JPS62239057A - 螢光偏光免疫検定法および該検定法に使用する試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般には液体、殊に例えば血清、血漿、を髄液
、羊水、および尿のような生物学液体中のリガンドを測
定するための方法およびこの方法に有用な試薬に関する
。更に詳しくは、本発明は、検定の効能を改善するべく
界面活性剤トシてスルホコハク酸ジオクチルナトリウム
を用いる新規な螢光偏光免疫検定法に関する。

リガンドを測定するための拮抗結合免疫検定は周知であ
り、リガンドおよびトレーサーに特異的な抗体上の限ら
れた数のレセプター結合部位について、供試試料中のり
ガントと標識された試薬（トレーサーと称する）との間
の拮抗を基としている。試料中のりガントの濃度は抗体
に特異的に結合するトレーサーの量を定めている。生成
されるトレーサー−抗体複合体の量は定量的に測定する
ことができ、そして供試試料中のリガンドの量に反比例
している。

螢光偏光免疫検定技術は、螢光標識化合物は平面偏光で
励起されるとその回転速度と逆の関連を有する偏光度を
有する螢光を発するという原理に基いている。特に、螢
光ラベルヲ有スるトレーサー−抗体複合体のような分子
を平面偏光で励起すると、発光される光は極度に偏光し
たままである。その理由は螢光団は元が吸収される時の
時間と光が発光される時の時間との間の回転から拘束さ
れるからである。「遊離の」トレーサー化合物（すなわ
ち、抗体に結合されていない）を平面偏光で励起すると
、その回転は相当するトレーサー−抗体複合体の回転よ
シも速くなる。従って、発光される光がより大巾に消極
される。すなわち、分子回転弛緩時間、それ故螢元偏光
反応の大きさは化合物の分子サイズに直接関係する。従
って、平面偏光を比較的高分子量の螢光化合物を含有す
る溶液中を通過させると、発光の偏光の度合は一般に平
面偏光を低分子量の螢光化合物を含有する溶液中を通過
させるときよシも太きい。それで、螢光偏光によシ拮抗
結合免疫検定において生成されるトレーサー−抗体複合
体の量を測定する定量的手段が提供される。

螢元偏光涼埋は、関心のある分析物もしくはリガンド（
あるいは分析物を含有すると予想される）を含む試料を
「トレーサー」すなわち分析物と類似しているが平面偏
光に対して螢光偏光反応を生成し得る標識化合物と混合
することによって、検定に通常利用されている。通例、
分析物もしくはリガンドは比較的低分子量の化合物、す
なわち約２．０００ダルトン未満の化合物であるが、分
析物（ａｌ−１ｙｔｍ　）は螢光偏光免疫検定技術を用
いて測定可能である限り実質的により太きい、例えば１
００，０００ダルトン以上の程度の分子ｆｔヲ有するも
のであってよい〔例えば、１９８５年７月２２日出願の
本出願人の出願に係る米国特許出願第７５７，８２２号
を診照、この記載を参考として本文に挿入する。そこで
は、約１２０，０００ダルトンの分子量を有するＣ−反
応性蛋白質についての螢光偏光免疫検定が開示されてい
る。］。分析物およびトレーサーに特異的な抗体もまた
混合物に包含されている。トレーサーおよびリガンドは
抗体上の限られた数のレセプター結合部位と拮抗する。

結合するトレーサーの量は試料中の分析物の濃度と逆の
関係を有する。その理由は分析物およびトレーサーはそ
れぞれの濃度に比例してそれぞれ抗体に結合するからで
ある。

ＴＤ、フルオレセンス・ポーラリゼーション・アナライ
ザー、すなわちアボット・ラボラトリーズ、アボット・
パーク、イリノイから商業上入手し得る装置は就中螢光
偏光検定の達成のための自動化システムである。ＴＤ、
アナライザーは、多くのリガンドの患者試料中の測定の
ために臨床検査所に螢光偏光免疫検定を提供するにａｂ
者しい商業的成功をおさめている。こｔらのりガントに
は、抗喘息剤例えばテオフィリン、抗不整脈剤例えばり
ドカイン、Ｎ−アセチルブロ力インアミド、プロカイン
アミドおよびキニジン、抗生物質例えばアミカシン、ゲ
ンタマイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、ストレ
プトマイシン、トフラ６一 マイシン、およびバンコマイシン、抗けいれん剤例えば
カルバムアゼピン、フェニトイン、フェノバルビタール
、ピリミドンおよびパルプロイツク・アシド（τα１ｐ
ｒｏｉｃαｃｉｄ）、抗ガン剤例えばメトトレキセート
、強心グリコシド例えばジゴキシン、甲状腺機能検定例
えばＴ−貯留、チロキシンおよびその他が包含される。

