JPH026755A

JPH026755A - リポ蛋白粒子の免疫学的測定方法，抗Ｌｐ（ａ）モノクロナル抗体，およびそれらのアテローム性動脈硬化症の診断における使用

Info

Publication number: JPH026755A
Application number: JP1011746A
Authority: JP
Inventors: Jean-Charles Fruchart; ジャン・シャルル・フルーシャール; Dac Ngoc Vu; ゴック・ヴュー・ダック
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1988-01-19
Filing date: 1989-01-19
Publication date: 1990-01-10
Also published as: EP0327418B1; ES2073448T3; DE68922126D1; ATE121197T1; EP0327418A1; DE68922126T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明分野本発明は、アポリポ蛋白Ｂ（すなわちアポＢ）および少
なくとも一つの他のアポリポ蛋白を含むリポ蛋白粒子の
アッセイ或いは選択的免疫測定法に関する。

従来技術およびその問題点虚血性心臓血管疾患は、工業国において主要な死因の１
つとなっている。アテローム性動脈硬化症は、その代表
的な障害である。それは、−船釣で地固的な疾患であり
、二つの重大な合併症を伴う。その一つは心筋梗塞であ
り、もう一つは大脳動脈の障害である。

この重大な疾患の病因に関して、リポ蛋白によって輸送
される脂質が重大な役割を果たしていることは多くの疫
学的および遺伝学的研究によって明らかにされてきた。

実際に、異常リポ蛋白血症がその主要な危険因子となっ
ていることが今日充分に証明されている。

アテローム性動脈硬化症の生物学的危険度の指標を探る
研究は、多くの研究の主題となってきた。

こうして、アポリポ蛋白の測定のために多くの免疫化学
的方法が応用された結果、それらアポリポ蛋白のうちの
特定のもの（主にアポＡ−１およびアポＢ）については
従来の脂質（コレステロールおよびトリグリセリド）の
アッセイによる分析力よりも優れた分析力が得られてい
る。

リポ蛋白粒子は、一般に、少なくとも一つの脂質関連ア
ポリポ蛋白を含んでいる。これら粒子のうちのあるもの
は、アテローム原粒子（ａ　ｔｈｅｒｏｇｅｎｐａｒｔ
ｉｃｌｅｓ）と考えられており、特に、アポＢを含むリ
ポ蛋白粒子ばそうである。その他の粒子（たとえばアポ
Ａを含む粒子）は、非アテローム原性であり、さらに言
えば、保護的効果を有するものと考えられ得る。

リポ蛋白（ａ）（以下Ｌｐ　（ａ）と表記する）は、複
数のアテローム原粒子のうちのひとつを構成する特殊な
リポ蛋白である。１９６３年にベルク〔Ｂｅｒｇ（Ａｃ
ｔａ　ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄ
、１９６３．５９．３６８３８２）　）によって発見さ
れて以来、その正確な組成をめぐって何年もの間議論が
あった。ある面で、それは、特にそのアポＢの組成故に
ＬＤＬ　（低密度リポ蛋白）の１つのポリモルフイズム
であると考えられてきた。現在では、このリポ蛋白はも
っとよく解明されている。その蛋白コピュラ（ｐｒｏｔ
ａｉｎ　ｃｏｐｕｌａ）は、一つ乃至二つの特異的糖蛋
白（アポ（ａ））に対して一つ若しくは複数のジスルフ
ィド架橋により結合されたアポＢから構成されている。

また、この糖蛋白の一次構造が最近決定された。その脂
質組成は、ＬＤＬの組成に極めて近い。その遺伝学的、
代謝的、および病理学的特徴のかなりの部分が、より良
く知られるようになってきたが、しかし、その生体中に
おける役割および機能は未だに解明されていない。

リポ蛋白Ｌｐ　（ａ）は、Ｌｐ　（ａ）粒子（ｐａｒｔ
ｉｃｌｅ）を意味しており、それは、アポ蛋白Ｂ−１０
０（ずなわらアポＢ−１００）、アポ蛋白（ａ）（すな
わちアポ（ａ））、および疏水性脂質〔コレステロール
エステル（ＣＥ）およびグリセリド（Ｇ）］によって構
成された中心コアを含む。この中心コアの表面には、燐
脂質（ＰＬ）、遊離コレステロール（ＣＬ　）および沈
降アポ蛋白が見られる。アポ蛋白Ｂ−１００は、ＬＤＬ
　（低密度リポ蛋白）およびＬｐ　（ａ）に共通のもの
である。

アポ（ａ）は、プラスミノゲンの構造に近い構造を有し
ている。

以下の記述中、Ｌｐ（ａ）　　・Ｂと記載した場合には
、これはアポ（ａ）およびアポＢを含む粒子を意味する
ものとし、ＬｐＡＩ：ＢはアポＡＩおよびアポＢを含む
粒子を意味し、ＬｐＣＩＩＩ：ＢはアポＣ１ｌ＋および
アポＢを含む粒子を指し、ＬｐＡＩｌ：ＢはアポＡＩｌ
およびアポＢを含む粒子を指し、また、ＬｐＥ：Ｂばア
ポＥおよびアポＢを含む粒子を意味するものとする。

現在までに開発された免疫化学的分析法では、アポリポ
蛋白のアッセイ（測定）のみが可能であり、リポ蛋白粒
子のアッセイは決してできない。

そして、アポリポ蛋白のアッセイによっては、アポリポ
蛋白が関係している粒子のタイプを予言することはでき
ない。

従来の技術で提案された方法として、特に、免疫拡散法
、電気免疫拡散法、免疫ネフェロメトリＲＩＡおよびＥ
ＬＩＳＡなどをあげることができる。

アポリポ蛋白Ａ（たとえばアポＡＩ若しくはアポＡＩＩ
）に関しては、スクリップス・クリニック・アンド・リ
サーチ・ファウンデーション（ＳＣＲＩＰＰＳ　ＣＬＩ
ＮＩＣＡＮＤ　ＲＥＳＥＡＲＣＩＩ　ＦＯＵＮＤＡＴＩ
ＯＮ）によるＰＣＴ国際出願ＰＣＴ　ＷＯ−八−８６（
１５４９３が参照され得る。

リポ蛋白Ｌｐ　（ａ）粒子に関しては、幾つかの研究お
よび分析法が提案されている。

従来の技術において提案されたＬｐ（ａ）の分離に関す
る非免疫学的方法の中では、ポリアクリルアミドゲルを
用いて電気泳動法が最も良い結果を示している。もっと
も、この方法は感度が低く、高濃度のＬｐ　（ａ）の検
出を許容するのみである。

