JPH03187395A - ヒトインターロイキン―４に対するモノクローナル抗体および該抗体の利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はヒトインターロイキン−４（以下、ＩＬ−４と
略記する。）を特異的に認識し、かつ親和性の高いモノ
クローナル抗体、および該モノクローナル抗体の利用方
法、特に該抗体を用いた免疫学的定量法に関するもので
ある。

［発明の背景］ ＩＬ−４はレクチンやフォルボールエステルあるいは抗
原の刺激を受けたＴリンパ球が産生ずる、分子量１８．
０００〜２１．０００の糖タン白質であり、Ｂリンパ球
の分化、増殖、Ｔリンパ球の分化、増殖、肥満細胞の分
化、増殖など生体の免疫反応にとって重要な種々の作用
を有している［Ｙ、　　Ｎｏｒｔｒａ　ｅｔａｌ、、　
Ｎａｔｕｒｅ、　３１９．６４０−６４６　（１９８Ｂ
）、Ｐ、　Ｌｅｅ　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１
１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　８３．２０６
１−２０６５　（１９８６）　、Ｅ、　５ｅｖｅｒｉｎ
ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

１■ｕｎｏ１．、１７．６７−７２　（１９８７）およ
びＴ、Ｒ，Ｍｏｓｍａｎｎａｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３．５６５４−
５６５８　（１９８Ｂ）参照のこと］。１９８６年、ヒ
トＩＬ−４のｃＤＮＡがクローン化され、そのアミノ酸
配列も以下のように明らかにされた［Ｔ、　Ｙｏｋｏｔ
ａ　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　８３．５８９４−５８９８　
（１９８Ｂ）参照のこと］。

Ｍｅ　ｔ　Ｇ　Ｉ　ｙＬｅｕＴｈ　ｒｓｅ　ｒＧ　Ｉ　
ｎＬｅｕ［、ｅｕＰ　ｒｏＰｒｏＬｅｕＰｈｅＰｈｅＬ
ｅｕＬｅｕＡ　ｌ　ａＣｙｓ＾１ａＧｌｙＡｓｎＰｈｅ
ＶａｌＨ１ｓＧＩｙｌｌｌｓＬｙｓＣｙｓＡｓｐ１１ｅ
ＴｈｒＬｅｕＧＩｎＧｌｕｌｌｅｆ　ＩｅＬｙｓＴｈｒ
ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＬｅｕＴｈｒＧＩｕＧＩｎＬｙｓＴ
ｈｒＬｅｕＣｙｓＴｈｒＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＴｈ
ｒＡｓｐｌ　ＩｅＰｈｅ＾ＩａＡｌａＳｅｒＬｙｓＡｓ
ｎＴｈｒＴｈｒＧｌｕＬｙｓＧＩｕＴｈｒＰｈｅＣｙｓ
ＡｒｇＡｌａＡｌａＴｈｒＶａＩＬｅｕＡｒｇＧＩｎＰ
ｈｅＴｙｒＳｅｒｌｌｆｓｌｌｌｓＧＩｕＬｙｓＡｓｐ
ＴｈｒＡｒｇＣｙｓＬｅｕＧＩｙＡＩａＴｈｒ＾ＩａＧ
ｌｎＧＩｎＰｈｅｌｌｌｓＡ　ｒｇＨｊ　５ＬｙｓＧ　
Ｉ　ｎＬｅｕ　Ｉ　ｌ　ｅＡ　ｒｇＰｈｅＬｅｕＬｙｓ
Ａ　ｒｇＬｅｕＡｓｐＡｒｇＡｓｎＬｅｕＴｒｐＧｌｙ
ＬｅｕＡｌａＧｌｙＬｅｕＡｓｎＳｅｒＣｙｓＰｒｏＶ
ａｌＬｙｓＧＩｕＡＩａＡｓｎＧＩｎＳｅｒＴｈｒＬｅ
ｕＧＩｕＡｓｎＰｈｅＬｅｕＧＩｕＡｒｇＬｅｕＬｙｓ
Ｔｈｒｌ　ＩｅＭｅｔＡｒｇＧｌｕＬｙｓＴｙｒＳｅｒ
ＬｙｓＣｙｓＳｅｒＳｅｒ最近になって、Ｉ　Ｌ−４が
Ｂ細胞でのＩｇＥの産生誘導作用や肥満細胞の増殖促進
作用を有していることが明らかにされｒＪ、　Ｅｘｐ−
Ｍｅｄ、、　１６９（４）、　１２９５　（１９８９）
参照のこと１、ＩＬ−４がアレルギー反応に関与してい
るのではないかと考えられている。

ヒトＩＬ−４の詳細な生理学的作用の探究は、まだその
緒についたばかりで、今後の研究の成果に大きな期待が
かかるところであるが、その推進にはヒトＩＬ−４の微
量定量法を早急に確立する必要がある。

従来、ＩＬ−４の定量はその生物学的作用を利用して行
なわれてきた。すなわち、Ｉ　Ｌ−４によるＴ細胞の活
性化がどの程度なされたかによって、生成したＩＬ−４
の量を推定していた。この方法はいわゆるバイオアッセ
イである。しかしながら、バイオアッセイでは、ＩＬ−
４以外の生体内因子によってもＴ細胞が活性化されるの
で検出精度が劣るうえ、検出限界も約２５０　ｐｇ／　
ｍｌと悪く、その利用は大きく制限される状態であった
。

［従来の技術］ 当業者であれば、バイオアッセイより検出精度が高く、
検出限界もすぐれている方法として免疫学的定量法が考
えられる。免疫学的定量法の系を確立するためにはヒト
ＩＬ−４を特異的に認識し、かつ親和性の高いモノクロ
ーナル抗体を得る必要がある。

