KR101729056B1 - 모노클로날 항체 및 이것을 이용한 면역학적 측정 방법 - Google Patents

모노클로날 항체 및 이것을 이용한 면역학적 측정 방법 Download PDF

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Abstract

인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하며, 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집체를 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 및 당해 모노클로날 항체를 사용하는 면역학적 측정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 종래법에서는 저지할 수 없는 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응을 억제하는 억제제 및 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응이 억제된 면역학적 측정 방법의 제공을 과제로 한다. 인간 면역 글로불린 M에 반응하는 모노클로날 항체의 선별에 있어서, 용액 상태에서의 반응성을 평가 지표로 하고, 1종류로 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 있고, 실용적인 면역 응집 측정을 달성할 수 있는 신규의 모노클로날 항체를 얻어 상기 과제를 해결하였다.

Description

모노클로날 항체 및 이것을 이용한 면역학적 측정 방법{MONOCLONAL ANTIBODY, AND IMMUNOASSAY USING SAME}
본 발명은 인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하며, 용액 상태에서도 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 응집을 일으킬 수 있는 모노클로날 항체, 이 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편, 및 이들을 사용하는 면역학적 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트, 또한 그 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 비특이 반응의 억제제 및 이것을 이용한 면역학적 측정 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제 및 이것을 이용한 면역학적 측정 방법에 관한 것이다.
진단약에서 범용되는 측정 방법으로서, 미리 애널라이트(측정 대상 물질)를 항원으로 하여 제조된 항체를 이용하여 피험 시료 중에 존재하는 애널라이트를 검출하는 면역학적 측정 방법을 들 수 있다. 그 중에서도 면역 응집 측정 방법은 항체에 의한 애널라이트의 가교 작용에 의해 형성되는 격자 형상의 면역 복합체의 응집 정도에 기초하여, 시료 중의 애널라이트를 정성 또는 정량적으로 측정하는 방법이다. 면역 응집 측정 방법은 광학적인 검출에 적합하고 자동화도 용이한 점으로부터, 다양한 검사 항목에 적용되고 있는 범용성이 높은 측정 방법이다.
한편, 면역 응답의 최초기에 생산되는 인간 면역 글로불린 M은 혈장 중에 대략 50 내지 200㎎/dL(500 내지 2000㎍/mL) 포함되고, 기준 농도 범위 외의 낮은 값에서는 다발성 골수종이나 단백 누출성 위장증, 높은 값에서는 교원병이나 매크로 글로불린 혈증과 같이 여러 가지 질환의 가능성을 나타내는 마커로 되어 있다.
인간 면역 글로불린 M 진단약에 관해서도 면역 응집 측정 방법을 원리로 하는 제품이 복수 실용화되고 있는데, 지금까지는 폴리클로날 항체가 이용되어 왔다.
폴리클로날 항체는 다양한 반응성을 갖는 항체의 집합체이고, 애널라이트 분자 상의 복수의 에피토프(항원 결정기)에 결합하기 때문에 응집력이 강하고, 분자 내에 동일한 에피토프가 복수 존재하지 않는 애널라이트의 면역 응집 측정 방법에 최적인 항체이다. 그러나 그 반면, 복수의 에피토프와 결합하는 폴리클로날 항체는 특이성이 낮다는 큰 과제를 갖고 있다. 실제로 인간 면역 글로불린을 예로 들면, 체내에는 면역 글로불린 G를 비롯하여 구조가 유사한 5종류의 면역 글로불린이 존재하기 때문에, 면역 글로불린 M 특이적인 폴리클로날 항체를 조제할 때에는 그 외의 면역 글로불린과 교차 반응하는 항체 획분을 제거하는 처리 조작이 불가결하여 팽대한 수고와 노력을 필요로 하고 있었다.
한편, 단일의 항체로 구성되는 모노클로날 항체는 특정의 에피토프에 결합하기 때문에 특이성이 높고, 조제가 용이하고 성능이 안정되고, 또한 근년에는 유전자 재조합을 이용한 수식이나 개변도 용이해진 점으로부터, 진단 용도뿐만 아니라 치료 분야에서도 그 존재감을 높이고 있고, 그 적용 영역은 점점 확대되고 있다.
원리적으로는 동일한 에피토프를 복수 갖는 애널라이트의 면역 응집 측정 방법에 있어서 모노클로날 항체의 이용도 가능한데, 분자 내에 동일 에피토프가 10개소 존재하도록 하는 면역 글로불린 M에 관해서는, 모노클로날 항체에서는 효과적으로 응집을 형성할 수 없다고 생각되고 있고, 면역 응집 측정 방법에 모노클로날 항체가 이용되는 일은 없었다. 혈장 면역 글로불린 M은 도 1에 나타내는 바와 같이 Y자형의 단위 구조 5개가, Y자형의 꼬리부를 중심으로 선단부를 외주측을 향하여 배위하여 별 모양을 형성하고 있다. Y자형은 면역 글로불린의 단위 구조이고, 힌지 부분이 유연하게 가동하는 것은 잘 알려져 있지만, 또한 비특허 문헌 1의 전자 현미경 상에 나타나는 바와 같이 5개의 Y자형 단위 구조가 (b) Y자형의 꼬리부를 중심으로 선단부를 외주측을 향하여 평면상으로 배위한 별 모양 구조나, (c) Y자형의 꼬리부를 지점으로 하여 선단부를 동일 방향을 향하여 배위한 「게 모양」이라고 기술되는 구조를 형성할 수 있는 점으로부터, Y자형 꼬리부의 복합부도 유연하게 가동하는 것이 확인되어 있다.
이와 같이 면역 글로불린 M 분자 중의 각 서브 유닛의 접합부는 유연하게 가동하여 입체적인 구조가 용이하게 변화하기 때문에, 항 면역 글로불린 M 모노클로날 항체는 2분자의 면역 글로불린 M에 결합하여 분자간 가교를 형성하지 않고, 대부분이 도 2에 나타낸 바와 같이 1분자의 면역 글로불린 M 상의 2개소의 에피토프와 결합하는 소위 분자내 가교의 상태로 된다. 따라서, 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 방법에 있어서, 모노클로날 항체에서는 효율적으로 응집을 형성할 수 없다고 생각되어, 할 수 없이 복수의 에피토프에 결합하는 폴리클로날 항체가 이용되어 왔다. 또한, 모노클로날 항체을 이용할 수 있었다고 하더라도 그것은 복수의 모노클로날 항체를 조합하여 폴리클로날 항체의 작용을 시키는 예이고(예를 들면, 특허 문헌 4 실시예 3), 1종류의 모노클로날 항체로 인간 면역 글로불린 M을 응집시키도록 하는 성질을 갖는 모노클로날 항체의 존재는 지금까지 알려져 있지 않았다. 또한, 지금까지 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 제조시의 선별 조작은, 인간 면역 글로불린 M 또는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 고상화한 조건 하에서 평가한 반응성의 강도를 지표로 하고 있고, 용액 상태에서의 양자의 반응성이 지표로 되는 일은 없었다(특허 문헌 1 내지 3).
또한, 근년에는 기술의 진보에 따라 다양한 물질을 항원으로 한 항체의 제조가 가능해진 점으로부터, 면역학적 측정 방법을 이용한 검사용 시약의 이용 건수는 증가 일로를 걷고 있으나, 이에 수반하여 종래보다 더욱 고성능이 요구되어 비특이 반응의 발생을 엄밀하게 회피할 필요성이 발생하게 되었다.
비특이 반응이란, 피험 시료 중의 인자에 의해 특이 반응에 기초하지 않는 결합이 촉진되거나, 특이적인 면역 반응이 방해받는 현상으로 측정 과오의 원인이 된다. 비특이 반응의 원인 인자로서 이호성 항체나 류머티즘 인자(RF)의 존재가 명확해지고 있다.
