SE452067B - Reagens for och sett vid immunkemisk bestemning av c3a - Google Patents

Description

452 067 Med immunkemisk bestämning av C3a enligt uppfinningen avses att man bestämmer C3a, C3ai och fragment av C3a som inne- håller antigena determinanter mot vilka uppfinningens anti-C3a antikroppspreparation är riktad.

En immunkemisk metod för kvantitativ eller kvalitativ bestämning av en komplementfaktor eller dess fragment utnyttjar alltid en antikroppspreparation som är riktad mot det som skall bestämmas. Preparationen får reagera med ett prov innehållande faktorn i fråga, varefter bildat immun- komplex tas som en indikation eller ett mátt på närvaron respektive mängden av faktorn. Skall ett fragment bestämmas (t ex C3a), får motsvarande ursprungliga komplementfaktor (C3) ej korsreagera med det aktuella fragmentet på ett störande sätt. Tidigare har man ej lyckats framställa antikroppspreparationer med tillräcklig specificitet för C3a, vilket lett till att "Prior Art"-metoderna alltid inneburit en separation som ett första steg. De kommersiellt tillgängliga testerna för C3a utnyttjar alla att fragmentet *W är synnerligen stabilt gentemot denaturering. I starkt sur miljö kan man därför fälla ut C3 och separera denna ifrån C3a innan det senare kvantifieras immunkemiskt.

C3 är uppbyggd av två olika polypeptidkedjor, som kallas alfa- respektive beta-kedjan och är sammanhâllna via di- sulfidbindningar. Vid komplementaktivering klyves C3 i fragmenten C3a (molvikt 9 000 dalton = ca 5 % av C3) och C3b. C3a anses ej delta i den vidare aktiveringssekvensen.

C3b är nödvändig för den fortsatta aktiveringen och då för omvandlingen av CS till C5b under frisättning av C5a. När C3b nedbrytes vidare under fysiologiska betingelser bildas bl a fragmenten C3bi, C3d,g och C3c. C3a och C3d,g består av delar från alfa-kedjan. C3c och C3b innehåller delar av både alfa- och beta-kedjan. Fragmentens läge i den nativa C3- molekylen kan grovt skisseras: 452 067 l*- c3b -sl C3a C3d,g _ C3f ** alfa-kedja I s-s __m _m_ beta-kedja Flera -S-S- finns. De är såväl inter- som intra-"chain".

C3b --9 C3bi + C3f; C3bi > C3c + C3d,g_ C3b kan binda kovalent till ett stort antal olika substrat, som t ex immunkomplex och cellväggar. När fragmenteringen sker eller när fragmenten bindes till substrat, har man visat att vissa antigena determinanter försvinner under det att nya blottas i fragmenten som bildas. Sá kallade neoantigen uppkommer.

I ett antal tidigare publicerade arbeten har uppfinnarna visat att determinanterna som uppkommer som en följd av bindning till erytrocyter kan återfinnas i denaturerat C3 (9, 11, 12, 13). Uppfinnarna har med utgångspunkt från dessa fynd klassificerat antigena determinanter hos C3 i a) C3(S), vilka är stabila determinanter som áterfinnes i både nativt C3 och denaturerat C3, b) C3(D), vilka är determinanter som uppkommer vid denaturering och c) C3(N), vilka är nativa determinanter som ersätts av C3(D) vid denaturering. Som exempel på denaturerande medier som framkallar C3(D)-deter- minanter kan nämnas SDS (= Sodium dodecylsulfat = Na lauryl- sulfat), guanidinhydroklorid, sura och alkaliska lösningar (pH >10, pH <2,8) och deoxycholat. Hittills publicerade resultat har endast påvisat C3(D)-determinanter i C3b- regionen av denaturerat C3. Uppfinningen bygger pà att det vid denatureringen av C3 kan uppkomma nya unika determínanter av C3(D)-typ i C3a-regionen av C3. Dessa determinanter àterfinnes även i cirkulerande former av C3a och har där uppkommit som en följd av att C3a bildats ur C3. Grunden för uppfinningen är alltså nyupptäckta neoantigen. - ~ i-vnfiæ-øamurP-w- ='“'-"*'-_' ~° 452 Û67 4 Ett syfte med uppfinningen är att erbjuda anti-C3a-anti- kroppspreparationer som är riktade mot neoantigen. Ett andra syfte med uppfinningen är att erbjuda förbättrade metoder för att immunkemiskt bestämma C3a (snabbare och med högre precision och specificitet än tidigare metoder). Ett tredje syfte är att erbjuda en bestämningsmetod för C3a i vilken den immunkemiska reaktionen mellan C3a och dess homologa antikroppspreparation kan utföras i närvaro av nativt C3.

