HU222041B1 - Az IL4 által kőzvetített rendellenességek kezelésére használható rekombináns 1L4 antitestek, eljárás ezek előállítására, alkalmazására és az őket tartalmazó gyógyszerkészítmények - Google Patents

Abstract

A találmány nagy affinitású monoklonális antitestekből származó kiméraés humanizált, IL–4 elleni monoklonális antitesteket, ezek előállításieljárását, alkalmazását, és ezeket tartalmazó gyógyászatikészítményeket nyújtja. ŕ

Description

Hivatkozás a kapcsolódó bejelentésekhez

Ez a bejelentés az 1993. október 14-én bejelentett US 08/136,783 számú bejelentés részben folytatólagos bejelentése, amely az 1993. szeptember 7-én bejelentett US 08/117,366 számú bejelentés folytatása, mindkét bejelentést teljes egészében referenciaként építettük be a jelen bejelentésbe.

A találmány területe

A jelen találmány általánosan a fúziós proteinek területére, valamint az IL-4- és az IgE-termelés túlsúlya által közvetített állapotok diagnózisára használható proteinekre, részletesebben kiméra és humanizált IL-4 antitestekre, ezek előállítási eljárására, diagnosztikumként való alkalmazására, és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik.

A találmány háttere

Az atópiás allergiás betegségek a viszonylag kisebbektől, mint a szezonális nátha és kötőhártya-gyulladás, a komolyabbakig, mint az atópiás dermatitisz és az atópiás asztma, egészen az életet veszélyeztetőkig, mint az anafilaxiás sokk, terjednek. Ezen állapotokban a közös a szervezet immunválasza az allergénre, amely válasz magában foglalja a genetikailag prediszponált egyedekben az immunglobulin-E (IgE) antitestek termelődését (atópia). Az IgE-termelődés gátlása sokáig cél volt a deszenzitivizáló vakcinákat használó specifikus immunterápiában. Az elmúlt években azonban a vakcinaterápia hatásossága és biztonságossága kérdésessé vált, az IgEszint csökkentésének igénye viszont nem csökkent.

Az interleukin-4 a limfoid rendszer egyik proteinmediátora. Atópiás egyedek limfocitáinak vizsgálata rávilágított, hogy a stimulációra adott válasz hatására a normálisnál nagyobb számban vannak jelen IL-4-szekretáló képességgel rendelkező T-limfociták, és a stimulációt nagyobb mennyiségű IL-4 szekréciója követi.

Az anti-IL-4 antitestekről úgy találták, hogy gátolják az IgE-t, de nem gátolják az IgG_ret, vagy az IgG^-t [Finkelman et al., Ann. Rév. Immunoi. 8, 303 (1990)], és gátolják az IL-5-szekretáló T-sejtek termelődését [Maggi et al., J. Immunoi. 148, 2142 (1992)]. Ezenfelül nem régi adatok azt sugallják, hogy az IL-4 a szövetekben az eozinofil granulociták felhalmozódását okozhatja [például Tepper et al., Cell 62, 457 (1990); Tepper et al., Cell 57, 503 (1989)].

A szakterületen továbbra is fennáll egy nagy affinitású IL-4-antagonista iránti igény, amely csökkenthetné az eozinofilgyulladást mind az IL-5-szekretáló sejtek proliferációjának csökkentése, mind egy, az eozinofilek szövetekben való felhalmozódásáért felelős tapadási mechanizmus gátlása révén, és amely így az allergiás reakciók kezelésére, megelőzésére vagy diagnosztizálására lenne használható.

Kaveler J. et al. Hybridoma, 12(4), 475-483, (1991) és Madea et al. az EP A 327000 számú európai szabadalmi leírásban olyan szekvenciákat ismertetnek, amelyek tartalmazzák a 16., 18., 20., 22. és 24. aminosavszekvenciákat és az ezeket kódoló nukleinsavszekvenciákat (15., 17., 19., 21. és 23. szekvencia).

Továbbá, a WO A 9007861 számú közzétett nemzetközi szabadalmi leírás (Queen et al.) antitesteket kódoló gének klónozását írja le, idegen eredetű CDR-szakaszokat tartalmazó antitesteket kódoló nukleinsavkonstrukciók kialakítására.

Többek között a WO-A-9109059 számú közzétett nemzetközi szabadalmi leírás (Ramanathan et al.) foglalkozik IL-4-hez kötődő és azt neutralizálni képes monoklonális ellenanyagok előállításával, és utal arra, hogy ezek hasznosak lehetnek a humángyógyászatban és diagnosztikai célú immunvizsgálatokban.

A találmány szerinti konkrét megoldásra nem adnak kitanítást, illetőleg javaslatot a fenti irodalmi helyek, a találmány a szakember számára meglepő, előre nem várt módon meghaladja a technika állását.

A találmány összefoglalása

Első megközelítésben a találmány humán interleukin-4 (IL-4)-kötő sajátossággal rendelkező fúziós protein, amely olyan komplementaritást (CDR) meghatározó régiókat tartalmaz, ahol a nehéz lánc komplementaritást meghatározó régióinak aminosavszekvenciái a (a) ThrSerGlyMetGlyValSer: 22. számú szekvencia, (b) HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: 24. szálú szekvencia és (c) ArgGluThrValPheTyrTrpTyrPheAspVal: 26. számú szekvencia, ahol a könnyű lánc komplementaritást meghatározó régióinak aminosavszekvenciái (a) LysAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: 16. számú szekvencia, (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: 18. számú szekvencia és (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: 28. számú szekvencia, vagy ahol a könnyű lánc komplementaritást meghatározó régióinak aminosavszekvenciái (a) LysAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: 16. számú szekvencia, (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: 18. számú szekvencia és (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: 20. számú szekvencia, amelyeket egy nem humán monoklonális antitestből származó, a humán IL-4 tekintetében 2χ10~^1θ M-lal egyenlő vagy annál kisebb disszociációs konstanssal jellemezhető csoportok közül választunk ki, valamint egy első fúziós partnert tartalmaz, ahol az első fúziós partner aminosavszekvenciája a 12. számú szekvencia 21-50., 56-71., 88-119. és 131-141. számú aminosavait tartalmazó nehéz láncú aminosavszekvencia és a 14. számú szekvencia 20-42., 58-72., 80-111. és 121-131. számú aminosavait tartalmazó könnyű láncú aminosavszekvencia.

Egy másik megközelítésben a találmány nehéz és könnyű láncot tartalmazó humanizált antitestet nyújt, amely a humán IL-4 tekintetében 2xl0~¹⁰ M-nál kisebb vagy avval egyenlő disszociációs konstanssal jellemezhető, amelyben az említett nehéz és könnyű lánc keretrégiói legalább egy humán antitestből származnak, és minden említett lánc komplementaritást meghatározó régiójának aminosavszekvenciái a humán IL-4 te2

HU 222 041 Bl kintetében 2 χ 10-¹⁰ M-nál kisebb vagy avval egyenlő disszociációs konstanssal jellemezhető, és a 3B9 monoklonális antitestével azonos tulajdonságokkal jellemezhető, nem humán neutralizáló monoklonális antitestből származnak.

Egy másik megközelítésben egy nehéz láncból és egy könnyű láncból álló kiméra antitestet nyújt a találmány, amely antitest a humán IL-4 tekintetében 2χ10^1θ M-lal egyenlő vagy annál kisebb disszociációs konstanssal jellemezhető, amelyben az említett nehéz lánc és könnyű lánc komplementaritást meghatározó régiók aminosavszekvenciái humán IL-4-specifikus humán, IL-4 tekintetében 2 χ 10-¹⁰ M-nál kisebb vagy avval egyenlő disszociációs konstanssal jellemezhető, és a 3B9 monoklonális antitestével azonos tulajdonságokkal jellemezhető, nem humán neutralizáló monoklonális antitestből származnak.

Más megközelítésben a találmány egy gyógyszerkészítményt nyújt, amely egy (vagy több) a fentiekben leírt fúziós proteint vagy MAb-t (például humanizált, kiméra stb.), és egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmény alkalmas allergiás állapotok kezelésére és/vagy megelőzésére emberekben, az alkalmazás során a találmány szerinti gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét kell beadni a kezelendő személyeknek.

Egy másik megközelítésben a találmány eljárást és hasznos komponenseket nyújt fúziós proteinek, MAb-k (például humanizált, kiméra stb.), ezek CDR-jei, egy Fab vagy F(ab’)₂, vagy ezek olyan analógjának rekombináns előállításához, mely a humán IL-4 tekintetében 2 χ 10-¹⁰ M, vagy annál kisebb disszociációs konstanssal jellemezhető nem humán neutralizáló monoklonális antitestekből (MAb) származik. Ezek a komponensek magukban foglalják a fentieket kódoló izolált nukleinsavszekvenciákat, az ezen nukelinsavszekvenciákat olyan szelektált regulációs szekvenciák kontrollja alatt tartalmazó rekombináns plazmidokat, mely regulációs szekvenciák képesek az említett nukleinsavszekvenciák expresszióját irányítani a gazdasejtekben, és a rekombináns plazmidokkal transzformált (előnyösen emlős) gazdasejteket. Az előállítási eljárás magában foglalja a találmány szerinti transzformált gazdasejtvonalak olyan körülmények közötti tenyésztését, hogy az említett sejtekben egy antitest, előnyösen humanizált antitest expresszálódjon, valamint az expresszált termék kinyerését.

A találmány egy másik megközelítésben egy eljárás allergiák és más, immunglobulin-E-túltermeléssel kapcsolt állapotok diagnosztizálására emberben, amely eljárás magában foglalja a biológiai anyag egy mintájának érintkezésbe hozását a találmány szerinti fúziós proteinekkel, MAb-ékkel (humanizált, kiméra stb.) és Fabékkel, és az említett fúziós proteinek, MAb-ék vagy Fab-ék és a humán interleukin-4 közötti kötések előfordulásának mérését.

A találmány egy, az IL-4-hez nagy affinitással rendelkező neutralizáló MAb-t is nyújt, illetve ennek Fab- vagy F(ab’)₂-fragmensét, amelyeket a hibridómatermékek könyvtárának aldehiddel kötött vagy biotinezett humán interleukin-4-gyel való szűrésével állítunk elő.

Egy másik megközelítésben a találmány rágcsáló neutralizáló monoklonális antitesteket nyújt, melyek humán interleukin-4-specifikusak, és 2xl0~¹⁰ M, vagy annál kisebb disszociációs konstanssal jellemezhető kötőaffinitásuk van. Az ilyen monoklonális antitestekre példa a 3B9 egér MAb, a 6A1 patkány MAb, és más, ugyanolyan azonosító jellemzőkkel bíró MAb-k (azaz ugyanahhoz az epitophoz körnek, mint a 3B9 vagy a 6A1, humán IL-4-specifikusak, és disszociációs konstansuk 2x10-'° M, vagy annál kisebb). A találmány egy másik aspektusa a 3426A11C1B9 hibridóma.

A találmány más aspektusait és előnyeit előnyös megvalósítási módjainak következő részletes leírásában taglaljuk.

Az ábrák rövid leírása

1. ábra: (1. és 2. számú szekvenciák) a 3B9 egérIL-4 antitest, és a humán/egér 3B9 kiméra antitest könnyű láncának variábilis régióját (21-132. aminosavak), és a natív szignálszekvenciát (1-20. aminosavak) mutatja be. Az aláhúzott részek a CDR-eket jelölik (15. és 16., 17. és 18., és 19. és 20. számú szekvenciák).

2. ábra: (3. és 4. számú szekvenciák) a 3B9 egérantitest nehéz lánc variábilis régióját (21-141. aminosavak) és a natív szignálszekvenciát (1-19. aminosavak) mutatja be. Az aláhúzott részek a CDR-eket jelölik (21. és 22., 23. és 24., és 25. és 26. számú szekvenciák).

3. ábra: (9. és 10. számú szekvenciák) a humán/egér 3B9 antitest nehéz lánc variábilis régióját (21-141. aminosavak) és ennek szignálszekvenciáját (1-19. aminosavak, 5. és 6. számú szekvenciák) mutatja be. Az aláhúzott részek a 3B9ből származó CDR-eket jelölik (21. és

22., 23. és 24., és 25. és 26. számú szekvenciák).

4. ábra: (11. és 12. számú szekvenciák) a humanizált 3B9 antitest nehéz lánc variábilis régióját (21-141. aminosavak) és egy szignálszekvenciát (1-19. aminosavak, 5. és 6. számú szekvenciák) mutat be. Az aláhúzott részek a 3B9-ből származó CDR-eket jelölik (21. és 22., 23. és 24., és 25. és 26. számú szekvenciák).

5. ábra: (13. és 14. számú szekvenciák) humanizált 3B9 antitest könnyű lánc variábilis régióját (21-131. aminosavak) és egy szignálszekvenciát (1-19. aminosavak, 7. és 8. számú szekvenciák) mutat be. Az aláhúzott részek a 3B9-ből származó CDR-eket jelölik (53. és 16.,

17. és 18., és 27. és 28. számú szekvenciák).

HU 222 041 Bl

6A. ábra: (5. és 6. számú szekvenciák) a 4. példában használt nehéz lánc szignálszekvencia.

6B. ábra: (7. és 8. számú szekvenciák) a 4. példában használt könnyű lánc szignálszekvencia.

7. ábra: a pIL-4chhc3-pcd plazmid sematikus rajza, melyet egy kunéra IL-4 emlőssejtekben való kifejezésére használtunk. A plazmid egy béta-laktamázgént (BÉTA LAC), egy SV40 replikációs origót, egy citomegalovínis promoterszekvenciát (CMV), egy szignálszekvenciát, a 9. és 10. számú szekvencia szerinti kiméra variábilis nehéz láncot, egy humán nehéz lánc konstans régiót, egy poliA szignált a szarvasmarha növekedési hormonból (BGH), egy bétaglobin-promotert (béta glopro), egy dihidrofolát-reduktáz gént (DHFR), és egy másik BGH szekvencia poliA szignált tartalmaz pUC 19-ben.

8. ábra: a pIL-4chlc-pcdn plazmid sematikus rajza, amelyet az 1. és 2. számú szekvencia szerinti kiméra IL-4 könnyű lánc variábilis régió emlőssejtekben történő kifejezésére használtunk. A plazmid a 7. ábra szerinti plazmidtól abban tér el, hogy a kiméra nehéz lánc variábilis régió helyett egy kiméra könnyű lánc variábilis régiót tartalmaz, valamint tartalmaz egy humán könnyű lánc konstans régiót és egy neomicingént (Neo) a DHFR-en felül.

9. ábra: a pIL-4hzhc-l-pcd plazmid sematikus rajza, amelyet az 11. és 12. számú szekvencia szerinti szintetikus IL-4 nehéz lánc variábilis régió emlőssejtekben történő kifejezésére használtunk. A plazmid a 7. ábra szerinti plazmidtól abban tér el, hogy a kiméra nehéz lánc variábilis régió helyett egy humanizált nehéz lánc variábilis régiót tartalmaz.

10. ábra: a pIL-4hzlcl-0-Pcn plazmid sematikus rajza, amelyet az 13. és 14. számú szekvencia szerinti humanizált IL-4 könnyű variábilis régió emlőssejtekben történő kifejezésére használtunk. A plazmid a

8. ábra szerinti plazmidtól abban tér el, hogy a kiméra könnyű lánc variábilis régió helyett egy humanizált könnyű lánc variábilis régiót tartalmaz, és nem kódolja a DHFR-gént.

A találmány részletes leírása

A találmány olyan antitestek, ezek fragmensei, és részlegesen humanizált antitest fúziós proteinek skáláját nyújtja, amelyek humán IL-4-kötő specifitással, neutralizálóaktivitással, és a humán IL-4-hez való nagy affinitással jellemezhetők, mint azt az egér 3B9 vagy a patkány 6A1 MAb példázza. Ezek a termékek az IL-4 által közvetített és az IgE-közvetített allergiás reakciók kezelésére való gyógyszerkészítményekben vagy terápiás készítményekben használhatók fel. A termékek felhasználhatók emberekben az IL-4 által közvetített állapotok diagnózisára a keringő, belső IL-4-szint mérésével (például enzimkötött immunoszorbens assay (ELISA) útján).

I. Definíciók

A „fúziós protein” egy fúziós molekula által kódolt protein, melyet egy kiválasztott gazdasejtben való expresszióval kaphatunk meg. Ilyen fúziós proteinek lehetnek tervezett antitestek, például kiméra vagy humanizált antitestek, vagy olyan antitestfragmensek, melyekből hiányzik egy immunglobulin konstans régió, vagy annak egy része, például Fv, Fab vagy F(ab’)₂ és hasonlók.

A „fúziós molekula” egy olyan nukleinsavmolekula, amely egy nem humán immunglobulinból származó komplementaritásmeghatározó régiókat (CDR-ek) kódol, melyek egy olyan első fúziós partnerbe vannak inszertálva, amely humán variábilis keretszekvenciákat tartalmaz. Kívánság szerint az első fúziós partner operatívan kapcsolódhat egy második fúziós partnerhez.