免疫検定の実施でのＴＤ、アナライザーおよびその使用
は、ジョレイ（Ｊｏｌｌａｙ）等、［フルオレセンス・
ポーラリゼーション・イムノアッセイＩ（Ｆｌｕｒｏｒ
ｇｓｃｇｓｅａ　Ｐｏｌａｒｔｔａｔｉｏ％Ｉｍｍｗｓ
ｏα５８ａｙ　Ｉ、モニタリング・アミノグリコシド・
アンチバイオティクス・イン・シーラム・アンド・プラ
ズマ（Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓ
ｉｄｇ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−（Ｃ１ｒｎｉｃａｌ
　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）、２７／７、第１１９０−
１１９７頁（１９８１年）；ボペルカ（Ｐｏｐｅｌｋａ
　）等、「フルオレセンス・ポーラリゼーション・イム
ノアッセイ■、アナライザー・フォア・ラビッド・プレ
サイス・メジュアメント・オプ・フルオレセンス・ポー
ラリゼーション・クイズ・ユース・オブ・デイスポザプ
ル・キュペッツ（Ａｎａｌｙｚｅｒ　ｆｏｒ　Ｒａｐｉ
ｄ、　Ｐｒｅｃｉｓｅ　Ｍｅａｓｓｏｇｍａ−ｓｔ　　
ｏｆ　　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　　Ｐｏ１ａデ１ｚ
ａｔｉｏｎ　　ｗｉｔ五Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｄｉｓｐｏｓａ
ｂｌｅ　Ｃｕｖｇｔｔｇｓ　Ｊ、クリ二カルーグミスト
リー、２７／７、第１１９８−１２０１頁（１９８１年
）：ジョレイ等、「フルオレセンス・ボーラリゼーショ
ン・イムノアッセイ■、アン・オートメーテツド・シス
テム・フォア・セラビューティック・ドラッグ・デター
ミネーション（Ａｎ　Ａｓｔｏｍａｔｓｄ　５１１ｓｔ
ａｔｎ　ｆｏｒＴｈｍｒａｐｇｓｔｉｃ　Ｐｒｕｇ　Ｄ
ａｔａｒｔｎｉｎａｔｉｏｎ）Ｊ、　クリ頁（１９８１
年）；およびルーステフエス（ＬｌＬ−８ｔｔｒｆｆ−
、、）等、ｒフルオレセンス・ポーラリゼーション・イ
ムノアッセイＩＶ、デターミネーション・オプ・フェニ
トイン・アンド・フエノバルビタール・イン・ヒユーマ
ン・シーラム−アンド・プラズマ（Ｄｇｔｔｒｒｒｎｔ
ｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｈｇｎｙ−１ｏｉｎ　　ａｎｄ
　　Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ　　ｉｎ　　Ｈｕｔｎ
ａｓ　　Ｓｅｒｕｍａｎｄ　Ｐｌａｓｍａ）Ｊ、　クリ
二カ化・ケミストリー、２８／１１、第２２７８−２２
８２（１９８２年）に記載されている。

血清または血漿試料中の関心のある分析物を測定するた
めの螢光偏光免疫検定法の使用で遭遇する一つの問題は
、試料中に様々の程度で存在する基底値螢光（ｂａｃｋ
ｇｒｏ−ｓｓｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　）である
０黄桓血清または血漿は所望の偏光測定値に著しい誤差
を与える。黄桓血清または血漿の主要螢光成分はアルブ
ミン−結合ビリルビンである。

ビリルビンはヘム異化作用の最終生成物であり、正常な
個９一 体では血清中に１１ｎ９／ｄｔ未満で存在する。肝臓に
影響する種々の疾病状態では、ビリルビンは著しく上昇
し、場合によっては１０−２０１０−２Ｏに達する。新
生児では往々にして出生直後の弱い肝機能のために１０
−２０１０−２Ｏの高レベルとなる。ビリルビンは水溶
液中にあるときは比較的非螢光性であるが、アルブミン
と結合すると極めて螢光性となる〔チェノ（Ｃｈａｔ）
、アーク・ビオヘム・ビオフイズ（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ
ｃｈｇｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　）、１６０．１０６−１
１２頁〕。そして、ビリルビン−アルブミン結合Ｆｉ非
常に強固である〔グレイ（Ｇｒａｙ）等、Ｊ、ビオル・
ケム（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｇｍ、　）、２５３、第４
３７０−４３７７頁〕。従って、上昇したビリルビンレ
ベルを有する血清または血漿試料はビリルビン−アルブ
ミン複合体の存在により上昇した螢光を示す。

