FI75935B - Foerfarande foer analysering av komplementfragmentet c3a, c4a och c5a eller des-arg derivat och en foer utfoerande av foerfarandet anvaendbar uppsaettning. - Google Patents

Description

1 75935

Menetelmä komplementtipalasen C^a, C^a ja C^a tai niiden des-Arg-johdannaisen analysoimiseksi ja menetelmän toteuttamiseksi käytettävä välinesarja Tämä keksintö kohdistuu parannettuun menetelmään komplement-tipalasten 03a, c^a ja C^a tai niiden des-Arg-johdannaisten analysoimiseksi ja kaupallista välinesarjaa, joka on hyödyllinen sanotun immuunianalyysin suorittamisessa.

Ihmisen ja muiden nisäkkäiden komplementtisysteemiin liittyy yli 20 komponenttia, jotka osallistuvat säännölliseen reak-tiosarjaan, joka johtaa komplementin aktivoitumiseen. Lukuisat tutkimukset osoittavat, että komplementtisysteemi on normaalin isäntäelimen puolustusmekanismin perusosanen. Tämän seurauksena komplementin aktivoitumiseen liittyy yleisesti joukko patologisia tiloja, kuten tiettyjä pahanlaatuisia tauteja, ei-tulehduksellinen sydänlihasinfarkti, sisäis-punahukka ja aikuisten hengityskipuoireisto. Johtuen näistä vastaavuussuhteista kliiniset laboratoriomenetelmät, joilla todetaan komplementin aktivoituminen, ovat hyödyllisiä määritettäessä tiettyjä tautitiloja.

Komplementin aktivoitumista voi tapahtua jommalla kummalla kahdesta päätävasta, jotka tunnetaan "klassisena" tienä ja "vaihtoehtoisena" tienä. Nämä tiet erotetaan yleensä toisistaan sen prosessin mukaisesti, joka panee alulle komplementin aktivoitumisen. Klassista tietä tapahtuvaan aktivoitumiseen liittyy tavallisesti immunologista ärsytystä, kun taas vaihtoehtoista tietä tapahtuvaan aktivoitumiseen liittyy yleisimmin ei-immunologisia ärsykkeitä. Riippumatta alulle panevasta ärsykkeestä molemmat tiet lähenevät toisiaan, mitä seuraa komplementin C3-komponentin konversio sen C^a-ja C^b-palasiksi. Tämän C^:n lohkeamisen alakomponenteik-seen katsotaan olevan eräs merkittävimmistä tapahtumista, joka ilmoittaa vaihtoehtoisen komplementtien aktivoitumisen.

2 75935 C^:n konversion jälkeen muodostuu C^-konvertaasientsyymi-kompleksi. Tämä entsyymi lohkaisee -komponentin tuottaen palaset C^a ja C^b. Komplementin aktivoitumiselle klassisen tien mekanismilla on ainutlaatuisesti luonteenomaista, että tämä reitti johtaa -komponentin konversioon sen C^a- ja C^b-palasiksi.

Herkistäviksi myrkyiksi kutsuttujen lohkeamistuotteiden C3a, C4a ja C5a fysikokemialliset ja fysiologiset ominaisuudet ovat hyvin tunnettuja. Jokainen niistä on voimakas bioaktiivinen polypeptidi ja näyttelee tärkeää osaa tällaisten tulehdusprosessien välittäjinä. Näistä kolmesta herkistävästä myrkystä pelkästään C^a:lle on ainutlaatuisesti luonteenomaista sen kyky toimia yhdessä valkoisten verisolujen kanssa. Sekä C3a että C^a muuttuvat in vivo inaktiivisiksi konversiolla vastaaviksi des-arginiinijohdannaisiksi (C-a. „ . tai C-,a., C.a. . tai C.a.) seerumin karbok-3 des-Arg 3 1' 4 des-Arg 4 ι sipeptidaasin avulla. Toisaalta ihmisen C^a konvertoituu <"5ades-Arg:^s;'' ^Hä seerumin karboksipeptidaasilla vasta, kun kaikki valkoisen verisolun käytettävissä olevat C^a:n sidoskohdat on tyydytetty.

