CZ297275B6 - Pouzití jednodimensionální nukleární magnetické resonance pro identifikaci ligandu na cílové biomolekuly - Google Patents

Pouzití jednodimensionální nukleární magnetické resonance pro identifikaci ligandu na cílové biomolekuly Download PDF

Info

Publication number
CZ297275B6
CZ297275B6 CZ0368399A CZ368399A CZ297275B6 CZ 297275 B6 CZ297275 B6 CZ 297275B6 CZ 0368399 A CZ0368399 A CZ 0368399A CZ 368399 A CZ368399 A CZ 368399A CZ 297275 B6 CZ297275 B6 CZ 297275B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
target molecule
ligand
ligands
compound
compounds
Prior art date
Application number
CZ0368399A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ9903683A3 (cs
Inventor
W. Fesik@Stephen
J. Hajduk@Philip
T. Olejniczak@Edward
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25291882&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ297275(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of CZ9903683A3 publication Critical patent/CZ9903683A3/cs
Publication of CZ297275B6 publication Critical patent/CZ297275B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/087—Structure determination of a chemical compound, e.g. of a biomolecule such as a protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01V—GEOPHYSICS; GRAVITATIONAL MEASUREMENTS; DETECTING MASSES OR OBJECTS; TAGS
    • G01V3/00—Electric or magnetic prospecting or detecting; Measuring magnetic field characteristics of the earth, e.g. declination, deviation
    • G01V3/14—Electric or magnetic prospecting or detecting; Measuring magnetic field characteristics of the earth, e.g. declination, deviation operating with electron or nuclear magnetic resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Geology (AREA)
  • Remote Sensing (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Geophysics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Zpusob zahrnuje identifikaci sloucenin, které se vázou na specifickou cílovou molekulu. Zpusob zahrnuje tyto kroky: a) vytvorení prvního jednodimensionálního T.sub.2-.n. nebo difusne filtrovaného spektra jedné slouceniny nebo smesi chemických sloucenin; b) vystavení jedné slouceniny nebo smesi chemických sloucenin vuci cílové molekule; c) vytvorení druhého jednodimensionálního T.sub.2-.n. nebo difusne filtrovaného spektra jedné slouceniny nebo smesi chemických sloucenin, které byly vystaveny vuci cílové molekule v kroku (b); a d) porovnání uvedeného prvního a druhého jednodimensionálního T.sub.2- .n.nebo difusne filtrovaného spektra pro urcení rozdílu mezi uvedeným prvním a uvedeným druhým spektrem, pricemz tyto rozdíly identifikují prítomnost jedné nebo více sloucenin, které jsou ligandy, jez se navázaly na cílovou molekulu.