基底値螢光による誤った結果を避けるために、検定を行
う前にＴＤ、アナライザーで血清または血漿試料につい
て通常ブランクの読み取りをし、これを次に最終検定読
みから差引いて補正値に達する。しかしながら、基底値
差引はいくつかの上昇ビリルビン試料で基底値螢光を適
切に補償するのに無効である場合もあシ、そして検定過
程でのビリルビン−アルブミン複合体の分解によりかか
る試料中で不正確な基底値螢光の補償を生じ得る。従っ
て、米国特許第４．４９２，７６２号には、試料中のビ
リルビン−血清アルブミン複合体を分裂させるのに有効
な量の陰イオン界面活性剤を含有し、かくして試料の基
底値螢光を減少させる溶液で螢光偏光免疫検定を実施す
ることが開示されている。この米国特許には、この目的
のために広いカテゴリーの陰イオン界面活性剤が有用で
あること、および０．００１−０．２（重量／容せ）％
の濃度範囲が好ましいことが開示されている。この米国
特許の方法の実施に用いるのに好ましい界面活性剤はド
デシル硫酸ナトリウムおよびコール酸ナトリウムであっ
た。この米国特許の方法は血清試料中の高ビリルビンレ
ベルの故にＴＤｚアナライザーでの測定誤差を限定する
のに非常に有効であることが立証されているが、このよ
うな界面活性剤の使用はある種のリガンドについての螢
光検定の発を妨げていた。例えば、供試試料中のリガン
ドの低濃度の故に、感度要件および大量の試料が必要と
される場合のリガンドである。こ引らの場合、この米国
特許に開示されているドデシル硫酸すｌ−ＩＪウムある
いはその他の界面活性剤の使用は十分に高い濃度の界面
活性剤を必要とし、それにより検定の実施において抗体
または分析物の分解を生じる。比較的低い分子量のりガ
ント例えばジゴキシンのような治療薬の低濃度のために
この問題を克服するためには、例えば血清中の蛋白質の
変性による螢光偏光免疫検定でのビリルビン干渉を除去
するのに、過酷な前処理工程が必要であった。比較的大
きい分子例えば蛋白質の低濃度に対して、このような前
処理は使用することができない。その理由はとわらの前
処理によって試料中の分析物の変性を生じ、そして螢光
偏光技術を用いるこのような比較的大きい分子について
の螢光偏光免疫検定は不可能であったからである。先行
技術のシステムによるこれらの問題およびその他の問題
は本発明の実施により克服さべそして本発明では血清ま
たは血漿試料中の分析物についての螢光偏光免疫検定を
スルホコハク酸ジオクチルナトリウムの存在下で実施す
るものである。

本発明の実施に当り、スルホコハク酸ジオクチルナトリ
ウム（ＤＳＳ）を螢光偏光免疫検定において陰イオン性
界面活性剤として使用して血清試料中のビリルビン−血
清アルブミン複合体から生じる基底値を低減させる。意
外にも、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムが比較的
低い濃度でこの目的に非常に有効であって、検定に使用
さね２る抗体に対して分解効果をほとんどあるいは全く
示さず、かくして螢光偏光技術に使用して先行技術の方
法ではとねまで除外されていた分析物の濃度を測定する
ことが可能となることが見い出された。

本発明は更に上述の方法に有用なある種の新規な試薬を
も包含している。

定義 本文で使用されるＤＢＳ、すなわちスルホコハク酸ジオ
クチルナトリウムは構造式 を有する化合物、スルホブタンジオイック・アシド１，
４−ビス（２−エチルヘキシル）エステルナトリウム塩
である。ナトリウム塩に加えて、他の塩例えばカリウム
塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩および
その他の均等な塩も本文にＭｅ載の如く本発明の範囲内
に包含される。

本文で使用される「リガンド」なる語は、結合蛋白質例
えばレセプターあるいは抗体が得らｈるかまたは形成さ
れ得る分子例えばハブテンを称する。このようなハブテ
ンは、動物に注入されたとき抗体形成を誘起しないが、
抗体に対して反応性である一般に低分子量の蛋白質を含
まない化合物である。更に、「リガンド」なる語は、中
程度の捷たけ高い分子量の化合物例えばＣ−反応性蛋白
質のような蛋白質を称することもある。ハブテンに対す
る抗体は、まずハブテンを蛋白質に共役させ、そして共
役生成物を動物に注入することによって一般に生産され
る。得られた抗体は通常の周知の抗体単離技術により単
離される。

本文で使用される「リガンド類似体」なる語は、−価あ
るいは多価ラジカルを称し、このラジカルの実質的な部
分は、レセプターの結合部位に対するリガンドと拮抗し
得る１種またはそれ以上の決定因子またはエピトープ部
位を定めるリガンドと同じ空間および極性機構を有して
いる。このようなリガンド類似体の特徴は、関心のある
リガンドに対して十分な構造類似性を有してリガンドに
対する抗体によって認識されるようになっていることで
ある。たいていの場合、リガンド類似体は分子表面の軍
費な部分に対して関心のあるリガンド（本発明の目的に
適う、ＣＲＰ）と同一もしくは実質的に同一の構造およ
び帯電分布（空間および極性機構）を有している。往々
にして、ノ・ブテンのだめの結合部位はリガンドに結合
させるためのトレーサーに使用されるのと同じであるの
で（抗体生産のための抗原の調製において）、抗体に対
する鋳型を提供するリガンド類似体の同一部分はトレー
サーにおいてリガンド類似体により露出される。

