な部分について関心
のあるリガンド（本発明の目的にとってはＣＲＰ）と同
じ又は実質的に同じ構造および電荷分布（空間的および
極性の組織）をもつ。

多くの場合、ハブテンの結合性の場はリガンドに結合さ
せるためにトレーサー中に使用するものと抗体製造用抗
原の製造において同一であるので、抗体用テンプレツ）
ｋ与えるリガンド類似体の同じ部分がトレーサー中のり
ガント類似体によって露出される。

本発明はフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体の
使用を包含する。特に、トレーサー化合物の有用性にと
って必要なフルオレセインおよびその誘導体の性質は、
フルオレセインの螢光性部分である。これらの化合物は
適切な波長の偏光によって励起されたとき螢光応答を与
えて螢光偏光測定の実施を可能ならしめる。一般に、本
発明によって提供される分析法において使用するトレー
サー化合物はナトリウム、カリウム、アンモニウムなど
のような生物学的に許容される塩として溶液中に存在し
、このものは本発明の分析法で使用するとき該化合物を
開環、螢光形体で存在させる。存在する特定の塩はｐＨ
水準を調節するのに使用する緩衝液に依存し、だとえは
リン酸す）　ＩＪウムの存在下では本発明に使用する化
合物はナトリウム塩として開環形体で一般に存在する。

本発明に使用するのに好適々化合物としてたとえばカル
ボキシ螢光フルオレセイン・インチオシアネー）（ＦＩ
ＴＣ）、トリアジニルアミノ　フルオレセイン（ＤＴＡ
Ｆ）および前述の従来技術に記載されているものを含め
て画業技術において周知の他の多くの化合物があげられ
る。使用するための特定の螢光トレーサーの選択は日常
作業の選択事項であり、本発明の実施にとって臨界的な
ことではない。

螢光偏光免疫分析 本発明の方法によれば、ＣＲＰを含む試料をトレーサー
およびＣＲＰと該トレーサーに対して特異の抗体と混合
する。試料中に存在するＣＲＰ、およびトレーサーは限
られた数の抗体の場を競合してとりあい、その結果とし
てＣＲＰ抗体の錯体とトレーサー・抗体の錯体が生成す
る。トレーサーおよび抗体の濃度を一定に保つことによ
って、生成したＣＲＰ抗体の錯体とトレーサー・抗体の
錯体の比率は試相中に存在するＣＲＰＯ量に正比例する
。従って混合物を偏光で励起してトレーサーおよびトレ
ーサー・抗体錯体によって放射される螢光の偏光を測定
すると、試料中のＣＲＰＯ量が定量的に決定される。

抗体に結合していない溶液中のトレーサーは吸収に必要
な時間より短い時間に回転が自由であり、再放出光が比
較的ランダムに配位され、従って抗体に結合していない
トレーサーの螢光偏光は低く、ゼロに近い。特定の抗体
に結合すると、生成するトレーサー・抗体の錯体は比較
的小さいトレーサー分子の回転よりもおそい抗体分子の
回転をとり、これによって観察される偏光が減少する。

従ってリガンドが抗体の場についてトレーサーと競合す
ると、遊離トレーサーとトレーサー・抗体の錯体との生
成混合物について観察される螢光偏光はトレーサとトレ
ーサー・抗体錯体との中間の値をとるう試料が高濃度の
りガントを含んでいると、観察される偏光値は遊Ｎ＞　
’）カントの偏光値に近く、すなわち低い。試＠試料が
低濃度１ノガンドを含んでいると、その偏光値は結合リ
ガンドの偏光値に近く、すなわち高い。免疫分析の反応
混合物を垂直に次いで水平に偏光で逐次励起して放出光
の垂直偏光成分のみを分析することによって、反応混合
物中の螢光の偏光を正確に決定することができる。

決定すべきリガンドの偏光と濃度との間の正確な関係は
既知濃度のキャリブレータの偏光値を測定することによ
って確立される。リガンド濃度はこのようにして調製し
た標準曲線から補間することができる。

