JPS63503089A - ヒトｃ３中のある抗原決定基に対する抗体調製物及びその使用並びにその生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＣ３中のある抗原決定基に対する抗体調　びその　用並びにその生産 本発明は、いわゆるヒトＣ３（補体因子３）中の新抗原（新抗原決定基、　ｎｅ ｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　）に対する単一特異性抗体調製物に係わるもので ある。この抗体３１製物は第一にモノクローナル型である。この抗体調製物は、 その抗Ｃ３断片抗体活性成分を適当なＣ３断片に免疫化学的に結合させることに 使用される。この抗体調製物は、Ｃ３断片、特に循環免疫複合体（ｃｉｒｃｕｌ ａｔｉｎｇｉｇｖｕｎｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ、ＣＴＣ）に結合したＣ３断片を 検出する目的に特に使用される。

本明細書中、他に記載のない限り、「Ｃ３」という用語はヒトＣ３を意味し、免 疫グロブリンは「Ｉ９」と表記する。

補体系は約２０の成分から成り、これらの成分は厳格な反応順序で反応するよう になっており、そのｉ終段階で、例えば、侵入した微生物を破壊することができ る。補体系は、細菌及びウィルス感染に対する哺乳動物の基礎的な防御要素と考 えられている。最初に発見された成分は「因子」と呼ばれ、以下発見された年代 順に、ＣＩ、Ｃ２・・・・・・Ｃ９と命名された。

補体活性化はしばしば、炎症過程２合成表面への該因子の露出、免疫複合体形成 を含む外傷及び疾患例えば、感染、自己免疫疾患及び癌等と関連づけることがで きる。

Ｃ３は２つの異なるポリペプチド鎖がら成っている。夫々α鎖及びβ鎖と呼ばれ 、ジスルフィド結合によって互いに連結している。α鎖及びβ鎖の分子量は夫々 １１５，０００ダルトン及び７０．０００ダルトンであるとされている。

現在のところ、Ｃ３の構造は以下のようなものであると考えられている。

両鏡間及び夫々の鎖の内部に更にいくつかのｓ−ｓブリッジが存在し、断片は、 Ｃ３ｂ　−Ｃ３ｂ１　＋　Ｃ３ｆ；　Ｃ３ｂ１−　Ｃ３ｃ　＋　Ｃ３ｄ、ｇのよ うに分解される。

Ｃ３ｄ領域はチオエステル基を含有していることに注目されたい。

Ｃ３は極めて複雑な３次元構造を有している。Ｃ３の活性化により、第一段階と してＣ３ａ及びＣ３ｂが生成し、それによって、チオエステル基がヒドロキシル 又はアミノ基と反応しやすくなる。

こうしてＣ３ｂは、前記の基を有する適当な受容体（標的表面。

基質）１例えば、細胞壁又は免疫複合体等に共有結合することができる。競合反 応は加水分解である。受容体に結合したＣ３ｂはそれ以降の活性化連続反応に関 与することができる。Ｃ３ｂはＣ３ｂ１（ｉＣ３ｂ）及びＣ３ｆ断片に開裂して 不活性化する。Ｃ３ｂ　ｉは、一方Ｃ３ｃ及びＣ３ｄ、ｇを生じる。断片化及び ／又は標的表面への結合によって構造変化が生じ、元の抗原決定基が消失すると 共に新たな抗原決定基が露出してくる。元のＣ３には見出だされないが、その断 片中に現れてくる抗原決定基は新抗原（ＮＥＯＡＮＴＩＧＥＭＳ）と呼ばれる。

これに関しては数多くの文献中が取上げている（５）。

新抗原を検出し、それに対する抗体調製物を得ようとする試みが長年にわたりな されてぎた。これに関して、Ｃ３断片が種々の標的表面１例えば、免疫複合体に 結合することによって発生する新抗原がこれまで特に興味の対象となってきた。

免疫複合体化Ｃ３断片に対する抗体調製物はＣ３含有ＣＩＣ及び組織沈着Ｃ３断 片を検出する上で大変有用なものであると考えられている（４゜３１）。様々な 免疫複合体決定法が比較されている（１４，１５）。

Ｃ３に対するモノクローナル抗体はこれまでに多数報告されている。タメリアス （Ｔａｍｅｒｉｕｓ、ＪＤ）他はヒトＣ３に対するモノクローナル抗体を０３に よる免疫によって調製した（２５．２６）。このうちのたった一つのものしかＣ ３断片（Ｃ３ｄ領域）と特異的に反応しなかった。ラバマン（ＬａｃｈＩｌａｎ ｎ、　ＰＪ）他は異なる三種類のモノクローナル抗体を調製した（１０，１１， １２．３２）。このうちの一種（クローン９）だけが新抗原（Ｃ３（ｌ領域）と 反応した。バーガー（Ｂｕｒｇｅｒ、Ｒ）他はモルモットＣ３で免疫感作して異 なるへ種類のモノクローナル抗体を調製した（２）。これらへ種類全ては、マイ クロタイターウェルのプラスチック表面に結合した元のモルモットＣ３と反応し たが、そのうちの二種類の抗体（クローン１０５及び１１１）はヒトＣ３とも反 応した。アゲアト（Ａｇｕａｄｏ、　ＨＴ）他は、免疫複合体及び補体活性化の 検出に於ける有用性の観点から分析する為に、上記モノクローナル抗体のうちの いくつかを選択した（１）。フワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、ＡＳ）他は 元の０３と反応するモノクローナル抗体を調製した（２９）。受容体に結合した 断片と遊離状態に於ける該断片とを確実に識別し得るモノクロ−ナル抗体はこれ まで作製されていない。

ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ、　０）他はＣ３ｃエピトープに対する特異性を有する 吸着抗血清について記載している（７）。この調製物は複数の抗原決定基に対す る抗体を含んでいる。

本発明者自身も、Ｃ３ｂが赤血球細胞膜に共有結合した際に顕在化する抗原決定 基は変性Ｃ３中にも見出だされることをすでに多くの文献で発表している（１６ ．１ｇ、　１９．２０）。これらの発見に基づいて、本発明者はＣ３の抗原決定 基を、元の０３及び変性Ｃ３中の双方に存在する安定な抗原決定基であるＣ３（ Ｓ）　、変性によって発生する抗原決定基であるＣ３（Ｄ）、元の０３中に存在 するが、変性によってＣ３（Ｄ）にとってかわられる抗原決定基であるＣ３（Ｎ ）に分類した。Ｃ３（Ｄ）抗原決定基を生じやすい変性溶媒の例としては、ＳＯ Ｓ　（ドデシル硫酸ナトリウム）、デオキシコール酸塩。

グアニジン塩酸及び酸性又はアルカリ性溶媒（夫々ｌ）Ｈ＜３又はｐＨ＞１０） カアル。Ｃ３（Ｄ）　（Ｚ、　Ｃ３（Ｄ）β、　Ｃ３（Ｄ）、Ｃ３（Ｎ）、Ｃ３ （Ｓ）　及ヒＣ３（Ｓ、Ｎ）の各型の抗原決定基の夫々に対するラビットのポリ クローナル抗体調製物が得られている。「α」及び「β」はｃ３の夫々のペプチ ド鎖を示しており、それらは免疫感作操作に用いられた還元型である。

１．１１，１６，２６，３２．３３及び３４は、スウェーデン出願に基づく優先 権を伴う出願手続きに於けるスウェーデン特許庁による国際調査報告に於いて、 夫々単独で又は他の文献と組合わせることにより特に関連性の高いものとして分 類されているものである。