Ihmisen komplementin komponenttien C3 ja konversio, joka tuottaa niiden vastaavia herkistäviä myrkkytuotteita, on kietoutunut tiettyihin luonnossa esiintyviin patologisiin tiloihin, kuten; autoimmuunisuuden häiriötiloihin, kuten systeemiseen punahukkaan, nivelreumaan, pahanlaatuiseen tilaan, ei-tulehdukselliseen sydänlihasinfarktiin, Purtscher'in verkko-kalvosairauteen ja aikuisen hengityskipuoireistoon. Lisäksi C3a:n ja C^a:n kasvaneita kiertotasoja on todettu tietyissä tiloissa, jotka liittyvät lääkärinhoidosta aiheutuvaan komplementin aktivoitumiseen, kuten sydämen ja keuhkojen ohitusleikkauksiin, munuaisdialyysiin ja nylonkuidulla tapahtuvaan valkotäpläisyyden ionihoitoon. C^a-herkistysmyrkyn kohonneet tasot liittyvät yleisesti yllä mainittuihin autoimmuunisuuden häiriötiloihin. Tämän vuoksi kyvystä mitata kvantitatiivisesti näiden herkistävien myrkkyjen tai niiden des-Arg- 3 75935 johdannaisten kiertotasoja on suurta hyötyä määritettäessä monia erilaisia tärkeitä patologisia tiloja. Lisäksi kyky

mitata C.a:n tai C.a, A -tasoja tekee mahdolliseksi mää-4 4 des-Arg J

rittää sen tien, jota komplementin aktivoituminen tapahtuu. Tässä väline ei tee vain mahdolliseksi määrittää komplementin aktivoitumisen tarkkaa mekanismia, vaan myös toimivatko potilaan luonnolliset immunologiset puolustusmekanismit.

Tony E. Hugli'in ja Dennis E. Chenoweth'in radioimmuuni-analyysimenetelmän (RIA) kehittämiseen asti, jota on selostettu teoksessa "Immunoassays: Clinical Laboratory Techniques for the 1980s", 443-460, Alan R. Liss, Inc., New York, N.Y. (1980) , herkistävien myrkkyjen C^a, C^a ja C^a tai niiden des-Arg-johdannaisten mittaus oli aikaansaatu vain kun näiden tekijöiden määrät olivat suhteelliset suuret, esimerkiksi, kun tautitapahtuma oli saavuttanut pitkälle edistyneen tilan. Hugli'n ja Chenoweth'in RIA-tekniikka tekee mahdolliseksi herkistävien myrkkyjen tai niiden des-Arg-johdannaisten hivenmäärien kvantitatiivisen mittaamisen ja muodostaa näin ollen herkän diagnostisen työkalun. Kuitenkin tähän saakka tunnettua keinoa mitata näitä tekijöitä on vaivannut merkittävä ongelma, joka liittyy vaatimukseen, että herkistävien myrkkyjen C^~* C^- ja Cg-plasmaedeltäjät on poistettava testattavasta biologisesta nesteestä. Tämä ankara vaatimus perustuu havaintoon, että vasta-aineilla, jotka ovat nousseet herkistäviä myrkkyjä vastaan, on merkittävää ristikkäistä reaktiivisuutta niiden vastaavan plasmaedeltäjän kanssa, koska C^a, C^a tai C^a on osa lähtömolekyyleistä Cg, C^ ja Cg samassa järjestyksessä. Johtuen tästä väistämättömästä ristikkäisestä reaktiivisuudesta on pakottavaa, että edeltäjäyhdiste, jota esiintyy verrattain suurina väkevyyksinä seerumissa ja plasmassa, poistetaan täysin, jotta vältytään toteamasta keinotekoisesti korotettuja herkistävien myrkkyjen tasoja, joita on normaalisti läsnä vain hi-venmääriä. Aikaisempiin tunnettuihin menetelmiin herkistävien myrkkyjen erottamiseksi niiden plasmaedeltäjistä liittyy plasman laimentaminen natriumkloridilla ja hapotus kloori- 4 75935 vetyhapolla ja sen jälkeen talteensaadun seeruminäytteen neutralointi. Kts. yllä mainittu Bigli'n ja Chenoweth'in artikkeli. Tämä keksintö kohdistuu uuteen ja yksinkertaistettuun keinoon poistaa kvantitatiivisesti herkistävän myrkyn plasmaedeltäjä biologisista näytteistä sallien kuitenkin samanaikaisesti pienen molekyylipainon herkistävien myrkkyjen C^a, C^a ja C^a tai niiden des-Arg-johdannaisten kvantitatiivisen talteenoton.