Description

Předložený vynález se týká způsobu zkoumání sloučenin pro vazbu na cílové biomolekuly za použití jednodimensionální nukleární magnetické resonanční spektroskopie (NMR).
Dosavadní stav techniky
Jedním z nejmocnějších nástrojů vedoucích k objevům nových léčiv je náhodné prozkoumávání syntetických chemických látek a databází přírodních produktů, aby byly objeveny sloučeniny, které se vážou na konkrétní cílovou molekulu (tj. identifikace ligandů pro tento cíl). Při použití tohoto způsobu mohou být identifikovány ligandy z hlediska jejich schopnosti tvořit fyzikální asociáty s cílovou molekulou nebo vzhledem k jejich schopnosti změnit funkci cílové molekuly.
Když se vyhledává fyzikální vazba, je typické, že se cílová molekula vystaví jedné nebo více sloučeninám, u nichž je podezření, že budou ligandy a provádí se essaye, aby se zjistilo, zda se tvoří komplexy mezi cílovou molekulou a jednou nebo větším množstvím z těchto sloučenin. Jak je v oboru dobře známo, takové analýzy testují hrubé změny cílových molekul (např. změny velikosti, náboje, pohyblivosti), které ukazují na tvorbu komplexu.
Kde se měří funkční změny, jsou podmínky essaye upraveny tak, že dovolují měření biologického nebo chemického výsledku vztahujícího se na cílovou molekulu (např. enzymaticky katalyzovanou reakci, aktivaci receptoru prostřednictvím enzymu). Pro identifikaci změny se stanovuje funkce cílové molekuly před a po expozici testovací sloučeninou.
Existující fyzikální funkční essaye byly úspěšně použity v určení nového léčiva používaného při navrhování terapeutických sloučenin. Těmto analýzám jsou však inherentní omezení, která ohrožují jejich přesnost, spolehlivost a účinnost.
Hlavní nedostatek existujících essayů se týká problémů „falešných pozitiv“. V typickém funkčním essayi je „falešným pozitivem“ sloučenina, která essay spustí, ale která je neefektivní pro vyvolání žádané fysiologické odezvy. Při typickém fyzikálním essayi je „falešným pozitivem“ na příklad sloučenina, která se sice připojí na cílovou molekulu, avšak nespecifickým způsobem (např. nespecifickou vazbou). Falešná pozitiva jsou zejména převažující a problematická, když se zkoumají vyšší koncentrace předpokládaných ligandů, protože mnohé sloučeniny mají při těchto koncentracích nespecifické nepříznivé vlivy.
Podobným způsobem jsou existující essaye postiženy problémem „falešných negativ“, které vznikají, když při essayi dává sloučenina negativní odezvu, ale ve skutečnosti je pro cílovou sloučeninu ligandem. Falešná negativa obvykle přicházejí u essayů, při nichž se užívají pro testované sloučeniny koncentrace, které jsou buď příliš vysoké (způsobují toxicitu), nebo příliš nízké vzhledem k vazbě nebo disociační konstantě sloučeniny vůči cílové sloučenině.
V poslední době bylo ukázáno, že k identifikování sloučenin, které se vážou na cílový protein, může být použita dvoudimenzionální 'Χμ/’Η spektrální analýza a tento přístup překonává mnohé z problémů spojených s jinými existujícími essayi pro identifikaci ligandů. Avšak tento přístup vyžaduje, aby byl protein označen na l5N, rozpustný a dobře se choval až do koncentrací 0,3 mM nebo vyšších. Dále pak u této metody mohou být použity pouze proteiny, které dávají analyzovatelné l5N/'H korelační mapy, což při běžné technologii limituje molekulární hmotnost cílového proteinu na méně než 40 kDa (tj. méně než 40 000). Vedle toho je metoda časově náročná v tom,
- 1 CZ 297275 B6 že sloučeniny se testují v kombinacích po 10, a když bylo zjištěno, že nejméně jedna ze sloučenin ve směsi je aktivní, musí být na vazbu na cílový protein individuálně testována každá sloučenina.
Vzhledem k problémům inherentním existujícím metodám zkoumání je tu stále potřeba poskytovat nové, rychlé, účinné, přesné a spolehlivé prostředky ke zkoumání sloučenin pro identifikaci a navrhování ligandů, které se specificky vážou na konkrétní cíl.
Podstata vynálezu
Z jednoho hlediska poskytuje předkládaný vynález postup zkoumání sloučenin k identifikaci přítomnosti sloučenin, které jsou ligandy, které se vážou na konkrétní cílovou molekulu. Tento postup zahrnuje kroky:
a) vytvoření prvního jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra jedné sloučeniny nebo směsi chemických sloučenin;
b) vystavení sloučeniny nebo směsi chemických sloučenin vůči cílové molekule;
c) vytvoření druhého jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra jedné sloučeniny nebo směsi chemických sloučenin, když jsou vystaveny vůči cílové molekule v kroku (b); a
d) porovnání prvního a druhého jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektr pro určení rozdílů mezi prvním a uvedeným druhým NMR spektrem, přičemž tyto rozdíly identifikují v této jedné sloučenině nebo směsi chemických sloučenin přítomnost jedné nebo více sloučenin, které jsou ligandy, jež se navázaly na cílovou molekulu.
Pokud se v kroku (b) použije směs chemických sloučenin, zahrnuje postup po kroku (d) ještě další kroky:
e) vytvoření prvního jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra každé sloučeniny ve směsi;
f) vystavení každé sloučeniny uvedené směsi jednotlivě vůči cílové molekule;
g) vytvoření druhého jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra každé ze sloučenin, když jsou vystaveny vůči cílové molekule v kroku (f); a
h) porovnání každého NMR spektra vytvořeného v kroku (g) s uvedeným prvním NMR spektrem pro určení rozdílů v kterémkoli z těchto srovnávaných NMR spekter, přičemž tyto rozdíly identifikují přítomnost sloučeniny, jež je ligandem, který se navázal na cílovou molekulu.
Výhodou předkládaného vynálezu je schopnost způsobu podle vynálezu stanovit vazbu potenciálních ligandů na neznačenou cílovou molekulu jakékoliv velikosti nebo složení, za předpokladu, že velikost cíle je dostatečně větší než potenciální ligand tak, aby způsobil změny v rychlostech jeho relaxace nebo difuse po navázání na cílovou molekulu.
Jinou výhodou předkládaného vynálezu je schopnost způsobu podle předkládaného vynálezu určit vazbu i ligandů vázajících se na cílovou molekulu slabě.
Další výhodou předkládaného vynálezu je schopnost způsobu podle vynálezu identifikovat aktivní sloučeninu, nebo sloučeniny ve směsi sloučenin, přímým srovnáváním chemických posunů v rozdílných spektrech se známými chemickými posuny sloučenin obsažených ve směsi za nepřítomnosti cílové biomolekuly.
. 2 .
Při tomto preferovaném provedení může být způsob určení vazby ligandu proveden v přítomnosti druhého vázaného ligandu. Při tomto provedení je cílová molekula vázána k tomuto druhému ligandu před exponováním tohoto cíle testovaným sloučeninám.
Jak uvedeno shora, používá tato metoda k identifikaci prvního ligandu a následujících ligandu, které se na cílovou vážou, T2- nebo difusně filtrovaný protonový spektroskopický vyhledávací způsob. Tvoří se komplex cílové molekuly a dvou či více ligandů a strukturní data se získají nejlépe NMR spektroskopií nebo rentgenovou krystalografií. Taková strukturní data se používají k určení prostorové orientace vzhledem k sobě navzájem a k cílové molekule.