本発明の目的は、新抗原（従来公知のものと比較して）、特にＣ３ｂの標的表面 への共有結合又はＣ３ｂのさらなる断片化によって生じる結合型に特異的な新抗 原に対してより優れた特異性を有する抗体調製物を提供するものである。本発明 は更に、（ａ）可溶性Ｃ３断片、（ｂ）補体活性化、　（ｃ）　Ｃ３断片の組織 沈着。

（ｄ）細胞結合０３断片、　（ｅ）　Ｃ３断片含有免疫複合体等の検出方法状態 の診断に関する代替方法を提供することである。本発明は最後に、個々の新抗原 に対する抗体調製物を獲得する為の改良本発明の抗体調製物は、Ｃ３の還元型、 第一に０３のＣ３ｂ領域、即ち、Ｃ３ｃ又はＣ３ｄ領域に存在する個々の新抗原 に対して単一特異的なものである。問題となる新抗原は（好ましくは）α鎖又は β鎖のいずれかに存在している。従って、本発明の抗体調製物は、免疫感作する ときに使用した免疫原に相同な元の完全なＣ３とは反応せずに、変性し完全に還 元された型の０３、即ち、他の鎖から解離したＣ３ポリペプチド鎖の少なくとも 一つと反応するものである。ある場合は、本発明の抗体調製物は、Ｃ３ｂ。

Ｃ３ｂ１．Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄ、ｇ、Ｃ３ｄ、Ｃ３（１及ヒ他（７）生３！ｌ’Ｈ： 発生ｔ　ルＣ３ｂ　［片から成る群から選ばれた少なくとも一つの断片（標的表 面に結合している可能性がある）とも特異的に反応し得るものである。

本発明の抗体調製物は、前記標的表面のいずれかに共有結合している断片と優先 的に反応するが、他の型のものと反応することができる場合もある。特に好まし い抗体調製物は、結合断片をそれに対応する遊離断片の存在下で免疫化学的にア ッセイすることのできるものである。

本発明の好適な抗体調製物は、可溶性（遊離）の元のＣ３ｂ。

Ｃ３ｊｌｉ、Ｃ３ｄ、ｏ、　又ＬｔＣ３ｄ　’Ｉｆｒ片ＩＣヨッＴ、Ｃ３（Ｄ） 　ト１７）　反応に：　１１　著す阻害を受けないようなものである。例えば、 実験条件下で、対応するＳＯＳ変性又は共有結合断片と比較して、それと同等の 阻害効果を阻害ＥＬＩＳＡに於いて示すには、２５倍以上２例えば、５０倍以上 のモル数の該可溶性断片が必要とされる。

本発明の抗体調製物は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、　Ｆ（ａｂ’）２のような 抗体活性断片の形態でも良い。又、誘導化抗体の形態でも良い。必須条件は、抗 体断ハ及びその誘導体が本発明に従う生物特異的な免疫型アフィニティを有して いることである。

本発明抗体ｖ４製轡の抗体活性成分は、酵素活性、蛍光発生。

化学ルミネッセンス発生、放射活性、ビオチニル基等の分析によって検出可能な 基、又は、補因子、補酵素、基質又は補基質等として作用し得る基と結合した形 態で使用することができる。

該成分は、試験溶媒に対して不溶性の相、いわゆる固相に結合した形態をとるこ とも可能である。即ち、該成分は、例えば、親水性０Ｈ−１又はＮＨ２−含有ポ リマーのような種々のポリマー又はマイクロタイターウェルのようなプラスチッ ク表面に物理結合又は共有結合することができる。本発明抗体調製物は溶液又は 懸濁液の形態をとり得、特殊な使用目的に応じて、自体公知の様々な化学物質を これに添加することができる。本発明抗体調製物を凍結乾燥し、これを、試験キ ット等の成分として使用するために、密封バックに詰めることができる。

本発明の目的の一つは、少なくとも一種の０３断片の免疫化学的アッセイ用の試 験バックを提供することである。この試験バックは本発明の抗体調製物を含む。

本発明抗体調製物を生産するために、本明細書中で既に述べたような特異性を有 する抗体を産生じ得る細胞をしてそのような抗体を分泌するようにせしめ、この 抗体を単離・精製し、自体公知方法によってこれを断片化及び／又は誘導する。

精製は前記の特異性を満たすことのできない抗体を除去することを含む。を椎動 物、好ましくは瀉血を椎動物２例えば、マウスのごとき哺乳動物に於いては、本 発明で言うところの特異な新抗原構造（新抗原決定基）を有する免疫原で免疫感 作した結果、イン・ピボで分泌が生起する。得られる免疫応答はポリクローナル なものであり、免疫動物から得られる抗血清は、新抗原であるか否かに拘らず、 該免疫原の全ての抗原決定基に対する抗体を含むものとなる。適当な選択方法を 講することによって、免操作によって、所望の新抗原に対する抗体を精製した形 で得ることは原理的には可能である。しかしながら、現段階に於いてポリクロー ナル抗体を免疫吸著により精製して本発明の抗体調製物を得る方法は、非常に労 多くして常に収率が低いものとなる。

本発明に於ける優れた抗体調製物を得る目的で免疫応答に於いて抗体を選択する 為の最も良い方法は、いわゆるモノクローナル法（８）と呼ばれているものであ る。この方法に依ると、免疫感作後に抗体産生プラズマｌｌＩ胞を適当なメラノ ーマ細胞系細胞と融合させて、その結果、この融合細胞は早く且つ永続的に増殖 するようになる。本発明に従う特異性（Ｃ３（Ｄ））及び交差反応性を有する抗 体を産生する融合細胞をクローニングし、選択及び培養することによって、Ｃ３ の還元型、即ち、Ｃ３の遊離ペプチド鎖中に見出される個々の抗原決定基に対す る抗体調製物を得ることが可能になる。本発明の抗体ｖＡ製物を産生する選択細 胞クローンはイン・ごトロでの細胞培養又はイン・ビボに於いて腹水腫瘍として 培養することができる。精製及び単離操作は一般の方法、即ち、塩沈澱又はイオ ン交換、アフィニティ、ゲルクロマトグラフィ等の様々なりロマトグラフィ操作 によって実施することが可能である。

免疫原としては、イン・ビポで免疫系にさらされた際に前記のような特定の抗原 決定基を提示し得るようなものが用いられる。本明細書中で既に記載した特異性 を有する抗体が、変性形態のα鎖若しくはβ鎖、それらの混合物、又はそれらの 適当な免疫原性断片のいずれかを免疫原として用いた場合には、免疫応答に於い て実に驚くべきほど多舟に得られる。この断片の例としては、各鎮のＣ３ｂ、Ｃ ３ｂ１．Ｃ３ｄ、！Ｉｔ及びＣ３ｃ領域に対応する変性−還元形態である。

本発明の抗体調製物は、まず第一に０３断片の免疫化学的アッセイ方法に有用で あるが、補体活性化をイン・ビトロ及びイン・どボの両方に於いて調節する目的 にも使用することが可能である。

本川ｉ！１ｍに於けるアッセイは、Ｃ３断片を含有する試料を本発明の抗体調製 物と接触させ免疫複合体を形成させ、その形成及び論が試料中の０３断片の夫々 、定性及び定量測定値となるものである。必要ならば、形成された免疫複合体（ 抗Ｃ３断片−０３断片）中に存在する成分と反応する反応体を更に加えることも 可能である。この反応体を本発明抗体調製物の添加前後又は同時に加えるかは、 実際の測定に応じて決めることができる。通常、使用する反応体の少なくとも一 つには、適当なマーカー、いわゆる［分析によって検出し得る」基がついている 。該反応体の量は、複合体に取り込まれる標識反応体量又は取り込まれないで残 存する標識反応体量が試料中の０３断片の測定値となり得るように選ばれる。