これまでにヒトＩＬ−４に対するモノクローナル抗体お
よび／または該抗体を用いた免疫学的定量法に関して以
下に示す３つの報告がある。

（１）欧州特許公開第３１４４０２号には、ヒトＩＬ＝
４に対するラットのモノクローナル抗体および該抗体を
用いたサンドイツチ法による免疫学的定量法が開示され
ている。より詳細には、常法によリリコンビナントのヒ
トＩＬ−４の腹腔的投与によってラットを感作した後、
肺臓を摘出し、集めた肺臓細胞をマウスのミエローマ細
胞と細胞融合し、得られたハイブリドーマ群を常法によ
ってスクリーニングして、ヒトＩ　Ｌ−４と特異的に結
合する抗体を産生ずる細胞Ｉ　Ｃｉｌｌ　Ｂ　４．６と
ＭＰ４．２５Ｄ　２．１１を得ている。Ｉ　Ｃ１，１ｌ
Ｂ４．８より産生されたモノクローナル抗体はそのクラ
スがラットＩｇＧ２．にアイソタイプであり、またＭ　
Ｐ　４．２５Ｄ２．１１より産生されたモノクローナル
抗体はそのクラスがラットＩｇＧ１であることが記載さ
れている。さらに該モノクローナル抗体を用いたヒト■
Ｌ−４の免疫学的定量法を確立している。該方法ではヒ
ト血清中５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−４まで検出可能である
ことが記載されている。

（２）一方、ヒトＩＬ−４のサンドイツチ法による測定
用試薬キットがすでにジエンザイム社（Ｇｅｎｚｙｗｅ
　Ｃｏｒｐ、社）より市販されている。該キットで用い
られているモノクローナル抗体の取得方法および抗体と
しての性質は、その仕様書の中では明らかにされていな
いが、本発明者らの確認実験によれば感作動物としては
マウスを用いているものと推定される。抗体のクラスは
確定することはできなかったが、該抗体は原液（濃度は
不明）の６倍希釈の濃度でヒトＩＬ−４の活性を完全に
阻害するものであることが確認された（第２図（ｂ）参
照）。また、本キットの検出限界は９０ＤｇヒトＩＬ−
４／ｍｌであることが仕様書の中で明らかにされている
。

（３）さらに、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　２６２．８
９７　（１９８９）には、ヒトＩＬ−４に対するマウス
のモノクローナル抗体、４Ｂ２−Ｆ９と４Ｂ２−ＨＩ３
が開示されている。４Ｂ２−Ｆ９はそのクラスがＩｇＧ
ｔアイソタイプであり、６．２５μｇ／ｍｌ濃度でヒト
ＩＬ−４の活性をほぼ１００％阻害するものであり、一
方４Ｂ２−Ｈ１２は１ｇＧ２アイソ（２５ タイプであり、また　　■−組み換えヒトＩＬ４を用い
るヒトＩＬ−４レセプターパインディングアッセイで、
腹水の７倍希釈の濃度まで無影響であることが記載され
ている。

［従来技術の問題点］ これまでに知られているヒトＩＬ−４の免疫学−１，１ 的定量法における検出限界は１０　　　ｇ／ｍｌのオー
ダーであるが、生体でのヒトＩＬ−４の分泌が超微量で
あることを考慮すると、まだまだ満足できる値ではない
。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、精度および検出限界のよりすぐれた免疫
学的定量法を確立すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒトＩ
Ｌ−４を特異的に認識し、かつ親和性の高いモノクロー
ナル抗体を得、目的が達成されることを見い出して本発
明を完成した。

本発明のモノクローナル抗体が前記［従来の技術］で示
した３つのモノクローナル抗体と全く異った新規な抗体
であることはその性質より明らかである。すなわち、本
発明のモノクローナル抗体はヒトＩ　Ｌ−４をマウスに
感作することによって得られたマウスの抗体であり、そ
のクラスはＩ　ｇ　Ｇ１　、　　にアイソタイプである
ことが確認されている。一方、［従来の技術］中、（１
）で示した抗体はラットより得られた抗体であるので、
両者は根本的に異なる。一方、（２）で示した抗体の感
作動物種はその仕様書では明らかにされていないが、本
発明者らの確認実験ではマウスであると推定される。し
かしながら、両抗体のヒトＩＬ４に対する阻害パターン
が異なる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体、３
８０−１のヒトＩＬ−４に対する阻害は１００μｇ　／
　ｍｌに濃度を」二げても７０数％程度で、１００％活
性を阻害することはない。これに対し、（２）で示した
モノクローナル抗体は原液（濃度は不明）の６倍希釈の
濃度で１００％の阻害が認められる。この事実は、両モ
ノクローナル抗体では、ヒトＩＬ−４に対する認識部位
が異なっていること、すなわち抗体の超可変領域が異な
っていることを意味する。

従って、本発明のモノクローナル抗体、３８０−１は（
２）で示したモノクローナル抗体とは構造が全く異なっ
たものであると結論づけられる。

一方、本発明に含まれるもうひとつのモノクローナル抗
体、すなわち１４４−６はＩ　ｇＧｌ、　　にアイソタ
イプ型の抗体であって、ヒトＩＬ−４の活性を１００μ
ｚ　／　ｍｌでも２０数％しか阻害しないので、［従来
の技術］中の（２）の抗体とは構造が異なっていると言
える。

また、（３）で示した抗体もマウス抗体であるがやはり
クラスと阻害パターンの点で本発明のモノクローナル抗
体とは異なる。すなわち、一方の抗体、４Ｂ２−Ｆ９は
６．２５　μｇ；　／　ｍｌでヒトＩＬ−４の活性をほ
ぼ１００％阻害するのに対し、本発明の抗体、３８０−
１は１００μｇ／ｍｌの濃度で７０数％の阻害しか示さ
ない。他方４Ｂ２−ＨＩ３は１ｇＧ２アイソタイプであ
るのに対し、本発明の抗体１４４−６はＩｇＧｔ、　　
にアイソタイプである。また４Ｂ２−ＨＩ３は１２５Ｉ
−組み換えヒトＩ　Ｌ−４を用いるヒトＩ　Ｌ−４リセ
プターバインデイングアツセイにおいて、腹水の７倍希
釈の濃度（概ね１０００μｚ　／　ｍｌの濃度と推定さ
れる）まで影響を与えない旨の記載があるが、本発明の
抗体１４４−６は１００μｚ／ｍＩで８２％の結合阻害
活性を有している。

