JPS5811857A - アデノシンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アデノシンをラジオイムノアッセイにより定
量する方法に関するものである。

アデノシンは、生体内におけるプリン系核酸→ヌクレオ
チドの分解過程の１中間体として、また９　　ゝ サルベージ反応の基質としてよく知られてきた。

最近になって、いくつかの実験データからアデノシンが
重要な生理作用をもつ可能性か示唆されてきている。代
表的な例を示せは以下のとおりである。

■　アデノシンには冠状循環増強作用があり、冠血流量
の生理的調節物質として働いているといｐ３１７、（１
９６８）　）。

■　アデノシンかサイクリックＡＭＰのレベル調節に大
きな役割を果たしていて、しかも組織や細胞の種類によ
ってその効果が正、負と反対方向になることが知られて
いる（　ｐｒｏｃＮａｔｌ（１９７７））。

サイクリックＡＭＰか増量する系： リンパ球、脳スライス、線維芽細胞、血小板など サイクリックＡＭＰが減量する系； これらのことから、アデノシンはフ；Ｌに細胞より分泌
されていてホルモン作用を修飾している可能性か考えら
れている。

欠如している遺伝性疾患患者の赤血球にアデノシンデア
ミナーゼの欠損か発見されたことから、次のような仮説
がうちたてられた。デアミナーゼ欠損→アデノンン増量
→ビリミンン代謝異常→リンパ球発育１引１に→免疫不
全−（１，ａｎｃｅｔ、２、ｐ１０６７、（１９７２）
）。

以上のように、アデノシンは単なる代謝産物としてては
なく、細胞間のメツセンジャー機能を有する重要な生理
活性物質として何らかの標的あるいはレセプターに作用
していると考えられるに至っている。したかつて、種々
の生理的状態、病的状態におけるアデノシンの生体内含
１■を測定することは、基礎医学研究の分！ｌ！Ｆにお
いてはいうまでもなく、臨床医学の分野においても病気
の予防、診断および治療に関連して重要な意義をもっこ
とが期待されている。

従来、アデノシンの測定法として原理的に異なるいくつ
かの方法が報告されているか、生体試料中のアデノシン
の定量に実用的な方法の一つに酵素法が知られている（
　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　１３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
。

−１」、ｐ８７７　（１９７９））。この方法は、生体
試料中のアデノシンをアデノシンデアミナーゼ齋こよっ
て脱アミノしてイノシン１こ導びき、イノシンにりん酸
の共存下でプリンヌクレオシドホスホリラーゼを作用さ
せてヒボキサンチンとし、次いでヒボキサンチンにキサ
ンチンオキシターゼを作用させ、生じた過酸化水素をペ
ルオキシダーゼを用いる蛍光法で定量する方法である。

しかしながら、この方法は、試薬の添加回数および反応
の段階が多く定量操作が繁雑であり、また最小測定限界
２０ｐ　ｍｏｌ　／　ｔｕｂｅと感度が低いなどの欠点
がある。

−し また他の定量法としてパイディングプロティン基」、ｐ
１３２〜１３８　（１９７８））。これは、７′′ ウサギ赤血球よりアデニンアナ口−一一パインデイング
プロテインを調製し、８Ｉ−■−アデノノンと試料中の
アデノシンを競合反応さゼるコンペティテイブ・プロテ
ィン・パインディンク・アッセイ　（沓 ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｉｎｄｉ
ｎｌｌ　ａｓｓａｙ）　ノ一種である。しかしこの方法
にも、パインディングプロティンの特異性が低いために
、アッセイに際しては試料中のアデノシンをＰＥＩセル
ロースカラムクロマトグラフィーにより単離するための
前処理を必要とする欠点がある。

