JPH07119238B2 - ヒトインターロイキン―４に対するモノクローナル抗体および該抗体の利用方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託さ
れたハイブリドーマ（寄託番号:FERM BP−2486）を用い
て産生される、ヒトインターロイキン−４（以下、IL−
４と略記する。）に対するマウスモノクローナル抗体
（以下、380−１と略記する。）、および該モノクロー
ナル抗体の利用方法、特に該抗体を用いた免疫学的定量
法に関するものである。

［発明の背景］ IL−４はレクチンやフォルボールエステルあるいは抗原
の刺激を受けたＴリンパ球が産生する、分子量18,000〜
21,000の糖タン白質であり、Ｂリンパ球の分化、増殖、
Ｔリンパ球の分化、増殖、肥満細胞の分化、増殖など生
体の免疫反応にとって重要な種々の作用を有している
［Y.Noma et al.,Nature,319,640−646（1986）、F.Lee
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,2061−2065（198
6）、E.Severinson et al.,Eur.J.Immunol.,17,67−72
（1987）およびT.R.Mosmannet al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,83,5654−5658（1986）参照のこと］。1986年、
ヒトIL−４のcDNAがクローン化され、そのアミノ酸配列
も以下のように明らかにされた［T.Yokota et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,83,5894−5898（1986）参照のこ
と］。

MetGlyLeuTheSerGlnLeuLeuProProLeuPhePheLeuLeuAlaCy
sAlaGlyAsnPheValHisGlyHisLysCysAspIleThrLeuGlnGluI
leIleLysThrLeuAsnSerLeuThrGluGlnLysThrLeuCysThrGlu
LeuThrValThrAspIlePheAlaAlaSerLysAsnThrThrGluLysGl
uThrPheCysArgAlaAlaThrValLeuArgGlnPheTyrSerHisHisC
luLysAspThrArgCysLeuGlyAlaThrAlaGlnGlnPheHisArgHis
LysGlnLeuIleArgPheLeuLysArgLeuAspArgAsnLeuTrpGlyLe
uAlaGlyLeuAsnSerCysProValLysGluAlaAsnGlnSerThrLeuG
luAsnPheLeuGluArgLeuLysThrIleMetArgGluLysTysSerLys
CysSerSer 最近になって、IL−４がＢ細胞でのIgEの産生誘導作用
や肥満細胞の増殖促進作用を有していることが明らかに
され「J.Exp.Med.,169（４）,1295（1989）参照のこ
と］、IL−４がアレルギー反応に関与しているのではな
いかと考えられている。

ヒトIL−４の詳細な生理学的作用の探究は、まだその諸
についたばかりで、今後の研究の成果に大きな期待がか
かるところであるが、その推進にはひとIL−４の微量定
量法を早急に確立する必要がある。

従来、IL−４の定量はその生物学的作用を利用して行な
われてきた。すなわち、IL−４によるＴ細胞の活性化が
どの程度なされたかによって、生成したIL−４の量を推
定していた。この方法はいわゆるバイオアッセイであ
る。しかしながら、バイオアッセイでは、IL−４以外の
生体内因子によってもＴ細胞が活性化されるので検出精
度が劣るうえ、検出限界も約250pg/mlと悪く、その利用
は大きく制限される状態であった。

［従来の技術］ 当業者であれば、バイオアッセイより検出精度が高く、
検出限界もすぐれている方法として免疫学的量法が考え
られる。免疫学的定量法の系を確立するためにはヒトIL
−４を特異的に認識し、かつ親和性の高いモノクローナ
ル抗体を得る必要がある。

これまでにヒトIL−４に対するモノクローナル抗体およ
び／または該抗体を用いた免疫学的定量法に関して以下
に示す３つの報告がある。

（１）欧州特許公開第314402号には、ヒトIL−４に対す
るラットのモノクローナル抗体および該抗体を用いたサ
ンドイッチ法による免疫学的定量法が開示されている。
より詳細には、常法によりリコンビナントのヒトIL−４
の腹腔内投与によってラットを感作した後、脾臓を摘出
し、集めた脾臓細胞をマウスのミエローマ細胞と細胞融
合し、得られたハイブリドーマ群を常法によってスクリ
ーニングして、ヒトIL−４と特異的に結合する抗体を産
生する細胞IC1.11B4.6とMP4.25D2.11を得ている。IC1.1
1B4.6より産生されたモノクローナル抗体はそのクラス
がラットIgG_2aにアイソタイプであり、またMP4.25D2.11
より産生されたモノクローナル抗体はそのクラスがラッ
トIgG₁であることが記載されている。さらに該モノクロ
ーナル抗体を用いたヒトIL−４の免疫学的定量法を確立
している。該方法ではヒト血清中50pg/mlのIL−４まで
検出可能であることが記載されている。

（２）一方、ヒトIL−４のサンドイッチ法による測定用
試薬キットがすでにジェンザイム社（Genzyme Corp.
社）より市販されている。該キットで用いられているモ
ノクローナル抗体の取得方法および抗体としての性質
は、その仕様書の中では明らかにされていないが、本発
明者らの確認実験によれば感作動物としてはマウスを用
いているものと推定される。抗体のクラスは確定するこ
とはできなかったが、該抗体は原液（濃度は不明）の６
倍希釈の濃度でヒトIL−４の活性を完全に阻害するもの
であることが確認された（第２図（ｂ）参照）。また、
本キットの検出限界は90pgヒトIL−4/mlであることが仕
様書の中で明らかにされている。

