JPS6257220B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アデノシンをイムノアツセイにより
定量する方法に関するものである。 アデノシンは、生体内におけるプリン系核酸→
ヌクレオチドの分解過程の１中間体として、また
サルベージ反応の基質としてよく知られてきた。
最近になつて、いくつかの実験データからアデノ
シンが重要な生理作用をもつ可能性が示唆されて
きている。代表的な例を示せば以下のとおりであ
る。 アデノシンには冠状循環増強作用があり、冠
血流量の生理的調節物質として働いているとい
う可能性がある（Amer.J.Physiol. 204
p317、（1963））。 アデノシンがサイクリツクAMPのレベル調
節に大きな役割を果たしていて、しかも組織や
細胞の種類によつてその効果が正、負と反対方
向になることが知られている（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、65、p1033（1970）；J.Biol.
Chem.、247、p6866（1972）；Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、74、p5482、（1977））。 サイクリツクAMPが増量する系； リンパ球、脳スライス、線維芽細胞、血小板
など サイクリツクAMPが減量する系； 脂肪細胞、〓皮質、肝細胞etc これらのことから、アデノシンは常に細胞よ
り分泌されていてホルモン作用を修飾している
可能性が考えられている。 先天性免疫不全症とアデノシン代謝が関連し
ている可能性について、ＴおよびＢ細胞がほぼ
完全に欠如している遺伝性疾患患者の赤血球に
アデノシンデアミナーゼの欠損が発見されたこ
とから、次のような仮説がうちたてられた。デ
アミナーゼ欠損→アデノシン増量→ピリミジン
代謝異常→リンパ球発育阻止→免疫不全
（Lancet、２、p1067、（1972））。 以上のように、アデノシンは単なる代謝産物と
してではなく、細胞間のメツセンジヤー機能を有
する重要な生理活性物質として何らかの標的ある
いはレセプターに作用していると考えられるに至
つている。したがつて、種々の生理的状態、病的
状態におけるアデノシンの生体内含量を測定する
ことは、基礎医学研究の分野においてはいうまで
もなく、臨床医学の分野においても病気の予防、
診断および治療に関連して重要な意義をもつこと
が期待されている。 従来、アデノシンの測定法として原理的に異な
るいくつかの方法が報告されているが、生体試料
中のアデノシンの定量に実用的な方法の一つに酵
素法が知られている（Analytical
Biochemistry、95、p377（1979））。この方法
は、生体試料中のアデノシンをアデノシンデアミ
ナーゼによつて脱アミノしてイノシンに導びき、
イノシンにりん酸の共存下でプリンヌクレオシド
ホスホリラーゼを作用させてヒポキサチンとし、
次いでヒポキサチンにキサンチンオキシダーゼを
作用させ、生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ
を用いる蛍光法で定量する方法である。しかしな
がら、この方法は、試薬の添加回数および反応の
段階が多く定量操作が繁雑であり、また最小測定
限界20pmol／tubeと感度が低いなどの欠点があ
る。 また他の定量法としてバインデイングプロテイ
ン法が報告されている（Analytical
Biochemistry 85、p132〜138（1978））。これ
は、ウサギ赤血球よりアデニンアナローグ―バイ
ンデイングプロテインを調製し、³H―アデノシ
ンと試料中のアデノシンを競合反応させるコンペ
テイテイブ・プロテイン・バインデイング・アツ
セイ（competitive protein binding assay）の
一種である。しかしこの方法にも、バインデイン
グプロテインの特異性が低いために、アツセイに
際しては試料中のアデノシンをPEIセルロースカ
ラムクロマトグラフイーにより単離するための前
処理を必要とする欠点がある。 一方、近年生体内の微量物質を定量する方法と
してラジオイムノアツセイ法、エンザイムイムノ
アツセイ法、蛍光イムノアツセイ法などのイムノ