Az „első fúziós partner” egy humán keretet, vagy humán immunglobulin variábilis régiót kódoló nukleinsavszekvencia, amelyben a natív (vagy természetesen előforduló) CDR-eket egy donorantitest CDR-jeivel helyettesítettük. A humán variábilis régió lehet egy immunglobulin nehéz lánc, egy könnyű lánc (vagy mindkét lánc), vagy ezeknek egy funkcionális analógja. Az ilyen, az antitest (immunglobulin) variábilis régiójában elhelyezkedő CDR-eket vagy CDR-régiókat ismert eljárásokkal határozhatjuk meg. Például Kábát és munkatársai [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U. S. Department of Health and Humán Services, National Institutes of Health (1987)] szabályokat írnak le a CDR-ek azonosításához. Ezenfelül ismeretesek olyan számítógépes programok, melyek a CDR-régiók azonosítására használhatók.

A „nagy titer” kifejezés olyan antitestre vonatkozik, amely 2χ 10^-10 M, vagy annál kisebb Kj-vel rendelkezik a humán IL-4 tekintetében.

A „humán IL-4-kötő specifitás” jelentése nagy titer (vagy affinitás) a humán IL-4-hez, amely a szarvasmarha vagy egér IL-4-re nem vonatkozik.

A „második fúziós partner” egy másik nukleotidszekvencia, amely egy olyan proteint vagy peptidet kódol, amellyel az első fúziós partner keretben, vagy egy opcionális konvencionális linkerszekvencián keresztül fuzionált (azaz operatívan kapcsolt). Előnyösen ez egy immunglobulin. A második fúziós partner tartalmazhat egy olyan nukleotidszekvenciát, amely ugyanannak az antitestnek (azaz homológ - az első és a második fúziós proteinek ugyanolyan eredetűek) vagy egy addicionális (azaz heterológ) antitestnek a teljes konstans régióját kódolja. Ez lehet egy immunglobulin nehéz vagy könnyű lánc (vagy mindkét lánc, mint egy egyedi polipeptid része). A második fúziós partner nem korlátozható egy adott immunglobulin-osztályra vagy izotípusra. Ezenfelül a második fúziós partner tartalmazhatja egy

HU 222 041 Β1 immunglobulin konstans régió egy részét, amint az az Fab-ban vagy az F(ab’)₂-ben van (azaz egy megfelelő humán konstans régió vagy keretrégió különálló részét). Az ilyen második fúziós partner tartalmazhat egy, a gazdasejt külső felszínén található integrális membránproteint kódoló szekvenciát is, például egy fág-megjelenítő könyvtár, vagy egy analitikai vagy diagnosztikai úton detektálható proteint kódoló szekvenciát, például torma-peroxidáz, β-galaktozidáz stb.

Az Fv, Fc, Fab és F(ab’)₂ kifejezéseket szokásos jelentésükkel használtuk [lásd például Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)].

A „tervezett antitest” kifejezés, amint itt használjuk, egy bizonyos fúziós proteint ír le, azaz egy szintetikus antitestet (például kiméra vagy humanizált antitestet), ahol egy kiválasztott akceptorantitest könnyű és/vagy nehéz lánc variábilis doménjének egy része egy vagy több, a kiválasztott epitopra specifikus donorantitest analóg részeivel van helyettesítve. Például egy ilyen molekula olyan antitesteket tartalmazhat, melyek azzal jellemezhetőek, hogy egy humanizált nehéz lánc egy nem módosított (vagy kiméra) könnyű lánccal asszociált, vagy fordítva. A tervezett antitesteket jellemezheti az is, hogy az akceptorantitest könnyű és/vagy nehéz variábilis dómén keretrégióját kódoló nukleinsavszekvencia módosított, hogy a donorantitest kötőspecifitását megőrizzük. Az ilyen antitestek egy vagy több, az akceptorantitestből származó CDR-je (előnyösen mind) helyettesítve lehet az itt leírt donorantitest CDR-jeivel.

A,kiméra antitest” a tervezett antitestek egy olyan típusa, amely egy donorantitestből származó, természetesen előforduló variábilis régiót (könnyű és nehéz lánc) tartalmaz egy akceptorantitestből származó könnyű és nehéz lánc konstans régióval asszociálva.

A „humanizált antitest” a tervezett antitesteknek egy olyan típusa, melynek CDR-jei egy nem humán immunglobulinból, a molekula fennmaradó immunglobulin-eredetű részei pedig egy (vagy több) humán immunglobulinból származnak. Ezenfelül a keretgyököket módosíthatjuk, hogy a kötőspecifitást megőrizzük [lásd például Qeen et al., Proc Natl. Acad Sci USA 86, 10 029-10 032 (1989); Hodgson et al., Bio/Technology 9, 421 (1991)].

A „donorantitest” kifejezés egy olyan (poliklonális, monoklonális vagy rekombináns) antitestet jelent, amely variábilis régiójának, CDR-jeinek vagy ezek más funkcionális fragmenseinek vagy analógjainak nukleotidszekvenciájával hozzájárul egy első fúziós partner szekvenciájához úgy, hogy azok fúziós molekulát adjanak, és ez egy, a donorantitest neutralizálóaktivitásával és antigénspecifitásával rendelkező expresszált fúziós proteint eredményezzen. Egy, a jelen találmányban felhasználható donorantitest a 3B9 jelű nem humán (pontosabban egér) neutralizáló monoklonális antitest. A 3B9 antitestet egy magas titerű humán IL-4-specifikus (azaz nem ismeri fel a szarvasmarha vagy az egér IL-4-et), neutralizáló-, IgGj izotípusú antitestként határoztuk meg, amely az 1. és 2. számú szekvenciák szerinti variábilis könnyű lánc DNS- és aminosavszekvenciával, és a 3. és 4. számú szekvenciák szerinti variábilis nehéz lánc DNS- és aminosavszekvenciával rendelkezik egy megfelelő egér IgG konstans régión.

Az „akceptorantitest” kifejezésen egy olyan (poliklonális, monoklonális vagy rekombináns), a donorantitesthez képest heterológ antitestet értünk, mely a nehéz és/vagy könnyű láncának keretrégióit és/vagy nehéz és/vagy könnyű láncának konstans régióit kódoló nukleotidszekvenciák egészével (vagy bármely részével, de előnyösen egészével) járul hozzá a második fúziós partner szekvenciáihoz. Előnyösen az akceptorantitest egy humán antitest.

A „CDR”-eket úgy definiáltuk, mint egy antitest komplementaritásmeghatározó régióinak aminosavszekvenciái, melyek az immunglobulin nehéz és könnyű láncok hipervariábilis régiói. [Lásd például Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunoligical Interest, 4th Ed., U. S. Department of Health and Humán Services, National Institutes of Health (1987)]. Három nehéz lánc és három könnyű lánc CDR (vagy CDR-régió) van egy immunglobulin variábilis részében. így a „CDR” kifejezés, amint itt használjuk, mind a három nehéz lánc CDR-t, vagy mind a három könnyű lánc CDR-t (vagy mind a könnyű, mind a nehéz lánc CDR-eket, ha ez a megfelelő) jelenti.

A CDR-ek adják az antitest antigénhez vagy epitophoz való kötésére szolgáló kapcsológyökök többségét. A jelen találmány szempontjából érdekes CDR-ek a donorantitest variábilis nehéz és könnyű lánc szekvenciáiból származnak, és magukban foglalják a természetben előforduló CDR-ek analógjait, amely analógok osztják vagy megtartják ugyanazt az antigénkötő specifitást és/vagy neutralizálóképességet, mint a donorantitestek, melyekből származnak.

Az „osztják az antigénkötő specifitást vagy neutralizálóképességet” kifejezés azt jelenti például, hogy bár a 3B9 MAb jellemezhető egy bizonyos szintű antigénaffinitással, és a 3B9 egy nukleotidszekvenciája által kódolt CDR egy megfelelő strukturális környezetben alacsonyabb vagy magasabb affinitással rendelkezhet, mégis várható, hogy a 3B9 CDR-jei egy ilyen környezetben felismerik ugyanazt az epitopot, amit a 3B9. Például a 3B9 nehéz lánc CDR-jei tartalmazzák a 22. számú szekvenciát, a 24. számú szekvenciát és a 26. számú szekvenciát; és például a 3B9 könnyű lánc CDR-jei tartalmazzák a 16. számú szekvenciát, a 18. számú szekvenciát és a 20. számú szekvenciát.

Egy „funkcionális fragmens” egy részleges nehéz vagy könnyű lánc variábilis szekvencia (például kisebb deléciók az immunglobulin variábilis régió aminovagy karboxiterminálisán), amely megtartja ugyanazt az antigénkötő specifitást és/vagy neutralizálóképességet, mint ahonnan a fragmens származik.

Egy „analóg” egy legalább egy aminosavban megváltoztatott aminosavszekvencia, ahol az említett módosítás kémiai módosítás vagy szubsztitúció, vagy néhány (azaz nem több mint tíz) aminosav újrarendezése lehet, és amely módosítás lehetővé teszi, hogy az aminosavszekvencia megtartsa a nem módosított ami5

HU 222 041 Β1 nosavszekvencia biológiai jellemzőit, azaz antigénspecifitását és magas titerét vagy affinitását. Például csendes mutációkat hozhatunk létre szubsztitúciók útján azért, hogy endonukleáz restrikciós helyeket alakítunk ki a CDR-régiókon belül vagy azok körül.

Az analógok allélváltozatokként is keletkezhetnek. Egy „allélváltozat vagy módosulat” egy, a találmány szerinti aminosav- vagy peptidszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciában történt változás. Az ilyen módosulatok a genetikai kód degeneráltságából fakadhatnak, vagy kívánt tulajdonságok elérése céljából szándékosan tervezettek. Ezek a változatok vagy módosulatok az aminosavszekvenciában vagy okoznak változást, vagy nem. Például a 16. számú szekvencia szerinti könnyű lánc aminosavszekvencia azonos a természetes egér és a humanizált 3B9 antitest esetén. Mindamellett ezeket a CDR-szekvenciákat kódolja a 15. és az 53. számú szekvencia is. Hasonlóképpen a 22. számú szekvencia szerinti CDR-t kódolja a 21. és az 54. számú szekvencia, a

24. számú szekvencia szerinti CDR-t kódolja a 23. és az 55. számú szekvencia, és a 26. számú szekvencia szerinti CDR-t kódolja a 25. és az 56. számú szekvencia.

Az „effektoranyagok” kifejezés olyan nem protein hordozómolekulákra utal, amelyekhez a fúziós protein, és/vagy a donorantitest szintetikus vagy természetes nehéz vagy könnyű lánca, vagy a donorantitest más fragmensei asszociálhatnak a szokásos értelemben. Az ilyen nem protein hordozók lehetnek a szokásosan a diagnosztika területén használt hordozók, például polisztirén- vagy plasztikgyöngyök, poliszacharidok, például amilyen a BIAcore rendszerben (Pharmacia) használatos vagy más nem proteinanyagok, melyek az orvostudomány területén használatosak, és embereknek és állatoknak történő beadásuk biztonságos. Más effektoranyagok magukban foglalhatnak egy makrociklust egy nehézfématom kelátban tartásához, vagy radioizotópokat. Az ilyen effektoranyagok a fúziós protein féléletidejének növelésére is használhatók, mint például a polietilénglikol.

II. Nagy affinitású monoklonális IL-4 antitestek

A találmány szerinti antitestek, ffagmensek és fúziós proteinek előállítása során egy nem humán faj [például szarvasmarha, juh, főemlős, rágcsáló (például egér és patkány) stb.] használható arra, hogy a natív humán IL-4 vagy annak egy peptid epitopjának bemutatása révén a kívánt immunglobulin termelődését kiváltsuk. A nem humán IL-4 elleni MAb-t szekretáló hibridóma-sejtvonal előállításához konvencionális hibridómatechnikát alkalmaztunk. Az ilyen hibridómákat azután egy 96 lyukú lemezhez kovalensen kötött IL-4-et alkalmazva szűrtük, vagy alternatív módon biotinezett IL-4-gyet alkalmaztunk a szűrőeljárásban, mint azt alább a 2. példában részletesen leírjuk. így a találmány egy aspektusa egy humán IL-4 elleni MAb-k detektálására szolgáló eljárás, amelyben a vizsgálati rendszer elkerüli az IL-4 denaturálását. Ily módon felfedeztük, hogy hogyan lehet nagy titerű (vagy nagy affinitású) humán IL-4 elleni MAb-kat detektálni.

Példaként először egy nagy titerű neutralizáló MAb-t írunk le egérdonorból. A 3B9 MAb-t, amely egy, a kiméra vagy humanizált antitestek kialakításához megfelelő egér- (donor-) antitest, alább az 1. példa ismerteti. A 3B9 antitest humán IL-4 antigénkötő specifitással jellemezhető, 2 χ 10¹⁰ M-nál kisebb (körülbelül 1,8 χ 10~¹⁰ M) Kj-vel. Ezen 3B9 Fab-fragmensének Kj-je az IL-4 tekintetében kisebb, mint körülbelül 3x 10-’° M. Ezen antitest epitopját nem tudtuk lináris pepiidként az IL-4-hez térképezni, és ezért az epitop úgy tekinthető, mint ami egy nem folyamatos epitophoz köt. A kötés mintázata egy, a B-C hurok (60-69 gyökök) -» C hélix (70-93 gyökök) régiónál lévő kötőhelyet sugall. Ezek a régiók a Cook és munkatársai, J. Mól. Bioi. 218; 675-678 (1991), a Walter és munkatársai, J. Bioi. Chem. 267; 20 371-20 376 (1992), Wlodaver és munkatársai, FEBS Lett. 309; 59-64 (1992), Redfield és munkatársai, Biochem. 30; 11 029-11 035 (1991), Smith és munkatársai, J. Mól. Bioi. 224; 899-904 (1992), Garrett és munkatársai, (1992), és Powers és munkatársai, Biochem. 31; 4334-4346 (1992) és Science 256; 1673-1677 (1992) helyeken megadott térképjelölésekkel megegyeznek, melyeket referenciaként építünk be ide.

Egy másik kívánatos donorantitest a patkány 6A1 antitest. Ennek az antitestnek az előállítását alább a 7. példában adjuk meg. Ez az MAb IgG_2a izotípusként jellemezhető, mely 2x 10-¹⁰ M-nál kisebb (körülbelül 1,6 xlO^-10 M) disszociációs konstanssal rendelkezik a hIL-4 tekintetében. Mint a 3B9, e 6A1 célepitopja sem térképezhető az IL-4-hez lineáris pepiidként, és ezért az epitopot úgy tekintik, mint amely nem folyamatos és háromdimmenziós. Az IL-4 muteinjeihez való kötés mintázata, és ezek biológiai aktivitása azt jelzi, hogy a humán IL-4 D hélix régiójában (109-127 gyökök) köt, legvalószínűbben a 124. aminosavmaradéknál levő tirozin környékén.

Ez a találmány nem korlátozódik a 3B9 MAb, a 6A1 MAb vagy ezek hipervariábilis (azaz CDR) szekvenciáinak használatára. Más megfelelő magas titerű IL-4 antitestek is helyettesíthetik azokat, melyek 2 χ 10-¹⁰ M, vagy annál kisebb Kj-vel, és ennek megfelelő anti-IL-4 CDR-ekkel jellemezhetők a humán IL-4 tekintetében. Ahol a következő leírásban a donorantitestet 3B9-ként vagy 6Al-ként azonosítottuk, ez a megjelölés csupán példaképpen, és az egyszerűség kedvéért történt.

III. Antitestfragmensek

A jelen találmány magában foglalja a humán IL-4 ellen irányuló MAb-ékből származó Fab-fragmensek vagy F(ab’)₂-fragmensek használatát is. Ezek a fragmensek in vivő az IL-4 és IgE által közvetített állapotok elleni védő anyagokként, in vitro egy IL-4 diagnosztikum részeként használhatók. Egy Fab-fragmens az egész könnyű láncot és a nehéz lánc aminoterminális részét tartalmazza; egy F(ab’)₂-fragmens olyan fragmens, melyet két diszulfídhiddal összekötött Fab-fragmens alkot. A 3B9, a 6A1 MAb-k, és más hasonlóan nagy affinitású IL-4-kötő antitestek megfelelő forrásai az Fab- és F(ab’)₂-fragmenseknek, melyek szokásos módon, például az MAb-k megfelelő proteolitikus enzimmel, papainnal és/vagy pepszinnel végzett hasításá6

HU 222 041 Bl val, vagy rekombináns eljárásokkal kaphatók. Ezek az Fab- és F(ab’)₂-fragmensek maguk terápiás, profilaktikus vagy diagnosztikus szerként használhatók, valamint a rekombináns vagy humanizált antitestek kialakításában felhasználható szekvenciákként, beleértve a variábilis régiókat és a CDR-szekvenciákat is, amint azt leírjuk.