Uppfinningens antikroppspreparation är riktad mot minst en determinant, som är gemensam för C3a och denaturerat C3 men som ej är tillgänglig i nativt C3. Korsreaktiviteten mellan C3a och C3 gentemot uppfinningens antikroppspreparation skall således vara sådan att preparationen kan användas för att påvisa kliniskt intressanta nivåer av C3a i prover som innehåller C3. I sin reaktion med C3a inhiberas den väsent- ligen ej av nativt C3. Den kan därför användas för att immunkemiskt bestämma C3a vid samtidig närvaro av nativt C3, t ex i plasmaprov där man anser att det kliniskt relevanta g mätomràdet är 40 ng - 1 000 ng per 1, Ytterligare kännetecken för uppfinningen framgår av bifogade patentkrav som även utgör en del av beskrivningen.

Uppfinningens antikroppspreparation uppvisar den nyss nämnda specificiteten. Den kan vara i form av en monoklonal anti- kropp eller ett antisera (polyklonal). Antikropparna i preparationen kan vara fragmenterade och/eller derivati- serade. Det väsentliga är att fragmenten och/eller derivaten uppvisar biospecifik affinitet av immuntyp med den ovan angivna specificiteten och korsreaktiviteten. Preparationen kan vara i form av en lösning, till vilken olika tillsatser av för en speciell användning nödvändiga kemikalier gjorts.

Det väsentliga är, att den ej innehåller en störande mängd anti-C3a-antikroppar gentemot vilka C3a och C3 korsreagerar.

Preparationens anti-C3a-antikroppsaktiva komponenter kan 452 067 vara försedda med analytiskt indikerbara grupper eller vara bundna till i testmediet olösliga faser, s k fasta faser.

Framställningen av en antikroppspreparation enligt upp- finningen innebär, att man förmår celler, som potentiellt har förmåga att producera antikroppar med specificitet i enlighet med uppfinningen, att utsöndra dem, varefter dessa isoleras och renas så att anti-C3a-antikroppar som ej uppfyller specificitetskraven avlägsnas. I en vertebrat (t ex däggdjur såsom mus eller råtta) kan utsöndringen ske in vivo som en följd av att djuret immuniserats med lämpligt immunogen. Det sålunda erhållna immunsvaret ger en polyklonal antikroppspreparation, vilken innehåller den eller de önskade antikropparna i en blandning tillsammans med anti- kroppar riktade mot andra determinanter i immunogenet. För att ta bort dessa senare antikroppar kan man tillgripa s k immunsorbentrening (IS-rening), t ex på fastfasbundna former av nativt eller denaturerat C3 eller C3a. Beroende på immunsorbenten hamnar de antikroppar man är intresserad av i antingen eluatet eller pà adsorbenten. För de aktuella antikropparna leder IS-reningen till låga utbyten och omständliga förfaranden.

Den bästa metoden att erhålla en god antikroppspreparation enligt uppfinningen är s k monoklonal teknik (6). Denna innebär att man efter immuniseringen fuserar de plasmaceller som producerar antikroppar med en myelomcell, så att de blir i stånd till snabb och oavbruten tillväxt. Genom att klona och odla de hybridceller som producerar uppfinningens anti-C3a-antikroppar kan man få fram monoklonala anti-C3a- antikroppspreparationer vilka i princip enbart reagerar med determinanter av den aktuella typen i C3a. Odling av de utvalda cellklonerna för produktion av uppfinningens anti- kroppspreparationer kan ske i cellkultur in vitro eller som ascitestumör. Rening och isolering kan ske som för anti- kroppar i allmänhet genom saltprecipitering eller genom olika kromatografiska metoder såsom jonbytes-, affinitets-, gel- etc kromatografi. 452 067 i Immunogenen som användes vid immuniseringen skall uppvisa de nödvändiga determinanterna, d v s C3(D)-determinanter som finns exklusivt i C3a-regionen av denaturerad C3. Denatu- reringen skall därvid företrädesvis vara utförd i vatten- lösning med en SDS-koncentration som är över 10-3 M (pH 9 ca 7, rumstemp), men den kan även ha skett med något av de tidigare nämnda agensen. Det väsentliga är därvid inte denatureringsmediet som sådant, utan att denatureringen har skett, så att minst en antigendeterminant, som finns i C3a _ men ej är tillgänglig i nativt C3, blir blottad. Med kunskap ~ om att dessa antigena determinanter finns, kan i princip även C3a utnyttjas som immunogen, speciellt om detta kombineras med monoklonalteknik.