本発明はフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体の
使用を包含している。特に、トレーサー化合物の有用性
のために必要とされるフルオレセインおよびその誘導体
の特性はフルオレセインの螢光である。これらの化合物
は適当な波長の偏光で励起されると螢光反応を示し、こ
れによシ螢元偏光測定を行うことが可能となる。一般に
、本発明によって提供される検定で使用されるトレーサ
ー化合物は測定すべきリガンドあるいはリガンド類似体
とフルオレセインあるいはフルオレセイン誘導体との共
役体から形成され、そして溶液中で生物学的に計容し得
る塩例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム等とし
て存在し、これによυ本発明の分析法で使用した場合化
合物が開環、螢光形態で存在することが可能となる。存
在する特定の塩はｐＨレベルを調節するのに使用される
緩衝剤によって圧右される。例えば、りん酸ナトリウム
緩衝剤の存在下で、本発明に使用される化合物は一般に
ナトリウム塩として開環形態で存在する。本発明に使用
するのに適したフルオレセイントレーサー化合物ｔｒｉ
９ｆｌ　、ｊｉｉカルボキシフルオレセンフルオレセイ
ンインチオシアネート（ＦＩＴＣ）、トリアジニルアミ
ノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）および先にあげた先行技
術に開示されたものを包含する多くの他の周知の化合物
を包含する。

使用のために特別な螢光トレーサーの選択は本文の教示
によシ通例の選択の問題であり、そして本発明の実施に
決定的なものではない。

本発明の方法によれば、測定すべきりガントを含む試料
ｆＤＥ：Ｓの存在下トレーサーおよびリガンドとトレー
サーとに特異的な抗体と混合させる。本発明の実施に有
効な反応混合物中のＤＢＳの濃度範囲は特定のりガント
、抗体および検定に用いられる他の試薬によって左右さ
れる〃ζ一般には約０．００１乃至約１．０％（重量／
容量）、更に好ましぐは約０．００２乃至約０．５％（
重量／容量）、最も好ましくは約０．００５乃至約０．
１％（重量／容量）の範囲にある。試料中に存在するリ
ガンドおよびトレーサーは限られた数の抗体部位と拮抗
し、結果としてリガンド−抗体およびトレーサー−抗体
複合体が形成される。トレーサーおよび抗体の濃度を一
定に保持することによシ、形成されるリガンド−抗体複
合体対トレーサー−抗体複合体の比は試料中に存在する
リガンドの量に正比例する。従って、混合物を偏光で励
起し、そしてトレーサーおよびトレーサー−抗体複合体
により発する螢光の偏光を測定すると、試料中のリガン
ドの甘を定量的に測定することが可能となる。

抗体と複合されていない溶液中のトレーサーは、吸収に
必要な時間よりも短い時間で自由回転し、そして再発光
される光は比較的無作為に配向さね、その結果抗体に複
合さ負ていないトレーサーの螢光偏光は低く、零に近い
。特定の抗体と複合すると、このようにして形成さｆま
たトレーサー−抗体複合体は、比較的小さいトレーサー
分子の回転よシも遅い抗体分子の回転をするものと予想
され、これによって観察される偏光が増大さ名る。従っ
て、リガンドが抗体部位についてトレーサーと拮抗する
場合、得ら名た遊離トレーサーとトレーサー−抗体複合
体との混合物の螢光の観察される偏光はトレーサーの偏
光とトレーサー−抗体複合体の偏光との中間にある値を
示すものと予想される。試料が高濃度のりガントを含有
しているときは、観察される偏光値は遊離リガンドの値
によｐ近くなる、すなわち低くなる。供試試料が低濃度
のりガントを含有しているときは、偏光値は結合リガン
ドの値によシ近くなる、すなわち高くなる。免疫検定の
反応混合物を順次垂直偏光次いで水平偏光で励起し、そ
して発光された光の垂直偏光された成分のみを分析する
ことによシ、反応混合物での螢光偏光を正確に測定する
ことができる。偏光と測定すべきリガンドの濃度との間
の正確な関係は、既知濃度を有する検量体の偏光値を測
定することによシ確立することができる。リガンドの濃
度はこのようにして作成した標準曲線から内挿すること
ができる。

本発明の方法を実施するｐＨは、トレーサーをそのイオ
ン化された状態で存在させるのに十分でなければならな
い。

ｐＨは約３−１２、更に普通には約５−１０の範囲、最
も好ましくは約６−９の範囲におシ得る。検定操作中ｐ
Ｈを得て、維持するのに、種々の緩衝剤を使用すること
ができる。代表的な緩衝剤には、／Ｉ丘つ酸塩、酢酸塩
、シん酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等が包含さ
れる。使用される特別な緩衝剤は本発明にとって限定的
ではないが、個々の検定においては使用される抗体およ
び測定すべきリガンドに鑑み、特定の緩衝剤が好ましい
こともある。緩衝剤の陽イオン部分は一般に溶液中のト
レーサーの陽イオン部分を決定する。

本発明の方法は適度の温度、好脣しくは一定の温度で実
施される。温度は普通約０℃−約５０℃、更に好１しく
は約１５℃−約４０℃の範囲にある。

本発明に従って検定されるリガンドの濃度は一般に約１
０−２乃至約１０−１３Ｍ、更に通常では約１０→乃至
約１０−”　Ｈに変化する。高濃度のリガンドは当初の
試料を希釈すると検定することができる。

リガンドの濃度範囲に加えて、例えば、検定が定量的、
半定量的あるいは定量的であるか否か、使用する装置お
よびトレーサーおよび抗体の特徴を考慮すると普通使用
されるトレーサーおよび抗体の濃度を決定する。試料中
のリガンドの濃度範囲は通常検定の感度を最適とするの
に他の試薬、すなわちトレーサーおよび抗体の濃度範囲
を定めるヵζ個々の試薬濃度は経験則で定めることがで
きる。トレーサーおよび抗体の適切な濃度は当業者によ
って容易に確定される。