一方、近年生体内の微量物質を定■する方法としてラジ
オイムノアッセイ法か開発され、種々の生体内物質の定
量に応用されているか、アデノシンの定量にラジオイム
ノアッセイ法を応用した報告はまた知られていない。ラ
ジオイムノアッセイ法は、試料中の測定対象物質と既定
量の放射性リガンドとを既定量の抗体に対して競合的に
反応させ、その後抗体に結合した放射性リガンドもしく
は遊離の（未結合の）放射性リカンドの放射能量を測定
して試料中の測定対象物質を定量する原理に基つく方法
である。従来、アデノシンの抗原およびその抗体の作製
法としては、アデノシンを過ヨウ素酸ナトリウムで処理
してリボース残基の２′位および３′位間の結合を酸化
的に開裂させ、過剰の過ヨウ素酸をエチレングリコール
で中和した後、１）Ｈ９〜９５てウノ血清アルブミン（
ＢＳＡ）とカップリンクさせ、水素化ホウ素ナトリウム
で還元してハブテンとＢＳＡとの結合を安定化して抗原
を得る方法、これをウサギに免疫させて抗体をＵＳＡ、
５２、Ｉ）６８　（１９６４））。本発明者は、この抗
体をラジオイムノアッセイに応用することを試み、この
抗体に対してアデノシンを抗原抗体反応させたところ、
抗体に対するアデノシンの結合能がほとんどな（、アデ
ノシンの定量への応用は不可能であることを知見した。

さらに、測定試料中のアデノシンあるいは放射性元素標
識アデノシンに対して、抗原作成時と同様の処理、すな
わち過ヨウ素酸処理、エチレングリコール処理を施して
抗原抗体反応に供すれば、抗体との結合反応゛か生起し
、イムノアッセイか可能であることか判明した。しかし
ながら、この方法は試料の前処理が２段階を要し、しか
も処理後の放射性リカンドおよび試料中のアデノシンか
不安定である問題があり、アデノシンの実用的な定は法
を確立するまでに至らなかった。

本発明者らは、アデノシンをラジオイムノアッセイによ
り簡便かつ高感度に定量する方法を確立縁アミンの存在
下で無水コハク酸などの酸無水物を反応させると、アノ
ルノｌ（か導入される可能性のあるＮ６位アミン基、２
′位水酸基、３′位水酸基および５′位水酸基のうち、
意外にも２′位水酸基および３′位水酸基に対して優先
的１こアシル化が進み、適当な反応条件下では約８５％
以上の収率でｚ、３′−ジアシルアデノシンが生成する
こと、 ■　ｊ−記のようにアデノシンをジカルボン酸の酸無水
物によってアシル化して得られる、たとえば２’、８’
−ジアシルアデノシンと、担体蛋白とを縮合剤によって
縮合させ、抗原を作製し、これを動物に免疫させれば、
感度の高い抗アデノシン抗体が得られること、 ■　かくして得られる抗アデノシン抗体は、アデノシン
に対しては全く結合能かなく、その反面、２’、８′−
ジアシルアデノシンに対してきわめて特異的に親和性と
高い結合能を有すること、■　試料中のアデノシンを２
′、「−ジアシルアデノシンに導びき、２′位および３
′位水酸基がアシル化された放射性元素標識アデノシン
とともに該抗アデノシン抗体に反応させると、相互の濃
度に依存する競合的な抗原抗体反応が生起し、高感度の
ラジオイムノアッセイが可能であること などの知見を得、どれらの知見を総合することにより本
発明方法を完成するに至った。

すなわち、本発明方法は、 ■　液体試料およびアデノシン標準溶液にアシル９−　
　　　゛ 化試薬を添加反応させてアデノシンの２′位水酸基およ
び３′位水酸基をアシル化し、 ■　該アシル化反応終了液に緩衝液を加えて希釈した後
、（イ）これらに、（ロ）既定■の放射性元素標識２′
９ｇ−ジアシルアデノシンと、（ハ）アデノシンの２′
位水酸基および３′位水酸基と担体蛋白とをジカルボン
酸残基を介して結合させてなる抗原によって得られた抗
アデノシン抗体の既定量ノシンと、抗アデノシン抗体に
結合した放射性元素標識アデノシンとを分離し、いずれ
がの放射能量を測定することにより試料中のアデノシン
含量を算出する という操作手段からなるアデノシンの定量法である。

