JPS62245964A - 免疫化学的アツセイによるＣ３ａ測定用の試薬及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は哺乳類の補体系（Ｃ）の活性化に際し放出され
る物質Ｃ３ａの測定に関し、特にヒトＣ３及びヒトＣ３
ａ　ｋ：ｒｉする。

補体系は、例えば侵入する微生物を最終的に破壊しうる
ように明確に定義された反応列（−補体活性化）で反応
する約２０の成分からなる。補体系は細菌やウィルスに
より生ずる感染に対する＋Ｄｉ乳類の防御の基本的要素
と考えられている。最初に発見された成分は「補体因子
」とＱ半ばれ、Ｃ１゜Ｃ、・・・Ｃ９と命名された。

例えば免疫複合体、凝集免疫グロブリン、プロティンＡ
、細菌の多糖類等多くの物質により活性化が起りえ、活
性化はある種の自己免疫疾患や炎症の過程に特に関係し
うる。活性化が起ったことを示すマーカーとして、活性
化に際し放出されるフラグメントを使用することは既に
示唆されていた。こうして、Ｃ３ａ　、Ｃ４ａ及びＣ５
ａを測定するための多くの免疫化学的方法が開発された
（３，４．１６）。

Ｃ３ａ　、Ｃ４ａ及びＣ５ａには共に１つの共通の名称
「アナフィラトキシン」が与えられている。

それらの循環する形態は末端のアルギニル残基が消失す
ることによって急速に不活化され、その後は各々Ｃ３ａ
ｉ、　Ｃ４ａｉ及びＣ３ａｉと呼ばれる。それらの免疫
化学的アッセイでは、（ｉ　）アッセイすべきアナフィ
ラトキシン、（ｉｉ）対応する脱Ａｒｇ形、及び（ｉｉ
ｉ）前記アナフィシトキシン上にあるのと同じ決定基で
あって使用する抗体製剤が対抗している決定基を有する
他のアナフィラトキシンフラグメントと特異的に反応す
る抗体製剤が使用される。従って、測定されるものはあ
る型の決定基を有する成分の総体である。

本明細書におけるｒＣ３ａの免疫化学的アッセイＪとい
う用語は、Ｃ３ａ　、Ｃ３ａｉ及び本発明の杭−Ｃ３ａ
抗体製剤が対抗する抗原決定基を含有するＣ３ａのフラ
グメントをアッセイすることを意味している。

補体因子又はそのフラグメントを定量的又は定性的にア
ッセイするための免疫化学的方法では常にアッセイする
分子種に対して対抗する抗体製剤を使用する。この製剤
をアッセイする因子を含有するサンプルと反応させると
、形成された免疫複合体が因子の存在を示す指標、又は
その量の尺度となる。アッセイする種が７ラグメント（
例えばＣ３ａ　）であるときには、対応する元の補体因
子（Ｃ３）は妨害となるまでにそのフラグメントと交差
反応しないことが肝要である。これまで」−分なＣ３ａ
特異性を有する抗体製剤を製造することはできなかった
。このために、従来技術の方法は第１段階どして常に分
離を含んでいた。商業的に入手できるＣ３ａのテストは
全て、このフラグメントが変性に対し非常に安定である
という事実を利用している。そのために強力な酸性ｖｉ
、賀中ではＣ３が沈澱し、したがってＣ３ａを免疫化学
的に定最する前に０３の沈澱をＣ３ａから分離すること
ができる。

Ｃ３はα鎖及びβ鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖か
らなる。これらはジスルフィド結合で互いに結合してい
る。補体が活性化されると、Ｃ３はフラグメントＣ３ａ
　　（分子量９０００ダルトン、Ｃ３の約５％）とＣ３
ｂとに開裂する。Ｃ３ａフラグメントは以後の活性化反
応列には関与しないと信じられている。Ｃ５をＣ５ｂに
変換すると共にＣ５ａを放出させるにはＣ３ｂが必要な
ので持続的に活性化するにはＣ３ｂが必要である。生理
的条件下でＣ３ｂがさらに分解される間にフラグメン１
へＣ３ｂ１．Ｃ３ｄ、ｇ及びＣ３ｃ等が形成される。Ｃ
３ａ及びＣ３ｄ、ａはα鎖の一部分からなる。