（３）さらに、Biochem.j.,262,897（1989）には、ヒト
IL−４に対するマウスのモノクローナル抗体、4B2−F9
と4B2−H12が開示されている。4B2−F9はそのクラスがI
gG₁アイソタイプであり、6.25μg/ml濃度でヒトIL−４
の活性をほぼ100％阻害するものであり、一方4B2−H12
はIgG₂アイソタイプであり、また¹²⁵I−組み換えヒトIL
−４を用いるヒトIL−４レセプターバインディングアッ
セイで、腹水の７倍希釈の濃度まで無影響であることが
記載されている。

［従来技術の問題点］ これまでに知られているヒトIL−４の免疫学的定量法に
おける検出限界は10^-11g/mlのオーダーであるが、生体
でのヒトIL−４の分泌が超微量であることを考慮する
と、まだまだ満足できる値ではない。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、精度および検出限界のよりすぐれた免疫
学的定量法を確立すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒトIL
−４を特異的に認識し、かつ親和性の高いモノクローナ
ル抗体を得、目的が達成されることを見い出して本発明
を完成した。

本発明のモノクローナル抗体が前記［従来の技術］で示
した３つのモノクローナル抗体と全く異った新規な抗体
であることはその性質より明らかである。すなわち、本
発明のモノクローナル抗体はヒトIL−４をマウスに感作
することによって得られたマウスの抗体であり、そのク
ラスはIgG₁，κアイソタイプであることが確認されてい
る。一方、［従来の技術］中、（１）で示した抗体はラ
ットより得られた抗体であるので、両者は根本的に異な
る。一方、（２）で示した抗体の感作動物種はその仕様
書では明らかにされていないが、本発明者らの確認実験
ではマウスであると推定される。しかしながら、両抗体
のヒトIL−４に対する阻害パターンが異なる。すなわ
ち、本発明のモノローナル抗体、380−１のヒトIL−４
に対する阻害は100μg/mlに濃度を上げても70数％程度
で、100％活性を阻害することはない。これに対し、
（２）で示したモノクローナル抗体は原液（濃度は不
明）の６倍希釈の濃度で100％の阻害が認められる。こ
の事実は、両モノクローナル抗体では、ヒトIL−４に対
する認識部位が異なっていること、すなわち抗体の超可
変領域が異なっていることを意味する。従って、本発明
のモノクローナル抗体、380−１は（２）で示したモノ
クローナル抗体とは構造が全く異なったものであると結
論づけられる。

なお、本発明で用いられる手法と同様にして別のハイブ
リドーマ（これも工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託され寄託番号FERM BP−2485を付与されている。）
も得られているが、このハイブリドーマによって産生さ
れるモノクローナル抗体（以下、144−６と略記し、参
考例として記載する。）もIgG₁・κアイソタイプ型の抗
体であって、ヒトIL−４の活性を100μg/mlでも20数％
しか阻害しない。

また、（３）で示した抗体もマウス抗体であるがやはり
クラスと阻害パターンの点で本発明のモノクローナル抗
体とは異なる。すなわち、一方の抗体、4B2−F9は6.25
μg/mlでヒトIL−４の活性をほぼ100％阻害するのに対
し、本発明の抗体、380−１は100μg/mlの濃度で70数％
の阻害しか示さない。他方4B2−H12はIgG₂アイソタイプ
であるのに対し、144−６はIgG₁，κアイソタイプであ
る。また4B2−H12は¹²⁵I−組み換えヒトIL−４を用いる
ヒトIL−４リセプターバインディングアッセイにおい
て、腹水の７倍希釈の濃度（概ね1000μg/mlの濃度と推
定される）まで影響を与えない旨の記載があるが、144
−６は100μg/mlで82％の結合阻害活性を有している。

さらに、［従来の技術］中の（１）および（２）の定量
法の検出限界は、10^-11g/mlであるのに対し、本発明の
それは3.9pg/ml、すなわち10^-12g/mlオーダーまで測定
可能となった。本発明のモノクローナル抗体を用いるこ
とによって、検出限界が１オーダー向上するということ
は全く予期できないことであった。

［発明の開示］ 従って、本発明はヒトIL−４を特異的に認識し、かつ親
和性の高いマウスモノクローナル抗体、380−１、さら
に該モノクローナル抗体の利用方法に関する。

本発明の抗体、380−１は、100μg/mlの濃度でヒトIL−
４の生物学的活性の72.5％を阻害するが、さらに抗体の
濃度を上げても100％阻害には至らない抗体であり、他
方、144−６は100μg/mlの濃度でも20％を阻害するに過
ぎない抗体である。

また、¹²⁵I−ヒト組み換えIL−４を用いるIL−４レセプ
ターバインディングアッセイにおいて、380−１は100μ
g/mlで94.5％の結合阻害活性を有しており、144−６は1
00μg/mlで82％の結合阻害活性を有する。