一つの分類法によれば、上記方法はホモジニアスか又はヘテロジニアスかに分類 される。ホモジニ７ス法は、複合体に取り込まれた標識反応体を取り込まれなか ったものから物理的に分離することを一切せずに該標識反応体を測定するもので ある。

一方、ヘテロジニアス法では、標識反応体の二つの形態を物理的に互いに分離し た後で、その二つの形態の双方又はどちらか一方の標識反応体をアッセイするも のである。分離を容易にするために、反応体の一方が試験溶媒中で不溶性である ことが望ましい。

二番目の分類法によれば、競合又は非競合方法のいずれかに分類される。競合方 法に於いては、共通のエピトープ（抗原決定基）を有する二つの免疫反応体が作 製され、これらは不充分な量の免疫学的一対部分（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）　 ｈの相同な結合部位に対して競合関係となるものである。従って、試料中に存在 し、本発明抗体調製物に対する新抗原を有するＣ３断片をアッセイする為には、 試料中の新抗原が、この抗体調製物に関して、同一の新抗原を担持する新たな添 加反応体と競合するようにしなければならない。この添加新抗原は標識されてい るか、固相結合しているか、又は固相結合しているか、又は不溶性形態をとり得 る。

以上の方法のうち、どの特定の型のものを採用するかは、例えば、試料中に存在 する断片の形態に即して決定するというように、実際のアッセイ条件に徴して決 めれば良い。競合反応はしばしば「阻害方法」と呼ばれる。非競合方法に於いて は、当然のことながら競合反応が起らないようにアッセイ系を組立る。

第三番目の分類によると、沈降又は非沈降方法のいずれかに分類される。有効な 沈降剤としては、免疫複合体成分、好ましくは抗体成分に対する特異性をもった 沈降抗血清及びいわゆる固相結合抗体を挙げることができる。Ｃ３中の新抗原決 定基は、一般的に言って、非反復的なものであり、この意味では、これら抗原決 定基に対するモノクローナル抗体は非沈降性のものである。

第四番目の分類法では、使用するマーカー基によって分類している。即ち、放射 性、酵素、蛍光性、化学ルミネッセンス、酵素基質、免疫化学的方法等に分類さ れる。

免疫化学的方法には、免疫電気泳動、粒子凝集、免疫拡散及び標識抗体による顕 微鏡などがある。

以上のどの方法を選択するかは、検出したい断片の試料中の存在形態にによって 決めることができる。断片が試料中に溶解しており標的表面に結合していない場 合には、一般的に可溶性の分析物に適用される原則にしたがって、方法を選択す る。また一方、目的する特定の断片がある特異的な標的表面に結合している場合 には、方法を選択する際に、この事実を考慮に入れなければならない。従って、 組織沈着断片をアッセイするための最も簡単な方法は、標識された本発明の抗体 ｙＪ製物を使用し、適宜、顕微鏡を組み合せて実施することである。赤血球に結 合している断片も同様にしてアッセイすることができるが、定量的には、阻害方 法を用いると実際上有利な結果が得られる。

一般的には、特異的な可溶性標的表面（Ｍ）に結合している特異的なＣ３断片を 選択的にアッセイするには、少なくとも、二種類の反応体が必要である。その一 つは該断片中の新抗原と特異的に反応する型でなければならず、他の一つは、標 的表面上の適当なエビ１−一ブと反応するものでなければならない。方法論的に は、つまり、三次元複合体（反応体１−Ｃ３−Ｍ−反応体２）が形成されること を意味する。技術用語でいうと、これは「サンドイッチ」と呼ばれ、このサンド インチ法に一般に適用される原則は、この方法を選択した場合に採用される。

本発明は、Ｃ３断片が結合した循環免疫複合体（ＣｔＣ）のアッセイ法に特に有 用である。この複合体は、（１）Ｃ３断片（Ｃ３ｂ、　Ｃ３ｂ　ｉ　。

Ｃ３ｄ、Ｑ及びＣ３ｄについてはこれまで共有結合形態での存在が知られている 。）、■ｒｇ＾、　Ｉｇｎ、　ＩＣ＋Ｅ、　ＩｇＧ又は１ｇＮ型の抗体、及び■ 抗原を含有するものである。本発明の抗体ｗ４製物を使用すること以外は、公知 の操作を一般的に使用することができる。操作は、夫々個々の場合で、まさに何 を測定しようとするかによって異なる。ある断片を含有する免疫複合体の総量を 測定する場合には、免疫複合体に用いられる一般的な沈降法を該断片中に存在す る特定新抗原に特異的な本発明抗体調製物と組合わせて使用することができる。

もし免疫複合体中に存在する可能性があると考え得る全ての０３断片と反応する 抗体調製物を使用した場合には、得られる結果は、この免疫複合体に結合してい るＣ３断片の総量を表すものとなる。Ｃ３断片含有ＣＩＣの特異成分をアッセイ する場合には、ＣＩＣの異なる成分に対して特異的である夫々別個の二つの試薬 が必要となる。この場合に、抗Ｃ３断片抗体調製物に加えてＣＩＣ中の抗原部分 又は抗体部分に特異的な試薬が必要である。例えば、公知の１ｇクラスの一つ又 は抗原に対して特異的な試薬が考えられる。これらの試薬に加えて更に適宜別の 試薬を使用することもできる。　Ｃ３断片含有免疫複合体に関しては既に報告が ある（　１，２１，２３．３１　）。

本発明は、Ｃ３及び／又はその断片を含有する様々な種類の試料のアッセイに対 して適用できる。Ｃ３及びその断片は、例えば、組織並びに血液、血漿、血清、 尿、滑液及び脳を髄液等の体液中に存在することが知られている。Ｃ３（Ｄ）抗 原決定基を有しないＣ３形態は、抗Ｃ３調製物と反応する以前にそれが変性され ていれば、アッセイすることができる場合もある。

免疫化学的反応を実施する際の条件は、この種のアッセイ方法に於いて通常使用 するものである。例えば、温度は０−４０℃。

特に１５−４０℃の範囲で選択される。適当なｐＨは通常４．５−１０．好まし くは、５−８．６で、ある。極めて当然のことであるが、補体の活性化又はＣ３ の非所望の変性を避けるように測定及び各操作を実施しなければならない。補体 の活性化にはプロテアーゼ及び二価のカルシウム及び／又はマグネシウムイオン が必要である。

従って、Ｃ３（Ｄ）抗原を有するＣ３形態を他の０３形態の存在下でアッセイす る場合には、プロテアーゼインヒビター又は前記イオンと複合体を形成する試薬 、例えば、ＥＤＴＡを加えるのが適切である。洗浄剤及び！１ｌｉｉ液を添加す る場合には、Ｃ３に対して変性作用のないものにしなければならない。

元の（ｎａｔｉｖｅ）Ｃ３（Ｃ３（３Ｎ））を公知方法で精製した（１７）。Ｃ ３１００埒を１００４の２　Ｘ　１０’ＨＳＯ３中、３０分間３７℃で変性させ た（Ｃ３（ＳＯ））。変性還元されたＣ３及び単離Ｃ３α鎖及びＣ３β鎖（Ｃ３ （Ｄ））を二−ルソン他の方法で調製した（１９）。エラスターゼ生成Ｃ３ｃ及 びＣ３ｄはブリアン・タック博士（ｏｒ、Ｂｒ’ｉａｎ　Ｔａｃｋ　）の好意に より、５ＣｒｉｐｐＳ　Ｃｌ１ｎｉｃおよびＲｅ５ｅａｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉ ｏｎ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ。

ＵＳＡから頂いた（２４）。Ｃ３１］は１％（Ｗ／Ｖ）　トリプシン（ＴＰＣに 処理。

Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、　ＵＳＡ）の存在下、空温で２分間でＩ製した（１７ ）。