Ｃ３ｃとＣ３ｂはα及びβ鎖の両名の一部分を含む。天
然の０３分子内でのフラグメントの位置は次の図式で示
されるニ ド　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
」３ｂ 鎖間及び鎖内にさらにいくつかのＳ−Ｓブリッジがある
。Ｃ３ｂ−＞Ｃ３ｂ１＋Ｃ３ｆ　；Ｃ３ｂ１−＞Ｃ３Ｃ
＋Ｃ３ｄ、ｌＪ。

Ｃ３ｂは例えば免疫複合体や細胞壁のような多くの物質
と共有結合しうる。フラグメンテーションが発生したと
き又はフラグメントが基質と結合したときに、いくつか
の抗原決定基が消失し、形成されたフラグメント内に新
しい抗原決定基が現われ、いわゆる新生抗原（ｒｌｅｏ
ａｎｔｉｇ４ｎｓ）が生成する。

既に発表された多数の論文中で、本発明者らは、赤血球
との結合により現われた決定基は変性Ｃ３中でも見られ
ることを示した（　９．　ＩＬ　１２．１３）。これら
の発見に基き、本発明者らはＣ３の抗原決定基を、（ａ
）天然の０３及び変性したＣ３の両方に存在する安定な
決定基Ｃ３（Ｓ）　、　（ｂ）変性により生成する決定
基ｃ３（Ｄ）、及び（Ｃ）変性によりＣ３（Ｄ）に変る
天然の決定ＩＣ３（Ｎ＞に分類した。Ｃ３（Ｄ）決定基
を発生しやすい変性媒体の例には、ＳＤＳ（ドデシル硫
酸ナトリウム−ラウリル硫酸ナトリウム）、塩酸グアニ
ジン、酸性及びアルカリ性溶液（ＤＨ＞１０．　ｐＨ＜
２．８　）およびデオキシコール酸塩がある。現在まで
に発表された結果は、Ｃ３（Ｄ）決定基が変性されたＣ
３のＣ３ｂ領域内にのみ存在することを示している。

本発明は、Ｃ３の変性により、Ｃ３のＣ３ａ領域に新規
で独特なＣ３（Ｄ）型の決定基が出現するという発見に
基いている。これらの決定基はＣ３からのＣ３ａの形成
により発生したとぎに、Ｃ３ａの循環形の内でも検出さ
れるはずである。従って、本発明の基橢は新しく発見さ
れた新生抗原である。

本発明の目的の１つは新生抗原に対する抗−Ｃ３ａ抗体
製剤を提供することである。本発明の第二の目的はＣ３
ａの免疫化学的アッセイの改良された〈従来の方法より
、より速く、より正確で、より特異的な）方法を提供す
ることである。第三の目的は、天然の０３の存在下でＣ
３ａとその対応の抗体製剤との間の免疫化学的反応を実
施しうるＣ３ａアツセイを提供することである。

本発明の抗体製剤はＣ３ａと変性Ｃ３とに共通であるが
天然の０３では近づきにくい少なくとも１つの決定基に
対するものである。従って、本発明製剤に対するＣ３ａ
とＣ３の交差反応性によって、Ｃ３含有サンプル中の臨
床的に有意義なレベルの０３ａを実証するのにこの製剤
を利用しうろことになる。本発明の製剤はＣ３ａとの反
応において天然の０３により実質的に阻害されない。こ
のため本発明の製剤は、例えば臨床的にａ連する測定域
が１１！当り４０〜１０ＧＯｎ（ｌと考えられる血漿サ
ンプル中で、天然Ｃ３が正に存在する中での免疫化学的
なＣ３ａの測定に使用できる。

本発明の他の特徴は水明［ｌ書の一部である特許請求の
範囲に示しである。

本発明の抗体製剤は上記のような特異性を有しており、
モノクローナル抗体の形又は抗血清（ポリクローナル）
の形でもよい。

本発明の製剤中に含有される抗体はフラグメント及び／
又は誘導体にすることができるが、重要を有しているこ
とである。製剤は、予期する任意の特定な用途に必要と
されるような化学物質を種々に添加した溶液の形であっ
てよい。ここで問題なのは、この溶液はＣ３ａと０３が
交差反応するであろう妨害する量の抗−Ｃ３ａ抗体を含
有すべきではないということである。製剤の抗−０３ａ
抗体活性成分は分析的に検出しつる基を具備していても
、あるいはテスト媒質に不溶性の相、すなわち、いわゆ
る「固」相と結合していてもよい。