本発明の方法を実施する際のｐＨはトレーサーをそのイ
オン状態で存在させるに十分でなければならない。この
ｐＨは約３〜１２の範囲にあること−Ａ；アへ、更に好
ましくは約５〜１０であり、最も好才しく；よ約６〜９
である。分析操作中のｐＨを達成し保持するために神々
の緩衝液を使用することかできる。代表的か緩衝液とし
てホウ酸塩、酢酸基、リン酸塩、トリス、バルビタール
などがあげられる。使用する特定の緩衝液は本発明にと
って臨界的ではカいが、個々の分析において使用する抗
体および測定すべきりガント全溝ｊζ土、て特定のぜ衝
液全１す用するのが好１１〜い。緩衝液のカチオン部分
は溶液中のトレーサー塩のカチオン部分を一般に決定す
る。本発明の方法は温和な温度で且つ好１しくけ一宇温
度で実ＥＩＩされる。温度は通常約り℃〜約５０℃、更
に好ましくは約り４℃〜約４０℃の範囲にある。

本発明により分析することのできるＣＲＰ濃度は一般に
約１０−２〜約１０−１３モル、更に好ましくけ約１０
−４〜約１０−１０モルの範囲で変化する。これより高
ｅｔ￥のＣＲＰはもとの試料を希釈して分析することが
できる。

ＣＲＰの像度範囲の外をτ、分析が定性的、半定量また
は定量的であるか否かという考慮、使用する装置、なら
びにトレーサーと抗体の特性、が一般的にいって使用す
るトレーサー塩−と抗体の濃度を決める。試料中０ＣＲ
Ｐの濃度範囲は他の試剤すなわちトレーサーおよび抗体
の濃度範囲を決めるけれども、通常は分析の感度を最適
化するために、個々の試剤濃度が経験的に決められる。

トレーサーおよび抗体の適切な濃度は当業者によって容
易に確かめられることである。

本発明の一部を構成するわけではないが、本発明によっ
て提供されるＣＲＰの螢光偏光免疫分析は米国イリノイ
州アボット・パークのアボット・ラボラトリ−から商業
的に入手しうるＴＤＸ　（登録商標）螢光偏光分析器上
で本発明による試剤と分析法を使用して有利に行なうこ
とができＳ。

上記の分析器の操作と將徴に関する詳、１ｊＩＩはアボ
ット・ラボラトリーズから入手することができる。

前述の如く、遊離トレーサー（フルオレセイン標識蛋白
）と結合トレーサー（フルオレセイン標識蛋白・抗体の
錯体）との間の観察される偏光の差は許容しえないほど
低いでちろうという一般に受は入れられた概念のために
、螢光偏光免疫分析の試みは蛋白のような高分子量物質
の定量には従来商業的に利用されなかった。本発明の開
発に際して、このようなことはフルオレセイン標識ＣＲ
Ｐをヤギ、ウサギ、寸たはヒツジの抗ＣＲＰ抗血清で培
養するときには事実ではないことが発見された。フルオ
レ上１′ン標識ＣＲＰを過剰の抗ＣＲＰ抗血清で培養す
るとき、０．１００単位以上の偏光変化（再現性は０．
００３）が観察された。この観察された偏光変化はヒト
の血清またはプラズマ中の高濃度ＣＲＰの定量について
の均一螢光偏光免疫分析の開発全可能ならしめるに十分
な強度であることが予電外にも発見された。

螢光偏光免疫分析におけるトレーサー＝として十分に良
く働（ＣＲＩ）、／フルオレセイン結合体ＩＨ造する際
にいくつかの考慮が必要であるう考慮きれなければなら
ない重要な因子の中には次の事屓がある。