アツセイが開発され、種々の生体内物質の定量に
応用されているが、アデノシンの定量にイムノア
ツセイ法を応用した報告はまだ知られていない。
ラジオイムノアツセイ法は、試料中の測定対象物
質と既定量の標識リガンドとを既定量の抗体に対
して競合的に反応させ、その後抗体に結合した標
識リガンドもしくは遊離の（未結合の）放射性リ
ガンドの標識量を測定して試料中の測定対象物質
を定量する原理に基づく方法である。従来、アデ
ノシンの抗原およびその抗体の作製法としては、
アデノシンを過ヨウ素酸ナトリウムで処理してリ
ボース残基の2′位および3′位間の結合を酸化的に
開裂させ、過剰の過ヨウ素酸をエチレングリコー
ルで中和した後、PH９〜9.5でウシ血清アルブミ
ン（BSA）とカツプリングさせ、水素化ホウ素
ナトリウムで還元してハプテンとBSAとの結合
を安定化して抗原を得る方法、これをウサギに免
疫させて抗体を得る方法が知られている（Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、52、p68（1964））。本発明
者は、この抗体をラジオイムノアツセイに応用す
ることを試み、この抗体に対してアデノシンを抗
原抗体反応させたところ、抗体に対するアデノシ
ンの結合能がほとんどなく、アデノシンの定量へ
の応用は不可能であることを知見した。さらに、
測定試料中のアデノシンあるいは放射性元素標識
アデノシンに対して、抗原作成時と同様の処理、
すなわち過ヨウ素酸処理、エチレングリコール処
理を施して抗原抗体反応に供すれば、抗体との結
合反応が生起し、イムノアツセイが可能であるこ
とが判明した。しかしながら、この方法は試料の
前処理が２段階を要し、しかも処理後の放射性リ
ガンドおよび試料中のアデノシンが不安定である
問題があり、アデノシンの実用的な定量法を確立
するまでに至らなかつた。 本発明者らは、アデノシンをイムノアツセイに
より簡便かつ高感度に定量する方法を確立すべく
種々研究を重ねた。その結果、 水系または水―有機溶媒系でアデノシンに対
して有機三級アミンの存在下で無水コハク酸な
どの酸無水物を反応させると、アシル基が導入
される可能性のあるN⁶位アミノ基、2′位水酸
基、3′位水酸基および5′位水酸基のうち、意外
にも2′位水酸基および3′位水酸基に対して優先
的にアシル化が進み、適当な反応条件下では約
85％以上の収率で2′，3′―ジアシルアデノシン
が生成すること、 上記のようにアデノシンをジカルボン酸の酸
無水物によつてアシル化して得られる、たとえ
ば2′，3′―ジサクシニルアデノシンと、担体蛋
白とを縮合剤によつて縮合させ、抗原を作製
し、これを動物に免疫させれば、感度の高い抗
アデノシン抗体が得られること、 かくして得られる抗アデノシン抗体は、アデ
ノシンに対しては全く結合能がなく、その反
面、2′，3′―ジアシルアデノシンに対してきわ
めて特異的に親和性と高い結合能を有するこ
と、 試料中のアデノシンを2′，3′―ジアシルアデ
ノシンに導びき、2′位および3′位水酸基がアシ
ル化された放射性元素標識アデノシンとともに
該抗アデノシン抗体に反応させると、相互の濃
度に依存する競合的な抗原抗体反応が生起し、
高感度のラジオイムノアツセイが可能であるこ
と などの知見を得、これらの知見を総合することに
より本発明方法を完成するに至つた。 すなわち、本発明方法は、 液体試料およびアデノシン標識溶液にアシル
化試薬を添加反応させてアデノシンの2′位水酸
基および3′位水酸基をアシル化し、 該アシル化反応終了液に緩衝液を加えて希釈
した後、(イ)これらに、(ロ)既定量の標識2′，3′―
ジアシルアデノシンと、(ハ)アデノシンの2′位水
酸基および3′位水酸基と担体蛋白とをジカルボ
ン酸残基を介して結合させてなる抗原によつて
得られた抗アデノシン抗体の既定量とを混合し
て抗原抗体反応を行なわせ、 次いで反応液中に遊離の標識アデノシンと、
抗アデノシン抗体に結合した標識アデノシンと
を分離し、いずれかの放射能量を測定すること
により試料中のアデノシン含量を算出する という操作手段からなるアデノシンの定量法であ
る。 本発明方法によれば、その最適実施態様では、
0.125〜64pmol／tubeの測定範囲で、高感度かつ
高精度のアデノシンの定量が可能である。また、