Tämä keksintö kohdistuu uuteen menetelmään oleellisesti kaikkien komponentin edeltäjäyhdisteiden tai komponenttien C^, ja Cg jälkien poistamiseksi biologisten nesteiden näytteistä ja komplementtipalasten C^a, C^a ja C^a tai niiden des-Arg-johdannaisten talteenottamiseksi sanotuista nesteistä häiritsemättä sanottujen palasten immunogeenisyyttä, jossa menetelmässä yhdistetään yhtä suuret tilavuusmäärät biologisen nesteen näytettä ja puskuroitua 0,8-1,6 %:sta akrinoliliuosta, hautomalla seosta yhdestä minuutista kahteen tuntiin n. 25°C:ssa ja ottamalla yläpuolinen neste talteen tuloksena olevasta sakasta.

Tämä keksintö kohdistuu myös uuteen ja parannettuun menetelmään komplementtipalasten C^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg- johdannaisten kvantitatiiviseksi mittaamiseksi biologisesta näytteestä, jossa menetelmässä yhdistetään yhtä suuret tilavuusmäärät biologista näytettä ja 0,8-1,6 %:sta aktinol.ia haudotaan seosta yhdestä minuutista kahteen tuntiin n. 25°C:ssa, otetaan yläpuolinen neste talteen tuloksena olevasta sakasta ja haudotaan yläpuolista nestettä tunnetun määrän kanssa merkittyä komplementtipilasta, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat C^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannainen ja tunnetun määrän kanssa vasta-ainetta, joka toteaa sanotun merkityn komplementtipalasen tai sen des-Arg-johdannaisen, erotetaan vapaa merkitty komplementtipalanen sidotusta merkitystä komplementtipalasesta, mitataan merkityn komplementtipalasen määrä joko vapaassa tai vasta-aineeseen sidotussa komplementtikomponentissa ja määritetään 5 75935 komplementtipalasen väkevyys biologisessa näytteessä vertaamalla standardikäyrään.

Tämä keksintö kohdistuu myös uuteen välinesarjaan, johon komponenttiosat on koottu käytettäväksi biologisten nesteiden näytteiden analysoinnissa komplementtipalasten C^a, C^a ja Cj-a tai niiden des-Arg-johdannaisten suhteen, joka sarja käsittää ensimmäisen astian, jossa on akrinolin 0,8-1,6 %:sen liuoksen puskuroitua liuosta; toisen astian, jossa on merkittyä reagenssia, joka on valittu merkityistä komplementtipalasista C^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaisista; ja kolmannen astian, jossa on vasta-aine-reagenssia, joka on valittu vasta-aineesta, joka toteaa komplementtipalaset C^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaiset .

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

Tässä käytettynä akrinolin ymmärretään tarkoittavan 2-etoksi- 6,9-diaminoakridiinia tai sen laktaattimonohydraattisuolaa.

Tätä keksintöä toteutettaessa biologisen nesteen näyte voi olla mikä tahansa ruumiin neste, kuten esimerkiksi seerumi, plasma, virtsa tai aivo-selkäydinneste. Kun käytetty biologinen neste on plasma tai aivo-selkäydinneste, siihen lisätään EDTA:ta.

Yhtä suuret tilavuusmäärät biologista nestettä ja 0,8-1,6 %:sta akrinolia yhdistetään akrinolin 0,4-0,8 %:n loppuväkevyydeksi. Edullinen akirinolin loppuväkevyys on 0,4 %. Akrinoli-proteiinikompleksi puskuroidaan pH-arvoon n. 7,4. Mikä tahansa puskuri, joka ei sisällä kloridi-ioneja on sopiva, esimerkiksi karbonaattipuskureita, fosfaattipuskureita tai HEPES:iä (N-2-hydroksietyylipiperatsiinietaanisulfonihappo) voidaan käyttää. Puskurin molaarisuus on edullisesti välillä 0,05-0,1 M ja pH-arvo 6,8-7,8. Edullinen puskuri käytettäväksi tämän keksinnön toteutuksessa on 0,05 M fosfaattipuskuri, pH 7,4.