１）蛋白を変質させることなしに、または蛋白の主要な
抗原因子を遮へいすることなしに誘導しうるＣＲＰ蛋白
の官能基（すなわち構成アミノ酸残基）。

２）ＣＲＰ十のフルオレセイン置換度。

３）蛋白の面及び結合フルオレセインの吸収／放出双極
子の間のスペーサ腕の長さ及び柔軟性。

本発明に関連する実験は、ＣＲＰのアミン基に主として
結合ゴるフルオレセイン誘導体が最少量の蛋白変性およ
び／−！たけ交差結合および沈殿しか生せしめずに分析
性能という意味で好ましいトレーラ−をもたらすという
事実およびＣＲＰ分子に結合したとき最大の分析スパン
を達成するという意味で最良のトレーサーを与える最適
数のフルオレセイン分子が存在ブるという事実を示した
。この最適の置ＰｉはＣＲＰ１モル当り約１〜２モルの
フルオレセインである。また更なる実験は、たとえば前
述のＤ　Ｔ　Ａ　Ｆ／ＣＲＰ結合体におけるようにＣＲ
Ｐにフルオレセインに結合させる三官能トリアジン環が
最乎のスペーサ腕の長さと剛性を与え、それ故フルオレ
セイン標識ＣＲＰトレーサを製造するのに使用するため
に最も好ましいことを示した。

従って、５（４，６−シクロロトリアジンー２−イル）
−アミノフルオレセイン全適切な条件下でヒトＣＲＰと
反応させるときに、本発明による螢光偏光免疫分析にト
レーサーとして使用するのに好適なフルオレセイン／Ｃ
ＲＩ−’結合体かえられるという事実を見出した。これ
を連成するための一般の好ましい操作法は次のとおりで
ある。

１）ヒトＣＲＰ　’ｘ　２　”ｊ　／　ｍｌ”（７Ｊ）
濃度でｐＨ８，５の０．１Ｍホウ酸塩緩衝液にとかｔ。

２）　　Ｄ　Ｔ　Ａ　Ｆ　ｋ　１■／−の濃度でジメチ
ルホルムアミドにとかす。

３）十分なりＴＡＦ溶液をＣＲＰ溶液に加えてＤＴＡＦ
／ＣＲＰが２０／１モル以上になるようにする。この反
応混合物を旋回させ、室温で２時間数ｆｆｉする。次い
で反応混合物をセファデックスＧ−２５の知いカラム上
でクロマトグラフ処理して未反応ＤＴＡＦを除く。空隙
容積中で溶離する螢光物質はＤＴＡＦ／ＣＲＰ結合体で
ある。

リン酸塩緩衝食塩水に対するこの結合体の透析は十分な
純度ノドレーサーを与え、このトレーサーは緩衝液で希
釈して、血清もしくはプラズマ試料中の未標識ヒ）ＣＲ
Ｐの定量のだめの螢光偏光免疫分析に直接使用される。

〈実施例〉 以下に述べる実施例は本発明の概念に従って行なった且
つ螢光偏光技術を使用するＣＲＰの分析に関する実験を
述べるものである。このような分析は次の一般操作法に
従つて行なうことができる。

１）標準血清または試験血清を試験管に入れて緩衝液で
希釈する。

２）既知濃度のトレーサー（任意に表面活性剤を含む）
を次いで各試験管に加える。

３）既知濃度の抗血清をこれらの試験管に加える。

４）反応混合物を室温で培養する。そして５）抗体に結
合したトレーサーの量を試料中のりガントの量の尺度と
して螢光偏光技術によって測定する。

ＣＲＰの螢光偏光免疫分析は従来技術の比濁分析におい
て通常必要とするような事前の試料予備処理なしに、且
つ放射状免疫拡散、放射能免疫分析または酵素免疫分析
技術よりもずっと短い時間でＴＤＫ分析器上で行なうこ
とができる。その上、本発明の試剤は安定であり製造が
比較的に容易であることがわかった。本発明の原理は非
自動化分析に十分に適用しうるけれども、ＴＤＸ分析器
の自動化性は分析の遂行およびデータの解釈を最小の時
間で行なうことを保証する。

実施例１ ヒトＣＲＰのプロトタイプの一般均一螢光偏光免疫分析
を本発明に従って次のように行なった。

試剤： １）ヤギの抗ヒトＣＲＰ抗血清 ２）好適な緩衝液中に希釈したＤＴＡＦ標識ＣＲＰ　（
前述のとおり） ３）血清中の既知濃度のＣＲＰによるキャリブレータプ
ロト　タイプ分析の操作法 ヤギの抗ヒ）ＣＲＰ抗血清の適当な希釈物１．８ｍ６を
６本の１２ｍＸ７５＋ｅｉの使い捨て試験管のそれぞれ
に加えた。