本発明の一部を形成するものではないが、本発明で提供
されるリガンドのための螢光偏光免疫検定法は、ＴＤ。

（登録商標）フルオレセンス・ボーラリゼーション・ア
ナライザー（Ｆｌｕｏｒｇｔｔｅａ％ｃｍ　Ｐｏ１ａｒ
ｉｚａｔｉｏｎ　Ａｎａｌ−ｙｇｇｒ）［７ポツト・ラ
ボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉ
ａｓ　）、アポツレバーク（Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ）
、イリノイで商業上入手可能で＝１．ここからこのアナ
ライザーの操作および特徴に関する細部が入手し得る〕
で本発明に従って試薬および検定操作を用いて特に有利
に達成することができる。

本発明はまた本発明の検定に用いるための試薬を包含し
、この試薬は検定の実施に当り希釈するととｈ寸でに記
載した濃度範囲内に反応混合物でＤＳＳ濃度を生じる。

試薬中のＤＳＳの濃度は使用することが企図されている
検定プロトコールによって変るが、有利には約０．０１
乃至約２０．０％（重量／容量）ＤＳＳ、更に好１しく
は約０．０２乃至約１５．０％（重量／容量）ＤＳＳお
よび最も好ましくは約０．０５乃至約１Ｏ５０％（重量
／容量）ＤＳＳを包含している。本発明の試薬の溶媒系
は水性溶媒あるいは水に混和し得る有機溶媒例えばエチ
レングリコール、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ，Ｄ
ＭＦ、低級アルカノール等の１種またはそれ以上であり
得る。一つの境在特に好ましい溶媒系は２−プロパツー
ル、Ｄ＃；Ｏおよびプロピレングリコールの混合物であ
る。ＤＳＳｆｆ：含む試薬は好捷しくに検定で使用する
ための前処理緩衝溶液である。

実施例 次に実施例をあげて本発明の着想に従って行われる実験
を記載し、そしてこれらの実施例は螢光分極技術を用い
るＣＲＰおよびＴ３の検定に係るものである。実施例は
先行技術による陰イオン界面活性剤を使用する顕著な技
術上の難点を提供するリガンドについて例示しているも
のであるが、本発明の着想は本文に記載の如く他のリガ
ンドの検定についても同等に適用し得ることが明白であ
る。このような検定は次の一般的操作に従って行うこと
ができる。

１）標準または供試血清の測定量を試験管に送り、ＤＳ
Ｓからなる前処理緩衝剤で希釈する； ２）既知濃度の抗血清を試験管に加える；３）任意に界
面活性剤を含有する既知濃度のトレーサーを次に各試験
管に加える； ４）反応混合物を室温で培養する； ５）抗体に結合されたトレーサーの量を試料中のリガン
ドの量の標準として螢光分極技術により測定する。

本発明の原理は非自動化検定に十分に適用し得るが、Ｔ
Ｄｓ検定の自動化性状により検定の実施あるいはデータ
の解釈のための技術者の時間が最小となるようにされる
。

実施例１゜ ＣＲＰは、臭化シアン活性化セファロースにより共有結
合された肺炎球菌Ｃ−多糖類でのカルシウム依存アフィ
ニティークロマトグラフィーにより、悪性腫瘍腹水およ
び胸膜液から得られる。次に、このものをカルシウムイ
オンの存在下分子ふるいクロマトグラフィーとアガロー
スに対する親和力による混在ＳＡＰの除去と組合せてア
ルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｇｌ）ＡｃＡ　４４　（アク
リルアミド−アガロース・ビーズ）でゲル濾過する。残
留痕跡量の不純分はセファロースで不溶化した抗圧常人
血清および抗ＳＡＰ抗体による免疫吸着によって、そし
て糖蛋白質を除去するためのセファロース−ＣｏｎＡお
よびアルブミンを除去するためのブルー−セフロースで
の吸着により除去する。セファクリル（Ｓｇｐｈａｃｒ
ｙＬ　）　Ｓ　−３００での最終ゲル濾過工程の後、最
初のＣＲＰの３５−４０％が実質的に純粋な形態で採取
される。

完全フロインドアジュバントに懸濁した単離ＣＲＰの深
部皮下もしくは筋肉内注射次いで不完全アジュバント中
のエマルジョンの隔週または毎月の促進注射によシ、羊
および山羊を免疫する。各注射は少くとも５００μグの
ＣＲＰを含有している。この規則を全動物について５ケ
月間続行し、この間動物を隔週または毎月の飼育間隔で
抗体力価をモニターする。次に、促進注射を３ケ月間中
断し、一方力価モニターを続ける。３ケ月の休止期につ
いで、力価が低下し始めるにつれて促進注射を一士開す
る。

トレーサー合成りＴＡＦ／ＣＲＰ ５−（４，６−ジクロｏ−トリアジン−２−イル）−ア
ミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）のストック溶液を超音
波処理の助けで無水エタノール中２〜／−で調製する。