Na základě prostorové orientace jsou ligandy spolu spojeny a vytvářejí ligand s vysokou afinitou, který je použitelný jako ligand konkrétní cílové molekuly a je vhodný k použití jako potenciální farmaceuticky aktivní léčivo. Výběr vhodné spojovací skupiny se činí za zachování prostorové orientace ligandů navzájem a vůči cílové molekule spočívající na principech informace o vazebných úhlech a délkách vazeb obecně známých v oboru organické chemie. Postup spojování nebo syntetické schéma pro kombinaci nejméně dvou ligandů pro vytvoření ligandu s vysokou afinitou se uskutečňuje obecně známými syntetickými postupy a/nebo retrosyntetickou analýzou. Ligand s vysokou afinitou může být připraven jakýmkoliv způsobem, který skutečně vznikne finální ligand a není omezen jednoduchým vzájemným spojením dvou ligandů spojující skupinou. Pro vytvoření finálního produktu může být použita jakákoliv lineární syntéza nebo konvergentní syntetická metoda. Jakmile jsou nalezeny nejméně dva ligandy, které mají afinitu k cílové molekule (nejlépe proteinu), určí se ligand s vysokou afinitou a připraví se metodami, které jsou odborníkům v oboru obecně známé. Ligandy se zvolí z pestré skupiny malých molekul, které mají různé atomové a molekulové uspořádání, stereochemii atd. Limitujícím faktorem je, aby nejméně dva ligandy měly určitou afinitu jako ligand nejméně k jednomu místu polypeptidové nebo cílové molekuly. Zde uvedený vyhledávací proces však může identifikovat jednotlivý ligand nebo vyšší množství ligandů, kterém mohou být také upravovány tradičními způsoby designu léčiv při vytváření farmaceuticky aktivních produktů anebo mohou být v procesu získávání léčiv zde uvedeným postupem využívány ke spojování nejméně dvou ligandů pro vytvoření ligandu s vysokou afinitou.
Metoda získávání molekul tedy zahrnuje postup, který obsahuje:
(a) identifikaci prvního ligandu na cílovou molekulu za použití jednodimensionální T2- nebo difusně filtrované NMR spektroskopie s použitím způsobu podle nároku 1;
(b) identifikaci jednoho nebo více dalších ligandů na cílovou molekulu za použití jednodimensionální T2- nebo difusně filtrované NMR spektroskopie;
(c) vytvoření komplexu mezi prvním identifikovaným ligandem a jedním nebo více dalšími identifikovanými ligandy s cílovou molekulou;
(d) určení trojdimensionální struktury alespoň té části komplexu, kde první a jeden nebo více dalších ligandů se vážou na cílovou molekulu, a tím i prostorové orientace prvního a jednoho nebo více dalších ligandů na cílovou molekulu; a (e) spojení prvního a jednoho nebo více dalších ligandů k zachování prostorové orientace, o které bylo v kroku (d) zjištěno, že tvoří ligand s vysokou afinitou.
Identifikace následných ligandových jednotek může být provedena v nepřítomnosti nebo v přítomnosti prvního ligandu (například cílová molekula může být vázána s prvním ligandem předtím, než byla vystavena sloučeninám testovaných pro identifikaci druhého ligandu).
Při preferovaném provedení je cílovou sloučeninou, používanou v procesu vyhledávání nebo získávání, polypeptid. Polypeptidový cíl je nejvhodnější produkován v rekombinantní formě z hostitelské buňky transformované expresním vektorem obsahujícím polynukleotid, který polypeptid kóduje.
-3CZ 297275 B6
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 ukazuje (A) T2-filtrované spektrum sloučeniny 1 ve vodném pufru, (B) T2-filtrované spektrum sloučeniny 1 v přítomnosti FKBP, (C) T2-filtrované spektrum FKBP, (D) diferenční spektrum získané odečtením (C) od (B) a (E) diferenční spektrum získané odečtením (D) od (A). Pro všechny experimenty byla doba „spin-locku“ T2-filtru 200 ms a lms prodleva spinového echa, koncentrace sloučeniny 1 byla 100 μΜ, koncentrace FKBP byla 50 μΜ, pufr byl 50 mM PO4, 100 MM NacL, pH 6,5 (95 % D2O).
Obrázek 2 ukazuje (A) T2-filtrované spektrum směsi sloučenin 1-9, (B) T2-filtrované spektrum směsi sloučenin 1-9 v přítomnosti FKBP, (C) T2-filtrované spektrum FKBP, (D) diferenční spektrum získané odečtení (C) od (B) a (E) diferenční spektrum získané odečtením (D) od (A) a(F) referenční T2-filtrované spektrum samotné sloučeniny 1. Pro všechny experimenty byla doba „spin-locku“ T2-filtru 200 ms a lms prodlevou spinového echa, koncentrace všech chemických sloučenin byl 100 μΜ, koncentrace FKBP byl 50 μΜ, pufr byl 50 mM PO4, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95 % D2O).
Obrázek 3 ukazuje (A) T2-filtrované spektrum směsi sloučenin 2-9, (B) T2-filtrované spektrum směsi sloučenin 2-9 v přítomnosti FKBP, (C) T2-filtrované spektrum FKBP, (D) diferenční spektrum získané odečtením (C) od (B) a (E) diferenční spektrum získané odečtením (D) od (A). Pro všechny experimenty byla doba „spin-locku“ T2-filtru 200 ms a lms prodlevou spinového echa, koncentrace všech chemických sloučenin byla 100 μΜ, koncentrace FKBP byl 50 μΜ, pufr byl 50 mM PO4, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95 % D2O).
Obrázek 4 ukazuje (A) difusně filtrované spektrum sloučeniny 1 v přítomnosti FKBP za použití nízkého výkonu gradientu pulzů, (B) difusně filtrované spektrum sloučeniny 1 v přítomnosti FKBP za použití vysokého výkonu gradientu pulzů, (C) diferenční spektrum získané odečtením (B) od (A), (D) difusně filtrované spektrum sloučeniny 1 za použití nízkého výkonu gradientu pulzů a (E) diferenční spektrum získané odečtením (C) od (D). U všech experimentů odpovídá nízký a vysoký výkon gradientu pulzů 3 a respektive 48 Gauss/cm. Vysoký výkon gradientu pulzů byl dostatečný k eliminaci zbytkového HDO signálu ve vzorku. Použitá doba prodlevy difuse byla 300 ms, koncentrace všech chemických sloučenin byla 100 μΜ, koncentrace FKBP byl 50 μΜ, pufr byl 50 mM PO4, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95 % D2O).
Obrázek 5 ukazuje (A) difusně filtrované spektrum směsi sloučenin 1-9 v přítomnosti FKBP za použití nízkého výkonu gradientu pulzů, (B) difusně filtrované spektrum směsi sloučenin 1-9 v přítomnosti FKBP za použití vysokého výkonu gradientů pulzů, (C) diferenční spektrum získané odečtením (B) od (A), (D) difusně filtrované spektrum směsi sloučenin 1-9 za použití nízkého výkonu gradientu pulzů, (E) diferenční spektrum získané odečtením (C) od (D) a (F) referenční spektrum sloučeniny 1 samotné. U všech experimentů odpovídá nízký a vysoký výkon gradientu pulzů 3 a respektive 48 Gauss/cm. Vysoký výkon gradientu pulzů byl dostatečný k eliminaci zbytkového HDO signálu ve vzorku. Použitá doba prodlevy difuse byla 300 ms, koncentrace všech chemických sloučenin byl 100 μΜ, koncentrace FKBP byla 50 μΜ, pufr byl 50 mM PO4, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95 % D2O).
Obrázek 6 ukazuje (A) difusně filtrované spektrum směsi sloučeniny 2-9 v přítomnosti FKBP za použití nízkého výkonu gradientu pulzů, (B) difusně filtrované spektrum směsi sloučenin 2-9 v přítomnosti FKBP za použití vysokého výkonu gradientu pulzů, (C) diferenční spektrum získané odečtením (B) od (A), (D) difusně filtrované spektrum směsi sloučenin 2-9 za použití nízkého výkonu gradientu pulzů, (E) diferenční spektrum získané odečtením (C) od (D). U všech experimentů odpovídá nízký a vysoký výkon gradientu pulzů 3 a respektive 48 Gauss/cm. Vysoký výkon gradientu pulzů byl dostatečný k eliminaci zbytkového HDO signálu ve vzorku.
-4CZ 297275 B6
Použitá doba prodlevy difuse byl 300 ms, koncentrace všech chemických sloučenin byla 100 μΜ, koncentrace FK.BP byla 50 μΜ, pufr byl 50 mM PO4, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95 % D2O).
Podrobný popis vynálezu
Předložený vynález poskytuje rychlou a účinnou vyhledávací metodu pro identifikaci ligandů, které se vážou na terapeutické cílové molekuly.
Pomocí nukleárně magnetické resonance (NMR) se ligandy identifikují testováním vazby molekul na cílovou molekulu (např. protein, nukleovou kyselinu atd) sledováním buď rychlosti relaxace, nebo difuse resonancí ligandů po adici na cílovou molekulu. Soubor zkoumaných molekul může být vybrán ze sbírek sloučenin jak jsou běžně dostupné ve většině farmaceutických společností nebo univerzitních laboratoří.