本発明の抗体製剤を製造するためには、本発明に従って
規定した特異性を有する抗体を潜在的に産生しうる細胞
にこのような抗体を分泌させ、次にこれを単離（及び適
宜さらに精製）して上記の特異性の要件を満さない抗−
Ｃ３ａ抗体を除去する。この過程には体液性免疫応答を
生起することが含まれており、この場合＼抗体は天然Ｃ
３の０３ａ領域内で近づきにくいＣａａ内抗原決定基、
特にいわゆるＣ３　（Ｄ）抗原に対する特異性によって
選択する。製造には２つの主要な経路−ポリクローナル
法とモノクローナル法がある。

を椎動物（例えばマウス又はラットのような補乳類）で
は、適当な免疫原による免疫感作の結果としてｉｎ　ｖ
ｉｖｏで分泌が起りうる。このようにして得た免疫応答
により、免疫原の他の決定基に対する抗体との混合物と
して所望の抗体く１種以上）を含有するポリクローナル
抗体製剤が得られる。

これらの弛の決定基に対する抗体を除去するためには、
例えば固相に結合した形態の天然の又は変性したＣ３又
はＣＧａ上で実施する、いわゆるイムノソルベント精！
Ｉｌ法（ＴＳ精製法）が必要となろう。使用するイムノ
ソルベントに応じて、当該抗体は溶出液中又は吸着剤上
で得られる。本明細書中で予期する抗体の場合、Ｉｓ精
製での収率は低く、労力を要する手順を含んでいる。

本発明の良好な抗体製剤を得るための最良の方法はいわ
ゆるモノクローナル法（例えばｒｅｆ−６参照）であり
、その方法によると免疫感作後に、抗体を産生する血漿
ａｍをミエローマｌ１ｌｔｌと融合させて、急速かつ無
限に（中断することなく）増殖できる細胞とする。本発
明の抗−Ｃ３ａ抗体を産生ずるハイブリッド細胞をクロ
ーニングし、かつ培養することにより、Ｃａａ上で原則
として所望の型の決定基とのみ反応するモノクローナル
抗−Ｃ３ａ抗体製剤が得られる。本発明の抗体製剤を産
生ずるために選択した細胞クローンはｉｎ　ｖｉｔｒ。

の細胞培養で又は腹水腫瘍として培養しうる。精製及び
単離は、塩析又は例えばイオン交換、アフィニテイー、
ゲル等のクロマトグラフィーのような種々のクロマトグ
ラフィー法により、一般の任意の抗体の精製及び単離と
同じ方法で実施しうる。

免疫感作に使用する免疫原は所要の決定基、好ましくは
変性Ｃ３のＣ３ａ領域にのみ存在するＣ３　（Ｄ）決定
基を有していなければならない。

変性は１０’Ｍを越えるＳＯ３濃度の水溶液中（ｐＨ約
７、ｖｌ＞で行なうと好ましいが、同じタイプの限定的
なＣ３ａ−決定基を創生ずる他の薬品でも実施しうる。

ここで重要なことは、Ｃ３ａ中に存在するが天然の０３
中では近づきにくい（反応に利用しにくい）少なくとも
１つの抗原決定基を露出させるようなやり方で変性を実
施することであり、特定の変性剤ではない。これらの抗
原決定基の存在が明らかになった場合、特にこれをモノ
クローナル法と合せて使用すれば原則的にＣ３ａを免疫
原として使用することも可能になる。

上記の「変性」という語はもちろん決定基の免疫応答を
産み出ず能力を破壊するような非可逆的変化を含むもの
ではない（加水分解はこのような効果を示すかもしれな
い）。

本発明の免疫化学的方法によれば、Ｃ３ａを免疫化学的
にアッセイするために本発明の抗体製剤を使用する。こ
の目的のために利用でき、本発明を適用しつる一般的で
それ自身公知の免疫化学的テスト法は沢山ある。これら
の方法はＣ３ａの場合、Ｃ３ａ含有サンプルと抗−０３
ａ抗体活性成分とを反応させて免疫複合体を形成するこ
とからだ定量を容易にするために、上記の免疫複合体の
成分と生体特異的に親和反応しうる他の免疫反応体又は
他の反応体を加えることができる。通常使用する手段は
マーカー基、いわゆる［分析的に検出しうる」基をもつ
反応体を添加することである。