非同質的ポリクロナル抗体若しくはモノクロナル抗体の
使用を基礎に、リポ蛋白（ａ）の定量的および定性的分
析のために開発された免疫化学的諸方法では、プラスミ
ノゲンの他アポＢとも交叉（ｃｒｏｓｓ）する免疫学的
反応を示すことが最近証明された。

免疫学的研究方法の中で、抗原と抗体がアガロスゲル中
に拡散して沈降曲線を描くごとを特徴とするオークタロ
ー　−（Ｏｕｃ）＋ｔｅｒｌｏｎｙ（ＰＲＯＧ、ＡＬＬ
ＥＲＧＹ、　１９５８．５．１）　）の免疫拡散法は、
本質的には検出方法であり、その応用である免疫電気泳
動法や免疫エレクトロシネレーシス（ｉｍｍｕｎｏｅｌ
ｅｃｔｒｏｓｙｎｅｒｅｓｉｓ）　　も同様である。

免疫学的分析方法のうち、マンシー二〔■＾ＮＣＩＮＩ
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、、１９６５．２，２３５　）
　Ｅによる放射状免疫拡散法、ローレル〔１，八ＬＩＲ
ＥＬＬ（Ｓｃａｎｄ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、　１ｎｖ
ｅｓｔ、、１９７２，２９５．１２４））による電気免
疫拡散法免疫ネフェロメトリ（免疫比濁分析法）および
放射免疫学的手法では、それらの起源ゆえに非同質性（
ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　）であるポリクロナル抗
体を使用し、また、上記したように、アポＢとの交差反
応を除くために予備的吸着プロセスを導入する必要があ
る。

本出願人は、当初、免疫ラテックス法によってリポ蛋白
（ａ）を測定する方法を開発した。この方法は、免疫ネ
フェロメトリおよび電気免疫拡散法に伴う特定の欠点を
回避し、他方、方法実施のスピードアップを図り、さら
に高い感度と試薬に関してかなりの経済的効果を収める
ものであった。

しかしながら、この方法においてもまた、交差反応を示
す欠点を有していた。

抗Ｌｐ　（ａ）抗体を用いる免疫酵素学的分析法も提案
されている。（ＤＩＩＶＩＣａｎｄ　Ｃｏ１１．Ｊ、Ｌ
ＩＰＩＤ、ｌ？ＢＳ、　、　１９８５．２６．５４０参
照）これは、競合試験であり、抗原を固体の支持体上で
固定すること、および、この抗原と血清の抗原とをモノ
クロナルＬ　ＨＬ　Ｐｌ抗体に関して競合させることに
よって構成されている。この方法の重大な欠点は、抗原
として純粋なＬｐ　（ａ）を手に入れる必要があること
である。現在、このリポ蛋白は精製が困難であり、］　
］構４純粋な状態では一定の不安定性を有している。その結果
、このタイプの分析法は、断念されることになった。

発明の目的したがって、本発明の「１的は、アポリポ蛋白Ｂ（アポ
Ｂ）と少なくとも一つの他のアポリポ蛋白とを含むリポ
蛋白粒子の免疫的分析法を提供することであって、その
方法は従来桿案された方法よりも実用性が高く、特に、
リポ蛋白粒子の定量を実現し、しかも、交差反応を示さ
ないことを特徴とする免疫測定法を提供することである
。

手段上記目的を達成するための本発明の要旨とするところは
、生物学的流体において、アポリポ蛋白Ｂ（ａｐｏＢ）
および少なくとも一つの他のアポ蛋白を含むリポ蛋白粒
子の測定のための免疫学的測定方法であって、そのリポ
蛋白粒子は二つの相異なる抗体の存在下に置かれ、その
うちの第１の抗体は存在するかもしれないリポ蛋白粒子
を捕獲するものであってかつ全アポＢ以外の他のアポ蛋
白に対する抗体およびアポＢのフラグメントもしくは決
定エピトープに対する抗体を含むグループから選択され
るものであり、第２の抗体は適当な方法でラベルされか
つ抗全アポＢ抗体を含むグループから選択されるもので
あり、前記リポ蛋白粒子の存在が適当な方法、特に、Ｅ
ＴＡ、ＲＩＡ螢光光度法、耐集反応によって確認される
ものであることにある。

また、前記第１の抗体は、好適には、抗アポＡＩ抗体、
抗アポＡＩＩ抗体、抗アポＣＩＩＩ抗体、抗アポＥ抗体
および抗アポ（ａ）抗体を含むグループから選択される
ものである。

また、前記第１の抗体は、好適には、適当な固体支持体
、特に、マイクロタイトレーショップレート、ビーズ若
しくはその類似物上で固定化されるものである。

また、前記第１の抗体は、好適には、ポリクロナル抗体
である。

また、前記第１の抗体は、好適には、モノクロナル抗体
である。

また、前記第１の抗体は、好適には、オリゴクロナル抗
体である。

ここで、オリゴクロナル抗体とは、モノクロナル抗体の
混合体のことである。

また、前記第２の抗体は、好適には、抗アポＢポリクロ
ナル抗体である。

また、前記第２の抗体は、好適には、抗アポＢモノクロ
ナル抗体である。

また、前記第２の抗体は、好適には、抗アポＢオリゴク
ロナル抗体である。

また、前記第２の抗体は、好適には、酵素、螢光物質、
放射性物質若しくは適当なラテックスビズを含むグルー
プから選択される適当なラベリング物を用いて適当な方
法によってラベルされている。

なお、リポ蛋白粒子の存在は、使用酵素の基質内での発
色反応の発生、蛍光度或いは放射能の測定、または擬集
反応の発生によって確認されるものである。

また、好適には、前記第１の抗体が抗アポ（ａ）抗体で
あり、且つ前記第２の抗体が抗アポＢ抗体である場合に
、検出される粒子はＬｐ　（ａ）　　：Ｂである。

また、好適には、前記第１の抗体が抗アポＡＩ抗体であ
り、且つ前記第２の抗体が抗アポＢ抗体である場合に、
検出される粒子がＬｐＡＩ：Ｂである。

また、好適には、前記第１の抗体が抗アポＡＩＩ抗体で
あり、且つ前記第２の抗体が抗アポＢ抗体である場合に
、検出される粒子がＬｐＡＩＩ：Ｂである。

また、好適には、前記第１の抗体が抗アポＣＩＩＩ抗体
であり、且つ前記第２の抗体が抗アポＢ抗体である場合
に、検出される粒子がＬｐＣＩＩＩ：Ｂである。

また、好適には、前記第１の抗体が抗アポＥ抗体であり
、且つ前記第２の抗体が抗アポＢ抗体である場合に、検
出される抗体がＬｐＥ：Ｂである。

本発明の他の態様の要旨とするところは、アポ蛋白（ａ
）（すなわちアポ（ａ））に特異的であリ、且つそのア
ポ蛋白（ａ）に対して極めて大きな親和性を有するモノ
クロナル抗体であって、その解離定数に、が０．８７　
Ｘ　］　０−”　Ｍと０．３２　Ｘｌ　０−１０Ｍの中
間であるモノクロナル抗体によって構成されることにあ
る。