本発明方法によれば、その最適実施態様では、０．１２
５〜６４ｐｍＯ１／１ｕｂｅノ測定範囲で、高感度かつ
高精度のアデノシンの定量が可能である。また、血液、
尿などの体液試料は除蛋白やアデノソー　　　１０　゛ ンの単離精製のための前処理を必要とせず、組織試料に
ついても酸抽出液をそのまま本発明方法のアッセイに供
することができる。

以下、本発明の具体的構成および効果について本発明方
法の操作手順にしたがってより詳細に説明する。

〔１〕　　測定試ネ］の調製 生体試料の調製については特に制約されるもののではな
い。血漿、髄液、尿などの体液試料は前処理を必要とぜ
す、そのまま直接次のアシル化反応に適用できる。しか
し、血漿試料の場合は、保時 血後経−的にアデノジンデアミナーゼ１こよるアデノシ
ンの分解や血球によるアデノシンの取り込みが進行し、
アデノジン含量の低下をきたす。アゾ否 ノシンデアミナーゼの活性を阻震するためにマン害 ガンイオンなどのアデノシンデアミナーゼ阻履剤、また
血球の取り込みを抑制するためにリドカインモジ＜はベ
ンジルアルコールなどの局所麻酔剤を採血直後に添加す
るとよい。各薬剤の使用量はそれぞれの種類に応して任
意に定めつるか、たとえばマンカンイオンの場合約１０
ｍ、Ｍ程度、リドカイン、ベンジルアルコールの場（７
約＋１．２〜０４％程度試料中に存在するように用いれ
ばよい。一般組識は酸（たとえば、塩酸、過塩素酸、ト
リクロル酢酸など）で除蛋白、抽出を行ない、中和して
アシル化反応に適用する。

〔■〕　　抗アデノソン抗体の調製 本発明方法における抗アデノシン抗体は、抗原としてア
デノシンの２′位水酸基および３′位水酸基と担体蛋白
とをジカルボン酸残基を介して結合させてなる抗原を用
いて動物に免疫させることにより調製することができる
。

抗原のジカルボン酸残基の具体例としては、コハク酸残
基、グルタル酸残基などが挙げられる。

また、担体蛋白には、血清アルブミン、グ１プリン、ヘ
モシアニン、オバルプミン、フィブリノーゲンなどが適
用されうるが、血清アルブミンが一般的に用いられる。

抗原の調製は次のとおり行えばよい。

ジン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、ジメチ
ルスルホキシド、ジエチレンゲルコールジメチルエーテ
ル、ヘキサメチルホスホルトリアミド、テトラハイドロ
ピラン、テトラハイドロフラン、メチルセロソルブアセ
テートなど）混合溶媒中で、ジカルボン酸の酸無水物（
たとえば、無水コハク酸、無水グルタル酸などうを有機
三級アミン（たとえばトリエチルアミン、４−モルホリ
ノ−Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルホキサミンなど）
の存在下反応させる。反応は室温下で数秒〜士数分で十
分進行する。

■　２’、８’−ジアシルアデノシンと担体蛋白との縮
合 ２’、　　８’−ジアシルアデノシンのアシル基残基の
遊離のカルボン酸部分と担体蛋白のアミン基などとを縮
合反応させる。縮合反応ζこは特に制約されず、たとえ
ば、ジシクロへキシルカルボジイミド、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（
ＥＤＣ）、１−エチル−３−（８−ジエチルアミノプロ
ピル）−カルボジイミド、■−シクロへキシル−３−（
２−モルホリノエチル）−カルボジイミド、Ｎ−メチル
−Ｎ、Ｎ’−ジｔ−プチルカルボジイミジウムテトラフ
ルオロホウ酸塩などのカルボジイミド試薬の存在下で両
者を縮合させるカルボジイミド法などを適用すればよい
。さらに縮合剤と１．てウッドワード試薬Ｋを用いる方
法、酸無水物法などを適用することもてきる。