従って、これら２種類の抗体はヒトIL−４の異なるエピ
トープを認識するものと考えられる。また両抗体のIgG
サブクラスはともにマウスIgG₁，κであることが確認さ
れている。

本発明のモノクローナル抗体は、 （１）ヒトIL−４を免疫抗原としてマウスを感作し、 （２）感作マウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞を細
胞融合し、 （３）得られたハイブリドーマよりIL−４に対するモノ
クローナル抗体を産生する細胞をスクリーニングし、 （４）目的とする抗体産生ハイブリドーマをクローニン
グし、 （５）クローン化された抗体産生ハリブリドーマを増殖
させ、 （６）産生された抗体を分離精製する ことによって調製することができる。

より具体的に各ステップを説明すると以下のようにな
る。

（１）の免疫感作の工程は、初回免疫感作時にはヒトIL
−４（天然のものでも遺伝子操作によって作製されたも
のでもよい）を生理的食塩含有リン酸緩衝液（以下、PB
Sと略記する）中に溶解し、フロイントの完全アジェバ
ント（FCA）と1:1の割合で乳化させたものをマウスに腹
腔内投与し、２週間後、同様にヒトIL−４を含むPBSを
フロイントの不完全アジェバント（FICA）と1:1の割合
で乳化させたものを腹腔内投与し、さらに２週間後、ヒ
トIL−４を含むPBSを腹腔内投与することによって行な
われる。用いられるマウスの種類は特に限定されない
が、好ましくはBALB/cである。感作の回数および抗原の
投与量は特に限定されないが、１回につき50〜100μｇ
のヒトIL−４を３回投与すれば十分である。

（２）の細胞融合は、まず（１）で免疫感作したマウス
の脾臓を摘出し、常法に従って、脾細胞の懸濁液を調製
し、次に得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞との混
合物に37℃でポリエチレングリコール（好ましくは、PE
G1500）を加えることによって行われる。マウスミエロ
ーマ細胞にはP3×63Ag8、P3/NS1/1−Ag4−１、SP−2/0
−Ag−14など数種類が知られており、いずれも容易に入
手可能である。ミエローマ細胞はHAT培地（ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）では
生存できないHGPRT（ヒポキサンチン・グアニン・ホス
ホリビシル・トランスフェラーゼ）欠損細胞株が有用で
あり、さらにミエローマ細胞自身が抗体を分泌しない細
胞株であることが望ましい。好適にはSP−2/0−Ag−14
が用いられる。

次に、得られた融合細胞の混合物を、低細胞密度で96マ
イクロウェルプレートに分注し、HAT培地中で培養す
る。１〜２週間の培養で未融合のミエローマ細胞、ミエ
ローア細胞同志のハイブリドーマ、さらに未融合の脾細
胞、脾細胞同志のハイブリドーマは生存条件が満足され
ないため死滅し、脾細胞とミエローマ細胞とのハイブリ
ドーマのみが増殖してくる。

（３）のスクリーニングは、ハイブリドーマ培養上清中
の抗ヒトIL−４活性を測定することにより行なわれる。
すなわち、黄色ブドウ状球菌の死菌にマウスIgGに対す
るウサギポリクローナル抗体（IgG画分）を結合させた
ものに、ハイブリドーマ培養上清、さらにヒトIL−４を
加えて、その上清中のIL−４活性をバイオアッセイで測
定し、活性が減弱またはゼロとなった検体は目的とする
モノクローナル抗体を産生していると判定できる。

（４）の工程は、抗体産生ハイブリドーマを軟寒天培養
法［Monoclonal Antibodies,372ページ（1980）参照の
こと］に従ってクローニングすることによって行われ
る。この際、限界希釈法を用いることも可能である。

（５）の工程は、クローン化されたバイブリドーマを通
常の培地で培養し、その培養上清から分離精製すること
によって得られるが、より大量の抗体を効率よく得るに
はハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し増殖させ、そ
の腹水中より分離精製する方法が用いられる。

（６）の工程は、通常の方法、例えば塩析、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー等により精製
できるが、より効果的にはアフィゲルプロテインＡ（Af
figel Protein A）MAPSIIカラム（BIO−RAD社製）を用
いたアフィニティ−クロマトグラフィーが用いられる。

本発明のモノクローナル抗体はヒトIL−４を特異的に認
識し、かつ親和性の高いものであるので、ヒトIL−４の
精製、例えばアフィニティ−クロマトグラフィー等に利
用することができる。

また、本発明抗体のうち、ヒトIL−４の活性を阻害する
抗体、すなわち380−１は、それ自身あるいはそれとヒ
トIgGとのキメラ抗体の形でIL−４の異常産生を伴うと
考えられる種々の疾患、例えばＩ型アレルギーが原因と
される諸疾患、例えばアナフィラキシー性ショック、じ
ん麻疹、喘息、鼻炎、腸管アレルギー等、また慢性関節
リウマチ、全身性エリトマトーデス、特発性血小板減少
性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症等に代
表される自己免疫疾患の治療および／または予防に用い
ることができる。

