JPH026755A - リポ蛋白粒子の免疫学的測定方法,抗Lp(a)モノクロナル抗体,およびそれらのアテローム性動脈硬化症の診断における使用 - Google Patents

リポ蛋白粒子の免疫学的測定方法,抗Lp(a)モノクロナル抗体,およびそれらのアテローム性動脈硬化症の診断における使用

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JPH026755A
JPH026755A JP1011746A JP1174689A JPH026755A JP H026755 A JPH026755 A JP H026755A JP 1011746 A JP1011746 A JP 1011746A JP 1174689 A JP1174689 A JP 1174689A JP H026755 A JPH026755 A JP H026755A
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Jean-Charles Fruchart
ジャン・シャルル・フルーシャール
Dac Ngoc Vu
ゴック・ヴュー・ダック
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Institut Pasteur de Lille
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Institut Pasteur de Lille
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    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明分野 本発明は、アポリポ蛋白B(すなわちアポB)および少
なくとも一つの他のアポリポ蛋白を含むリポ蛋白粒子の
アッセイ或いは選択的免疫測定法に関する。
従来技術およびその問題点 虚血性心臓血管疾患は、工業国において主要な死因の1
つとなっている。アテローム性動脈硬化症は、その代表
的な障害である。それは、−船釣で地固的な疾患であり
、二つの重大な合併症を伴う。その一つは心筋梗塞であ
り、もう一つは大脳動脈の障害である。
この重大な疾患の病因に関して、リポ蛋白によって輸送
される脂質が重大な役割を果たしていることは多くの疫
学的および遺伝学的研究によって明らかにされてきた。
実際に、異常リポ蛋白血症がその主要な危険因子となっ
ていることが今日充分に証明されている。
アテローム性動脈硬化症の生物学的危険度の指標を探る
研究は、多くの研究の主題となってきた。
こうして、アポリポ蛋白の測定のために多くの免疫化学
的方法が応用された結果、それらアポリポ蛋白のうちの
特定のもの(主にアポA−1およびアポB)については
従来の脂質(コレステロールおよびトリグリセリド)の
アッセイによる分析力よりも優れた分析力が得られてい
る。
リポ蛋白粒子は、一般に、少なくとも一つの脂質関連ア
ポリポ蛋白を含んでいる。これら粒子のうちのあるもの
は、アテローム原粒子(a therogenpart
icles)と考えられており、特に、アポBを含むリ
ポ蛋白粒子ばそうである。その他の粒子(たとえばアポ
Aを含む粒子)は、非アテローム原性であり、さらに言
えば、保護的効果を有するものと考えられ得る。
リポ蛋白(a)(以下Lp (a)と表記する)は、複
数のアテローム原粒子のうちのひとつを構成する特殊な
リポ蛋白である。1963年にベルク〔Berg(Ac
ta path、 Microbiol、 5cand
、1963.59.368382) )によって発見さ
れて以来、その正確な組成をめぐって何年もの間議論が
あった。ある面で、それは、特にそのアポBの組成故に
LDL (低密度リポ蛋白)の1つのポリモルフイズム
であると考えられてきた。現在では、このリポ蛋白はも
っとよく解明されている。その蛋白コピュラ(prot
ain copula)は、一つ乃至二つの特異的糖蛋
白(アポ(a))に対して一つ若しくは複数のジスルフ
ィド架橋により結合されたアポBから構成されている。
また、この糖蛋白の一次構造が最近決定された。その脂
質組成は、LDLの組成に極めて近い。その遺伝学的、
代謝的、および病理学的特徴のかなりの部分が、より良
く知られるようになってきたが、しかし、その生体中に
おける役割および機能は未だに解明されていない。
リポ蛋白Lp (a)は、Lp (a)粒子(part
icle)を意味しており、それは、アポ蛋白B−10
0(ずなわらアポB−100)、アポ蛋白(a)(すな
わちアポ(a))、および疏水性脂質〔コレステロール
エステル(CE)およびグリセリド(G)]によって構
成された中心コアを含む。この中心コアの表面には、燐
脂質(PL)、遊離コレステロール(CL )および沈
降アポ蛋白が見られる。アポ蛋白B−100は、LDL
 (低密度リポ蛋白)およびLp (a)に共通のもの
である。
アポ(a)は、プラスミノゲンの構造に近い構造を有し
ている。
以下の記述中、Lp(a)  ・Bと記載した場合には
、これはアポ(a)およびアポBを含む粒子を意味する
ものとし、LpAI:BはアポAIおよびアポBを含む
粒子を意味し、LpCIII:BはアポC1l+および
アポBを含む粒子を指し、LpAIl:BはアポAIl
およびアポBを含む粒子を指し、また、LpE:Bばア
ポEおよびアポBを含む粒子を意味するものとする。
現在までに開発された免疫化学的分析法では、アポリポ
蛋白のアッセイ(測定)のみが可能であり、リポ蛋白粒
子のアッセイは決してできない。
そして、アポリポ蛋白のアッセイによっては、アポリポ
蛋白が関係している粒子のタイプを予言することはでき
ない。