IV. A kérdéses anti-IL-4 aminosav és nukleotidszekvenciák

A 3B9 vagy más fent leírt antitestek olyan szekvenciákat nyújthatnak, mint például variábilis nehéz és/vagy könnyű lánc peptidszekvenciák, keretszekvenciák, CDR-szekvenciák, funkcionális fragmensek, és azok analógjai, és az ezeket kódoló nukleinsavszekvenciák, melyek különböző fúziós proteinek (beleértve a tervezett antitesteket) tervezésére és kialakítására használhatók, és melyek a donorantitest kötőspecificitásával jellemezhetőek.

Példaként a jelen bejelentés variábilis könnyű lánc és variábilis nehéz lánc szekvenciákat, és ezekből származó más szekvenciákat nyújt az egér 3B9 IL-4 antitestből. A 3B9 nehéz lánc variábilis régiója a 4. számú szekvencia 20-140 aminosavmaradékaival jellemezhető. A CDR-régiókat a 2. ábrán aláhúzással jelöltük, ezeket a 22., a 24. és a 26. számú szekvenciák írják le. A 3B9 könnyű lánc klón variábilis régióját az 1. ábra (2. számú szekvencia) 21-132. aminosavmaradékai jellemzik. A CDR-régiók a 44-58. aminosavak (16. számú szekvencia), 74-80. aminosavak (18. számú szekvencia), és a 113-121. aminosavak (20. számú szekvencia).

Kiméra nehéz lánc variábilis régiót és szignál nukleotid- és aminosavszekvenciákat is nyújtunk. Ezek a szekvenciák a 3B9 nehéz láncával azonosak a szignálszekvencia kivételével. A kiméra nehéz lánc szignálszekvenciát az 5. és a 6. számú szekvenciák írják le. A 3. ábrán a CDR-eket aláhúzással jelöltük, és ezek aminosavszekvenciája azonos a természetes egér CDR-ekkel (21-26. számú szekvenciák). A kiméra könnyű lánc variábilis régió nukleotid és aminosavszekvenciák azonosak a nem módosított 3B9 szekvenciákkal (21-132 aminosavak a

2. számú szekvenciában), és a természetes egér szignálszekvenciákat (1-20. aminosavak a 2. számú szekvenciában) használják.

A 4. ábrán egy humanizált nehéz lánc variábilis régiót és szignálszekvenciát mutatunk be (11. és 12. számú szekvencia). A szignálszekvenciát az 5. és 6. számú szekvenciák is leírják. Az itt leírt szignálszekvenciák helyettesíthetők az irodalomból ismert más megfelelő szignálszekvenciákkal. Ezen konstrukció CDR aminosavszekvenciái azonosak a természetes egér és a kiméra nehéz lánc CDR-ekkel, és a 22. (az 54. számú szekvencia által kódolva), a 24. (az 55. számú szekvencia által kódolva), és az 56. (a 26. számú szekvencia által kódolva) számú szekvencia írja le azokat.

Egy (szintetikus) humanizált könnyű lánc variábilis szekvenciára példa az 5. ábrán bemutatott szekvencia (13. és 14. számú szekvencia). A szignálszekvencia a 8. számú szekvencia 1-19. aminosavmaradékait éri át. Ezen ábra CDR-jeit aláhúzás jelöli, és ezek a 20. számú szekvencia egyetlen aminosavában különböznek a természetes egér CDR-ektől. így a humanizált könnyű lánc CDR-jeit az 53. és a 16., a 17. és 18., és a 27. és a

28. számú szekvenciák írják le. Ezt a különbséget a 3. példa részletesen tárgyalja.

A találmány szerinti, a variábilis könnyű lánc és nehéz lánc peptidszekvenciákat kódoló nukleinsavszekvenciákat, vagy azok fragmenseit vagy módosítatlan formában használjuk, vagy a kívánt módosítások, például restrikciós helyek bevezetése céljából szintetizáljuk azokat. Az izolált, a természetben előforduló, vagy alternatív módon a szintetizált nukleinsavszekvenciák, melyek a 3B9 MAb-ből vagy más kívánt nagy titerű IL-4 antitestekből származnak, opcionálisan tartalmazhatnak restrikciós helyeket, egy megfelelő nukleinsavszekvenciába, mint például egy kívánt antitest-keretrégiót kódoló szekvenciába történő inszerció vagy ligálás, mutagenizált CDR-ekkel való ligálás, vagy egy kiválasztott második fúziós partnert kódoló nukleinsavszekvenciával való fúzió megkönnyítésére.

A genetikai kód degeneráltságát figyelembe véve számos olyan kódolószekvencia alakítható ki, amely a variábilis nehéz lánc és könnyű lánc aminosavszekvenciákat, és a találmány szerinti CDR-szekvenciákat, valamint ezek funkcionális fragmenseit és analógjait kódolja, és amely a donorantitest antigénspecifitását mutatja. A találmány szerinti izolált nukleinsavszekvenciák, vagy azok fragmensei, melyek a variábilis lánc peptidszekvenciát vagy CDR-eket kódolják egy második fúziós partnerrel operatívan kapcsolva, fúziós proteinek, kiméra vagy humanizált antitestek, vagy más, a találmány szerinti tervezett antitestek előállítására használhatók.

Ezek a szekvenciák a CDR-eket vagy a keretrégiókat kódoló nukleinsavszekvenciákon belüli specifikus változások mutagenikus bevezetésére, és a megváltoztatott vagy fúziós nukleinsavszekvencia egy plazmidba expresszió céljából való beépítésére is használhatók. Például a keret- és CDR-kódoló régiók nukleotidszekvenciájában történt csendes szubsztitúciókat a mutagenizált CDR (és/vagy keret-) régiók inszercióját megkönnyítő restrikciós helyek előállítására használtuk. Ezeket a CDR-eket egy találmány szerinti humanizált antitest kialakítására használtuk fel.

Meg kell jegyezni, hogy az itt leírt fúziós proteinek és antitestek részeit kódoló izolált nukleinsavszekvenciákon felül más ilyen nukleinsavszekvenciákat is alkalmazhatunk, mint például a natív szekvenciákkal komplementer szekvenciák. A hasznos DNS-szekvenciák magukban foglalják azokat a szekvenciákat, melyek szigorú hibridizálási körülmények között [lásd T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A. Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 387/389 oldalak] hibridizálnak a DNS-szekvenciákkal. Egy ilyen szigorú hibridizálási körülményre példa a 4xSSC-ben, 65 °C-nál történő hibridizáció, amit 0,lxSSC-ben 65 °C-nál 1 órán át történő mosás követ. Alternatív módon egy szigorú hibridizálási körülmény az 50% formamid, 4 χ SSC 42 °C-nál. Előnyösen ezek a hibridizáló DNS-szekvenciák legalább 18 nukleotid hosszúak, azaz körülbelül egy CDR méretének felelnek meg.

HU 222 041 Β1

V. Fúziós molekulák és fúziós proteinek

A fúziós molekulák olyan fúziós proteineket kódolhatnak, melyek a tervezett antitesteket, például kiméra antitesteket, és humanizált antitesteket foglalják magukban. Egy kívánatos fúziós molekula egy IL-4 elleni antitest, előnyösen egy a találmány szerinti nagy affinitású antitest antigénspecifitásával rendelkező peptideket kódoló CDR-szekvenciákat tartalmaz egy első fúziós partnerbe (egy humán keret vagy humán immunglobulin variábilis régióba) inszertálva.

Előnyösen az első fúziós partner operatívan kapcsolódik egy második fúziós partnerhez. A második fúziós partnert fentebb definiáltuk, és egy második kérdéses antitestrégiót, például egy Fc-régiót kódoló szekvenciát tartalmazhat. A második fúziós partner tartalmazhat más immunglobulinokat kódoló szekvenciákat, melyekhez a könnyű vagy nehéz lánc konstans régiókeretben, vagy egy linkerszekvencia segítségével fuzionálva van. Tervezhetünk az IL-4 funkcionális fragmensei vagy analógjai ellen irányuló tervezett antitesteket, hogy megnövekedett kötést hozzunk létre ugyanazzal az antitesttel.

A második fúziós partner a fentebb definiált effektoranyagokkal is kapcsolódhat, beleértve a nem protein hordozómolekulákat, melyekhez a második fúziós partner konvencionális módon operatívan kapcsolható.

A második fúziós partner, azaz az antitestszekvenciák és az effektoranyag közötti fúzió vagy kötés bármely megfelelő módon létrejöhet, például konvencionális kovalens vagy ionos kötés, proteinfúzió, vagy hetero-bifúnkcionális keresztkötések, például karbodiimid-, glutáraldehid-kötések és hasonlók útján. Ezek a módszerek ismertek, és a hagyományos kémiai és biokémiai irodalomban le vannak írva.

Ezenfelül a fúziós molekulába beépíthetők olyan hagyományos linkerszekvenciák, melyek egyszerűen a második fúziós partner és az effektoranyag közötti megfelelő távolság kialakítására szolgálnak. Az ilyen linkerek tervezése jól ismert a szakterületen járatosak számára.

Ezen túl a találmány szerinti molekuláknál módosíthatjuk a szignálszekvenciákat, hogy az expressziót fokozzuk. Példaként egy kívánt fúziós protein esetén, mely a 2. ábra kiméra variábilis nehéz láncával (V_H; 4. számú szekvencia) azonos egér nehéz lánc szekvencia aminosavszekvenciájával rendelkezik, az eredeti szignálpeptidet egy másik szignálszekvenciával helyettesítettünk (6. számú szekvencia; 1-20. aminosavak).

Egy fúziós protein példaként egy variábilis nehéz és/vagy könnyű lánc peptid- vagy proteinszekvenciát tartalmazhat, amely a 3B9 MAb antigénspecifitásával rendelkezik, mint például a V_H (a 9. és 10. számú szekvencia 21-141. aminosavai) és V_L lánc (a 1. és 2. számú szekvencia 21-132. amminosavai). Egy másik találmány szerinti fúziós protein azzal jellemezhető, hogy a 3B9 egér-antitestmolekula nehéz és/vagy könnyű lánc variábilis régiójának legalább egy, és előnyösen minden CDR-jét tartalmazza, a fennmaradó szekvenciák pedig egy humán fonásból, vagy ennek egy funkcionális fragmenséből vagy analógjából származnak. Lásd például a 11. és 12. és a 13. és 14. számú szekvencia humanizált Vh- és V_L-régióit (4. és 5. ábrák).

Egy további megvalósítási módban a találmány szerinti tervezett antitestet egy járulékos anyaghoz kapcsolhatjuk. Például egy olyan találmány szerinti tervezett antitest előállításához, melyben a teljes antitestmolekula Fc-fragmensét vagy CH₃-doménjét egy enzim vagy más detektálható molekula helyettesíti (például egy effektorpolipeptid vagy riportermolekula) a rekombináns DNS-technológia eljárásait alkalmazhatjuk.

A második fúziós partner operatívan kapcsolódhat egy a CDR-tartalmú, egér 3B9 antigénspecifitású szekvenciára nézve heterológ nem immunglobulin pepiiddel, proteinnel vagy annak egy fragmensével. Az így nyert protein mind anti-IL-4 antigénspecifitást, mind a nem immunglobulinrész jellemzőit mutathatja az expresszió során. Ez a fúziós partnerjellemző lehet például egy funkcionális jellemző, mint például egy más kötővagy receptordomén, vagy egy terápiás jellemző, ha a fúziós partner maga egy terápiás protein, vagy járulékos antigenikus jellemző.

Más találmány szerinti proteinek egy teljes antitestmolekulából állhatnak, amely teljes hosszúságú nehéz és könnyű lánccal, vagy ezek bármely elkülönült fragmensével, mint például az Fab- vagy az F(ab’)₂-fragmens, egy nehéz lánc dimerrel vagy ennek bármely minimális rekombináns fragmensével, mint például egy Fv, vagy egy egyláncú antitesttel (SCA) vagy bármely más molekulával rendelkezik, amely a kiválasztott donor MAb-vel azonos specifitású, például a 3B9 vagy a 6A1 MAb. Az ilyen proteint fúziós protein formájában vagy nem fuzionált formájában használhatjuk fel.

Ha a második fúziós partner egy másik antitestből, például immunglobulin keret- vagy konstans régió bármely izotípusából vagy osztályából származik, az eredmény egy tervezett antitest. A tervezett antitestek az egyik forrásból, például az akceptorantitestből immunglobulin (lg) konstans régiókat és variábilis keretrégiókat tartalmazhatnak, a donorantitestből, például az itt leírt anti-IL-4 antitestből pedig egy vagy több (előnyösen az összes) CDR-t. Ezenfelül a donorantitest antigénkötő specifitásának megőrzése céljából módosíthatjuk az akceptor MAb könnyű és/vagy nehéz variábilis dómén keretrégióit nukleinsav- vagy aminosavszinten, például deléciók, szubsztitúciók vagy addíciók útján.

Ilyen tervezett antitesteket hoztunk létre a leírtak szerint opcionálisan módosított IL-4 MAb variábilis nehéz és/vagy könnyű láncai egyikének (vagy mindkettőnek), vagy a lentebb definiált nehéz vagy könnyű lánc CDRek (lásd a 3. példát) egyikének vagy többnek a használatával. A találmány szerinti tervezett antitestek neutralizálók, azaz a kívánt módon gátolják az IL-4 protein receptorához való kötődést. Például a 3B9 MAb-ből származó tervezett antitest a humán IL-4 egy specifikus tercier protein epitopja ellen irányul, amelyről úgy hisszük, hogy a B-C hurok->C hélix régióban van, amint fentebb leírtuk.

Az ilyen tervezett antitestek magukban foglalhatnak egy kiválasztott humán immunglobulin vagy szubtípus keretrégióját tartalmazó humanizált antitestet,

HU 222 041 Bl vagy egy, a humán nehéz és könnyű lánc konstans régiókat az IL-4 antitest funkcionális ffagmensével fúzióban tartalmazó kiméra antitestet. Egy megfelelő humán (vagy más állati) akceptorantitestet a szokásos adatbázisokból, például a KÁBÁT® adatbázis, Los Alamos adatbázis, és Swiss Protein adatbázis, választhatjuk ki a donorantitest nukleotid- és aminosavszekvenciájával való homológia alapján. A donorantitest keretrégiójával aminosavalapon homológ humán antitest megfelelő lehet ahhoz, hogy a donor CDR-ek beépítéséhez nehéz lánc konstans régiót és/vagy nehéz lánc variábilis keretrégiót nyújtson. Egy könnyű lánc konstans vagy variábilis keretrégiót nyújtani képes megfelelő akceptorantitestet hasonló módon választhatunk ki. Meg kell jegyezni, hogy nem szükséges, hogy az akceptorantitest nehéz és könnyű láncok ugyanabból az akceptorantitestből származzanak.

Kívánatos, hogy a heterológ keret- és konstans régiókat humán immunglobulin-osztályokból és izotípusokból, például IgG (1-4 szubtípusok), IgM, IgA, és IgE, válasszuk. Azonban nem szükséges, hogy az akceptorantitest csak humán immunglobulin proteinszekvenciákat tartalmazzon. Például előállíthatunk egy gént, amelyben egy humán immunglobulinlánc egy részét kódoló DNS-szekvencia fúzióban van egy nem immunglobulin aminosavszekvenciát, például egy effektorpolipeptidet vagy riportermolekulát kódoló DNSszekvenciával.

Egy különösen kívánatos humanizált antitestre példa egy olyan antitest, amely a 3B9 CDR-jeit egy kiválasztott humán antitestszekvencia keretrégióiba inszertálva tartalmazza. A neutralizáló humanizált antitestekhez egy, kettő vagy előnyösen három IL-4 antitest nehéz lánc és/vagy könnyű lánc variábilis régiókból származó CDR-t a kiválasztott humán antitestszekvencia keretrégióiba inszertálunk, az előbbi antitest természetes CDR-jeit helyettesítve.

Előnyösen egy humanizált antitestben mind a humán nehéz láncban, mind a könnyű láncban lévő variábilis domént átalakítottuk egy vagy több CDR helyettesítésével. Lehetséges mind a hat CDR használata, vagy hatnál kevesebb CDR számos kombinációja. Előnyösen mind a hat CDR-t helyettesítjük. A CDR-eket helyettesíthetjük a humán nehéz láncban, könnyű láncként a humán akceptorantitest módosítatlan könnyű láncát használva. Alternatív módon egy kompatibilis könnyű láncot egy másik humán antitestből is kiválaszthatunk a szokásos antitest-adatbázisokat futtatva. A tervezett antitest fennmaradó része bármely megfelelő humán akceptor-immunglobulinból származhat.

A tervezett humanizált antitest tehát előnyösen egy természetes humán antitest vagy annak ffagmense szerkezetével rendelkezik, és a hatásos terápiás használathoz, például IL-4 által közvetített gyulladásos betegségek kezeléséhez emberben, vagy diagnosztikai felhasználáshoz szükséges tulajdonságok kombinációjával bír.

Másik példaként egy tervezett antitest a 3B9 variábilis könnyű lánc régió három CDR-jét (16., 18., 20. és

28. számú szekvencia), és a 3B9 variábilis nehéz lánc régió három CDR-jét (22., 24. és 26. számú szekvencia) tartalmazhatja. Az így kapott humanizált antitest a 3B9 antigénkötő specifitásával és nagy affinitásával jellemezhető.