しかし、本発明のモノクローナル抗体の最大かつ重要な
利用方法は、精度および検出限界にすぐれた、ヒトIL−
４の免疫学的定量法への適用である。

免疫学的定量法には一点結合測定法と二点結合測定法
（いわゆるサンドイッチ法）がよく知られているが、精
度および検出限界の点で二点結合測定法がすぐれてい
る。

二点結合測定法は、第１図に概略図を示すように、 （１）固相化したヒトIL−４に対するモノクローナル抗
体（第１抗体）に、ヒトIL−４を含有するサンプルを添
加して、該モノクローナル抗体とヒトIL−４を結合さ
せ、 （２）（１）で得られた結合物にヒトIL−４に対するポ
リクローナル抗体（第２抗体）を結合させ、 （３）（２）で得られた結合物に、第２抗体を認識し、
かつ標識物で標識された抗体（第３抗体）を結合させ、 （４）該標識物の活性を測定する ことによって、サンプル中のヒトIL−４を測定する方法
である。

第１抗体としては、本発明のモノクローナル抗体、380
−１が用いられる。免疫学的定量法に用いられる固相お
よび固定化方法はよく知られている（千畑一郎編、固定
化酵素（1975年、講談社発行）参照のこと）。例えば、
固相としてはポリスチレンプレート、ポリスチレンビー
ズ、ナイロンビーズ、ガラスビーズ、プロテインＧアガ
ロースビーズ、ポリスチレンチューブなどが挙げられる
が、より好ましくは市販の96ウェルポリスチレンプレー
トである。固定化は物理的吸着や共有結合による不溶化
法が用いられる。第１抗体とサンプル中のヒトIL−４と
の反応は24℃で１晩放置することで行なわれる。

第２抗体はヒトIL−４に対するポリクローナル抗体であ
れば感作する動物種に制限はない。該ポリクローナル抗
体の作製は公知の方法により行なわれる。例えば、ヒト
IL−４（天然のものでも遺伝子操作によって作製された
ものでもよい）と適当なアジェバントとの混合物を感作
動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、
ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ等、好ましくはウサギ）に適
当な投与間隔で数回静脈内、皮下または腹腔内投与して
感作する。感作後血清を採取して、アフィニティークロ
マドグラフィー等により分離精製して、所望の抗体画分
を得ることにより目的とするヒトIL−４に対するポリク
ローナル抗体が作製される。第１抗体IL−４結合物と第
２抗体との反応は24℃で数時間、好ましくは２時間放置
することで行なわれる。

第３抗体は第２抗体を認識する抗体であれば特に制限は
ない。標識物としては一般に酵素が用いられるがラジオ
アイソトープ、蛍光物質も使用できる。ここで用いられ
る酵素としては一般的に酵素免疫測定に用いられる酵素
であれば何でもよく、例えば、ペルオキシダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵
素等が挙げられ、好ましくは西洋ワサビペルオキシダー
ゼである。ペルオキシダーゼで標識されたウサギIgGに
対するヤギポリクローナル抗体や同様に標識されたヒツ
ジポリクローナル抗体は市販されている。市販されてい
ないものでも公知の方法により容易に作製することがで
きる。第１抗体−IL−４−第２抗体の結合物と第３抗体
との反応は24℃で数時間、好ましくは２時間放置するこ
とにより行なわれる。

（４）の標識物の活性の測定も公知の方法により行なわ
れる。例えば、第３抗体をペルオキシダーゼで標識した
場合には基質としてオルトフェニレンジアミンを用いて
過酸化水素を反応させ、反応生成物のO.D.490を測定す
ることによって行なわれる。この場合、基質として３−
（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸や3,3′,5,
5′−テトラメチルベンチジンを使用することもでき
る。これ以外の場合でも適当な基質を用いて行なわれ
る。

二点結合測定法のより簡便な方法として、第２抗体を標
識物で標識し、第３抗体との反応を省略する方法が知ら
れている。この場合、ヒトIL−４に対するポリクローナ
ル抗体自身を標識することもできるが、該抗体をパパイ
ンで分解したFabフラグメント、あるいはペプシンで分
解したF(ab^-)₂フラグメント、あるいは該フラグメント
をさらに還元的に開裂させたFab^-フラグメントを標識し
て第２抗体として用いることもできる。

さらに、前記した二点結合測定法の応用として、第１抗
体としてヒトIL−４に対するポリクローナル抗体を用
い、第２抗体としてヒトIL−４に対するモノクローナル
抗体を用いて、標識された第３抗体（例えば標識され
た、マウスIgGに対するポリクローナル抗体）で検量す
る方法やあるいは該方法において、第２抗体自身、また
はそのFabフラグメント、F(ab^-)₂フラグメント、Fab^-フ
ラグメントを標識して、第３抗体との反応を省略する方
法も行なうことができる。

本発明のモノクローナル抗体は一点結合測定法によるヒ
トIL−４の定量方法にも用いることができる。

一点結合測定法は、 （１）ヒトIL−４を含有するサンプルを固相に固定化
し、 （２）ヒトIL−４に対するモノクローナル抗体（第１抗
体）を添加して、ヒトIL−４と結合させ、 （３）（２）で得られた結合物に、第１抗体を認識し、
かつ標識物で標識されたポリクローナル抗体を結合さ
せ、 （４）該標識物の活性を測定する ことによって行なわれる。固相、固定化方法、標識物、
反応条件等は二点結合測定法に準じて任意に選択でき
る。