複合体中に取り込まれた又は取り込まれずに残っている
標識反応体の量がサンプル中のＣ３ａの存在の尺度とな
るように反応体の割合を選択する。

１つの分類系によれば、方法は均−法又は不均一法のい
ずれかに分類されうる。均−法では複合体に取り込まれ
た標識反応体を取り込まれていない反応体から物理的に
分離することなく標識反応体をアツイする。不均一法を
使用するときには、応体を互いに物理的に分離する。分
離を容易にするためには反応体の１つがテスト媒質に不
溶であると有用である。

第二の分類系によれば、方法は競合法又は非競合法のい
ずれかに分類されうる。競合法では、共通のエピトープ
（決定基）を有する２つの免疫反応体を、免疫学上の相
手の上にある不十分な数の対応結合部位に対して競合さ
せる。Ｃ３ａの測定に応用するには、サンプルの０３ａ
を本発明の抗−０３ａ抗体に対して標識Ｃ３ａ又はその
同相結合形態と競合させる。このようにして抗体と反応
する量がサンプル中のＣ３ａ含最の尺度である。

非競合法では、競合が起り得ないように反応体を選択す
る。

第三の分類系によれば、方法は沈澱法又は非沈澱法のい
ずれかに分類しうる。本発明方法に沈澱法を適用するに
は、抗−Ｃ３ａ抗体製剤は、サンプルのＣ３ａとの反応
により沈澱が生ずるように、又は得られた免疫複合体が
殆仲ボリエヂレングリコール、抗−抗血清又は囚相結合
抗−抗体等のような沈澱剤を過剰に添加することにより
沈澱するように選択する。標識反応体を使用する場合に
は、選択した抗−抗血清又は固相結合抗−抗体は標識反
応体に対するものではないものであろうことは言うまで
もない。

第四の分類系によれば、方法は使用するマーカー基に従
って分類され、従って、方法は放射性−１酵素、蛍光、
化学ルミネセンス、酵素−基質、免疫化学的方法等であ
る。

免疫化学的方法の中では、免疫電気泳動１粒子凝集、免
疫拡散及び標識抗体による顕微鏡も挙げることができる
。

抗原内の非反復決定基に対するモノクローナル抗体はあ
る種のタイプの沈澱法には使用できない。

本発明方法はＣ３ａを含有する種々の体液及び組織中で
のＣ３ａアツセイに通用しうる。これまでに、Ｃ３ａは
血液、血漿、血清、尿、滑液、脳を髄液等の中に存在す
ることが知られている。

免疫化学反応を実施するのに使用する条件は、この型の
アッセイ法で普通使用するようなものである。例えば、
温度は０〜４０℃、特に１５〜４０℃の範囲内で選択し
うる。好適な１ｕ１１は４．５〜９、好ましくは約５〜
８．６の範囲である。Ｉ）Ｈ値が高すぎる（　＞　１（
４）又は低すぎる（〈３）と０３が変性する（従って０
３　（Ｄ）決定基が形成される）ので、これらの１）＋
１は避けるべきである。全く一般的なことであるが、Ｃ
３ａのアッセイを０３の存在下に実施するときには補体
系の活性化又は変性を避けるように測定やステップを実
施すべきことは勿論である。補体を活性化すると追加の
０３ａが形成されるが、これにはプロテアーゼ並びに二
価のカルシウム及び／又はマグネシウムイオンの存在が
必要である。従って、プロテア−げ阻害剤を添加するこ
と及び／又は上記のイオンと複合体を形成するＥＤＴＡ
のような薬剤を添加することが好適である。洗剤及びバ
ッファ系を添加するときにはＣ３を変性させないような
種類のものでなければならない。

以下に、本明細四の一部をなすが、本発明の範囲を何ら
限定することを意図するものではないいくつかの実施例
により本発明を説明しよう。

材料及び方法 Ｃ３の調製： 既に記載されている（１（４）ようにして天然Ｃ３（Ｃ
３（ＳＮ））をＭ製した。１００Ｉｄの２Ｘ　１Ｏ−３
ＨＳＤＳ中、３７℃で３０分間、１００ｕｉの０３　（
Ｃ３（ＳＤ））を変性させた。Ｎｉ１ｓｓｏｎ他（１１
）におけると同様にして、変性−還元Ｃ３並びに単離し
たＣ３α鎖及びＣ３β鎖（Ｃ３（Ｄ））を調製した。エ
ラスターゼで生ぜしめたＣ３ａ　、Ｃ３Ｃ及びＣ３ｄは
５ｃｒｉｐｐｓ　Ｃｌ１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｆｏｕｎｄａ−ｔｉｏｎ、　　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ
、　　ＵＳＡの口ｒ　Ｂｒ１ａｎ　Ｔａｃｋ　（１５）
から親切にも寄贈されたものである。Ｃ３ｂは１％（ｗ
／Ｖ）のトリプシン（ＴＰＣに処理、ｗｏｒｔｈ；ｎｇ
ｔｏｎ。