Informace o vztazích struktura/aktivita mezi ligandy identifikovaná takovým postupem, může být pak využita k navrhování nových léčiv, které slouží jako ligandy cílových molekul. Jako příklad, kde jsou identifikovány dva nebo více ligandů na danou cílovou molekulu, je vytvoření komplexu těchto ligandů a cílové molekuly. Prostorová orientace ligandů navzájem, stejně jako vůči cílové molekule, se odvozuje ze strukturních dat. Tato prostorová orientace určuje vzdálenost mezi vazebnými místy dvou ligandů a orientaci každého ligandů vůči těmto místům.
Využitím těchto dat o prostorové orientaci, se pak spolu spojí dva nebo více ligandů za vytvoření nového ligandů. Spojení se uskuteční takovým způsobem, že zůstává zachována prostorová orientace ligandů navzájem i vůči cílové molekule.
Postup zkoumání podle předloženého vynálezu založený na 1D-NMR má četné výhody. Za prvé tím, že postup podle tohoto vynálezu identifikuje ligandy přímým měřením vazby na cílovou molekulu, je výrazně snížen problém falešných pozitiv.
Za druhé je výrazně snížen problém falešných negativ, protože předložený postup může identifikovat sloučeniny, které specificky vážou na cílovou molekulu s širokým rozsahem disociační konstant.
Za třetí při použití předloženého vynálezu je eliminován požadavek na l5N-labelované, nízkomolekulámí (<40 kDa) proteiny, které jsou stále při vysokých koncentracích, jak se to požaduje při metodách využívajících ^Ν/'Η korelační spektroskopii.
Za čtvrté schopnost přímé identifikace aktivních sloučenin ve směsi sloučenin srovnáváním známých chemických posunů výrazně snižuje množství času potřebného pro vyhledávání a identifikaci aktivních sloučenin, které se vážou na cílovou molekulu.
Protože se signály potenciálních ligandů monitorují kvůli detekci vazby na cílovou molekulu, mohou být identifikovány dva nebo více ligandů, které se na cílovou molekulu vážou simultánně. Schopnost současné identifikace vazebných míst různých ligandů dovoluje zkušenému praktikovi 1) definovat negativní a pozitivní spolupůsobící vazby mezi ligandy a 2) navrhovat nová léčiva vázání dvou nebo více ligandů do jednotlivé sloučeniny, zatímco je zachována vlastní orientace ligantů navzájem i k jejich vazebným místům.
V základním hledisku předložený vynález poskytuje postup vyhledávání sloučenin pro identifikaci přítomnosti sloučenin, které jsou ligandy, které se vážou na cílovou molekulu. Tento postup se skládá z kroků:
a) vytvoření prvního jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra jedné sloučeniny nebo směsi chemických sloučenin;
-5CZ 297275 B6
b) vystavení sloučeniny nebo směsi chemických sloučenin vůči cílové molekule;
c) vytvoření druhého jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra jedné sloučeniny nebo směsi chemických sloučenin, když jsou vystaveny vůči cílové molekule v kroku (b); a
d) porovnání prvního a druhého jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra pro určení rozdílů mezi prvním a uvedeným druhým NMR spektrem, přičemž tyto rozdíly identifikují v této jedné sloučenině nebo směsi chemických sloučenin přítomnost jedné nebo více sloučenin, které jsou ligandy, jež se navázaly na cílovou molekulu.
Pokud postu podle předkládaného vynálezu vyhledá v kroku b) více než jednu sloučeninu a kde se zjistí mezi spektry rozdíl, může být aktivní sloučenina identifikována na základě předchozí znalosti chemických posunů sloučenin ve směsi za nepřítomnosti cílové molekuly. Jestliže taková informace chybí, provádí se další kroky, aby se identifikovalo, která konkrétní sloučenina se na cílovou molekulu navázala. Takové dodatečné kroky zahrnují
e) vytvoření prvního jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra každé sloučeniny ve směsi;
f) vystavení každé sloučeniny uvedené směsi jednotlivě vůči cílové molekule;
g) vytvoření druhého jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra každé ze sloučenin, když jsou vystaveny vůči cílové molekule v kroku (f); a
h) porovnání každého NMR spektra vytvořeného v kroku (g) s uvedeným prvním NMR spektrem pro určení rozdílů v kterémkoli z těchto srovnávaných NMR spekter, přičemž tyto rozdíly identifikují přítomnost sloučeniny, jež je ligandem, který se navázán na cílovou molekulu.
Při postupu podle předkládaného vynálezu může být použita jakákoliv cílová molekula za předpokladu, že cílová molekula je dostatečně větší než testované sloučeniny tak, aby byly způsobeny velké diference v relaxačních nebo difusních rychlostech testovaných sloučenin po navázání na cílovou molekulu. Vzhledem k významu proteinů v lékařské chemii je preferovanou cílovou sloučeninou polypeptid. Při preferovaném provedení je cílovou molekulou polypeptid o molekulové hmotnosti větší než 5 kDa.
Vyhledávací proces podle předloženého vynálezu začíná vytvořením nebo získáním buď T2-filtrovaného, nebo difusně filtrovaného jednodimensionálního prostorového spektra sloučeniny nebo směsi sloučenin. Prostředky pro vytvoření T2- filtrovaného nebo difusně filtrovaného jednodimensionálního protonového spektra jsou v oboru dobře známé, [viz např. S. Meiboom a D. Gill, Rev, Sci. Instrum.. 29: 688 (1958), S. J. Gibbs a C.S. Johnson Jr., J, Magn. Reson., 93: 395-402 (1991), a S. Altieri a spol., J. Am. Chem. Soc., 117: 7566-7567 (1995)].
Pro usnadnění získání NMR dat o velkém počtu sloučenin (například databáze syntetických nebo v přírodě se vyskytujících malých organických molekul) se užívá automatický měnič vzorků. Při použití měniče vzorků může být naměřeno bez dozoru celkem 60 vzorků. Tak při užití typických parametrů měření [128 skenování zániku volné indukce (fid)] může být v čase 24 hodin získáno 100 až 200 spekter.
Pro usnadnění zpracování NMR dat se k přenosu používá počítačové programy a automaticky zpracovávají mnohočetná jednodimensionální NMR data.
Representativní jednodimensionální T2-filtrované spektrum směsi sloučeni je uvedeno na Obr. IA. Reprezentativní jednodimensionální difusně filtrované spektrum směsi sloučenin je uvedeno na Obr. 2A.
-6CZ 297275 B6
Následně po získání prvního spektra je cílová molekula vystavena působení jedné nebo více testovaných sloučenin. Když má být současně testováno více než jedna sloučenina, dává se přednost použití databáze sloučenin např. při velkém množství malých molekul. Takové molekuly se zpravidla rozpouštějí v perdeuterovaném dimethylsulfoxidu. Sloučeniny v databázi mohou být nakoupeny od prodejce nebo vytvořeny podle požadovaných potřeb.
Jednotlivé sloučeniny mohou být mezi jiným vybírány na základě velikosti (molekulová hmotnost = 100 až 300) molekulové různosti. Sloučeniny ve sbírce mohou mít rozličné tvary (např. ploché aromatické kruhy, zalomené alifatické kruhy, přímé a rozvětvené alifatické řetězce s jednoduchými, dvojnými a trojnými vazbami) a různé funkční skupiny (např. karboxylové kyseliny, estery, ethery, aminy, aldehydy, ketony a různé heterocyklické kruhy), aby se maximalizovala možnost objevení sloučenin, které interagují s široce rozdílnými vazebnými místy.
NMR vyhledávací postup podle předkládaného vynálezu využívá koncentrace ligandu kolísající od kolem 0,05 do kolem 1,0 mM. Sloučeniny, které jsou kyselé nebo zásadité, mohou při těchto koncentracích výrazně měnit pH pufrovaných roztoků proteinu. Chemické posuny jsou ke změnám pH citlivé stejně jako přímé vazebné interakce a proto mohou být pozorovány „falešné pozitivní“ změny chemických posunů, které nejsou výsledkem vazby ligandu, nýbrž změn pH. Proto je nezbytné ujistit se, že se po přidání ligandu nezměnilo pH pufrovaného roztoku. Jeden prostředek kontroly pH je uveden dále níže.