Med denaturering ovan avses givetvis inte sådana irreversibla förändringar som förstör den aktuella determinantens förmåga att ge ett immunsvar (hydrolys kan ge sådana effekter).

Uppfinningens immunkemiska bestämningsmetod innebär att g antikroppspreparationen användes för immunkemisk bestämning av C3a. För detta finns det ett stort antal generella och i och för sig kända immunkemiska testmetoder som uppfinningen kan appliceras pá. För C3a innebär de, att anti-C3a-antikropps- aktiva komponenter får reagera med ett prov innehållande C3a till bildande av ett immunkomplex, vars bildning och mängd utgör ett kvantitativt respektive kvalitativt mått på att C3a fanns närvarande i provet. Ytterligare immunreaktanter eller andra reaktanter, som reagerar medelst biospecifika affinitetsreaktioner med i immunkomplexet ingående komponenter, kan tillsättas för att underlätta kvantifieringen. Vanligt är att man tillsätter en reaktant som är försedd med en markörgrupp, s k analytiskt indikerbar grupp. Mängderna av de olika reaktantera avpassas dä, så att mängden märkt reaktant, som inkorporeras i komplexet eller som finns kvar i icke-inkorporerad form, utgör ett mått på förekomsten av C3a i provet. 452 067 ' \| Ett sätt att indela metoderna är i homogena och heterogena.

Det homogena innebär att en märkt reaktant bestämmas, utan att i komplexet inkorporerad märkt reaktant fysiskt sepa- reras från icke-inkorporerad form. Det heterogena innebär att de tvà formerna av märkt reaktant separeras fysiskt från varandra, före det att den märkta reaktanten bestämmes i endera eller båda av de två formerna. För att underlätta en separation är det praktiskt om en av reaktanterna är olöslig i testmediet.

. , ..¶......,..... . Ett andra sätt att indela metoderna är i kompetitiva och icke-kompetitiva. I en kompetitiv metod arrangeras så att två immunreaktanter som har en gemensam epitop (determinant) får tävla om ett underskott homologa bindningsställen på en immunologisk motpart. För C3a-bestämningar gäller att provets C3a får konkurrera med märkt C3a eller en fast- fasbunden form därav om anti-C3a-antikroppar enligt upp- finningen. Mängden som på det sättet reagerar med anti- kropparna utgör ett mått pà halten C3a i provet. I en F icke-kompetitiv metod väljes reaktanterna så att kompe- titionen ej kan ske.

Ett tredje sätt att indela metoderna är i precipitations- och icke-precipitationsmetoder. För uppfinningen innebär den f förstnämnda att en anti-C3a-antikroppspreparation väljes så att dess reaktion med provets C3a leder till en fällning eller att det bildade immunkomplexet efteråt fälles med tillsats av ett överskott precipiterande agens såsom poly- etylenglykol, anti-antiserum, fastfasbunden anti-antikropp etc. Om en märkt reaktant utnyttjas tillses givetvis att anti-antiserumet eller den fastfasbundna anti-antikroppen ej är riktad mot den märkta reaktanten.

Ett fjärde sätt att indela metoderna är enligt markör- gruppen. Man har då radio-, enzym-, fluorescent-, kemi- luminiscent-, enzymsubstrat- immunkemiska metoder etc. 452 067 Bland immunkemiska metoder kan dessutom nämnas immunelektro- fores, partikelagglutination, immundiffusion och mikrosko- piering med hjälp av märkta antikroppar.

Monoklonala antikroppar, som är riktade mot icke-repetitiva determinanter i ett antigen, kan ej utnyttjas för vissa former av precipitationsmetoder.