ＵＳＡ　）の存在下で室温、２分間で１１製した（１（
４）。

３７℃でＨ因子５埒と■因子１埒と共にＣ３ｂを６０分
間インキュベートすることによりＣ３ｂｉを得た。

既に記述のようにして、ラクトペルオキシダーゼ法を使
って比活性が３００００　ｃｐＩＩｌ／４蛋白質となる
まで天然Ｃ３を　　Ｉで放射標識した（９）。

Ｋ生立１１ 抗体を生じさせ、５ＤＳ−変性Ｃ３に対する特異性につ
いて選択した。フロイントの完全アジュバント（Ｆ　Ｃ
Ａ　、　Ｂｅｈｒｉｎａｗｅｒｋｃ　ＡＧ、西独）中ノ
ヒト５ＤＳ−変性Ｃ３２１１４ＦとＬｉｐｏｐｏｌｙｓ
ａｃｃｈａｒｉｄｅＨ（ＬＰＳ、　Ｄｉｒｃｏ、　ｃａ
ｔ　ｎｏ　３１２０−２５　）　２０Ｂとを皮下注射す
ることにより、８〜１２遍令の雌のＢａ　ｌ　ｂ／ｃマ
ウス２匹を免疫感作した。８週間後、融合の４日前に、
リン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７，４）中の５ＤＳ−変性Ｃ
３１００埒を腹腔内投与（ｉ、ｐ、）した。次のように
若干の改変を行った標準手順（２，５）に従ってハイブ
リドーマを製造した。４つの異なるＳｐ　２１０セルラ
インを使用した。５％の牛胎児血清（ｒｃｓ、　０ｉｂ
ｃｏ、　ｃａｔ　ｎｏ　０１１−６２９（４）及び２Ｊ
４Ｆ／ｍｉ！のゲンタマイシン（ｃａｔ　ｎｏ　Ｇ−７
５０７，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ　Ｃｏ。

１１ＳＡ）を含有した標準のＤｕ！ｂｃｃｃｏ改変Ｅａ
ｇｌｅ培地（ＯＭＥＮ、　Ｐａ１ｓｌｅｙ、　５ｃｏｔ
ｌａｎｄ、　ｃａｔ　ｎｏ　０４１ｉ９６６）中で増殖
しているオリジナルのＳＯＳ１０．　八ｇ　ｔ４（１４
）が前駆細胞であった。血清を含まない培地で増殖させ
るために選択した２つの異なるサブクローンと低い血清
濃度の培地Ｈｙ−０，１で増殖するサブクローンも使用
した。選択及びクローニングには１０％ＦＣ３を含有す
る標準ＤＭＥＭ又はＩ−ＩＹ−０，１培地を使用した。

直接結合ＥＬＩＳ＾で５Ｏ８−変性Ｃ３と結合するクロ
ーンを選別した。１４個のクローンを無作為に選択し、
更にテストした。

ＴＣフラスコ内での供給バッチ型（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ
ｔｙｐｅ　）培養により、確立したハイブリドーマライ
ンを２００戒容まで膨張さ１．！た。以前の記述（１）
のようにし、カヂオン交換クロマトグラフィーを使用し
てモノクローナル抗体を精製した。

マイクロタイタープレートウェルに吸着さぜた一定里の
Ｃ３又はＣ３フラグメントに、段階的に希釈した抗−Ｃ
３抗体を結合さゼた。その役、ホースラディツシュのペ
ルオキシダーゼ＜　１−Ｉ　ＲＰ　）と抱合した抗ウサ
ギ又は抗マウスイムノグロブリン（ＤＡＫＯＩｍｍｕｎ
ｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　Ａ／Ｓ、　Ｄｅｎｍａｒｋ　）
で、結合した抗体を定量した。作用溶液として、０．１
％ＴＷＥＥＮ　２０　（ｖ／ｖ）及び０．１％（ｗ／ｖ
）牛血清アルブミン（ＢＳＡ＞を含有するリンＭ塩緩衝
食塩水（ＰＢＳ）を使用した。