6 75935

Kun biologinen neste ja akrinoli yhdistetään, sakka muodostuu lähes välittömästi. Kompleksin on kuitenkin edullista antaa hautua vähintään n. 20 minuuttia komplementin edeltäjä-yhdisteiden Cg, ja Cg mahdollisimman suuren erottumisen aikaansaamiseksi niiden aktivoiduista palasista. On havaittu, että komplementtikomponentin saostuminen on täydellinen n. yhdestä minuutista kahteen tuntiin. Kompleksin voidaan antaa hautua tarvittaessa yli 2 tuntia, mutta edullista proteiinin lisäsaostumista ei odoteta tapahtuvan 2 tunnin jälkeen. Hautominen suoritetaan huoneen lämpötilassa, ts. n. 25°C:ssa.

Sakan poisto suoritetaan sopivasti sentrifugoimalla akrinoli-proteiinikompleksia n. 3000-7000 g:n kiihtyvyydellä n. 10-20 minuutin ajan ja dekantoimalla sitten yläpuolinen neste, joka sisältää komplementtipalaset C^a, C^a ja C^a tai niiden des-Arg-johdannaiset. Kuten yllä mainittiin karboksipeptidaa-sit muuttavat komplementtipalaset C^a, C^a ja C^a inaktiivisiksi in vivo seerumissa ja plasmassa konversiolla niiden vastaaviksi inaktiiviksi des-Arg-johdannaisiksi. Tällainen konversio tapahtuu myös in vivo virtsassa. Näin ollen tämän keksinnön uudesta akrinolisaostusmenetelmästä talteen saatu yläpuolinen neste sisältää pääasiassa komplementtipalasten C^a, C^a ja C^a des-Arg-johdannaista, sanottujen palasten aktivoidun muodon sijasta, kun biologinen neste on plasma, seerumi tai virtsa. Diagnostisiin tarkoituksiin inaktiivisen des-Arg-johdannaisen mittaaminen on aivan yhtä tarkoituksenmukaista kuin komplementtipalasten aktiivisen muodon suora mittaus.

Talteen saatua yläpuolista nestettä käytetään ilman lisäkä-sittelyä tai prosessointia immuunianalyysimenettelyssä. On havaittu, että akrlnolin läsnäolo koenäytteissä ei häiritse komplementtipalasten tai niiden des-Arg-johdannaisten vasta-ainevaikutusta, mikä aikaansaa ainutlaatuisen ja suuresti yksinkertaistetun keinon analysoida sanottuja palasia.

Immuunianalyysimenettely ei ole oleellisesti erilainen kuin 7 75935 tunnetut iiranuunianalyysit C^a:n, C^a:n ja C^a:n tai niiden des-Arg-johdannaisten toteamiseksi. Yhtä suuret tilavuus-määrät analysoitavaa koenäytettä, merkittyä komplementtipa-lasta C.ja, C^a tai C5a tai niiden des-Arg-johdannaista ja vasta-ainetta, joka toteaa sanotun komplementtipalasen, yhdistetään ja haudotaan, minkä jälkeen vasta-aineeseen sidottu ja sitomaton tai vapaa, merkitty komplemenettipalanen erotetaan ja mitataan komplementtipalasen määrän määrittämiseksi koenäytteessä vertaamalla standardikäyriin. Analyysi-puskuria lisätään yleensä hauteeseen. On havaittu puskurin, joka sisältää HEPESsiä, protamiinisulfaattia, timerosolia ja gelatiinia, olevan erityisen hyödyllisen.

Komplementtipalasen C^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaisen puhdistus käytettäväksi vasta-aineiden muodostamisessa sitä vastaan ja käytettäväksi standardikäyrien kehittämiseen sekä merkityn komplementtipalasen valmistukseen voidaan saavuttaa sillä yleisellä menetelmällä, jota on kuvattu julkaisussa J. Biol. Chem. 256, 8685-8692 (1981). On havaittu, että tätä menettelyä voidaan muuntaa ja parantaa korvaamalla kloorive-tyhapposaostustekniikka yllä kuvatulla akrinolisaostustek-niikalla.