さらに、［従来の技術］中の（１）および（２）の定量
法の検出限界は、Ｉ　Ｃ１”’　ｇ／ｍｌであるのに対
し、本発明のそれはＣ９ｐｇ／ｍｌすなわち１０−１２
ｇオーダーまで測定可能となった。本発明のモノクロー
ナル抗体を用いることによって、検出限界が１オーダー
向上するということは全く予期できないことであった。

［発明の開示］ 従って、本発明はヒトＩＬ−４を特異的に認識し、かつ
親和性の高いマウスモノクローナル抗体、３８０−１お
よび１４４−６、さらに該モノクローナル抗体の利用方
法に関する。

本発明の抗体のうち、３８０−１は、１００μｇ　／　
ｍｌの濃度でヒトＩＬ−４の生物学的活性の７２．５％
を阻害するが、さらに抗体の濃度を上げても１００％阻
害には至らない抗体であり、他方、１４４−６は１００
μｇ／ｍｌの濃度でも２０％を阻害するに過ぎない抗体
である。

２５ また、　　　■−ヒト組み換えＩＬ−４を用いるＩＬ−
４レセプターパインデイングアツセイにおいて、３８０
−１は１００μｇ／ｍｌで９４．５％の結合阻害活性を
有しており、１４４−６は１００μｇ　／　ｍｌで８２
％の結合阻害活性を有する。

従って、これら２種類の抗体はヒトＩＬ−４の異なるエ
ピトープを認識するものと考えられる。

また両抗体のＩｇＧサブクラスはともにマウスＩｇＧ１
．　　にであることが確認されている。

本発明のモノクローナル抗体は、 （１）ヒトＩ　Ｌ−４を免疫抗原としてマウスを感作し
、 （２）感作マウスの牌細胞とマウスミエローマ細胞を細
胞融合し、 （３）得られたハイブリドーマよりＩＬ−４に対するモ
ノクローナル抗体を産生ずる細胞をスクリーニングし、 （４）目的とする抗体産生ハイブリドーマをクロニング
し、 （５）クローン化された抗体産生ノ１イブリドーマを増
殖させ、 （６）産生きれた抗体を分離精製する ことによって調製することができる。

より具体的に各ステップを説明すると以下のようになる
。

（１）の免疫感作の工程は、初回免疫感作時にはヒトＩ
Ｌ−４（天然のものでも遺伝子操作によって作製された
ものでもよい）を生理的食塩含有リン酸緩衝液（以下、
ＰＢＳと略記する）中に溶解し、フロイントの完全アジ
ユバント（ＦＣＡ）と１：１の割合で乳化させたものを
マウスに腹腔内投与し、２週間後、同様にヒトＩＬ−４
を含むＰＢＳをフロイントの不完全アジユバント（Ｆ　
Ｉ　ＣＡ）と１＝１の割合で乳化させたものを腹腔内投
与し、さらに２週間後、ヒトＩＬ−４を含むＰＢＳを腹
腔内投与することによって行なわれる。用いられるマウ
スの種類は特に限定されないが、好ましくはＢ　Ａ　Ｌ
　Ｂ　／　ｃである。感作の回数および抗原の投与量は
特に限定されないが、１回につき５０〜１００μｇのヒ
トＩＬ−４を３回投与すれば十分である。

（２）の細胞融合は、まず（１）で免疫感作したマウス
の肺臓を摘出し、常法に従って、牌細胞の懸濁波を調製
し、次に得られた牌細胞とマウスミエローマ細胞との混
合物に３７℃でポリエチレングリコール（好ましくは、
Ｐ　Ｅ　Ｇ　１５００）を加えることによって行われる
。マウスミエローマ細胞にはＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３／
ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＳＰ−２１０−Ａｇ−１４な
ど数種類が知られており、いずれも容易に入手可能であ
る。ミエローマ細胞はＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、ア
ミノプテリンおよびチミジンを含む培地）では生存でき
ないＨＧＰＲＴ　（ヒボキサンチン・グアニン・ホスホ
リボシル・トランスフェラーゼ）欠損細胞株が有用であ
り、さらにミエローマ細胞自身が抗体を分泌しない細胞
株であることが望ましい。好適にはＳＰ−２１０−Ａｇ
−１４が用いられる。

次に、得られた融合細胞の混合物を、低細胞密度で９６
マイクロウエルプレートに分注し、Ｉ（ＡＴ培地中で培
養する。１〜２週間の培養で未融合のミエローマ細胞、
ミエローマ細胞同志のハイブリドーマ、さらに未融合の
牌細胞、肺細胞同志のハイブリドーマは生存条件が満足
されないため死滅し、牌細胞とミエローマ細胞とのハイ
ブリドーマのみが増殖してくる。

（３）のスクリーニングは、ハイブリドーマ培養上清中
の抗ヒトＩＬ−４活性を測定することにより行なわれる
。すなわち、黄色ブドウ状球菌の死菌にマウスＩｇＧに
対するウサギポリクローナル抗体（Ｉ　ｇＧ画分）を結
合させたものに、ハイブリドーマ培養上清、さらにヒト
Ｉ　Ｌ−４を加えて、その上清中のＩＬ−４活性をバイ
オアッセイで測定し、活性が減弱またはゼロとなった検
体は目的とするモノクローナル抗体を産生じていると判
定できる。

（４）の工程は、抗体産生ハイブリドーマを軟寒天培養
法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　
３７２ページ（１９８０）参照のこと］に従ってクロー
ニングすることによって行われる。この際、限界希釈法
を用いることも可能である。

（５）の工程は、クローン化されたパイブリドーマを通
常の培地で培養し、その培養上清から分離精製すること
によって得られるが、より大量の抗体を効率よく得るに
はハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し増殖させ、そ
の腹水中より分離精製する方法が用いられる。

（６）の工程は、通常の方法、例えば塩析、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー等により精製
できるが、より効果的にはアフィゲルプロティンＡ　（
Ａｆｆ’１ｇｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　）ＭＡＰＳＩ
Ｉカラム（Ｂ　ｌｏ−ＲＡＤ社製）を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーが用いられる。