７、　　ＰＢＳ中のＣ３，Ｃ３α及びβ鎖、５ＯＳ−変
性Ｃ３，Ｃ３ｃ及びＣ３ｄの各々を２００パ（Ｃ３２０
ｒｖｏｌ／ｌ！に相当）、４℃１晩で、マイクロタイタ
ープレート（Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ　ＩＩ　Ｆ　。

Ｄｕｎｅ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）の異なるウェルのプラス
チック表面に吸着さした。

２、　ステップ１のウェルと共に、段階的に希釈した抗
体製剤１００成を室１（ＲＴ）で６０分間インキュベー
トした。

３、　１−Ｉ　ＲＰと抱合したブタ抗−イムノグロプリ
ン１００成を、ステップ２からの表面結合波−０３抗体
とＲＴで６０分間結合させた。

４、＠色試薬（１，２−フエニレンジアミンニ塩酸塩（
Ｆｌｕｋａ　ＡＧ、スイス）　２０ＩＩＩ）　　１ｏｏ
ｎ及び７５ｍの０．１Ｍクエン酸塩／リン酸塩バッファ
（＋）ＩＩ　５．（４）中の３０％　８２０．、１０Ｍ
を添加することにより酵素反応を開始した。約１０分後
１ＨＨ２ＳＯ４１００成により反応を停止した。４９２
　ｎｍの分光々昨！＋Ｔ−缶に中閘　１．た ステップ１〜３の次に、０．１％のＴ）ＩＥＥＮ　２０
を含有する生理食塩水で３回ウェルを充分にすすいだ。

１１ヱエヱヱニ このアッセイは直接結合アッセイの変法であった。一定
量の抗体に対する結合について、段階的に希釈したサン
プル１００成を吸着抗原と競合させた。直接結合アッセ
イに記載したようにＲＴで６０分間予め吸着させた天然
Ｃ３と結合させたときにＯＤ　　−１となるように抗体
の用量を選択した。

これらの初期ステップの後に、直接結合アッセイのステ
ップ３〜４を行って阻害アッセイを完了させた。

７、　マイクロタイタープレートの各ウェル内に吸着さ
せるために２００ｐｉのＣ３ａ　４０ｐｏ／　ｍｌをブ
レインキュベートし、その侵ウェルを空にしてすすいだ
。

？、　リーンプ／Ｌ／（ＥＤＴＡ−血ａ　１／２０又ｉ
；を標準曲線用）Ｃ３ａの段階的希釈＞　５ｏ１１１＋
モノクローナル抗−０３ａ　　１００屑を（ブレインキ
ュベートし）、ステップ１のウェルに加えた。

標準曲線はＣ３ａ　５０ｐｏ／　ｒｄのストック溶液の
段階希釈である。標準曲線から血漿濃度が（Ｊられる。

天然Ｃ３，５ＤＳ−変性Ｃ３，プロテアーゼで生じたＣ
３フラグメント（Ｃ３ａ　、Ｃ３ｃ及びＣ３ｄ　）並び
にＣ３α及びβ鎖への結合について、選択したモノクロ
ーナル抗体を直接結合ＥＬＩＳ＾でテストした。

Ｃ３（ＳＮ）　　　Ｃ３（８口）　　　Ｃ３ｃ　　　　
Ｃ３ｄ　　　　Ｃ３ａ　　　　Ｃ３α　　Ｃ３βＣ３ａ
に特異的な抗体は抗−Ｃ３ａ抗体であり、これについて
更に研究した。

結果を添付の図に示す。

第１図は、可溶性の精製天然Ｃ３（）、５Ｏ８−変性Ｃ
３（）、ＥＤＴＡ−血漿中の天然Ｃ３（）及びＣ３ａ　
　（（４）　による阻害ＥＬＩＳ＾ニオケる、プラスチ
ックに吸着したＣ３ａに対するモノクローナル抗−０３
ａ抗体の阻害の結果を示すグラフである。

Ｃ３ａと比べ同等に結合を阻害するための５Ｏ８−変性
Ｃ３，精製天然Ｃ３，及び（’ＤＴＡ−血漿中の天然Ｃ
３の１（重ｆｆ１）は各々２７．　２４３及び〉１００
００倍大きい。

第２図は、Ｃ１ｑ　−結合免疫複合体をもつ患者及び冠
動脈不全（人工心肺を使用しながらバイパス手術を受け
た）の患者と正常人とからのＥＤＴＡ−血漿中の０３ａ
濃度を示す図である。

