JPS63255662A - 免疫複合体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫複合体の測定法に係り、殊にモノクローナ
ルリウマトイド因子を用いる免疫複合体の測定法に係る
。

免疫複合体は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を始
めとして慢性関節リウマチ（ＲＡ）、膠原病、糸球体腎
炎、血管炎、感染症、肝疾患、肺疾患、カン等の種々の
疾患に際して血清等の体液中に出現してくることが報告
されている。

従って、本発明による測定法はこれら疾患についての臨
床診断検査法の一つとして利用することができる。

（従来の技術及びその問題点） ヒト体液中、殊に血清中における免疫複合体の測定は従
来から種々の方法を用いて実施されており、これらの従
来法は例えば ａ）超遠沈法、 ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈降法、Ｃ）抗
補体法、 ｄ）　　Ｃ１ｑ法、 ｅ〉　ラジ（Ｒａｊｉ）細胞法及び ｆ）　リウマｌ〜イド因子（ＲＦ）による方法に大別さ
れる。

これらの諸方法の内で、超遠沈法は分析操作に長時間を
要するために多検体処理が困難である点に問題がある。

ポリエチレングリコール沈降法は操作か容易であると云
う利点を有しているが、免疫複合体以外の高分子蛋白も
測定してしまい、その結果として測定精度が低くなる点
に問題がある。抗補体法は、免疫複合体に結合した補体
の第３成分（Ｃ３）に対する抗体を利用して免疫複合体
を測定する方法てあって、広範囲の免疫複合体の検出に
応用し得る利点を有しているが、測定において血中の０
３の影響を受は易い点に問題がある。Ｃ１ｑ法は、補体
の第１成分であるＣ１ｑをヒト又は動物の血清から分離
精製し、Ｃ１ｑが免疫複合体と特異的に結合する性質を
利用して免疫複合体を測定する方法であって、Ｃ１ｑバ
インデイングテスト、Ｃ１ｑ同相ラジオイムノアツセイ
（ＲＩ人）、Ｃ１ｑ固相エンザイムイムノアツセイ＜Ｅ
ＩＡ）等がある。これらのＣ１ｑ法は何れも特異性及び
感度において優れているが、この方法に用いるＣ１ｑ自
体の精製に手間を要し且つ多量の血清を必要とするのて
、これらの入手の点に問題があり、又安定性が低い点に
問題がある。尚、Ｃ１ｑ法の実施に際して、免疫複合体
が血中で自己補体と結合している場合には、測定に先立
ちＥＤＴＡ処理や非動化が必要とされる。又ウシ細胞法
は、バーキットリンパ腫患者の腫瘍細胞から株化された
ラジ細胞を用いるものであり、このラジ細胞がその表面
に補体のＣ３ｂ、　Ｃ３ｄのリセプターを有しているこ
とを利用し、免疫複合体と結合した補体を介して免疫複
合体を測定する方法であるが、細胞を用いるためにその
維持管理が必要てあり、且つ細胞を培養するだめの特別
な設備を必要とする点に問題かある。

一方、本発明が関与する従来法であって、リウマトイド
因子による方法の内で慢性関節リウマチ患者の血清中に
存在するりウマトイド因子（ＲＦ）を利用する方法は、
そのＲＦがポリクローナルＲＦであるために特異性が低
く、このＲＦ含有血清ては検出率が低い点に問題があっ
た。尚、ワルデンストローム・マクログロブリネミア（
ｌＶａｌｄｅｎｓｔｒｉｆｍ　ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌ
ｊｎａｍｉａ）の患者血清中にはモノクローナルリウマ
トイド因子（ｍＲＦ）が存在しており、このｍＲＦを利
用した免疫複合体の測定法は感度が高く且つ特異性にも
優れている点て有利であるが、使用すべきｍＲＦの入手
自体が困難であり且つ又大量に得られない点に問題があ
った。更に、ｍＲＦに関しては、自己免疫疾患モデルマ
ウス（ＭＲＬ／Ｍｐ−ｌｐｒ／１ｐｒ）より調製された
ＩＩＩＲＦ産生細胞を用いてマウスミエローマ細胞との
ハイブリドーマを作製し、これからマウスｍＲＦを得た
ことが報告されｆ　ｒ　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　Ｊ
第１５８巻第９０１−９１９頁（１９８３年）、ｒｉｂ
ｉｄ」第１５９巻第１４２９−１４４０頁（１９８４年
）及び「第２９回日本リウマチ学会会報」第１７４頁１
９８５年）１、又免疫複合体測定系へのその応用も報告
されるに至っている　（［第２９回日本リウマチ学会会
報」第１７４頁（１９８５年）。