縮合反応の条件は常法による。

抗体は、上記のようにして得られる抗原を常法によって
、ウサギ、ラット、ヒツジ、ウマ、ウシなどの動物に免
疫させることにより得られる。抗体としては、このよう
な動物から得られる抗血清を用いることができる。また
、抗血清から抗体を精製してもよいし、抗体をペプシン
などの酵素処理によりＦ　（ａ　ｔ）’　）２　　フラ
グメント、さらに２−メルカプトエチルアミンなとの還
元剤処理により得られるＦ　ａ　ｂ’フラグメントなど
の抗体活性画分も用いうる。

また、免疫動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを公
知の方法により細胞融合させ、得られた融合細胞（ハイ
ブリドーマ）をｉｎ　ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ　ｖｉｖ
ｏ　　で増殖させて得られるモノクローナル抗体を使用
子ることもてきる。

さらに、−抗体は、液相法によるアッセイ用には各種緩
衝液溶液または凍結乾燥物として調製されるが、固相法
によるアッセイ法用には不溶性担体に固相化して調製さ
れる。

抗体を固相化させる不溶性担体としては、ソリコーン、
ガラス、セラミック、ポリスチレン、スチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体、ポリエチレン、ポリプロピレン、
架橋ポリアクリルアミド、ＣＭナセルース、ＤＥＡＥセ
ルロース、架橋デキストランなど一般のイムノアッセイ
で用いられうすれてもよい。不溶性担体に抗体を同相化
させる方法も公知の方法によればよく、たとえば直接物
理的に吸着させる方法、グルタルアルデヒド、２゜２−
ジピリジルサルファイド、ｐ、ヴージフルオローｍ、イ
ージニトロジフェニルスルホンなとの二官能基性の化学
結合剤を介して化学的に結合させる方法が適用される。

〔■〕　　放射性元素標識２’、３’−ジアシルアデノ
シンの調製 放射性元素様ｍ　２’　、　　８’−ジアシルアデノシ
ンの標識用放射性元素としては　８Ｈ、１２５■、！８
１　エなとが用いられる。

３Ｈを標識に用いる場合は、市販の８Ｈ−アデノシンを
用いて、その２′位水酸基および３′位水酸基をアシル
化すればよい。導入されるべきアシル基の種類は、抗体
の作製に用いられた抗原のハプテンと担体蛋白の結合部
分のジカルボン酸残基の種類に応じて選択される。たと
えば、抗原がコハク酸残基を有するものである場合には
、サクシニル基が最も好適に選択される。またサクシニ
ル基と構造を類似する他のアシル基、たとえばアセチル
基、プロピオニル基、ブチリル基、グルタル基などもア
ッセイの測定感度が低下するものの使用することは可能
である。アシル化の方法条件は、抗原作製の項の記載に
準する。このような放射性リガンドのアシル化は、アッ
セイに際して測定試料と同時に行ってもよい。

また、放射性ヨードを標識にする場合は、アデノシンの
２′位水酸基および３′位水酸基にアシル基としてジカ
ルボン酸残基を導入し、遊離のカルボン酸部分にさらに
たとえばチロシンメチルエステルなどを結合させ、この
ベンゼン環に放射性ヨードを標識する手段などが採用さ
れる。

Ｉｎ　　試料および標準溶液のアシル化アシル化反応は
、前記の抗原作製時のアデノシンのアシル化反応に準し
る。すなわち、試料および標準溶液に対して、■−−５
５ｍｇ＠酸無水物と有機三級アミンを添加することによ
りアシル化が行われる。

酸無水物の種類は、放射性元素標識２’、８’−ジアシ
ルアデノシンのアンルｆｆ１ｌｉに準して同様に決定す
ればよい。このような試料および標準溶液のアシル化に
際しては、酸無水物を一定の試薬形態として調製してお
くことが、その定量操作性上好ましい。調製形態として
は、粉末態であってもよいが、予め有機溶媒溶液とした
方が有機三級アミンおよび試料との混和性にすぐれてお
り、取り扱いが容易である。有機溶媒および有機三級ア
ミンの種類ｉこついても前例による。酸無水物と有機三
級アミンとを同一溶媒溶液中に共存させておくと、両者
が反応して２４時間経過時ではそのアンル化能は半減す
る。したかつて、試薬の安定性が求められる試薬キット
などに両試薬を組み入れる場合は、それぞれを別封にす
る必要がある。