A szakterületen járatosak megértik, hogy egy tervezett antitestet tovább módosíthatunk a variábilis dómén aminosavainak megváltoztatásával anélkül, hogy ez szükségszerűen hatással lenne a donorantitest (azaz egy analóg) nagy affinitására és specifitására. Például olyan humanizált monoklonális antitesteket hoztunk létre, ahol a könnyű lánc 120. helyén lévő aminosavmaradék egy arginin (13. és 14. számú szekvencia) vagy threonin (57. és 58. számú szekvencia) volt. Az előre látható volt, hogy a nehéz és a könnyű lánc aminosavakat más aminosavakkal lehet helyettesíteni a variábilis dómén keretrészében vagy a CDR-ekben, vagy mindkettőben.

Ezenfelül a konstans régiót is megváltoztathatjuk a találmány szerinti molekulák szelektív tulajdonságainak növelésére vagy csökkentésére. Ilyen tulajdonság például a dimerizáció, Fc-receptorhoz való kötődés, vagy a komplementhez kötődés és aktiválás képessége [lásd például Angal et al., Mol. Immunoi. 30., 105-108 (1993), Xu et al., J. Biol.Chem. 269., 3469-3474 (1994), Winter et al., EP 307,434-B]

Egy kiméra antitest fúziós protein abban különbözik a fentebb leírt humanizált antitestektől, hogy a nem humán donorantitest az egész, a keretrégiókat is tartalmazó nehéz lánc és könnyű lánc variábilis régiót nyújtja mindkét lánc számára, a humán immunglobulin konstans régióval kapcsolódva. Előre látható volt, hogy a járulékos nem humán szekvenciákat megtartó kiméra antitestek a találmány szerinti humanizált antitesthez képest szignifikáns immunválaszt válthatnak ki emberben.

Ezeket az antitesteket az IL-4 által közvetített allergiás rendellenességek megelőzésére és kezelésére használhatjuk, amint lejjebb bemutatjuk.

VI. Fúziós proteinek és tervezett antitestek előállítása

Előnyösen a találmány szerinti fúziós proteinek és a tervezett antitestek, előnyösen humanizált antitestek előállításához a 3B9 MAb, vagy más megfelelő donor MAb-k (például 6A1) variábilis könnyű és/vagy nehéz lánc szekvenciáit és CDR-jeit (16., 18., 20., 22., 24. és

26. számú szekvenciák), és az azokat kódoló nukleinsavszekvenciákat használhatjuk, a következő eljárás szerint. Ugyanezek vagy hasonló eljárások alkalmazhatók a találmány más megvalósítási módjainak előállítására.

Egy kiválasztott donor MAb-t, például az egér 3B9 antitestet termelő hibridómát a szokásos módon klónoztuk, és a nehéz és könnyű lánc variábilis régiók DNS-ét a szakterületen járatosak számára ismert módszerekkel, például a következő helyen leírtak szerint kaptuk meg: Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning (A. Laboratory Manual), 2. kiadás, Cold Sprong Harbor Laboratory (1989). A 3B9 legalább a CDReket tartalmazó nehéz és könnyű variábilis régióját és az akceptorantitest könnyű és/vagy nehéz variábilis dómén keretrégió azon részeit, amelyek a donor MAb kötőspecifitásának megtartása miatt szükségesek, valamint az antitestlánc fennmaradó, egy humán immun9

HU 222 041 Bl globulinból származó immunglobulin-eredetű részeit polinukleotid printereket és reverz transzkriptázt használva kaptuk meg. A CDR-eket egy ismert adatbázis alkalmazásával más antitestekkel való összehasonlítással azonosítottuk.

Ezután egy egér/humán kiméra antitestet állíthatunk elő, és kötő képességére tesztelhetjük. Egy ilyen kiméra antitest mindkét lánca a nem humán donorantitest egész V_H- és V_L-régióit tartalmazza, humán lg konstans régiókkal kapcsolva.

Egy humán antitestből származó nehéz lánc variábilis régió homológ keretrégióit számítógépes adatbázisokat, például KABAT®-t használva azonosítottuk, és egy a 3B9-cel homológiát tartalmazó humán antitestet választottunk ki akceptorantitestként. A 3B9 CDR-eket humán antitestkeretekben tartalmazó szintetikus nehéz lánc variábilis régiók szekvenciáit a keretrégiókban opcionális nukleotidhelyettesítésekkel terveztük meg, hogy restrikciós helyeket építsünk be. Ezt a tervezett szekvenciát azután átfedő oligonukleotidokkal szintetizáltuk, polimeráz-láncreakcióval (PCR) amplifikáltuk, és a hibákat kijavítottuk.

Egy megfelelő könnyű lánc variábilis keretrégiót terveztünk hasonló módon.

Egy humanizált antitest a kiméra antitestből származhat, vagy előnyösen szintetikusan állítható elő a nehéz és könnyű láncból származó donor MAb CDR-eknek a kiválasztott nehéz és könnyű lánc keretbe történő inszertálásával. Alternatív módon a találmány szerinti humanizált antitestet standard mutagenezis-módszerekkel is előállíthatjuk. Az így kapott humanizált antitest humán keretrégiókat és a donor MAb CDR-jeit tartalmazza. A keretszekvenciában később módosításokat végeztünk. Az így kapott humanizált antitestet rekombináns gazdasejtben, például COS- vagy CHO-sejtekben expresszálhatjuk. Az eljárás további részleteit a 4. példa adja meg. Más humanizált antitesteket is előállíthatunk ezeket a módszereket alkalmazva más megfelelő IL-4-specifikus, neutralizáló, magas titerű, nem humán antitesteken.

Ezeket a fúziós proteint kódoló szekvenciákat egy gazdasejtben az expresszió és a replikáció, és/vagy a szekréció szabályozására képes szokásos szabályozó kontrollszekvenciákkal operatív kapcsolatban elhelyezve egy szokásos expressziós vektort vagy rekombináns plazmidot állítottunk elő. A szabályozószekvenciák magukban foglalják a promoterszekvenciákat, például CMV-promoter, és a szignálszekvenciákat, melyek más ismert antitestekből származhatnak. Hasonlóképpen egy második expressziós vektort állítottunk elő, amely egy komplementer antitest könnyű vagy nehéz láncát kódoló DNS-szekvenciával rendelkezik. Előnyösen ez a második expressziós vektor azonos az elsővel, kivéve ami a kódolószekvenciákat és szelektálható markereket illeti, és ezáltal biztosítja, amennyire lehetséges, hogy minden polipeptidlánc funkcionálisan kifejeződjön.

Egy kiválasztott gazdasejtet kontranszformálunk a szokásos technikákkal mind az első, mind a második vektorral, vagy egyszerűen egy egyedi vektorral transzformáljuk, egy találmány szerinti transzfektált gazdasejt előállítása céljából, amely gazdasejt tartalmazza a rekombináns vagy szintetikus könnyű és nehéz láncokat is. A transzfektált sejtet azután a szokásos technikákkal tenyésztjük, hogy a találmány szerinti tervezett antitesteket termelje. A rekombináns nehéz láncot és/vagy könnyű láncot tartalmazó humanizált antitestet megfelelő tesztekkel, mint például az ELISA vagy a R1A, kiválasztjuk a tenyészetekből. Hasonló konvencionális technikákat alkalmazhatunk más, találmány szerinti fúziós proteinek és molekulák előállítására.

A klónozási és szubklónozási lépésekhez megfelelő, a találmány szerinti eljárásokban és a készítmények előállításában alkalmazott vektorokat a szakterületen járatosak kiválaszthatják. Például a konvencionális pUC-sorozat klónozóvektorait alkalmazhatjuk. Az egyik használt vektor a pUC19, amely kereskedelmi forgalomban beszerezhető az olyan forgalmazóktól, mint az Amersham (Buckinghamshire, Egyesült Királyság) vagy a Pharmacia (Uppsala, Svédország). Ezenfelül bármely vektor, amely képes könnyen replikálódni, számos klónozóhelye és markergénje van, és könnyen manipulálható, használható a klónozásra. így a klónozóvektor kiválasztása nem limitáló tényező a jelen találmány esetében.

Hasonlóan, a találmány szerinti tervezett antitestek kifejezésére használható vektorokat a szakterületen járatosak a szokásos vektorok közül választhatják ki. A vektorok kiválasztott szabályozószekvenciákat is tartalmaznak, amelyek operatív kapcsolatban vannak az immunglobulin-régiók DNS-kódoló szekvenciáival, és képesek irányítani a heterológ DNS-szekvencia replikációját és expresszióját egy kiválasztott gazdasejtben, mint például a CMV-promoter. Ezek a vektorok tartalmazzák a fent leírt DNS-szekvenciákat, amelyek a tervezett antitestet vagy fúziós proteint kódolják. Alternatív módon a vektorok a könnyű manipulálhatóság érdekében kívánatos restrikciós helyek beépítésével módosított kiválasztott immunglobulin-szekvenciákat is tartalmazhatnak.

Az expressziós vektorok jellemezhetők a heterológ DNS-szekvenciák expressziójának megsokszorozására alkalmas markergénekkel is, például az emlős dihidrofolát-reduktáz-génnel (DHFR) vagy a neomicinrezisztencia-génnel (neoR). Más előnyös vektorszekvenciák tartalmaznak egy poliA szignálszekvenciát, mint például a szarvasmarha növekedési hormonból (BGH), és a béta-globin-promoterszekvenciából (betaglopro) származó. Az itt használható expressziós vektorokat a szakterületen járatosak számára jól ismert eljárásokkal szintetizálhatjuk.

Az ilyen vektoroknak a rekombináns DNS-termékek expressziójának és/vagy szekréciójának egy kiválasztott sejtben való irányítására szolgáló alkotórészeit, például a replikonokat, szelekciós géneket, enhanszereket, promotereket, szignálszekvenciákat és hasonlókat természetes forrásokból kaphatjuk meg, vagy ismert eljárásokkal szintetizálhatjuk. Más megfelelő expressziós vektorokat, melyeknek számos típusa ismert az irodalomban emlős-, bakteriális, rovar-, élesztő- és gombaexpresszióhoz, is kiválaszthatunk erre a célra.

HU 222 041 Bl

A találmány vonatkozik egy, a tervezett antitesteket vagy fúziós molekulákat kódoló szekvenciákat tartalmazó rekombináns plazmiddal transzformált sejtvonalra is. A klónozáshoz használható gazdasejtek, és a klónozóvektorok más átalakításai a szokásosak lehetnek. Legelőnyösebb azonban a klónozóvektorok replikációjához és a találmány szerinti fúziós proteinek előállításának más lépéseihez az E. coli különböző törzseinek sejtjeit használni.

A találmány szerinti fúziós proteinek vagy tervezett antitestek expressziójához a megfelelő gazdasejt vagy sejtvonal előnyösen egy eukariótasejt, mint például a CHO, a COS, egy fibroblasztsejt (például 3T3), vagy mieloidsejtek, és legelőnyösebben egy emlőssejt, mint a CHO-sejt vagy egy mieloidsejt. Humán sejteket is használhatunk, így téve lehetővé a molekula humán glikozilációs mintázattal való módosítását. Alternatív módon más eukarióta-sejtvonalakat is használhatunk. A megfelelő emlősgazdasejt kiválasztása, a transzformációs, tenyésztési, amplifikációs, tesztelési és terméktermelési és tisztítási eljárások ismertek az irodalomból. Lásd például Sambrook és munkatársai fentebb idézett munkáját.

Bakteriális sejtek is hasznosak lehetnek megfelelő gazdasejtként a találmány szerinti rekombináns MAb-k expressziójához. Azonban annak a tendenciának köszönhetően, hogy a bakteriális sejtekben expresszált proteinek nem hajtogatott vagy nem megfelelően hajtogatott formában, vagy nem glikozilált formában találhatók, minden bakteriális sejtben előállított MAb-t tesztelni kellene az antigénkötő képesség megtartására. Ha a bakteriális sejt által kifejezett molekula megfelelően hajtogatódva termelődött, ez a bakteriális sejt egy megfelelő gazdasejt lehet. Jól ismertek például gazdasejtként a biotechnológia területén a különböző expresszióra használt E. coli törzsek. Különböző B. subtilis, Streptomyces vagy más baktériumok törzsei szintén használhatók ebben az eljárásban.

Ahol az kívánatos, a szakterületen járatosak számára ismert élesztősejtek is elérhetők, mint gazdasejtek, valamint rovarsejtek és virális expressziós rendszerek, például Drosophila és Lepidoptera. Lásd például Miller és munkatársai, Genetic Engineering 8, 277-298, Plenum Press (1986) és az abban idézett referenciák.

A találmány szerinti vektorok előállítására szolgáló általános eljárások, a találmány szerinti gazdasejtek előállításához szükséges transzfekciós eljárások, az ilyen gazdasejtekkel a találmány szerinti fúziós protein vagy tervezett antitest termeléséhez szükséges tenyésztési eljárások mindegyike konvencionális eljárás. Hasonlóképpen a termelt találmány szerinti fúziós protein vagy tervezett antitest az azt tartalmazó sejtkultúrából a szakterület standard eljárásaival tisztítható, beleértve az ammónium-szulfátos kicsapást, az affinitásoszlopokat, a kromatográfiás oszlopokat, a gélelektroforézist és hasonlókat. Ezek az eljárások a technika állásához tartoznak, és nem korlátozzák a találmányt.

Egy, a humanizált antitestek expressziójára szolgáló másik eljárás transzgenikus állatokat alkalmazhat, mint amilyeneket például az 4,873,316 számú US szabadalom leír. Ez a szabadalom egy állati kazeinpromotert használó expressziós rendszene vonatkozik, amely promoter transzgenikusan beépítve egy emlősbe lehetővé teszi, hogy a nőstény a kívánt rekombináns proteint a tejében termelje.

Ha a kívánt eljárással kifejeztük, a tervezett antitestet azután in vivő aktivitására megvizsgáljuk megfelelő teszteket alkalmazva. Jelenleg a konvencionális ELISA-teszt-formátumokat alkalmazzuk a tervezett antitestnek egy IL-4 epitophoz való kötésének mennyiségi és minőségi vizsgálatára. Ezenfelül más in vitro tesztek, például BLAcore (Pharmacia) is használhatók a neutralizálóhatás igazolására az azt követő humán klinikai vizsgálatokat megelőzően, mely utóbbiakat a tervezett antitestnek a testben a szokásos tisztítási mechanizmusok ellenére való fennmaradásának becslésére végzünk.**

A 3B9-ből előállított humanizált antitestre leírt eljárásokat követve a szakterületen járatosak más humanizált antitesteket is előállíthatnak más itt leírt donor IL-4 antitestekből, variábilis régió szekvenciákból és CDR-peptidekből. Tervezett antitesteket az azokat befogadó szervezet által potenciálisan sajátként felismert variábilis régiókeretekkel is előállíthatunk. A variábilis régiókeretekben végezhetünk kisebb módosításokat, hogy az antigénkötésben nagy növekedést érjünk el a befogadó immunogenitásának látható növekedése nélkül. így a tervezett antitestekkel hatásosan kezelhetők az emberek az IL-4 által közvetített állapotokban. Az ilyen antitesteket az ilyen állapotok diagnosztizálására is használhatjuk.

VII. Terápiás/profilaktikus alkalmazások

A találmány allergiás rendellenességen áteső emberek kezelésére szolgáló eljárásra is vonatkozik, amely antitestek egy hatásos dózisának beadásából áll, beleértve egy vagy több, itt leírt tervezett antitestet vagy fúziós proteint, vagy azok fragmenseit.

A találmány szerinti molekulák alkalmazása által indukált terápiás választ az IL-4-hez való kötődés, és ebből következően az IgE-kibocsátás gátlása váltja ki. Ezért a találmány szerinti molekulák, ha a terápiás alkalmazáshoz megfelelő készítményekben és megjelenésformában vannak, igen kívánatosak azon személyek számára, akik allergiás rendellenességen esnek át, például allergiás náthán, kötőhártya-gyulladáson, atópiás dermatitiszen, atópiás asztmán, és anafilaxiás sokkon.

A találmány szerinti fúziós proteineket, antitesteket, tervezett antitesteket vagy azok fragmenseit más antitestekkel együtt is alkalmazhatjuk, különösen olyan más markerekkel (epitopokkal) reaktív humán MAbkel, melyek azon állapotokért felelősek, melyek ellen a találmány szerinti tervezett antitest irányul. Hasonlóképpen egy kiválasztott állatban az olyan állapotért felelős epitopokkal reaktív MAb-k, melyek ellen a találmány szerinti antitest irányul, szintén alkalmazhatók állatgyógyászati készítményekben.

A találmány szerinti terápiás anyagról úgy hisszük, hogy az allergiás állapotok kezelésére körülbelül 2 naptól körülbelül 3 hétig kívánatos alkalmazni, vagy amint szükséges. Például hosszabb kezelés lehet kívánatos,

HU 222 041 Bl ha szezonális náthát vagy hasonlót kezelünk. Ez jelentős előnyt jelent a technika állása szerinti IL-4 által közvetített rendellenességek kezelésére jelenleg használatos infúziós eljárással szemben. A dózis és a kezelés időtartama a találmány szerinti molekuláknak az emberi keringésben való relatív fennmaradásától függ, és szakember beállíthatja a kezelendő állapot és a páciens általános egészségi állapota függvényében.