それぞれ０ＣＲＰキヤリブレータの２μを当量をそれぞ
れの試験管に入れ、次いで旋回させた。抗血清による試
料の培養を１０分間行ない、この期間中に背景の螢光の
読みを各試料について行ないＴＤＸ分析器のコンピュー
タ記憶装置に貯蔵した。

それぞれのキャリブレータ試料をそれぞれの抗血清希釈
物に加えてから１０分後に、適切な濃度のＤＴＡＦ／Ｃ
ＲＰ結合体トレーサー２５μｔをそれぞれの試料に加え
た。これらの試料をよく混合して更に８分間放置し、そ
の後に分析器中で各試料を逐次読みとった。とのＴＤｘ
分析器は背景の螢光を自動的に控除して各試料の補正偏
光値をプリントすることのできるものである。

実施例２ シアノーゲンブロマイド活性化セファローズと共有結合
したニュー上コツカルＣ−多糖類上でのカルシウム依存
親和性クロマトグラフにより悪性腹水症の流体および肋
膜流体からＣＲＰをえた。次いでこれ金カル７ウムイオ
ンの存在下ウルトラゲルＡｃＡ４４（アクリルアミド−
アガロースのビーズ）上でゲル沢過し、モレキュラーシ
ーブ・クロマトグラフを組み合せてアガロースに対する
その親和力により夾雑ＳＡＰを除去した。残存する痕跡
蓋の夾雑物はセファローズ上で不溶化した抗−正常ヒト
血清および抗ＳＡＰ抗体を用いる免疫吸収により除去し
、そしてセファローズＣｏｎ　　Ａを用いる吸収により
グリコ蛋白を除き、ブルーセファローズによりアルブミ
ンを除いた。セファクリルＳ−３００上での最終ゲル濾
過の後に、はじめのＣＲＰの３５〜４０係が実質的に純
粋な状態で回収された。

ＣＲＰ抗血清の製造 完全なフロイント助剤中で乳化した単１ｉＦｌｌｃＲＰ
の深部皮下注射もしくは筋肉内注射により、次いで２週
間ごとの又は１ケ月ごとの不完全助剤中乳剤の爾後の注
射により、ヒツジおよびヤギを免疫にした。それぞれの
注射は少なくとも５００μ？０ＣＲＰを含んでいた。こ
の一連の注射はすべての動物について５ケ月間行ない、
そのあいだ２週間毎に、又は１ケ月ごとにこれらの動物
を検査して抗体滴定値を調べたつこの滴定値の検査をつ
づけながら、上記の爾後の注射を３ケ月間中断した。こ
の３ケ月の休止の後に、滴定値が低下し始めたので爾後
注射を再開した。

トレーサー合成　ＤＴＡＦ／ＣＲＰ ５−（４，６−シクロロトリアジンー２−イル）アミノ
フルオレセイン（ＤＴＡＦ）のストック溶液を給体エタ
ノール中で鹸化により２■／−の濃度で調製した。０．
００５モルのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９，０）、０．００
２モルのＣａＣ１４および０．９％ＮａＣ１の中に３＋
＋ｙ／＋ｎ！、の濃度で含まれるストックＣＲＰを０．
０４モルのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９，０）、０．００２
ＭのＣａＣｌ２および０．９％ＮａＣ１中で５ｏｏｐｙ
／ｍｔの濃度にした。このＣＲＰ溶液（５００μ２７勺
）の１−に、２５μｔのストックＤＴＡＦを加えた。次
いで暗室で混合しながら室温で１時間、結合反応を行な
った。１時間の終りに、０．０４モルのホウ酸塩緩衝液
（ｐＨは上記と同様に９．０）中で調製した１０％グリ
シン５０μｔを加えてＤＴＡＦ反応を停止させ、そして
上記条件で１５分間混合しながら培養した。この結合体
をセフホデツクスＧ−２５上でクロマトグラフ処理し、
ｐＨ９，０のホウ酸塩緩衝液（上記と同じ緩衝液）で溶
離し、空隙容積に集めた。次いでこれを所望濃度に希釈
してＴＤＫ分析器上での自動化分析での使用に供した。