試薬の使用量はその種類に応じて適宜に決定すればよい
が、たとえば試薬１００μｌ　に対して酸無水物２０〜
４０μｍｏｌ、有機三級アミン５〜１０μβに有機溶媒
を加えて１．　ＯＯμｐとしたものを用いればよい。

アシル化反応条件も室温で数秒〜士数分て十分である。

たとえばアデノシン５７１ｍｏｌ　　を添加した生理食
塩水または各種試料に対してサクシニル化ヲ行なった時
の２’、８’−ジサクシニルアデノシンの収率を高速液
体クロマトグラフィーによって求めた結果を第１表に示
す。

第１表 〔■〕　　抗原抗体反応 アシル化反応後、測定試ネ゛１は緩衝液を用いて通常５
〜６倍に希釈する。アデノシン標準液は希釈用緩衝液（
通常、アシル化試薬を５〜１０％銅含有する緩衝液）を
用いて順次倍数希釈して、抗原抗体反応に供する。

緩衝液としては、抗原抗体反応を安定に進行させうるも
のであれば適用可能である。本発明方法においては、特
にｐＩ−１５〜８の０１〜０．５　Ｍイミダゾール緩衝
液か好適に用いられる。抗原抗体反応を阻害する非特異
性因子や未反応のアシル化試薬等の影響を実質的に排除
できる工夫を施せば、他の緩衝液、たとえば酢酸緩衝液
、クエン酸緩衝液、りん酸緩衝液なとの使用も可能であ
る。

抗原抗体反応は、既定量の可溶性もしくは不溶性抗アデ
ノジン抗体に対して測定試料中の２’、８’−ジアシル
アデノシンと既定量の放射性元素標識２’、８’−ジア
シルアゾ／シンとを同時もしくは相前後して添加して行
なわれる。放射性元素標識２：３′−ジアシルアゾ／シ
ンの化学量は、８Ｈ−２’、８’−ジサクシニルアデノ
シンの場合０．５〜１　ｐｍｏｌ／１ｕｂｅ　　とする
のが最適である。

抗原抗体反応は、通常、０〜１０°Ｃ１６〜４８時間、
好ましくは１２〜２４時間の条件下で行なわれる。

ＣＶＩ）　　測定 抗原抗体反応が終了した後、抗体に結合した放射性元素
１８１６２’、　　８’−ジアシルアデノシン（以下「
Ｂ」と称する）と結合しなかった遊離の放射性２１　　
”　　　　　　　１ 元素標識２’、８’−ジアシルアデノシン（以下「Ｆ」
と称する〕とを常法により分離１７、そのいずれかの放
射能量を測定する。

固相法の場合には「Ｂ」とＩＦ、Ｊとの分離は、賜 吸引、傾瀉、ろ過なとの方法により容１に行われる。液
相法の場合には、適当な分離剤を用いる方法により両者
の分離が行われる。適用される分離法としては、たとえ
ば抗アデノシン抗体またはそのＦ（ａｂ’）２　　もし
くはｌ？ａｂ’フラグメント番こ対する第二抗体を、第
一抗体作製時の免疫動物とは異種の動物に免疫させて作
成し、得られた第二抗体を用いてｒＢＪを吸着沈澱化さ
せる方法、あるいは第二抗体を適宜な不溶性担体に固相
化してこれにｒＢＪを結合させる方法などの二重抗体法
をはじめ、デキストランでコートした活性炭（ＤＣＣ）
によりｒＦＪを吸着分離する方法、ポリエチレングリコ
ールてｒＢＪを沈澱分離する方法、硫酸アンモニウムを
用いて「Ｂ」と「Ｆ」とを分画する塩析法などが適用で
きる。これらの分離剤による分離操作はそれぞれ公知の
方法によればよい。たとえば、ＤＣＣの場合は、抗原抗
体反応終了液にＤＣＣを加えて遠心分離すれば、上清に
１Ｂ」を回収することができ、その上清を放射能測定に
供すればよい。