従来の技術で提案された方法として、特に、免疫拡散法
、電気免疫拡散法、免疫ネフェロメトリRIAおよびE
LISAなどをあげることができる。
アポリポ蛋白A(たとえばアポAI若しくはアポAII
)に関しては、スクリップス・クリニック・アンド・リ
サーチ・ファウンデーション(SCRIPPS CLI
NICAND RESEARCII FOUNDATI
ON)によるPCT国際出願PCT WO−八−86(
15493が参照され得る。
リポ蛋白Lp (a)粒子に関しては、幾つかの研究お
よび分析法が提案されている。
従来の技術において提案されたLp(a)の分離に関す
る非免疫学的方法の中では、ポリアクリルアミドゲルを
用いて電気泳動法が最も良い結果を示している。もっと
も、この方法は感度が低く、高濃度のLp (a)の検
出を許容するのみである。
非同質的ポリクロナル抗体若しくはモノクロナル抗体の
使用を基礎に、リポ蛋白(a)の定量的および定性的分
析のために開発された免疫化学的諸方法では、プラスミ
ノゲンの他アポBとも交叉(cross)する免疫学的
反応を示すことが最近証明された。
免疫学的研究方法の中で、抗原と抗体がアガロスゲル中
に拡散して沈降曲線を描くごとを特徴とするオークタロ
ー −(Ouc)+terlony(PROG、ALL
ERGY、 1958.5.1) )の免疫拡散法は、
本質的には検出方法であり、その応用である免疫電気泳
動法や免疫エレクトロシネレーシス(immunoel
ectrosyneresis)  も同様である。
免疫学的分析方法のうち、マンシー二〔■^NCINI
(Immunochem、、1965.2,235 )
 Eによる放射状免疫拡散法、ローレル〔1,八LIR
ELL(Scand、J、Cl1n、Lab、 1nv
est、、1972,295.124))による電気免
疫拡散法免疫ネフェロメトリ(免疫比濁分析法)および
放射免疫学的手法では、それらの起源ゆえに非同質性(
heterogeneous )であるポリクロナル抗
体を使用し、また、上記したように、アポBとの交差反
応を除くために予備的吸着プロセスを導入する必要があ
る。
本出願人は、当初、免疫ラテックス法によってリポ蛋白
(a)を測定する方法を開発した。この方法は、免疫ネ
フェロメトリおよび電気免疫拡散法に伴う特定の欠点を
回避し、他方、方法実施のスピードアップを図り、さら
に高い感度と試薬に関してかなりの経済的効果を収める
ものであった。
しかしながら、この方法においてもまた、交差反応を示
す欠点を有していた。
抗Lp (a)抗体を用いる免疫酵素学的分析法も提案
されている。(DIIVICand Co11.J、L
IPID、l?BS、 、 1985.26.540参
照)これは、競合試験であり、抗原を固体の支持体上で
固定すること、および、この抗原と血清の抗原とをモノ
クロナルL HL Pl抗体に関して競合させることに
よって構成されている。この方法の重大な欠点は、抗原
として純粋なLp (a)を手に入れる必要があること
である。現在、このリポ蛋白は精製が困難であり、] 
] 構4 純粋な状態では一定の不安定性を有している。その結果
、このタイプの分析法は、断念されることになった。
発明の目的 したがって、本発明の「1的は、アポリポ蛋白B(アポ
B)と少なくとも一つの他のアポリポ蛋白とを含むリポ
蛋白粒子の免疫的分析法を提供することであって、その
方法は従来桿案された方法よりも実用性が高く、特に、
リポ蛋白粒子の定量を実現し、しかも、交差反応を示さ
ないことを特徴とする免疫測定法を提供することである
手段 上記目的を達成するための本発明の要旨とするところは
、生物学的流体において、アポリポ蛋白B(apoB)
および少なくとも一つの他のアポ蛋白を含むリポ蛋白粒
子の測定のための免疫学的測定方法であって、そのリポ
蛋白粒子は二つの相異なる抗体の存在下に置かれ、その
うちの第1の抗体は存在するかもしれないリポ蛋白粒子
を捕獲するものであってかつ全アポB以外の他のアポ蛋
白に対する抗体およびアポBのフラグメントもしくは決
定エピトープに対する抗体を含むグループから選択され
るものであり、第2の抗体は適当な方法でラベルされか
つ抗全アポB抗体を含むグループから選択されるもので
あり、前記リポ蛋白粒子の存在が適当な方法、特に、E
TA、RIA螢光光度法、耐集反応によって確認される
ものであることにある。
また、前記第1の抗体は、好適には、抗アポAI抗体、
抗アポAII抗体、抗アポCIII抗体、抗アポE抗体
および抗アポ(a)抗体を含むグループから選択される
ものである。
また、前記第1の抗体は、好適には、適当な固体支持体
、特に、マイクロタイトレーショップレート、ビーズ若
しくはその類似物上で固定化されるものである。
また、前記第1の抗体は、好適には、ポリクロナル抗体
である。
また、前記第1の抗体は、好適には、モノクロナル抗体
である。
また、前記第1の抗体は、好適には、オリゴクロナル抗
体である。
ここで、オリゴクロナル抗体とは、モノクロナル抗体の
混合体のことである。
また、前記第2の抗体は、好適には、抗アポBポリクロ
ナル抗体である。
また、前記第2の抗体は、好適には、抗アポBモノクロ
ナル抗体である。
また、前記第2の抗体は、好適には、抗アポBオリゴク
ロナル抗体である。
また、前記第2の抗体は、好適には、酵素、螢光物質、
放射性物質若しくは適当なラテックスビズを含むグルー
プから選択される適当なラベリング物を用いて適当な方
法によってラベルされている。
なお、リポ蛋白粒子の存在は、使用酵素の基質内での発
色反応の発生、蛍光度或いは放射能の測定、または擬集
反応の発生によって確認されるものである。
また、好適には、前記第1の抗体が抗アポ(a)抗体で
あり、且つ前記第2の抗体が抗アポB抗体である場合に
、検出される粒子はLp (a)  :Bである。