本発明のモノクローナル抗体はヒトＩ　Ｌ−４を特異的
に認識し、かつ親和性の高いものであるので、ヒトＩ　
Ｌ−４の精製、例えばアフィニティークロマトグラフィ
ー等に利用することができる。

また、本発明抗体のうち、ヒトＩＬ−４の活性を阻害す
る抗体、すなわち３８０−１は、それ自身あるいはそれ
とヒトＩｇＧとのキメラ抗体の形でＩＬ−４の異常産生
を伴うと考えられる種々の疾患、例えばＩ型アレルギー
が原因とされる諸疾患、例えばアナフィラキシ−性ショ
ック５、じん麻疹、喘息、鼻炎、腸管アレルギー等、ま
た慢性関節リウマチ、全身性エリトマト−デス、特発性
血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無
力症等に代表される自己免疫疾患の治療および／または
予防に用いることができる。

しかし、本発明のモノクローナル抗体の最大かつ重要な
利用方法は、精度および検出限界にすぐれた、ヒトＩＬ
−４の免疫学的定量法への適用である。

免疫学的定量法には一点結合測定法と二点結合測定法（
いわゆるサンドイツチ法）がよく知られているが、精度
および検出限界の点で二点結合測定法がすぐれている。

二点結合測定法は、第１図に概略図を示すように、 （１）固相化したヒトＩＬ−４に対するモノクローナル
抗体（第１抗体）に、ヒトＩＬ−４を含有するサンプル
を添加して、該モノクローナル抗体とヒトＩＬ−４を結
合させ、 （２）（１）で得られた結合物にヒトＩＬ−４に対する
ポリクローナル抗体（第２抗体）を結合させ、 （３）（２）で得られた結合物に、第２抗体を認識し、
かつ標識物で標識された抗体（第３抗体）を結合させ、 （４）該標識物の活性を測定する ことによって、サンプル中のヒトＩＬ−４を測定する方
法である。

第１抗体としては、本発明のモノクローナル抗体、３８
０−１または１４４−６が用いられるが、より好ましく
は３８０−１である。免疫学的定量法に用いられる固相
および固定化方法はよく知られている（千畑一部編、固
定化酵素（１９７５年、講談社発行）参照のこと）。例
えば、固相としてはポリスチレンプレート、ポリスチレ
ンビーズ、ナイロンビーズ、ガラスピーズ、プロティン
Ｇアガロースビーズ、ポリスチレンチューブなどが挙げ
られるが、より好ましくは市販の９６ウエルボリスチレ
ンプレートである。固定化は物理的吸着や共有結合によ
る不溶化法が用いられる。第１抗体とサンプル中のヒト
ＩＬ−４との反応は２４℃で１晩放置することで行なわ
れる。

第２抗体はヒトＩＬ−４に対するポリクローナル抗体で
あれば感作する動物種に制限はない。該ポリクローナル
抗体の作製は公知の方法により行なわれる。例えば、ヒ
トＩＬ−４（天然のものでも遺伝子操作によって作製さ
れたものでもよい）と適当なアジユバントとの混合物を
感作動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサ
ギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ等、好ましくはウサギ）
に適当な投与間隔で数回静脈内、皮下または腹腔内投与
して感作する。感作後血清を採取して、アフィニティー
クロマトグラフィー等により分離精製して、所望の抗体
画分を得ることにより目的とするヒトＩ　Ｌ−４に対す
るポリクローナル抗体が作製される。第１抗体ＩＬ−４
結合物と第２抗体との反応は２４℃で数時間、好ましく
は２時間放置することで行なわれる。

第３抗体は第２抗体を認識する抗体であれば特に制限は
ない。標識物としては一般に酵素が用いられるがラジオ
アイソトープ、蛍光物質も使用できる。ここで用いられ
る酵素としては一般的に酵素免疫測定に用いられる酵素
であれば何でもよく、例えば、ペルオキシダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵
素等が挙げられ、好ましくは西洋ワサビペルオキシダー
ゼである。ペルオキシダーゼで標識されたウサギＩｇＧ
に対するヤギポリクローナル抗体や同様に標識されたヒ
ツジポリクローナル抗体は市販されている。市販されて
いないものでも公知の方法により容易に作製することが
できる。第１抗体−Ｉ　Ｌ−４−第２抗体の結合物と第
３抗体との反応は２４℃で数時間、好ましくは２時間放
置することにより行なわれる。

（４）の標識物の活性の測定も公知の方法により行なわ
れる。例えば、第３抗体をペルオキシダーゼで標識した
場合には基質としてオルトフェニレンジアミンを用いて
過酸化水素を反応させ、反応生成物のＯ，０，４９０を
測定することによって行なわれる。この場合、基質とし
て３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸や３．
３’　　５．５’−テトラメチルベンチジンを使用する
こともできる。これ以外の場合でも適当な基質を用いて
行なわれる。

二点結合測定法のより簡便な方法として、第２抗体を標
識物で標識し、第３抗体との反応を省略する方法が知ら
れている。この場合、ヒトＩＬ−４に対するポリクロー
ナル抗体自身を標識することもできるが、該抗体をパパ
インで分解したＦａｂフラグメント、あるいはペプシン
で分解したＦ（ａｂ）２フラグメント、あるいは該フラ
グメントをさらに還元的に開裂させたＦａｂ　　フラグ
メントを標識して第２抗体として用いることもできる。

さらに、前記した二点結合測定法の応用として、第１抗
体としてヒトＩＬ−４に対するポリクローナル抗体を用
い、第２抗体としてヒトＩＬ−４に対するモノクローナ
ル抗体を用いて、標識された第３抗体（例えば標識され
た、マウスＩｇＧに対するポリクローナル抗体）で検量
する方法やあるいは該方法において、第２抗体自身、ま
たはそのＦａｂフラグメント、Ｆ　（ａ　ｂ　　）　２
フラグメント、Ｆａｂ−フラグメントを標識して、第３
抗体との反応を省略する方法も行なうことができる。