血液、尿などの体液試料は除蛋白やアデノシンの
単離精製のための前処理を必要とせず、組織試料
についても酸抽出液をそのまま本発明方法のアツ
セイに供することができる。 以下、本発明の具体的構成および効果について
本発明方法の操作手順にしたがつてより詳細に説
明する。 〔〕 測定試料の調製 生体試料の調製については特に制約されるもの
のではない。血漿、髄液、尿などの体液試料は前
処理を必要とせず、そのまま直接次のアシル化反
応に適用できる。しかし、血漿試料の場合は、採
血後経時的にアデノシンデアミナーゼによるアデ
ノシンの分解や血球によるアデノシンの取り込み
が進行し、アデノシン含量の低下をきたす。アデ
ノシンデアミナーゼの活性を阻害するためにマン
ガンイオンなどのアデノシンデアミナーゼ阻害
剤、また血球の取り込みを抑制するためにリドカ
インもしくはベンジルアルコールなどの局所麻酔
剤を採血直後に添加するとよい。各薬剤の使用量
はそれぞれの種類に応じて任意に定めうるが、た
とえばマンガンイオンの場合約10mM程度、リド
カイン、ベンジルアルコールの場合約0.2〜0.4％
程度試料中に存在するように用いればよい。一般
組識は酸（たとえば、塩酸、過塩素酸、トリクロ
ル酢酸など）で除蛋白、抽出を行ない、中和して
アシル化反応に適用する。 〔〕 抗アデノシン抗体の調製 本発明方法における抗アデノシン抗体は、抗原
としてアデノシンの2′位水酸基および3′位水酸基
と担体蛋白とをジカルボン酸残基を介して結合さ
せてなる抗原を用いて動物に免疫させることによ
り調製することができる。 抗原のジカルボン酸残基の具体例としては、コ
ハク酸残基、グルタル酸残基などが挙げられる。
また、担体蛋白には、血清アルブミン、グロブリ
ン、ヘモシアニン、オバルブミン、フイブリノー
ゲンなどが適用されうるが、血清アルブミンが一
般的に用いられる。 抗原の調製は次のとおり行えばよい。 アデノシンの2′，3′―ジアシル化 アデノシンに、水または水―有機溶媒（たとえ
ば、ピリジン、ジオキサン、アセトン、アセトニ
トリル、ジメチルスルホキシド、ジエチレングリ
コールジメチルエーテル、ヘキサメチルスルホス
ホルトリアミド、テトラハイドロピラン、テトラ
ハイドロフラン、メチルセロソルブアセテートな
ど）混合溶媒中で、ジカルボン酸の酸無水物（た
とえば、無水コハク酸、無水グルタル酸など）を
有機三級アミン（たとえばトリエチルアミン、４
―モルホリノ―Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカル
ボキサミンなど）の存在下反応させる。反応は室
温下で数秒〜十数分で十分進行する。 2′，3′―ジアシルアデノシンと担体蛋白との
縮合 2′，3′―ジアシルアデノシンのアシル基残基の
遊離のカルボン酸部分と担体蛋白のアミノ基など
とを縮合反応させる。縮合反応には特に制約され
ず、たとえば、ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド、１―エチル―３―（３―ジメチルアミノプロ
ピル）―カルボジイミド（EDC）、１―エチル―
３―（３―ジエチルアミノプロピル）―カルボジ
イミド、１―シクロヘキシル―３―（２―モルホ
リノエチル）―カルボジイミド、Ｎ―メチル―
Ｎ，N′―ジｔ―ブチルカルボジイミジウムテト
ラフルオロホウ酸塩などのカルボジイミド試薬の
存在下で両者を縮合させるカルボジイミド法など
を適用すればよい。さらに縮合剤としてウツドワ
ード試薬Ｋを用いる方法、酸無水物法などを適用
することもできる。 縮合反応の条件は常法による。 抗体は、上記のようにして得られる抗原を常法
によつて、ウサギ、ラツト、ヒツジ、ウマ、ウシ
などの動物に免疫させることにより得られる。抗
体としては、このような動物から得られる抗血清
を用いることができる。また、抗血清から抗体を
精製してもよいし、抗体をペプシンなどの酵素処
理によりＦ（ab′）₂フラグメント、さらに２―メ
ルカプトエチルアミンなどの還元剤処理により得
られるFab′フラグメントなどの抗体活性画分を
用いうる。 また、免疫動物の抗体産生細胞とミエローマ細
胞とを公知の方法により細胞融合させ、得られた
融合細胞（ハイブリドーマ）をin vitroあるいは
in vivoで増殖させて得られるモノクローナル抗