また、好適には、前記第1の抗体が抗アポAI抗体であ
り、且つ前記第2の抗体が抗アポB抗体である場合に、
検出される粒子がLpAI:Bである。
また、好適には、前記第1の抗体が抗アポAII抗体で
あり、且つ前記第2の抗体が抗アポB抗体である場合に
、検出される粒子がLpAII:Bである。
また、好適には、前記第1の抗体が抗アポCIII抗体
であり、且つ前記第2の抗体が抗アポB抗体である場合
に、検出される粒子がLpCIII:Bである。
また、好適には、前記第1の抗体が抗アポE抗体であり
、且つ前記第2の抗体が抗アポB抗体である場合に、検
出される抗体がLpE:Bである。
本発明の他の態様の要旨とするところは、アポ蛋白(a
)(すなわちアポ(a))に特異的であリ、且つそのア
ポ蛋白(a)に対して極めて大きな親和性を有するモノ
クロナル抗体であって、その解離定数に、が0.87 
X ] 0−” Mと0.32 Xl 0−10Mの中
間であるモノクロナル抗体によって構成されることにあ
る。
また、前記抗体は、好適には、人起源のLp(a)によ
って構成される抗原によって免疫されたマウス脾臓細胞
と、適当な骨髄肝細胞の融合によって得られるハイブリ
ドーマの適当なクローニングによって得られ、前記モノ
クロナル抗体は1g61タイプの免疫グロブリンである
本発明の他の態様の要旨とするところは、アテローム性
動脈硬化症の検出のために、前記免疫学的測定法を使用
することにある。
また、本発明の他の態様の要旨とするところは、前記免
疫学的測定方法を実行するため、若しくはアテローム性
動脈硬化症の検出のためのそれら免疫学的測定方法の使
用を実施するためのキラ1−若しくは用具一式若しくは
調整された集合物であって、(a)全アポB以外のアポ
リポ蛋白に対する抗体およびアポBのフラグメント若し
くは決定されたエピトープに対する抗体を含むグループ
から選択された第1の抗体の適当な分量と、(b)適当
なラベリング物でラベルされた第2の抗全アポB抗体の
適当な分量と、(C)標準血清と、(d)前記検出を実
行するだめの適当な干渉液の相当量と、(e)最終的に
リポ蛋白粒子の存在を確認する確認手段と、を含むこと
にある。
また、前記キットに含まれる第1の抗体は、好適には、
抗アポAI抗体、抗アポAII抗体、抗アポCIII抗
体、抗アポE抗体、抗アポ(a)抗体、抗アポBフラグ
メント抗体、抗アポBエピトープ抗体を含むグループか
ら選択されるものである。
また、前記キットに含まれる第1の抗体は、好適には、
適当な固体支持物、特に、マイクロタイトレーショップ
レート、ビーズ、若しくはそれらの類似物上で固定化さ
れる。
また、前記キットに含まれる第1の抗体は、好適には、
ポリクロナル抗体である。
また、前記キットに含まれる第1の抗体は、好適には、
モノクロナル抗体である。
また、前記キットに含まれる第1の抗体は、好適には、
オリゴクロナル抗体である。
また、前記キットに含まれる第1のモノクロナル抗体は
、好適には、アポ蛋白(a)(すなわちアポ(a))に
特異的であり、且つそのアポ蛋白(a)に対して極めて
大きな親和性を有するものであって、その解離定数KD
が0.87X10−’Mと0.32X 10−10Mの
中間であるモノクロナル抗体によって構成される抗Lp
(a)モノクロナル抗体から構成される。
また、前記キラ1〜に含まれる第1のモノクロナル抗体
は、好適には、人起源のLp (a)によって構成され
る抗原によって免疫されたマウス脾臓細胞と、適当な骨
髄腫細胞の融合によって得られるハイブリドーマの適当
なクローニングによって得られ、IgG1 タイプの免
疫グロブリンから構成される。
また、前記キットに含まれる第2の抗体は、好適には、
抗アポBポリクロナル抗体である。
また、前記キットに含まれる第2の抗体は、好適には、
抗アポBモノクロナル抗体である。
また、前記キットに含まれる第2の抗体は、好適には、
抗アポBオリゴクロナル抗体である。
また、前記キットに含まれる第2の抗体は、好適には、
適当な酵素系に結合されている。
また、好適には、前記キットに含まれる第2の抗体が適
当な酵素系に結合されているときに、そのキットがリポ
蛋白粒子の存在を確認する確認手段として、その酵素系
の適当な基質を適当量含んでいる。
また、好適には、前記キットに含まれる第2の抗体が適
当な螢光物質に結合されている。この場合には、リポ蛋
白粒子の存在は蛍光度の検出によって確認される。
また、好適には、前記キットに含まれる第2の抗体がラ
テックスビーズに結合されている。
実施例 例J:血液標本の調製 血液標本は、絶食健康桿供者から静脈穿刺によって得て
、真空下においてEDTAを含むチューブ中に集めた。
保存剤を添加(最終濃度はEDTAか0.27 mmo
l / I’、、εアミノカプロン酸が0.9mmo1
/jl!、0.6mmol/lのクロラムフェニコール
および0.3 mmol/ lのグルタチオン)し、遠
心分離によって細葉と細胞成分とに分離した後、血漿サ
ンプルを4°Cで保存した。この血漿サンプルは、48
時間以内に使用するか、もしくは−20°Cで冷(東さ
れなげればならない。
例2:Lp(a)粒子の分離および精製Lp(a)濃厚
(rich)分画を遠心分離により、固体臭化カリウム
で1.06−1.12kg/ffの間の密度に調整され
たLp (a)十血漿プールから分離した。この血漿を
。ついて、50Tiロータを有するヘンクマン(Bec
kman)  I−8−70超遠心分離機で、48時間
、100.000 Xg 、4°Cの条件で遠心分離し
た。
精製には、寸法が100X2.6のセファ1コース(S
epharose) CL 6 Bカラムを用いた。
分子量キットによるキャリブレーションの後、精製を行
った。
溶出停止溶液ば、トリス0.IM、  NaCl20.