自動化Ｃ反応性蛋白分析の試剤、キャリブレータおよび
対照標準 トレーサー：ストックＤＴＡＦ／ＣＲＰ結合体を蛋白お
よび塩の安定剤ならびに保存剤としての０．１％ＮａＮ
３を含む緩衝液中で希釈して、ＴＤＸ分析器上２０の取
得において３０００の正味強度読みを与えるものとした
。

抗血清：原料ＣＲＰ抗血清の希釈剤を１：１０〜１：１
００において希釈した。それぞれの希釈液２５μｔをキ
ュベツトに加え、０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，
５）、０．０１％のウシーγエチレングリコーグロブリ
ン（ＢＧＧ）、０．１チＮａＮ５および２％（容量基準
）から成る２−の最終容量で２５μｔのトレーサー試剤
により培養した。抗血清とトレーサーは上記の緩衝条件
で３５℃において３．４分間反応した。希釈係数は測定
される螢光偏光の基準となる抗血清について決定した。

′次いで抗血清試剤を決定された希釈係数に従って原料
抗血清を希釈することによって上記のリン酸塩緩衝液中
で調製した。

予備処理 予備処理（ポツパー）試剤は０．０５モルのトリス（ｐ
ＨＳ、Ｏ）、保存剤としての０．１４　ＮａＮ５、およ
び他の有機安定化溶媒中のアニオン表面活性剤の溶液か
ら成るものでちった。

緩衝液：　ＴＤＸ分析緩衝液は０．１モルのリン酸塩（
ｐＨ７，５）、０．０１％のウシ−γグロブリン（ＢＧ
Ｇ）および保存剤としての０．１％ＮａＮ５から成るも
のであった。

キャリブレータ：蛋白および塩の安定剤ならびに保存剤
としての０．１１　ＮａＮ５を含む緩衝合成血清マトリ
ックス中にＣ反応性蛋白を入れた。

対照標準：（キャリブレータと同じマトリックス中に含
まれる）。

ＤＴＡＦ／ＣＲＰトレーサー用の安定化用媒質試剤の組
成トリグモ・ベース（トリス）　　　　　　１２．１１
　　　　（０，１モル）Ｎａ２　ＳＯ４（無水）　　　
　　　　　２０．０　　　　（２％）オバルブミン加水
分解物　　　　　　５．０　　　　（０，５％）プロピ
レン　グリコール　　　　　　　２０．Ｏ＋＋ｔ／　　
　（２容量％）ＣａＣ１ｚ・２ＨｚＯＯ，２９４（０，
００２モル）ＮａＮ３１．０　　　　　（０，１％　）
６Ｎの）ｉｃｌでｐＨ′ｆｒニア、　０に調節。

上記処方の許容変化： ｐＨ範囲６〜８゜ ４チおよび０．２％のオバルブミン、　ｐＨ７，０にお
けるＮａｚ　ｓ　０４　ｆｌＡＵ。

２チプロビレングリコールの代りに２チエチレングリコ
ールを使用。

１’Ｊａ２　Ｓ　（）４　　の代りに（Ｎ）１４　）２
８０４　　ｋ使用、オペＡブミンスノロ水分解物の代り
にオバルブミン金使用・）上記の処方はＣＲＰ−ＤＴＡ
Ｆ結合体を４５℃で１０［」間滅菌し、キャリプレー、
夕／対照標準の試剤を安定化することがわかった。

成　　分　　　　　　　濃度ｙ／ｌ　　その他トリグモ
・ベース（トリス）　　　　　　１２．１１　　　　（
０，１モル）Ｎａｚ８０４　　　　　　　　　　　　　
　　８．０　　　　　（８，０％）オバルブミン加水分
解物　　　　　１０．０　　　　　（１−０φ）（：’
ａ（’ｌ、−２Ｈ２００，２９４（０，００２モル）Ｎ
ａＮ、　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　　
　　（０，１％）６ＮのＨＣＩ　でｐＨを８，０に調節
。