体を使用することもできる。 さらに、抗体は、液相法によるアツセイ用には
各種緩衝液溶液または凍結乾燥物として調製され
るが、固相法によるアツセイ法用には不溶性担体
に固相化して調製される。 抗体を固相化させる不溶性担体としては、シリ
コーン、ガラス、セラミツク、ポリスチレン、ス
チレン―ジビニルベンゼン共重合体、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、架橋ポリアクリルアミド、
CMセルロース、DEAEセルロース、架橋デキス
トランなど一般のイムノアツセイで用いられうる
ものを適用すればよい。担体の形状は特に限定さ
れず、ラテツクス状、粒子状、チユーブ状などの
いずれでもよい。不溶性担体に抗体を固相化させ
る方法も公知の方法によればよく、たとえば直接
物理的に吸着させる方法、グルタルアルデヒド、
２，２―ジピリジルサルフアイド、ｐ，p′―ジフ
ルオロ―ｍ，m′―ジニトロジフエニルスルホン
などの二官能基性の化学結合剤を介して化学的に
結合させる方法が適用される。 〔〕 標識2′，3′―ジアシルアデノシンの調製 標識2′，3′―ジアシルアデノシンの標識物質と
してはラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、化
学発光物質などのイムノアツセイの標識物質とし
て一般に用いられているもので、アデノシンへの
標識化が可能なものを適用することができる。た
とえば標識用ラジオアイソトープとしては ³H、
¹²⁵I、 ¹³¹Iなど、標識用酵素としてはβ―ガラク
トシダーゼ、アルカリホスフアターゼ、パーオキ
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、これら酵素
の活性フラグメントなど、標識用蛍光物質として
はフルオレセイン、ローダミンなどが用いられ
る。これらの標識化方法は公知の方法に準じて行
うことができる。 たとえば、 ³Hを標識に用いる場合は、市販の
³H―アデノシンを用いて、その2′位水酸基およ
び3′位水酸基をアシル化すればよい。導入される
べきアシル基の種類は、抗体の作製に用いられた
抗原のハプテンと担体蛋白の結合部分のジカルボ
ン酸残基の種類に応じて選択される。たとえば、
抗原がコハク酸残基を有するものである場合に
は、サクシニル基が最も好適に選択される。また
サクシニル基と構造を類似する他のアシル基、た
とえばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル
基、グルタル基などもアツセイの測定感度が低下
するものの使用することは可能である。アシル化
の方法条件は、抗原作製の項の記載に準ずる。こ
のような放射性リガンドのアシル化は、アツセイ
に際して測定試料と同時に行つてもよい。 また、放射性ヨードを標識にする場合は、アデ
ノシンの2′位水酸基および3′位水酸基にアシル基
としてジカルボン酸残基を導入し、遊離のカルボ
ン酸部分にさらにたとえばチロシンメチルエステ
ルなどを結合させ、このベンゼン環に放射性ヨー
ドを標識する手段などが採用される。 〔〕 試料および標識溶液のアシル化 アシル化反応は、前記の抗原作製時のアデノシ
ンのアシル化反応に準じる。すなわち、試料およ
び標識溶液に対して、酸無水物と有機三級アミン
を添加することによりアシル化が行われる。 酸無水物の種類は、標識2′，3′―ジアシルアデ
ノシンのアシル基に準じて同様に決定すればよ
い。このような試料および標準溶液のアシル化に
際しては、酸無水物を一定の試薬形態として調製
しておくことが、その定量操作性上好ましい。調
製形態としては、粉末態であつてもよいが、予め
有機溶媒溶液とした方が有機三級アミンおよび試
料との混和性にすぐれており、取り扱いが容易で
ある有機溶媒および有機三級アミンの種類につい
ても前例による。酸無水物と有機三級アミンとを
同一溶媒溶液中に共存させておくと、両者が反応
して24時間経過時ではそのアシル化能は半減す
る。したがつて、試薬の安定性が求められる試薬
キツトなどに両試薬を組み入れる場合は、それぞ
れを別封にする必要がある。 試薬の使用量はその種類に応じて適宜に決定す
ればよいが、たとえば試薬100μｌに対して酸無
水物20〜40μmol、有機三級アミン５〜10μｌに