15M、Na2EDTA1mM、ph8.2の組成のも
のを用いた。
超遠心分離によりLp(a)が濃縮された分画80mg
が、デポジットされた。
溶出は、4°Cにおいて8 ml/hの流速で24時間
以上行った。回収は5mlの分画毎に行った。
それを、0.22μmミリポアフィルタを用いて濾過し
た。第1図において、横軸は溶出体積(ml)であり、
縦軸は吸光度(280nm)である。3つのピークが得
られた。
ピーク1は、抗Lp(a)および抗アポB抗血清に対す
る沈降アーク(arcs)を示し、ピーク2は、抗アポ
B (LDL)抗血清のみに対するものであり、そして
、ピーク3は、抗アポAI(HDL)に対してのもので
ある。
ピーク1からは、11mgのLp(a):Bが得られた
。この精製Lp(a)  ・3粒子は、30%の蛋白質
と60%の脂質を含む。
例3:抗アポ(a)モノクロナル抗体の調製A、アポ(
a)の精製 例2で得られた濃厚Lp(a)の分画を以下のように処
理した。
Lp(a)を緩衝液中においてジスルフィド架橋のレベ
ルで開裂させた。この緩衝液としては、トリス1.0m
M、NaCLo、(15M、、Naz EDTA 1 
mM、 N a N30.02%緩衝液(p H7,6
)を用い、これに固体状のジチオスレイトール(DTT
)を最終濃度が10mMとなるように添加した。
こうして得られたン容液を、37°Cで3日間インキュ
へ−1〜し、さらに、DTTを加えない同し緩衝液に対
して4.°Cで−・夜透析した。
ン容液は、その後、セファロースヘパリンカラム(ファ
ーマシアpharmacia )上によるクロマ1ヘグ
ラフイにかけられた。2つのピークがン容量されて、そ
のうち第1のピークはアポ(a)に対応し、第2のピー
クはL D L類似の粒子である。
B、 抗1−p (a)モノクロナル抗体の産生1、免
疫化: バルブ(Balb)/CCママウス、100gのL p
(a)と300μiのフロイント完全アジュバントとの
混合物を腹腔注射することにより免疫化した。この注射
は、各マウスにつき21日後に繰り返したが、その後は
4力月の間フロイント不完全アジュバントその他のもの
によった。これらのマウスから、細胞バイブリプ−ジョ
ンに進む前に免疫学的反応を検証するために採血をした
2、モノクロナル抗体の採取: 融合: D−10の日に前もってインターペリトネアルブースタ
ー投与を受け、その後I)−3の日に最後の静脈内投与
を与えられたLp (a)反応性のマウスから採血した
。免疫血清を回収した。これは、スクリーニング中にポ
ジティブコントロールとして用いるために、部分標本と
されその後凍結されるであろう。また、マウスの脾臓を
摘出した。
この脾臓を、無菌的にぺI・り皿に採り上げ、細かくし
た。このようにして得た脾臓細胞を、コーラ−およびミ
ルシュタインによって記載された手順に従い、PEG−
DMSOにより、骨髄腫5P210細胞と融合させた。
脾臓細胞の骨髄腫細胞に対する割合は10である。
PEGを除いた後に、全ての細胞を再び選択1−IAT
培地に採り上げ、96ウエルの培養皿に蒔いた。HAT
培地の2滴で1ウエル当たり25000個の細胞の割合
であった。培養皿は、37°C湿潤雰囲気かつ5%の二
酸化炭素の存在下のオーブン中に置かれた。
細胞は選択HA T培地の存在下で培養され、次いで1
5日後今度はHT培地の存在下で培養し、さらに最終的
にはA培地の存在下で培養した。こうして、ハイプリン
ト化されなかった骨髄腫細胞は消失した。得られたウェ
ルを免疫酵素的スクリニング法によりテストした。
クローニング: 陽性のウェルが限界希釈によりクローニングされた。
こうして20の培養細胞が検出された。また、LDLの
みに向けられた免疫グロブリンを放出する3つのウェル
が認められた。
培養の放出性細胞を懸濁液中に置き、ついで、サンプリ
ングを行い、A培地を含む無菌のチゴーブ内で10分の
1に希釈した。また、100分の1の希釈サンプルで、
ソックス細胞により計数を行った。細胞の数は、A培地
1 ml当たり20個まで戻した。この細胞を、24時
間から48時間前に調整されたマウスの腹膜細胞(栄養
細胞nutrient cells)が含む96ウエル
の培養皿に再び蒔いた。その割合は1ウエル当たり50
μlの割合であり、そして理論上50μ!当たり一つの
細胞を含んでいる。抗Lp (a)陽性クローンは、2
回、さらに3回とクローンされる。陽性クローンは、そ
の後、大量に増殖させられ、液体窒素で保存されるか、
あるいは復水産生のために用いられる。
Lp (a)に向けられた抗体を産成する20の培養ウ
ェルに関し、4つの安定したクローンのみが得られ保存
された。これらは、クローンKO1゜KO6KO7およ
びKO9である。これらのクローンから、復水そして最
終的にはモノクロナル抗体の産成を行った。各抗体のク
ラスは、市販の特異的免疫血清を用いて免疫拡散法によ
って決定された。これら4つのクローンは、IgGを産
成し、それらは、プロティン−Aセファロースによるク
ロマトグラフィーにより容易に精製される。
復水の産成 2つの方法が用いられた: クローン由来のハイブリッド細胞を、0.5 mlのプ
リスタン(pris Lane)を10日前に受けたノ
くシブ/Cマウスに腹腔注射により与えた。マウス1匹
当たり約5.106個のハイプリ・ンド細胞が注射され
た。これらの細胞は、ウシ胎児血清を除去するためにダ
ルベツコ培地で前もって洗浄された。マウスは、拒絶の
危険を無くすため免疫的見地からプリスタン注射により
前もって抑制させられた。
ハイブリッド細胞によってマウスの復水が産成された。
この復水はモノクロナル抗体に冨む。
第2の方法は、大量生産により適合的である。
第1のステップにおいては、2〜3.106(11i1
の細胞を皮下注射することにより15日の間に腫脹(t
umar)を生じさせる。この腫脹は、極めて多量の細
胞増殖の場所である。サンプリングの後は、腫脹はグラ
インドされ、細胞はダルベツコ培地で洗浄されて、プリ
スタン処理されていないバルブ/Cマウスに腹腔内注射
された。一つの腫脹を用いて8〜lO匹のマウスの注射
が可能である。それと同時に別のマウスには、産成サイ
クルを維持するために皮下注射も行った。