이호성 항체란, 면역학적 측정 방법의 주성분인 동물 유래 항체에 대하여 반응성을 나타내는 인간 항체의 총칭이고, HAMA(인간 항 마우스 면역 글로불린 항체)가 대표적인 것으로서 알려져 있다. 그 성인으로서는 식사나 동물과의 접촉, 생물학적 제제의 투여와 같은 무자각 하에서의 항원 감작에 의해 생산되는 케이스에 더여, 항원 미감작의 항체가 이호성을 나타낼 가능성도 있기 때문에 해명되어 있지 않은 부분도 많다. 한편, 류머티즘 인자는 관절 류머티즘 환자에게 출현하고 결합 부위도 특정되어 있는 점으로부터, 이호성 항체와는 별도의 개념으로서 해석되고 있으나, 동물 유래 항체에 대하여 반응성을 나타낸다는 성질은 공통되어 있고, 비특허 문헌 2에 기재된 바와 같이 그 실체는 모두 인간의 면역 글로불린 G나 면역 글로불린 M인 것이 알려져 있다.
지금까지도 이호성 항체에 의한 비특이 반응의 대책으로서, 비특허 문헌 3, 4 기재의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 성분으로 하는 이호성 저지 시약 HBR이 제품화되어 있고, 면역학적 측정 방법을 원리로 하는 각종 검사에서 이용되어 왔다.
또한, 측정에 이용하는 항체와 동종 동물로부터 조제한 인간 면역 글로불린 M형 자연 항체에 대한 폴리클로날 항체를 첨가하는 특허 문헌 5의 비특이 반응의 억제제나, 류머티즘 인자의 반응 부위에 대한 각종 동물 항체를 첨가하는 특허 문헌 6 기재의 비특이 반응 억제책도 고안되어 있다. 그러나 모두 폴리클로날 항체의 이용이기 때문에, 각종 동물에 면역하기 위한 대량의 항원을 장기적으로 필요로 하고, 또한 전자는 자연 항체에 의한 비특이 반응만 억제할 수 있고, 후자가 인식하는 RF 인자의 반응 부위는 처음부터 가변성을 갖기 때문에, 그 비특이 반응의 억제 효과는 한정적이다. 실제로 면역학적 측정 방법을 이용한 검사 항목 및 검사 수의 증가에 수반하여 종래의 대책법으로는 비특이 반응의 억제 효과가 충분히 발휘되지 않는 검체가 발견되게 되었다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 소60-42400호 공보 특허 문헌 2: 일본 특허 공개 소63-58260호 공보 특허 문헌 3: 일본 특허 공표 평6-504424호 공보 특허 문헌 4: 일본 특허 공개 소60-237363호 공보 특허 문헌 5: 일본 특허 제4065600호 공보 특허 문헌 6: 일본 특허 공개 평07-012818호 공보
비특허 문헌 1: 로이트 면역학 요설 원자 제3판 도 2. 16 비특허 문헌 2: 임상 화학; 제23권 보책 175a-1∼175a-10(1994) 비특허 문헌 3: 이호성 저지 시약 HBR에 관계되는 선전 자료(나가세산교 1993) 비특허 문헌 4: CLIN. CHEM. 45/7, 942-956(1999)
본 발명은 인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하며, 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집체를 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체, 이 모노클로날 항체의 기능성 단편, 및 이들을 사용하는 면역학적 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트, 또한 이 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공하는 것을 과제로 한다.
또한, 본 발명은 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제 및 이것을 이용한 면역학적 측정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 행한 결과, 인간 면역 글로불린 M에 반응하는 모노클로날 항체의 선별에 있어서, 용액 상태에서의 반응성을 평가 지표로 함으로써, 1종류로 인간 면역 글로불린 M을 분자간 가교하여 응집할 수 있어 실용적인 면역 응집 측정을 달성할 수 있는 신규의 모노클로날 항체를 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 이와 같이 하여 얻어진 모노클로날 항체는, 종래의 고상화된 항원을 이용하는 평가법에서는 반드시 높은 반응성을 나타내는 것은 아닌 모노클로날 항체였다.
또한, 본 발명자들은 놀랍게도 상기 1종류로 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 있는 성질을 갖는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체에 의해, 종래법에서는 저지할 수 없는 비특이 반응이어도 강하게 억제되는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명의 다른 목적은 1종류로 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 포함하는 비특이 반응의 억제제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 항원 항체 반응을 이용한 면역학적 측정 방법에 있어서, 1종류로 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 첨가함으로써, 비특이 반응을 억제하여 정확한 측정값을 얻는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트에 관한 것이다.
구체적으로는 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.
(1) 인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하며, 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집체를 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체.
(2) 이하의 공정을 포함하는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체의 제조 방법에 의해 취득된 상기 (1)에 기재된 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체:
공정 1) 인간 면역 글로불린 M을 항원으로 하여 항 인간 면역 글로불린 M 항체 생산 하이브리도마를 취득하는 공정,
공정 2) 공정 1에서 취득한 하이브리도마가 생산하는 항체를 용액 상태의 인간 면역 글로불린 M과 접촉시켜 당해 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집체를 형성할 수 있는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 공정, 및
공정 3) 공정 2에서 선택된 하이브리도마가 생산하는 항체를 취득하는 공정.
(3) 이하의 (a) 또는 (b)인 항체:
(a) FERM BP-11134인 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체, 또는
(b) 상기 (a)의 항체와 교차 반응성을 갖는 상기 (1)에 기재된 항체.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편.
(5) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 및/또는 상기 (4)에 기재된 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편을 이용하는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 인간 면역 글로불린 M을 측정하는 면역 응집 측정 방법.
(6) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 및/또는 상기 (4)에 기재된 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편을 이용하는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 인간 면역 글로불린 M을 측정하는 면역 응집 측정 시약 및 측정 키트.
(7) 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 모노클로날 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 하이브리도마.
(8) FERM BP-11134인 하이브리도마.
(9) 이하의 공정을 포함하는 것으로 이루어지는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체의 제조 방법:
공정 1) 인간 면역 글로불린 M을 항원으로 하여 항 인간 면역 글로불린 M 항체 생산 하이브리도마를 취득하는 공정,
공정 2) 공정 1에서 취득한 하이브리도마가 생산하는 항체를 용액 상태의 인간 면역 글로불린 M과 접촉시켜, 당해 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집체를 형성할 수 있는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 공정, 및
공정 3) 공정 2에서 선택된 하이브리도마가 생산하는 항체를 취득하는 공정.
(10) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 및/또는 상기 (4)에 기재된 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편을 포함하는, 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제.
(11) 시료 중의 측정 대상 성분을 측정용 항체 또는 측정용 항원과의 항원 항체 반응에 의해 측정을 행하는 면역학적 측정 방법에 있어서, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 및/또는 상기 (4)에 기재된 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편을 포함하는 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제의 첨가에 의해, 상기 항원 항체 반응 이외의 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정 방법.
(12) 측정용 항체 또는 측정용 항원이 불용성 담체에 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (11)에 기재된 면역학적 측정 방법.
(13) 불용성 담체가 라텍스, 금속 콜로이드, 실리카를 포함하는 상기 (12)에 기재된 면역학적 측정 방법.
(14) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 및/또는 상기 (4)에 기재된 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편을 포함하는 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제 및 시료 중의 측정 대상 성분을 측정하기 위한 측정용 항체 또는 측정용 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정 시약 및 측정 키트.
(15) 측정용 항체 또는 측정용 항원이 불용성 담체에 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (14)에 기재된 면역학적 측정 시약 및 측정 키트.
(16) 불용성 담체가 라텍스, 금속 콜로이드, 실리카를 포함하는 상기 (15)에 기재된 면역학적 측정 시약 및 측정 키트.