Uppfinningen kan appliceras pà bestämning av C3a i olika kroppsvätskor och vävnader som innehåller C3a. Det är tidigare känt att C3a finns i blod, plasma, serum, urin, synovialvätska, cerebrospinalvätska, etc.

Den eller de avsedda immunkemiska reaktionerna utföres under betingelser som är vanliga för den aktuella typen av bestäm- ningsmetoder. Sålunda kan temperaturen vara vald i inter- vallet 0 - 40 OC, speciellt 15 - 40 °C. pH kan variera från 4,5 upp till 9,0, företrädesvis ca 5 - 8,6. Alltför höga (>10) och alltför låga pH-värden (<3) ger denaturerings- fi effekter pà C3 (C3(D)-determinanter uppkommer) och skall undvikas. Allmänt gäller givetvis att man skall vidta åtgärder som förhindrar aktivering av komplement eller denaturering om C3a bestämmes i närvaro av C3. Komplement- aktiveringen innebär nybildníng av C3 och kräver närvaro av proteaser och tvàvärda kalcium- och/eller magnesiumjoner.

Det är därför lämpligt att tillsätta proteasinhibitorer och/eller till dessa joner komplexbindande agens såsom EDTA.

Vid en eventuell tillsats av detergenter och buffertsystem, bör man undvika sådana som kan verka denaturerande pá C3.

Uppfinningen skall nu àskâdliggöras med ett antal exempel som utgör en del av beskrivning och som pà intet sätt avser att inskränka på uppfinningen. 452 067 MATERIAL OCH METODER C3-Eregarationerz Nativt C3 (C3(SN)) renades som tidigare beskrivits (10).

Denaturering av 100 /ug av C3 (C3(SD)) utfördes i 100 /ul 2x10_3M SDS i 30 min vid 37°C. Denaturerat-reducerat C3 och isolerade C3 alfa- och C3 betakedjor (C3(D)) framställdes enligt Nilsson et al (ll). Elastas-genererat C3a, C3c och C3d var en gåva från dr Brian Tack, Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, USA (15). C3b framställdes från humant C3 genom trypsin-digerering med 1 % (w/v) trypsin (TPCK treated, Worthington, USA) under 2 min vid rumstemperatur (10). C3bi framställdes genom att C3b inku- berades med 5 /ug faktor H och l /ug faktorzš under 60 min I utfördes med laktoperoxidas till en specifik aktivitet av 30 000 cpm//ug protein (9). vid 37°C. Isotopmärkning av nativt C3 med Antikroppar framställdes genom immunisering med SDS-denatu- rerat C3 och specificitet för immunogenet utgjorde urvals- kriteriet vid efterföljande selektion. Två Balb/c honmöss, 8 - 12 veckor gamla, injicerades subkutant med 24 /ug humant SDS-denaturerat C3 i komplett Freunds adjuvans (FCA, Behringwerke AG, Västtyskland) tillsammans med 20 /üg Lipopolysackarid W (LPS, Difco, katalog nr 3120-25). Åtta veckor senare, pà dag 4 före fusering, gavs intraperitonealt (i.p.) 100 /ug SDS-denaturerat C3 i fosfatbuffrad koksalt- lösning (pH 7,4). Hybridomen framställdes enligt standard- procedurer (2,5), med följande smärre modifikationer. Fyra olika Sp2/0 cellinjer användes. Ursprungslinjen var Sp2/0.Agl4 (14) och odlades i standardmedium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Paisley, Scotland, katalog nr 041-1966) innehållande 5 % fetalt kalvserum (FCS, Gibco, katalog nr 011-6290) och 25 /ug/ml av Gentamycin (katalog nr G-7507, Sigma Chem Co, USA). Dessutom användes tvâ olika subkloner utvalda för sin förmåga att kunna odlas i serumfritt medium och en subklon i odlad làgserummedium Hy-0,1. 452 067 10 Standard DMEM innehållande 10 % FCS eller HY-0,1 medium användes för selektion och kloning. Klonerna (hybridomen) utvaldes med avseende på förmåga att binda till SDS-denatu- rerat C3 i direktbindnings-ELISA. Av dessa utvaldeš sedan fjorton kloner slumpmässigt för vidare studier.