Sloučeniny se uchovávají při 263 Kjako 1,0 a 0,1 M zásobní roztoky v dimethylsulfoxidu (DMSO). Je to nutné vzhledem k omezené rozpustnosti ligandů ve vodném roztoku. Adjustovat přímo pH DMSO roztoku není možné. Vedle toho tvoří HC1 a NaOH v DMSO nerozpustné soli, takže musí být používány alternativní kyseliny a zásady. Pro získání stabilního pH byl nalezen následující přístup.
l,0M zásobní roztoky v DMSO se zředí 1:10 v 50mM fosfátu, pH 7,0. Pak se změní pH tohoto zředěného alikvotního roztoku. Jestliže se pH tohoto alikvotu nezměnilo (tj. zůstává u 7,0), udělá se pracovní roztok zředěním zásobního DMSO roztoku 1:10, aby vznikl 0,lM roztok a roztok se uschová.
Jestliže je pH alikvotu menší než 7,0, přidá se k l,0M zásobnímu DMSO roztoku ethanolamin, tento zásobní roztok se potom 1:10 zředí fosfátovým pufrem, aby se udělal jiný alikvot a znovu se změří pH tohoto alikvotu.
Je-li pH zředěného alikvotu větší než 7,0, přidá se kyselina octová k l,0M zásobnímu DMSO roztoku, tento zásobní roztok se potom 1:10 zředí fosfátovým pufrem, aby se udělal jiný alikvot a znovu se změří pH tohoto alikvotu.
Ethanolamin a kyselina octová jsou rozpustné v DMSO a přidávají se odpovídající ekvivalenty, aby se zajistilo, že po přenesení do vodného pufru se nezměnilo pH. Úprava pH je interaktivní proces, opakující se do dosažení požadovaného výsledku.
Budiž poznamenáno, že se tato procedura provádí s 1:10 zředěními l,0M zásobních roztoků (lOOmM ligand), aby se zajistilo, že se nezaznamenají žádné změny pH při nižších koncentracích používaných při experimentech (0,1 až 10 mM) nebo v různých/slabších pufřovacích systémech.
Po expozici testovaných sloučenin vůči cílové molekule se vytvoří druhé jednodimensionální T2- nebo difusně filtrované spektrum. Při T2-filtrovaném přístupu se druhé spektrum vytvoří stejným způsobem jak uvedeno nahoře. První a druhá spektra se potom porovnávají, aby se zjistilo, zda mezi těmi dvěma spektry existují nějaké rozdíly. Rozdíly v jednodimensionálních T2filtrovaných spektrech značí, že se ligand navázal na cílovou molekulu. Tyto rozdíly se zjišťují pomocí standardních postupů, které jsou v oboru běžné. Při difusně filtrované metodě se druhé spektrum vytvoří pozorováním, spektrálních rozdílů mezi nízkými a vysokými výkony gradien
-7CZ 297275 B6 tových pulzů, tedy výběrem těch sloučenin, jejichž rychlosti difuse jsou srovnatelné s těmi, které byly pozorovány za nepřítomnosti cílové molekuly.
Pro příklad ukazuje Obr. 1 srovnání jednodimensionálních T2-filtrovaných spekter před a po expozici různých cílových molekul směsí testovaných sloučenin a následující identifikaci aktivní sloučeniny. Podrobný popis, jak se tyto studie provádějí, může být potom nalezen v příkladu provedení 1.
Také pro příklad ukazuje Obr. 2 srovnání jednodimensionálních difusně filtrovaných spekter před a po expozici různých cílových molekul směsí testovaných sloučenin a následující identifikaci aktivní sloučeniny. Podrobný popis, jak se tyto studie provádějí, může být potom nalezen v příkladu provedení 2.
Aby se zjistily další molekuly, které se na protein vážou, vybírají se molekuly pro testování na základě souvislosti struktura/aktivita z počátečního vyhledávání a/nebo strukturní informace o počátečních příkladech, když se vážou na protein. Jako příklad: počáteční vyhledávání může vyústit v identifikaci ligandů, z nichž všechny obsahují aromatický kruh. Druhé kolo vyhledávání by potom jako testovací sloučeniny využívalo jiné aromatické molekuly.
Pro svůj význam v lékařské chemii, je preferovanou cílovou molekulou používanou při takovém postupu polypeptid. Při jednom z preferovaných postupů může být způsob detekce vazby jednoho ligandu na cílovou molekulu uskutečněn za přítomnosti druhého ligandu. V souhlase s tímto provedením je cílová molekula vázána k tomuto druhému ligandu před vystavením tohoto cíle testovaným sloučeninám.
Preferované cílové molekuly, způsoby vytvoření spekter a způsoby srovnávání spekter jsou stejné jako nahoře.
Počáteční krok v procesu navrhování je identifikace dvou nebo více ligandů, které se vážou na konkrétní cílovou molekulu. Identifikace takových ligandů se provádí pomocí jednodimensionální T2- nebo difusně filtrované spektroskopie, jak je uvedeno shora.
Jakmile jsou dva nebo více ligandů identifikovány jako vázací se na cílovou molekulu na různých místech, vytváří se komplex mezi cílovou molekulou a ligandy. Kde jsou dva ligandy, je takový komplex temámím komplexem. Kvartémí a další komplexy se tvoří, kde jsou tři nebo více ligandů.
Komplexy se tvoří smísením cílové molekuly současně nebo postupně s různými ligandy za podmínek, které dovolují, aby se tyto ligandy na cíl navázaly. Způsoby určení takových podmínek jsou v oboru běžně známy.
Jakmile se takový komplex vytvoří, získají se strukturní data. Pro získání strukturní dat může být použit jakýkoliv způsob. V oboru jsou takové metody obecně známé. Typickými a preferovanými metodami jsou NMR a rentgenová krystalografie.
Analýza strukturních dat může odhalit prostorovou orientaci ligandů, navzájem právě tak, jako konformaci cílové molekuly. Prostorová orientace každého ligandu vůči cílové molekule za prvé dovoluje identifikaci částí ligandu přímo zapojených do vazby (tj. těch částí interagujících s vazebným místem na cíli) a oněch částí ligandu, které se promítají vzdáleny do vazebného místa, přičemž tyto části mohou být využity pro následující spojování.
Za druhé se prostorová orientace využívá ke zmapování poloh každého ligandu ve vztahu ke každému dalšímu. Jinými slovy řečeno, mezi prostorově orientovanými ligandy mohou být vypočítány jednotlivé vzdálenosti.
-8CZ 297275 B6
Za třetí data a prostorové orientaci také definují trojrozměrné vztahy mezi ligandy a cílovou molekulou. Navíc k výpočtu absolutních vzdáleností mezi ligandy, mohou být tedy rovněž stanoveny angulární orientace těchto ligandů.
Znalost prostorové orientace ligandů a cílové molekuly se potom využije pro výběr spojen ke spojení dvou nebo více ligandů dohromady do jediného celku, který obsahuje všechny z ligandů. Výběr spojen se zakládá na vzdálenostech a angulárních orientacích, které jsou nutné, aby byla zachována každá z ligandových částí jediného celu ve vhodné orientaci k cílové molekule.
Trojrozměrná konformace vhodných spojek je obecně známá nebo pro zkušeného odborníka zjistitelná. Zatímco je teoreticky možné spojit spolu dva nebo více ligandů v jakémkoliv rozsahu vzdálenosti a trojrozměrného promítání, v praxi se dává přednost určitým omezením vzdálenosti a průmětu. U preferovaného provedení jsou ligandy odděleny ve vzdálenosti menší než kolem 15 Angstrómů (Á), lepší je menší než kolem 10 A a nejlépe pak je méně než kolem 5 Á.
Jakmile je identifikována vhodná spojka, spojí se ligandy touto spojkou. Způsoby spojování ligandů jsou v oboru obecně známé a závisí na chemické struktuře ligandů a spojují skupině samotné. Ligandy se spolu spojují při využití těchto částí ligandů, které nejsou zapojeny přímo na vazbě na cílovou molekulu.
Následující příklady provedení ilustrují preferovaná provedení předloženého vynálezu a žádným způsobem neomezují specifikaci a patentové nároky.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Vyhledávání sloučenin za použití T2-fíltrované spektroskopie
A FKBP
Rekombinantní lidský FK vázající protein (FKPB) byl připraven jak popisuje Logan a spol.
J. Mol, Biok, 236: 637-648 (1994).
Sekvence pulzů používaná pro využití změn v transversních (T2) relaxačních dobách potenciálních ligandů v přítomnosti cílové molekuly je Carrova-Pulcellova-Meiboomov-Gillova (CPMG) sekvence jak popsal S. Meiboom a D. Gill, Rev. Sci., Instrum.. 29: 668 (1958).