放射能量の測定は、液体ンンチレーションカウター、ガ
ンマ−カウンターなど標識に用いられた放射性元素の放
射能量を測定することができる機器を用いて行なえばよ
い。

生体試料中のアデノンン含量は、試料に対する放射能測
定値から下記の式によって結合率＝　Ｂ／Ｔ（４）値を
求め、同様に各種濃度の標準溶液の放射能測定値から求
めたＢ／Ｔ（財）値を縦軸に、横軸に片対数で濃度をと
ってプロットして作成した標準曲線に、試料のＢ／Ｔ（
財）値をプロットすることにより求めることができる。

ｆＴｌ　−（Ｂ　Ｌ） ＦＢ＋・・・生体試料または各標準溶液のカウント平均
値 （ＢＩ、）・・・ブランク平均値 ３ ｆＴｌ・・　総カウント平均値 本発明方法による生体試料の測定における正当性を希釈
、添加実験結果で示す。なお、定量操作の方法条件、試
薬は後記実施例と同様にして行なった。

（１）血漿試料の場合（ｎ−３平均埴土標準誤差）第２
表 （２）肝油出液の場合（ｎ−３平均埴土標準誤差）第３
表 以下、本発明方法の実施例を挙げて、本発明方法のより
具体的な説明とする。ただし、これらは実施態様の一例
を開示するものであり、本発明を限定するものではない
。

実施例 〔１〕　　定量試薬の調製 ■　抗アデノシン抗体の作製用抗原の調製アデノシン６
．７ｇを蒸留水５００　ｖｔｌに溶解させ、これに無水
コハク酸２０９、ジオキサン４５０π１１トリエチルア
ミン５０ｍ１を加えて室温で１０分間撹拌反応させた。

反応液に蒸留水１１を加えて反応を停止させ、減圧上濃
縮した後、残渣を水に溶解させて冷却し、析出した結晶
を濾取した。このジ ｔｆｌ　結晶を水−エタノールー−オキサンから再結晶
して乾燥し、２’、８’−ジサクシニルアデノシン６．
８０ｇを得た。

融点　１９２．２°Ｃ 核磁気共鳴スペクトル　　δ（ｐｐｍ）（ＤＭＳＯ＝　
ｄ６）８．８１．８．１８　　（各ＩＨ，５ＳＨ−２ｏ
ｒ　Ｈ−８）７．８７　（、’、２Ｈ，ｂｓ、　ＮＨ２
）　　６．２１　（ＩＨ，ｄ、　Ｈ−１’）５．９０（
ＩＩ（、ｔ、Ｈ−２’）　　　５．５１　　（ＩＨ，ｍ
、Ｈ−８’）４．２０　（ｌＨＳ　ｍ、Ｈ−４’）　　
　８．６７　（２Ｉ−１，ｂｄ、Ｈ−５’）２’、３’
−ジサクシニルアデノジン２００１ｎｆｌ、ヒト血清ア
ルブミン１００　ｍｇ、ＥＤ’（ｌ塩酸塩）１００　ｍ
ｇに酢酸緩衝液（ｐ１４５．５　）を加えて総量８０　
ｔｔｔｔにし、室温て２０時間反応さぜた。反応液を４
°Ｃにて０．９％生理的食塩水２０７？に対して４８時
間流水透析した。透析内液についてＵＶ吸収スペクトル
から２”、　　８’−ジサクシニルアデノシン／ヒト血
清アルブミンのモル比を求めたところ１０．６であった
。

■　抗アデノシン抗体の作製 上記の抗原溶液を等量のコンプリー１・・フロインズ・
アジュバントと混合し、油中水滴乳剤として家兎の背側
皮内にアルブミン量として０．２１１１１ずつ１０日お
きに８回投与し、さらに３０日後膜与を２回繰返した。