Vasta-aine komplementtipalasille C^a, C^a, C^a tai niiden des-Arg-johdannaisille muodostetaan siten kuin Hugli et ai., J. Biol. Chem. 250, 1472-1478 (1975) ja J. Biol. Chem. 256, 8685-8692 (1981) ovat yleisesti esittäneet.

Merkityssä komplementtipalasessa tai sen des-Arg-johdannaisessa käytetty merkkiaine voi olla mikä tahansa aine, joka kyetään toteamaan fysikaalisin tai kemiallisin keinoin.

Radioisotoopit, kuten tritium, jodi-131 ja jodi-125 ovat 125 125 hyödyllisiä J:n ollessa edullinen. J-merkitty materiaali voidaan valmistaa eri keinoin, jotka alalla yleisesti tunnetaan, kuten kiinteäfaasisella laktoperoksidaasimene-telmällä. Edullisessa menetelmässä käytetään hyväksi TCDG:n 8 75935 (1,3,4,6-tetrakloori-3a,6α-difenyyliglykouriili) käyttöä fosfaattipuskuroidussa saliinissa.

Vasta-aineeseen sidottu komplementtipalanen voidaan erottaa vapaasta tai sitomattomasta komplementtipalasesta eri keinoin, joita yleisesti käytetään immuunianalyysimenettelyissä. Tämä erotus voidaan saavuttaa esimerkiksi käsittelemällä polyetyleeniglykolilla /Desbuquois, B. ja Aurback, G.D., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33, 732 (1971]_/ tai IgG Sorb:illa tai saattamalla haude kosketukseen toisen vasta-aineen kanssa. Toinen vasta-aine, joka valmistetaan standardimenettelyillä, esimerkiksi kuten kuvataan julkaisussa Daughaday, et. ai., "Principle of Competitive Protein Binding Assay", J.B. Lippincott, Philadelphia (1971), toteaa hauteeseen sisältyvän komplementtipalasen ja vasta-aineen muodostaman kompleksin. Toisen vasta-ainetekniikan käyttö on erityisen edullista.

Standardikäyrät saadaan olennaisesti suorittamalla yllä kuvattu analyysimenettely käyttäen tunnettuja määriä komple-menttipalasia ¢33, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaista koenäytteen asemesta. Tässä kuvattu analyysimenettely on erittäin herkkä ja se on todettu erittäin hyödylliseksi stan-dardikäyrien kehittämiseen komplementtipalasten väkevyyksille, jotka vaihtelevat välillä 1,0-25 ng.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä tarkemmin.

Esimerkki 1

Komplementtipalasten tai des-Arg-johdannaisen puhdistus 2-4 litraa seerumia aktivoitiin 37°C:ssa lisäämällä keitettyä hiivaa (20 mg/ml seerumia) ja antamalla seoksen seistä 45 minuutista tuntiin. Yhtä suuret tilavuusmäärät aktivoitua seerumia ja 0,8-1,6 %:sta akrinolia puskuroituna pH-arvoon 7,4 0,05 M fosfaattipuskurilla yhdistettiin ja annettiin seistä 30 minuuttia 25°C:ssa, minkä jälkeen seos sentrifu-goitiin ja yläpuolinen neste dekantoitiin. Yläpuolista nestettä dialysoitiin juoksevaa vettä vastaan yli yön 5-8°C:ssa 9 75935 ja geelisuodatettiin sitten p-60-kolonnilla, joka oli tasapainotettu 0,1 M ammoniumformaatilla, pH 5,0. Jakeet, jotka sisälsivät komplementtipalasia C-^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaisia, kerättiin yhteen ja ajettiin SP-Sephadex-kolonniin, joka oli tasapainotettu 0,1 M ammonium-formaatilla, pH 5,0. Kolonni eluoitiin 0,1-0,8 M ammonium-formaatin lineaarisella gradientilla, pH 7,0. Jakeet, joissa oli C^a, c^a ja C^a tai niiden des-Arg-johdannaisia, kerättiin talteen ja ajettiin erikseen erillisiin CM-selluloosa-kolonneihin ja eluoitiin ammoniumformaatin 0,15-0,43 M:n gradientilla, pH 7,0 virtausnopeudella 75 ml/h. Jokainen komplementtikomponenteista C^a, C^a tai C^a kerättiin yhteen kolonnista talteen saadun sitä vastaavan des-Arg-johdannaisen kanssa ja lyofilisoitiin ja liuotettiin sitten uudelleen veteen ja dialysoitiin 1 %:sta etikkahappoa vastaan. Lopullinen lyofilisointi ja uudelleensuspendointi veteen n.