しかしながら、従来報告されてきたモノクローナルリウ
マトイド因子（ｍＲＦ）は全て　１ｇＭ型のものであり
、これを免疫複合体の測定に利用するには難がある。即
ちＩｇＭ型ｍＲＦとは、長くて重いポリペプチド鎖（＋
（鎖ン２本と、短くて軽いポリペプチド鎖（Ｌ鎖）２本
とが結合して形成されるＹ字状構造体が５つ複合したも
のであり、構造安定性が低いからである。

（発明の目的） 従って、本発明の目的は感度が高く且つ特異性に優れて
いるのみならず、測定試薬の供給性の面で満足でき、然
かも測定試薬の安定性において有利な免疫複合体の測定
法を提供することにある。

（目的を達成するための手段及び作用）本発明によれば
、上記の目的は、ヒト体液中の免疫複合体の測定法であ
って、ＩｇＧ型マウスモノクローナルリウマトイド因子
を用いることを特徴とする、免疫複合体の測定法により
達成される。

本発明による測定法に使用されるＩｇＧ型マウスモノク
ローナルリウマトイド因子は、自己免疫疾患モデルマウ
スであるＭＲＬ／λτｐ−１ｐｒ／ｌｐｒマウス由来の
ものであることが好ましい。

本発明方法において「ヒト体液」としては血清、尿等が
、殊に血清が用いられる。本発明方法はヒ）へ免疫複合
体に対して特異的に反応する性質を有するマウスｍＲＦ
、殊にＩｇＧ型のマウスｍＲＦを利用し、これを抗体試
薬として各種の抗原を免疫学的に測定しようとするもの
であり、従ってこのＩｇＧ型マウマウスＦを抗体試薬と
して用い得る免疫学的測定法であれば、どの測定システ
ムにも適用することができる。このような測定システム
自体は既に種々開発実施されており、例えば凝集反応法
、凝集阻止法、免疫拡散法、免疫比濁法、免疫比濁法、
ラテックス比濁法、競合反応法（固相法、第二抗体法等
）、サンドイツチ法、イムノメトリック法、リポソーム
イムノライシスアッセイ　（ＬＩＬＡ）があり、又標識
物質を用いる測定システムとしてはラジオイムノア・ン
セイ　（ＲＩ人）、エンザイムイムノアッセイ　（ＥＩ
人）、蛍光イムノアッセイ　（ＦＩＡ）、化学発光イム
ノアッセイ、金属イムノアッセイ、スピンイムノアッセ
イ　（ＳＩＡ）等がある。

例えば、本発明方法は、ＩｇＧ型マウマウスＦを固相化
し、試料と反応させた後、標識化した抗し）−ＩｇＧ抗
体類又は上記のＩｇＧ型マウマウスＦを添加して結合さ
せ、その結合標識量から免疫複合体を測定しなり、微粒
子例えばラテックス粒子や赤血球等にＩｇＧ型マウマウ
スＦを吸着させ、これと試料とを反応させることにより
生じる凝集の度合から免疫複合体を測定したり、或はＩ
ｇＧ型マウマウスＦと試料とを液相中で反応させ、生じ
た濁度から免疫複合体を測定することにより実施するこ
とができる。

本発明方法において使用される　ＩｇＧ型マウスモノク
ローナルリウマトイド因子（ｍＲＦ）、殊に自己免疫疾
患モデルマウスであるＭＲＬ／Ｍｐ−１ｐｒ／Ｉｐｒマ
ウス由来のＩｇＧ型マウスモノクローナルリウマトイド
因子は特願昭６２−４２７４７号明細書に開示のもので
あって、同明細書に開示の方法によって得られる。即ち
、このＩｇＧ型マウマウスＦはＭＲＬ／Ｍｐ−１ｐｒ／
Ｉｐｒマウスの牌細胞とミエローマ細胞とを細胞融合さ
せてハイブリドーマを作製し、各ハイブリドーマを選択
培養し、培養により生育した各ハイブリドーマについて
変性ヒｌ−ＩｇＧ及び免疫複合体に対する反応性を調べ
ることによりリウマトイド因子産生バイブリド―マを特
定しクローン化してモノクローナルリウマ１〜イド因子
を安定に産生する細胞株を取得し、この細胞株を培地で
培養するか、又はマウスの腹腔内に移植し増殖させてモ
ノクローナルリウマトイト因子を産生させ、次いで培養
物又は腹水を採取し分離精製することにより得ることが
できる。