有機溶媒を加えて100μｌとしたものを用いれば
よい。 アシル化反応条件も室温で数秒〜十数分で十分
である。たとえばアデノシン５μmolを添加した
生理食塩水または各種試料に対してサクシニル化
を行なつた時の2′，3′―ジサクシニルアデノシン
の収率を高速液体クロマトグラフイーによつて求
めた結果を第１表に示す。 【表】 〔〕 抗原抗体反応 アシル化反応後、測定試料は緩衝液を用いて通
常５〜10倍に希釈する。アデノシン標準液は希釈
用緩衝液（通常、アシル化試薬を５〜10％含有す
る緩衝液）を用いて順次倍数希釈して、抗原抗体
反応に供する。 緩衝液としては、抗原抗体反応を安定に進行さ
せうるものであれば適用可能である。本発明方法
においては、特にPH５〜８の0.1〜0.5Mイミダゾ
ール緩衝液が好適に用いられる。抗原抗体反応を
阻害する非特異性因子や未反応のアシル化試薬等
の影響を実質的に排除できる工夫を施せば、他の
緩衝液、たとえば酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、
りん酸緩衝液などの使用も可能である。 抗原抗体反応は、既定量の可溶性もしくは不溶
性抗アデノシン抗体に対して測定試料中の2′，
3′―ジアシルアデノシンと既定量の標識2′，3′―
ジアシルアデノシンとを同時もしくは相前後して
添加して行なわれる。標識2′，3′―ジアシルアデ
ノシンの化学量は、 ³H―2′，3′―ジサクシニル
アデノシンの場合0.5〜1pmol／tubeとするのが
最適である。 抗原抗体反応は、通常、０〜10℃、６〜48時
間、好ましくは12〜24時間の条件下で行なわれ
る。 〔〕 測定 抗原抗体反応が終了した後、抗体に結合した標
識2′，3′―ジアシルアデノシン（以下「Ｂ」と称
する）と結合しなかつた遊離の標識2′，3′―ジア
シルアデノシン（以下「Ｆ」と称する）とを常法
により分離し、そのいずれかの標識量を測定す
る。 固相法の場合には「Ｂ」と「Ｆ」その分離は、
吸引、傾瀉、ろ過などの方法により容易に行われ
る。液相法の場合には、適当な分離剤を用いる方
法により両者の分離が行われる。適用される分離
法としては、たとえば抗アデノシン抗体またはそ
のＦ（ab′）₂もしくはFab′フラグメントに対する
第二抗体を、第一抗体作製時の免疫動物とは異種
の動物に免疫させて作成し、得られた第二抗体を
用いて「Ｂ」を吸着沈澱化させる方法、あるいは
第二抗体を適宜な不溶性担体に固相化してこれに
「Ｂ」を結合させる方法などの二重抗体法をはじ
め、デキストランでコートした活性炭（DCC）
により「Ｆ」を吸着分離する方法、ポリエチレン
グリコールで「Ｂ」を沈澱分離する方法、硫酸ア
ンモニウムを用いて「Ｂ」と「Ｆ」とを分画する
塩析法などが適用できる。これらの分離剤による
分離操作はそれぞれ公知の方法によればよい。た
とえば、DCCの場合は、抗原抗体反応終了液に
DCCを加えて遠心分離すれば、上清に「Ｂ」を
回収することができ、その上清を標識量測定に供
すればよい。 標識量の測定は、各標識物質の種類に応じて公
知の手段を採用して行う。たとえば、放射能量の
測定は、液体シンチレーシヨンカウター、ガンマ
ーカウンターなど標識に用いられた放射性元素の
放射能量を測定することができる機器を用いて行
なえばよい。酵素量の測定は、その酵素の種類に
対応する基質溶液を用い、酵素反応に伴う物質の
消費、生成の量もしくは速度を電気化学的、分光
光学的、蛍光的手法などによつて測定することに
より行なわれる。 生体試料中のアデノシン含量は、試料に対する
放射能測定値から下記の式によつて結合率＝Ｂ／
Ｔ（％）値を求め、同様に各種濃度の標準溶液の
放射能測定値から求めたＢ／Ｔ（％）値を縦軸
に、横軸に片対数で濃度をとつてプロツトして作
成した標準曲線に、試料のＢ／Ｔ（％）値をプロ
ツトすることにより求めることができる。 Ｂ／Ｔ（％）＝(B)−（ＢＬ）／（Ｔ）−（ＢＬ）×1
00（％） (B)…生体試料または各標準溶液の標識量平均測
定値 （BL）…ブランク平均値 （Ｔ）…総標識量平均測定値 本発明方法による生体試料の測定における正当
性を希釈、添加実験結果で示す。なお、定量操作
の方法条件、試薬は後記実施例と同様にして行な
つた。 (1) 血漿試料の場合（ｎ＝３ 平均値±標準誤