本発明のモノクローナル抗体は一点結合測定法によるヒ
トＩＬ−４の定量方法にも用いることができる。

一点結合測定法は、 （１）ヒトＩＬ−４を含有するサンプルを固相に固定化
し、 （２）ヒトＩ　Ｌ−４に対するモノクローナル抗体（第
１抗体）を添加して、ヒトＩＬ−４と結合させ、 （３）（２）で得られた結合物に、第１抗体を認識し、
かつ標識物で標識されたポリクローナル抗体を結合させ
、 （４）該標識物の活性を測定する ことによって行なわれる。固相、固定化方法、標識物、
反応条件等は二点結合測定法に準じて任意に選択できる
。

［発明の効果］ 本発明のヒトＩＬ−４に対するモノクローナル抗体、３
８０−１または１４４−６を用いることによって、測定
感度が極めて高く（測定限界は３−９　ｐｇ／ｍｌ）　
、特異性にすぐれた、再現性の高い、ヒトＩＬ−４の免
疫学的定量法が確立された。

［実施例］ 以下に実施例をあげて本発明をより具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１ ヒトＩＬ−４に対するモノクローナル抗体、３８０−１
および１４４−６の作製 （１）マウスの感作 組み換えヒトＩＬ−４（特願昭６３−１８８８７１号明
細書に記載された方法により作成した）５０μｇを含有
するＰ　Ｂ　Ｓ　（０，５ｍｌ）とＦ　ＣＡ　（０，５
ｍｌ）からなるエマルジョンをＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ
雌性マウス２匹のそれぞれに腹腔的投与した。２週間後
、前回と同様に調製した、ＰＢＳに溶解した組み換えし
トＩＬ−４とＦＩＣＡ（１：１）からなるエマルジョン
を腹腔的投与して追加免疫を行なった。

さらに２週間後、ＰＢＳ（１ｍｌ）に溶解した組み換え
ヒトＩＬ−４（８０μｇ）を腹腔的投与した。

（２）細胞融合 最終免疫から３日後に、感作マウスから肺臓を摘出し牌
細胞を調製した。得られた牌細胞とマウス骨髄腫細胞［
ＳＰ−２１０−Ａｇ１４、Ｎａｔｕｒｅ、　２７６、２
６９　（１９７８）記載の方法により調製した］を１０
：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール［Ｐ　Ｅ
　Ｇ１５００　（登録商標）、ＭＡバイオプロダクト社
製］を５０％の濃度で加えて、ｃｏｄｔｎｇの方法［Ｊ
、　Ｉｇｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　３９．２８
５（１９８０）参照のこと］に準じて細胞融合を行なっ
た。

融合操作後の細胞混合物を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢ
Ｓ）　、１０％ウマ血清（Ｈ８）、１０％ＮＣＴＣ１０
９培地（登録商標、ＭＡバイオプロダクト社製）、ヒボ
キサンチン（１３，６μｇ　／　ｍｌ　）、チミジン（
３，９μｇ／ｍｌ）およびグリシン（２，０μｇ　／　
ｍｌ　）を含有するダルベツコ変法イーグル培地（以下
、ＤＭＥと略記する）　　（４，５ｇ／ｌグルコース含
有タイプ、ギブコ社製）を浮遊させ、９６ウエルプレー
トに分注して３７℃、７％ＣＯ２含有大気下で培養した
。培養後２．４および７日目に、培地の半量をＨＡＴ培
地（アミノプテリン０．１８μｇ　／　ｍｌを含有する
上記イーグル培地）に変換し培養を続けた。培養１００
日目ろより、いくつかのウェルではブドウの房状のコロ
ニーが形成され、最終的に１００６ウエルにおいてノ＼
イブリドーマの増殖が認められた。

（３）モノクローナル抗体産生株のスクリーニング スクリーニングは金子らの方法［Ｊ、ＢＩｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　２６２．６７４１　（１９８７）記載］
に準じて行なった。すなわち、２０ｍＭ　　）リス−塩
酸緩衝液（１）１１８．０）（１００μｇ）に懸濁させ
た黄色ブドウ状球菌（５μｇ）にマウスＩｇＧに対する
ウサギポリクローナル抗体（ＩｇＧ画分）（６０μｇ）
を加えて、ブドウ状球菌と該抗体を結合させ、未結合の
抗体はＰＢＳによる洗浄および遠心分離（１５００Ｘ　
ｇ、　１０分間）を繰り返して除いた。

得られた結合物にハイブリドーマ培養上清（１００μＩ
ｌ）を加えて、ＰＢＳによる洗浄および遠心分離をした
後、得られたペレットを組み換えヒトＩ　Ｌ−４（２μ
ｇ／ｍｌ）を溶解した１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭ　Ｉ　−
１８４０にラスイ社製）（１００μρ）に懸濁させ、室
温でインキュベーションした。１時間後遠心分離して、
得られた上清中のＩＬ−４活性を測定し、該活性が減少
または消失している場合をヒトＩＬ−４に対する抗体を
産生しているウェルであると判定した。

ヒトＩ　Ｌ−４活性はヒトリンパ球増殖刺激活性を指標
にして測定した。すなわち、ヒト末梢血より調製したリ
ンパ球をフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（１０，ｃｚ
ｇ／ｍｌ）を含む培養液［１０％ウシ胎児血清、５Ｘ１
０−５Ｍ　　２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭ　
ｌ−１６４０１に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で
４〜６日間培養した。

培養液を用いて充分洗浄（３回以上）したリンパ球を２
００μｇの培養液中に５Ｘ１０’個含まれるように再懸
濁し、被検サンプルを加えて、更に３日間培養を続けた
。最後の１２時間をトリチウムチミジン（０，２５μＣ
ｉ／カルチヤー）でパルスした後、その高分子画分への
取込量を液体シンチレーションカウンターを用いて測定
した。

（４）抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養ヒトＩＬ−４
に対する抗体を産生じていると判定された細胞（２ウエ
ル）をＫｅｎｎｅｔｔの方法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　　３７２ページ（１９８０）
参照のこと］に従って軟寒天培養法でクローニングした
。