［発明の効果］ 本発明のヒトIL−４に対するモノクローナル抗体、380
−１を用いることによって、測定感度が極めて高く（測
定限界は3.9pg/ml）、特異性にすぐれた、再現性の高
い、ヒトIL−４の免疫学的定量法が確立された。

［実施例］ 以下に実施例をあげて本発明をより具体的に説明する
が、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１ ヒトIL−４に対するモノクローナル抗体、 380−１の作製 （１）マウスの感作 組み換えヒトIL−４（特開平２−485号明細書に記載さ
れた方法により作成した）50μｇを含有するPBS（0.5m
l）とFCA（0.5ml）からなるエマルジョンをBALB/c雌性
マウス２匹のそれぞれに腹腔内投与した。２週間後、前
回と同様に調製した、PBSに溶解した組み換えヒトIL−
４とFICA（1:1）からなるエマルジョンを腹腔内投与し
て追加免疫を行なった。さらに２週間後、PBS（1ml）に
溶解した組み換えヒトIL−４（80μｇ）を腹腔内投与し
た。

（２）細胞融合 最終免疫から３日後に、感作マウスから脾臓を摘出し脾
細胞を調製した。得られた脾細胞とマウス骨髄腫細胞
［SP−2/0−Ag14、Nature,276,269（1978）記載の方法
により調製した］を10:1の割合で混合し、ポリエチレン
グリコール［PEG1500（登録商標）、MAバイオプロダク
ト社製］を50％の濃度で加えて、Godingの方法［J.Immu
nol,Methods,39,285（1980）参照のこと］に準じて細胞
融合を行なった。

融合操作後の細胞混合物を、10％ウシ胎児血清（FB
S）、10％ウマ血清（HS）、10％NCTC109培地（登録商
標、MAバイオプロダクト社製）、ヒポキサンチン（13.6
μg/ml）、チミジン（3.9μg/ml）およびグリシン（2.0
μg/ml）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（以
下、DMEと略記する）（4.5g/lグルコース含有タイプ、
ギブコ社製）を浮遊させ、96ウェルプレートに分注して
37℃、７％CO₂含有大気下で培養した。培養後２、４お
よび７日目に、培地の半量をHAT培地（アミノプテリン
0.18μg/mlを含有する上記イーグル培地）に変換し培養
を続けた。培養10日目ごろより、いくつかのウェルでは
ブドウの房状のコロニーが形成され、最終的に1006ウェ
ルにおいてハイブリドーマの増殖が認められた。

（３）モノクローナル抗体産生株のスクリーニング スクリーニングは金子らの方法［J.Biol.Chem.,262,674
1（1987）記載］に準じて行なった。すなわち、20mMト
リス−塩酸緩衝液（pH8.0）（100μｌ）に懸濁させた黄
色ブドウ状球菌（５μｇ）にマウスIgGに対するウサギ
ポリクローナル抗体（IgG画分）（60μｇ）を加えて、
ブドウ状球菌と該抗体を結合させ、未結合の抗体はPBS
による洗浄および遠心分離（1500×ｇ、10分間）を繰り
返して除いた。

得られた結合物にハイブリドーマ培養上清（100μｌ）
を加えて、PBSによる洗浄および遠心分離をした後、得
られたペレットを組み換えヒトIL−４（2ng/ml）を溶解
した10％FBS含有RPMI−1640（ニッスイ社製）（100μ
ｌ）に懸濁させ、室温でインキュベーションした。１時
間後遠心分離して、得られた上清中のIL−４活性を測定
し、該活性が減少または消失している場合をヒトIL−４
に対する抗体を産生しているウェルであると判定した。

ヒトIL−４活性はヒトリンパ球増殖刺激活性を指標にし
て測定した。すなわち、ヒト末梢血より調製したリンパ
球をフィトヘマグルチニン（PHA）（10μg/ml）を含む
培養液［10％ウシ胎児血清、５×10^-5M 2−メルカプト
エタノールを含むRPMI−1640］に懸濁し、37℃、５％CO
₂存在下で４〜６日間培養した。培養液を用いて充分洗
浄（３回以上）したリンパ球を200μｌの培養液中に５
×10⁴個含まれるように再懸濁し、被検サンプルを加え
て、更に３日間培養を続けた。最後の12時間をトリチウ
ムチミジン（0.25μCi/カルチャー）でパルスした後、
その高分子画分への取込量を液体シンチレーションカウ
ンターを用いて測定した。

（４）抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養 ヒトIL−４に対する抗体を産生していると判定された細
胞（２ウェル）をKennettの方法［Monoclonal Antibodi
es,372ページ（1980）参照のこと］に従って軟寒天培養
法でクローニングした。