上記処方はＣ反応性蛋白を４５℃で３０日間安定化する
ことがわかった。

予備処理試剤の組成 トリス　　　　　　　　　　　０．０５モル　　　　　
６．０６ｆＮａＮ３０．１　％　　　　　　　　１．０
０９２−プロパツール　　　　　　　１０容量％　　　
　１００．０ｍｊＤＭＳＯ２０容量％　　　２００．Ｏ
Ｌｌ＋７！プロピレングリコール　　　　　５容量％　
　　　　２０．０ｍ／（６０チストック濃度において） ６ＮのＨＣＩでｐＨを８．０に調節した。この予儂処理
組ｈシフ物は８０だｌのＣＲＰ分析試料容量を使用しな
がら２０■／ｄのバイラルピン（１３ｉ１ｉｒｕｂｉｎ
　）濃度においてバイラルピン干渉をなくすのに有効で
あることがわかった。

分訪操作 ＣＲＰの螢光偏光免疫分析（ＦＰＩＡ）全１’Ｄｘ螢光
偏光分析器、上で次のように行なった。反応順序、培養
、タイミンク、試剤容量および試料容量はプログラムし
た分析パラメータによりマイクロプロセッサ制御した。

ＣＲＰ分析を行なうために試料および試剤をＴＤＸ分析
器のそれぞれの容器に入れた。試料、抗血清、ポツパー
　（予イ６；、処理試剤）および緩衝液を反応井戸に分
配した。希釈試料の最終容量の−１ｋ最終反応容５［の
＋を与えるに十分な緩衝液と共にキュベツトに分配した
。試料、抗血ＣＩ７およびポツパーの混合物について背
景強度の読みをとった。希゛釈試料の第２の７をトレー
サーおよび緩ｍ液と共にキュベツトに分配して２ｍｌの
最終８情を与えた。次いで最終の強度ツ（１１定を行な
った。

ＴＤＸ／ＣＲＰ操作法を遂行するための峙定の分析順序
は次の諸工程から、成るものであった。

１、　８．６μｔの試料を反応井戸に分配し、２５μｌ
の緩偵ｊ必ケ加える。

２、１０μｔのホッパー試剤および２５μｔの抗血清試
剤を反応井戸中の試料に加え、そして４３１．４μｔの
緩衝液を加えて最終の反応井戸容量を５００μｔにする
。

３、　　追加の２５μｔのポツパー試剤全キュベツトに
分配する。

４、反応井戸に含まれる試料、抗血清およびポツパーの
混合物１７４１ｔｔをキュベツトに移し、７７６μｔの
緩衝液で希釈して１０００μｔの中間キュベツト容量を
得る。

注：工程１〜４はそれぞれの試料についてくりかえし、
１つの試料につき１８４秒で達成させる。

５、キュベツト内容物を３４℃で６．４分間培養し、こ
のあいだに各試料について背景の読みを３６４分でとり
、貯蔵する。

６　背景の読みをとった後に、試料、抗血清およびポツ
パーの混合物の追加伝１７４μｔを反応井戸からキュベ
ツトに移し、２０μｔの緩衝液を加える。

７、２５μｔのトレーサー試剤をキュベツトに加え、十
分な緩衝液（６０１μｔ）を加えて最終キュベツト容量
を２−にする。

８、最終のキュベツト反応混合物を３．４分間培養し、
各試料について最終の読みをとる。

９、ブランクの読みを最終の読みから差引き、正味の偏
光の読みを各試料について報告する。

１０、既知のＣＲＰ濃度のキャリブレーションによシ予
め作成したキャリブレーション曲線から誘導された４個
の貯蔵された数学的常数を利用することによって、正味
の偏光の読みをＣＲＰ濃度に変換する。この４個の常数
はＴＤｘ分析器に付随するデータハンドリング・システ
ムの部分である最小自乗曲線適合の４個のパラメータ・
プログラムによって決定される。