本発明方法の実施において、モノクローナルリウマトイ
ド因子として、このようにモノクローナルリウマトイド
因子産生細胞株から得られたものを用いれば、その性質
は常に一定であり且つその入手性も安定しており、又モ
ノクローナルリウマトイド因子であるが故に測定感度や
反応特異性に優れている。更に、本発明方法に使用され
るモノクローナルリウマ１へイト因子はＩｇＧ型ｍＲＦ
であり、従って単一のＹ字状構造体［長くて重いポリペ
プチド鎖（Ｈ鎖〉２本と、短くて軽いポリペプチド鎖（
Ｌ鎖）２本とから形成されている１からなっているため
に構造安定性が従来発表されたＩｇＭ型ｍＲＦと比較し
て高く、その結果として　ＩｇＧ型モノクローナルリウ
マトイド因子は試一つ− 素化されても安定性に優れているのである。

（実施例等） 次に、参考例及び実施例に関連して本発明を更に詳細に
説明する。

支１匠ユ（ＩｇＧ型マウマウスＦの調製）自己免疫疾患
モデル動物であるλＩＲＬ／Ｍｐ−Ｉｐｒ／Ｉｐｒマウ
スてあって血中にリウマトイド因子を産生しているマウ
スを選択し、これらのマウスから牌臓を摘出し、常法に
より牌細胞懸濁液を調製した。この牌細胞懸濁液と、マ
ウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１）
　ノ懸濁液とを１０対１の細胞比となるような割合で混
合し、遠心処理した後に５０％ポリエチレングリコール
（メルク社製、分子量４０００）を滴下し、２分間反応
させて上記の両細胞を融合させた。

得られた細胞を無血清培地（日水製薬株式会社製のＳＦ
Ｍ−１０１）に懸濁させて培養を行うことにより融合細
胞の選択を行ったくこの融合細胞の選択は自体公知のＨ
ＡＴｉＨ択法により実施することもできる）。融合細胞
の培養１４日目位に培養」二清を用い変性ヒト　ＩｇＧ
及び免疫複合体に対する反応性についてラテックス凝集
法及びＥＩＡ法により検討し、リウマトイド因子産生の
有無を調べた。これにより判明したりウマトイト因子産
生融合細胞について、限界稀釈法によるクローニングを
行って単個細胞由来のクローンとなし、このクローニン
グによりモノクローナルリウマトイド因子を安定に産生
ずる細胞株を得、これをｒＩＶ３−５株」と命名した。

参考例２　（ＩｇＧ型マウスｍＲＦの産生と精製）参考
例１で得たＴＶ　３−５株を無血清培地（上記のＳＦＭ
−１０１）を用い培養してモノクローナルリウマトイド
因子を産生さぜた。次いで培養上清を採取して濃縮し、
５０％飽和硫安を用いて分画することにより所望の精製
ＩｇＧ型マウスモノクローナルリウマ）・イド因子を得
た。

尚、モノクローナルリウマトイド因子の産生は上記の細
胞株をマウスの腹腔内に投与することによっても行うこ
とができ、この場合には腹水を採取し、これをプロティ
２人カラムクロマトグラフィーにかけることにより精製
を行うことがてきる。

上記の精製モノクローナルリウマトイド因子の免疫グロ
ブリンクラスのサブタイプを、抗マウスイムノグロブリ
ンサブタイプ血清（マイルス社製及びシグマ社製〉を用
いたオフタロニー法により、並びに酵素標識抗マウスイ
ムノグロブリンサブタイプ血清（大日本製薬株式会社製
）を用いたＥＩＡ法により調べた結果、ＴｇＧタイプ＜
ＩｇＧ　Ｉ）のモノクローナルリウマトイド因子であっ
た。

参考例３　（ＩｇＧ型マウスｍＲＦの性質）参考例２で
得た精製ＩｇＧ型マウスｍＲＦがヒＩ−ＩｇＧ　（熱変
性１ｇＧ及び無処理１ｇＧ）に対して示す反応性をＥＩ
Ａ法により検討した。