Ｃ３ｂ１はＣ３ｂを５埒のＨ因子及び１１４のＩ因子と共に３１℃で６０分間イ ンキュベートして得た。元の０３の　Ｉによる放射標識化は、従来のラクトペル オキシダーゼ法により比活性３０．０ＯＯｃｕ／埒タンパク質となるまでおこな った（１６）。

１護」Ｌ玉 従来方法により、抗Ｃ３α−β鎖（抗−Ｃ３（Ｄ））抗体をラビットを用いて作 製した（１９）。

［マウスモノクローナル抗体］ ＬＬ−１−ユ 可溶性であって赤血球結合Ｃ３ｂに対する特異性に関して選択された、元の０３ 及びＣ３ｂに対するマウスモノクローナル抗体はハンス・ミュラーーエベルハル ド博士（Ｄｒ　Ｈａｎｓ　Ｈｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ）　、　５ｃｒｉｐ ｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃおよびＲｅ５ｅａｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　ＬａＪｏ ｌｌａ、ＵＳＡから好意により贈られたものである（２５）。

これらの抗体はＳＯ５変性Ｃ３に対する特異性を有する抗体である。、８−１２ 週令のメスＢａ　Ｉ　ｂ／ｃマウス二匹を７０インド完全アジユバント（ＦＣＡ 、Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒｗｅｒｋｅ　ＡＧＪ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中のヒトＳＤＳ変 性Ｃ３の２４ｎ及びリポポリサッカライドＷ（ＬＰＳ、Ｄｉｒｃｏ、ｃａｔ　ｎ ｏ　３１２０−２５）２０／ＩＩ！を皮下投与した。８週間後、融合の４日前に 、リン酸ｍ＊溶液、　ｐＨ７，４中ノＳＯ８変性Ｃ３，１００Ｉ４を静注（ｉ、 ｐ、）した。標準方法（６，９）に以下の変更を加えてハイブリドーマを作製し た。

四種の異なる５ｐ２１０細胞系を使用した。５％牛脂児血ｍ（ＦＣＳ。

Ｇｉｂｃｏ、　ｃａｔ　ｎｏ　０１１−６２９０）及び２５埒／　ｄのゲンタｖ 　イシン（ｃａｔｎｏ　Ｇ−７５０７，５ｉｕａ　Ｃｈｅｗ　Ｃｏ、　ＵＳＡ） 含有タルヘツコ修飾イークル培地（ＤＨＥＨ，Ｐａ１ｓｌｅｙ、５ｃｏｔｌａｎ ｄ、　ｃａｔ　ｎｏ　０４１−１９６６）中で増殖させた元の５Ｄ２１０．　Ａ ｇ１４が前駆細胞であった。無血清培地中で増殖する二種類のサブクローン及び 低血清培地Ｈｙ−０，１中で増殖する一種類のサブクローンも同様に使用した。

１０％ＦＣ３又は８ｙ−０，１含有標準ＤＨＥＨをクローニング及び選択に用い た。クローンはＳＯ３変性Ｃ３に対する結合性によって直接結合ＥＬＩＳＡで選 択した。１４のクローンをランダムに選択し、それらを更に試験した。

グループ　■ これらの抗体はＳＤＳ変性−還元Ｃ３に対する特異性を有する抗体である。この グループのモノクローナル抗体は、以下の変更点以外は同じ方法で作製された。

ＦＣＡ中の変性−還元Ｃ３，３０／Ｊを前記マウスに皮下注射した。フロインド 不完全アジュバント（ＦＩＡ、　Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒｗｅｒｋｅ　ＡＧ、　Ｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中の同一抗原３０埒を２週間隔で４回静注により追加免疫し、 その後、９か月間マウスを放置した。融合３日前に、１９０埒のＳＤＳ変性−還 元Ｃ３（ＰＢＳ中）を−日一回静注により最後の追加免疫をした。低血清培地Ｈ ｙ−０，１中で増殖し得た５ｐ２１０．Ａｏ１４ミエローマ細胞系を融合に使用 した。ＤＨＥＨ５％ＦＣ５又は低血清培地Ｈｙ−０，１％中で２種の異なるハイ ブリドーマ細胞系を選択及びクローン化した。クローンは特異性によって直接結 合ＥＬＩＳＡで選択した。１４０のクローンが得られ、このうちの１３をランダ ムに選択して更に試験した。

樹立されたハイブリドーマはＴＣフラスコ中で２００ｄになるまで流加培養した 。陽イオンクロマトグラフィを用いてモノクローナル抗体を精製した（３）。

ループ■に　するりＯ−ン選択 モノクローナル抗体の最初の選択は、ポリスチレン吸着変性−還元Ｃ３に対する 反応性を分析することによっておこなった。

６４４の陽性クローンを検出した。

第二段階目の選択は、Ｃ３の上程の異なる断片及び構造的変異体に対するこれら 全ての陽性クローンの反応性を直接結合ＥＬＩＳＡに於いて互いに比較すること によって行った。この結果、モノクローナル抗体の反応パターンに大きな相違の あることが判明した。各パターンの代表例を選び出した。反応性が弱いクローン は除外した。こうして１４０クローンを選択した。これらのクローンは全て０３ の変性形態に強く反応するが、Ｃ３断片の種々の型に対してはそれらの特異性及 び反応強度は様々であった。

このうち、７０クローンを２００ｄの培養容色まで殖やすことができた。更にこ のなかの１４クローンをランダムに選択しそれらの特異性を分析した。ＥＬＩＳ Ａ試験を反復しＩ（＋濃度を定量した。１４クローンのうちの一つは反応性を消 失し１ｇ産生を停止してしまった。その他のクローンは、溶液中のＣ３（Ｄ）に 対する強い特異性を有する、以前と同じ特異性パターンを依然として保持し、こ のことは、これらのクローンの産生ずる抗体は前記に定義した新抗原に対して反 応するものであることを意味するものである。この新抗原の存在を次に結合Ｃ３ の生理的形態中でアッセイした。好ましくない構造変化及び該抗原表面への接触 の減少を避ける為に、モノクローナル抗体の反応性を阻害ＥＬＩＳＡ及びサンド イッチＥＬＩＳＡで試験した。これらの試験に於いて、モノクローナル抗体は直 接吸着又は抗マウスＴｉ１ｌを介して間接的に固相に結合されている。

粒子結合Ｃ３の調製 ＥＡＣ１４°ｘｙ２３ｂ及ヒＥＡＣ１４°ｘｙ２３ｂｉｌＢｌａヲ１ｌｔＬ、コ レラ細胞上への０３の取込みを１２５工標識された元の０３を用いて推定した（ １６）。沸騰させたザイモサンＡ　（Ｚｙｖｏｓａｎ　Ａ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅａ＋、ＣＯｌ、ＵＳＡ）　１００■を２埒の１２５工標識化元の０３を含む血 清２．５ｄと共に３７℃で３０分間インキュベートした。Ｃ３ｂ１の取込みは粒 子結合１２５ＩＣｐＨから計算した。

エンザイムリンクドイムノソーペントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）直接結合アッセイ ：　マイクロタイタープレートウェルに吸着させたＣ３又はＣ３断片の一定量に 連続稀釈の抗ｃ３抗体を結合させた。結合抗体をその後、西洋ワサビペルオキシ ダーゼ（ＨＲＰ）（ＤＡＫＯＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　Ａ／Ｓ、Ｄｅｎ ｍａｒｋ）結合抗ラビット又は抗マウス免疫グロブリンで定量した。０．ＩＸＴ ＷＥＥＮ　２０（ｖ／ｖ）及ヒｏ、　１ｓ（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ ）ＰＢＳを実行溶液として使用した。