クローン化した株細胞１０７個をあらかじめブリスタン
処理しておいたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌性マウスの腹
腔内に移植した。約２週間後、腹水が大量に蓄積された
時点で腹水を採取した。得られた採水を５０％飽和硫安
で分画した後、アフィゲルプロティンＡ　　ＭＡＰＳｎ
カラム（Ｂ　ｌｏ−ＲＡＤ社製）を用いたアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーで精製してＩｇＧ画分を得
た。なお、本発明のモノクローナル抗体、３８０−１お
よび１４４−６を産生ずるハイブリドーマ、３８０１株
および１４４−６株は、微生物工業技術研究所に、それ
ぞれ、寄託番号微工研条寄第２４８６号（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−２４８６）および同第２４８５号（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−２４８５）で１９８９年６月２１日に寄託されて
いる。

実施例２ 本発明のモノクローナル抗体の諸性質 （１）イムノグロブリンサブクラス 実施例１で作製したモノクローナル抗体、３８０−１お
よび１４４−６について、マウスＭｏｎｏ　　Ａ　ｂ　
−Ｉ　Ｄ　　Ｅ　Ｉ　Ａキット（Ｚｙｍｅｄ社製）を用
いてサブクラスをスクリーニングした。その結果、両抗
体はともにマウスＩ　ｇＧｌ、　　にであった。

（２）　生物学的性質 ヒト末梢リンパ球のＰＨＡにより幼若化した細胞（Ｐ　
Ｂ　Ｌ）に対するＩＬ−４の活性化作用に及ぼす両抗体
の効果について検討した。すなわち、組換えヒトＩ　Ｌ
−４（２Ｊ　ｎ　ｇ／ｍｌ）と種々の濃度のモノクロー
ナル抗体を混和し、ＰＢＬ５Ｘ１０’個１０．２ｍｌ／
ウェルとともに３７℃、５％ＣＯ２含有大気下で７２時
間培養した。培養後ＭＴＴ法［Ｍｅｄｌｃａｌ　Ｉｍｓ
ｕｎｏｌｏｇｙ、　１２．４１１（１９８Ｂ）参照のこ
と］でＰＢＬの生物学的活性を測定した。結果を第２図
（ａ）に示す。図かられかるように、モノクローナル抗
体、３８０−１は０、ｌμｇ／ｍｌからヒトＩＬ−４の
活性を阻害する作用を示し、１００μｇ／ｍｌでは７２
．５％の阻害作用を示したが完全阻害には至らなかった
。一方、モノクローナル抗体、１４４−６は１００μｇ
　／　ｍｌでも２０％程度の阻害を示すにとどまった。

このことから、３８０−１と１４４−６はヒ）　Ｉ　Ｌ
−４の立体構造の異なる部分を認識しているものと考え
られる。さらに３８０−１は、ヒトＩＬ−４がリセブタ
ーと結合してシグナル伝達する部分を必ずしも完全に認
識しているのではなく、ヒトＩＬ−４と結合することに
よって、ヒトＩＬ−４の立体構造の変化を引き起こすか
、あるいはりセブターとの結合を障害することによって
阻害効果がでている可能性が示唆される。

（３）ウェスタンブロッティング 組換えヒトＩＬ−４産生ＣＨＯ細胞の培養上清（特願昭
８３−１８６８７１号明細書参照のこと）の５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥとの対比から、モノクローナル抗体、３８０−１
および１４４−６を用いたウェスタンブロッティング［
Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｌ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７６、４３５０　（１９７９）記載の
方法に従って行なった。］において、分子量１４〜１９
Ｋｄのところに数本のバンドが検出された。これらは精
製ヒトＩＬ−４を用いて同様にして行なったウェスタン
ブロッティングによって検出されるバンドと位置的に一
致していた。また本方法において、３８０−１では０−
２　ｎ　ｇ　ｓまた１４４−６では５ｎｇの組換えヒト
ＩＬ−４の存在が確認できた。

（４）ヒトＩＬ−４リセプターバインディングアッセイ ヒト組み換えＩＬ−４をＩｏｄｏｇｅｎ試薬（Ｐｌｅｒ
ｃｅ社製造）を用いて、Ｆｒａｋｅｒらの方法［Ｂｌｏ
ｃｈｅｓ。

Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｕ＋、、　８０．
８４９　（１９７８）に記載されている］によりヨウ素
（１２５１）化し、比放射能４　Ｘ　１０１５ｃｐｓ／
＊ａｇｏｌの標識化合物を得た。

ＰＨＡ刺激ヒト末梢リンパ球１０６個と各濃度の抗体、
あるいは３μＭの非標識ＩＬ−４存在下、１５０μＭの
１２５Ｉ−ヒト組み換えＩ　Ｌ−４を添加して終審量２
００μｇとし、１０％ＦＢＳ、２０ｍＭ　　ＨＥ　Ｐ　
Ｅ　Ｓおよび０．２％アジ化ナトリウムを含有するＲＰ
ＭＩ−１６４０培地（ｐｉｔ　７．２）を用いて４℃で
２時間インキュベーションした。

結合および非結合の１２５Ｉ　−Ｉ　Ｌ−４はオイルク
ツション法［Ｎａｔｕｒｅ、　３２０．７５　（１９８
６）に記載されている］によって分離し、γ−カウンタ
ー（島津製作所製）で放射活性を測定した。大過剰のＩ
　Ｌ−４存在下での放射活性の値を非特異的結合値とし
て各測定値から差し引き、特異的結合値を算出した。結
果を第３図に示す。図かられかるように、本発明のモノ
クローナル抗体、３８０−１および１４４−６は０．３
μｇ　／　ｍｌから容量依存的にＩＬ−４のレセプター
との結合を阻害し、１００μｇ／ｍｌで３８０−１は９
４．５％、１４４６は８２％の阻害活性を示した。なお
、本実験では、ＩＬ−４と無関係な抗体（抗ウシインシ
ュリンモノクローナル抗体）をコントロールとして用い
たが、１００μｇ　／　ｍｌでも無影響であった。

実施例３ 本発明のモノクローナル抗体、３８０−１を用いた免疫
学的定量法 （１）ヒトＩＬ−４に対するウサギポリクローナル抗体
の調製 組み換えヒトＩＬ−４（特願昭６３−１８６８７１号明
細書に記載された方法により作製した）　　（２ａ＋ｇ
）を含有するＰＢＳ（１ｍｌ）とＦＣＡ（１ｍｌ）から
なるエマルジョンを雄性ニューシーラントホワイトラビ
ットの背部皮下に数ケ所に分けて投与した。