即ち、精製ＩｇＧ型ｍＲＦを９６穴マイクロプレート　
（ＥＩ人用）に４°Ｃで２４時間放置し、次いで洗浄し
た後に０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）によりブロッキン
グしてＩｇＧ型ｍＲＦ感作プレートを作製した。

この感作プレートに各濃度の無処理ヒト　ＩｇＧ及び熱
変性ヒト　ＩｇＧを添加して２時間放置した後に洗浄し
、それらか反応したか否かをアルカリフォスファターゼ
標識抗ヒｌ−ＩｇＧにより調べた。

結果は第１図に示されている通りであり、このＩｇＧ型
ｍＲＦは変性ヒト　ＩｇＧに対しては強い反応性を示す
が、無処理ヒト　ＩｇＧに対しては反応性が殆ど認めら
れなかった。

更に、熱変性ヒト　ＩｇＧをウル１ヘラゲルＡ　２２に
よりポリマーＩｇＧとモノマー１ｇＧとに分画し、これ
らの画分につき上記と同様にしてＥＩＡ法により反応性
を検討した。結果は第２図に示される通ってあり、ポリ
マーＩｇＧに関してはＩｇＧ濃度０．０５μｇ／ｍ　１
以上で反応が認められため族モノマー１ｇＧに関しては
反応性が殆ど認められなか一ンた。

上記の結果から、参考例２で得られた　ＩｇＧ型ｍＲＦ
、即ちＭＲＬ／Ｍｐ−１ｐｒ／Ｉｐｒマウス由来のＩｇ
Ｇ型ｍＲＦは、熱変性ヒト　ＩｇＧ、殊にポリマー　Ｉ
ｇＧに対して強く反応し、無処理１ｇＧ及びモノマーＩ
ｇＧに対しては殆ど反応しないと云うヒト　ＲＦの活性
と同様の活性を有していることか判る。

１１鮭Ｊ（Ｔｇａ型マウスｍＲＦと各種動物の免疫グロ
ブリンとの反応性） 参考例２で得た精製ＩｇＧ型マウスｍＲＦと各種動物の
免疫グロブリン（ヒト、家兎、山羊、馬及びマウス）と
の反応性をＥＩＡ法により検討した。

即ち、参考例３におけると同様にＩｇＧ型ｍＲＦ感作プ
レートを作製し、これに各種動物の変性１ｇＧを反応さ
せ、反応の有無をアルカリフォスファターゼ標識抗ヒト
　ＩｇＧ、抗ヒトＩｇＡ、抗し）　１ｇＭ、抗家兎１ｇ
Ｇ、抗山羊ＩｇＧ、抗馬１ｇＧ及び抗マウスＩｇＧによ
り調べた。尚、対照としてＭＲＬ／Ｍｐ−１ｐｒ／ｌｐ
ｒマウス牌細胞から得られたＩｇＭ型のｍＲＦについて
も同様の検討を行った。

結果は下記の表に示されている通りであり、ＩｇＧ型ｍ
ＲＦはヒト　ＩｇＧ、家兎ＩｇＧ及び馬ＩｇＧに対して
反応を示したが、ヒトＩｇＡ、ヒト　ＩｇＭ、山羊１ｇ
Ｇ及びマウスＩｇＧに対しては反応を示さなかった。一
方、ＩＢＭ型ｍＲＦはヒト　ＩｇＧ、山羊１ｇＧ、馬Ｉ
ｇＧ及びマウスＩｇＧに対して反応を示し、ヒトＪｇＡ
、ヒトＩｇＭ及び家兎ＩｇＧに対しては反応を示さなか
った。従って、ＭＲＬ／Ｍｐ−Ｉｐｒ／ｌｐｒ由来のｍ
ＲＦであっても、ＩｇＧ型のものと　ＩｇＭ　　型のも
のとは反応性が異なることが判る。