ストックＣＲＰは０．００５−Ｅニルｌ’：１う酸塩緩
衝剤、ｐＨ９，０゜０．００２モルＣａＣｔ、および０
．９％ＮａＣＬ　を３η／−で含有し、そして０．０４
モルはう酸塩緩衝剤ｐＨ９，０，０，００２Ｍ　ＣａＣ
１，，０，９％ＮａＣＬ５００μｖＩ７）濃度とする。

（５００μ９７ａｔ）ＣＲＰ浴ａ１ｍｔ、に、ストック
ＤＴＡＦの２５μＬを加える。次に、暗所で混合しなが
ら周囲の温度で１時間カップＩル′グ反応全行う。１時
間の終りに、ＤＴＡＦ反応物を１０％グリシン５０μｔ
（ｏ、ｏ４モルｔ１う酸塩緩衝剤、ｐＨ９，０、上述し
たものと同じ緩衝剤）で急冷し、そして上記条件で１５
分間混合しながら培養する。

複合体ヲセファデックスＧ−２５でクロマトグラフィー
処理し、そしてＩｊつ酸塩緩衝剤ｐＨ９，０（上述した
ものと同じ緩衝剤）で溶離し、そしてボイドボリューム
で採集する。

次に、ＴＤ、アナライザーでの自動検定で使用するため
に、このものを所望の濃度に希釈する。

トレーサー：ストックＤＴＡＦ／ＣＲＰ複合体を蛋白質
および塩安定剤および防腐剤として０．１％Ｈａｎｇを
含む緩衝剤で希釈してＴＤｚアナライザーで２０のゲイ
ンで３０００の正味強度読みを与える。

抗血清：原ＣＰＲ抗血清の希釈を１＝１０乃至１：１０
０で行う。各希釈液２５μｔをキュベツトに入れ、そし
て０、ＩＭＦ）ん酸塩緩衝剤、ｐＨ７，５，０，０１％
牛−γ−エチレングリコーグロブリン（ＢＧＧ）、０，
１％Ｎ　ａ　Ｎｇおよび２％（容量）の最終２−容量中
のトレーサー試薬２５μｔと共に培養する。抗血清およ
びトレーサーを上記緩衝条件下３５℃で３．４分間反応
させる。希釈係数は、螢光側光測、定値に基いて抗血清
について決定する。次に、抗血清試薬を、決定した希釈
係数に従って原抗血清を希釈することによって上記りん
酸塩緩衝剤中で調製する。

前処理：前処理緩衝剤試薬は、０．０５モルトリス、ｐ
Ｈ８，０，０，１％ＮａＮ５（防腐剤）およびその他の
有機安定化溶媒中の３．５％（重量／容量）ＤＳＳの溶
液からなる。

緩衝剤：ＴＤｘ検定緩衝剤は、０．１モルりん酸塩、ｐ
Ｈ７，５，０，０１％牛−γ−グロブリン（ＢＧＧ）お
よび防腐剤としての０．１％Ｎ　ａ　Ｎ３からなる。

検量体二〇−反応性蛋白質は、蛋白質および塩安定剤お
よび防腐剤と［７ての０．１％Ａ／　ａ　Ｎ、を含む緩
衝化合成血清マトリックス中に入れる。

比較対照：（検量体と同じマトリックスに含有される）
ＤＴＡＦ／ＣＲＰ　トレーサーの 成　分　　　　　濃度　ｆ／／ｌ　　　　その他トリス
　　　　　　　　　１２．１１　　　　（０，１モル）
Ｎａ、Ｓｏ、　　　　　　　　　２０．０　　　　　（
２％）（無水） 卵アルブミン　　　　　　５．０　　　　　（（１５％
）加水分解物 プロピレングリコール　　　　２０．０ＷＬｌ　　　（
２％容量）Ｃａｃｔｘ　２　ＨｔＯＯ，２９４（０，０
０２モル） ＮａＮ、　　　　　　　　　　　　１．０　　　　　（
０，１％）６Ｎ　ＨＣｔでｐＨを７．０に調節 上記処方の許容し得る変更： ｐＨ領域　６−８ Ｎａ、ＳＯ４濃度４％およびｐＨ７，０で０．２％卵ア
ルブミン ２％プロピレングリコールを２％エチレングリコールで
置換 Ｎａ、Ｓｏ４を（Ｎｌｌ４）、　Ｓ　Ｏ４で、卵アルブ
ミン加水分解物ヲ卵アルブミンで置換 上記処方物は４５℃で１０日間ＣＲＰ−ＤＴＡＦ複合体
を安定化することがわかる。