クローン化した株細胞10⁷個をあらかじめプリスタン処
理しておいたBALB/c雌性マウスの腹腔内に移植した。約
２週間後、腹水が大量に蓄積された時点で腹水を採取し
た。得られた採水を50％飽和硫安で分画した後、アフィ
ゲルプロテインA MAPSIIカラム（BIO−RAD社製）を用い
たアフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製して
IgG画分を得た。このようにして２種類のハイブリドー
マが得られた。そのうち一方、本発明のモノクローナル
抗体380−１を産生するハイブリドーマ380−１株は、19
89年６月21日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託され、寄託番号FERM BP−2486を与えられている。
もう一方の本発明に属さないモノクローナル抗体144−
６を産生するハイブリドーマ144−６株も同日付で工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、寄託番号FE
RM BP−2485を与えられている。これらの寄託は、特許
手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約に基づく国際寄託である。

実施例２ 本発明のモノクローナル抗体の諸性質 （１）イムノグロブリンサブクラス 実施例１で作製したモノクローナル抗体、380−１およ
び144−６について、マウスMono Ab−ID EIAキット（Zy
med社製）を用いてサブクラスをスクリーニングした。
その結果、両抗体はともにマウスIgG₁，κであった。

（２）生物学的性質 ヒト末梢リンパ球のPHAにより幼若化した細胞（PBL）に
対するIL−４の活性化作用に及ぼす両抗体の効果につい
て検討した。すなわち、組変えヒトIL−４（2.5ng/ml）
と種々の濃度のモノクローナル抗体を混和し、PBL5×10
⁴個/0.2ml/ウェルとともに37℃、５％CO₂含有大気下で7
2時間培養した。培養後MTT法［Medical Immunology.12,
411（1986）参照のこと］でPBLの生物学的活性を測定し
た。結果を第２図（ａ）に示す。図からわかるように、
モノクローンマル抗体、380−１は0.1μg/mlからヒトIL
−４の活性を阻害する作用を示し、100μg/mlでは72.5
％の阻害作用を示したが完全阻害には至らなかった。一
方、モノクローナル抗体、144−６は100μg/mlでも20％
程度の阻害を示すにとどまった。このことから、380−
１と144−６はヒトIL−４の立体構造の異なる部分を認
識しているものと考えられる。さらに380−１は、ヒトI
L−４がリセプターと結合してシグナル伝達する部分を
必ずしも完全に認識しているのではなく、ヒトIL−４と
結合することによって、ヒトIL−４の組立構造の変化を
引き起こすか、あるいはリセプターとの結合を障害する
ことによって阻害効果がでている可能性が示唆される。

（３）ウエスタンブロッティング 組換えヒトIL−４産生CHO細胞の培養上清（特開平２−4
85号明細書参照のこと）のSDS−PAGEとの対比から、モ
ノクローナル抗体、380−１および144−６を用いたウエ
スタンブロッティング［Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,7
6,4350（1979）記載の方法に従って行なった。］におい
て、分子量14〜19Kdのところに数本のバンドが検出され
た。これらは精製ヒトIL−４を用いて同様にして行なっ
たウエスタンブロッティングによって検出されるバンド
と位置的に一致していた。また本方法において、380−
１では0.2ng、また144−６では5ngの組換えヒトIL−４
の存在が確認できた。

（４）ヒトIL−４リセプターバインディングアッセイ ヒト組み換えIL−４をIodogen試薬（Pierce社製造）を
用いて、Frakerらの方法［Biochem.Biophys.Res.Comm.,
80,849（1978）に記載されている］によりヨウ素
（¹²⁵I）化し、比放射能４×10¹⁵cpm/mmolの標識化合物
を得た。

PHA刺激ヒト末梢リンパ球10⁶個と各濃度の抗体、あるい
は３μＭの非標識IL−４存在下、150pMの¹²⁵I−ヒト組
み換えIL−４を添加して終容量200μｌとし、10％FBS、
20mM HEPESおよび0.2％アジ化ナトリウムを含有するRPM
I−1640培地（pH7.2）を用いて４℃で２時間インキュベ
ーションした。

結合および非結合の¹²⁵I−IL4はオイルクッション法［N
ature,320,75（1986）に記載されている］によって分離
し、γ−カウンター（島津製作所製）で放射活性を測定
した。大過剰のIL−４存在下での放射活性の値を非特異
的結合値として各測定値から差し引き、特異的結合値を
算出した。結果を第３図に示す。図からわかるように、
本発明のモノクローナル抗体、380−１および144−６は
0.3μg/mlから容量依存的にIL−４のレセプターとの結
合を阻害し、100μg/mlで380−１は94.5％、144−６は8
2％の阻害活性を示した。なお、本実験ではIL−４と無
関係な抗体（抗ウシインシュリンモノクローナル抗体）
をコントロールとして用いたが、100μg/mlでも無影響
であった。