差） 【表】 (2) 肝抽出液の場合（ｎ＝３ 平均値±標準誤
差） 【表】 以下、本発明方法の実施例を挙げて、本発明方
法のより具体的な説明とする。ただし、これらは
実施態様の一例を開示するものであり、本発明を
限定するものではない。 実施例 〔１〕 定量試薬の調製 抗アデノシン抗体の作製用抗原の調製 アデノシン6.7ｇを蒸留水500mlに溶解させ、こ
れに無水コハク酸20ｇ、ジオキサン450ml、トリ
エチルアミン50mlを加えて室温で10分間攪拌反応
させた。反応液に蒸留水１を加えて反応を停止
させ、減圧下濃縮した後、残渣を水に溶解させて
冷却し、析出した結晶を濾取した。この粗結晶を
水―エタノール―ジオキサンから再結晶して乾燥
し、2′，3′―ジサクシニルアデノシン6.80ｇを得
た。 融点 192.2℃ 核磁気共鳴スペクトル δ（ppm）（DMSO―
d₆） 8.31、8.13（各1H、ｓ、Ｈ―2or Ｈ―
８） 7.37（2H、bs、NH₂） 6.21（1H、
ｄ、Ｈ―1′） 5.90（1H、ｔ、Ｈ―2′）
5.51（1H、ｍ、Ｈ―3′） 4.20（1H、ｍ、Ｈ
―4′） 3.67（2H、bd、Ｈ―5′） 2.30〜
2.75（8H、ｍ、【式】） 2′，3′―ジサクシニルアデノシン200mg、ヒト
血清アルブミン100mg、EDC（塩酸塩）100mgに
酢酸緩衝液（PH5.5）を加えて総量30mlにし、室
温で20時間反応させた。反応液を４℃にて0.9％
生理的食塩水20に対して48時間流水透析した。
透析内液についてUV吸収スペクトルから2′，
3′―ジサクシニルアデノシン／ヒト血清アルブミ
ンのモル比を求めたところ10.6であつた。 抗アデノシン抗体の作製 上記の抗原溶液を等量のコンプリート・フロイ
ンズ、アジユバントと混合し、油中水滴乳剤とし
て家兎の背側皮内にアルブミン量として0.2mgず
つ10日おきに３回投与し、さらに30日後投与を２
回繰返した。採血後、遠心分離して得た血清に
50mM酢酸緩衝液（PH6.5）を加え抗アデノシン
抗体試薬とした。 放射性元素標識2′，3′―ジサクシニルアデノ
シンの調製 〔２，８― ³H〕アデノシン（NEN社製、比放
射能35.2Ci／mmol）を50mM酢酸緩衝液（PH
6.5）で100倍に希釈し、この溶液１mlに無水コハ
ク酸40mg、ジオキサン0.9ml、トリエチルアミン
0.1mlを加えて室温で５分間反応させた。反応
後、0.3Mイミダゾール緩衝液（PH6.5）を38ml加
えて最終的に ³H―2′，３―ジサクシニルアデノ
シン2.5μCi／0.3Mイミダゾール緩衝液（PH6.5）
10mlとして ³H―2′，3′―ジサクシニルアデノシ
ン試薬とした。 測定試料の調製 SD系ラツトから採取した血液に、10mM塩化
マンガン、ベンジルアルコール４mg／mlを加え、
遠心分離して上清を血漿試料とした。 サクシニル化試薬の調製 無水コハク酸400mg／ジオキサン９mlとトリエ
チルアミン１mlを混合してサクシニル化試薬を調
製した。 希釈用緩衝液の調製 0.3Mイミダゾール緩衝液（PH6.5）、蒸留水お
よびサクシニル化試薬を８：１：１に混合して希
釈用緩衝液を調製した。 BF分離用試薬の調製 活性炭500mg、ウシ血清アルブミン500mg、デキ
ストラン75mgを蒸留水50ml中で混合してDCCを
調製し、この２倍希釈液を分離用試薬とした。 〔２〕 定量操昨 試料および標準溶液のサクシニル化 アデノシン溶液（6400pmol／水１ml）100μ
を小試験管に採り、サクシニル化試薬100μと
混合し、５分間室温に放置した後、0.3Mイミダ
ゾール緩衝液（PH6.5）800μを加えて2′，3′―
ジサクシニルアデノシン（64pmol／100μ）標
準液１ml（No.１）を調製した。 小試験管９本（No.〜）に希釈用緩衝液を
500μずつ分注し、2′，3′―ジサクシニルアデ
ノシン標準液500μをNo.の小試験管に加えて
混合した。以下順次倍数希釈を行ない、次に示す
各濃度（／100μ）の2′，3′―サクシニルアデ
ノシン標準液を調製した。 64pmol（No.）、 32pmol（No.） 16pmol（No.）、 8pmol（No.） 4pmol（No.）、 2pmol（No.） 1pmol（No.）、 1.5pmol（No.） 0.25pmol（No.）、 0.125pmol（No.） 血漿試料100μを小試験管に採り、これにサ