Předložený vynález využívá výhody té skutečnosti,že velké molekuly nebo komplexy, které v roztoku kmitají pomalu, budou mít kratší transversní (T2) relaxační časy než malé molekuly, které se v roztoku kmitají rychle. To je v technice obecně známé. Předložený vynález využívá výhody té skutečnosti, že malá molekula, která rychle kmitá pokud je v roztoku volná, bude kmitat daleko pomaleji, když je vázána na velkou cílovou molekulu. Transversní (T2) relaxační časy malé molekuly se budou tedy měnit (snižovat), když bude vázána na cílovou molekulu.
To je demonstrováno na Obr. 1 pro FKPB a sloučeninu 1, která se váže na FKPB s afinitou 200 μΜ. Na obr. IA je na sloučeninu v nepřítomnosti FKPB aplikována CPMG sekvence s dobou „spin-locku“ 200 ms. Protože transversní relaxační doby malých molekul volných v roztoku jsou obecně v řádu sekund, nastává během doby „spin-locku“ k zanedbatelné relaxaci a zaznamenávají se signály volného ligandů. Avšak v přítomnosti FKPB jsou po době „spinlocku“ signály ligandů výrazně sníženy a ve spektru zůstávají pouze peaky residuálního proteinu a ligandů jak ukazuje Obr. 1B. tyto rozdíly mohou být detegovány buď přímým prozkoumáním, nebo spektrální diferenční metodou, při níž se spektrum samotného FKBP (po „spin-locku“, Obr.
-9CZ 297275 B6
1C) odečte od spektra sloučeniny za přítomnosti FKBP (rovněž po „spin-locku“, Obr. 1B), čehož výsledkem je spektrum uvedené na Obr. ID. Toto spektrum potom obsahuje pouze residuální peaky ligandu, které, pokud se to požaduje, mohou být i dále co do výkonu sníženy aplikací delších dob „spin-locku“. Toto spektru (Obr. ID) se potom odečte od spektra testované sloučeniny samotné (obr. 1A) a tak vznikne spektrum uvedené na obr. 1E. Pozitivní peaky v diferenčním spektru odpovídají chemickým posunům sloučeniny v nepřítomnosti cílového proteinu, jak to demonstruje srovnání Obr. 1A s Obr. 1E, zatímco negativní peaky odpovídají chemickým posunům sloučeniny, když se váže na FKBP. Tato informace může být využita pro identifikaci aktivní sloučeniny.
Tytéž experimenty lze provádět se směsí sloučenin. Při těchto experimentech jsou se sloučeninou 1 kombinovány sloučeniny 2-9, o nichž je známo, že se nevážou na FKBP. Obr. 2 uvádí T2-filtrovaná spektra pro směs sloučenin za nepřítomnosti FKBP (Obr. 2A), za přítomnosti FKBP (obr. 2B) a pro FKBP samotný (Obr. 2C). Spektrum na Obr. 2D, získané odečtením Obr. 2C od Obr. 2B, obsahuje resonance ligandů za přítomnosti proteinu. Spektrum na Obr. 2E, získané odečtením Obr. 2D od Obr. 2A obsahuje pozitivní peaky, které odpovídají polohám resonancí sloučeniny 1 za nepřítomnosti FKBP, jak je ukázáno na referenčním spektrum uvedeném na Obr. 2F. Informace o chemickém posunu obsažená na Obr. 2E se užívá nejen pro detekci ligandu, který se váže na protein, ale může být také použita pro identifikaci, která sloučenina ve směsi sloučenin se váže za předpokladu, že taková informace o chemickém posunu o volných ligandech je předem známá.
Obr. 3 uvádí tentýž soubor experimentů jenom se směsí sloučenin 2-9, které se na FKBp nevážou. Jak lze zaznamenat na Obr. 3E, nejsou v diferenčním spektru pozorovány žádné pozitivní resonance absorbovaného ligandu, což naznačuje, že se na FKBP nenavázaly žádné ligandy.
Příklad 2
Vyhledávání sloučenin za použití difusně filtrované spektroskopie
A. FKBP
Sekvence pulzů aplikovaná pro využití změn v difusních rychlostech potenciálních ligandů za přítomnosti cílové molekuly byla popsána. Viz S. J. Gibbs a C.S. Johnoson Jr„ J. Magn. Reson. 93: 395-402 (1991) a A.S. Altieri a spol. J. Am. Chem., 117: 7566-7567 (1995).
Předložený vynález využívá výhody té skutečnosti, že malé molekuly difundují v roztoku rychleji než velké molekuly. To je v oboru dobře známé. Předložený vynález využívá výhody té skutečnosti, že malé molekuly, které rychle difundují, pokud jsou v roztoku volné, budou difundovány pomaleji, když jsou vázány na větší cílovou molekulu. Tudíž se u malé molekuly, když je vázána na cílovou molekulu, budou měnit (snižovat) difusní rychlosti.
Schopnost detegovat vázání ligandu za použití difusních filtrů je demonstrována pro vazbu FKBP se sloučeninou 1, jak ukazuje Obr. 4. Nejprve se difusně filtrovaná spektra získají při slabém a silném výkonu gradientu pulzů u vzorku sloučeniny 1 v přítomnosti FKBP (obr. 4A respektive 4B). Tato spektra se potom odečtou, aby se získalo spektrum uvedené na Obr. 4C. Toto spektrum obsahuje residuální ligandové resonance sloučeniny 1. Toto spektrum se potom odečte od referenčního spektra samotné sloučeniny 1 (po slabém gradientu pulzů, Obr. 4D), aby poskytlo spektrum obsahující resonance ligandu, který se váže na protein (Obr. 4E). Jak u experimentu s T2filtrací, pozitivní peaky v Obr. 4E odpovídající chemickým posunům ligandu v nepřítomnosti proteinu, zatímco negativní peaky odpovídají chemickým posunům sloučeniny, když je vázána na FKBP. Tato informace může být využita pro identifikaci aktivní sloučeniny.
- 10CZ 297275 B6
Stejné experimenty mohou být uskutečněny se směsí sloučenin. Při těchto experimentech jsou se sloučeninou 1 kombinovány sloučeniny 2-9, o nichž je známo, že se na FKBP nevážou. Obr. 5 A a 5B ukazují spektra směsi sloučenin za přítomnosti FKBP po slabém výkonu gradientu pulzů respektive silném výkonu gradientu pulzů. Rozdíl mezi těmito spektry poskytuje spektrum na Obr. 5C. Odečtení tohoto spektra od kontrolního spektra směsi ligandů za nepřítomnosti FKBP (po slabém gradientu, Obr. 5D) poskytuje spektrum (Obr. 5E), které obsahuje pozitivní resonance u chemických posunů pro sloučeninu 1 za nepřítomnosti FKBP (Obr. 5F). Informace o chemickém posunu obsažená v Obr. 5E se používá jeden pro detekci přítomnosti ligandu, který se váže na protein, nýbrž může být také použita k identifikaci, která sloučenina ze směsi sloučenin se váže, za předpokladu, že taková informace o chemickém posunu pro volné ligandy je předem známa.
Obr. 6 uvádí tentýž soubor experimentů jenom se směsí sloučenin 2-9, které se na FKBP nevážou. Jak lze zaznamenat, na Obr. 6E, nejsou v diferenčním spektru pozorovány žádné pozitivní resonance absorbovaného ligandu, což naznačuje, že se na FKBP nenavázaly žádné ligandy.
Všechny NMR spektra byla snímána při 300 K na spektrometru Bruker AMX 500 NMR. Všechna spektra zaznamenávána při počtu 256 skenů, šíře rozmítání protonu (šíře spektra) byla 8333,3 Hz a 90 stupňový protonový pulz měl délku 7 ps. U experimentů s T2-filtrací byl doba „spin-locku“ 200 ms s 1 ms prodlevou spinového echa. U gradient-filtrovaného spektra nízký a vysoký výkon gradientových pulzů odpovídají 3 a respektive 48 Gauss/cm a byla použita 300 ms doba prodlevy difuse. Ve všech experimentech byla koncentrace každého ligandu 100 μΜ, koncentrace FKBP byla 50 μΜ a pufrem bylo 50 mM PO4, 100 mM NaCl spH 6,5 (95 % D2P). NMR data byla zpracovávána a analyzována na počítacích Silicon Grafics.
Shora uvedené příklady nejsou limitující a předložený vynález je také zaměřen na proces určování ligandu s vysokou afinitou, který je spojenou kombinací nejméně dvou ligandů nalézajících se v příkladu jak je shora uvedeno.
Tabulka 1
> 10
> 10
> 10 >10 > 10
- 12CZ 297275 B6
Tabulka 1 - pokračování
Číslo
Sloučenina
KD (mM)a
> 10 > 10 aKD pro sloučeninu 1 bylo získáno z S. Shuker a spol., Science 274: 1531-1534 (1996), zatímco pro sloučeniny 2-9 byly tyto odhadnuty z nepřítomnosti pozorovaných změn chemických posunů v 15N-HSQC spektrech FK.BP při 1,0 mM koncentracích sloučeni jak je popsáno v témž odkazu.