본 발명의 모노클로날 항체에 의해 인간 면역 글로불린 M 특이적인 검출 방법을 제공함과 함께, 고품질이고 저렴한 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 시약 및 측정 키트를 제공하는 것이 가능해졌다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체의 선택 방법은 용액 상태에서의 응집성의 강도를 지표로 선택되기 때문에, 정밀도 높게 목적으로 하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있어 효율적이다.
또한, 본 발명의 비특이 반응의 억제제에 의하면, 면역 글로불린 M과 1:1의 분자내 가교를 형성하지 않고 면역 글로불린 M의 영향을 효율적으로 중화할 수 있기 때문에, 이것을 이용한 면역학적 측정 방법, 면역학적 측정용 시약 및 측정 키트에서는, 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 종래형의 비특이 반응에 더하여 기지의 대책으로 회피할 수 없었던 비특이 반응도 억제할 수 있다. 따라서, 폭넓은 측정 항목 및 시료에 대하여 종래의 측정 방법보다도 정확한 측정값을 부여하는 것이 가능해져서 검사 수가 증가 경향에 있는 면역학적 측정 방법에 바람직하게 이용된다.
도 1은 인간 면역 글로불린 M의 구조 모식도이다.
도 2는 인간 면역 글로불린 M과 종래의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체의 결합 양식을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 이용한 면역 응집 측정 시험 결과를 나타내는 도면이다(실시예 1).
도 4는 PSA 측정 라텍스 시약으로 정상 검체를 측정하였을 때 본 발명의 비특이 반응의 억제제, 대조의 비특이 반응의 저지제의 영향을 나타내는 도면이다.
도 5는 PSA 측정 라텍스 시약으로 비특이 반응 검체를 측정하였을 때 본 발명의 비특이 반응의 억제제, 대조의 비특이 반응의 저지제의 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 6은 인슐린 측정 시약으로 비특이 반응 검체를 측정하였을 때 본 발명의 비특이 반응의 억제제, 대조의 비특이 반응의 저지제의 억제 효과를 나타내는 도면이다.
(항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체)
본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체는 인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하며, 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M 분자끼리의 분자간 가교를 형성하고, 1종류로 면역 응집 측정이 가능하다는 특성을 갖는 모노클로날 항체이면 특별히 한정되지 않는다. 여기서 인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하는 것이란, 인간 면역 글로불린 M과 항원 항체 반응을 일으키지만, 다른 인간 면역 글로불린과는 항원 항체 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 지금까지 면역 응집의 형성 유무에 착안한 면역 글로불린 M에 대한 모노클로날 항체의 탐색은 행해지고 있지 않고, 본 발명의 1종류로 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체는 신규이다.
또한, 종래의 항 면역 글로불린 M 모노클로날 항체는 2분자의 면역 글로불린의 분자간을 가교하는 것이 아니라, 1분자의 면역 글로불린의 분자내를 가교할 수밖에 없었다. 그러나, 본 발명의 1종류로 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 있는 모노클로날 항체는 인간 면역 글로불린 M의 분자간을 가교할 수 있기 때문에, 인간 면역 글로불린 M의 영향을 효율적으로 중화하여 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응을 강력하게 억제하는 것이 가능해져서, 후술하는 바와 같이 비특이 반응의 억제제로서 바람직하게 이용할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체의 구체예로서는, FERM BP-11134인 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체를 들 수 있고, 또한 FERM BP-11134인 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체와 교차 반응성을 갖는 항체도 본 발명의 항체의 범위에 포함된다. FERM BP-11134인 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체와 교차 반응성을 갖는 항체에는, 당해 항체와 동일한 에피토프(항원 결정기)의 아민산 서열을 특이적으로 인식할 수 있는 항체가 포함된다.
(기능성 단편)
본 발명에는 효소적 소화에 의해 얻어지는 그 모노클로날 항체의 Fab 부분을 포함하는 기능성 단편이나 유전자 재조합에 의해 제조되는 그 모노클로날 항체의 Fab 부분을 포함하는 기능성 단편에 관계없이, 그 모노클로날 항체에서 유래하는 Fab 부분을 포함하는 기능성 단편을 갖는 것이면 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 기능성 단편의 「기능성」의 의미는 구체적으로는 인간 면역 글로불린 M과의 결합능을 갖는 것을 말한다.
(측정 대상 시료)
본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 또는 그 모노클로날 항체 단편을 이용한 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 방법의 측정 대상 시료는 생체 시료이면 되고, 예를 들면 혈액, 혈청, 혈장, 소변 등의 체액이다.
(측정 방법)
본 발명의 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 방법은, 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체와 측정 대상 시료를 임의의 방법으로 혼합하여 면역 응집을 형성시켜, 인간 면역 글로불린 M을 측정하는 측정 방법이면 특별히 한정은 없다. 또한 면역 응집의 형성을 보다 촉진시키기 위해서 이 모노클로날 항체와는 에피토프가 상이한 다른 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 병용할 수 있고, 병용하는 모노클로날 항체의 특성에 관해서는 특별히 제한이 없다.
(면역 응집 측정 시약 및 측정 키트)
본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 또는 그 모노클로날 항체 단편을 이용한 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 시약 및 키트는, 시료의 이온 강도나 침투압 등을 완충하는 성분이나 면역학적 응집을 증강하는 성분을 포함할 수도 있다. 상기 시료의 이온 강도나 침투압 등을 완충하는 성분으로서는, 예를 들면 아세트산, 시트르산, 인산, 트리스, 글리신, 붕산, 탄산, 굳 완충액이나 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등을 들 수 있고, 상기 면역학적 응집을 증강하는 성분으로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 인지질 중합체 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 또는 그 모노클로날 항체 단편을 이용한 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 시약 및 측정 키트는, 광학적인 측정이 가능하여 분광 광도계나 분광 광도 측정을 측정 원리로 한 히다치사 제조 자동 분석 장치 외에 도시바사 제조 TBA 시리즈, 닛폰덴시사 제조 BM 시리즈, 올림퍼스사 제조 AU 시리즈, 세키스이메디컬사 제조 CP2000이라는 범용 자동 분석 장치, 나아가 근적외를 측정 파장으로 한 장치(미츠비시가가쿠야토론사 제조 LPIA 등), 산란 광 강도를 측정하는 장치(데이드베링사 제조 BN 시스템 등) 등을 이용하여도 측정할 수 있다.
본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 제조하는 기술에 관하여 특별히 제한은 없지만, 마우스 하이브리도마를 제조하는 방법이 일반적이다. 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체의 선정을 위한 평가 방법은, 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M을 응집시키는 응집성의 강도를 지표로 선택된다. 그 결과, 인간 면역 글로불린 M에 특이적으로 반응하고, 또한 단독으로 인간 면역 글로불린 M을 응집시킨다는 성질을 갖는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 조제 후의 구조 개변이나 수식에 관하여, 이 모노클로날 항체의 인간 면역 글로불린 M과의 반응 특성을 크게 해치지 않는 한 특별히 제한은 없다.
(하이브리도마)
본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 생산하기 위해서 이용하는 하이브리도마는, 인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하고, 또한 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집을 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날을 생산할 수 있는 하이브리도마이면 어느 것이나 되고, 생산되는 모노클로날 항체가 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과의 면역 응집 형성능이 높은 것이 선택된다. 즉, 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체는 이하의 공정 1) 내지 3)을 거쳐 제조된다.
공정 1) 인간 면역 글로불린 M을 항원으로 하여 항 인간 면역 글로불린 M 항체 생산 하이브리도마를 취득하는 공정,
공정 2) 공정 1에서 취득한 하이브리도마가 생산하는 항체를 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과 접촉시켜, 당해 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집체를 형성할 수 있는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 공정, 및
공정 3) 공정 2에서 선택된 하이브리도마가 생산하는 항체를 취득하는 공정.