また、前記抗体は、好適には、人起源のＬｐ（ａ）によ
って構成される抗原によって免疫されたマウス脾臓細胞
と、適当な骨髄肝細胞の融合によって得られるハイブリ
ドーマの適当なクローニングによって得られ、前記モノ
クロナル抗体は１ｇ６１タイプの免疫グロブリンである
。

本発明の他の態様の要旨とするところは、アテローム性
動脈硬化症の検出のために、前記免疫学的測定法を使用
することにある。

また、本発明の他の態様の要旨とするところは、前記免
疫学的測定方法を実行するため、若しくはアテローム性
動脈硬化症の検出のためのそれら免疫学的測定方法の使
用を実施するためのキラ１−若しくは用具一式若しくは
調整された集合物であって、（ａ）全アポＢ以外のアポ
リポ蛋白に対する抗体およびアポＢのフラグメント若し
くは決定されたエピトープに対する抗体を含むグループ
から選択された第１の抗体の適当な分量と、（ｂ）適当
なラベリング物でラベルされた第２の抗全アポＢ抗体の
適当な分量と、（Ｃ）標準血清と、（ｄ）前記検出を実
行するだめの適当な干渉液の相当量と、（ｅ）最終的に
リポ蛋白粒子の存在を確認する確認手段と、を含むこと
にある。

また、前記キットに含まれる第１の抗体は、好適には、
抗アポＡＩ抗体、抗アポＡＩＩ抗体、抗アポＣＩＩＩ抗
体、抗アポＥ抗体、抗アポ（ａ）抗体、抗アポＢフラグ
メント抗体、抗アポＢエピトープ抗体を含むグループか
ら選択されるものである。

また、前記キットに含まれる第１の抗体は、好適には、
適当な固体支持物、特に、マイクロタイトレーショップ
レート、ビーズ、若しくはそれらの類似物上で固定化さ
れる。

また、前記キットに含まれる第１の抗体は、好適には、
ポリクロナル抗体である。

また、前記キットに含まれる第１の抗体は、好適には、
モノクロナル抗体である。

また、前記キットに含まれる第１の抗体は、好適には、
オリゴクロナル抗体である。

また、前記キットに含まれる第１のモノクロナル抗体は
、好適には、アポ蛋白（ａ）（すなわちアポ（ａ））に
特異的であり、且つそのアポ蛋白（ａ）に対して極めて
大きな親和性を有するものであって、その解離定数ＫＤ
が０．８７Ｘ１０−’Ｍと０．３２Ｘ　１０−１０Ｍの
中間であるモノクロナル抗体によって構成される抗Ｌｐ
（ａ）モノクロナル抗体から構成される。

また、前記キラ１〜に含まれる第１のモノクロナル抗体
は、好適には、人起源のＬｐ　（ａ）によって構成され
る抗原によって免疫されたマウス脾臓細胞と、適当な骨
髄腫細胞の融合によって得られるハイブリドーマの適当
なクローニングによって得られ、ＩｇＧ１　タイプの免
疫グロブリンから構成される。

また、前記キットに含まれる第２の抗体は、好適には、
抗アポＢポリクロナル抗体である。

また、前記キットに含まれる第２の抗体は、好適には、
抗アポＢモノクロナル抗体である。

また、前記キットに含まれる第２の抗体は、好適には、
抗アポＢオリゴクロナル抗体である。

また、前記キットに含まれる第２の抗体は、好適には、
適当な酵素系に結合されている。

また、好適には、前記キットに含まれる第２の抗体が適
当な酵素系に結合されているときに、そのキットがリポ
蛋白粒子の存在を確認する確認手段として、その酵素系
の適当な基質を適当量含んでいる。

また、好適には、前記キットに含まれる第２の抗体が適
当な螢光物質に結合されている。この場合には、リポ蛋
白粒子の存在は蛍光度の検出によって確認される。

また、好適には、前記キットに含まれる第２の抗体がラ
テックスビーズに結合されている。

実施例例Ｊ：血液標本の調製血液標本は、絶食健康桿供者から静脈穿刺によって得て
、真空下においてＥＤＴＡを含むチューブ中に集めた。

保存剤を添加（最終濃度はＥＤＴＡか０．２７　ｍｍｏ
ｌ　／　Ｉ’、、εアミノカプロン酸が０．９ｍｍｏ１
／ｊｌ！、０．６ｍｍｏｌ／ｌのクロラムフェニコール
および０．３　ｍｍｏｌ／　ｌのグルタチオン）し、遠
心分離によって細葉と細胞成分とに分離した後、血漿サ
ンプルを４°Ｃで保存した。この血漿サンプルは、４８
時間以内に使用するか、もしくは−２０°Ｃで冷（東さ
れなげればならない。

例２：Ｌｐ（ａ）粒子の分離および精製Ｌｐ（ａ）濃厚
（ｒｉｃｈ）分画を遠心分離により、固体臭化カリウム
で１．０６−１．１２ｋｇ／ｆｆの間の密度に調整され
たＬｐ　（ａ）十血漿プールから分離した。この血漿を
。ついて、５０Ｔｉロータを有するヘンクマン（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ）　　Ｉ−８−７０超遠心分離機で、４８時間
、１００．０００　Ｘｇ　、４°Ｃの条件で遠心分離し
た。

精製には、寸法が１００Ｘ２．６のセファ１コース（Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ　６　Ｂカラムを用いた。

分子量キットによるキャリブレーションの後、精製を行
った。

溶出停止溶液ば、トリス０．ＩＭ、　　ＮａＣｌ２０．
１５Ｍ、Ｎａ２ＥＤＴＡ１ｍＭ、ｐｈ８．２の組成のも
のを用いた。

超遠心分離によりＬｐ（ａ）が濃縮された分画８０ｍｇ
が、デポジットされた。

溶出は、４°Ｃにおいて８　ｍｌ／ｈの流速で２４時間
以上行った。回収は５ｍｌの分画毎に行った。

それを、０．２２μｍミリポアフィルタを用いて濾過し
た。第１図において、横軸は溶出体積（ｍｌ）であり、
縦軸は吸光度（２８０ｎｍ）である。３つのピークが得
られた。

ピーク１は、抗Ｌｐ（ａ）および抗アポＢ抗血清に対す
る沈降アーク（ａｒｃｓ）を示し、ピーク２は、抗アポ
Ｂ　（ＬＤＬ）抗血清のみに対するものであり、そして
、ピーク３は、抗アポＡＩ（ＨＤＬ）に対してのもので
ある。