１、　ＰＢＳ中のＣ３，Ｃ３ａ及びβ鎖、　ＳＯＳ変性Ｃ３，Ｃ３ｃ及びＣ３ｄ の各２００７Ｊ　（Ｃ３／１の２０ｎａ＋ｏ　ｌに対応）を別々にマイクロタイ タープレート（Ｉａｖｕｎｏｐｌａｔｅ　ＩＩ　Ｆ、Ｎｕｎｃ、　Ｄｅｎｍａｒ ｋ）の異なるウェルのプラスチック表面上に４℃で一晩放置して吸着させた。

２、抗体調製物の連続稀釈液１００　／ｊｊ！をウェル内で空温（ＲＴ）下６０ 分間インキュベートした。

３、ＨＲＰ結合ブタ抗イムノグロブリン１００４を前段階の表面結合抗Ｃ３抗体 に空温（ＲＴ）下６０分間で結合させた。

４、発色試１ｉ（１，２−フェニレンジアミンジハイドロクロライド（Ｆｌｕｋ ａ　ＡＧ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）２０　ａｙ及び０．１８クエン酸塩／リ ン酸塩緩衝液ｐＨ５，０，７５ｄ中ｆ７）１０ｍ３０％Ｈ２Ｏ２１ｏｏＪＩｉヲ ウエルニ添加して、酸素反応を開始した。約１０分後に１ＨのＨ２ＳＯ４゜１０ ０１ＩＩｌを加えて反応を停止した。４９２ｎｆｆｉの波長を分光光度計で測定 して染色度を定量した。

前記１〜３の各段階の後に、各ウェルを０．１％　ＴＷＥＥＮ　２０（ｖ／ｖ） 含有食塩水で３回十分に洗浄した。

阻害アッセイ：　このアッセイは直接結合アッセイを変更したものであった。一 定量の抗体に対して、吸着抗原と連続稀釈試料１００１１１が競合関係になった 。直接結合アッセイに於いて記載したように、空温（Ｒ月下６０分間で予め吸着 させた元の０３に結合させた場合、０Ｄ４９２＝１を与えるように抗体投与量を 選択した。

この最初の段階に続いて、直接結合アッセイの第３及び４段階を実施して阻害ア ッセイを完遂した。

サンドイッチＥＬＩＳＡ １、マイクロタイターウェルへのモノクローナル抗体の間接結合： アフィニティ精製したＦｃ特異的ラうット抗マウスＩＱをマイクロタイターウェ ル（ＮＵＮＣＩｍｍｕｎｏｐｌｔｅ　ｔｙｐｅ　Ｉ）の９６個の各ウェル１、ニ ー　１．２５Ｎ１ｇ／ａ＋ｆ！含有２００ｐを４℃で１６時間以上インキュベー トすることで吸着させた。洗浄後、各ウェルをモノクローナル抗体の連続稀釈物 （未精製の上澄でも良い）１００成で１時間空温でインキュベートした。

２、免疫複合体分析： その後、１／１０から１／１０２４０の標準稀釈又は血漿試料（１／２６稀釈） の１００　ｍを上記各ウェル内で１時間変温でインキュベートした。次に、βガ ラクトシダーゼ結合Ｆｃ特異性ラビット抗ヒトＩｇＧのアイニティ精製物の２０ ０倍稀釈物を１時間Ｖ温でインキュベートした。ウェル中でＰＲＩＳＴ／ＲＡＳ Ｔ発色基質（１００１１１，Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ）と２時間反応させた後 、５０成の０．６６８のＮａ２ＣＯ３を加えて反応を停止させ、ウェルに結合し た酵素旦を定量した。

抗体及び試料とのインキュベーション後は各ウェルを３回充分に洗浄した。

免疫複合体モデル 結合Ｃ３と凝集したＩｇＧを、血清に６０ＯＮの凝集１ｇＧ／ｘｉ！を添加し３ ７℃でインキュベートして作製した（１４）。

試　料 ＥＤＴＡ血漿は４０℃で保存した。

５Ｏ３−ＰＡＧＥ／イムノブロッティング５ＤＳ−ＰＡＧＥはレムリの方法に従 って実施した（１３）。イムノブロッティングは文献記載の方法によった（１６ ）。イムノブロッティングに於いてＨＲＰ結合抗マウスイムノグロブリンを用い てモノクローナル抗体を検出した。

結　果 ポリクローナルラビット抗Ｃ３（Ｄ）抗体及びＳＯＳ変性Ｃ３（グループＩＩの 調製から誘導）及び還元−変性Ｃ３（グループ■の調製から誘導）に対するマウ ス抗血清の特異性をＥＬＴＳＡによって分析した。各抗体の連続稀釈物を直接結 合アッセイで試験したところ、これら三種の抗体は全て元の０３で被覆したウェ ルに結合することが示された。元のＣ３（３及びＮ抗原）　、　ＳＤＳ変性ｃ３ （Ｓ及びＤ抗原）及び還元−変性Ｃ３（［）抗原）は流体相中の前記三種の抗体 に対する結合に関して、競合することが阻害アッセイで判明した（第１図）。予 想されるように、ラビット抗ｃ３（Ｄ）抗体ハｃ３（ＳＯ）及ヒＣ３（Ｄ）　ニ Ｊｌ：　ッＴ阻害すレタが、Ｃ３（ＳＮ）ニ抗体の結合にＣ３（Ｄ）が関与して いることを意味している。対照的に、二種類のマウス抗血清はＣ３（ＳＯ）及び Ｃ３（ＳＮ）によっては阻害を受けたが、Ｃ３（Ｄ）では僅かに阻害されただけ であった。ただ、還元−変性Ｃ３に対する抗体がＣ３（ＳＮ）よりも少量のＣ３ （ＳＤ）によって阻害されることである。結論として、この二種類のマウス抗Ｃ ３抗血清の特異性は主にＣ３（Ｓ）抗原に対するものであることが判明した。

ロ　、に　するモノクローナル抗体の特異性阻害ＥＬＩＳＡに於いて、個々のグ ループＩ−ＩＩモノクローナル抗体の流体相中のＣ３（Ｄ）、　Ｃ３（ＳＤ）又 はＣ３（ＳＮ）抗原を表現する０３２５ｐｍｏｌに対する結合に関して試験した 。第２図に示したように、グループ■はＣ３（ＳＮ）のみによって阻害を受け、 Ｃ３（Ｄ）又はＣ３（ＳＤ）によっては阻害を受けなかった。このことから、こ の阻害は元の０３のＣ３（Ｎ）抗原によって引き起こされたことを示している。

グループ■についても、　Ｃ３（Ｄ）及びＣ３（ＳＤ）によって阻害を受け、従 ってこの阻害はＣ３（Ｄ）抗原に因るものであることが明らかである。元の０３ によっても限られた阻害がみられたが、これは恐らく、調製及び保存中に変性し た僅かの部分に因るものと考えられる。因みに、Ｃ３（Ｄ）による阻害と同程度 の阻害を得る為には、３２倍間のＣ３（ＳＮ）が必要とされた。

グル７−ブＩＩはより複雑であった。何故ならば、この抗体は全ての型の０３に よって阻害されたからである。このグループに属する三種の抗体はＣ３（Ｄ）抗 原によって優位に阻害され、一方、他の抗体はＣ３（ＳＤ）及びＣ３（ＳＮ）抗 原によってより影響を受けた。