상기 공정 2에서 선택된 하이브리도마로서는, 예를 들면 FERM BP-11134를 들 수 있다.
상기 제조 공정에서의 하이브리도마의 선택은, 보다 구체적으로는 정제 항체를 이용하여 용액 상태의 인간 면역 글로불린과 반응시킴으로써 용액 상태에서의 면역 응집 형성능의 차이에 의한 선택 공정을 들 수 있는데, 본 선택 공정의 전에 정제 항체를 이용하지 않고 하이브리도마 배양 상청 등을 이용하여, 우선 ELISA법 등의 고상 상태에서의 항 인간 면역 글로불린 M 항체 생산 하이브리도마의 선택 공정을 미리 행하면, 보다 효율적으로 본 발명의 항체 생산 하이브리도마를 선택할 수 있다.
이와 같은 선택 공정을 거쳐 얻어진 항체는 인간 면역 글로불린 M에 특이적으로 반응하고, 또한 용액 상태에서 1종류로 인간 면역 글로불린 M과의 사이에 분자간 가교를 형성하여 면역 응집체를 형성할 수 있다는 성질을 갖는다.
(용도)
본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체는 인간 면역 글로불린 M에 특이적으로 반응하고, 또한 1종류로 인간 면역 글로불린을 응집시킨다는 성질을 갖는 용도이면 어느 것에나 적용할 수 있고, 전술한 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 방법 외에 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제로서의 사용을 바람직한 예로서 들 수 있다. 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체는, 인간 면역 글로불린 M과 1:1로 분자내 가교하지 않는 점으로부터 인간 면역 글로불린 M을 효율적으로 중화할 수 있어, 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제로서 바람직하게 이용할 수 있다. 본 발명의 항체가 종래의 비특이 반응의 저지제로도 억제할 수 없었던 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응을 억제할 수 있는 메커니즘은, 명확하지는 않지만, 용액 상태의 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 있다는 성질이 크게 관계되어 있는 것으로 생각된다. 예를 들면, 용액 상태의 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 있다는 성질을 갖는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체는, 이호성 항체형, 류머티즘 인자(RF)형 등에 관계없이 인간 면역 글로불린 M 분자 내에서 보편적으로 존재하는 에피토프를 인식하고 있을 가능성이 고려된다.
따라서, 본 발명에서 말하는 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응이란, 인간 면역 글로불린 M이 원인으로 되어 있는 모든 비특이 반응을 가리키고, 상기 비특이 반응에는 이호성 항체나 류머티즘 인자(RF)로 되어 동물 유래 항체와 반응하는 인간 면역 글로불린 M과 같이 발생 기서(機序)가 공지인 비특이 반응에 더하여 기서가 불명한 비특이 반응도 포함된다. 이와 같이 본 발명의 억제제는 상기 원인의 인자의 실체가 인간 면역 글로불린 M인 모든 비특이 반응을 대상으로 한다.
본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체의 비특이 반응의 억제제로서의 사용은, 용액 상태이어도 고상 상태이어도 그 효과를 발휘할 수 있다. 본 억제제의 용액 상태의 사용으로서는, 시료 용액에 본 억제제를 첨가하고, 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과 반응시켜 응집시키는 경우를 들 수 있다. 또한, 고상 상태에서의 사용으로서는, 예를 들면 이뮤노크로마토그래피법에 이용되는 샘플 패드에 미리 본 억제제 용액을 첨가하여 건조·고상화하고, 당해 샘플 패드에 시료를 적하하여 통과할 때에 시료 용액 중의 인간 면역 글로불린 M을 고정화된 억제제에 의해 트랩시키는 경우 등을 들 수 있다.
본 발명의 비특이 반응의 억제제는 시료 중의 측정 대상 성분을 측정용 항체 또는 측정용 항원과의 항원 항체 반응에 의해 측정하는 면역학적 측정 방법에 이용할 수 있고, 이에 의해 상기 항원 항체 반응 이외의 인간 면역 글로불린 M에서 유래하는 비특이 반응을 효과적으로 억제할 수 있어, 정확한 면역 측정이 가능해진다.
1종류로 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 첨가함으로써, 비특이 반응을 억제하여 정확한 측정값을 얻는 것을 특징으로 하는 본 발명의 면역학적 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트의 측정 대상 시료는, 다양한 인간 생체 시료로서 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응 발생의 가능성이 있는 시료이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 혈액, 혈청, 혈장, 소변 등의 체액이다. 측정 대상에 관해서도 항원 항체 반응을 이용할 수 있는 분자이면 특별히 한정은 없고, 예를 들면 CRP(C 반응성 단백질), Lp(a), MMP3(매트릭스 메탈로프로테이나아제 3), Ⅳ형 콜라겐, PSA(전립선 특이 항원), BNP(뇌성 나트륨 이뇨 펩티드), 인슐린, 마이크로알부민, 시스타틴 C, 항 인지질 항체, 항 트레포네마 팔리둠 항체, FDP(피브린·피브리노겐 분해 산물), D 다이머, SF(가용성 피브린), TAT(트롬빈-안티트롬빈 Ⅲ 복합체), ⅩⅢ 인자, 페프시노겐 Ⅰ·Ⅱ 등에 더하여 합텐인 페니토인, 페노바르비탈, 카르바마제핀, 바르프로산, 테오필린 등의 약물도 들 수 있다. 단, 본 발명의 원리상 인간 면역 글로불린 M을 측정 대상 분자로 할 수는 없다.
본 발명의 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제에 이용되는 1종류로 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체는 용액 상태 및 고상화 상태 어느 상태에서나 첨가할 수 있고, 첨가 농도는 충분한 비특이 반응 억제 효과를 나타내고, 또한 면역학적 측정의 본 반응에 영향을 미치지 않는 농도이면 특별히 제한은 없지만, 0.01 내지 10㎎/mL의 농도 범위로의 이용이 바람직하고, 0.05 내지 1㎎/mL가 보다 바람직하다. 또한 실제의 측정시에는 측정용 항체 또는 측정용 항원과 피험 시료를 접촉시키는 공정 이전에 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체와 피험 시료를 접촉시킨 쪽이 비특이 반응을 보다 효율적으로 억제할 수 있다. 또한 그 외의 비특이 반응 억제책이나 저지 성분의 병용도 가능하다.
면역학적 측정에 관계되는 성분(측정용 항체 또는 측정용 항원)을 담지한 불용성 담체를 이용하는 본 발명의 면역학적 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트에서 불용성 담체로서 이용되는 소재는, 검사약의 성분으로서 이용 가능한 불용성 성질이면 특별히 제한은 없지만, 구체적으로 라텍스 입자, 금속 콜로이드, 실리카, 카본 등을 들 수 있고, 라텍스 입자가 특히 바람직하다. 불용성 담체의 소재 및 사이즈는 본 발명의 면역학적 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트의 측정 대상 분자, 검출 원리 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 라텍스 입자의 경우에서는 페닐기를 갖는 중합성 단량체와 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체의 공중합체로 이루어지는 담체 입자에 의해 구성되는 것이 바람직하고, 그 평균 입자 직경은 투과형 전자 현미경 장치를 이용한 경우의 측정에서 0.01 내지 1.5㎛이고, 바람직하게는 0.03 내지 0.8㎛, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.5㎛이다.