10 mg/ml:n pitoisuudeksi tuotti jokaisesta palasesta käyttövalmiin .

Esimerkki 2 125 J-komplementti C^a tai sen des-Arg-johdannainen

Haudeputkeen lisättiin 50 ^ug komplementtipalasta C^a tai sen des-Arg-johdannaista, 150 ,ul fosfaattipuskuroitua sa- 125 liinia, 100 yug TCDG:a ja 1 mCi (10 ^,ul) J-natriumia. Fosfaattipuskuroitu saliini valmistettiin varastoliuokseksi, joka sisälsi 81 mg natriumkloridia, 39 mg vedetöntä natrium-bifosfaattia, 199 mg natriumfosfaatin kaksiemäksistä hepta-hydraattireagenssia ja 100 ml lasitislattua ionivaihdettua vettä. Seosta haudutettiin 20 minuuttia n. 25°C:ssa ja siirrettiin sitten kromatografiakolonniin, joka oli tasapainotettu fosfaattipuskuroidulla saliinilla, joka sisälsi gelatiinia ja joka valmistettiin varastoliuokseksi, joka sisälsi 143 g natriumkloridia, 200 mg thimerosol NF, 6 g vedetöntä natriumbifösfaattia, 34 g natriumfosfaatin kaksiemäksistä heptahydraattireagenssia, 17 g gelatiinia ja lasitislattua ionivaihdettua vettä 17,5 litran tilavuuteen asti. 0,5 ml:n 10 75935 radioaktiivisia jakeita otettiin talteen ja laimennettiin niin, että saatiin 20 000 - 60 000 cpm/0,05 ml fosfaattipus-kuroitua, gelatiinia sisältävää saliinia.

Esimerkki 3 (a) Seokseen, jossa oli 0,45 ml aktivoitua plasmaa, 0,45 ml 0,8 %:sta akrinolia 0,05 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4 ja 0,1 ml tislattua vettä, annettiin reagoida n. 25°C:ssa 20 minuuttia ja sentrifugoitiin sitten 1700 x g:n kiihtyvyydellä 10 minuuttia. Yläpuolinen neste kerättiin talteen. Seosta, jossa oli 50 ^ul yllä kuvatulla tavalla valmistettua ana- lyysipuskuria, 50 ,ul yllä saatua yläpuolista nestettä, 125 50 ^ul J-komplementtipalasta C^a tai sen des-Arg-johdannais ta ja 50 yul komplementtipalasta C^a sidottuna kaniinin an-tiseerumeihin, haudottiin 30 minuuttia n. 25°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 50 ^ul vuohen antikaniinin vastaseerumei-ta ja sekoitettiin hyvin. Seosta haudottiin vielä 30 minuuttia n. 25°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 2 ml isotonista saliinia. Seosta sentrifugoitiin 200 x g:n kiihtyvyydellä 10 minuuttia ja yläpuolinen neste dekantoitiin. Rakeen radioaktiivisuus oli 4555 cpm.

(b) Suoritettiin edellä oleva menettely korvaamalla vain akrinolisaostusvaihe happosaostustekniikalla, jonka Hugli ja Chenoweth ovat esittäneet julkaisussa Immunoassays:

Clinical Laboratory Techniques for the 1980s: 443-460. Tuloksena olevan rakeen radioaktiivisuus oli 4521-4757 cpm, mikä osoittaa, että akrinolisaostustekniikka poistaa koskematonta komplementtiproteiinin edeltäjäyhdistettä yhtä tehokkaasti kuin käsittely kloorivetyhapolla, mitä seuraa emäs-neutralointi, aikaansaaden suuresti parantuneen yksinkertaistetun analyysimenettelyn. Samoin näiden kahden kokeen tulokset osoittavat, että akrinolin läsnäolo ei vaikuta enempää ensimmäiseen kuin toiseenkaan immunologiseen reaktioon.