上述のような本発明により遂行される分析を利用して、
２．１０および２０■／ｄ／ＣＲＰの適正濃度を与える
ために通常の水準のＣＲＰを含む試料に加えたＣＲＰの
回収はそれぞれ１００チ、１００チおよび９９，６％に
あった。

やや高い水準のＣＲＰを含む他の２つの試料に、１０■
／ｄ／の適正濃度を加えた。これらの試料からの回収は
９８．９チおよび９７．４％であった。これらの結果を
下記に要約する０ ０．１５　　　　　　１１９　　　　　Ｚ３４　　　１
０００．１５　　　　　１０．９６　　　　１１．１１
　　　１０００．１５　　　　　２１．９’２　　　２
１．９９　　　　９９．６１．７３　　　　　　９．５
５　　　　１１．１７　　　　９８．９１．６８　　　
　　　９．５５　　　　１０．９８　　　　９７．４他
の方法との相関： ＣＲＰ試験を必要とする患者集団から１去ケ月の期間に
わたってヒト血清試料を集めた。商業的比濁分析法を使
用して病院で各試料のＣＲＰ値をえた。試料を凍結して
輸送し、次いで前述の本発明０ＣＲＰ分析によって試験
した。

両者の方法からの患者の結果を線状回帰分析によって比
較した。試験した３４５の試料について次の結果が示さ
れた：相関係数＝０．９９２ 傾　　斜＝０．９７６ ｙ切片＝３．０μｆ／− 地方病院でフィールド研究を約２週間行なった。この期
間中、３つの方法ずなわち比濁分析（ＮＰＭ）　、放射
状免疫拡散分析（ＲＩＤ）および前述の本発明による分
析（ＴＤｘＣＲＰ）を使用して、７０個の試料を試験し
た。

３つの方法からの相関データは次のように要約される。

比較した方法　　　　　　　傾斜　　切片　　ｒＴＤｘ
　ＣＲＰ対ＮＰＭＣＲＰ　　　１．０６−０．１７　０
．９９ＴＤＸ　ＣＲＰ対ＲＩＤ　ＣＲＰ　　　Ｏ，９７
０，４００，９９ＮＰＭ　ＣＲＰ対ＲＩＤ　ＣＲＰ　　
　Ｏ，９１０，５００，９８分析感度 検知限界０．３■／ｄ／は２０回の「ゼロ」キャリブレ
ータのくりかえしのミＩＪ偏光（ｍＰ＞平均からとった
２つの標準導関数にもとづくものであった。えられたｍ
ｐを次いでキャリブレーション曲線から読みとり、０．
３■／ｄ／のＣＲＰ濃度に相補することを見出した。

Ｘ２゜＝２７０．５５　　ｍＰ 標準導関数　　　”　　　０．５２９ｍｐ標準導関数（
２つ）＝　１．０６ｍＰ＝０．３！／ｄ／特許請求の範
囲によってのみ規定される本発明の精神と範囲から逸脱
することなしに、前述の本発明の具体的開示から種々の
変化と変形が描業者によってなしうることは明らかであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体試料中のＣ反応性蛋白の存在もしくは濃度を測
   定する方法であつて、該試料をＣ反応性蛋白と共通の少
   なくとも１つのエピトープをもち、共通の抗体もしくは
   受容体の結合性の場によつて特異的に識別されるように
   なつている螢光トレーサーならびに試料中のＣ反応性蛋
   白および該トレーサーを特異的に識別しうる抗体の溶液
   と混合し；そして該抗体に結合しているトレーサーの量
   を試料中のＣ反応性蛋白の量の尺度として螢光偏光によ
   つて測定することから成る方法。 ２、Ｃ反応性蛋白と共通の少なくとも１つのエピトープ
   をもち、共通の抗体もしくは受容体の結合性の場によつ
   て特異的に識別しうるようになつていることを特徴とす
   る液体試料中のＣ反応性蛋白の存在もしくは量を測定す
   るための螢光偏光分析に有用な化合物。 ３、化合物がフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
   体で標識されている特許請求の範囲第２項記載の化合物
   。