측정 대상 분자와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 비특이 인자의 영향을 억제하고, 정확한 측정값을 얻는 것을 특징으로 하는 본 발명의 면역학적 측정 방법에 있어서, 검출 원리로서는 효소, 형광, 화학 발광, 탁도 등 어느 것이나 이용할 수 있고, 또한 조작·평가법 모두 용수적, 기계적 어느 것이나 이용할 수 있다. 따라서 본 발명의 면역학적 측정 시약 및 측정 키트로서는 ELISA법, EIA법, 화학 발광법, 이뮤노크로마토그래피법, 면역 응집법이나 라텍스 면역 응집법 등 어느 형태나 이용할 수 있다. 특히 면역 응집법이나 라텍스 면역 응집법은 전술한 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 시약 및 측정 키트에서 이용되는 기기가 마찬가지로 이용된다.
또한, 본 발명의 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제가 이용되는 면역학적 측정 시약 및 측정 키트는 주성분 외에 시료의 이온 강도나 침투압 등을 완충하는 성분이나 면역학적 응집을 증강하는 성분을 포함하여도 되고, 전술한 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 시약 및 측정 키트와 마찬가지의 성분을 들 수 있다.
<실시예>
이하, 1종류로 면역 응집을 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체의 제조 방법, 이 모노클로날 항체를 이용한 면역 응집 측정 방법, 및 이 모노클로날 항체를 비특이 반응의 억제제로서 이용한 면역학적 측정 방법의 예를 들어 본 발명의 일부를 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
[시험예 1] 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체의 제조
(1) 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 조제
정제 인간 면역 글로불린 M(케미콘(CHEMICON)사 제조) 100㎍을 1회의 면역에 사용하였다. 초회 면역은 인간 면역 글로불린 M과 프로인트의 완전 애쥬벤트를 등량 혼합하여 조제한 에멀션 200μL를 이용하고, 이것을 BALB/c 마우스의 복강에 주사하였다. 추가 면역에는 프로인트의 불완전 애쥬벤트를 사용하여 마찬가지로 조제한 에멀션 200μL를 이용하고, 2주일 간격으로 3회 면역을 반복하였다. 마우스 안저 정맥으로부터 채혈한 혈액 중의 항체가를 ELISA법으로 측정하고, 항체가가 높은 마우스를 선택하여 세포 융합에 제공하였다. 4회째의 면역으로부터 2주일 후에 인간 면역 글로불린 M 100㎍을 생리 식염액 200μL에 용해한 것을 마우스 복강에 주사하고, 3일 후에 비장을 적출하였다. 비장을 RPMI 1640 배지 중에서 푼 후, 1500rpm으로 원심 분리하여 비장 세포를 회수하였다. 이것을 소 태아 혈청이 없는 RPMI 1640 배지에서 3회 이상 세정 후, 15% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지 2mL를 첨가하여 현탁하여 비장 세포 현탁액으로 하였다. 비장 세포와 미엘로마 세포 SP2/O-AG14를 6대1의 비율로 혼합한 후, 50% 폴리에틸렌글리콜 존재 하에서 세포 융합시켜 하이브리도마(융합 세포)를 얻었다. 1500rpm의 원심 분리로 침전부를 모으고, GKN액(글루코오스 2g, 염화칼륨 0.4g, 염화나트륨 8g, 인산수소나트륨 1.41g 및 인산이수소나트륨 이수화물 0.78g을 정제수에 녹여 1리터로 한 것)에 현탁, 원심 분리에 의해 세정 후, 침전부를 회수하였다. 이것을 15% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지 30mL에 현탁한 것을 1웰당 100μL, 및 피더 세포로서 BALB/c 마우스의 흉선 세포를 2.5×106개/mL 포함하는 HAT 배지를 1웰당 200μL 96웰 마이크로플레이트 3장에 각각 분주하고, 37℃에서 5% 탄산 가스 배양기 중에서 하이브리도마를 배양하였다.
배양 상청 중의 항 인간 면역 글로불린 M 항체의 존재를 인간 면역 글로불린 M을 고상화한 ELISA법으로 확인하였다. 10일 후에 모든 웰에서 하이브리도마의 증식을 확인하였다. 상세하게는 10㎍/mL의 인간 면역 글로불린 M 및 150mM 염화나트륨을 포함하는 10mM 인산 완충액(pH 7.2; 이하, PBS라고 약칭함) 100μL를 상기 하이브리도마의 증식이 확인된 96웰 마이크로플레이트에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 이어서, 이 96웰 마이크로플레이트를 0.05% 트윈(Tween) 20 및 1% 소 혈청 알부민을 포함하는 PBS 300μL로 3회 세정한 후, 각 웰의 배양 상청을 50μL/웰 첨가하여 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 당해 플레이트를 0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS(이하, PBS-T라고 약칭함)로 3회 세정 후, 퍼옥시다아제 표지 항 마우스 IgG 염소 항체(서던바이오테크(SouthernBiotech)사)를 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 당해 플레이트를 PBS-T로 3회 세정 후, 0.2% 오르소페닐렌디아민 및 0.02% 과산화수소를 포함하는 시트르산 완충액(pH 5.0) 50μL/웰을 첨가하고, 실온에서 15분간 방치 후, 4.5N 황산 50μL/웰을 첨가하여 반응을 정지시키고, 각 웰의 파장 492㎚에 있어서의 흡광도를 측정하고, 블랭크와 차이가 있는 웰을 양성 웰로서 선택하였다.
단클론화는 한계 희석법으로 행하였다. 즉, 피더 세포로서 BALB/c 마우스의 흉선 세포를 1웰당 106개식 분주한 96웰 마이크로플레이트에, 상기 양성 웰 중의 하이브리도마를 10개/mL가 되도록 희석한 것을 0.1mL씩 분주하였다. 배지는 초회는 HAT 배지를, 2회째 이후는 15% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640을 이용하고, 37℃에서 5% 탄산 가스 배양기 중에서 10일간 배양하였다. ELISA법에 의한 양성 웰의 선택 및 한계 희석법에 의한 단클론화 조작을 각 3회 반복하여 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 26종류(A 내지 Z)를 얻었다.
(2) 모노클로날 항체의 생산
각 하이브리도마의 약 105개를 프리스탄 전처리한 마우스 복강에 투여하고, 생성된 복수를 각각 채취하였다. 채취한 각 복수로부터 원심 분리에 의해 불용물을 제거하고, 등량의 포화 황산 암모늄액을 첨가하고, 교반하면서 하룻밤 방치 후, 원심 분리로 침강을 회수하였다. 회수한 침강을 20mM 트리스 완충액(pH 8.0)에 용해하고, 동 완충액으로 투석하였다. 투석 내용물 각각을 동 완충액으로 평형화한 DEAE-세파로오스 칼럼에 별개로 흡착시킨 후, 각각 동 완충액 중의 염화나트륨 0 내지 300mM의 농도 구배로 용출시키고, 정제 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 얻었다. A 내지 Z의 하이브리도마가 생산한 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 각각 a 내지 z로서 이하의 시험에 이용하였다.
[평가예]
(1) 평가예 1 고상 상태에서의 반응성 평가(종래형의 평가법)
1㎍/mL의 인간 면역 글로불린 M을 포함하는 PBS 50μL을 96웰 마이크로플레이트에 분주하여 실온에서 1시간 방치하고, 인간 면역 글로불린 M을 마이크로플레이트에 고정하였다. 이어서 3% BSA(소 혈청 알부민)를 포함하는 PBS 200μL로 블로킹한 후, 각 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 1㎍/mL 포함하는 PBS 50μL를 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, PBS-T로 3회 세정 후, 퍼옥시다아제 표지 항 마우스 항체를 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 방치하고, PBS-T로 3회 세정 후, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산(ABTS)(KPL사 제조) 기질액을 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 20분간 방치 후, 1% SDS 수용액 50μL/웰을 첨가하여 반응을 정지시키고, 파장 405㎚에서의 흡광도를 측정하고, 흡광도로부터 각 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체의 반응성의 강도를 순위로 나타냈다(표 1).