Muodostettaessa standardikäyriä komplementtipalaselle C^a tai sen des-Arg-johdannaiselle käyttäen 1,0 ng, 2,5 ng, 11 75935 5,0 ng, 10 ng, 25 ng ja 50 ng:n määriä C^a:a, havaittiin, että akrinolisaostusvaiheen käyttö Hugli'n ja Chenoweth'in happosaostus-emäsneutralointivaiheen sijasta paransi immuuni-analyysin herkkyyttä kertoimella 12, mitä osoittaa se seikka, että toteamisalue muuttui lyhyemmäksi ja kaltevuus % B/Bo (standardilukemafc/sidottu standardi) kasvoi -2,3:sta -4,0:aan.

Esimerkki 4

Suoritettiin esimerkissä 3 (a) yllä esitetty analyysi käyttäen aktivoituja plasmanäytteitä, joihin lisättiin tunnetut määrät komplementtitekijää C^a tai sen des-Arg-johdannaista välillä 2-20 ng. Tulokset osoittavat, että jokaisessa analysoidussa "naulatussa" normaalinäytteessä oli 100 % tunnetuista C^a-väkevyyksistä.

Esimerkki 5 Välttämättömät reagenssit tämän keksinnön immuunianalyysin suorittamiseksi kootaan kaupalliseen yksikköön välinesarjaksi. Välinesarja käsittää useita astioita, kuten pulloja tai muita sopivia astioita seuraavasti: (a) ensimmäisen astian, jossa on 0,8-1,6 %:sen akrinolin puskuroitua liuosta; (b) toisen astian, jossa on merkittyä reagenssia, joka on 125 valittu J-merkityistä komplementtipalasista C^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaisista; (c) kolmannen astian, jossa on kaniinin vastaseerumeja kyseiselle komplementtipalaselle; ja joka sisältää valinnaisesti seuraavia lisäreagensseja: (d) astian, jossa on analyysipuskuria, joka on valmistettu yllä kuvatulla tavalla; (e) astian, jossa on toista vasta-ainetta, joka sitoo ensimmäisen komplementtipalasen ja vasta-aineen välisen reaktion tuotteen, edullisesti vuohen vasta-kaniinin vastasee-rumiin; (f) astian, jossa on komplementtipalasen standardi, 25 ng; (g) astian, jossa on komplementtipalasen standardi, 10 ng 12 75935 (h) astian, jossa on komplementtipalasen standardi, 5 ng (i) astian, jossa on komplementtipalasen standardi, 2,5 ng (j) astian, jossa on komplementtipalasen standardi, 1,0 ng

Jokaisessa kohdassa (f)-(j) komplementtipalanen on joko C3a, C4a tai C5a tai niiden des-Arg-johdannainen riippuen siitä, mitä komplementtipalasta analysoidaan.

Vaikka edellä olevat esimerkit ovat rajoittuneet komplementti-palasen C^a tai sen des-Arg-johdannaisen erottamiseen ja an-lyysiin, tämän keksinnön uusi erotus- ja analyysimenettely on yhtä hyvin sovellettavissa komplementtipalasiin C4a ja C^a tai niiden des-Arg-johdannaisiin.

Claims (10)