ピーク１からは、１１ｍｇのＬｐ（ａ）：Ｂが得られた
。この精製Ｌｐ（ａ）　　・３粒子は、３０％の蛋白質
と６０％の脂質を含む。

例３：抗アポ（ａ）モノクロナル抗体の調製Ａ、アポ（
ａ）の精製例２で得られた濃厚Ｌｐ（ａ）の分画を以下のように処
理した。

Ｌｐ（ａ）を緩衝液中においてジスルフィド架橋のレベ
ルで開裂させた。この緩衝液としては、トリス１．０ｍ
Ｍ、ＮａＣＬｏ、（１５Ｍ、、Ｎａｚ　ＥＤＴＡ　１　
ｍＭ、　Ｎ　ａ　Ｎ３０．０２％緩衝液（ｐ　Ｈ７，６
）を用い、これに固体状のジチオスレイトール（ＤＴＴ
）を最終濃度が１０ｍＭとなるように添加した。

こうして得られたン容液を、３７°Ｃで３日間インキュ
へ−１〜し、さらに、ＤＴＴを加えない同し緩衝液に対
して４．°Ｃで−・夜透析した。

ン容液は、その後、セファロースヘパリンカラム（ファ
ーマシアｐｈａｒｍａｃｉａ　）上によるクロマ１ヘグ
ラフイにかけられた。２つのピークがン容量されて、そ
のうち第１のピークはアポ（ａ）に対応し、第２のピー
クはＬ　Ｄ　Ｌ類似の粒子である。

Ｂ、　抗１−ｐ　（ａ）モノクロナル抗体の産生１、免
疫化：バルブ（Ｂａｌｂ）／ＣＣママウス、１００ｇのＬ　ｐ
（ａ）と３００μｉのフロイント完全アジュバントとの
混合物を腹腔注射することにより免疫化した。この注射
は、各マウスにつき２１日後に繰り返したが、その後は
４力月の間フロイント不完全アジュバントその他のもの
によった。これらのマウスから、細胞バイブリプ−ジョ
ンに進む前に免疫学的反応を検証するために採血をした
。

２、モノクロナル抗体の採取：融合：Ｄ−１０の日に前もってインターペリトネアルブースタ
ー投与を受け、その後Ｉ）−３の日に最後の静脈内投与
を与えられたＬｐ　（ａ）反応性のマウスから採血した
。免疫血清を回収した。これは、スクリーニング中にポ
ジティブコントロールとして用いるために、部分標本と
されその後凍結されるであろう。また、マウスの脾臓を
摘出した。

この脾臓を、無菌的にぺＩ・り皿に採り上げ、細かくし
た。このようにして得た脾臓細胞を、コーラ−およびミ
ルシュタインによって記載された手順に従い、ＰＥＧ−
ＤＭＳＯにより、骨髄腫５Ｐ２１０細胞と融合させた。

脾臓細胞の骨髄腫細胞に対する割合は１０である。

ＰＥＧを除いた後に、全ての細胞を再び選択１−ＩＡＴ
培地に採り上げ、９６ウエルの培養皿に蒔いた。ＨＡＴ
培地の２滴で１ウエル当たり２５０００個の細胞の割合
であった。培養皿は、３７°Ｃ湿潤雰囲気かつ５％の二
酸化炭素の存在下のオーブン中に置かれた。

細胞は選択ＨＡ　Ｔ培地の存在下で培養され、次いで１
５日後今度はＨＴ培地の存在下で培養し、さらに最終的
にはＡ培地の存在下で培養した。こうして、ハイプリン
ト化されなかった骨髄腫細胞は消失した。得られたウェ
ルを免疫酵素的スクリニング法によりテストした。

クローニング：陽性のウェルが限界希釈によりクローニングされた。

こうして２０の培養細胞が検出された。また、ＬＤＬの
みに向けられた免疫グロブリンを放出する３つのウェル
が認められた。

培養の放出性細胞を懸濁液中に置き、ついで、サンプリ
ングを行い、Ａ培地を含む無菌のチゴーブ内で１０分の
１に希釈した。また、１００分の１の希釈サンプルで、
ソックス細胞により計数を行った。細胞の数は、Ａ培地
１　ｍｌ当たり２０個まで戻した。この細胞を、２４時
間から４８時間前に調整されたマウスの腹膜細胞（栄養
細胞ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ）が含む９６ウエル
の培養皿に再び蒔いた。その割合は１ウエル当たり５０
μｌの割合であり、そして理論上５０μ！当たり一つの
細胞を含んでいる。抗Ｌｐ　（ａ）陽性クローンは、２
回、さらに３回とクローンされる。陽性クローンは、そ
の後、大量に増殖させられ、液体窒素で保存されるか、
あるいは復水産生のために用いられる。

Ｌｐ　（ａ）に向けられた抗体を産成する２０の培養ウ
ェルに関し、４つの安定したクローンのみが得られ保存
された。これらは、クローンＫＯ１゜ＫＯ６ＫＯ７およ
びＫＯ９である。これらのクローンから、復水そして最
終的にはモノクロナル抗体の産成を行った。各抗体のク
ラスは、市販の特異的免疫血清を用いて免疫拡散法によ
って決定された。これら４つのクローンは、ＩｇＧを産
成し、それらは、プロティン−Ａセファロースによるク
ロマトグラフィーにより容易に精製される。

復水の産成２つの方法が用いられた：クローン由来のハイブリッド細胞を、０．５　ｍｌのプ
リスタン（ｐｒｉｓ　Ｌａｎｅ）を１０日前に受けたノ
くシブ／Ｃマウスに腹腔注射により与えた。マウス１匹
当たり約５．１０６個のハイプリ・ンド細胞が注射され
た。これらの細胞は、ウシ胎児血清を除去するためにダ
ルベツコ培地で前もって洗浄された。マウスは、拒絶の
危険を無くすため免疫的見地からプリスタン注射により
前もって抑制させられた。

ハイブリッド細胞によってマウスの復水が産成された。

この復水はモノクロナル抗体に冨む。

第２の方法は、大量生産により適合的である。

第１のステップにおいては、２〜３．１０６（１１ｉ１
の細胞を皮下注射することにより１５日の間に腫脹（ｔ
ｕｍａｒ）を生じさせる。この腫脹は、極めて多量の細
胞増殖の場所である。サンプリングの後は、腫脹はグラ
インドされ、細胞はダルベツコ培地で洗浄されて、プリ
スタン処理されていないバルブ／Ｃマウスに腹腔内注射
された。一つの腫脹を用いて８〜ｌＯ匹のマウスの注射
が可能である。それと同時に別のマウスには、産成サイ
クルを維持するために皮下注射も行った。