A találmány szerinti terápiás anyag beadásának módja bármely megfelelő út lehet, amely az anyagot a gazdához eljuttatja. A találmány szerinti fúziós proteinek, antitestek, tervezett antitestek, és azok fragmensei, és gyógyszerkészítmények különösen hasznosak parenterális beadáskor, azaz szubkután, intramuszkuláris, intravénás vagy intranazális úton.

A találmány szerinti terápiás anyagokat előállíthatjuk a találmány szerinti tervezett (például humanizált) antitest hatásos mennyiségét, mint aktív összetevőt egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban tartalmazó gyógyszerkészítményként. A találmány szerinti profilaktikus anyag esetén a tervezett antitestet tartalmazó vizes szuszpenzió vagy oldat, melyet előnyösen fiziológiás pH-ra állítottunk be, előnyösen injektálásra kész formában van. A parenterális beadásra szolgáló készítmény általában a találmány szerinti tervezett antitest oldatát vagy koktélját egy gyógyszerészetileg elfogadható, előnyösen vizes hordozóban feloldva tartalmazza. Számos vizes hordozó alkalmazható, például 0,4% sóoldat, 0,3% glicin és hasonlók. Ezek az oldatok sterilek és általában szemcsés anyagoktól mentesek. Az oldatokat szokásos, jól ismert sterilizálóeljárásokkal (például szűrés) sterilezhetjük. A készítmény tartalmazhat gyógyszerészetileg elfogadható adalék anyagokat, ahogy az a fiziológiás állapot megközelítéséhez kívánatos, mint például pH-beállító és pufferolóanyagokat stb. A találmány szerinti antitest koncentrációja az ilyen gyógyszerkészítményekben széles tartományban változhat, azaz kevesebb mint körülbelül 0,5%-tól, általában legalább körülbelül 1%-tól egészen 15%-ig vagy 20%-ig tömegszázalékban, és elsődlegesen a folyadék térfogatán, viszkozitásán stb. alapulva választjuk meg, a választott beadási módnak megfelelően.

így a találmány szerinti gyógyszerkészítményt intramuszkuláris injektáláshoz úgy állíthatjuk elő, hogy az 1 ml steril pufferolt vizet és körülbelül 1 ng-tól körülbelül 100 mg-ig, például körülbelül 50 ng-tól 30 ng-ig, vagy annál több, előnyösen körülbelül 5 mg-tól körülbelül 25 mg-ig teqedő mennyiségű találmány szerinti tervezett antitestet tartalmazzon. Hasonlóan, a találmány szerinti gyógyszerkészítményt intravénás infúzióhoz úgy állíthatjuk elő, hogy körülbelül 250 ml steril Ringer-oldatot és körülbelül 1-től körülbelül 30-ig, előnyösen 5 mg-tól körülbelül 25 mg-ig teqedő mennyiségű találmány szerinti tervezett antitestet tartalmazzon. A parenterálisan beadható készítmények előállításának aktuális eljárásai jól ismertek, vagy nyilvánvalóak lesznek a szakterületen járatosak számára, és részletesen le vannak írva például a Remington’s Pharmaceutical Science, 15. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania helyen.

Előnyös, ha a találmány szerinti terápiás anyag gyógyszerkészítményben egységdózis formában van jelen. A megfelelő terápiásán hatékony dózist a szakterületen járatosak könnyen megállapíthatják. Egy gyulladásos rendellenesség hatásos kezelésére emberben vagy más állatban a találmány szerinti antitest vagy fehéqe egy körülbelül 0,1 mg-körülbelül 20 mg per 70 kg testsúly dózisát kell beadni parenterálisan, előnyösen im. (intramuszkulárisan). Ezt a dózist az orvos által a gyulladásos válasz alatt kiválasztott megfelelő időpontban megismételhetjük, amennyiben az szükséges.

A találmány felöleli a találmány szerinti IL-4 fúziós proteinek egyidejű vagy egymás utáni beadását más antitestekkel vagy fúziós proteinekkel, amelyek anti-IL-4-aktivitással jellemezhetők, mint például az antitumomekrózisfaktor-aktivitás, vagy más, a találmány szerinti fúziós proteinek IL-4-receptor-kötő képességével kompatibilis gyógyszerészeti aktivitás. Ilyen más antitestek a kereskedelemben hozzáférhetők vagy az itt leírtakhoz hasonló módon tervezhetők.

A találmány szerinti fúziós proteineket és tervezett antitesteket diagnosztikai rendszerben is alkalmazhatjuk az IL-4 által közvetített rendellenességek meghatározására, vagy az ilyen rendellenességek kezelésének nyomon követésére. Mint diagnosztikai reagens, a fúziós proteineket szokásos módon jelölhetjük az ELISAban és más szokásos tesztben való használat céljából, amely a szérum, a plazma vagy más megfelelő szövet IL-4-szintjének mérésére szolgál. Azon tesztek természete, melyekben a fúziós proteineket használjuk, szokásos, és nem korlátozza ezt a leírást.

Az itt leírt antitesteket, tervezett antitesteket vagy fragmenseit tárolás céljából liofilezhetjük, és egy megfelelő hordozóban használat előtt visszaalakíthatjuk. Erről a technikáról bemutatták, hogy a szokásos immunglobulinok esetében eredményes, így itt is alkalmazhatók a technika állásából ismert liofilezési és visszaalakítást eljárások.

A következő példák a találmány számos aspektusát illusztrálják, beleértve a példaként említett tervezett antitestek konstrukcióját és azok expresszióját egy megfelelő vektorban és gazdasejtben, és nem értelmezhetők úgy, mint amik korlátozzák a találmány oltalmi körét. Minden aminosavat a szokásos hárombetűs vagy egybetűs kóddal jelöltünk. Minden szükséges restrikciós enzimet, plazmidot és más reagenst és anyagot kereskedelmi forgalomból szereztünk be, hacsak mást nem jelöltünk. Minden általános klónozóligálást és más rekombináns DNS-eljárást T. Maniatis és munkatársai fent idézett művében leírtak szerint, vagy annak ugyanazon kiadó által publikált második kiadásában [Sambrook et al. (1989)] leírtak szerint végeztünk.

Példák

1. példa

A 3B9 MAb előállítása

A) Immunizálási eljárás

Négy egeret (C57BL/6 és Balb/c Fl hibridjei) szubkután 50 pg humán IL-4 rekombináns E. colival im12

HU 222 041 Β1 munizáltunk komplett Freund-adjuvánsban, és ezt 4 héttel később intraperitoneálisan (ip.) inkomplett Freundadjuvánsban lévő 50 pg IL-4-gyel megerősítettük. Az IL-4-hez való jó szérum antitesttiter alapján egy egeret tovább immunizáltunk 200 pg IL-4-gyel (ip. sóoldatban) a 8. héten, két nappal később 100 pg IL-4-gyel (ip. sóoldatban), és két nappal később 50 pg IL-4-gyel (ip. sóoldatban). Két nappal az utolsó immunizálás után splenectomiát (lépkivétel) hajtottunk végre.

B) Fúziós eljárás és szűrési rendszer

Az egérlépsejteket hibridómák előállítására használtuk (standard eljárásokkal, például amint Kohler és munkatársai leírják [Natúré 256, 495 (1975)]), melyekből >250 sejtklónt vizsgáltunk IL-4 elleni antitestszekrécióra az IL-4-kötés alapján, a kereskedelemben elérhető BIAcore rendszert, és a lentebb leírt ELISA-eljárást alkalmazva. Öt lyuk adott pozitív eredményt. Egérből csak egy klón, a 3B9 volt erősen pozitív. Minden, a 3B9-ből származó másodlagos klón pozitív volt.

2. példa

ELISA-vizsgálatok és affinitáskonstansok

A) ELISA

A humán IL-4-hez való affinitás mérésére a következők szerint végrehajtott vizsgálóeljárást dolgoztuk ki. Az 1. kísérlethez aldehidaktivált 96 lyukú lemezeket IL-4-gyel vontunk be (1 pg/ml, 100 pl/lyuk 0,1 M borátpufferban, pH 8,5), és szobahőmérsékleten inkubáltuk egy éjszakán át. A hIL-4 kovalensen kötött a lemezhez. Az IL-4 oldatot leszívtuk, és a nem specifikus kötőhelyeket (NSB) 1% szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA) TBS-pufferban (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0,02% NaN₃, pH 7,4) blokkoltuk 60 percig 37 °C-on. Ezután, és minden következő lépés után a lemezt 4-szer mostuk mosópufferban (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20, 0,02% NaN₃, pH 7,4). Ezután 50 pl hibridómaközeget (vagy tisztított 3B9-et vagy Fab-fragmenst) és 50 pl assay-puffert (0,5% szarvasmarha-gamma-globulin TBS-pufferban) adtunk hozzá, és a lemezeket 60 percig 37 °C-on inkubáltuk. Lyukanként 100 pl biotinezett antiegér antitestet adtunk hozzá assay pufferban, és a fentiek szerint inkubáltuk. 100 pl alkalikus foszfatázzal konjugált sztreptavidint adtunk hozzá lyukanként, és inkubáltuk (30 perc 37 °C-on). 100 pl/lyuk PNP szubsztrátot adtunk hozzá, és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. A 405 nm-es optikai denzitást olvastuk le.

A 2. kísérlethez a sztreptavidinnel borított lemezeket (100 pl/lyuk, 1 pg/ml foszfátpufferolt sóoldatban (PBS)) 4 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk, és a következők szerint vizsgáltuk. A sztreptavidinoldatot leszívtuk, az NSB helyeket 1% BSA-val blokkoltuk TBS-pufferban (60 perc 37 °C-on). Ezután, és minden következő lépés után a lemezeket négyszer mosópufferban mostuk. Ötven pl biotinezett IL-4-et adtunk hozzá 50 pl assay puffénál, és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. Ezután 50 pl tisztított 3B9 IgG-t vagy Fab-fragmenst (vagy hibridómaközeget) és 50 pl assay puffért adtunk hozzá, és 60 percig 37 °C-on inkubáltuk, 100 pl antiegér-IgG alkalikus foszfatáz konjugátumot adtunk hozzá, és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. 100 pl PNP szubsztrátot adtunk hozzá, és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. A leolvasást a fentiek szerint végeztük.

B) A 3B9 IL-4 affinitásának számolása

A fenti kísérletek eredményeit használva, és a következők szerint összegezve, a 3B9 K^-jét kiszámoltuk, a Beattu és munkatársai, J. Immunoi. Methods 700, 173-179 (1987) helyen leírtak szerint:

__

2(2[Ab*]-[Ab])

Ab*=az Ab-kötés koncentrációja 150 ng/ml biotinezett hIL-4-nél

Ab=az Ab-kötés koncentrációja 300 ng/ml biotinezett hIL-4-nél

A disszociációs konstanst a következő összefüggés alapján számoltuk:

1. kísérlet: ELISA-vizsgálat egy sztreptavidinnel borított 96 lyukú lemezen (100 ng/lyuk). 8^=2,2 χ 10~^1θΜ (3B9 Fab)

2. kísérlet: ELISA-vizsgálat egy sztreptavidinnel borított 96 lyukú lemezen 100 ng/lyuk). K_d=l,4x 10“ⁱ⁰M (3B9IgG)

C) Specifitás

A 3B9 MAb felismeri a humán IL-4-et, de nem ismeri fel a szarvasmarha- vagy az egér-IL-4-et. Ennek a meghatározása a következő módon történhet. Egy antiegér-IgG-vel borított, majd szarvasmarha-szérumalbuminnal blokkolt 96 lyukú lemezt használva, melyen 50 pl 3B9-et (100 ng/ml), 25 pl nem humán IL-4-et, és 25 pl biotin-IL-4-et inkubáltunk 60 percig 37 °C-on, amit egy mosás, sztreptavidinkonjugált alkalikus foszfatáz és PNP követett, ELISA-t végzünk.

Hasonlóképpen, a 6A1 MAb-ról is úgy találtuk, hogy nem ismeri fel a szarvasmarha vagy az egér IL-4-et.

3. példa

Humanizált antitest

Egy humanizált antitestet terveztünk, amely tartalmazza az egér CDR-eket egy humán antitestkeretben. Az IL-4-specifikus 3B9 egérantitestnek ezt a humanizált változatát a következő manipulációkat végrehajtva állítottuk elő.

A) cDNS-klónozás

A 3B9 nehéz és könnyű láncához cDNS-klónokat készítettünk a 3B9 hibridóma-sejtvonalból kivont mRNSből, Boehringer-Mannheim-kitet alkalmazva. Az első lánc szintéziséhez vagy egér kapocs régióra, vagy kappa konstans régióra specifikus printereket használtunk.

A kappa lánc primer (29. számú szekvencia):

5’-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3’

A gamma nehéz lánc primer (30. számú szekvencia):

5’-GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC-3’

HU 222 041 Β1

A kétláncú cDNS-t egyenesen pGEM7f+ plazmidokba (Promega) klónoztuk, melyekkel azután E. coli DH5-a sejteket transzformáltunk (Bethesda Research Labs.).

B) DNS-szekvenálás

A fenti A) pontból nyolc nehéz és egy könnyű lánc egér-cDNS-klónt szekvenáltunk. Az ezen kiónokból származó variábilis régiók szekvenálásának eredményét az 1., 2., 3. és 4. számú szekvenciák mutatják be. Minden klón tartalmazott olyan aminosavakat, amelyekről ismert, hogy megőrződtek az egér nehéz lánc variábilis régiók vagy könnyű lánc variábilis régiók, és az egér szignálszekvenciák között. A CDR-aminosavszekvenciákat alább soroljuk fel.

A nehéz lánc CDR-régiói a 22., 24. és 26. számú szekvenciák (a 4. számú szekvencia 50-56., 71-86. és 119-129. aminosavai). Lásd a 2. ábrát. Ezeket a szekvenciákat a 21. számú szekvencia, a 23. számú szekvencia és a 25. számú szekvencia kódolja. A könnyű lánc CDR-régiók a 16., 18. és 20. számú szekvenciák (a 2. számú szekvencia 45-58., 74-80. és 113-121. aminosavai). Lásd az 1. ábrát. Ezeket a szekvenciákat a

15., 17. és 19. számú szekvenciák kódolják.

C) A humán keret kiválasztása

A 3B9 klónozását követően a variábilis régió aminosavszekvenciáit (a 2. számú szekvencia 21-132. és a

4. számú szekvencia 20-140. aminosavai) összehasonlítottuk humán immunglobulin-szekvenciákat tartalmazó adatbázisok segítségével, a KABAT®-t és a SWISS adatbázisokat használva, hogy így egy olyan humán keretet azonosítsunk mind a nehéz, mind a könnyű lánc esetében, amelynek szekvenciája a legszorosabban illeszkedik az egérszülő megfelelő szekvenciájával. Ezen szekvenciahomológia-kutatásokon felül a nehéz és könnyű láncokat egy, az Fab-domén szerkezeti modelljeiből előállított helyi adatbázis alapján is kiértékeltük, hogy a CDR-bemutatást befolyásoló aminosavhelyettesítésekből adódó potenciális konfliktusokat felbecsüljük. A jelen esetben nem mutattunk ki nyilvánvaló problémákat a szerkezeti kutatásban; ezért az aminosavszekvenciahomológia-kutatásból levezetett kódoló DNS-szekvenciát használtuk.

Nehéz lánc keretrégióként egy humán mieloma-immunglobulinból (COR) kapott antitest megfelelő régióját alkalmaztuk [E. M. Press és N. M. Hogg, Biochem. J. 117, 641-660 (1970)]. Erről a szekvenciáról úgy találtuk, hogy körülbelül 77%-ban homológ (69,4% azonosság) a 3B9 variábilis lánc régióval aminosavszinten.

Megfelelő könnyű lánc variábilis keretrégióként a

H. G. Klobeck és munkatársai által a Nucl. Acids Rés 13, 6515-6529 (1989) helyen azonosított humán antitest könnyű lánc variábilis keretszekvenciát alkalmaztuk. A humán antitestszekvenciáról úgy találtuk, hogy körülbelül 80,2%-ban homológ (72,0% azonosság) az egér 3B9 variábilis könnyű lánc régióval aminosavszinten.