Etablerade hybridomlinjer expanderades som "fed-batch" kultur till 200 ml volym i TC flaskor. De monoklonala antikropparna renades med katjonbytes-kromatografi som tidigare beskrivits (1).

Enzym-kopplad immunsorbent-metod (ELISA): Direktbindningsmetod: Seriespädda anti-C3-antikroppar fick binda till konstanta mängder C3 eller C3-fragment som adsorberats till brunnarna i mikrotiter-plattor. De bundna antikropparna kvantifierades därefter med hjälp av anti-kanin eller anti-mus-immunglobu- nr liner som var konjugerade med peroxidas från pepparot (HRP)(DAKO Immunoglobulins A/S, Danmark). Fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) innehållande 0,1 % TWEEN 20(v/v) och 0,1 % (w/v) bovint serumalbumin (BSA) användes som buffert- lösning vid inkuberingarna. 1. 200 /ul av vardera C3, C3 alfa- och beta-kedjor, SDS- denaturerat C3, C3c och C3d i PBS (svarande mot 20 nmol C3/1) adsorberades under natt vid 4°C till plastytorna av mikrotiterplattornas brunnar (Immunoplate II F, Nunc, Danmark). 2. 100 /ul antikroppspreparatíoner i seriespädning inkube- rades under 60 min vid rumstemperatur (RT). 3. 100 /ul gris~anti-immunglobuliner konjugerade med BRP fick under 60 min vid RT binda till de i steg 2 adsorbe- rade anti-C3-antikropparna. 452 067 ll 4. Enzymreaktionen startades genom tillsats av 100 /ul färgreagens (20 mg 1,2-fenylendiamin-dihydroklorid (Fluka AG, Schweiz) och 10 /ul 30 % HZO2 i 75 ml 0,1 M citrat/fosfatbuffert pH 5,0). Reaktionen stoppades efter ungefärligen 10 min med hjälp av 100 /ul 1 M HZSO4. Färgutvecklingen kvantifierades spektrofoto- metriskt vid 492 nm.

Efter stegen 1 - 3 tvättades brunnarna noggrannt 3 gånger i koksaltlösning (PBS) som innehöll 0,1 % TWEEN 20.

Inhibitionsmetod: Metoden var en modifiering av direktbindningsmetoden. 100 /ul av seriespätt prov fick konkurrera med det adsorbe- rade antigenet om bindning till en konstant mängd antikropp. 4920D=1 erhölls när den fick binda till preadsorberat nativt C3 under 60 min vid RT, En enligt direktbindningsmetoden. Inhibitionsmetoden avslutades Antikroppsmängden var vald så att med stegen 3 - 4 från direktbindningsmetoden. 1. 200 /ul C3a 40pg/ml preinkuberas i varje hål i mícrotiter- plattan. 2. 50 /ul prov (EDTA-plasma l/20 eller seriespädning av C3a till standardkurvan) + 100 /ul monoklonal anti-C3a.

Standardkurvan är en seriespädning av en stamlösning av C3a 50pg/ml. Från standardkurvan får man fram plasma- koncentrationen.

Monoklonala antikroppars specificitet för fastfasbundet C3 och fastfasbundna C3-fragment i ELISA De utvalda monoklonala antikropparna testades med direkt- bindnings-ELISA för bindning till nativt C3, SDS-denaturerat 452 067 12 C3, proteas-genererade C3-fragment (C3a, C3c och C3d) och C3 alfa- och C3 beta-kedjor.

C3(SN) C3(SD) C3c C3d C3a C3 alfa C3 beta 14 14 10 2 1 ll 0 Antikroppen som var specifik för C3a är en anti-C3a-antikropp och den studerades ytterligare.

Figur 1: Inhibition av monoklonal anti-C3a-antikropp till plastadsorberat C3a i inhíbitions-ELISA med lösligt renat nativt CNC) , SDS-denaturerat C303), nativt C3 i EDTA-plasma (A) och C3a (O) .

Doserna SDS-denaturerat C3, renat natívt C3 och nativt C3 i EDTA-plasma för att få en ekvivalent hämning av bindningen jämfört med C3a är 27, 243 resp mer än 10 000 gånger större.

Figur 2: Koncentrationen C3a i EDTA-plasmor från normala individer samt från patienter med Clq-bindande immunkomplex och coronar insufficiens (op. med "by pass" och legat i hjärt-lungmaskin under operationen).