上記２つの方法においては、復水を集め、３００、　Ｏ
ｒｐｍ　　（１０ｍ１ｎ　）で遠心分離し、得られた上
澄み液のみを回収した。１０−’ＭのＰＭＳＦを添加す
ることにより、プロテアーゼの作用を抑制することがで
きる。保存は、−２０°Ｃで行った。Ｋｏｌ、ＫＯ６，
ＫＯ７，ＫＯ９の各クローンにつき、多量の復水が回収
された。

３、モノクロナル抗体の精製：硫酸アンモニウムによる沈降（ｐｒｅｃｉｐｉ　Ｌａｔ
ｉｏｎ）得られた復水は、５０％（Ｐ／Ｖ）硫酸アンモ
ニウムン容液で（市を足（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）され
た。

連続して２回の沈降を行った。こうしてヘモグロビンの
他にアルブミンの一部も除去された。最後の沈降物が少
なくとも０．１５　Ｍの塩化ナトリウム溶液の最小量中
に再び採り」二げられて、同じ溶液に対して一夜透析さ
れた。

アフィニティ力ラムによる精製第２のステップは、Ａ−セファロース蛋白質上でのクロ
マトグラフィーによるＩｇＧの本来の精製である。再溶
解させられた蛋白質の最適量を０゜１０Ｍ燐酸ナトリウ
ム（ｐＨ８）の緩衝液により平衡カラム上にデポジット
し、その後、室温において少なくとも３０分間インキユ
ヘートする。ついでそのカラムをその平衡緩衝溶液で洗
浄し、さらに０．１　Ｍのクエン酸−クエン酸ナトリウ
ム緩衝ン容液（ｐＨ３）で？容出した。ＩｇＧの全ての
クラスが溶出された。？容量液は、直ちにＩＭの燐酸二
カリウムの溶液で中和した。そのカラムは、最初の緩衝
液で再平衡化された。ＩｇＣ，分画は、０．１ＭＰＢＳ
溶液（ｐＨ７，２）に対して透析され、次いで一２０°
Ｃで保存された。

得られたモノクロナル抗体について、ＥＬＩＳＡ法によ
り、アポ（ａ）、Ｌｐ　（ａ）、ＬＤＬおよびＨＤＬに
対してのラピ・ノド特異性試験を行った。これが、ＬＰ
　（ａ）粒子の免疫酵素的測定のために使用される。

以下に示す表１は、直接ＥＬＩＳＡによる抗しｐ　（ａ
）モノクロナル抗体の特異性コントロールを表す。

表１例４：抗アポ（ａ）モノクロナル抗体の特徴：それらの
Ｌｐ（ａ）：Ｂおよびプラスミノゲンに対する親和性これらの抗体は、プラスミノゲンとの間で交差反応を示
す。

解離定数は、フリゲット（ＦＲＩＣＵＥＴ）その他によ
って決定され、記載されている（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　１９８５．７７、３（１５−３
１９）。０．１　ｍｌの抗体（３０ｎｇ／ｍｌのＫＯ７
もしくはに（１９）が０．１　ｍｆｌのＩ−ｐ（ａ）＋
Ｂもしくは様々の濃度のプラスミノゲンと共にインキュ
ベートされた。室温での１５時間のインキュベーション
の後に、０．１　ｍｌのその混合物を、精製Ｌｐ　（ａ
）：Ｂで前もってコーティングされている。マイクロタ
イトレーショップレートのウェルの中に移し、３７°Ｃ
で２時間インキュベートシた。結合した抗体は、パーオ
キシダーゼでラベルされた抗マウスラビット免疫グロブ
リンによって検出される。解離定数ＫＤは、スキャッチ
ャード式によって計算される。モノクロナル抗体ＫＯ７
およびＫＯ９のＬｐ（ａ）：Ｂに対する親和性と、それ
らのプラスミノゲンに対する親和性との間には重大な差
異が観察された。その結果が以下の表２および第２図に
示されている。

表２第２図は、修正スキャッチャード式によって計算された
解離定数を示している。曲線１は、Ｌｐ（ａ）：Ｂと抗
アポ（ａ）モノクロナル抗体（Ｋ（１７＋ＫＯ９）混合
物との結合を表し、曲線２は、プラスミノゲンと抗アポ
（ａ）モノクロナル抗体混合物（ＫＯ７＋ＫＯ９）との
結合を表す。■は、結合抗体分画に対応し、ａは、遊離
抗原濃度に対応する。

これら抗アポ（ａ）モノクロナル抗体は、アポ（ａ）に
対してかなりの親和性を示す。

例５：抗アポＢポリクロナル抗体の調製：この抗体は、
ラヒソト中から得られ、ＩｇＧ分画は、硫酸すトリウム
による沈降およびそれに続くアフィニティクロマトグラ
フィによって精製された。

精製された抗アポＢポリクロナル抗体を、パーオキシダ
ーゼと結合させて複合体とした。

例６：抗アポＢモノクロナル抗体の調製アポＢに対する
モノクロナル抗体を、５Ｐ２１０骨髄腫細胞と１．　Ｄ
　Ｌで免疫化されたマウスより得られた脾臓細胞との融
合により得た。ＢＯ４ＢＯ５，ＢＯ６Ｂ（１７　　Ｂ１
８およびＢ１９と名付Ｑノられた抗体は、アポＢに対し
て特異的であるが、血漿のその他の蛋白質とは反応しな
い。

それらのエピト−プはアポ−Ｂ１００のトロンビンＴｌ
／Ｔ３のフラグメントに位置する。

抗アポＢモノクロナル抗体の混合物をパーオキシダーゼ
と結合させて複合体とした。

例７：Ｌｐ（ａ）：８粒子の選択的免疫酵素学的測定法
、第１の抗体は、ＫＯ７およびＫＯ９のモノクロナル抗
アポ（ａ）抗体の混合物であり、第２の抗体は、抗アポ
Ｂモノクロナル抗体（ＢＯ４、ＢＯ５，ＢＯ６，ＢＯ７
，Ｂ１８．Ｂ１９）の混合物であり、パーオキシダーゼ
によってラベルされている。

本発明に従う免疫酵素学的測定法においては、ハイブリ
チック（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ）の特許ｎ　°２４８７９
８３（１９８１年８月３日）に記載されているサンドイ
ンチ法を採用する。