Claims (22)

1. Způsob vyhledávání sloučenin pro identifikaci přítomnosti sloučenin, které jsou ligandy, jež se vážou na specifickou cílovou molekulu, vyznačující se tím, že se skládá z kroků:
a) vytvoření prvního jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra jedné sloučeniny nebo směsi chemických sloučenin;
b) vystavení sloučeniny nebo směsi chemických sloučenin vůči cílové molekule;
c) vytvoření druhého jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra jedné sloučeniny nebo směsi chemických sloučenin, když jsou vystaveny vůči cílové molekule v kroku (b); a
d) porovnání prvního a druhého jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra pro určení rozdílů mezi prvním a uvedeným druhým NMR spektrem, přičemž tyto rozdíly identifikují v této jedné sloučenině nebo směsi chemických sloučenin přítomnost jedné nebo více sloučenin, které jsou ligandy, jež se navázaly na cílovou molekulu.
2. Způsob podle nároku 1, kde se v kroku (b) použije směs chemických sloučenin, vyznačující se t i m , že podrobí dále krokům následujícím po kroku d) za:
e) vytvoření prvního jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra každé sloučeniny ve směsi;
f) vystavení každé sloučeniny uvedené směsí jednotlivě vůči cílové molekule;
g) vytvoření druhého jednodimensionálního T2- nebo difusně filtrovaného NMR spektra každé ze sloučenin, když jsou vystaveny vůči cílové molekule v kroku (f); a
h) porovnání každého NMR spektra vytvořeného v kroku (g) s uvedeným prvním NMR spektrem pro určení rozdílů v kterémkoli z těchto srovnávaných NMR spekter, přičemž tyto rozdíly identifikují přítomnost sloučeniny, jež je ligandem, který se navázal na cílovou molekulu.
- 13 CZ 297275 B6
3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že obsahuje dále krok vazby cílové molekuly na druhý ligand před krokem (a).
4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že vyhledávané sloučeniny jsou vybírány ze souboru sloučenin různých malých molekul.
5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že jako cílová se volí polypeptid.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že jako polypeptid se volí enzym nebo receptor.
7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že jako cílová molekula se volí polynukleová kyselina.
8. Způsob podle nároku l,vy značu j ící se tí m , že cílová molekula je neznačená.
9. Způsob získávání ligandu svysokou afinitou kcílové molekule, vyznačující se tím, že obsahuje:
a) identifikaci prvního ligandu na cílovou molekulu za použití jednodimensionální T2- nebo difusně filtrované NMR spektroskopie s použitím způsobu podle nároku 1;
(b) identifikaci jednoho nebo více dalších ligandů na cílovou molekulu za použití jednodimensionální T2- nebo difusně filtrované NMR spektroskopie;
(c) vytvoření komplexu mezi prvním identifikovaným ligandem a jedním nebo více dalšími identifikovanými ligandy s cílovou molekulou;
(d) určení trojdimensionální struktury alespoň té části komplexu, kde první a jeden nebo více dalších ligandů se vážou na cílovou molekulu, a tím i prostorové orientace prvního a jednoho nebo více dalších ligandů na cílovou molekulu; a (e) spojení prvního a jednoho nebo více dalších ligandů k zachování prostorové orientace, o které bylo v kroku (d) zjištěno, že tvoří ligand s vysokou afinitou.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že jako cílová molekula se volí polypeptid.
11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že cílová molekula je neznačená.
12. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že první ligand a jeden nebí více dalších ligandů jsou navzájem spojeny konvergentní nebo lineární organickou syntézou za vzniku ligandu s vysokou afinitou.
13. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že ligandem s vysokou afinitou je farmaceuticky účinná jednotka.
14. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že první ligand a jeden nebo více dalších ligandů jsou vybrány ze skupiny různých malých molekul.
15. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že malé molekuly jsou vybrány ze sbírky sloučenin.
16. Způsob podle nároku 9, v y z n a č u j í c í se t í m , že komplex je tvořen spojením prvního ligandu a jednoho nebo více dalších ligandů s cílovou molekulou v roztoku.
- 14CZ 297275 B6
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že komplex utvořený v roztoku je podobný nebo identický s komplexem utvořeným s ligandem nebo jedním nebo více dalšími ligandy za fyziologických podmínek.
18. Způsob podle nároku 1, v y z n a č uj í c í se t í m , že dále zahrnuje kroky:
(e) použití tohoto porovnání k nápomoci při identifikaci chemické sloučeniny, která je ligandem pro uvedenou cílovou molekulu, a (f) přípravy této sloučeniny.
19. Způsob podle nároku 9, vy znač u j ící se tím, že dále zahrnuje před krokem (a) krok výběru cílové molekuly a po kroku (e) krok přípravy chemické sloučeniny, která má strukturu získanou spojením prvního ligandu a dalších identifikovaných ligandů za zachování prostorové orientace stanovené ve stupni (d).
20. Způsob podle nároku 18 nebo 19, vy z n ač u j í c í se tím, že cílovou molekulou je polypeptid.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že polypeptid má molekulovou hmotnost vyšší než 5000.
22. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 5 nebo 9až21, vyznačující se tím, že cílovou molekulou je lidský KF vazebný protein (FKBP).
CZ0368399A 1997-04-18 1998-04-17 Pouzití jednodimensionální nukleární magnetické resonance pro identifikaci ligandu na cílové biomolekuly CZ297275B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/844,124 US6043024A (en) 1997-04-18 1997-04-18 Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ9903683A3 CZ9903683A3 (cs) 2001-02-14
CZ297275B6 true CZ297275B6 (cs) 2006-10-11