実施例３ 本発明のモノクローナル抗体、380−１を用いた免疫学
的定量法 （１）ヒトIL−４に対するウサギポリクローナル抗体の
調製 組み換えヒトIL−４（特開平２−485号明細書に記載さ
れた方法により作製した）（2mg）を含有するPBS（1m
l）とFCA（1ml）からなるエマルジョンを雄性ニュージ
ーランドホワイトラビットの背部皮下に数ヶ所に分けて
投与した。初回感作から10、24および38日後に、前回と
同様に調製した。組み換えIL−４を含有するPBSとFICA
（1:1）からなるエマルジョンを皮下投与して追加免疫
を行なった。さらに初回感作から58日目に、PBS（3ml）
に溶解した組み換えヒトIL−４（3mg）で最終感作し
た。それから７日後に頸動脈より全血液を採取し、室温
で３時間放置後、遠心分離し（1500×ｇ、10分間）血清
を得た。得られた血清をプロテインＡセファロース（Pr
otein A Sepharose）CL−4Bカラム（ファルマシア社製
造）を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製
しIgG画分を得た。この画分をPBSに対して透析して、ヒ
トIL−４に対するウサギポリクローナル抗体を得た。

（２）ヒトIL−４の免疫学的定量用試薬の調製 （ａ）第１抗体溶液 本発明のモノクローナル抗体（380−１、実施例１で調
製した。）を0.1M炭酸水素ナトリウム溶液で30μg/mlと
なるように調製したもの。

（ｂ）第２抗体溶液 ヒトIL−４に対するウサギポリクローナル抗体（実施例
３−（１）で調製した。）を２％FBSを含有するPBSで2.
5μg/mlとなるように調製したもの。

（ｃ）第３抗体溶液 西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたウサギIgGに
対するヤギポリクローナル抗体（ZYMED社製）を１％ヤ
ギ正常血清（Vector社製）含有PBSで2000倍希釈したも
の。

（ｄ）標準溶液 組み換えヒトIL−４を10％FBS含有RPMI−1640で1000、5
00、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9pg/mlとな
るように調製したもの。

（ｅ）洗浄液 0.05％Tween 20含有PBS。

（ｆ）ブロッキング液 ブロッキング試薬（ベーリンガー山之内社製）を水100m
lに溶解したもの。（使用時に水で10倍希釈して用い
る。） （ｇ）基質溶液 （ｉ）0.03％過酸化水素溶液。

（ii）10mgオルトフェニレンジアミン塩酸塩の錠剤（以
下、OPDと略記する、Sigma社製）を0.1Mクエン酸・リン
酸緩衝液（pH5.0）で2mg/mlとなるように調製したも
の。

（ｉ）と（ii）を使用する直前に等量混合する。

（ｈ）反応停止液 1N硫酸溶液。

（３）（２）で調製した試薬を用いたヒトIL−４の測定 １）96ウェルのイムノプレート（Nunc社製）に第１抗体
溶液を各ウェル100μｌずつ加え、シールで密封した
後、24℃で１晩放置した。（以後、放置の際はプレート
をシールで密封した。） ２）プレート中の第１抗体溶液を回収した後、洗浄液
（300μl/ウェル）で３回洗浄した。（以後、洗浄は各
ウェル300μｌで３回行った。） ３）ブロッキング液を各ウェル300μｌずつ加え、４〜
５時間放置した。

４）ブロッキング液を除去した後、洗浄した。

５）標準溶液を各ウェル100μｌずつ加え、室温で１晩
放置した。

６）標準溶液を除去した後洗浄した。

７）第２抗体溶液を各ウェル100μｌずつ加え、24℃で
２時間放置した。

８）第２抗体溶液を除去した後洗浄した。

９）第３抗体溶液を各ウェル100μｌずつ加え、24℃で
２時間放置した。

10）第３抗体溶液を除去した後、洗浄した。

11）基質溶液を各ウェル100μｌずつ加え、24℃で10分
間反応させた。（反応は暗所で行った。） 12）反応停止液を各ウェル100μｌずつ加えて、反応を
停止させた。

13）マイクロプレート用ミキサー（Belco社製）を用い
て30秒間混和した後、O.D.490をエライザー（日本イン
ターメッド社製；イムノリーダーNJ−2000）にて測定し
た。

標準IL−４のO.D.490値を第１表に示すとともに、その
値をプロットした標準検量線を第４図に示す。

第１表および第４図からわかるように、本発明の定量法
によって、3.9〜500pg/mlまでの濃度のヒトIL−４が測
定可能である。検出限界3.9pg/mlという値は、［従来の
技術］中の（１）のそれ、50pg/mlおよび（２）のそ
れ、90pg/mlよりはるかにすぐれた値であり、超微量定
量の分野でも本定量法が十分耐え得ることを示すもので
ある。

実施例４ 本発明の免疫学的定量の性質 （１）本発明の定量法とバイオアッセイとの相関関係 本発明の定量法（実施例３の方法により測定した）とバ
イオアッセイ（実施例１−（３）に記載したヒトリンパ
球増殖刺激活性を指標とする定量法）によって各種検体
中のヒトIL−４量を定量した。両定量法の相関関係を第
５図に示す。

相関の回帰直後はｎ＝５、ｒ＝0.998、ｙ＝0.937χ＋0.
968となり、両定量法間には良好な相関が認められた。

（２）本発明の定量法を用いる添加回収実験 組み換えIL−４（約14pg/ml）を含有する溶媒（10％FBS
含有RPMI−1640培地）に、種々の濃度の組み換えIL−４
を添加し、各試料中のIL−４含量を実施例３に従って定
量した。回収量および回収率を次表に示す。