Mivel a fentiek után az egér 3B9 CDR-ek (15-26. számú szekvenciák) és a humán antitestszekvenciája adott, egy szintetikus nehéz láncot készítettünk, és PCRt végeztünk a DNS betöltésére és megsokszorozására. Ezeket a szekvenciákat a következő átfedő oligonukleotidok segítségével, és azok PCR-rel végzett amplifikálásával szintetizáltuk. A 31-37. számú szekvencia öt átfedő oligonukleotidot és 2 PCR-primert igényel. Az 1. oligonukleotid (31. számú szekvencia) az 5-121 bázisokat öleli fel. A 2. oligonukleotid (32. számú szekvencia) a 122-241. bázisokat, a 3. oligonukleotid (33. számú szekvencia) a 242-361. bázisokat öleli fel. A két láncvégi primer, a 34. és a 35. számú szekvencia, a 134-110. bázisokat és a 253-230. bázisokat éri át. Minden, a PCR által bevezetett hibát a térképezett szekvenciában korrigáltunk. Ezután újból PCR-t végeztünk, 5’primerként a 36. számú szekvencia 1-25. nukleotidjait, 3’-primerként a 37. számú szekvencia 361-341. nukleotidjait használva.

A szintetikus variábilis régiót a pCD expressziós vektorba ligáitok a kiméra nehéz láncnak egy humán IgG, konstans régióval együtt történt előállításából származó 5. és 6. számú szekvencia szerinti szintetikus szignálszekvenciával együtt. A szintetikus V_H és szignálszekvencia nukleotidszekvenciáját és aminosavszekvenciáját a 4. ábra mutatja be (11. és 12. számú szekvencia). A CDR-ek aminosavszekvenciái (22., 24. és 26. számú szekvencia) azonosak a 3B9 egér CDRekkel. Azonban e CDR-ek kódolószekvenciái (54., 55. és 56. számú szekvencia) eltérnek az egér 3B9 kódolószekvenciáitól (21., 23. és 25. számú szekvencia). Az eredmény expressziós vektort, az IL-4hzhcl-lPcd-t a 9. ábra mutatja be.

Egy már létező könnyű lánc keret CDR-gén régióit restrikciós emésztéssel eltávolítottuk, és a következő szintetikus IL-4 CDR-génekkel helyettesítettük, melyeket szintetikusan állítottunk elő.

ACDRl-nél:

38. számú szekvencia:

’-CTAAGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGG-3’

39. számú szekvencia:

CCTTGCAGTTGATGGTGGCCCTCTCGCCAGAGACACAG

40. számú szekvencia:

TCGAGAGGCCTCCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAGCAGA

AACCC

41. számú szekvencia:

GGGTTTCTGCTGATACCAGTTCATATA ACTATCACCATCATAATCAACACTTTGGGAGGCCTC

A CDR2-nél:

44. számú szekvencia:

GGGCAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTAC

GCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGGTAC

45. számú szekvencia:

CCCAGATTCTAGATTGGATGCAGCGTAAATGAGCAACTTAGGAGGCTGCCC

A CDR3-nál:

42. számú szekvencia:

ATACTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCCGAGGTTCGGCGGAGGGAC

HU 222 041 Bl

43. számú szekvencia:

CTTGGTCCCTCCGCCGAACCTCGGAGGATCCTCATTACTTTGCTGACAGTAGT

A szintetikus V_L és szignálszekvencia nukleotid- és aminosavszekvenciákat az 5. ábra adja meg (13. és 14. számú szekvencia). Az első két CDR-aminosavszekvenciái (16. és 18. számú szekvencia) azonosak a megfelelő egér 3B9 CDR-ekével. Azonban az első CDR kódolószekvenciája (53. számú szekvencia) különbözik az egér 3B9 kódolószekvenciától (15. számú szekvencia). Továbbá az utolsó CDR-ben a 3B9 aminosavszekvenciájának két humanizált változatát hoztuk létre. Az egyik (28. számú szekvencia) egyetlen aminosavban különbözik a természetes egér 3B9 szekvenciától (20. számú szekvencia). A 28. számú szekvenciát a 27. számú szekvencia kódolja. A szintetikus variábilis könnyű régiót az expressziós vektorba ligáltuk a szignálszekvenciával (7. és 8. számú szekvencia) együtt. Az így kapott expressziós vektorok közül az egyiket, az IL-4hzIcl0-Pcn-t a 10. ábrán mutatjuk be.

Ezeket a szintetikus variábilis könnyű és/vagy nehéz lánc szekvenciákat alkalmaztuk a humanizált antitest előállításánál.

4. példa

A humanizált MAb-k expressziója COS- és CHOsejtekben

A V_H pUC18 szubklónjait állítottuk elő abból a célból, hogy egy eredetileg egy humán antitestből kapott, az 5. számú szekvencia szerinti szignálszekvenciát adjunk hozzá. A V_L esetében a 7. számú szekvencia szerinti szignálszekvencia hozzáadása céljából hoztunk létre a pUC18 szubklónokat.

Az IgG] izotípusból származó humanizált nehéz lánc 89,3%-os homológiát (84,3% azonosság) mutat aminosavszinten a 3B9-ből származó egér nehéz lánccal. Ezt a szintetikus V_L-t a 11. és 12. számú szekvencia 20-141. aminosavai adják meg.

A humanizált könnyű lánc, egy humán κ-lánc, 92,0% homológiát (86,6% azonosság) mutat a 3B9-cel aminosavszinten. Ezt a 3B9 CDR-eket tartalmazó szintetikus V_L-t (a 13. és 14. számú szekvencia 21-131 aminosavai) a fentiekben a szintetikus nehéz láncra leírtak szerint terveztük és szintetizáltuk.

A megfelelő szignálokat a humanizált nehéz vagy könnyű variábilis régióval kapcsolva tartalmazó DNSffagmenseket pUC19-alapú, CMV-promotert és az 5. példa szerint előállított kiméra humán nehéz lánc vagy humán könnyű lánc konstans régióit tartalmazó emlőssejt expressziós plazmidba inszertáltuk konvencionális eljárásokat alkalmazva [Maniatis et al., fentebb idézve], hogy így az IL-4hzhcl-lPcd (nehéz lánc) (9. ábra) és az IL-4hzlcl-0-Pcn (könnyű lánc)) (10. ábra) plazmidokat hozzuk létre. A HZHC és HZLC plazmidokat COSsejtekbe kotranszfektáltuk, és a felülúszót a fentebb ismertetett ELISA-val vizsgáltuk a humanizált antitestek jelenlétére három és öt nap múlva. Egy IgG₄ izotípussal egy másik humanizált antitestet is létrehoztunk.

A fenti példa egy példaértékű tervezett antitest előállítását írja le. Más tervezett antitestek létrehozására hasonló eljárásokat követhetünk, más szokásos úton kifejlesztett anti-IL-4 antitesteket (például 6A1-7. példa) alkalmazva.

5. példa

A kiméra antitest megalkotása A) Az egér variábilis nehéz lánc régiónak az eredeti egér

3B9 MAb-ból egy EcoRI-BstEII restrikciós fragmensként való izolálásával egy kiméra nehéz láncot állítottunk elő. Egy kis DNS-oligomert terveztünk és szintetizáltunk az egér variábilis régiónak a humán IgG! konstans régióval (BstEII-Apal) való kötésére: 5’-primer: 50. számú szekvencia: GTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGC

3’-primer: 51. számú szekvencia: CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACG

Ezt a két fragmenst (EcoRI-gyel és Apai-gyei emésztett) pCD plazmidba ligáltuk (lásd a 7. ábrát), amely már kódolja a humán IgGj konstans régiót. Ez a klón nem fejeződik ki; ezért a vad típusú 5’ UTR-t és szignálszekvenciát töröltük, és az 5. és a 6. számú szekvenciával helyettesítettük.

Mivel nem volt megfelelő restrikciós hely a szignálszekvencia 3’-végén, egy BstEII helyet (azaz csendes mutációt) vezettünk be PCR-rel. A következő PCR-primereket használtuk:

48. számú szekvencia: 5’-primer: 5’-CAGGTTACCCTGAAAGAGTC-3’

49. számú szekvencia: 3’-primer: 5’-GAAGTAGTCCTTGACCAG-3’

Azután ebből a plazmidból egy BstEII-PstI restrikciós fragmenst izoláltunk. Ezután egy új szignálszekvenciát és 5’-UTR-t terveztünk és szintetizáltunk, amely EcoRI és BstEII végekkel rendelkezik.

46. számú szekvencia: 5’-primer: AATTCGAGGACGCCAGCAACATGGTGTTGCAGACCCAGGTC TTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGCAG

47. számú szekvencia: 3’-primer: GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGAGCAACAGAG AAATGAAGACCTGGGTCTGCAACACCATGTTGCTGGCGTCCTCG

A kiméra könnyű láncot a PCR-technikának a pGEM72f(+)-ba (Promega) klónozott eredeti egér 3B9 könnyű láncára való alkalmazásával hoztuk létre. A használt primerek az 5’-végen a kereskedelmi forgalomban elérhető univerzális reverz primer (EcoRI), és egy NarI helyet bevezető 3’-primer (5’-CATCTAGATGGCGCCGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’, 52. számú szekvencia) voltak, ezeket alkalmaztuk az egér variábilis régiónak a humán konstans régióhoz való fúzionáltatására. Ezután ezt a variábilis régiót a pCDN expressziós vektorba (EcoRINarI) (8. ábra) ligáltuk, amely már tartalmazza a humán kappa-régiót.

A tenyészközeg felülúszóját összegyűjtöttük három és öt nappal később, és a következőkben leírt ELISAval vizsgáltuk: Az ELISA-lemezeket 0,1 pg a humán antitestek Fc-régiójára specifikus kecskeantitesttel fedtük. 1 órára hozzáadtuk a tenyészközeg felülúszót. Humán

HU 222 041 Β1

IgG antitestre specifikus, torma-peroxidázzal konjugált, teljes kecskeantitestet adtunk hozzá. Ezt ABTS-peroxidáz-szubsztrát (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) hozzáadása követte egy órára. A kiméra antitest expresszióját detektáltuk. Egy második 5 ELISA-ban a kiméra antitestet tartalmazó COS-sejt-felülúszó specifikusan kötött a rekombináns humán IL-4 proteinnel. Ez az eredmény alátámasztja, hogy IL-4-specifikus antitestet kódoló géneket klónoztunk.

B) Ebből a kiméra nehéz láncból egy humanizált ne- 10 héz láncot is kaphatunk. A humanizált nehéz láncot az egér CDR-eknek egy humán keretbe való inszertálásából terveztük. A választott humán keret a fentebb leírtak szerint a Swiss protein adatbázisban az egér 3B9 V_H-n (a 4. számú szekvencia 21-140 aminosavai) alapuló leghomológabb szekvencia volt. Ezt a humanizált nehéz lánc szekvenciát (EcoRIApal) szintetikusan hoztuk létre, és PCR-t végeztünk a DNS betöltésére és amplifikálására, amint fentebb leírtuk. Ezt a szintetikus variábilis régiót a pCD expressziós vektorba (EcorlApal) ligáltuk a kiméra nehéz lánc konstrukcióból származó 5. és 6. számú szekvencia szerinti szignálszekvenciával, és egy IgG] humán konstans régióval együtt.

Hasonlóan, egy humanizált könnyű lánc származhat a kiméra könnyű láncból, a nehéz láncra leírtak szerint el- 25 járva. Ezt a gént (EcoRVNarI) szintén szintetikusan állítottuk elő. A humanizált V_L-t az EcoRINarl-gyel emésztett pCN expressziós vektorba ligáltuk egy szignálszekvenciával (EcoRIEcoRV) együtt. Az expressziós vektor szolgáltatta a humán kappa konstans régiót.

6. példa

Tisztítás és termodinamika - humanizált MAb

A CHO által kifejezett kiméra és humanizált 3B9 tisztítását a konvencionális protein A (vagy G) affinitáskromatográfiával végezhetjük, amit ioncserélő és molekuláris szűrő kromatográfia követ. Hasonló eljárásokat sikeresen alkalmaztak más MAb-k (például a légzési szincicium vírus (respiratory syncytial vírus) elleni és a malária cirkumsporozoit antigén elleni MAbk) 95%-nál nagyobb tisztaságúra való tisztítására.

Az IL-4-nek a humanizált 3B9 MAb-hoz és az egér 3B9-hez való kötésének affinitását és részletes termodinamikáját (1. példa) mikrokalorimetriás titrálással határoztuk meg. Ez az eljárás a kötő reakciókat belső 15 reakcióhőjük alapján méri [lásd például Wiseman et al., Anal. Biochem 179, 131-137 (1989)]. Mindkét MAb affinitását túl erősnek találtuk ahhoz, hogy közvetlenül mérjük szobahőmérsékleten. Ezért egy termodinamikai megközelítést választottunk: i) az affinitást 60 °C-on 20 mértük, ahol elég gyenge ahhoz, hogy közvetlenül mérjük; és ii) mértük a kötési entalpia hőmérsékletfüggését 30-60 °C között. Ezek az adatok együttesen lehetővé teszik az affinitás széles hőmérséklet-tartományban való számítását a Gibbs-Helmholtz-egyenletet alkalmazva.

A humanizált és az egér 3B9 antitestek IL-4 kötésének termodinamikáját az 1. táblázatban összegeztük. A két MAb szabadenergia-, entalpia-, entrópia- és hőkapacitás-változásán alapulva kötési termodinamikájuk 30 megkülönböztethetetlen.

1. táblázat

A hIL-4 humanizált 3B9-hez és egér 3B9-hez való kötésének termodinamikája pH 7,4-nél, 150 mM NaCl, és 25 °C-on

MAb	Kj pikomoláris	AG kcal/mol IL-4	ΔΗ kcal/mol IL-4	-TAS kcal/mol IL-4	AC cal/mol IL-4/K°
Humanizált 3B9	11	-13,6+0,6	-21,8+2	8,2+2,1	-580+160
Egér 3B9	19	-13,3 ±0,6	-20,5+1	7,2+1,2	-660+200

A humanizált és egér 3B9 IL-4 affinitását kvadruplikáton, illetve duplikáton mértük.

7. példa

Patkány MAb előállítása és jellemzése

A nagy affinitású kötődés alapján kiválasztott 6A1 MAb egy immunizált patkányból származik, ugyanazt az immunizálási eljárást alkalmazva, mint amit az egér esetében az 1. példában leírtunk. A humán IL-4gyel immunizált patkányokból előállított hibridómákból (pontosabban a 346A11C1B9 hibridómából) a 6Al-et választottuk ki.

A 6A1 Kjj-jét a Beatty és munkatársai, J. Immunoi. Methods 100; 173-179 (1987) helyen leírtak szerint számoltuk, az eredmény 2 χ 10^1θ Μ.

A 3436A11C1B9 hibridómát 1993. október 6-án letétbe helyeztük az Állati Sejtkultúrák Európai Gyűjteményénél (European Collection of Animál Cell Cultures, EACACC), Public Health Laboratory Service

Centre fór Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Egyesült Királyság) 93100620 deponálási szám alatt, és ezt az 1977-es, a mikroorganizmusok szabadalmazási eljárás céljából történő letétbe helyezését szabályozó Budapesti Szerződéssel összhangban szabadalmi letétnek fogadták el.

8. példa

Az MAb-k biológiai aktivitása: 3B9 (humanizált),

3B9 (egér) és 6A1

A következő vizsgálatokat végeztük, a lentebb ismertetett eljárásokat alkalmazva.

A) A glikozilált rhIL-4-hez való kötődés

A fentebb meghatározott antitesteket nem glikozilált rekombináns humán IL-4-gyel (rhIL-4) gyűjtöttük össze, amelyet E. coliban állítottunk elő. Mivel a természetes IL-4 glikozilált, fontos volt, hogy ellenőrizzük az emlőssejtvonal által szekretált anyaghoz való kötődést is. A 3B9 ugyanolyan jól köt a glikozilált

HU 222 041 Β1 és a nem glikozilált humán rekombináns IL-4-hez, és így nem olyan epitophoz köt, ami a természetes humán IL-4-en rejtve van.

B) Az IL-4 receptorhoz való kötődésének gátlása

A 3B9 azon képességét, hogy gátolja az IL-4-nek a receptorához való kötődését, az MLA gibbonsejtvonalhoz (ATCC TIB201) kötött ¹²⁵I-rhIL-4 alkalmazásával vizsgáltuk, mely sejtvonal körülbelül 6000 receptort hordoz sejtenként. Az MLA-sejteket ¹²⁵I-IL-4gyel inkubáltuk 30 percig 37 °C-on. A felvett radioaktivitás mennyiségét gamma-számlálóval határoztuk meg, miután a sejthez kötött ¹²⁵I-IL-4-et olajgradienscentrifúgálással elválasztottuk. A nem specifikus kötést 100-szoros moláris feleslegben levő jelzetlen IL-4 jelenlétében végzett inkubálással határoztuk meg [Park et al., J. Exp. Med. 166; 467-488 (1987)]. Ebben a tesztben a jelöletlen IL-4 IC₅₀-értéke 22pM volt, amikor a (hozzáadott) IL-4 mennyisége 83 pM volt. A teljes egér (IgG) 3B9-re az IC₅₀ 63 pM volt, és 93 az Fab-fragmensre. Egy másik IL-4-koncentrációnál (218 pM) az egér (IgG) 3B9-re a teszt eredménye 109 pM volt.