上記2つの方法においては、復水を集め、300、 O
rpm  (10m1n )で遠心分離し、得られた上
澄み液のみを回収した。10−’MのPMSFを添加す
ることにより、プロテアーゼの作用を抑制することがで
きる。保存は、−20°Cで行った。Kol、KO6,
KO7,KO9の各クローンにつき、多量の復水が回収
された。
3、モノクロナル抗体の精製: 硫酸アンモニウムによる沈降(precipi Lat
ion)得られた復水は、50%(P/V)硫酸アンモ
ニウムン容液で(市を足(supplement)され
た。
連続して2回の沈降を行った。こうしてヘモグロビンの
他にアルブミンの一部も除去された。最後の沈降物が少
なくとも0.15 Mの塩化ナトリウム溶液の最小量中
に再び採り」二げられて、同じ溶液に対して一夜透析さ
れた。
アフィニティ力ラムによる精製 第2のステップは、A−セファロース蛋白質上でのクロ
マトグラフィーによるIgGの本来の精製である。再溶
解させられた蛋白質の最適量を0゜10M燐酸ナトリウ
ム(pH8)の緩衝液により平衡カラム上にデポジット
し、その後、室温において少なくとも30分間インキユ
ヘートする。ついでそのカラムをその平衡緩衝溶液で洗
浄し、さらに0.1 Mのクエン酸−クエン酸ナトリウ
ム緩衝ン容液(pH3)で?容出した。IgGの全ての
クラスが溶出された。?容量液は、直ちにIMの燐酸二
カリウムの溶液で中和した。そのカラムは、最初の緩衝
液で再平衡化された。IgC,分画は、0.1MPBS
溶液(pH7,2)に対して透析され、次いで一20°
Cで保存された。
得られたモノクロナル抗体について、ELISA法によ
り、アポ(a)、Lp (a)、LDLおよびHDLに
対してのラピ・ノド特異性試験を行った。これが、LP
 (a)粒子の免疫酵素的測定のために使用される。
以下に示す表1は、直接ELISAによる抗しp (a
)モノクロナル抗体の特異性コントロールを表す。
表1 例4:抗アポ(a)モノクロナル抗体の特徴:それらの
Lp(a):Bおよびプラスミノゲンに対する親和性 これらの抗体は、プラスミノゲンとの間で交差反応を示
す。
解離定数は、フリゲット(FRICUET)その他によ
って決定され、記載されている(J、 Immunol
、 Methods  1985.77、3(15−3
19)。0.1 mlの抗体(30ng/mlのKO7
もしくはに(19)が0.1 mflのI−p(a)+
Bもしくは様々の濃度のプラスミノゲンと共にインキュ
ベートされた。室温での15時間のインキュベーション
の後に、0.1 mlのその混合物を、精製Lp (a
):Bで前もってコーティングされている。マイクロタ
イトレーショップレートのウェルの中に移し、37°C
で2時間インキュベートシた。結合した抗体は、パーオ
キシダーゼでラベルされた抗マウスラビット免疫グロブ
リンによって検出される。解離定数KDは、スキャッチ
ャード式によって計算される。モノクロナル抗体KO7
およびKO9のLp(a):Bに対する親和性と、それ
らのプラスミノゲンに対する親和性との間には重大な差
異が観察された。その結果が以下の表2および第2図に
示されている。
表2 第2図は、修正スキャッチャード式によって計算された
解離定数を示している。曲線1は、Lp(a):Bと抗
アポ(a)モノクロナル抗体(K(17+KO9)混合
物との結合を表し、曲線2は、プラスミノゲンと抗アポ
(a)モノクロナル抗体混合物(KO7+KO9)との
結合を表す。■は、結合抗体分画に対応し、aは、遊離
抗原濃度に対応する。
これら抗アポ(a)モノクロナル抗体は、アポ(a)に
対してかなりの親和性を示す。
例5:抗アポBポリクロナル抗体の調製:この抗体は、
ラヒソト中から得られ、IgG分画は、硫酸すトリウム
による沈降およびそれに続くアフィニティクロマトグラ
フィによって精製された。
精製された抗アポBポリクロナル抗体を、パーオキシダ
ーゼと結合させて複合体とした。
例6:抗アポBモノクロナル抗体の調製アポBに対する
モノクロナル抗体を、5P210骨髄腫細胞と1. D
 Lで免疫化されたマウスより得られた脾臓細胞との融
合により得た。BO4BO5,BO6B(17  B1
8およびB19と名付Qノられた抗体は、アポBに対し
て特異的であるが、血漿のその他の蛋白質とは反応しな
い。
それらのエピト−プはアポ−B100のトロンビンTl
/T3のフラグメントに位置する。
抗アポBモノクロナル抗体の混合物をパーオキシダーゼ
と結合させて複合体とした。
例7:Lp(a):8粒子の選択的免疫酵素学的測定法
、第1の抗体は、KO7およびKO9のモノクロナル抗
アポ(a)抗体の混合物であり、第2の抗体は、抗アポ
Bモノクロナル抗体(BO4、BO5,BO6,BO7
,B18.B19)の混合物であり、パーオキシダーゼ
によってラベルされている。
本発明に従う免疫酵素学的測定法においては、ハイブリ
チック(Hybritech)の特許n °24879
83(1981年8月3日)に記載されているサンドイ
ンチ法を採用する。
キャリブレーション曲線 例2で得られたLp (a):8粒子に対応し、アポ(
a)およびアポB抗原(第3図)を表す一次標準(pr
imary 5tandard)は、50の市販の血漿
プールを標準化するために用いられる。標準グラフの直
線ゾーンは、0.06〜0.40μg / mflまで
である。第3図は、精製Lp (a):8粒子の標準化
曲線を示し、横軸は抗原の濃度(μg / d )(曲
線3についてはLp (a):Bの粒子であり、曲線4
についてはプラスミノゲンもしくはL D +−である
)であり、縦軸は、492nmでの吸光度である。ネガ
ティブサンプルの吸光度は0.(150に対応する。
本来的測定 ポリスチレン製マイクロクイトレージョンプレート(コ
スタ−(Cos tar) 3590 )を前日の夜、
室温において、O,1,MのP 13 S中での濃度が
20μg/雁である濃度例3に従う抗アポ(a)モノク
ロナル抗体の混合物0.1mj!(KO7およびKO9
モノクロナル抗体の混合物であり、モル比が1対1であ
る)を用いてコーティングした。
・標準血漿プールをLp (a):8粒子の濃度が0.