キャリブレーション曲線例２で得られたＬｐ　（ａ）：８粒子に対応し、アポ（
ａ）およびアポＢ抗原（第３図）を表す一次標準（ｐｒ
ｉｍａｒｙ　５ｔａｎｄａｒｄ）は、５０の市販の血漿
プールを標準化するために用いられる。標準グラフの直
線ゾーンは、０．０６〜０．４０μｇ　／　ｍｆｌまで
である。第３図は、精製Ｌｐ　（ａ）：８粒子の標準化
曲線を示し、横軸は抗原の濃度（μｇ　／　ｄ　）（曲
線３についてはＬｐ　（ａ）：Ｂの粒子であり、曲線４
についてはプラスミノゲンもしくはＬ　Ｄ　＋−である
）であり、縦軸は、４９２ｎｍでの吸光度である。ネガ
ティブサンプルの吸光度は０．（１５０に対応する。

本来的測定ポリスチレン製マイクロクイトレージョンプレート（コ
スタ−（Ｃｏｓ　ｔａｒ）　３５９０　）を前日の夜、
室温において、Ｏ，１，ＭのＰ　１３　Ｓ中での濃度が
２０μｇ／雁である濃度例３に従う抗アポ（ａ）モノク
ロナル抗体の混合物０．１ｍｊ！（ＫＯ７およびＫＯ９
モノクロナル抗体の混合物であり、モル比が１対１であ
る）を用いてコーティングした。

・標準血漿プールをＬｐ　（ａ）：８粒子の濃度が０．
０６〜０．４０μｇ／ｍＨの間に来るように希釈し、ま
た、分析される血漿のサンプルを２００分の１，８００
分の１および３２００分の１になるように１％ＰＢＳ−
ＢＳＡを用いて希釈した。

プレートをＰＢＳで四回リンスし、その後ウェルの壁に
１００μｌのサンプルもしくは標準体を添加し、３７°
Ｃで１５０ｍ１ｎの間インキュベーションを継続させた
。

ＰＢＳでリンスした後、１％ｐＢｓ＝ＢｓＡで１０００
分の１に希釈された０、　１　ｍｆｌの複合体（１ｍｇ
　／　ｍｆｌでの抗アポ／パーオキシダーゼ）を添加し
、３７°Ｃで１２０分インキュベートした。

ウェルを再びＰＢＳでリンスし、その後パーオキシダー
ゼの基質の溶液（０−フェニレンジアミンが３　ｍｇ　
／　ｍｌと０．１　Ｍクエン酸−燐酸緩衝液（ｐＨ５，
６）中で０．６４ｕ１．／ｍｌの濃縮Ｈ２０□）を０、
１　ｍｌ添加したところ、３０ｍ１ｎの後に暗所におい
て発色反応が見られた。この反応をＩＮＨ（１をＯＡｍ
ｌ添加して中断させ、４９２ｎｍでの吸光度を測定した
。

例８　：Ｌｐ　（ａ）：Ｂに関しての本発明の方法の特
異性ａ）プラスミノゲンの干渉抗体の特異性は、抗アポ（ａ）モノクロナル抗体ＫＯ７
およびＫＯ９の混合体のＬｐ　（ａ）　　：８粒子のア
ポ（ａ）に対する、およびそれのプラスミノゲンに対す
る親和性をそれぞれに測定することによって確認される
（例４）。

しかしながら、本方法の優れた特異性を表すために、プ
ラスミノゲンとの間で起こり得る干渉について研究する
ことが便利である。

本発明による分析方法の条件下での干渉を推定するため
に、精製Ｌｐ（ａ）：Ｂと精製プラスミノケンの存在下
で競合阻止試験を実施した。この競合阻止試験は、一定
濃度のＬｐ（ａ）：Ｂと一連の相異なる濃度のプラスミ
ノケンとについて実施した。０．０６ｍｇ／ａのＬＰ（
ａ）０．（１５ｍＮと０゜１から８０ｍｇ／ａの間の濃
度のプラスミノケン０゜（１５ｍｆ！、を、前もって抗
アポ（ａ）抗体ＫＯ７およびＫＯ９の混合物でコーティ
ングしておいたウェルに対し添加しインキュへ一トシた
。

そして、結合Ｌｐ（ａ）：Ｂの量を前記したように決定
した（例７参照）。

第４図は、本発明によるＬｐ（ａ）：８粒子の測定法の
条件下での、プラスミノケンの干渉の可能性を表す。

その結果が、Ｂ（プラスミノケンの存在）／ＢＯ（プラ
スミノケンの不存在）によって表されている。

第４図は、横軸がプラスミノケンの濃度（ｍｇ／准）で
あり、縦軸が結合Ｌｐ　（ａ）：８粒子のパーセンテー
ジである。この図に示されるように、高濃度（４０ｍｇ
／ｄｌｌ）のプラスミノケンは、Ｌｐ（ａ）：Ｂの結合
の５６％までを抑制し得る。しかしながら、その濃度が
１．２５　ｍｇ／ａでは、抑制は約１８％である。この
レベルのプラスミノケンは、一般に、血漿の四十倍の希
釈に対応するものであって、相対的に一定レベルのプラ
スミノケン（４７±７■／准）を含んでおり、また、実
際にはこの希釈率のみが極めて低レベルの血漿Ｌｐ（ａ
　）　　：　Ｂ　（＜０．１　ｍｇ／ｄ１）の測定に用
いられるので、プラスミノケンの干渉は本発明の方法に
おいては回避されるように思われる。

さらに、例３で見たように、抗体ＫＯ７，ＫＯ９のＬｐ
　（ａ）：Ｂおよびプラスミノケンに対する親和性には
顕著な差異が見られる（第１図）。

ｂ）抗アポ（ａ）抗体の特異性：相異なる血漿のＬｐ　
（ａ）：Ｂに関してＫＯ７およびＫＯ９モノクロナル抗
体によって認識されるエピトープのエクスプレッション
（発現）の研究による二次標＄　（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ
　５ｔａｎｄａｒｄ）との比較およびその二次標準につ
いてエピト−プのエクスプレッションについて、アポ（ａ）
の不均質性の影響の可能性を小さくするために、ＫＯ７
およびＫＯ９モノクロナル抗体の混合物が使用された。

これらエピトープの同時的エクスプレッションを、その
濃度が１〜４０ｍｇ／准であるＬｐ（ａ）：Ｂを含む１
０の相異なる血漿について決定した。例４で述べた競合
阻止法は、モノクロナル抗体ＫＯ７およびＫＯ９のエピ
ト−プのエクスプレッションの決定をも可能とする。

競合阻止曲線の傾斜は、相類似しており、Ｂ　／　Ｂ　
Ｏ（結合抗体／’ｉｌｉ離抗体）のロジットの関数とし
て表される。その値は、−１，８から−２，１５の間で
あり、平均値は−２である。ある血漿プールのＬｐ　（
ａ）：Ｂの典型的な傾斜は、−２，（１５である（第５
図）。これらの結果は、エビ１〜−プＫＯ７およびＫＯ
９が相異なる固体のＬｐ（ａ）について同しように発現
されることを示唆している。