(2) 평가예 2 용액 상태에서의 반응성 평가(본 발명의 평가법)
200㎍/mL의 인간 면역 글로불린 M을 포함하는 PBS 150μL에 각 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 용액(정제 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 400㎍/mL, 3% 폴리에틸렌글리콜 6000, 5mM 시트르산삼나트륨, 2.5mM 염화칼슘(무수)을 포함하는 100mM 트리스 염산 완충액 pH 8.0) 750μL를 첨가하여 교반하고, 10분 후에 히다치 U-3310 분광 광도계를 이용하여 주파장 340㎚, 부파장 800㎚의 2파장으로 흡광도를 측정하였다(흡광도 2). 대조로서 인간 면역 글로불린 M을 포함하지 않는 PBS 150μL에 각 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 용액 750μL를 첨가하여 교반하고, 동일 조건으로 흡광도를 측정하였다(흡광도 1). 흡광도 2로부터 흡광도 1을 빼서, 인간 면역 글로불린 M 특이적인 면역 응집에 수반하는 흡광도 변화량을 산출하였다(표 1).
Figure 112011024208732-pct00001
(3) 평가 결과
흡광도 변화량으로부터 항체 t는 인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하고, 또한 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집을 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날인 것을 알았다. 또한, 종래형의 평가법인 고상 상태의 반응성 평가에서는 항체 k, z의 반응성의 강도가 돌출하고 있어, 6번째의 강도이기는 하지만 강도가 k의 절반 이하인 본 발명의 모노클로날 항체 t가 선택될 가능성은 낮다. 또한 동시에, 용액 상태에서 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집체를 형성할 수 있다는 특성은 반응성의 강도와 반드시 일치하는 것은 아닌 점으로부터, 종래형의 고상 상태에 의한 반응성의 평가만으로는 본 발명의 특성을 갖는 모노클로날 항체를 발견하기는 매우 어려운 것을 알 수 있다. 또한, 항체 t를 생산하는 하이브리도마 T는 수탁 번호 FERM BP-11134로서 기탁되어 있다.
[실시예 1]
항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체에 의한 면역 응집 및 비특이 반응의 억제제로서의 이용 가능성의 확인
(1) 인간 면역 글로불린 M 용액의 조제
인간 면역 글로불린 M(케미콘사 제조)을 200㎍/mL 포함하는 용액을, PBS를 이용하여 연속적인 단계 희석을 행하여 100, 50, 25㎍/mL의 인간 면역 글로불린 M 용액을 조제하였다.
(2) 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 t 용액의 조제
3%의 폴리에틸렌글리콜 6000, 5mM의 시트르산삼나트륨, 2.5mM의 염화칼슘(무수)을 포함하는 pH 8.0의 100mM 트리스 염산 완충액(이하, 항체 희석액이라고 함)을 이용하여, 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 t를 최종 농도 400㎍/mL가 되도록 희석하여 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 t 용액을 조제하였다. 대조로서 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 t 대신에 비특이 반응의 저지제로서 이용되고 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 성분으로 하는 이호성 저지 시약 HBR(스칸티바디즈 래버러토리사(SCANTIBODIES LABORATORY, INC.) 제조, 수입원은 나가세산교가부시키가이샤)을 최종 농도 400㎍/mL가 되도록 항체 희석액으로 희석하여 이호성 저지 시약 HBR 용액을 조제하였다.
(3) 측정 방법
히다치 7170형 자동 분석 장치를 이용하여 면역 응집 측정을 실시하였다. 구체적으로는 (1)에서 조제한 각 농도의 인간 면역 글로불린 M 용액 30μL에, (2)에서 조제한 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 t 용액 150μL 또는 이호성 저지 시약 HBR 용액 150μL를 첨가하여 교반 후 37℃에서 가온하고, 주파장 340㎚, 부파장 800㎚에서 10분간의 흡광도 변화량을 감도(mAbs)로서 측정하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.
(4) 결과
본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 t(사내 관리 번호 73224)에 있어서 인간 면역 글로불린 M 농도 25㎍/mL부터 농도 의존적인 감도 상승이 나타나고, 1종류로 인간 면역 글로불린 M의 실용적인 면역 응집 측정이 가능한 것이 확인되었다. 또한, 대조로 한 이호성 저지 시약 HBR에서는 감도 상승이 전혀 나타나지 않고, 인간 면역 글로불린 M을 응집할 수 없음이 확인되었다. 이 점으로부터 본 발명의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체는, 종래의 비특이 반응의 저지제에 이용되고 있었던 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체와는 명확히 상이한 성질로, 종래의 비특이 반응의 저지제로는 억제할 수 없었던 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응을 억제할 수 있는 가능성이 시사되었다.
이하, 몇 가지 면역 반응 측정에 있어서의 본 발명의 비특이 반응의 억제 효과를 확인하였다(실시예 2 내지 4).
(실시예 2) 비특이 반응의 억제 효과의 확인 「1」(PSA 측정용 라텍스 시약에 있어서)
항 PSA 모노클로날 항체를 이용한 PSA 측정용 라텍스 시약에서 확인된 비특이 반응에 대한 본 발명의 억제 효과를 범용 자동 분석 장치를 이용한 감도 측정으로 확인하였다. PSA는 전립선의 선상피 세포에서 특이적으로 생산되는 분자량 약 34,000의 당단백질이고, 고령 남성이 걸리는 대표적인 악성 종양의 하나인 전립선암의 스크리닝(검진)에 응용되고 있다.
(1) 시약
(1-1) 제1 시약
(ⅰ) 기본 시약
0.5M KCl, 0.1% BSA(소 혈청 알부민)를 포함하는 30mM HEPES 완충액(pH 7.0)
(ⅱ) 본 발명 시약
상기 기본 시약에 1종류로 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집을 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 t 용액을 항체의 최종 농도 25, 50, 100㎍/mL가 되도록 첨가한 시약
(ⅲ) 대조 시약
기본 시약에 시판의 이호성 저지 시약 HBR, 또는 항 인간 면역 글로불린 M 염소 폴리클로날 항체(MBC사 제조)를 최종 농도 25, 50, 100㎍/mL가 되도록 첨가한 시약
(1-2) 제2 시약
나노피아(등록 상표) PSA PSA 라텍스 시액 제2액(세키스이메디컬가부시키가이샤)
(2) 측정 장치
히다치 7170형 자동 분석 장치:
파라미터 조건
(ⅰ) 검체-제1 시약-제2 시약의 양:4μL-100μL-100μL
(ⅱ) 분석법: 2포인트 엔드법(측광 포인트 19-34)
(ⅲ) 측정 파장: 주파장 570㎚/부파장 800㎚
(3) 측정 시료
(ⅰ) 정상 검체
여성 혈청을 이용하였다. 여성 혈 중에 PSA는 거의 존재하지 않거나 존재하여도 극히 미량인 점으로부터 음성 대조군으로서 자주 이용된다.
(ⅱ) 비특이 반응 검체
높은 값의 이상 감도를 나타내는 여성 혈청을 이용하였다. PSA는 남성에 특이적인 항원으로 여성 혈청에는 본래 발견되지 않는 것이기 때문에, 여성 혈청에서 높은 값의 이상 감도를 나타내는 것은 PSA 함량과는 관계없이 라텍스 응집이 야기된 비특이 반응의 결과라고 생각된다. 구체적으로는 시판 혈청(테네시 블러드 서비시즈사(TENNESSEE BLOOD SERVICES, INC.) 제조의 항응고제가 없는 전혈, 정상 여성으로부터의 혈청) 중으로부터 상기 기본 시약과 제2 시약의 조합에 의해 높은 흡광도를 나타내는 여성 혈청을 스크리닝에 의해 발견하여 사용하였다.