06〜0.40μg/mHの間に来るように希釈し、ま
た、分析される血漿のサンプルを200分の1,800
分の1および3200分の1になるように1%PBS−
BSAを用いて希釈した。
プレートをPBSで四回リンスし、その後ウェルの壁に
100μlのサンプルもしくは標準体を添加し、37°
Cで150m1nの間インキュベーションを継続させた
PBSでリンスした後、1%pBs=BsAで1000
分の1に希釈された0、 1 mflの複合体(1mg
 / mflでの抗アポ/パーオキシダーゼ)を添加し
、37°Cで120分インキュベートした。
ウェルを再びPBSでリンスし、その後パーオキシダー
ゼの基質の溶液(0−フェニレンジアミンが3 mg 
/ mlと0.1 Mクエン酸−燐酸緩衝液(pH5,
6)中で0.64u1./mlの濃縮H20□)を0、
1 ml添加したところ、30m1nの後に暗所におい
て発色反応が見られた。この反応をINH(1をOAm
l添加して中断させ、492nmでの吸光度を測定した
例8 :Lp (a):Bに関しての本発明の方法の特
異性 a)プラスミノゲンの干渉 抗体の特異性は、抗アポ(a)モノクロナル抗体KO7
およびKO9の混合体のLp (a)  :8粒子のア
ポ(a)に対する、およびそれのプラスミノゲンに対す
る親和性をそれぞれに測定することによって確認される
(例4)。
しかしながら、本方法の優れた特異性を表すために、プ
ラスミノゲンとの間で起こり得る干渉について研究する
ことが便利である。
本発明による分析方法の条件下での干渉を推定するため
に、精製Lp(a):Bと精製プラスミノケンの存在下
で競合阻止試験を実施した。この競合阻止試験は、一定
濃度のLp(a):Bと一連の相異なる濃度のプラスミ
ノケンとについて実施した。0.06mg/aのLP(
a)0.(15mNと0゜1から80mg/aの間の濃
度のプラスミノケン0゜(15mf!、を、前もって抗
アポ(a)抗体KO7およびKO9の混合物でコーティ
ングしておいたウェルに対し添加しインキュへ一トシた
そして、結合Lp(a):Bの量を前記したように決定
した(例7参照)。
第4図は、本発明によるLp(a):8粒子の測定法の
条件下での、プラスミノケンの干渉の可能性を表す。
その結果が、B(プラスミノケンの存在)/BO(プラ
スミノケンの不存在)によって表されている。
第4図は、横軸がプラスミノケンの濃度(mg/准)で
あり、縦軸が結合Lp (a):8粒子のパーセンテー
ジである。この図に示されるように、高濃度(40mg
/dll)のプラスミノケンは、Lp(a):Bの結合
の56%までを抑制し得る。しかしながら、その濃度が
1.25 mg/aでは、抑制は約18%である。この
レベルのプラスミノケンは、一般に、血漿の四十倍の希
釈に対応するものであって、相対的に一定レベルのプラ
スミノケン(47±7■/准)を含んでおり、また、実
際にはこの希釈率のみが極めて低レベルの血漿Lp(a
 )  : B (<0.1 mg/d1)の測定に用
いられるので、プラスミノケンの干渉は本発明の方法に
おいては回避されるように思われる。
さらに、例3で見たように、抗体KO7,KO9のLp
 (a):Bおよびプラスミノケンに対する親和性には
顕著な差異が見られる(第1図)。
b)抗アポ(a)抗体の特異性:相異なる血漿のLp 
(a):Bに関してKO7およびKO9モノクロナル抗
体によって認識されるエピトープのエクスプレッション
(発現)の研究による二次標$ (secondary
 5tandard)との比較およびその二次標準につ
いて エピト−プのエクスプレッションについて、アポ(a)
の不均質性の影響の可能性を小さくするために、KO7
およびKO9モノクロナル抗体の混合物が使用された。
これらエピトープの同時的エクスプレッションを、その
濃度が1〜40mg/准であるLp(a):Bを含む1
0の相異なる血漿について決定した。例4で述べた競合
阻止法は、モノクロナル抗体KO7およびKO9のエピ
ト−プのエクスプレッションの決定をも可能とする。
競合阻止曲線の傾斜は、相類似しており、B / B 
O(結合抗体/’ili離抗体)のロジットの関数とし
て表される。その値は、−1,8から−2,15の間で
あり、平均値は−2である。ある血漿プールのLp (
a):Bの典型的な傾斜は、−2,(15である(第5
図)。これらの結果は、エビ1〜−プKO7およびKO
9が相異なる固体のLp(a)について同しように発現
されることを示唆している。
第5図は、横軸にLp (a):Bの濃度(μg/雁)
をとり、縦軸にはB/BoOロジットをとっている。
個々のLp (a):Bの免疫反応性を決定するために
、Lp (a):Bを、1〜40 mg/clの間の濃
度のLp (a):Bを含む10の血漿について測定し
た。450nmでの吸光度のロシア)によッテ表された
ELISA曲線は、1.85〜2.30の間の傾斜(平
均値2.15 )を示す。二次標準の傾斜は、2.12
である。
試験の正確度を推定するために、相異なる量の精製Lp
 (a):B (5,20,50g)を相異なるレベル
のLp (a):B (1,10,30mg/d1.)