Figur 3: Korrelationen mellan C3a konc. mätta med uppfinningen och med ett kommersiellt test (UpJohn). r=0,9.

Figur 4: Hur C3a konc. påverkas av 1 - 10 frys-tinings cykler. Ingen signifikant påverkan på bindningen noteras.

Figur 5: Anti-C3a antikroppen som används i ovan beskrivna ELISA används här i en inhibitions-RIA. 1. so /ul anti-csa + 10 ul 1251-c3a + so /ul prov inkuberas 30 min 37°C. _ ___ _ _ U __________ ..._..__,.,.,..._.._._-_ »-.-. -.-fnøwm-n.-.a.-... .i.-:.=~.. _» . t 1 Urwi- . -li 452 067 13 2. 2 ml anti-mus-Ig kopplat till Sepharose (Pharmacia RIA-Sepharose) tillsätts och inkuberingen fortsätter i rumstemperatur i 30 min. 125I cpm mäts efter att partiklarna har centrifugerats och supernatanten hällts bort.

I figuren hämmas bindningen av 125I-C3a till Sepharose med C3a ( ~) och nativt C3 i EDTA-plasma men dosskillnaden är minst 100 ggr. 5:a! 10. ll. 12. 13. 14. 15. 16. 452 067 14 REFERENSER Carlsson, M et al (1985) J Immunol Meth 79: 89-98 Goding, JW (1980) J Immunol Meth 39: 285-308 Gorski, JP et al (1981) J Immunol Meth 47: 61-73 Hugli, T.E. et al (l980)'In: Laboratory and Research Methods in Biology and Medicine, Eds Nakamura, R.M. et al (Alan R. Liss, New York) 4:443-60 Lindell, P et al (1986) Framtagning av en ny uppsättning monoklonala antikroppar riktade mot Neisseria gonorrhoeae (Manuskript under skrivning) Köhler et al (1975) 256: 495-7 Lachmann, PJ et al (1982) J Exp Med 156: 205-16 Laemmli, UK et al (1973) J Mol Biol 80: 575-99 Nilsson, B et al (1985) Scand J Immunol 22: 703-10 Nilsson, UR et al (1975) J Immunol 114: 815-22 Nilsson, UR et al (1980) Mol Immunol 17: 1319-33 Nilsson, UR et al (1982) J Immunol 129: 2594-97 Nilsson, UR et al (1982) Mol Immunol 19: 1391 Schulman, M et al (1978) Nature 276: 269-70 Tack, BF et al (1981) Meth Enzymol 80: 64-101 Wagner, JL et al (1984) Anal Biochem 136: 75-88 .Jm nunnan: 1: Jun. w.-ivu..u.uf om.. .|...~.~..~ i ...uni . .

Claims (1)

452 067 15 Patentkrav

1. Anti-C3a-antikroppspreparation, k ä n n e t e c k n a d av att den är specifikt riktad mot minst en antigen determinant i C3a som ej är tillgänglig i C3a-regionen av nativt C3, och av att den i sin reaktion med C3a väsentligen ej inhiberas av C3, så att den kan användas för att bestämma C3a, t ex i plasmaprov, vid samtidig närvaro av nativt C3. Anti-C3a-antikroppspreparation enligt krav 1, k ä n n e - t e c k n a d av att den eller de antigena determi- nanteníerna) mot vilken(a) den är riktad i C3 är blottadle) när detta har denaturerats i en vattenlös- ning innehållande sus 1o'3 M, vid nu = ca 7 och runs- temperatur. sätt vid immunkemisk bestämning av C3a, k ä n n e - t e c k n a d av att den anti-C3a-antikroppsprepara- tion som man använder i sin reaktion med C3a väsent- ligen ej inhiberas av C3. Sätt vid immunkemisk bestämning av C3a enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a d av att den anti-C3a-anti- kroppspreparation som man använder är specifikt riktad mot minst en sådan determinant i C3a som ej är till- gänglig i C3a-regionen av nativt C3 men som är blottad när detta har denaturerats. Sätt enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att den eller de determinant(er) i C3a-regionen mot vi1ken(a) preparationen som användes är riktad är blottad(e) när detta har denaturerats med SDS 10-3 rumstemperatur. M vid pH ca 7 och