(4) 측정 방법
제1 시약으로서 기본 시약, 본 발명 시약 및 대조 시약, 제2 시약으로서 나노피아(등록 상표) PSA PSA 라텍스 시액 제2액을 사용하여 히다치 7170형 자동 분석 장치로 정상 검체 및 비특이 반응 검체를 측정하여 감도를 확인하였다.
(5) 측정 결과
도 4에 나타내는 정상 검체의 측정에 있어서는 본 발명 시약, 대조 시약 모두 항 인간 면역 글로불린 M 항체나 이호성 저지 시약 HBR의 첨가 농도에 관계없이 감도 변화가 나타나지 않는 점으로부터 검체 중에 PSA가 존재하지 않고, 또한 항 인간 면역 글로불린 M 항체나 HBR의 첨가가 측정 감도에는 전혀 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 한편, 도 5에 나타내는 비특이 반응 검체의 측정에 있어서는, 첨가물이 없는 기본 시약으로 150mAbs 이상의 이상치가 확인되고, 대조 시약인 항 인간 면역 글로불린 M 염소 폴리클로날 항체에서는 100㎍/mL의 첨가까지 현저한 억제 효과는 나타나지 않고, 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체를 성분으로 하는 시판의 이호성 저지 시약 HBR의 첨가에서는 저지는커녕 약간이지만 감도의 증가가 나타난다.
항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 t를 첨가한 본 발명의 시약에서는 25㎍/mL의 첨가로 현저한 이상치의 저하가 나타나고, 50㎍/mL의 첨가로 거의 완전히 비특이 반응이 억제되어 있다. 본 발명의 측정 방법은, 비특이 반응 저지의 목적으로 이용된 종래형의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체나 항 인간 면역 글로불린 M 폴리클로날 항체라는 대책법으로는 저지할 수 없는 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응에 대하여 강한 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 3] 비특이 반응 억제 효과의 확인 「2」(CRP 측정용 라텍스 시약에 있어서)
항 CRP 모노클로날 항체를 이용한 CRP 측정용 라텍스 시약으로 확인된 비특이 반응에 대한 본 발명의 억제 효과를 범용 자동 분석 장치를 이용한 측정으로 확인하였다. CRP는 비특이적인 염증 마커로서 잘 알려져 있다.
(1) 시약
(1-1) 제1 시약
(ⅰ) 기본 시약
500mM 염화나트륨을 포함하는 20mM 트리스 염산 완충액(pH 8.5)
(ⅱ) 본 발명 시약
기본 시약에 1종류로 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집을 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 t 용액을 항체의 최종 농도 50㎍/mL가 되도록 첨가한 시약
(ⅲ) 대조 시약
기본 시약에 수동형 비특이 반응 억제 효과를 나타내는 정상 마우스 IgG 또는 시판의 이호성 저지 시약 HBR을 50㎍/mL 첨가한 시약
(1-2) 제2 시약
SS 타입 퓨어오토(등록 상표) S CRP 라텍스 라텍스 시액 제2액(세키스이메디컬가부시키가이샤)
(1-3) 캘리브레이터
SS 타입 퓨어오토(등록 상표) S CRP 라텍스 캘리브레이터(세키스이메디컬가부시키가이샤)
(2) 측정 장치
히다치 7170형 자동 분석 장치:
파라미터 조건
(ⅰ) 검체-제1 시약-제2 시약의 양:3μL-150μL-50μL
(ⅱ) 분석법: 2포인트 엔드법(측광 포인트 19-34)
(ⅲ) 측정 파장: 주파장 570㎚/부파장 800㎚
(ⅳ) 캘리브레이션: 스플라인
(3) 측정 시료
비특이 반응 검체 1: 일반 혈청으로부터 발견된 높은 값 이상 검체
비특이 반응 검체 2: 일반 혈청으로부터 발견된 높은 값 이상 검체
(4) 측정 방법
제1 시약으로서 기본 시약, 본원 발명 시약 및 대조 시약, 제2 시약으로서 SS 타입 퓨어오토(등록 상표) S CRP 라텍스 라텍스 시액 제2액을 사용하여 히다치 7170형 자동 분석 장치로 비특이 반응 검체를 측정하여 측정값을 확인하였다.
(5) 측정 결과
표 2에 나타내는 바와 같이 비특이 반응 검체 1, 2의 정상 측정값(토끼 폴리클로날 항체를 이용한 타사 라텍스 시약으로 확인한 참고값. 제품명: CRP-라텍스(Ⅱ)「세이켄」X2, 덴카세이켄사)에 대하여 기본 시약에 있어서의 측정값은 각각 5 내지 10배의 높은 값이 된다. 정상 마우스 IgG 50㎍/mL를 첨가한 대조 시약에서는 비특이 반응 검체 1에서 측정값의 개선이 나타나고, 비특이 반응 검체 2에서는 개선이 나타나지 않는다. 따라서, 비특이 반응 검체 1은 이호성 항체 소위 HAMA 검체인 것을 알 수 있다. 이호성 저지 시약 HBR을 50㎍/mL 첨가한 대조 시약에서는 비특이 반응 검체 1, 2 모두 측정값이 정상 측정값 레벨까지 저하되어 개선이 나타난다. 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 t를 첨가한 본 발명 시약에서도 비특이 반응 검체 1, 2 모두 측정값이 개선되고, 그 효과는 이호성 저지 시약 HBR보다도 강하다. 본원 발명의 측정 방법은 이호성 저지 시약 HBR이 강한 저지 효과를 나타내도록 하는 종래형의 비특이 반응에 대해서도 동등 이상으로 강한 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
Figure 112011024208732-pct00002
[실시예 4] 비특이 반응 억제 효과의 확인 「3」(인슐린 측정용 라텍스 시약에 있어서)
본 발명의 비특이 억제제의 효과를 인슐린 측정용 라텍스 시약에서도 확인을 행하였다.
(1) 항 인슐린 마우스 모노클로날 항체의 취득
인간 인슐린(피츠제럴드(Fitzgerald)사 제조 30-AI51)을 면역원으로 하여 통상의 모노클로날 항체의 취득 방법에 의해 항원 인식 부위가 상이한 2종의 항 인슐린 마우스 모노클로날 항체를 취득하고, 사내 관리 번호 66221, 66412로 하였다(이하, 각각 66221 항체, 66412 항체라고 함).
(2) 라텍스 입자의 제조
교반기, 환류용 냉각기, 온도 검출기, 질소 도입관 및 재킷을 구비한 유리제 반응 용기(용량 2L)에 증류수 1100g, 스티렌 200g, 스티렌술폰산나트륨 0.2g, 및 증류수 50g에 과황산칼륨 1.5g을 용해한 수용액을 넣고, 용기 내를 질소 가스로 치환한 후, 70℃에서 교반하면서 48시간 중합하였다. 중합 종료 후, 상기 용액을 여과지로 여과 처리하고, 라텍스 입자를 취출하였다. 얻어진 라텍스 입자의 입자 직경을 투과형 전자 현미경 장치(닛폰덴시사 제조, 「JEM-1010형」)를 이용하여 10000배의 배율로 라텍스 입자를 촬영하고, 최저 100개 이상의 입자에 대하여 화상 해석함으로써 평균 입자 직경을 측정하였다. 얻어진 평균 입자 직경은 0.3㎛였다.
(3) 항 인슐린 모노클로날 항체 감작 라텍스 용액의 조제
1) 66221 항체 감작 라텍스 입자 용액의 제조
평균 입자 직경 0.3㎛의 1.0% 라텍스 용액(5mM 트리스 완충액(pH 8.5)에 0.60㎎/mL 66221 항체(5mM 트리스 완충액(pH 8.5))를 등량 첨가하여 4℃에서 2시간 교반하였다. 그 후, 등량의 0.5% BSA를 포함하는 5mM 트리스 완충액(pH 8.5)을 첨가하여 4℃에서 1시간 교반하였다. 이어서, 이것을 원심하여 상청을 제거 후, 침전을 5mM 트리스 완충액(pH 8.5)으로 재현탁하여 66221 항체 감작 라텍스 용액으로 하였다.