Family

ID=25291882

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0368399A CZ297275B6 (cs) 1997-04-18 1998-04-17 Pouzití jednodimensionální nukleární magnetické resonance pro identifikaci ligandu na cílové biomolekuly

Country Status (29)

Country Link
US (1) US6043024A (cs)
EP (1) EP0975954B2 (cs)
JP (1) JP2002507277A (cs)
KR (1) KR100542420B1 (cs)
CN (1) CN1225648C (cs)
AR (1) AR004651A1 (cs)
AT (1) ATE259061T1 (cs)
AU (1) AU7138098A (cs)
BG (1) BG64326B1 (cs)
BR (1) BR9808079A (cs)
CA (1) CA2286795C (cs)
CO (1) CO5060446A1 (cs)
CZ (1) CZ297275B6 (cs)
DE (1) DE69821475T3 (cs)
DK (1) DK0975954T4 (cs)
ES (1) ES2215296T5 (cs)
HK (1) HK1027158A1 (cs)
HU (1) HU228433B1 (cs)
IL (1) IL131726A0 (cs)
NO (1) NO995078L (cs)
NZ (1) NZ337126A (cs)
PL (1) PL194184B1 (cs)
PT (1) PT975954E (cs)
SI (1) SI0975954T1 (cs)
SK (1) SK285411B6 (cs)
TR (1) TR199902167T2 (cs)
TW (1) TW574502B (cs)
WO (1) WO1998048264A1 (cs)
ZA (1) ZA982919B (cs)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001503646A (ja) * 1996-03-29 2001-03-21 ローレンス バークレー ナショナル ラボラトリィ 過分極化希ガス存在下でのｎｍｒまたはｍｒｉの増強
US20030143757A1 (en) * 1997-06-13 2003-07-31 Jonathan Moore Methods for identifying drug cores
US6111066A (en) 1997-09-02 2000-08-29 Martek Biosciences Corporation Peptidic molecules which have been isotopically substituted with 13 C, 15 N and 2 H in the backbone but not in the sidechains
US6344330B1 (en) 1998-03-27 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Pharmacophore recombination for the identification of small molecule drug lead compounds
JP2002534687A (ja) * 1998-12-30 2002-10-15 アメルシャム・パブリック・リミテッド・カンパニー 過分極を使用したｎｍｒ分光学アッセイ
US6333149B1 (en) 1999-06-04 2001-12-25 Triad Biotechnology, Inc. NMR-solve method for rapid identification of bi-ligand drug candidates
WO2001014886A2 (en) * 1999-08-23 2001-03-01 Polaris Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of binding between proteins and macromolecular ligands
US6677160B1 (en) 1999-09-29 2004-01-13 Pharmacia & Upjohn Company Methods for creating a compound library and identifying lead chemical templates and ligands for target molecules
US6764858B2 (en) 1999-09-29 2004-07-20 Pharmacia & Upjohn Company Methods for creating a compound library
US20010051333A1 (en) * 2000-04-17 2001-12-13 Pharmacia & Upjohn Company Nuclear magnetic resonance methods for identifying sites in papillomavirus E2 protein
US7146277B2 (en) * 2000-06-13 2006-12-05 James H. Prestegard NMR assisted design of high affinity ligands for structurally uncharacterized proteins
US20030165431A1 (en) * 2000-07-13 2003-09-04 The Regents Of The University Of California Method for detecting macromolecular conformational change and binding information
US7061237B2 (en) * 2000-07-13 2006-06-13 The Regents Of The University Of California Remote NMR/MRI detection of laser polarized gases
EP1320387B1 (en) * 2000-09-13 2012-04-11 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions for sustained delivery of peptides
AU1106902A (en) 2000-09-27 2002-04-08 Univ Leiden Method for applying nmr for ligand discovery or as a drug screening tool
CA2432924A1 (en) * 2000-12-21 2002-06-27 Triad Therapeutics, Inc. Sea-trosy and related methods
GB0031566D0 (en) * 2000-12-22 2001-02-07 Mets Ometrix Methods for spectral analysis and their applications
US20030092027A1 (en) * 2001-06-01 2003-05-15 Luciano Mueller Nuclear magnetic resonance method for identifying ligands to target compounds
EP1423427A2 (en) * 2001-08-27 2004-06-02 Novartis AG Nogo receptor homologues and their use
US7653490B2 (en) 2001-09-10 2010-01-26 Triad Liquidating Company LLC Nuclear magnetic resonance assembly of chemical entities
US20050221420A1 (en) * 2001-10-22 2005-10-06 Carmen Barske Nogo receptor homologues and their use
US7037660B2 (en) * 2001-11-06 2006-05-02 Message Pharmaceuticals Methods for detecting and quantifying binding and inhibition of binding of species to nucleic acids
KR100888805B1 (ko) * 2002-06-14 2009-03-16 크리스탈지노믹스(주) 특정 아미노산이 표지된 단백질과 1ｄ ｎｍｒ 기법을이용하여 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을검색하는 방법
KR100901309B1 (ko) * 2002-06-15 2009-06-09 크리스탈지노믹스(주) 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법
NO20025738D0 (no) * 2002-11-29 2002-11-29 Amersham Health As Metode
CA2466792A1 (en) * 2003-05-16 2004-11-16 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Evaluation of spectra
US7595170B2 (en) * 2004-08-05 2009-09-29 Modrovich Ivan E Apparatus and method for measuring concentrations of molecules through a barrier
US8933209B2 (en) 2006-04-26 2015-01-13 Abbvie Inc. Dep2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders
US20070256148A1 (en) * 2006-04-26 2007-11-01 Katz David A DEP2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders
FR2954830A1 (fr) * 2009-12-31 2011-07-01 Nmrtec Methode d'analyse comparative par resonance magnetique nucleaire
CA2848520C (en) * 2011-09-29 2019-11-26 Seattle Genetics, Inc. Intact mass determination of protein conjugated agent compounds
CN102507627B (zh) * 2011-11-14 2014-10-01 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种高通量筛选药物的核磁共振方法
US9678185B2 (en) 2013-03-15 2017-06-13 Pepsico, Inc. Method and apparatus for measuring physico-chemical properties using a nuclear magnetic resonance spectrometer
CN104198517B (zh) * 2014-09-23 2017-02-08 中国科学院昆明植物研究所 联合使用不同核的一维核磁共振混合物定量方法
CN104897826B (zh) * 2015-06-16 2016-06-22 广西师范大学 一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法
CN107328804B (zh) * 2017-07-21 2019-02-05 中国科学院山西煤炭化学研究所 一种甘油加氢反应混合物的核磁共振检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4789832A (en) * 1987-01-14 1988-12-06 Jeol Ltd. Three-dimensional NMR spectroscopy
US5270163A (en) * 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5459077A (en) * 1989-12-29 1995-10-17 Pepmetics, Inc. Methods for modelling tertiary structures of biologically active ligands and for modelling agonists and antagonists thereto

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698401A (en) * 1995-11-14 1997-12-16 Abbott Laboratories Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4789832A (en) * 1987-01-14 1988-12-06 Jeol Ltd. Three-dimensional NMR spectroscopy
US5459077A (en) * 1989-12-29 1995-10-17 Pepmetics, Inc. Methods for modelling tertiary structures of biologically active ligands and for modelling agonists and antagonists thereto
US5270163A (en) * 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands

Also Published As

Publication number Publication date
BG103856A (en) 2000-07-31
HUP0003956A3 (en) 2002-04-29
SK285411B6 (sk) 2007-01-04
BG64326B1 (bg) 2004-09-30
PL336299A1 (en) 2000-06-19
HK1027158A1 (en) 2001-01-05
BR9808079A (pt) 2000-03-08
DE69821475T3 (de) 2009-07-23
EP0975954B2 (en) 2009-03-18
CZ9903683A3 (cs) 2001-02-14
HUP0003956A2 (en) 2001-03-28
JP2002507277A (ja) 2002-03-05
HU228433B1 (en) 2013-03-28
IL131726A0 (en) 2001-03-19
SK141699A3 (en) 2000-06-12
AU7138098A (en) 1998-11-13
ZA982919B (en) 1998-10-12
US6043024A (en) 2000-03-28
CN1225648C (zh) 2005-11-02
NO995078L (no) 1999-12-06
AR004651A1 (es) 1999-03-10
DE69821475D1 (de) 2004-03-11
PL194184B1 (pl) 2007-05-31
TR199902167T2 (xx) 2000-07-21
EP0975954B1 (en) 2004-02-04
NO995078D0 (no) 1999-10-18
DK0975954T4 (da) 2009-05-18
TW574502B (en) 2004-02-01
ES2215296T5 (es) 2009-07-06
CA2286795A1 (en) 1998-10-29
DE69821475T2 (de) 2004-11-25
WO1998048264A1 (en) 1998-10-29
KR20010006454A (ko) 2001-01-26
NZ337126A (en) 2001-05-25
CN1252868A (zh) 2000-05-10
CA2286795C (en) 2010-06-29
DK0975954T3 (da) 2004-06-07
PT975954E (pt) 2004-06-30
CO5060446A1 (es) 2001-07-30
EP0975954A1 (en) 2000-02-02
SI0975954T1 (en) 2004-08-31
ATE259061T1 (de) 2004-02-15
ES2215296T3 (es) 2004-10-01
KR100542420B1 (ko) 2006-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ297275B6 (cs) Pouzití jednodimensionální nukleární magnetické resonance pro identifikaci ligandu na cílové biomolekuly
Congreve et al. Fragment screening of stabilized G-protein-coupled receptors using biophysical methods
Fielding NMR methods for the determination of protein–ligand dissociation constants
van Dongen et al. Structure-based screening and design in drug discovery
Campos-Olivas NMR screening and hit validation in fragment based drug discovery
JPS62239057A (ja) 螢光偏光免疫検定法および該検定法に使用する試薬
Wang et al. Amplification of nuclear Overhauser effect signals by hyperpolarization for screening of ligand binding to immobilized target proteins
Maurer Advancing fragment binders to lead-like compounds using ligand and protein-based NMR spectroscopy
Dobrev et al. Characterization of the binding of small molecules to intrinsically disordered proteins
AU772620B2 (en) Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules
JP5129424B2 (ja) リガンドの発見または薬物スクリーニング手段としてのｎｍｒ利用法
EP0210410B1 (en) Fluorescence polarization immunoassay and reagents for measurement of c-reactive protein
Poller et al. Influence of different surface chemistries on the ultrasensitive on-chip detection of enrofloxacin in milk
JP2004502132A (ja) 生物学的活性に関する化合物スクリーニング法
Tian et al. Time-Resolved Acetaldehyde-Based Accessibility Profiling Maps Ligand–Target Interactions
US20220091128A1 (en) System and method for ligand thermal analysis
MXPA99009558A (en) Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules
Nowak et al. Microscale thermophoresis (MST) and Spectral Shift (SpS) in drug discovery
US20120122237A1 (en) Homogeneous noncompetitive detection of post translational modifications for use in high throughput assays
Huber Application of SPR technology to pharmaceutical relevant drug-receptor interactions
Jahnke Fragment-based Ligand Design
Barbero et al. SISTEMI COMPLESSI APPLICATI ALLA BIOLOGIA POST-GENOMICA XX CICLO

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20170417