このことは、グループＩＩの抗体はＣ３（Ｓ）及びＣ３（Ｄ）の両抗原に対して 特異性を有していることを示唆するものである。

Ｓ及びＮ抗原（Ｃ３ｂ、　Ｃ３ｂ　ｉ　、血清、熟成血清）を表現する可溶性流 動相断片２．５ｐｍｏｌに対するモノクローナル抗体の特異性も試験した（第３ 図参照）。夫々異なる調製物は各グループ抗体の結合に類似した影響を及ぼした 。グループ■は全ての断片で顕著に阻害され、グループＩｆは阻害程度の範囲が 広くヘテロジニアスなパターンを示した。グループ■は異なる断片で穏やかに阻 害されただけであったが、そのうちの四つの抗体は例外的にＣ３ｂ　ｉによっで ある程度阻害された。

モノクローナル抗Ｃ３抗体の粒子結合Ｃ３に　する阻害ＥＬＩＳＡに於いて、個 々のグループＩ−ｍモノクローナル０×ｙ 抗体（Ｄ　ＥＡＣ１４２３ｂｉ、ＥＡＣ１４°ｘｙ’　２３ｂ　及Ｕ　ｚｙｃ３ ｂ　ｉ　１７）　粒子結合Ｃ３゜２ＳＤＩＩＯ＋に対する結合に関して試験した 。粒子結合Ｃ３はグループＩの全ての抗体について阻害した（＜９０％結合）。

結合の平均値はＥＡＣ１４°ｘｙ２３ｂｉを使用した場合に最低であった。グル ープＩＩの八から丸棒の抗体が粒子結合Ｃ３によって阻害され、平均値は同一で あった。グループ■の九種の抗体が粒子結合Ｃ３に結合した。このうちの一種の みが粒子結合Ｃ３ｂ及びＣ３ｂ１の両方に反応し、残りはＣ３ｂ１に特異的に反 応した。Ｃ３の可溶性の生理的断片によって阻害されることが判明しているグル ープ■の抗体は、結合形態のものによってより阻害された。何故ならば、阻害Ｅ ＬＩＳＡに於いて、６４−２５６倍の可溶性断片量が同程度の阻害を生起させる のに必要とされたからである。

Ｃ３ｂ　ｉに特異的な四種類の抗体ば２疫複合体アッセイに充分使用し得る特異 性を有していると考えられる。

ＥＬＩＳＡに於けるモノクローナル　ｃ３　の　ｃ３　びｃ３　に対する特異性 直接結合ＥＬＩＳＡによって、グループＩ−Ｉ［［抗体の、予め吸着された、元 のＣ３，ＳＯ３変性Ｃ３，プロテアーゼ生成Ｃ３断片及びＣ３α及びβ鎖への結 合を試験したく第工表）。グループＩのうち、元の０３には全ての抗体が結合し たが、ＳＯ３変性Ｃ３には一つのみが、Ｃ３ｃには１２個の抗体が、２個の抗体 がＣ３α又はβ鎖へ結合した。

グループ■とは対照的に、グループＩＩ及び■の全ての抗体は元の０３及び変性 Ｃ３の双方に結合し、そのうちの多くが、Ｃ３α鎖に対して陽性であったが、プ ロテアーゼ生成０３断片への結合の分布はグループＩの抗体と類似していた。

第　工　表 Ｃ３（ＳＮ）　Ｃ３（ＳＯ）　Ｃ３ｃ　Ｃ３ｄ　Ｃ３ａ　Ｃ３（Ｄ）　Ｃ３（Ｄ ）α　β ＩＩＩ　１３　１３　９１０１０　０ イムノブロツテイン　に於けるモノクローナル抗Ｃ３抗体の運−イムノブロッテ ィング（第■表）に於いて、グループＩは一例を除いて殆ど完全に反応しなかっ た。この−例はβ鎖に対して曖昧ではあるが、反応している。グループＩＩにつ いては１４のうち７つしか反応しなかったことから、その結合はかなり弱いもの であることがわかる。このうちの６つはエラスターゼ生成Ｃ３ｃの３６ｋｄ断片 に結合した。グループ■の１３全ての抗体はα鎖断片と強い軟和性で結合した。

このうちの７つはエラスターゼ生成Ｃ３ｃの２５ｋｄ断片と結合し、４つは３６ ｋｄ断片と結合した（１９）。

１００℃でＳＤＳ変性して作製した４０ｋｄのα鎖断片に対して一つの抗体が陽 性を示したが、イムノブロッティングに於いて、還元又は非還元のＣ３ｃ又はＣ ３ｄに対しては陽性を示さなかった。このことから、この一つの抗体は、Ｃ３α 断片に結合していると思われる（１１）。

第　■　表 Ｃ３Ｃ３ｂ１　Ｃ３ｃ　Ｃ３ｄ αβ７０　ｋｄ　３６　ｋｄ　２５　ｋｄＩＩＩ　１３０　ＮＤ　４　７　１ ループＩＩ　び■の　Ｃ３（Ｄ　体性異性のまとめ第２図に示すように、変性又 は変性−還元Ｃ３によって表現されるＣ３（Ｄ）抗原により優先的に阻害される モノクローナル抗体は、抗Ｃ３（Ｄ）抗体と定義される。抗Ｃ３（Ｄ）特異性を 有する、グループＩＩの３抗体及びグループ■の１３抗体を選択し、それらの性 質を第■表にまとめた。それらは全てα鎖断片に結合した。

一つの例外を除いて、Ｃ３ｃの３６ｋｄ断片に結合する抗体は、結合Ｃ３に対し ては完全に非反応性である。その唯一の例外は、Ｃ３ｂ及びＣ３ｂ１の両方に結 合する。７つの抗体が２５ｋｄ断片と結合し、面白いことには、このうちの６つ が粒子結合Ｃ３ｂ１１．：特異的に結合した。これは０３ｇに結合すると考えら れていたモノクローナル抗体の場合と同様であった。Ｃ３ｄに結合した抗体は結 合Ｃ３には非反応性だった。

第　■　表 阻害　ＥＬＩＳ＾　イムノブロッティング粒子結合　可溶性　Ｃ３ｃ　Ｃ３ｄ Ｃ３ｂ　Ｃ３ｂ１　Ｃ３ｂ　Ｃ３ｂ１　２５ｋｄ　３６ｋｄ１）　１００℃のＳ Ｏ３変性で生成された４０ｋｄ断片への結合−に　ける　疫複合体分析 どの程度のレベルの免疫複合体が検出可能であるか、それらの免疫複合体が一群 の患者及び正常個人にどのように分布しているのか、そして、Ｃ３上の異なる新 抗原に基づいて検出する際にそれら免疫複合体が互いにどのように相違している かに関する予備的で概略的な見解を得壷為に、いくつかのヒト血漿を分析した。

Ｃｌｑ結合免疫複合体の分析用に集めた少数グループの患者の血漿を少数グルー プの健康な血液提供者の血漿と比較した。この少数グループの患者は免疫疾患と 思われるヘテロジニアスな混成であり、従って、様々な組成及びけの免疫複合体 が期待できる。Ｃ１０分析との正の相関（１５）は期待されなかったし、実際に 検出されなかったので、一定の期間中にＣｌｑ分析用に集められた全ての血漿試 料を分析した。この分析はＣｌｑ分析の陽性又は陰性に拘らず実施した。

三つのモノクローナル抗体を選択し、マイクロタイターウェルに吸着させ、免疫 複合体化Ｃ３を血漿から分離するのに使用した。そのうちの一つのモノクローナ ル抗体は結合Ｃ３ｂ及びＣ３ｂ１で露出し、４０ｋｄの分子量のＣ３ｃ　ａ断片 に位置する新抗原に対するものであった。二番目のモノクローナル抗体は結合ｃ ３ｂ；で露出するが結合Ｃ３ｂでは露出しない新抗原に対するものであり、Ｃ３ ｄ、Ｑのｑ部分に対すると考えられているものである。この両者はグループ■に 属するものモノクローナル抗体である。三番目のモノクローナル抗体はグループ ＩＩに属し、Ｃ３ｃの２０ｋｄ断片に対するもので結合Ｃ３ｂ　ｉと反応するも のである。