初回感作から１０．２４および３８日後に、前回と同様
に調製した、組み換えＩＬ−４を含有するＰＢＳとＦＩ
ＣＡ（１：１）からなるエマルジョンを皮下投与して追
加免疫を行なった。さらに初回感作から５８日目に、Ｐ
ＢＳ（３ｍｌ）に溶解した組み換えヒトＩＬ−４（３■
）で最終感作した。

それから７日後に頚動脈より全血液を採取し、室温で３
時間放置後、遠心分離しく１５００Ｘ　ｇ、１０分間）
血清を得た。得られた血清をプロティンＡセファロース
（Ｐｒｏｔｅｌｎ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　ＣＬ
　−４Ｂカラム（ファルマシア社製造）を用いたアフィ
ニティークロマトグラフィーで精製しＩｇＧ画分を得た
。この両分をＰＢＳに対して透析して、ヒトＩＬ−４に
対するウサギポリクローナル抗体を得た。

（２）ヒトＩＬ−４の免疫学的定量用試薬の調製 （ａ）第１抗体溶液 本発明のモノクローナル抗体（３８０−１、実施例１で
調製した。）を０．（Ｍ　　炭酸水素ナトリウム溶液で
３０％ｇ　／　ｍｌとなるように調製したもの。

（ｂ）第２抗体溶液 ヒトＩＬ−４に対するウサギポリクローナル抗体（実施
例３−（１）で調製した。）を２％ＦＢＳを含有するＰ
ＢＳで２．５μｇ／ｍｌとなるように調製したもの。

（ｃ）第３抗体溶液 西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたウサギＩｇＧ
に対するヤギポリクローナル抗体（ＺＹＭＥＤ社製）を
１％ヤギ正常血清（Ｖｅｃｔｏｒ社製）含有ＰＢＳで２
０００倍希釈したもの。

（ｄ）標準溶液 組み換えヒトＩＬ−４を１０％ＦＢＳ含有ＲＰ　Ｍ　Ｉ
　−１８４０テ１０００．５００．２５ｏ１１２５．６
２．５．３１．３、■５．６．７．８．３．９μｇ／ｍ
ｌとなるように調製したもの。

（ｅ）洗浄液 ０．０５％Ｔｖｅｅｎ　　２０含有ＰＢＳ０（ｆ）ブロ
ッキング液 ブロッキング試薬（ベーリンガー山之内社製）を水１０
０ｍ１に溶解したもの。（使用時に水で１０倍希釈して
用いる。） （ｇ）基質溶液 （１）０．０３％過酸化水素溶液。

（１１）１０■オルトフエニレンジアミン塩酸塩の錠剤
（以下、ＯＰＤと略記する、 Ｓｉｇｍａ社製）を０．１Ｍクエン酸・リン酸緩衝液（
ｐＨ５，０）で２■／ｍｌとなるように調製したもの。

（１）と（１１）を使用する直前に等量混合する。

（ｈ）反応停止波 ＩＮ硫酸溶液。

（３）（２）で調製した試薬を用いたヒトＩＬ４の測定 ９６ウエルのイムノプレート（Ｎｕｎｃ社製）に第１抗
体溶液を各ウェル１００μ皮ずつ加え、シールで密封し
た後、２４℃で１晩放置した。（以後、放置の際はプレ
ートをシールで密封した。） ２）プレート中の第１抗体溶液を回収した後、洗浄液（
３００μρ／ウエル）で３回洗浄した。（以後、洗浄は
各ウェル３００μρで３回行った。） ブロッキンダ液を各ウェル３００μρずつ加え、４〜５
時間放置した。

４〉　ブロワキンダ液を除去した後、洗浄した。

５）標準溶液を各ウェル１００μρずつ加え、室温で１
晩放置した。

６）標準溶液を除去した後洗浄した。

１） ３） ７〉　第２抗体溶液を各ウェル１００μｇずつ加え、２
４℃で２時間放置した。

８）第２抗体溶液を除去した後洗浄した。

９）第３抗体溶液を各ウェル１００μＤずつ加え、２４
℃で２時間放置した。

１０）第３抗体溶液を除去した後、洗浄した。

１１）基質溶液を各ウェル１００μρずつ加え、２４℃
で１０分間反応させた。（反応は暗所で行った。） １２）反応停止液を各ウェル１００μＤずつ加えて、反
応を停止させた。

１３）マイクロプレート用ミキサー（Ｂｅｌｃｏ社製）
を用いて３０秒間混和した後、Ｏ，Ｄ、４９０をエライ
ザ−（日本インターメッド社製；イムノリーダーＮ　Ｊ
　−２０００）にて測定した。

標準ＩＬ−４のＯ，Ｄ、４９０値を第１表に示すととも
に、その値をプロットした標準検量線を第４図に示す。

第１表二本発明の定量法における標準ＩＬ−４のＯ，０
，４９０値（Ｐ値はＩＬ−４ Ｏｎｇ／ｍｌのＯ，Ｄ、４９０に対して）第１表および
第４図かられかるように、本発明の定量法によって、３
．９〜５００　ｐｇ／　ｍｌまでの濃度のヒ）　Ｉ　Ｌ
−４が測定可能である。検出限界３．９　ｐｇ／ｍｌと
いう値は、［従来の技術］中の（１）のそれ、５０ｐｇ
／ｍｌおよび（２）のそれ、９０ｐｇ／ｍｌよりはるか
にすぐれた値であり、超微量定量の分野でも本定量法が
十分耐え得ることを示すものである。

実施例４ 本発明の免疫学的定量の性質 （１）本発明の定量法とバイオアッセイとの相関関係 本発明の定量法（実施例３の方法により測定した）とバ
イオアッセイ（実施例１−（３）に記載したヒトリンパ
球増殖刺激活性を指標とする定量法）によって各種検体
中のヒトＩＬ−４量を定量した。両定量法の相関関係を
第５図に示す。