表からわかるように、いずれの濃度においても回収率は
84％以上である。このことは、本発明の定量法が非常に
精度の高い方法であることを示しているといえる。

（３）本発明の定量法におけるアッセイ内変動試験 実施例３記載の方法に従って検量線を作成した後、同一
プレート内の各試料（約25、50および100pg/mlの組み換
えヒトIL−４を含有しているもの）中のIL−４濃度をｎ
＝５で測定し、平均値、標準偏差および変動係数（CV
値）を算出した。結果を次表に示す。

表からわかるように、いずれの濃度においてもC.V.値は
６％以内であり、このことは本発明の定量法が非常に精
度の高い方法であることを示しているといえる。

（４）本発明の定量法におけるアッセイ間変動試験 実施例３記載の方法に従って、毎回ごとに検量線を作成
し直すことを条件として各試料（約25、50および100pg/
mlの組み換えヒトIL−４を含有しているもの）中のIL−
４濃度の測定を５回行って、平均値、標準偏差および変
動係数（C.V.値）を算出した。結果を次表に示す。

表からわかるように、いずれの濃度においてもC.V.値は
5.4％以内であり、このことは本発明の定量法が非常に
精度の高い方法であることを示している。

（５）本発明の測定法における血清濃度の影響５、20、
40および100％ヒト血清存在下［溶媒としてはRPMI−164
0培地（ニッスイ社製造）を用いた］、種々の濃度の組
み換えうヒトIL−４（3.9〜250pg/ml）を添加し、本発
明の免疫学的定量法（実施例３に記載した方法）によっ
て定量した。結果を第５表および第６図に示す。

一般に免疫学的定量法においては、試料中の血清濃度が
測定の感度、精度、検出限界等に悪影響を及ぼすことが
多いが、本発明の測定法は血清濃度にまったく影響され
ないことが判明した。すなわち第５表および第６図から
わかるように、血清濃度に依存して発色強度は低下する
が、いずれの場合もきれいな直線関係を示し、またヒト
IL−４の添加量が3.9pg/mlにおいても0pg/mlに対してｐ
＜0.01の有意差を維持していた。

（６）本発明の測定法による天然型ヒトIL−４の定量 ふたりの健常人（ＡおよびＢ）の末梢静脈よりヘパリン
存在下で採血を行ない、リンフォプレップ（第一化学製
造）を用いてリンパ球を調製した。10⁶個のリンパ球を
種々のマイトジェン［コンカナバリンＡ（Con A、シグ
マ社製造）、フイトヘマアグリチニン−Ｐ−（PHA−
Ｐ、ディフコ社製造）、A 23187（カルビオケム社製
造）およびフォルボール12−ミリステート13−アセテー
ト（PMA、フナコシ社製造）］の存在下、37℃、５％CO₂
含有大気下で24時間培養した。培地としては、１％正常
ヒト血清、0.5％牛血清アルブミン、50mg/lトランスフ
ェリン、4.5g/lグルコース、0.3mg/lオレイン酸および
0.3mg/lパルミチン酸を含有するASF102培地（味の素社
製造）を用いた。培養後、上清中に産生されたIL−４含
量を本発明の免疫学的定量法で定量した。結果を第６表
に示す。

Con A、PHA−ＰおよびA 23187によって刺激された培養
上清中ではIL−４の産生が確認された。PMA刺激では検
出限界以下であった。このことから、本発明の定量法は
組み換えヒトIL−４を抗原として作製モノクローナル抗
体から構成されているが、天然型のヒトIL−４の定量が
可能であることが証明された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のヒトIL−４定量法の概念図であり、 第２図（ａ）および（ｂ）は、各々本発明および従来技
術のモノクローナル抗体の、ヒトIL−４の活性化作用に
対する阻害効果を示すグラフであり、 第３図は本発明のモノクローナル抗体の、ヒトIL−４と
リセプターとのバインディングに対する阻害効果を示す
グラフであり、 第４図は本発明のヒトIL−４定量法の検量線であり、 第５図は本発明のヒトIL−４定量法と従来のバイオアッ
セイとの相関関係を示すグラフであり、 第６図は本発明のヒトIL−４定量法における血清濃度の
影響を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏ ｕｒｎａｌ，262〔３〕（1989．９）Ｐ. 897−908

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
   されたハイブリドーマ（寄託番号:FERM BP−2486）を用
   いて産生される、ヒトインターロイキン−４に対するマ
   ウスモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】（１）工業技術院生命工学工業技術研究所
   に寄託されたハイブリドーマ（寄託番号:FERM BP−248
   6）を用いて産生されるヒトインターロイキン−４に対
   するマウスモノクローナル抗体を固相化し、これ（第１
   抗体）に、ヒトインターロイキン−４を含有するサンプ
   ルを添加して、該モノクローナル抗体とヒトインターロ
   イキン−４を結合させ、 （２）（１）で得られた結合物に、ヒトインターロイキ
   ン−４に対するポリクローナル抗体（第２抗体）を結合
   させ、 （３）（２）で得られた結合物に、第２抗体を認識し、
   かつ標識物で標識された抗体（第３抗体）を結合させ、 （４）該標識物の活性を測定する ことからなることを特徴とする、サンプル中のヒトイン
   ターロイキン−４の測定方法。