採血後、遠心分離して得た血清に５０　ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６，５）を加え抗アデノシン抗体試薬とした。

■　放射性元素標識２’、８’−ジサクシニルアデノシ
ンの調製 Ｃ２，８−８Ｈ〕アデノシン（ＮＥＮ社製、比放射能３
５．２　Ｃｉ　／ｍｍｏｌ　）を５０　ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６，５）で１００倍に希釈し、この溶液１　ｍｌ
に無水コハク酸４０１ｎｇ、ジオキサン０．９ｍｌ、）
リエチルアミン０．１　ｍｌを加えて室温で５分間反応
させた。

反応後、０．８　Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ６，５）
を８８　ｙｒｔ　加えて最終的に８Ｈ−２’、８−ジサ
クシニルアデノシン２．５μ（ｊｌｏ、８Ｍイミダゾー
ル緩衝液（ｐＨ６，５）１０肩ｔとして８Ｈ−２’、　
　８’−ジサクシニルアデノシン試薬とした。

■　測定試料の調製 ＳＤ系ラットから採取した血液に、１０　ｍＭ塩化マン
ガン、ベンジルアルコール４ＩＩ＋ｇ／Ｍｔヲ加え、遠
心分離して上清を血漿試料とした。

■　サクシニル化試薬の調製 無水コハク酸４０ｏ１ｎｇ／ジオキサン９　ｍｌとトリ
エチルアーミン１　ｍｌを混合してサクシニル化試薬を
調製した。

■　希釈用緩衝液の調製 ０．３Ｍイミダゾール緩衝液（ｒ）ＩＩ　６．５　）　
、蒸留水およびサクシニル化試薬を８：］：１に混合し
て希釈用緩衝液を調製した。

■　ＢＦ分離用試薬の調製 活性炭５００　ｍｌ、ウシ血清アルブミン５００　ｍｌ
、デキストラン７５ｍ９を蒸留水５０　ｍｌ中で混合し
てＤＣＣを調製し、この２倍希釈液を分離用試薬きした
。

〔２〕　　定量操作 ■　試料および標準溶液のサクンニル化アテノシン溶液
（６４００ｐｍｏｌ　／水１ｍ６）１００μｌ　を小試
験管番こ採り、サクシニル化試薬１００μｅと混合し、
５分間室温に放置した後、０．８　Ｍイミダゾール緩衝
液（ｐｌ（６，５）８００μｎ　を加えて乙３′−ジ”
ｊ−り’／　二／ｌ／　７７’　／　シフ　（６４ｐｍ
Ｏ］／１００μｌ）標準液１　ｍｌ　（Ｎα１）を調製
した。

小試験管９本（Ｎｏ、　Ｉｔ〜Ｘ）に希釈用緩衝液を５
００μγ　ずつ分注し、２’、　　８’−ジサクシニル
アデ／シン標準液５００μｅ　をＮｃＬｌの小試験管に
加えて混合した。以下順次倍数希釈を行ない、次に示す
各濃度（／１００μ召）の２’、８’−サクシニルアデ
ノシン標準液を調製した。

６４　ｐｍｏｌ　（ＮＦＬ　Ｉ　）、８２　＋）ｍｏｌ
（Ｎｎｌｌ）１６　ｐｍｏｌ（Ｎｎｎｌ）、　　８　ｐ
ｍｏｌ（Ｎｎ■）４　ｐｍｏｌ　（ＮαＶ　）、　　２
　ｐｍｏｌ（Ｎｃｉ■）１ｐｍｏｌ（Ｎｕ■）、０．５
　ｐｍｏｌ　（ＮｎＶＩＩｌ）０、２５　ｐｍｏ　］　
（Ｎ（１１Ｘ　）、０．１２５　ｐｍｏｌ　（Ｎ［ｌＸ
）血漿試料１００μｌ　を小試験管に採り、これにす゛
クンニル化試薬１００μｌ　を加えて混合し、５分間室
温に放置した後、０．３Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ６
，５）８００μｌ　を加えた。