トリス　　　　　　　１２．１１　　　　　（０，１モ
ル）ＮａｔＳｏ、　　　　　　　　８．０　　　　　　
　（８，０％）６ＮＨＣ１でｐＨをｐＨ８，０に調節す
る。

上記処方物はＣ−反応性蛋白質を４５℃で３０日間安定
化することがわかった。

トリス　　　　　　　　０．０５モル　　　６．０６ｆ
ＮａＮ３　　　　　　　　０．１％　　　　　１．００
ｆ２−プロパツール　　　　１０％容量　　　１００．
０祠ＤＭＳＯ２５％容量　　　２００．Ｏａｄプロピレ
ングリコール　　５％　容量　　　２０．０ｍクチルナ
トリウム ６ＮＨＣ１でｐＨを８．０に調節する。この前処理組成
物は、８．０μｔの試料容−１ｃＲＰ検定を用いて、ビ
リルビン濃度２０ｍ９／ｄｔでビリルビン干渉を除去す
るのに有効であることがわかった。

検定操作 ＣＲＰのための螢光偏光免疫検定（ＦＰＩＡ）は次の如
（ＴＤｚ・フルオレセンス・ポーラリゼーション・アナ
ライザー（ＴＤｗ　Ｆ１１Ｌｏｒｔｓｅｅｎ口Ｐｏ１ａ
ｒｉｚａｔｉｏｎ　Ａｎａ−ｊｙｇｇｒ）で実施する。

反応順序、培養、時期、試薬容量および試料容量は、プ
ログラム検定パラメーターに従ってマイクロプロセッサ
制御されている。ＣＲＰ検定を行うには、試料および試
薬をそれぞれの受は器でＴＤｘアナライザーに装填する
。試料、抗血清、前処理試薬、および緩衝剤を反応部め
に分配する。希釈試料の最終容量の３Ａを、最終反応容
量の％とするのに十分な緩衝剤と共にキュベツト中に分
配する。試料、抗血清および前処理試薬の混合物につい
て基底強度値の読みをとる。希釈試料の第二の半量をト
レーサーおよび緩衝剤と共にキュベツトに分配して最終
反応容量２−とする。最終強度測定を行う。Ｔ　Ｄ　ｚ
　／　ＣＲＰ操作を達成するための特定の検定順序は次
の工程からなる＝１、試料８．６μｔｆ反応溜めに分配
し、そして緩衝剤２５μｔな加える。

２、前処理試薬１０μｔおよび抗血清試薬２５μｔを反
応溜め中の試料に加え、そして緩衝剤４３１．４μｔを
加えて最終反応溜め容量を５００μＬとする。

３、前処理試薬の追加２５μｔをキュベツトに分配する
。

４、反応溜めに入っている試料、抗血清および前処理混
合物の１７４μｔをキュベツトに移し、緩衝剤７７６μ
ｔで希釈して中間キュベツト容量１０００　ｔｔｔとす
る。

〔註〕工程１〜４を各試料についてくシかえし、そして
試料当り１８．４秒で達成する。

５、キュベツト内容物を３４℃で６．４分間培養し、一
方３．４分で基底値を読みとり、そして各試料について
保存する。

６、基底値記録に従って、試料、抗血清および前処理試
薬混合物の追加１７４μｔを反応溜めからキュベツトに
移し、そして緩衝剤２０μｔを加える。

７、トレーサー試薬２５μｔをキュベツトに加え、そし
て十分な緩衝剤（６０１μｔ）を加えて最終キュベツト
容量２−とする。

８、最終キュベツト反応混合物を３．４分間培養し、そ
して各試料について最終読み取シをする。

９、ブランクの読み取り値を最終読み取υ値から差引き
し、そして各試料について正味の偏光読み取り値を記録
する。

１０、正味の偏光読み取ｐ値を、既知のＣＲＰ濃度の検
量体から予め得られた検量曲線から得られた４種の保存
数学定数を用いて、ＣＲＰ濃度に変換する。４種の定数
は、ＴＤｘアナライザーと組合されたデータ処理システ
ムの一部でるる最小−２乗曲線−フィツト４種パラメー
タープログラムによシ求める。

前述の如く、本発明に従って達成される検定を用いて、
正常濃度のＣＲＰを含む試料に加えてそれぞれ概略濃度
２、】０および２０ｒｎｆ／／　ｄｔ　ＣＲＰとするＣ
ＲＰの回収率は、それぞｉ、１００％、１００％および
９９．６％である。

僅かに上昇した濃度のＣＲＰｆ含有する２種の他の試料
に１０ｍ９／ｄｉの概略濃度金加える。これらの試料か
らの回収率は９８．９％および９７．４％であった。結
果を以下に要約する。

当初の試料　　添加された　　測定ＣＲＰ　　　　回収
率、１５　　　　　２．１９　　　　２．３４　　　１
００．１５　　　　１０．９６　　　１１．１１　　　
　１００．１５　　　　２１．９２　　　２１．９９　
　　　９９．６１．７３　　　　　９．５５　　　１１
．１７　　　　９８．９１．６８　　　　　９．５５　
　　１０．９８　　　　９７．４果 ビリルビン［シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ　ｉ　
ｇｍａＣｈａｔｎｉｅａｌ　Ｃｏ、）、カタログ／ｌ６
Ｂ４０１２６：］のストック溶液を０．　Ｉ　Ｍ　Ｎ１
１ＬＯＨ中１０００ｍ９／　ｄＬで調製する。