クシニル化試薬100μを加えて混合し、５分間
室温に放置した後、0.3Mイミダゾール緩衝液
（PH6.5）800μを加えた。 抗原抗体反応 小試験管を次のように準備した。 総カウント用 ２本 No.１、２ ブランク用 ２本 No.３、４ ゼロ用 ２本 No.５、６ 標準溶液用 20本 No.７〜26 血漿試料用 ２本 No.27、28 ³H―2′，3′―ジサクシニルアデノシン試薬を
100μずつNo.１〜28の試験管に分注した。 総カウント用（No.１、２）、ブランク用（No.
３、４）、ゼロ用（No.５、６）の各試験管に希釈
用緩衝液100μずつ加えた。 標準溶液用試験管（No.７〜26）に2′，3′―ジサ
クシニルアデノシン標準液No.〜を100μず
つ加えた。 血漿試料用試験管（No.27、28）にサクシニル化
した血漿試料100μを加えた。 ゼロ用、標準溶液用、血漿試料用試験管（No.５
〜28）に抗アデノシン抗体試薬を100μずつ添
加し、混合後18時間氷水中に放置した。 総カウント用、ブランク用試験管（No.１〜４）
に0.3Mイミダゾール緩衝液を100μずつ添加
し、混合後18時間氷水中に放置した。 放射能量の測定およびアデノシン含量の算出 総カウント用以外の試験管に、分離用試薬500
μずつ加え、3000rpm、５分間遠心分離した。 総カウント用試験管に水500μを加え、混合
した。 各試験管から上清を500μずつ採り、放射能
測定用試験管に移し、液体シンチレーシヨンカウ
ンター（アロカ社製、液体シンチレーシヨンスペ
クトロメーター）で各放射能を測定した。 測定値に基いて結合率Ｂ／Ｔ（％）を計算し
た。その結果を第４表に示す。 【表】 これらの値から標準曲線（第１図参照）を作成
し、これを用いて血漿試料中のアデノシン含量を
求めた。その値は2.8pmol／tube、280pmol／ml
血漿であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の一実施例において作成され
た標準曲線であり、縦軸は抗体結合率（Ｂ／Ｔ
（％））、横軸はアデノシン濃度を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試料中のアデノシン含量をイムノアツセイに
   より定量する方法において； 液体試料およびアデノシン標準溶液にアシル
   化試薬を添加反応させてアデノシンの2′位水酸
   基および3′位水酸基をアシル化し、 該アシル化反応終了液に緩衝液を加えて希釈
   した後、(イ)これらに、(ロ)既定量の標識2′，3′―
   ジアシルアデノシンと、(ハ)アデノシンの2′位水
   酸基および3′位水酸基と担体蛋白とをジカルボ
   ン酸残基を介して結合させてなる抗原によつて
   得られた抗アデノシン抗体の既定量とを混合し
   て抗原抗体反応を行なわせ、 次いで反応液中の遊離の標識アデノシンと、
   抗アデノシン抗体に結合した標識アデノシンと
   を分離し、いずれかの標識量を測定することに
   より試料中のアデノシン含量を算出する ことを特徴とするアデノシンの定量法。 ２ 抗アデノシン抗体を得るための抗原において
   アデノシンと担体蛋白とを結合させるジカルボン
   酸残基がコハク酸残基である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３ アシル化試薬が酸無水物と有機三級アミンか
   らなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 酸無水物が無水コハク酸である特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 ５ 標識2′，3′―ジアシルアデノシンが標識2′，
   3′―ジサクシニルアデノシンである特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ６ 標識が放射性元素、酵素、蛍光物質または化
   学発光物質である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。