13 75935 Patentti vaatiroukset

1. Menetelmä kömpiementtipalasen C a, C a tai C a tai niiden 3 4 5 des-Arg-johdannaisen analysoimiseksi biologisessa näytteessä, jossa menetelmässä inkuboidaan biologisen näytteen ja rea-genssin seosta, jolloin muodostuu sakka, otetaan yläpuolinen neste talteen, inkuboidaan yläpuolista nestettä tunnetun määrän kanssa merkittyä kömpiementtipalasta ja tunnetun määrän kanssa vasta-ainetta, joka tunnistaa kömpiementtipalasen, erotetaan vapaa, merkitty kömpiementtipalanen sidotusta merkitystä kömpiementtipalasesta, mitataan merkityn komplement-tipalasen määrä joko vapaassa tai vasta-aineeseen sidotussa kömpiementtikomponentissa ja määrätään kömpiementtipalasen pitoisuus biologisessa näytteessä vertaamalla standardi käyrään, tunnettu siitä, että reagenssi on 2-etoksi-6,9-akridiinidiamiini tai sen 1aktaattimonohydraattisuola (eli ak-rinoli), että seos käsittää yhtä suuret ti 1avuusmäärät biologista näytettä ja reagenssin 0,8-1,6-%:sta liuosta, ja että seosta inkuboidaan yhdestä minuutista kahteen tuntiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että akrinolin liuos on 2-etoksi-6,9-diaminoakridiinin 1aktaattimonohydraatti, joka on puskuroitu 0,05 M fosfaatti-puskurilla, pH 7,4 ja merkkiaine on J.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vapaa, merkitty kömpiementtipalanen tai sen des-Arg- johdannai nen erotetaan sidotusta, merkitystä komplement-tipalasesta lisäämällä toista vasta-ainetta.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analysoitava kömpiementtipalanen on C a tai sen 3 des-Arg-johdannainen.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analysoitava kömpiementtipalanen on C a tai sen 4 des-Arg-johdannainen. 14 75935

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että analysoitava komplementtipalanen on C^a tai sen des-Arg-johdannainen.

7. Menetelmä komplementtikomponenttien C^, ja poistamiseksi biologisten nesteiden näytteistä ja komplementti-palasten C^a, C^a ja C^a tai niiden des-Arg-johdannaisten ottamiseksi talteen sanotuista nesteistä, tunnettu siitä, että yhdistetään yhtä suuret tilavuusmäärät biologisen nesteen näytettä ja 2-etoksi-6,9-akridiinidiamiinin tai sen lak-taattimonohydraattisuolan 0,8-1,6 %:sta puskuroitua liuosta, haudotaan seosta noin yhdestä minuutista kahteen tuntiin n. 25°C:ssa ja otetaan yläpuolinen neste, joka sisältää sanottuja komplementtipalasia, talteen tuloksena olevasta sakasta.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että akrinoli on 2-etoksi-6,9-diaminoakridiini-laktaatin monohydraatti ja puskuri on 0,05 M fosfaattipuskuri, pH 7,4 ja seosta haudotaan n. 20 minuutista yhteen tuntiin.

9. Kaupallinen välinesarja, johon komponenttiosat on koottu käytettäväksi biologisten nesteiden analysoinnissa komple-menttipalasten C^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaisten suhteen, tunnettu siitä, että se käsittää (a) ensimmäisen astian, jossa on 0,8-1,6 %:sen 2-etöksi-6,9-akridiinidiamiinin tai sen laktaattimonohydraattisuolan puskuroitua liuosta; (b) toisen astian, jossa on merkittyä reagenssia, joka on valittu merkityistä komplementtipalasista C^a, C4a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaisista; ja (c) kolmannen astian, jossa on vasta-ainereagenssia, joka on valittu vasta-aineista, jotka toteavat komplementtipalasen C^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaisen.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen kaupallinen välinesarja, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi: (a) neljännen astian, jossa on analyysipuskuria; (b) viidennen astian, jossa on toista vasta-ainetta; 15 75935 (c) kuudennen astian, jossa on komplementtipalasen C^a, C^a tai C5a tai niiden des-Arg-johdannaisen standardi, 25 ng; (d) seitsemännen astian, jossa on komplementtipalasen C^a, C^a tai C5a tai niiden des-Arg-johdannaisen standardi, 10 ng; (e) kahdeksannen astian, jossa on komplementtipalasen C^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaisen standardi, 5,0 ng; (f) yhdeksännen astian, jossa on komplementtipalasen C^a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaisen standardi, 2,5 ng; ja (g) kymmenennen astian, jossa on komplementtipalasen C3a, C^a tai C^a tai niiden des-Arg-johdannaisen standardi, 1,0 ng ja että akrinoli on 2-etoksi-6,9-diaminoakridiinilaktaatin monohydraatti. 75935 1 o