ストック溶液を用いて低（Ｌ）、中ＣＭ）および高（Ｈ
）ＣＲＰ含有標準血清試料をスパイク（５ｐｉｋｅ　）
　　して以下に述べる如く試料中のビリルビン濃度を得
る。次に、試料を、ａ）先に記載したＤＳＳを包含する
前処理試薬組成物、あるいはｂ）ＤＳＳの代りにドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．７％、およびドデシル
硫酸ナトリウム（ＬＤＳ）０．５％からなる以外は前述
のとおシの前処理試薬組成物を用いて、前述の操作に従
って、検定する。各検定に対するビリルビン干渉％は次
の方程式に従って求める。

この式で、〔ＣＲＰＢ〕はビリルビン含有試料中のＣＲ
ＰＯ測定濃度であり、そして［ＣＲＰＣ）はビリルビン
を伴わない対応する比較対照中のＣＲＰの助］定濃度で
ある。結果は次のとおシである。

濃　度　　試験ＣＲＰ　　　ＳＤＳ／ＬＤＳ　　　　Ｄ
　Ｓ　Ｓ４．８　　　　　　　　Ｌ　　　　　　　　　
１７．１　　　　　　　４．８Ｍ　　　　　　　　　　
４．３　　　　　−０．８Ｈ８，３０，９ ９，８Ｌ　　　　　　　　　３０．９　　　　　−４．
９Ｍ　　　　　　　　　　５．６　　　　　−２．１Ｈ
１１，１３，５ １４，８Ｌ　　　　　　　　　４１．５　　　　　　　
２．８Ｍ　　　　　　　　　　７．２　　　　　　　１
．９Ｈ１２，２１，９ ２０，３Ｌ　　　　　　　１００＋６．１Ｍ　　　　　
　　　　　　９．６　　　　　−０．４Ｈ１８，８４，
１ ２４，６Ｌ　　　　　　　１００＋１８．１Ｍ　　　　
　　　　　　７．３　　　　　　　４．８Ａ　　　　　
　　　　］　　８．０　　　　　　　７．９ヒト血清試
料ｆｃＲＰ試験を必要とする患者集団から１．５ケ間の
期間にわたって得る。各試料についてのＣＲＰ値は商業
的比濁分析法を用いて病院で得られる。試料を凍結輸送
し、次に前述の如くＣＲＰ検定によシ試験する。両方の
方法から得られる患者の結果を直線回帰分析によシ比較
する。供試３４５試料について次の結果が示される。

相関係数＝０．９９２ スロープ＝（１９７６ Ｖ−インターセプト＝３．０μＳ’／ｍｇフィールド研
究を地方病院で約２週間実施した。この期間中、次の３
種の方法を用いて７０の臨床検体を試験した。

すなわち、比濁分析法（ＮＰＭ）、放射線免疫拡散法（
ＲＩＤ）および前述の本発明による検定法（ＴＤｚ　Ｃ
ＲＰ）である。３種の方法からの相関データを次のとお
シ要約する。

一４１＝ 比較した方法　　　スロープ　インターセプトｒＴｌｋ
　ＣＲＰ対ＮＰＭＣＲＰ　　　１．０６　　−０．１７
　　０．９９ＴＤｚ　ＣＲＰ対ＲＩＤ　ＣＲＰ　　Ｏ，
９７０，４００，９９ＮＰＭ　ＣＲＰ対ＲＩＤ　ＣＲＰ
　　０１９１　　　０．５０　　０．９８検定感度 ０、３　ｍ９７　ｄｔの検知限界は、２ｏの「零」検量
体複製のミリ偏光（ｍＰ）平均値からと９去った２つの
標準訪導体に基いていた。次に、得らねたｍＰを、ＣＲ
Ｐ濃度０．３■／ｄｔに相当することがわかっている検
量曲線で読みとった。

Ｘｔ６　＝２７０．５５　ｍ　Ｐ 標準誘導体＝０．５２９　ｍＦ 標準誘導体＝　１．０６　ｒｎＰ＝０．３１１１／　ｄ
Ｌ本文に含まれる本発明の特別な開示から、本発明の精
神および範囲を逸脱することなく、当業者が種々の変化
および変形をなし得ることが明らかである。

−４３＝

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、螢光偏光免疫検定法により試料中のリガンドの存在
   または量を測定する方法において、スルホコハク酸ジオ
   クチルナトリウムの約０．００１乃至約１．０％（重量
   ／容量）の存在下に螢光偏光免疫検定法を実施すること
   を特徴とする螢光偏光免疫検定法。 ２、螢光偏光免疫検定法をスルホコハク酸ジオクチルナ
   トリウムの約０．００２乃至約０．５％（重量／容量）
   の存在下で実施する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、螢光偏光免疫検定法をスルホコハク酸ジオクチルナ
   トリウムの約０．００５乃至約０．１％の存在下で実施
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム約０．０１乃
   至約２０．０％（重量／容量）を包含する螢光偏光免疫
   検定法に使用する試薬。 ５、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム約０．０２乃
   至約１５．０％（重量／容量）を包含する特許請求の範
   囲第４項記載の試薬。 ６、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム約０．０５乃
   至約１０．０％（重量／容量）を包含する特許請求の範
   囲第４項記載の試薬。