を含む3つの血漿に添加した。正確度は、85から10
0%であった。
C)本方法の反復性および再現性の研究本方法の正確度
は、また、同一のマイクロタイトレーショップレートを
用いて9の血漿を土間測定することによっても研究され
た。これは、イントラテスト(反復性)の変化率(CV
)(イントラテストの平均値−4,7%)を得るための
ものである。これらの血漿はまた、インターテスト変化
率(再現性)(インターテストCVの平均値−9゜6%
)を得るために、三日間連続して試験された。
血漿のLp(a):Bについて、これを−20°Cで保
存する効果を、相異なる日に同し9つの血漿を用いて測
定した。変化係数は、9.8%であった。
種々の変化係数は、このように低く、したがって本発明
による方法が正確でしかも有利なことを示している。
例9:抗アポCIIIおよび抗アポEポリクロナル抗体
の調製 個々のアポ蛋白に対する抗血清をラビットで産成した。
抗体の予備精製をNA2SO4沈降によって行い、その
後、CN13r−活性化セファロース4Bに結合された
対応の純粋抗原を用いるアフィニティクロマトグラフィ
により精製した。
例10:LpCIIl:Bの免疫酵素測定法96ウエル
のポリスチレンマイクロタイタプレー 1−を0.IM
燐酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて三回洗浄した後
に使用した。
LpCII[:Bを測定するために、プレートをアポC
Iに対する精製抗体でコーティングした。各ウェルを、
室温で一夜インキユーベーションすることにより、0.
1 mflの抗アポCIIIでコーティングした。
コーティングされたプレートを0.1 M P B S
で四回洗浄した後に、適当に希釈された血清0.1 m
p。
をマイクロタイタープレートに添加し、37°Cで2時
間インキュベートして反応を進行させた。プレートを再
び洗浄し、パーオキシダーゼによってラベルされたアポ
Bに対する抗体を1ウエル当たり0.1 mflの量で
全てのプレートに添加し、37゛Cで二時間インキユヘ
ートした。プレートは、洗浄し、アスピレ−1−して乾
燥させた。さらに、各ウェルに対して、新鮮な基質溶液
0.1 mflを添加し、暗所中室温で30m1nの間
酵素反応を進行させた。
そして、0.1 mlのIMHCfを添加することによ
ってこの反応を止め、492nmで吸光度を読んだ。
上記コーティングに使用された抗体の最適濃度は、抗ア
ポCIIIについては15μg / mlであった。
また、抗アポB複合体の最適希釈率は約4000分の1
であった。
本分析法の条件によれば、10ng/mR〜200n 
g / mRの間の濃度のLpCIII:Bを測定する
ことが可能である。
例11:Lpri:Bの免疫酵素的測定法プロトコルは
、例10において述べたと同一である。第1の抗体は、
抗アポE抗体である。
不法の条件によれば、濃度が20ng/ml〜500n
B/mρのLpE:8粒子の測定が可能である。
第6図は、LpCIII:8粒子の標準曲線(曲線1)
と、L p E : 8粒子の標準曲線(曲線2)を示
し、その横軸はアポBの濃度(ng/mりであり、縦軸
は492nmでの吸光度である。
【図面の簡単な説明】
第1図は、溶出体積と吸光度との関係から溶出されたリ
ポ蛋白粒子の種類を示すグラフである。第2図は、モノ
クロナル抗体とLp (a): Bおよびモノクロナル
抗体とプラスミノゲンとの間の解離定数をそれぞれ示す
グラフである。第3図は、精製Lp(a):8粒子の標
準化曲線を示すグラフである。 第4図は、本発明のLp (a): B測定方法におけ
るプラスミノゲンの干渉の可能性について示すグラフで
ある。第5図ば、Lp (a): Bの濃度とB/Bo
との間の関係を示すグラフである。第6図は、LpCI
B粒子とLpE:8粒子の標準曲線を示すグラフである
。 出願人 アンスティテユ・パスツール(ばか1名)イ成
1年5月25日

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)生物学的流体において、アポリポ蛋白B(apo
    B)および少なくとも一つの他のアポ蛋白を含むリポ蛋
    白粒子の測定のための免疫学的測定方法であって、その
    リポ蛋白粒子は二つの相異なる抗体の存在下に置かれ、
    そのうちの第1の抗体は存在するかもしれないリポ蛋白
    粒子を捕獲するものであってかつ全アポB以外の他のア
    ポ蛋白に対する抗体およびアポBのフラグメントもしく
    は決定エピトープに対する抗体を含むグループから選択
    されるものであり、第2の抗体は適当な方法でラベルさ
    れかつ抗全アポB抗体を含むグループから選択されるも
    のであり、前記リポ蛋白粒子の存在が適当な方法、特に
    、EIA、RIA、螢光光度法、凝集反応によって確認
    されるものであることを特徴とする免疫学的測定方法。
  2. (2)前記第1の抗体は、抗アポA I 抗体、抗アポA
    II抗体、抗アポCIII抗体、抗アポE抗体および抗アポ
    (a)抗体を含むグループから選択されるものである請
    求項1記載の免疫学的測定方法。
  3. (3)前記第1の抗体は、適当な固体支持体、特に、マ
    イクロタイトレーショップレート、ビーズ若しくはその
    類似物上で固定化される請求項1若しくは請求項2記載
    の免疫学的測定方法。
  4. (4)前記第1の抗体は、ポリクロナル抗体である請求
    項1乃至3のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
  5. (5)前記第1の抗体は、モノクロナル抗体である請求
    項1乃至3のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
  6. (6)前記第1の抗体は、オリゴクロナル抗体である請
    求項1乃至3のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
  7. (7)前記第2の抗体は、抗アポBポリクロナル抗体で
    ある請求項1乃至6のいずれかに記載の免疫学的測定方
    法。
  8. (8)前記第2の抗体は、抗アポBモノクロナル抗体で