第５図は、横軸にＬｐ　（ａ）：Ｂの濃度（μｇ／雁）
をとり、縦軸にはＢ／ＢｏＯロジットをとっている。

個々のＬｐ　（ａ）：Ｂの免疫反応性を決定するために
、Ｌｐ　（ａ）：Ｂを、１〜４０　ｍｇ／ｃｌの間の濃
度のＬｐ　（ａ）：Ｂを含む１０の血漿について測定し
た。４５０ｎｍでの吸光度のロシア）によッテ表された
ＥＬＩＳＡ曲線は、１．８５〜２．３０の間の傾斜（平
均値２．１５　）を示す。二次標準の傾斜は、２．１２
である。

試験の正確度を推定するために、相異なる量の精製Ｌｐ
　（ａ）：Ｂ　（５，２０，５０ｇ）を相異なるレベル
のＬｐ　（ａ）：Ｂ　（１，１０，３０ｍｇ／ｄ１．）
を含む３つの血漿に添加した。正確度は、８５から１０
０％であった。

Ｃ）本方法の反復性および再現性の研究本方法の正確度
は、また、同一のマイクロタイトレーショップレートを
用いて９の血漿を土間測定することによっても研究され
た。これは、イントラテスト（反復性）の変化率（ＣＶ
）（イントラテストの平均値−４，７％）を得るための
ものである。これらの血漿はまた、インターテスト変化
率（再現性）（インターテストＣＶの平均値−９゜６％
）を得るために、三日間連続して試験された。

血漿のＬｐ（ａ）：Ｂについて、これを−２０°Ｃで保
存する効果を、相異なる日に同し９つの血漿を用いて測
定した。変化係数は、９．８％であった。

種々の変化係数は、このように低く、したがって本発明
による方法が正確でしかも有利なことを示している。

例９：抗アポＣＩＩＩおよび抗アポＥポリクロナル抗体
の調製個々のアポ蛋白に対する抗血清をラビットで産成した。

抗体の予備精製をＮＡ２ＳＯ４沈降によって行い、その
後、ＣＮ１３ｒ−活性化セファロース４Ｂに結合された
対応の純粋抗原を用いるアフィニティクロマトグラフィ
により精製した。

例１０：ＬｐＣＩＩｌ：Ｂの免疫酵素測定法９６ウエル
のポリスチレンマイクロタイタプレー　１−を０．ＩＭ
燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて三回洗浄した後
に使用した。

ＬｐＣＩＩ［：Ｂを測定するために、プレートをアポＣ
Ｉに対する精製抗体でコーティングした。各ウェルを、
室温で一夜インキユーベーションすることにより、０．
１　ｍｆｌの抗アポＣＩＩＩでコーティングした。

コーティングされたプレートを０．１　Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ
で四回洗浄した後に、適当に希釈された血清０．１　ｍ
ｐ。

をマイクロタイタープレートに添加し、３７°Ｃで２時
間インキュベートして反応を進行させた。プレートを再
び洗浄し、パーオキシダーゼによってラベルされたアポ
Ｂに対する抗体を１ウエル当たり０．１　ｍｆｌの量で
全てのプレートに添加し、３７゛Ｃで二時間インキユヘ
ートした。プレートは、洗浄し、アスピレ−１−して乾
燥させた。さらに、各ウェルに対して、新鮮な基質溶液
０．１　ｍｆｌを添加し、暗所中室温で３０ｍ１ｎの間
酵素反応を進行させた。

そして、０．１　ｍｌのＩＭＨＣｆを添加することによ
ってこの反応を止め、４９２ｎｍで吸光度を読んだ。

上記コーティングに使用された抗体の最適濃度は、抗ア
ポＣＩＩＩについては１５μｇ　／　ｍｌであった。

また、抗アポＢ複合体の最適希釈率は約４０００分の１
であった。

本分析法の条件によれば、１０ｎｇ／ｍＲ〜２００ｎ　
ｇ　／　ｍＲの間の濃度のＬｐＣＩＩＩ：Ｂを測定する
ことが可能である。

例１１：Ｌｐｒｉ：Ｂの免疫酵素的測定法プロトコルは
、例１０において述べたと同一である。第１の抗体は、
抗アポＥ抗体である。

不法の条件によれば、濃度が２０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎ
Ｂ／ｍρのＬｐＥ：８粒子の測定が可能である。