統計処理９例えば、正常値の範囲を決定する作業は、試料数が少なくヘテロジニ アスであるために、まだ行っていない。

特に、患者はいかなる典型的な正規分布をも示していない。第５．１−５．６　 ｆｆｌを見ると、分布がかなり不規則であり、いくつかの場所でスーパーインボ ーズが起こっていることがわかるであろう。同様に、変動幅は患者の間でより大 きく、これはこの値のいくつかは異常値であることを示しているものと解釈する ことができるであろう。

正常個人よりも低いレベルの患者グループが存在することは大変興味深いことで あり、試験系の感度が高いことを示しているものであろう。以前の抗Ｃ３に基づ いた分析（１，３０）及び他のいくつかの免疫複合体分析（１４，１５）は、正 常値が大部分であって、患者の値の多くは最低の検出可能なレベルにある。特に 、正常個人より低い患者中のレベルは一般的でない現象である。−次元からの観 察ではなく、二つのモノクローナル抗体を用いた分析からの値を二次元系座標に プロットすると、正常値と患者の値の差異が増幅されることに気が付かれるであ ろう（第６図参照）。複数のエピトープに関する反応性の変動は、「免疫複合体 」というのはかなり多量のへテロジエニティを包含する広く総括的な概念である という理論（１５）によって支持されるであろう。多次元表記により、例えば、 （ａ）免疫複合体の含有レベルが低く、従って、排出過程の後期段階から誘導さ れる代謝物の相対的な蓄積がある血漿中の免疫複合化Ｃ３ｄの高い割合を（ｂ） Ｃ３ｄの割合がより正常である血漿から識別することが可能となる。

グループ■の１４種のＣ３（Ｄ）モノクローナル抗体の分析から、大量増殖した モノクローナル抗体の残りも優先的に溶液中の０３（Ｄ）上のエピトープと反応 すると想定することができる。また、これらの抗体は粒子結合Ｃ３の生理的形態 上に発生する新抗原とかなりの程度反応すると考えることができよう。これら新 抗原のかなり多くのものは、恐らく、凝集ヒトＩｇＧの形態の免疫複合体又はそ のモデルと結合したＣ３上に見出だされるものと思われる。更に、前記抗体は、 種々の型の免疫複合化Ｃ３に対する特異性が互いに異なると思われる。予備的な 試験によって明らかにされたように、少なくとも、二種の変異形態が存在する。

この理由によって、前記抗体は、免疫複合体化Ｃ３の異なる面を検出でき、それ らを組合わせることによって、得られる情報（７）Ｎ像度及び質を高めることが できる。従って、グループ■の残Ｖ）のクローンが、免疫複合体の他の性質を際 立たせる他の新抗原に対する抗体を含んでいるかも知れないと考えることは、不 合理なことではない。

第　１　図 Ｃ３（ＳＮ）　（０）　、　Ｃ３（ＳＤ）　（・）及びＣ３（Ｄ）（△）の連続 希釈物を、ラビットポリクローナル抗Ｃ３（Ｄ）（Ｉ）、ＳＤＳ変性に対するマ ウス抗血清（Ｉ［）及び変性−還元Ｃ３に対するマウス抗血清＜ＩＩＩ）への結 合に関して阻害ＥＬＩＳＡに於いて競合させた結果を示す。

第　２　図 阻害ＥＬＩＳＡに於ける、Ｃ３（ＳＮ）、　Ｃ３（ＳＯ）又はＣ３（Ｄ）の各２ ５ｐ＠０１を、グループＩ−１［［の個々のモノクローナル抗体に対する結合に 関１）で競合させた結果を示す。

１−１一旦 阻害ＥＬＩＳＡに於ける、正常ヒト血清（ＮＨ３）のＣ３ｂ、　Ｃ３ｂ１．　Ｃ ３の各２．５　ｐｓｏｌ及び熟成ヒト血清（ＡＩＩＳ）の０３断片２．５　ＤＩ ＩＯＩを、グループＩ−１［［の個々のモノクローナル抗体に対する結合に関し て、競合させたものを示す。

各０３調製物に対する異なるグループの平均値±ＳＥＮが表わさＥＡＣ１４°ｘ ｙ２３ｂ　、ＥＡＣ１４°ｘｙ２３ｂＢｌｋ　Ｕ　２ｙＣ３ｂＨ７）　粒子結合 Ｃ３（７）各２．５　ｐｍｏｌを、阻害ＥＬＩＳＡに於いて、グループＩ−Ｉ［ １の個々のモノクローナル抗体に対する結合に関して競合させたものを示す。

第　５　図 ′　明１１１！中で開示した三種のモノクローナル抗体を使用して実施した分析 に於ける、患者材料（ａ）及び正常材料（ｂ）の５分布を示すヒストグラムであ る。■で使用した抗体は、結合Ｃ３ｂ及びＣ３ｂ１上に露出し、Ｃ３ｃ部分に位 置する新抗原に対するものである。■で使用した抗体は、結合Ｃ３ｂ　ｉ上に露 出し、Ｃ３ｄ、ｌ；ｌに位置する新抗原に対するもの、■で使用した抗体は、結 合Ｃ３ｂ１上に露出し、Ｃ３ｃ部分に位置する新抗原に対するものである。