    ある請求項1乃至6のいずれかに記載の免疫学的測定方
    法。
  9. (9)前記第2の抗体は、抗アポBオリゴクロナル抗体
    である請求項1乃至6のいずれかに記載の免疫学的測定
    方法。
  10. (10)前記第2の抗体は、酵素、螢光物質、放射性物
    質若しくは適当なラテックスビーズを含むグループから
    選択される適当なラベリング物を用いて適当な方法によ
    ってラベルされている請求項1乃至9のいずれかに記載
    の免疫学的測定方法。
  11. (11)前記第1の抗体が抗アポ(a)抗体であり、且
    つ前記第2の抗体が抗アポB抗体である場合に、検出さ
    れる粒子はLp(a):Bである請求項1乃至10のい
    ずかに記載の免疫学的測定方法。
  12. (12)前記第1の抗体が抗アポA I 抗体であり、且
    つ前記第2の抗体が抗アポB抗体である場合に、検出さ
    れる粒子がLpA I :Bである請求項1乃至10のい
    ずれかに記載の免疫学的測定方法。
  13. (13)前記第1の抗体が抗アポAII抗体であり、且つ
    前記第2の抗体が抗アポB抗体である場合に、検出され
    る粒子がLpAII:Bである請求項1乃至10のいずれ
    かに記載の免疫学的測定方法。
  14. (14)前記第1の抗体が抗アポCIII抗体であり、且
    つ前記第2の抗体が抗アポB抗体である場合に、検出さ
    れる粒子がLpCIII:Bである請求項1乃至10のい
    ずれかに記載の免疫学的測定方法。
  15. (15)前記第1の抗体が抗アポE抗体であり、且つ前
    記第2の抗体が抗アポB抗体である場合に、検出される
    抗体がLpE:Bである請求項1乃至10のいずれかに
    記載の免疫学的測定方法。
  16. (16)アポ蛋白(a)(すなわちアポ(a))に特異
    的であり、且つそのアポ蛋白(a)に対して極めて大き
    な親和性を有するモノクロナル抗体であって、その解離
    定数K_Dが0.87×10^−^1^1Mと0.32
    ×10^−^1^0Mの中間であるモノクロナル抗体に
    よって構成される抗Lp(a)モノクロナル抗体。
  17. (17)人起源のLp(a)によって構成される抗原に
    よって免疫されたマウス脾臓細胞と、適当な骨髄腫細胞
    の融合によって得られるハイブリドーマの適当なクロー
    ニングによって得られ、前記モノクロナル抗体はIgG
    _1タイプの免疫グロブリンである、請求項8記載の抗
    体。
  18. (18)アテローム性動脈硬化症の検出のために、請求
    の範囲1から15のいずれかに従う免疫学的測定法の使
    用。
  19. (19)請求項1乃至15のいずれかに記載のリポ蛋白
    粒子の免疫学的測定方法を実行するため、若しくは請求
    項18記載のアテローム性動脈硬化症の検出のための免
    疫学的測定方法の使用を実施するためのキット若しくは
    用具一式若しくは調整された集合物であって、全アポB
    以外のアポリポ蛋白に対する抗体およびアポBのフラグ
    メント若しくは決定されたエピトープに対する抗体を含
    むグループから選択された第1の抗体の適当な分量と;
    適当なラベリング物でラベルされた第2の抗全アポB抗
    体の適当な分量; 標準血清; 前記検出を実行するための適当な干渉液の相当量;およ
    び最終的にリポ蛋白粒子の存在を確認する確認手段とを
    含むことを特徴とするキット若しくは用具一式若しくは
    調整された集合物。
  20. (20)前記第1の抗体が抗アポA I 抗体、抗アポA
    II抗体、抗アポCIII抗体、抗アポE抗体、抗アポ(a
    )抗体、抗アポBフラグメント抗体、抗アポBエピトー
    プ抗体を含むグループから選択される請求項19記載の
    キット。
  21. (21)前記第1の抗体は、適当な固体支持物、特に、
    マイクロタイトレーショップレート、ビーズ、若しくは
    それらの類似物上で固定化される請求項19若しくは2
    0のいずれかに記載のキット。
  22. (22)前記第1の抗体は、ポリクロナル抗体である請
    求項19乃至21のいずれかに記載のキット。
  23. (23)前記第1の抗体は、モノクロナル抗体である請
    求項19乃至21のいずれかに記載のキット。
  24. (24)前記第1の抗体は、オリゴクロナル抗体である
    請求項19乃至21のいずれかに記載のキット。
  25. (25)前記第1のモノクロナル抗体は、請求項16乃
    至請求項17に記載の抗体である請求項23乃至24に
    記載のキット。
  26. (26)前記第2の抗体は、抗アポBポリクロナル抗体
    である請求項19乃至25のいずれかに記載のキット。
  27. (27)前記第2の抗体は、抗アポBモノクロナル抗体
    である請求項19乃至25のいずれかに記載のキット。
  28. (28)前記第2の抗体は、抗アポBオリゴクロナル抗
    体である請求項19乃至25のいずれかに記載のキット
  29. (29)前記第2の抗体は、適当な酵素系に結合されて
    いる請求項19乃至28のいずれかに記載のキット。
  30. (30)前記第2の抗体が適当な酵素系に結合されてい
    るときに、本キットがリポ蛋白粒子の存在を確認する確
    認手段として、その酵素系の適当な基質を適当量含んで
    いる請求項29記載のキット。
  31. (31)前記第2の抗体が適当な螢光物質に結合されて
    いる請求項19乃至28のいずれかに記載のキット。
  32. (32)前記第2の抗体がラテックスビーズに結合され
    ている請求項19乃至28のいずれかに記載のキット。
JP1011746A 1988-01-19 1989-01-19 リポ蛋白粒子の免疫学的測定方法,抗Lp(a)モノクロナル抗体,およびそれらのアテローム性動脈硬化症の診断における使用 Pending JPH026755A (ja)

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