第３図は本発明に従って測定したＣ３ａ　１度と市販の
テスト（１ＩｐＪｏｈｎ）により測定したＣ３ａ　１度
との相ｍｍ係（ｒ−０，９）を示すグラフである。

第４図はＣ３ａ　１１度が１〜１０回の凍結−解凍サイ
クルによっていかに作用されるかを示す図である。結合
に対する顕著な影響は認められなかった。

第５図は上記のＥＬＩＳ＾で使用した抗−Ｃ３ａ抗体を
阻害ＲＩＡに使用した結果を示す図である。

７、　５０１Ｊｉの抗−Ｃ３ａ＋１０．ｕの　　ｌ−Ｃ
３ａ＋５０成のサンプルを３７℃で３０分間インキュベ
ートする。

２、　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｒ
１＾−８ｅＯｈａｒＯ３ｅ）に結合した抗マウスＩＱ２
ｙｄを加え、室温で３０分間インキュベートする。

３、　粒子を遠心し、Ｆ清を捨てた後に　　ｌ　　ｃｐ
ｓを測定する。

ステップ１〜３の後にウェルを良くすすいだ。

この図面中では、　　　Ｔ　−Ｃ３ａの５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅへの結合はＣ３ａ（）及びＥＤＴＡ−血漿中の天然
Ｃ３で阻害されるが、用量は少なくとも１００の因子で
異なる。

ｌ」二【１ ７、Ｃａｒｌｓｓｏｎ、　Ｈ他（１９８５）　Ｊ　Ｉｏ
＋ｍｕｎｏｌ　Ｈｅｔｈ　７９：２　、Ｇｏｄｉｎｇ、
　ＪＳｌ　（１９８（４）　Ｊ　ｌｍ１ｕｎｏｌ　Ｈｅ
ｔｈ　３９：２８５−３　、Ｇｏｒｓｋｉ、　　ＪＰ他
　（１９８１）　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｈｅｔｈ　４７
：６１４　、１ｌｕａｌｉ、　Ｔ、Ｅ、他（１９８Ｇ）
　ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍ
ｅｄｉｃｉｎａｌＮａｋａｌｔｌｒａ、　Ｒ，Ｈ，他部
（＾ｆａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ）　４：
４４３−６０ ５　、　Ｌｉｎｄｅｌｌ、Ｐ他（１９８６）リン菌に対
する新規のモノクローナル抗体の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｓｅｔ　ｏｒ　　ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｏａｉｎｓｔ　
Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）　（原
稿準備中） ６　、　　Ｋｉｊｈｌｅｒ他　（１９７５）　２５６：
　４９５−７７　、１．ａｃｈｍａｎｎ、ＰＪ他（１９
８２）　Ｊ　Ｅｘｔ）　Ｈｅｄ　１５６；２０５−８　
　、　　Ｌａｅｍｍｌｉ、ＵＫ他　　（１９７３）　　
Ｊ　　Ｍｏｌ　　Ｂｉｏｌ　　８０：５７５−９９９　
、　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、Ｂ他（１９８５）　５ｃａｎｄ　
Ｊ　ｒｍｍｕｎｏｌ　２２：１０、　　Ｎｉ１ＳＳＯｎ
、ＵＲ他　（１９７５）　　Ｊ　　Ｉｖｅｕｎｏｌ　　
１１４：８１５−２２１１　、　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、ＩＪ
Ｒ（ｌ！！　　（ｔ９８（４）　　Ｈｏｔ　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ　　１７：　　１３１９１２、　　Ｎｉ１ｓｓｏ
ｎ、ＯＲ他　（１９８２）　　Ｊ　　ｌ５−ｕｎｏｌ　
　１２９：　　２５９４−１３、　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、Ｕ
Ｒ他　（１９８２）　Ｈｏｔ　　Ｉ＋＋５ｕｎｏｌ　１
９：　　１３９１１４、Ｓｃｈｕｌｍａｎ、Ｈ他　（１
９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２７６：　２６９−７０１５
、　Ｔａｃｋ、ＢＦ他（１９８１）　Ｈｅｔｈ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ　８０：６４−１０１１Ｇ、　　ｌＩｌａｇｎ
ｅｒ、ＪＬ　　他　（１９１３４）　　八ｎａｌ　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ　　１３６：　　７