■　抗原抗体反応 小試験管を次のように準備した。

総カウント用　　２本　　　Ｎα１．２ブランク用　　
　２本　　　Ｎα８．４ゼロ用　　　　　２本　　　Ｎ
α５．６標準１溶液用　　２０本　　　Ｎα７〜２６血
漿基料用　　　２本　　　崩２７．２８”Ｈ−２’、８
’−ジサクンニルアデ／シン試薬を１００μβ　ずつＮ
α１〜２８の試験管に分注した。

総カウント用（Ｎα１．２）、ブランク用（Ｎα３．４
〕、ゼロ用（Ｎα５．６）の各試験管に希釈用緩衝液１
００１１１　　ずつ加えた。

標準溶液用試薬管（Ｎｏ７〜２６）に２’、８’−ジサ
クシニルアデノシン標準ＩＮｏ、Ｉ〜Ｘを１００μｌず
つ加えた。

血漿試料用試験管（ＮＦＬ　２７．２８）にサクシニル
化した血漿試料１００１１１　　を加えた。

ゼロ用、標準溶液用、血漿試料用試験管（Ｎｏ５〜２８
）に抗アデノシン抗体試薬を１００μｌ　ずつ添加し、
混合後１８時間氷水中に放置した。

総カウント用、ブランク用試験管（Ｎα１〜４〕に０．
３Ｍイミダゾール緩衝液を１００　ｔｔ（！　　ずつ添
加し、混合後１８時間氷水中に放置した。

■　放射能量の測定およびアデノシン含量の算出総−カ
ウント用以外の試験管に、分離用試薬５００　ｆｉ（ｌ
　　ずつ加え、８０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。

総カウンＩ・用試験管に水５００μ４　を加え、混合し
ｔ：。

各試験管から上清を５００　ｌｔｌ　　ずつ採り、放射
能測定用試験管に移し、液体シンチレーションカウンタ
ー（アロカ社製、Ｍ体シンチレーションスペクトロメー
ター）で各放射能を測定した。

測定値に基いて結合率Ｂ／Ｔ（ト）を計算した。その結
果を第４表に示す。

これらの値から標準曲線（第１図参照）を作成し、これ
を用いて血漿試料中のアデノシン含量を求めた。ソノ値
は２．８ｐｍｏｌ　／１ｕｌ）ｅ　、　２’　８０　ｐ
ｍｏ！／ｍｌ血漿てあった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の一実施例において作成された標準曲
線であり、縦軸は抗体結合率（Ｂ／Ｔ（至）χ横軸はア
デノシン濃度を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）試料中のアデノシン含量をラジオイムノアッセイに
   より定器する方法において； ■　液体試料およびアデノシン標準溶液にアシル化試薬
   を添加反応させてアデノシンの２′位水酸基および３′
   位水酸基をアシル化し、■　該アソル化反応終了液に緩
   衝液を加えて希釈した後、（イ）これらに、（ロ）既定
   量の放射性元ｆ［ｍ２’、８’−ジアンルアデノンンと
   、（ハ）アデノシンの２′位水酸基および３′位水酸基
   と担体蛋白とをジカルボン酸残基を介して結合させてな
   る抗原によって得られた抗アデノシン抗体の既定量と″
   を混合して抗原抗体反応を行なわせ、 ■　次いで反応液中の遊離の放射性元素標識アゾンシン
   と、抗アデノソン抗体番こ結合した放− 耐性元素標識アデノシンとを分断１し、いずれかの放射
   能量を測定することににり試料中のアデノシン含量を算
   出する ことを特徴とするアデノシンの定量法。 ２）抗アデノシン抗体を得るための抗原においてアデノ
   シンと担体蛋白とを結６させるジカルボン酸残基かコハ
   ク酸残基である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）アシル化試薬が酸無水物と有機三級アミンからなる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）酸無水物が無水コハク酸である特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ５）放射性元素標識２’、８’−ジアンルアデノシンが
   放射性元素標識２’、８′−ジサクンニルアデノシンで
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。