第６図は、ＬｐＣＩＩＩ：８粒子の標準曲線（曲線１）
と、Ｌ　ｐ　Ｅ　：　８粒子の標準曲線（曲線２）を示
し、その横軸はアポＢの濃度（ｎｇ／ｍりであり、縦軸
は４９２ｎｍでの吸光度である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、溶出体積と吸光度との関係から溶出されたリ
ポ蛋白粒子の種類を示すグラフである。第２図は、モノ
クロナル抗体とＬｐ　（ａ）：　Ｂおよびモノクロナル
抗体とプラスミノゲンとの間の解離定数をそれぞれ示す
グラフである。第３図は、精製Ｌｐ（ａ）：８粒子の標
準化曲線を示すグラフである。第４図は、本発明のＬｐ　（ａ）：　Ｂ測定方法におけ
るプラスミノゲンの干渉の可能性について示すグラフで
ある。第５図ば、Ｌｐ　（ａ）：　Ｂの濃度とＢ／Ｂｏ
との間の関係を示すグラフである。第６図は、ＬｐＣＩ
Ｂ粒子とＬｐＥ：８粒子の標準曲線を示すグラフである
。出願人　アンスティテユ・パスツール（ばか１名）イ成
１年５月２５日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）生物学的流体において、アポリポ蛋白Ｂ（ａｐｏ
Ｂ）および少なくとも一つの他のアポ蛋白を含むリポ蛋
白粒子の測定のための免疫学的測定方法であって、その
リポ蛋白粒子は二つの相異なる抗体の存在下に置かれ、
そのうちの第１の抗体は存在するかもしれないリポ蛋白
粒子を捕獲するものであってかつ全アポＢ以外の他のア
ポ蛋白に対する抗体およびアポＢのフラグメントもしく
は決定エピトープに対する抗体を含むグループから選択
されるものであり、第２の抗体は適当な方法でラベルさ
れかつ抗全アポＢ抗体を含むグループから選択されるも
のであり、前記リポ蛋白粒子の存在が適当な方法、特に
、ＥＩＡ、ＲＩＡ、螢光光度法、凝集反応によって確認
されるものであることを特徴とする免疫学的測定方法。
（２）前記第１の抗体は、抗アポＡ I 抗体、抗アポＡ
II抗体、抗アポＣIII抗体、抗アポＥ抗体および抗アポ
（ａ）抗体を含むグループから選択されるものである請
求項１記載の免疫学的測定方法。
（３）前記第１の抗体は、適当な固体支持体、特に、マ
イクロタイトレーショップレート、ビーズ若しくはその
類似物上で固定化される請求項１若しくは請求項２記載
の免疫学的測定方法。
（４）前記第１の抗体は、ポリクロナル抗体である請求
項１乃至３のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
（５）前記第１の抗体は、モノクロナル抗体である請求
項１乃至３のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
（６）前記第１の抗体は、オリゴクロナル抗体である請
求項１乃至３のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
（７）前記第２の抗体は、抗アポＢポリクロナル抗体で
ある請求項１乃至６のいずれかに記載の免疫学的測定方
法。
（８）前記第２の抗体は、抗アポＢモノクロナル抗体で
ある請求項１乃至６のいずれかに記載の免疫学的測定方
法。
（９）前記第２の抗体は、抗アポＢオリゴクロナル抗体
である請求項１乃至６のいずれかに記載の免疫学的測定
方法。
（１０）前記第２の抗体は、酵素、螢光物質、放射性物
質若しくは適当なラテックスビーズを含むグループから
選択される適当なラベリング物を用いて適当な方法によ
ってラベルされている請求項１乃至９のいずれかに記載
の免疫学的測定方法。
（１１）前記第１の抗体が抗アポ（ａ）抗体であり、且
つ前記第２の抗体が抗アポＢ抗体である場合に、検出さ
れる粒子はＬｐ（ａ）：Ｂである請求項１乃至１０のい
ずかに記載の免疫学的測定方法。
（１２）前記第１の抗体が抗アポＡ I 抗体であり、且
つ前記第２の抗体が抗アポＢ抗体である場合に、検出さ
れる粒子がＬｐＡ I ：Ｂである請求項１乃至１０のい
ずれかに記載の免疫学的測定方法。
（１３）前記第１の抗体が抗アポＡII抗体であり、且つ
前記第２の抗体が抗アポＢ抗体である場合に、検出され
る粒子がＬｐＡII：Ｂである請求項１乃至１０のいずれ
かに記載の免疫学的測定方法。
（１４）前記第１の抗体が抗アポＣIII抗体であり、且
つ前記第２の抗体が抗アポＢ抗体である場合に、検出さ
れる粒子がＬｐＣIII：Ｂである請求項１乃至１０のい
ずれかに記載の免疫学的測定方法。
（１５）前記第１の抗体が抗アポＥ抗体であり、且つ前
記第２の抗体が抗アポＢ抗体である場合に、検出される
抗体がＬｐＥ：Ｂである請求項１乃至１０のいずれかに
記載の免疫学的測定方法。
（１６）アポ蛋白（ａ）（すなわちアポ（ａ））に特異
的であり、且つそのアポ蛋白（ａ）に対して極めて大き
な親和性を有するモノクロナル抗体であって、その解離
定数Ｋ＿Ｄが０．８７×１０＾−＾１＾１Ｍと０．３２
×１０＾−＾１＾０Ｍの中間であるモノクロナル抗体に
よって構成される抗Ｌｐ（ａ）モノクロナル抗体。
（１７）人起源のＬｐ（ａ）によって構成される抗原に
よって免疫されたマウス脾臓細胞と、適当な骨髄腫細胞
の融合によって得られるハイブリドーマの適当なクロー
ニングによって得られ、前記モノクロナル抗体はＩｇＧ
＿１タイプの免疫グロブリンである、請求項８記載の抗
体。
（１８）アテローム性動脈硬化症の検出のために、請求
の範囲１から１５のいずれかに従う免疫学的測定法の使
用。
（１９）請求項１乃至１５のいずれかに記載のリポ蛋白
粒子の免疫学的測定方法を実行するため、若しくは請求
項１８記載のアテローム性動脈硬化症の検出のための免
疫学的測定方法の使用を実施するためのキット若しくは
用具一式若しくは調整された集合物であって、全アポＢ
以外のアポリポ蛋白に対する抗体およびアポＢのフラグ
メント若しくは決定されたエピトープに対する抗体を含
むグループから選択された第１の抗体の適当な分量と；
適当なラベリング物でラベルされた第２の抗全アポＢ抗
体の適当な分量；標準血清；前記検出を実行するための適当な干渉液の相当量；およ
び最終的にリポ蛋白粒子の存在を確認する確認手段とを
含むことを特徴とするキット若しくは用具一式若しくは
調整された集合物。
（２０）前記第１の抗体が抗アポＡ I 抗体、抗アポＡ
II抗体、抗アポＣIII抗体、抗アポＥ抗体、抗アポ（ａ
）抗体、抗アポＢフラグメント抗体、抗アポＢエピトー
プ抗体を含むグループから選択される請求項１９記載の
キット。
（２１）前記第１の抗体は、適当な固体支持物、特に、
マイクロタイトレーショップレート、ビーズ、若しくは
それらの類似物上で固定化される請求項１９若しくは２
０のいずれかに記載のキット。
（２２）前記第１の抗体は、ポリクロナル抗体である請
求項１９乃至２１のいずれかに記載のキット。
（２３）前記第１の抗体は、モノクロナル抗体である請
求項１９乃至２１のいずれかに記載のキット。
（２４）前記第１の抗体は、オリゴクロナル抗体である
請求項１９乃至２１のいずれかに記載のキット。
（２５）前記第１のモノクロナル抗体は、請求項１６乃
至請求項１７に記載の抗体である請求項２３乃至２４に
記載のキット。
（２６）前記第２の抗体は、抗アポＢポリクロナル抗体
である請求項１９乃至２５のいずれかに記載のキット。
（２７）前記第２の抗体は、抗アポＢモノクロナル抗体
である請求項１９乃至２５のいずれかに記載のキット。
（２８）前記第２の抗体は、抗アポＢオリゴクロナル抗
体である請求項１９乃至２５のいずれかに記載のキット
。
（２９）前記第２の抗体は、適当な酵素系に結合されて
いる請求項１９乃至２８のいずれかに記載のキット。
（３０）前記第２の抗体が適当な酵素系に結合されてい
るときに、本キットがリポ蛋白粒子の存在を確認する確
認手段として、その酵素系の適当な基質を適当量含んで
いる請求項２９記載のキット。
（３１）前記第２の抗体が適当な螢光物質に結合されて
いる請求項１９乃至２８のいずれかに記載のキット。
（３２）前記第２の抗体がラテックスビーズに結合され
ている請求項１９乃至２８のいずれかに記載のキット。