相関の回帰直線はｎ＝５、ｒ＝０．９９８、ｙ＝０．９
３７χ十０．９６８となり、両定量法間には良好な相関
が認められた。

（２）本発明の定量法を用いる添加回収実験組み換えＩ
Ｌ−４（約１４　ｐｇ／　ｍｌ　）を含有する溶媒（１
０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地）に、種々の濃
度の組み換えＩＬ−４を添加し、各試料中のＩＬ−４含
量を実施例３に従って定量した。

回収量および回収率を次表に示す。

表かられかるように、いずれの濃度においても回収率は
８４％以上である。このことは、本発明の定量法が非常
に精度の高い方法であることを示しているといえる。

（３）本発明の定量法におけるアッセイ内変動試験 実施例３記載の方法に従って検量線を作成した後、同一
プレート内の各試料（約２５．５０および１００　ｐｇ
／　ｍｌの組み換えヒトＩＬ−４を含有しているもの）
中のＩ　Ｌ−４濃度をｎ＝５で測定し、平均値、標準偏
差および変動係数（ＣＶ値）を算出した。結果を次表に
示す。

第３表：アッセイ内変動試験 表かられかるように、いずれの濃度においてもＣ，Ｖ、
値は６％以内であり、このことは本発明の定量法が非常
に精度の高い方法であることを示しているといえる。

（４）本発明の定量法におけるアッセイ間変動試験 実施例３記載の方法に従って、毎回ごとに検量線を作成
し直すことを条件として各試料（約２５．５０および１
００　ｐｇ／　ｍｌの組み換えヒトＩＬ−４を含有して
いるもの）中のＩ　Ｌ−４濃度の測定を５回行って、平
均値、標準偏差および変動係数（Ｃ，Ｖ、値）を算出し
た。結果を次表に示す。

第４表：アッセイ間変動試験 表かられかるように、いずれの濃度においてもＣ，Ｖ、
値は５．４％以内であり、このことは本発明の定量法が
非常に精度の高い方法であることを示している。

（５）　本発明の測定法における血清濃度の影響５．２
０．４０および１００％ヒト血清存在下［溶媒としては
ＲＰＭＩ−１６４０培地にラスイ社製造）を用いた］、
種々の濃度の組み換えうヒトＩ　Ｌ−４（３，９〜２５
０ｐｇ／ｍｌ）を添加し、本発明の免疫学的定量法（実
施例３に記載した方法）によって定量した。結果を第５
表および第６図に示す。

一般に免疫学的定量法においては、試料中の血清濃度が
測定の感度、精度、検出限界等に悪影響を及ぼすことが
多いが、本発明の測定法は血清濃度にまったく影響され
ないことが判明した。すなわち第５表および第６図から
れかるように、血清濃度に依存して発色強度は低下する
が、いずれの場合もきれいな直線関係を示し、またヒト
ＩＬ４の添加量が３．９　ｐｇ／ｍｌにおいてもＯｐｇ
／ｍｌに対してｐ　＜　０．０１の有意差を維持してい
た。

（６）本発明の測定法による天然型ヒトＩＬ−４の定量 ふたりの健常人（ＡおよびＢ）の末梢静脈よりヘパリン
存在下で採血を行ない、リンフォプレップ（第一化学製
造）を用いてリンパ球を調製した。

１０６個のリンパ球を種々のマイトジェン［コンカナバ
リンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ、シグマ社製造）、フイトヘマア
グリチニン−Ｐ　（ＰＨＡ−Ｐ、デイフコ社製造）　、
Ａ　２３１８７　（カルビオケム社製造）およびフォル
ボール１２−ミリステート１３−アセテ−）　（ＰＭＡ
、フナコシ社製造）］の存在下、３７℃、５％ＣＯ２含
有大気下で２４時間培養した。培地としては、１％正常
ヒト血清、０．５％牛血清アルブミン、５０■／ｇトラ
ンスフェリン、４．５ｇ／Ｉグルコース、０．３■／１
オレイン酸オヨび０．３■／Ｄパルミチン酸を含有する
ＡＳＦ１０２培地（味の素社製造）を用いた。培養後、
上清中に産生されたｌｌ−４含量を本発明の免疫学的定
量法で定量した。結果を第６表に示す。

第６表：ヒト末梢血リンパ球培養上清中のＩＬｏｎ １ ＰＨＡ−ＰおよびＡ ２８１８７によって 刺激された培養上清中ではＩＬ−４の産生が確認された
。ＰＭＡ刺激では検出限界以下であった。

このことから、本発明の定量法は組み換えヒトＩ　Ｌ−
４を抗原として作製モノクローナル抗体から構成されて
いるが、天然型のヒトＩＬ−４の定量が可能であること
が証明された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のヒトＩＬ−４定量法の概念図であり、 第２図（ａ）および（ｂ）は、各々本発明および従来技
術のモノクローナル抗体の、ヒトＩＬ−４の活性化作用
に対する阻害効果を示すグラフであり、 第３図は本発明のモノクローナル抗体の、ヒトＩＬ−４
とりセプターとのパインディングに対する阻害効果を示
すグラフであり、 第４図は本発明のヒトＩＬ−４定量法の検量線であり、 第５図は本発明のヒトＩＬ−４定量法と従来のバイオア
ッセイとの相関関係を示すグラフであり、第６図は本発
明のヒトＩＬ−４定量法における血清濃度の影響を示す
グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒトインターロイキン−４を特異的に認識し、かつ
   親和性の高いマウスモノクローナル抗体、３８０−１ま
   たは１４４−６０ ２）（１）固相化したヒトインターロイキン−４に対す
   るモノクローナル抗体、３８０−１または１４４−６（
   第１抗体）に、ヒトインターロイキン−４を含有するサ
   ンプルを添加して、該モノクローナル抗体とヒトインタ
   ーロイキン−４を結合させ、 （２）（１）で得られた結合物に、ヒトインターロイキ
   ン−４に対するポリクローナル抗体（第２抗体）を結合
   させ、 （３）（２）で得られた結合物に、第２抗体を認識し、
   かつ標識物で標識された抗体（第３抗体）を結合させ、 （４）該標識物の活性を測定する ことからなることを特徴とする、サンプル中のヒトイン
   ターロイキン−４の測定方法。