2) 66412 항체 감작 라텍스 입자 용액의 제조
66412 항체를 이용하여 상기 1)과 동일한 방법에 의해 66412 항체 감착 라텍스 입자 용액을 제조하였다.
(4) 시약
1) 제1 시약의 조제
(ⅰ) 기본 시약
500mM 염화나트륨, 0.2% BSA를 포함하는 5mM 트리스 완충액(pH 8.5)
(ⅱ) 본 발명 시약
기본 시약에 모노클로날 항체 t 용액을 항체의 최종 농도가 50㎍/mL로 되도록 첨가한 시약
(ⅲ) 대조 시약
본 발명의 모노클로날 항체 t 대신에 시판의 이호성 저지 시약 HBR을 항체의 최종 농도 50㎍/mL가 되도록 첨가한 시약
2) 제2 시약의 조제
66221 항체 감작 라텍스 입자 용액 및 66412 항체 감작 라텍스 입자 용액을 등량 혼합하고, 5mM 트리스 완충액(pH 8.5)으로 파장 600㎚에서의 흡광도가 5.0Abs로 되도록 희석하여 제2 시약으로 하였다.
(5) 시료
당 부하 시험 후 채취된 혈청 검체를 시료로 하였다.
(6) 측정 방법
(ⅰ) 본 발명 시약 및 대조 시약의 측정
제1 시약과 제2 시약을 조합하고, 히다치 7170형 자동 분석 장치를 이용하여 시료 중의 인슐린 농도를 측정하였다. 구체적으로는 시료 10μL에 제1 시약 150μL를 첨가하여 37℃에서 5분간 보온한 후, 제2 시약 50μL를 첨가하여 교반하였다. 응집 형성에 수반하는 흡광도 변화를 그 후 5분에 걸쳐 주파장 570㎚, 부파장 800㎚에서 측정하고, 그 흡광도 변화량을 농도 기지의 표준 물질을 측정하여 얻어지는 검량선에 적용시켜 인슐린 농도를 산출하였다.
(ⅱ) 기준 시약의 측정
시료 중의 인슐린 농도를 루미펄스(등록 상표) 인슐린-N(후지레비오사 제조)을 이용하여 첨부 문서 및 제조자 추장의 방법에 따라 측정하였다. 이 인슐린의 측정값과 상기 본 발명 시약 또는 대조 시약의 상관을 도 6에 나타낸다.
(7) 측정 결과 및 고찰
도 6의 상관도에 있어서, 대조 시약(HBR)을 이용한 시험의 상관도에 있어서 괴리 검체가 나타나는 것에 대하여, 본 발명 시약을 이용한 본 실시예에서는 괴리가 억제되고, 루미펄스(등록 상표) 인슐린-N과 양호한 상관 효과가 나타났다. 이상으로부터 인슐린 측정에서도 본 발명 시약은 시판의 이호성 저지 시약 HBR로 억제할 수 없는 비특이 반응을 억제하는 것이 확인되었다.
<산업상 이용가능성>
본 발명의 모노클로날 항체는 용액 상태에 있어서의 응집 반응성의 강도를 지표로 선택되기 때문에, 인간 면역 글로불린 M과 효율적으로 반응하고, 보다 정확하고 안정된 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 방법이 가능하게 된다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 고품질이고 저렴한 인간 면역 글로불린 M의 면역 응집 측정 시약 및 측정 키트를 제공한다.
본 발명의 비특이 반응의 억제제, 이것을 이용한 면역학적 측정 방법, 면역학적 측정용 시약 및 측정 키트에서는, HAMA 등에 기인하는 종래형의 비특이 반응에 더하여 기지의 대책으로 회피할 수 없었던 비특이 반응에 관해서도 인간 면역 글로불린 M에 기인한다고 생각되는 비특이 반응이면, 측정 항목에 관계없이 억제할 수 있기 때문에, 지금까지의 측정법보다도 정확한 측정값을 부여한다.
[기탁된 미생물에 대한 언급]
가. 당해 생물 재료를 기탁한 기탁 기관의 명칭 및 주소
일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터
일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1 츄오다이로쿠(우편번호 305-8566)
나. 가의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 날짜
2008년 9월 19일(원기탁일)
2009년 6월 9일(원기탁에 의해 부다페스트 조약에 기초한 기탁에의 이관일)
다. 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 붙인 수탁 번호
FERM BP-11134
일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP11134 20080919

Claims (20)

  1. 인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하며, 용액 상태에서 1종류로 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집체를 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 또는 상기 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편 또는 이들 둘 다를 포함하는, 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 또는 상기 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편이 이하의 (a) 또는 (b)의 항체 또는 (c)의 기능성 단편인 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제.
    (a) FERM BP-11134인 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체.
    (b) 상기 (a)의 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 제1항에 기재된 항체.
    (c) (a) 또는 (b)의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편.
  3. 시료 중의 측정 대상 성분을 측정용 항체 또는 측정용 항원과의 항원 항체 반응에 의해 측정을 행하는 면역학적 측정 방법에 있어서, 하기 비특이 반응 억제제의 첨가에 의해, 상기 항원 항체 반응 이외의 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정 방법.
    비특이 반응의 억제제;
    인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하며, 용액 상태에서 1종류로 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집체를 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 또는 상기 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편 또는 이들 둘 다를 포함하는, 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제.
  4. 제3항에 있어서, 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 또는 상기 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편이 이하의 (a) 또는 (b)의 항체 또는 (c)의 기능성 단편인 면역학적 측정 방법.
    (a) FERM BP-11134인 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체.
    (b) 상기 (a)의 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 제1항에 기재된 항체.
    (c) (a) 또는 (b)의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편.
  5. 제3항에 있어서, 측정용 항체 또는 측정용 항원이 불용성 담체에 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정 방법.
  6. 제5항에 있어서, 불용성 담체가 라텍스, 금속 콜로이드, 또는 실리카를 포함하는 면역학적 측정 방법.
  7. 하기 비특이 반응 억제제 및 시료 중의 측정 대상 성분을 측정하기 위한 측정용 항체 또는 측정용 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정 시약.
    비특이 반응의 억제제;
    인간 면역 글로불린 M과 특이적으로 반응하며, 용액 상태에서 1종류로 인간 면역 글로불린 M과의 사이에서 항원 항체 반응에 기초한 면역 응집체를 형성할 수 있는 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 또는 상기 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편 또는 이들 둘 다를 포함하는 인간 면역 글로불린 M에 기인하는 비특이 반응의 억제제.
  8. 제7항에 있어서, 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체 또는 상기 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편이 이하의 (a) 또는 (b)의 항체 또는 (c)의 기능성 단편인 면역학적 측정 시약.
    (a) FERM BP-11134인 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체.
    (b) 상기 (a)의 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 제1항에 기재된 항체.
    (c) (a) 또는 (b)의 항 인간 면역 글로불린 M 모노클로날 항체에서 유래하는 기능성 단편.
  9. 제7항에 있어서, 측정용 항체 또는 측정용 항원이 불용성 담체에 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정 시약.
  10. 제9항에 있어서, 불용성 담체가 라텍스, 금속 콜로이드, 또는 실리카를 포함하는 면역학적 측정 시약.
  11. 제7항에 기재된 면역학적 측정 시약을 포함하는 면역학적 측정 키트.
  12. 제9항에 기재된 면역학적 측정 시약을 포함하는 면역학적 측정 키트.
  13. 제10항에 기재된 면역학적 측정 시약을 포함하는 면역학적 측정 키트.
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