【図面の簡単な説明】

第１図は、可溶性の精製天然Ｃ３（）、５ｒ）Ｓ−変性
Ｃ３（）、［ＤＴ八−血漿中）天然ｃ３（）及びＣ３ａ
　　（（４）による阻害ＥＬＩＳ八にＪ３ける、プラス
チックに吸着したＣ３ａに対するモノクローナル抗−０
３ａ抗体の阻害の結果を示すグラフである。 ａ′Ｔ２図はＣ１ｑ−結合免疫複合体をもつ患者及び冠
動脈不全（人工心肺を使用しながらバイパス手術を受け
た）の患者と正常人とからのＥＤＴ＾−血漿中のＣ３ｑ
濃度を示す図である。 第３図は本発明に従って測定したＣ３ａ　１１度と市販
のテスト（ＵｐＪｏｈｎ）により測定したＣ３ａ　濃度
との相関関係（ｒ　−０，９）を示すグラフである。 第４図はＣ３ａ　７１度が１〜１０回の凍結−解凍サイ
クルによっていかに作用されるかを示す図である。 第５図は上記のＥＬＩＳＡで使用した抗−Ｃ３ｑ抗体を
阻害ＲｒＡに使用した結果を示す図である。 代珊入＋ｍ土中　村　至 Ｆ工Ｇ１ １ｏｏ　ｐｍｏＬ Ｆ工Ｇ２ ｎｇ／ｍｌ ９３±９１４０±１８　　７４：４ ＩＧ　　４

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）天然のＣ３の存在下に例えば血漿サンプル中のＣ
   ３ａのアッセイに使用できるように、Ｃ３ａとの反応に
   おいてＣ３により実質的に阻害されないことを特徴とす
   る抗−Ｃ３ａ抗体製剤。
2. （２）天然のＣ３のＣ３ａ領域内の近づきにくい少なく
   とも１つのＣ３ａ内抗原決定基に対して特異的に対抗す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の抗−
   Ｃ３ａ抗体製剤。
3. （３）ｐＨ約７及び室温のＳＤＳ１０＾−＾３Ｍを含有
   する水溶液中でＣ３が変性されているとき、当該抗−Ｃ
   ３ａ抗体製剤が対抗するＣ３内の１つ以上の抗原決定基
   が露出することを特徴とする特許請求の範囲第２項に記
   載の抗−Ｃ３ａ抗体製剤。
4. （４）少なくとも１つの前記抗原決定基を有している免
   疫原であって、（ｉ）変性Ｃ３、特にＳＤＳ変性Ｃ３、
   （ｉｉ）Ｃ３ａ領域を含有するＣ３の変性フラグメント
   、及び（ｉｉｉ）Ｃ３ａから選択された免疫原で免疫感
   作することにより製造されたものであって、こうして得
   られる免疫応答は、天然のＣ３のＣ３ａ領域内の近づき
   にくいＣ３ａ内決定基に対して特異的に対抗するこれら
   の抗体を選択することによって限定されていることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項から第３項のいずれかに
   記載の抗−Ｃ３ａ抗体製剤。
5. （５）使用する抗−Ｃ３ａ抗体製剤がそのＣ３ａとの反
   応においてＣ３により実質的に阻害されないことを特徴
   とする免疫化学的アッセイによるＣ３ａの測定方法。
6. （６）使用する抗−Ｃ３ａ抗体製剤が、天然のＣ３のＣ
   ３ａ領域内では近づきにくいがＣ３の変性によって露出
   されるようなＣ３ａの決定基の少なくとも１つに対して
   特異的に対抗することを特徴とする免疫化学的アッセイ
   によるＣ３ａの測定方法。
7. （７）使用する製剤が対抗するＣ３ａ領域の１つ以上の
   決定基が、ｐＨ約７、室温のＳＤＳ１０＾−＾３Ｍによ
   る変性によって露出することを特徴とする特許請求の範
   囲第６項に記載の方法。
8. （８）使用する抗−Ｃ３ａ抗体製剤が、（ａ）前記の決
   定基を少なくとも１つ有している免疫原であって、（ｉ
   ）変性Ｃ３、特にＳＤＳ変性Ｃ３、（ｉｉ）Ｃ３ａ領域
   を含有するＣ３の変性フラグメント、及び（ｉｉｉ）Ｃ
   ３ａから選択された免疫原で免疫感作し、次いで（ｂ）
   こうして得られた免疫応答をもち、天然のＣ３のＣ３ａ
   領域では近づきにくいＣ３ａの決定基に対して特異的に
   対抗するような抗体を選択することにより製造されてい
   ることを特徴とする特許請求の範囲第６項又は第７項に
   記載の方法。