第　６　図 第５図の分析値に相当するものであるが、それらを互いにプロットしたものであ る。正常値（ＩＩ）　、及び患者材料から得られた結果（０）を示している。

第　６．１　図 工及び■に相当する分析値 （以下余白） ４活矢献 Ｌ　Ａｑ＊ａｄｑ、Ｍτ　ｅｔ　ａｌ　（Ｌ９８５１　。　Ｊ　Ｃ］、ｉ：ｚ　 ｒｉｖａｓ＝　７６：　Ｌ４１３−２６２＋　Ｂａ：ｇｓｒ、Ｒａｔ　ａｎ　（ １９８２）、Ｊ　工＝ｘｕｎｏｌ　１２９：　２０４２−５０コ、　Ｃａｒｌｓ ｓｏｎ、Ｍ　ｅ＝　ａｌ　（１９８５）、Ｊ　ニーｕｎｃＬ　Ｍｅｔ″ｈ７９： ８９−９８４、　ｏｏｉ、τ　ｅｔ’　ａｎ　（１９８４）、’Ｊ　Ｋｒｘｕｎ ｏＬ　Ｆ、ｅセ！ｉ　６９：　９５−１０４７、　Ｆ！ａｒ、５ａｒｓ、　Ｏａ ｔ　ａＬ　（１９８３）　、　、ｆｆ　Ｘ＝ｍｕ＊ｏＬ　Ｍｅｔｈ　６１：　２ ４５−５２８、・′に５ｈｉｅｒ　ｅｔ　ａＬ　（１９７５１，２５６：　４９ ５−７９、ＬｉａｄｅＬｌ、　Ｐ　ｅセミｌ　（’１９８６１　１Ｍａｒ＋ｑｓ ｃ：ｉｐｔ　ｉｎ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｌｌｏ、　ＬａｃｍａｒＬｎ、ＰＪ 　ｅｔ　ａｍ　（１９８０）、工＝ｗ＊ｒ＋、ｏＬ　４Ｌ：　５０コー１５ＬＬ 、Ｌａｃ？＋ｘａｎ−ｑ、　ＰＪ　ａｔ　ａｌ　（１’ｊ８２１　、　Ｊ　Ｅｘ ｐ　Ｍｅｄ　１５６：　２０５−１６１２、Ｌａｃ？、ｍａｒ＋ｎ、　Ｐｊ　ａ ｔ、　ａｎ　（１９８３）　、　ＶＯＸ　Ｓａｎｇ　４５：　３６７−７２１° ３．　Ｌａｅ、ｚｌ、ｉ、　ｔｉｃ　ｅニーａｌ　（１９７３１、Ｊ　Ｍｏｌ　 Ｂｉｏｌ　８０：　５７５−９９１４、Ｌａｍｂｅｒ？、　ｐｇ　ｅｔ　ａｔ　 （１９７８＋　、　Ｊ　Ｃ１１ｒＬＬａｂ工＝ａｎｏｌ　１：　１４５１７、Ｎ ｕＳｓｏｎ、　ＵＲｅヒａｉ　（１９７５１、Ｊ　ｒ＝ｕｒ＋ｏｌ　１１４：　 ８１５−２２１９、Ｎ１Ｌｓｉｏｎ、じＲａｔこＬ　１１９８２＋　、　ＭｃＬ 　Ｘ＝北。Ｌ　Ｌ９＝　１２９１Ｌ９．　Ｎｉ１ｓｓＣｒ、、Ｌ’Ｐ、！セ　ａ ｎ　（１９８０１，ＭＣＬ　ニーｔ；、ｏｌ　１７：　１３１９−３３：Ｏ＋　 Ｎ１Ｌｓｓ：ｎ、じＲｅｔ　ａｉ　（１９８２１、Ｊ　Ｌ＝＋ｖｒ：ｏｎ　１２ ９＝　２５９４−９７２１　Ｒｃｄａ′：ＬＬ、Ｅ　（１９８５）、Ａｃ？ａ　 Ｐａｔ！：ｃｌ　ＨＬｃ：：ｂＬｏｌ　工ｖａａｒ、ｏＬ、Ｓｅａ二ｄＳａｃヒ 　Ｃ９コニ　１２５−コ０ ２２、５ｃａｕＬｚａ攪　Ｍ　ｅｔ　ａＬ　［１９７８１、Ｎａｔ＝＝　２７６ ：　２６９−７０２３、　５ｅｋｉｔｉ、　Ｋ　ｅｅ　ａｌ（１９８４）　、　 Ｃｈｉｎ　Ｅｘｐ　慕ｕｎｏｌ　５５：　４８７−９４２４、τａｃｋ、　ＢＹ 　ｅ：　ａｎ　（１９８１）　、　Ｍａｔｈ　Ｅ：ｚｚ；ｍｏｌ　８０＝　６４ −１ＯＬ２５、　Ｔａｍｅｒｉｕｓ、ＪＤ　ａｔ　ａｌ　（１９８２）、Ｊ　Ｋ 二ｍａｒ、ｏｌ　１２８：　５１２−４２６、Ｔａ５ｅｒｉｔ！ｓ、ＪＤ　ｅｔ 　ａｎ　（１９８５）、Ｊ　ｒニロｕｉｏｌ　１３５：　２０１５−９２７、τ ａｙＬｏｒ、ＪＣｅｔ　ａｌ　（１９フフ）、Ｂｉａｃ！−、ｅｚｉｓ＝＝７　 １６＝　３３９０−６２日、τｈｃｍａｓ、ＭＬ　ｅｔ　ａｌ　（１９８２１、 Ｐ＝Ｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　）９：　１０５４−５８２９、Ｗｈｉ ｔ？、ｅａｄ、ＡＳ　ａｔ　ａｌ　（１９８１）、Ｅｕ：　Ｊ　Ｉニニｕｎｏｌ 　１１：　１４０−６３１　Ｂｒ１ｔｔｉｓｋａ　ｐａセ＝ｒｓｔｅｔ　２，１ ０９，９３２　（工ｒｚｖｅａｔｏｒ　Ｐａｒ＝ａｅ　Ｄ）。

３３、　Ｋａｎａｙａ：ｍ、Ｙ　ａｔ　ａＬ　（’１９８６）、Ｊ　−ニーｕｎ ｏｌ　Ｍｅｔｈ　８８：　ココ−３６コ４．　Ｌａｍｂｒｉｓ、ＪＤ　ａｔ　ａ Ｌ　（１９８５１，工Ｃ５Ｕ　５ｈｏｒｔ　Ｒｅｐ　２　（λｖｄ　Ｇａ！１ａ τｅｃｈｎｃｌｌ　：　２Ｄ−４ ミニＧＩ Ｅ’、ＩＧ　２ ；丁シ大４°ｒ５−　ｃコ　（２５ｐｍｏｌ）？二Ｃ３ 躬シ１％　Ｃ３ＪＲｇ　（２，５ｐｍｃｌ）ＴＧ　４ Ｆ：Ｇ　５ Ｆ工Ｇ　６．２ 国際調査報告 １．。、＋ｍ　ＡｅｅＮ。やＮ、三Ｃτ、Ｓ三８７．Ｃｏ；−２

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＣ３のＣ３ｂ領域中に存在する個々の新抗原に対する抗体調製物であっ て、（ａ）ジスルフィド結合が還元されている変性ヒトＣ３のａ又はβ鎖のＣ３ ｂ領域中の抗原決定基と免疫化学的に反応し、（ｂ）元のヒトＣ３とは免疫化学 的に反応しないことを特徴とする前記抗体調製物。
2. ２．前記鎖のＣ３ｂ領域内に含まれ、ｃ３ｂｉ，ｃ３ｄ，ｇ，ｃ３ｄ，ｃ３ｇ及 びＣ３ｃ領域から成る群から選択された少なくとも一つの領域と免疫化学的に反 応することを特徴する、請求の範囲第１項に記載の抗体調製物。
3. ３．免疫化学的に反応する抗原決定基が、生理的に発生する循環免疫複合体に共 有結合したＣ３断片に相当するＣ３領域中に位置することを特徴する、請求の範 囲第１項又は第２項のいずれかに記載の抗体調製物。
4. ４．免疫化学的に反応し得る抗原決定基が、可溶性（遊離）生理的Ｃ３又はＣ３ 断片中では反応不可能であるが、これら断片が循環免疫複合体に結合した場合に は反応可能であることを特徴する、請求の範囲第１項，第２項又は第３項のいず れかに記載の抗体調製物。
5. ５．（ａ）ヒトＣ３中の新抗原及び（ｂ）ａ及びβ鎖を結合していたジスルフィ ド結合が還元されている変性ヒトＣ３のａ又はβ鎖のＣ３ｂ領域中の抗原決定基 の双方に免疫化学的に反応する抗体を産生する能力のある細胞をして該抗体を分 泌させるようにし、その後、該抗体を公知方法で精製し、更に、適宜公知方法で 単離及び／又は誘導することにより生産されたことを特徴とする、請求の範囲第 １項，第２項又は第３項のいずれかに記載の抗体調製物。
6. ６．請求の範囲第１項，第２項，第３項，第４項又は第５項のいずれかに記載の 抗体調製物が反応する新抗原を担持するＣ３断片との免疫化学的結合への請求の 範囲第１項。第２項，第３項，第４項又は第５項のいずれかに記載の抗体調製物 の使用。
7. ７．ヒトＣ３のＣ３ｂ領域中の新抗原に対する特異性を有する抗体調製物の生産 方法であって、（ａ）ヒトＣ３中の新抗原及び（ｂ）ａ及びβ鎖を結合していた ジスルフィド結合が還元されている変性ヒトＣ３のａ又はβ鎖のＣ３ｂ領域中の 抗原決定基の双方に免疫化学的に反応する抗体を産生する能力のある細胞をして 該抗体を分泌させるようにし、その後、該抗体を公知方法で精製し、更に、適宜 公知方法で単離及び／又は誘導することにより生産することを特徴とする前記方 法。