源定１０１例−Ｙ 参考例２で得た精製ＩｇＧ型マウマウスＦがヒトの免疫
複合体に対して示す反応性をＥＩＡ法により検討した。

即ち、参考例３におけると同様にＩｇＧ型ｍＲＦ感作プ
レートを作製し、各濃度の標準免疫複合体く三光純薬株
式会社製のｒ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｃｏｍｐｌｅｘ検出用試
薬」）を添加して２時間反応さぜな後に洗浄し、反応の
有無をアルカリフォスファターゼ標識を施した抗ヒト　
ＩｇＧ　（山羊Ｉ、ｇＧ）、抗ヒトＩｇＧ　［山羊１ｇ
Ｇ　−Ｆ（ａｂ’）２］、抗ヒト　ＩｇＧ　（マウスモ
ノクローナル）、ＩｇＧ型ｍＲＦ　（マウスモノクロナ
ール）及びＩｇＭ型ｍＲＦ　（マウスモノクロナール）
を用いて比較検討した。結果は第３人及び３Ｂ図に示さ
れる通りであった。

尚、対照として　ＩｇＭ型ｍＲＦを感作させた場合につ
いても同様の検討を行った。結果は第４人及び４Ｂ図に
示される通りであった。

これらの結果から、何れの型のｍＲＦを用いても上記の
ような標識抗体により免疫複合体の測定−１６＝ か可能であること並びに標識法を実施する場合には、殊
に固相化抗体として　ＩｇＧ型ｍＲＦを用いることによ
り　ＩｇＭ型ｍＲＦを用いる場合よりも高感度な測定系
を組めることが判明した。

汲支に１鮭ユく叫ｑ法との比較） 測定実施例１と同様にして、但しプレートにＩｇＧ型ｍ
ＲＦ　（参考例２）及びＣ１ｑをそれぞれ感作させて免
疫複合体を測定し、ＥＩＡ法により両者を比較検討した
。結果は第５図に示される通りであり、ＩｇＧ型ｍＲＦ
を用いる方が高感度で測定し得ることが判明した。

（発明の効果） 本発明方法に使用されるモノクローナルリウマ１〜イド
因子はその産生細胞株から得られたものであることがで
きるので、性質が常に一定であり且つその入手性も安定
しており、又モノクローナルリウマトイド因子であるが
故に測定感度や反応特異性に優れている。更に、本発明
方法に使用されるモノクローナルリウマトイド因子はＩ
ｇＧ型のものであり、従来発表されてきた１ｇＭ型のも
のと比較して構造が単純であり、安定性において優れて
いる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法において使用される　ＩｇＧ型マウ
スモノクローナルリウマトイド因子と無処理及び熱変性
ヒト　ＩｇＧとの反応性を示すグラフ、第２図は第１図
と同様の、但し熱変性し）　ＩｇＧ中のポリマーＩｇＧ
及びモノマーＩｇＧとの反応性を示すグラフ、第３Ａ及
び３Ｂ図はＩｇＧ型マウスモノクローナルリウマトイド
因子をプレートに感作させることにより固相化させ、こ
れを患者血清と反応させ、反応の有無を酵素標識した各
種の抗体で調べた結果を示すグラフ、第４Ａ及び４Ｂ図
は第３人及び３Ｂ図と同様な、但しＩｇＭ型マウスモノ
クローナルリウマトイド因子をプレートに感作させた場
合の結果を示すグラフ、第５図はＩｇＧ型マウスモノク
ローナルリウマトイド因子と　Ｃ１ｑとをそれぞれ用い
て免疫複合体を測定し、両者の測定結果を比較して示し
たグラフである。 派　　　　　　　　　　　　　　　　沫（ｗｕＯＯＣ，
）富渠遺 派　　　　　　　　　　　　　　　　　派ｄ （山Ｌ１００Ｃ，）”Ｗ蘂濯 昧　　　　　　　　　　　　　　沫 （ｕｐｕ００！；）葦票拍 第５図 免疫複合俸薮度（ｌ１ｇ／ｍｌ） φＣ１ｑ ΔＩｇＧ’１ｍＲＦ 手続補正書く自発） 昭和６２年６り／７日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト体液中の免疫複合体の測定法であって、Ｉｇ
   Ｇ型マウスモノクローナルリウマトイド因子を用いるこ
   とを特徴とする免疫複合体の測定法。
2. （２）ＩｇＧ型マウスモノクローナルリウマトイド因子
   が自己免疫疾患モデルマウスであるＭＲＬ／Ｍｐ−ｌｐ
   ｒ／ｌｐｒマウス由来のものであることを特徴とする、
   特許請求の範囲第１項に記載の免疫複合体の測定法。