C) A limfocita-proliferáció gátlása

A Spits és munkatársai, J. Immunoi. 139; 1142-1147 (1987) helyen leírt eljárást alkalmazva humán perifériális vérlimfocitákat három napig inkubáltunk fitohemagglutininnel, egy T-sejt-mitogénnel, hogy az IL-4 receptorokat túlszabályozzuk. Az így kapott blasztsejteket azután három napig további IL-4gyel stimuláltuk. A proliferációt ³H-timidin beépülésével mértük. A B-sejt-proliferációt a Callard és munkatársai által a Lymphokines and Interferons. A Practical Approach, Ch. 19; 345 helyen leírt teszttel mértük, melyet a következők szerint módosítottunk. A tisztított, humán mandulaeredetű B-limfocitákat 167 pM IL-4gyel és immobilizált IgM-mel stimuláltuk. A proliferációt ³H-timidin beépülésével mértük.

A 3B9 (egér) gátolta a 133 pM IL-4-gyel stimulált, humán perifériális vér T-limfociták és a 167 pM IL-4gyel stimulált, humán mandulaeredetű B-limfociták ³H-timidin-beépítését. Az IL-2 által stimulált T-limfocitákra nem volt hatása. A T-sejt-proliferáció gátlására az IC₅₀ 30 pM volt, a B-sejt-proliferációra 103 pM. A megfelelő értékek a 3B9 (egér) Fab-fragmense esetén 108 és 393 pM.

D) A CD23 indukció gátlása

A CD23 az IgE alacsony affinitású receptora (FcERII), és a pihenő B-limfociták membránján alacsony koncentrációjú IL-4 hatására indukálódik, mint az IgE-termelődés szükséges előfeltétele. Tisztított humán mandulaeredetű B-sejteket 2 napig IL-4-gyel stimuláltunk. A CD23 receptorokat kifejező sejtek arányát áramlásos citometriával [Deffance et al., J. Exp. Med. 165; 1459-1467 (1987)] határoztuk meg. A 3B9 gátolta a humán mandulaeredetű B-limfocitákon

8,3 pM IL-4-gyel való stimuláció hatására végbemenő CD23 expressziót, a gátlás IC_S0-értéke 136 pM.

E) Az IgE-szekréció gátlása

Hasonlóan más tesztekhez, ahol EC₅₀-koncentrációban IL-4-et adtak a rendszerhez [Pere et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85; 6880-6884 (1988)], az IgE-szekréciót IL-4 maximális szekréciót adó koncentrációkban való jelenlétében tanulmányoztuk, hogy a rendszerben rejlő variabilitást lecsökkentsük. A T-sejt-proliferációt a következők szerint mértük. Humán perifériális vérlimfocitákat inkubáltunk IL-4-gyel 10-18, előnyösen 12 napig. A tenyészet felülúszóban az IgE koncentrációját ELISA-val határoztuk meg.

A 3B9 és a 3B9 Fab-fragmense gátolta az IgEszekréciót 1,7 nM IL-4 jelenlétében, a gátlás 1,9 és 5,0 nM IC₅₀-értéket adott az egyes esetekben. A kísérletet alacsonyabb, 667 pM IL-4-koncentrációt alkalmazva megismételtük, amely az IC₅₀-értéket 0,65 nM-ra csökkentette 3B9 (egér) esetén. Az antitest (IgG) maradék IL-4-hez viszonyított moláris aránya változatlan volt (1:1) a vizsgált koncentrációtartományokban.

F) Összefoglalás és az adatok interpretálása

Az IL-4-nek a biológiai vizsgálatokban az egyes funkciók 50%-os gátlásához szükséges, különböző MAb-khoz viszonyított moláris arányát a 2. táblázatban adjuk meg.

2. táblázat

A 3B9, 6A1 és humanizált 3B9 (IgGl és IgG4 variáns) aktivitásának összehasonlítása IL-4-függő biológiai vizsgálatban

Vizsgálat	IC50 (pM) [sorrend],,
egér 3B9	egér 3B9 (Fab)	patkány 6A1	humanizált 3B9
IgG)	IgG4*
RBA	63[17-109]2	93	>50 000
T-sejt	30[10—40]4	108	87	44[30-56]3	40
B-sejt	103[79-120]3	393	187	47[10-80]3	79
CD23-indukció	136[53-272]4	216	80	333
IgE-szintézis	658(370-1070]6	1170	623[412-833]2	54[35-83]3	406

n=az elvégzett tesztek száma *Az IgG] és az IgG₄ változatokat eltérő időben teszteltük

HU 222 041 Β1

Az IgE-szekréciót kivéve minden tesztben IL-4-et adtunk hozzá megfelelő ED₅₀-koncentrációban. Az antitestnek az 50%-os gátláshoz szükséges, IL-4-hez viszonyított moláris aránya hasonló volt a humanizált 3B9, az egér 3B9 és a 6A1 esetében a két limfocita pro- 5 liferációs vizsgálatban, de a CD23 indukciós vizsgálatban a humanizált 3B9 esetében magasabb volt. Az utóbbi egy különösen érzékeny vizsgálat, amely látszólag nagyon alacsony (-5%) receptor foglaltságot követel [Kruse et al., EMBO J. 12, 5121 (1993)], és amint az 10 egér 3B9-cel kapott eredményekből nyilvánvaló, hajlamos elfedni a teszt variációját.

A patkány 6A1 és az egér 3B9 aktivitásának összehasonlítása a funkcionális hatásoknak hasonló profilját mutatta, de a 6Al-nek egy nem várt hibája, hogy telje- 15 sen gátolja a radiojódozott IL-4-nek a receptorhoz való kötését. A receptorhoz való kötés vizsgálatában használt radiojódozott IL-4-ről úgy gondolták, hogy a hozzáférhető tirozinon, a 124 gyökön jódozott. Ha a 6A1 CD23 expresszió gátlási képességét indukáltuk je- 20 löletlen vagy jódozott IL-4-gyel, és az eredményeket összehasonlítottuk, azt találtuk, hogy a gátlás kevésbé hatásos a jódozott ligandummal. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a 6A1 az IL-4-hez a 124. tirozin régiójában köt, de nem specifikusan a tirozinhoz. 25 így a fenti adatok alapján a 6A1 egy olyan nagy affinitású neutralizáló antitest, amely az IL-4 teljesen más régiójához köt, mint a 3B9.

9. példa 30

Farmakokinetika

A humanizált 3B9 farmakokinetikáját hím Sprague-Dawley-patkányokon vizsgáltuk. Humanizált 3B9-et adtunk be négy állatnak iv. 1 mg/kg egyszeri dózisban, a vérmintákat folyamatosan vettük a beadás utá- 35 ni 5 hétig. A plazma humanizált 3B9 koncentrációját IL-4/antihumán IgG szendvics-ELISA-val határoztuk meg, mely vizsgálatot nemcsak a keringő humán IgG jelenlétének kimutatására terveztük, hanem a rekombináns IL-4-kötő képesség igazolására is.

Az ebből a vizsgálatból származó eredményeket a 3. táblázat foglalja össze.

3. táblázat

	Clp (ml/h/kg)
1 patkány	0,442
2 patkány	0,655
3 patkány	0,555
4 patkány	0,447
átlag	0,525
SD	0,101

A farmakokinetikai paraméter rövidítése a következő: Clp: látszólagos plazmatisztaság

Az adatok azt jelzik, hogy az állatok közötti variabilitás viszonylag kicsi volt, és a humanizált 3B9 eltűnése a plazmából kétfázisúnak látszik. A látszólagos plazmatisztaság alacsony volt (0,5 ml/h/kg). A félélettartam 11 napnak tűnik. így a CHO-sejtekből származó humanizált 3B9 farmakokinetikai jellemzői egybevágnak más humanizált monoklonális antitesteknél tapasztaltakkal patkány esetén. A humanizált 3B9 hosszú keringési félélettartama patkányban szintén azt sugallja, hogy amikor embernek adják be, a humanizált 3B9 valószínűleg hosszabb időintervallumban hatékony marad.

A fenti részletes leírás a jelen találmány számos módosítását és változatát magában foglalja, melyeket úgy tekintünk, mint ami szakember számára nyilvánvaló. Például a humanizált antitestek előállításában a fent leírt, példaértékű antitestektől eltérő humán keretrégiókat, vagy ilyenek módosulatait is használhatjuk. A találmány szerinti készítmények és eljárások ilyen módosításairól és változatairól úgy hisszük, hogy a mellékelt igénypontok oltalmi körébe belefoglaltatnak.

Szekvencialista

INFORMÁCIÓ az 1. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 396 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1.. .396 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 1. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ATG Me t 1

GAG Glu

ACA GAC ACA ATC

CTG Leu

CTA Leu

TGG Trp

GTG Val 10

CTG Leu

CTG CTC TGG GTT CCA

Thr

Asp

Thr 5

I le

Leu

Leu

Trp

Val 15

Pro

GGC

TCC

ACT

GGT

GAC

ATT

GTG

CTG

ACC

CAA

TCT

CCA

GCT

TCT

TTG

GCT

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

11 e

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Al a

Se r

Leu

Al a

20

25

30

HU 222 041 Β1

GTG TCT CTA

GGG Gly

CAG AGG GCC

ACC Thr 40

ATC TCC TGC AAG GCC AGC

CAA Gin

AGT Ser

144

Val

Ser

Leu 35

Gin

Arg Alá

I le

Ser

Cys

Lys

Al a 45

Ser

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCA

192

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Me t

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

50

55

60

GGA

CAG

CCA

ccc

AAA

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

240

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

I le

Tyr

Al a

Al a

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

65

70

75

80

GGG

ATC

CCA

GCC

AGG

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

288

Gly

11 e

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

85

90

95

CTC

AAC

ATC

CAT

CCT

GTG

GAG

GAG

GAG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

TAC

TGT

336

Leu

Asn

I le

Hi s

Pr o

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Al a

Al a

Thr

Tyr

Tyr

Cys

100

105

110

CAG

CAA

AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CCG

ACG

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

384

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

115

120

125

GAA

ATC

AAA

CGG

396

Glu

I le

Lys

Arg

130 (2) INFORMÁCIÓ a 2. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 132 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Me t 1

Glu

Thr

Asp

Thr 5

Ile

Leu

Leu

Trp

Val 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Val 15

Pro

Gly

Ser

Thr

Gly 20

Asp

Ile

Val

Leu

Thr 25

Gin

Ser

Pro

Al a

Ser 30

Leu

Al a

Val

Ser

Leu 35

Gly

Gin

Arg

Al a

Thr 40

Ile

Ser

Cy s

Lys

Al a 45

Ser

Gin

Ser

Val

As p 50

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser 55

Tyr

Me t

Asn

Trp

Tyr 60

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 65

Gin

Pro

Pro

Ly s

Leu 70

Leu

Ile

Tyr

Alá

Alá 75

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser 80

Gly

Ile

Pro

Al a

Arg 85

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 90

Ser

Gly

Thr

As p

Phe 95

Thr

Leu

Asn

Ile

Hi s 100

Pro

Val

Glu

Glu

Glu 105

Asp

Al a

Al a

Thr

Tyr 110

Tyr

Cys

HU 222 041 Bl

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125

Glu I le Lys Arg 130

INFORMÁCIÓ a 3. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 483 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 64.. .483 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 3. SZEKVENCIÁHOZ:

GAATTCGCGG CCGCTATGCA GGGACAATCA GCAGCAGCAA TGAGGAAGTA AGCCTGTGCA 60

GAT ATG AAC

AGG CTT

ACT TCC TCA TTG CTG CTG CTG ATT GTC CCT GCA

108

Me t 1

Asn

Arg

Leu

Thr 5

Ser

Ser

Leu

Leu

Leu 10

Leu

Ile

Va 1

Pro

Al a 15

TAT

GTC

CTG

TCC

CAG

GTT

ACT

CTG

AAA

GAG

TCT

GGC

CCT

GGG

ATA

TTG

156

Tyr

Val

Leu

Ser

Gin

Val

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Ile

Leu

20

25

30

CAG

CCC

TCC

CAG

ACC

CTC

AGT

CTG

ACT

TGT

TCT

TTC

TCT

GGG

TTT

TCA

204

Gin

Pr o

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cy s

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

CTG

AGC

ACT

TCT

GGT

ATG

GGT

GTG

AGC

TGG

ATT

CGT

CAG

CCT

TCA

GGA

252

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Me t

Gly

Val

Ser

Trp

11 e

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

50

55

60

AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

CTG

GCA

CAC

ATT

TAC

TGG

GAT

GAT

GAC

AAG

CGC

300

Lys

G1 y

Leu

Glu

Trp

Leu

Al a

Hi s

I le

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

65

70

75

TAT

AAC

CCA

TCC

CTG

AAG

AGC

CGG

CTC

ACA

ATC

TCC

AAG

GAT

ACC

TCC

348

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

80

85

90

95

AGC

AAC

CAG

GTA

TTC

CTC

AAG

ATC

ACC

AGT

GTG

GAC

ACT

GCA

GAT

ACT

396

Ser

Asn

Gin

Val

Phe

Leu

Ly s

I le

Thr

Ser

Val

Asp

Thr

Al a

Asp

Thr

100

105

110

GCC

ACA

TAC

TAC

TGT

GCT

CGA

AGA

GAG

ACT

GTG

TTC

TAC

TGG

TAC

TTC

444

Al a

Thr

Tyr

Tyr

Cy s

Al a

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

115

120

125

GAT

GTC

TGG

GGC

GCA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

483

Asp

Val

Trp

Gly

Al a

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130 135 140

INFORMÁCIÓ a 4. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 140 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein

HU 222 041 Bl (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Me t

Asn

Arg

Leu

Thr

Ser

Ser

Leu

Leu

Leu

Leu

Ile

Val

Pro

Al a

Tyr

1

5

10

15

Val

Leu

Ser

Gin

Val

Thr

Leu

Ly s

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Ile

Leu

Gin

20

25

30

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

35

40

45

Ser

Thr

Ser

Gly

Me t

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

Lys

50

55

60

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Al a

Hi s

Ile

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

Tyr

65

70

75

80

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Ser

85

90

95

Asn

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Ile

Thr

Ser

Val

As p

Thr

Al a

Asp

Thr

Al a

100

105

110

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Alá

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

Asp

115

120

125

Val

Trp

Gly

Al a

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

135

140

INFORMÁCIÓ az 5. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 60bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1... 60 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 5. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ATG Me t 1

GTG TTG

CAG ACC CAG

GTC TTC ATT TCT CTG TTG CTC TGG ATC TCT

48

Val

Leu

Gin

Thr 5

Gin

Val

Phe

Ile

Ser 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Ile 15

Ser

GGT

GCC

TAC

GGG

60

Gly

Al a

Tyr

Gly

INFORMÁCIÓ a 6. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 20aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 6. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Me t Val Leu Gin Thr Gin Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

10 15

Gly Alá Tyr Gly 20

HU 222 041 Bl

INFORMÁCIÓ a 7. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 57 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS :1...57 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 7. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ATG Me t 1

GGA Gly

TGG Trp

AGC TGT ATC ATC

CTC TTC TTG

GTA GCA ACA GCT

ACA Thr 15

GGT Gly

48

Ser

Cys 5

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu 10

Val

Al a

Thr

Al a

GTC

CAC

TCC

57

Val

His

Ser

INFORMÁCIÓ a 8. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 19 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 8. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

10 15

Val His Ser

INFORMÁCIÓ a 9. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 423 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1.. .423 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 9. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ATG GTG

TTG Leu

CAG ACC CAG GTC TTC ATT TCT CTG TTG CTC TGG ATC

TCT Ser

48

Me t 1

Val

Gin

Thr 5

Gin

Val

Phe

Ile

Ser 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Ile 15

GGT

GCC

TAC

GGG

CAG

GTT

ACC

CTG

AAA

GAG

TCT

GGC

CCT

GGG

ATA

TTG

96

Gly

Al a

Tyr

Gly 20

Gin

Val

Thr

Leu

Lys 25

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly 30

Ile

Leu

CAG

CCC

TCC

CAG

ACC

CTC

AGT

CTG

ACT

TGT

TCT

TTC

TCT

GGG

TTT

TCA

144

Gin

Pro

Ser 35

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu 40

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser 45

Gly

Phe

Ser

CTG

AGC

ACT

TCT

GGT

ATG

GGT

GTG

AGC

TGG

ATT

CGT

CAG

CCT

TCA

GGA

192

Leu

Ser 50

Thr

Ser

Gly

Me t

Gly 55

Val

Ser

Trp

Ile

Arg 60

Gin

Pro

Ser

Gly

AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

CTG

GCA

CAC

ATT

TAC

TGG

GAT

GAT

GAC

AAG

CGC

240

Lys 65

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu 70

Al a

Hi s

Ile

Tyr

Trp 75

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg 80

HU 222 041 Β1

TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC CGG CTC ACA ATC TCC AAG GAT ACC TCC Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser

90 95

288

AGC AAC CAG GTA TTC CTC AAG ATC ACC AGT GTG GAC ACT GCA GAT ACT

Ser Asn Gin Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Alá Asp Thr

100 105 110

GCC ACA TAC TAC TGT GCT CGA AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC

Alá Thr Tyr Tyr Cys Alá Arg Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe

115 120 125

GAT GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA

Asp Val Trp Gly Alá Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

INFORMÁCIÓ a 10. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 141 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 10. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

336

384

423

Me t 1	Val	Leu	Gin	Thr 5	Gin	Val	Phe
Gly	Al a	Tyr	Gly 20	Gin	Val	Thr	Leu
Gin	Pro	Ser 35	Gin	Thr	Leu	Ser	Leu 40
Leu	Ser 50	Thr	Ser	Gly	Me t	Gly 55	Val
Lys 65	Gly	Leu	Glu	Trp	Leu 70	Al a	Hi s
Tyr	Asn	Pro	Ser	Leu 85	Lys	Ser	Arg
Ser	Asn	Gin	Val 100	Phe	Leu	Lys	Ile
Al a	Thr	Tyr 115	Tyr	Cy s	Al a	Arg	Arg 120
Asp	Val 130	Trp	Gly	Al a	Gly	Thr 135	Thr

Ile	Ser 10	Leu	Leu	Leu	Trp	Ile 15	Ser
Lys 25	Glu	Ser	Gly	Pro	Gly 30	Ile	Leu
Thr	Cys	Ser	Phe	Ser 45	Gly	Phe	Ser
Ser	Trp	Ile	Arg 60	Gin	Pro	Ser	Gly
Ile	Tyr	Trp 75	Asp	Asp	As p	Lys	Arg 80
Leu	Thr 90	Ile	Ser	Lys	Asp	Thr 95	Ser
Thr 105	Ser	Val	Asp	Thr	Al a 110	As p	Thr
Glu	Thr	Val	Phe	Tyr 125	Trp	Tyr	Phe
Val	Thr	Val	Ser	Ser

140

INFORMÁCIÓ all. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 423 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS

HU 222 041 Bl (B) ELHELYEZKEDÉS: 1.. .423 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: all. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ATG GTG TTG CAG ACC

CAG GTC TTC

ATT TCT CTG TTG CTC TGG ATC TCT

48

Me t 1

Val

Leu

Gin

Thr 5

Gin Val

Phe

Ile

Ser 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Ile 15

Ser

GGT

GCC

TAC

GGG

CAG

GTT

ACC

CTG

CGT

GAA

TCC

GGT

CCG

GCA

CTA

GTT

96

Gly

Al a

Tyr

Gly

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Al a

Leu

Val

20

25

30

AAA

CCG

ACC

CAG

ACC

CTG

ACG

TTA

ACC

TGC

ACC

TTC

TCC

GGT

TTC

TCC

144

Ly s

Pro

Thr

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cy s

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

CTG

TCG

ACC

TCC

GGT

ATG

GGT

GTT

TCC

TGG

ATC

CGT

CAG

CCG

CCG

GGT

192

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Me t

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

50

55

60

AAA

GGT

CTA

GAA

TGG

CTG

GCT

CAC

ATC

TAC

TGG

GAC

GAC

GAC

AAA

CGT

240

Ly s

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Al a

Hi s

Ile

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

65

70

75

80

TAC

AAC

CCG

AGC

CTG

AAA

TCC

CGT

CTG

ACG

ATA

TCC

AAA

GAC

ACC

TCC

288

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Ly s

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Ly s

Asp

Thr

Ser

85

90

95

CGT

AAC

CAG

GTT

GTT

CTG

ACC

ATG

ACT

AAC

ATG

GAC

CCG

GTT

GAC

ACC

336

Arg

Asn

Gin

Val

Val

Leu

Thr

Me t

Thr

Asn

Me t

Asp

Pro

Val

Asp

Thr

100

105

110

GCT

ACC

TAC

TAC

TGC

GCT

CGA

CGC

GAA

ACC

GTT

TTC

TAC

TGG

TAC

TTC

384

Al a

Thr

Tyr

Tyr

Cy s

Al a

Arg

Arg

Glu

Thr

Va 1

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

115

120

125

GAC

GTT

TGG

GGT

CGT

GGT

ACC

CCA

GTT

ACC

GTG

AGC

TCA

423

Asp

Val

Trp

Gly

Arg

Gly

Thr

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130 135 140

INFORMÁCIÓ a 12. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 141 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 12. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Me t

Val

Leu

Gin

Thr

Gin

Val

Phe

Ile

Ser

Leu

Leu

Leu

Trp

Ile

Ser

1

5

10

15

Gly

Al a

Tyr

Gly

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Al a

Leu

Val

20

25

30

Lys

Pro

Thr

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cy s

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Me t

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

50

55

60

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Al a

Hi s

Ile

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

65

70

75

80

HU 222 041 Bl

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

85

90

95

Arg

Asn

Gin

Val

Val

Leu

Thr

Me t

Thr

Asn

Me t

Asp

Pro

Val

Asp

Thr

100

105

110

Al a

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Alá

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

115

120

125

Asp

Val

Trp

Gly

Arg

Gly

Thr

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130 135 140

INFORMÁCIÓ a 13. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 393 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1... 393 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 13. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ATG GGA TGG AGC

TGT Cys 5

ATC ATC

CTC Leu

TTC Phe

TTG Leu 10

GTA GCA ACA GCT ACA GGT

48

Me t 1

Gly

Trp

Ser

Ile

Ile

Val

Al a

Thr

Al a

Thr 15

Gly

GTC

CAC

TCC

GAT

ATC

GTG

ATG

ACC

CAG

TCT

CCA

GAC

TCG

CTA

GCT

GTG

96

Val

Hi s

Ser

Asp 20

Ile

Val

Me t

Thr

Gin 25

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu 30

Alá

Val

TCT

CTG

GGC

GAG

AGG

GCC

ACC

ATC

AAC

TGC

AAG

GCC

TCC

CAA

AGT

GTT

144

Ser

Leu

Gly 35

Glu

Arg

Al a

Thr

Ile 40

Asn

Cys

Lys

Al a

Ser 45

Gin

Ser

Val

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

ccc

GGG

192

Asp

Tyr 50

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr 55

Me t

Asn

Trp

Tyr

Gin 60

Gin

Lys

Pro

Gly

CAG

CCT

CCT

AAG

TTG

CTC

ATT

TAC

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

GGG

240

Gin 65

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu 70

Ile

Tyr

Al a

Al a

Ser 75

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly 80

GTA

CCT

GAC

CGA

TTC

AGT

GGC

AGC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

288

Val

Pro

Asp

Arg

Phe 85

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 90

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr 95

Leu

ACC

ATC

AGC

AGC

CTG

CAG

GCT

GAA

GAT

GTG

GCA

GTA

TAC

TAC

TGT

CAG

336

Thr

Ile

Ser

Ser 100

Leu

Gin

Al a

Glu

Asp 105

Val

Al a

Val

Tyr

Tyr 110

Cy s

Gin

CAA

AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CCG

AGG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAG

384

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Arg

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

115 120 125

ATC AAA CGT 393

Ile Lys Arg

130

HU 222 041 Β1

INFORMÁCIÓ a 14. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 131 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 14. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Me t 1

Gly

Trp

Ser

Cys 5

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu 10

Val

Al a

Thr

Al a

Thr 15

Gly

Val

Hi s

Ser

Asp 20

Ile

Val

Me t

Thr

Gin 25

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu 30

Al a

Val

Ser

Leu

Gly 35

Glu

Arg

Al a

Thr

Ile 40

Asn

Cys

Lys

Al a

Ser 45

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr 50

Asp

Gly

As p

Ser

Tyr 55

Me t

Asn

Trp

Tyr

Gin 60

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin 65

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu 70

Ile

Tyr

Al a

Al a

Ser 75

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly 80

Val

Pro

Asp

Arg

Phe 85

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 90

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr 95

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser 100

Leu

Gin

Alá

Glu

Asp 105

Val

Al a

Val

Tyr

Tyr 110

Cys

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Arg

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

115 120 125

Ile Lys Arg 130

INFORMÁCIÓ a 15. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 45 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1...45 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 15. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC Lys Alá Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

10 15

INFORMÁCIÓ a 16. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 15 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 16. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Lys Alá Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Me t Asn

10 15

HU 222 041 Bl

INFORMÁCIÓ a 17. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS :1...21 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 17. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT 21

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

5

INFORMÁCIÓ a 18. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 18. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

5

INFORMÁCIÓ a 19. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS :1...27 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 19. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG 27

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr

5

INFORMÁCIÓ a 20. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 20. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ: Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr

5

INFORMÁCIÓ a 21. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1...21

HU 222 041 Β1 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 21. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC 21

Thr Ser Gly Me t Gly Val Ser

5

INFORMÁCIÓ a 22. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 22. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Thr Ser Gly Met Gly Val Ser

5

INFORMÁCIÓ a 23. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 48bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1.. .48 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 23. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC 48

His I le Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

10 15

INFORMÁCIÓ a 24. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 16 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 24. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

His I le Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

10 15

INFORMÁCIÓ a 25. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 33 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS :1...33 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 25. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC 3 3

Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

5 10

INFORMÁCIÓ a 26. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)TOPOLÓGIA: lineáris

HU 222 041 Bl (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 26 SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ: 26: Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

5 10

INFORMÁCIÓ a 27. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 27bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1.. .27 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 27. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG 27

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg

5

INFORMÁCIÓ a 28. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 28. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg

5

INFORMÁCIÓ a 29. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 36 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 29. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG 36

INFORMÁCIÓ a 30. SZEKVENCIÁHOZ :

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 29 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 30. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

GTACATATGC AAGGCTTACA ACCACAATC 29

INFORMÁCIÓ a 31. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 117 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális)

HU 222 041 Bl (B) ELHELYEZKEDÉS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 31. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

GGTTACCCTG CGTGAATCCG GTCCGGCACT AGTTAAACCG ACCCAGACCC TGACGTTAAC 60

CTGCACCTTC TCCGGTTTCT CCCTGTCGAC CTCCGGTATG GGTGTTTCCT GGATCCG 117

INFORMÁCIÓ a 32. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 120 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAS SÁG: egy szálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 32. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

TCAGCCGCCG GGTAAAGGTC TAGAATGGCT GGCTCACATC TACTGGGACG ACGACAAACG 60

TTACAACCCG AGCCTGAAAT CCCGTCTGAC GATATCCAAA GACACCTCCC GTAACCAGGT 120

INFORMÁCIÓ a 33. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 120 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 33. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

TGTTCTGACC ATGGACCCGG TTGACACCGC TACCTACTAC TGCGCTCGTC GCGAAACCGT 60

TTTCTACTGG TACTTCGACG TTTGGGGTCG TGGTACCCCA GTTACCGTGA GCTCCCAACC 120

INFORMÁCIÓ a 34. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 25 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 34. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ACCCGGCGGC TGACGGATCC AGGAA 25

INFORMÁCIÓ a 35. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 24bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 35. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ATGGTCAGAA CAACCTGGTT ACGG 24

INFORMÁCIÓ a 36. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 25 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 36. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

TTCGGGTTAC CCTGCGTGAA TCCGG 25

INFORMÁCIÓ a 37. SZEKVENCIÁHOZ: (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár

HU 222 041 Bl (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 37. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CCAACCCTCG AGTGCCATTG A 21

INFORMÁCIÓ a 38. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 43 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 38. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CTAGCTGTGT CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGG 4 3

INFORMÁCIÓ a 39. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 39 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 39. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CCTTGCAGTT GATGGTGGCC CTCTCGCCCA GAGACACAG 39

INFORMÁCIÓ a 40. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 67 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 40. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

TCGAGAGGCC TCCCAAAGTG TTGATTATGA TGGTGATAGT TATATGAACT GGTATCAGCA 60 GAAACCC 67

INFORMÁCIÓ a 41. SZEKVENCIÁHOZ :

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 63 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 41. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

GGGTTTCTGC TGATACCAGT TCATATAACT ATCACCATCA TAATCAACAC TTTGGGAGGC 60 CTC 6 3

INFORMÁCIÓ a 42. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 51 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 42. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ATACTACTGT CAGCAAAGTA ATGAGGATCC TCCGAGGTTC GGCGGAGGGA C 51

HU 222 041 Bl

INFORMÁCIÓ a 43. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 53 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 43. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CTTGGTCCCT CCGCCGAACC TCGGAGGATC CTCATTACTT TGCTGACAGT AGT 53

INFORMÁCIÓ a 44. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 55 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 44. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACGCT GCATCCAATC TAGAATCTGG GGTAC 55

INFORMÁCIÓ a45. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 51 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 45. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CCCAGATTCT AGATTGGATG CAGCGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C 51

INFORMÁCIÓ a 46. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 83 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS : DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 46. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

AATTCGAGGA CGCCAGCAAC ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT 60 GGATCTCTGG TGCCTACGGG CAG 83

INFORMÁCIÓ a 47. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 84bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 47. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

GTAACCTGCC CGTAGGCACC AGAGATCCAG AGCAACAGAG AAATGAAGAC CTGGGTCTGC 60 AACACCATGT TGCTGGCGTC CTCG 84

INFORMÁCIÓ a 48. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális)

HU 222 041 Β1 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 48. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CAGGTTACCC TGAAAGAGTC 20

INFORMÁCIÓ a 49. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 49. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

GAAGTAGTCC TTGACCAG 1 8

INFORMÁCIÓ az 50. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 50. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

GTCACCGTCT CCTCAGCTAG CACCAAGGGG C 31

INFORMÁCIÓ az 51. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS : DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 51. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CTTGGTGCTA GCTGAGGAGA CG 22

INFORMÁCIÓ az 52. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 47 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG; egyszálú (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 52. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CATCTAGATG GCGCCGCCAC AGTACGTTTG ATCTCCAGCT TGGTCCC 47

INFORMÁCIÓ az 53. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 45 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 53. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

AAGGCCTCCC AAAGTGTTGA TTATGATGGT GATAGTTATA TGAAC 45

INFORMÁCIÓ az 54. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS

HU 222 041 Bl (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 54. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ACCTCCGGTA TGGGTGTTTC C 21

INFORMÁCIÓ az 55. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 48 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 55. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CACATCTACT GGGACGACGA CAAACGTTAC AACCCGAGCC TGAAATCC 48

INFORMÁCIÓ az 56. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 33 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 56. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

CGCGAAACCG TTTTCTACTG GTACTTCGAC GTT 33

INFORMÁCIÓ az 57. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 393 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: dupla (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1.. .393 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 57. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

ATG GGA TGG AGC

TGT Cys 5

ATC Ile

ATC Ile

CTC TTC TTG GTA GCA ACA

GCT Al a

ACA Thr 15

GGT Gly

48

Me t 1

Gly Trp

Se r

Leu

Phe

Leu 10

Val

Ala

Thr

GTC

CAC

TCC

GAT

ATC

GTG

ATG

ACC

CAG

TCT

CCA

GAC

TCG

CTA

GCT

GTG

96

Val

Hi s

Ser

Asp

Ile

Val

Me t

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu

Al a

Val

20

25

30

TCT

CTG

GGC

GAG

AGG

GCC

ACC

ATC

AAC

TGC

AAG

GCC

TCC

CAA

AGT

GTT

144

Ser

Leu

Gly

Glu

Arg

Al a

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

35

40

45

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

CCC

GGG

192

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Me t

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

50

55

60

CAG

CCT

CCT

AAG

TTG

CTC

ATT

TAC

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

GGG

240

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Al a

Al a

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

65

70

75

80

GTA

CCT

GAC

CGA

TTC

AGT

GGC

AGC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

288

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Se r

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

85

90

95

HU 222 041 Bl

ACC ATC

AGC AGC CTG CAG GCT GAA GAT GTG

GCA GTA

TAC Tyr

TAC Tyr 110

TGT Cy s

CAG Gin

Thr

Ile

Ser

Ser 100

Leu

Gin Ala

Glu Asp Val 105

Al a

Val

CAA

AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CCG

ACG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAA

GTG

GAG

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

115 120 125

ATC AAA CGT 393

Ile Lys Arg

130

INFORMÁCIÓ az 58. SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 131 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 58. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ:

Me t 1

Gly

Trp

Ser

Cy s 5

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu 10

Val

Al a

Thr

Al a

Thr 15

Gly

Val

Hi s

Ser

Asp 20

Ile

Val

Me t

Thr

Gin 25

Ser

Pr o

Asp

Ser

Leu 30

Al a

Val

Ser

Leu

Gly 35

Glu

Arg

Al a

Thr

Ile 40

Asn

Cy s

Lys

Al a

Ser 45

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr 50

Asp

Gly

As p

Ser

Tyr 55

Me t

Asn

Trp

Tyr

Gin 60

Gin

Ly s

Pro

Gly

Gin 65

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu 70

Ile

Tyr

Al a

Al a

Ser 75

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly 80

Val

Pro

Asp

Arg

Phe 85

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 90

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr 95

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser 100

Leu

Gin

Al a

Glu

Asp 105

Val

Al a

Val

Tyr

Tyr 110

Cy s

Gin

Gin

Ser

Asn 115

Glu

As p

Pro

Pro

Thr 120

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr 125

Lys

Val

Glu

Ile Lys Arg

Claims (15)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Humán interleukin-4 (IL-4)-kötő sajátossággal 50 rendelkező fúziós protein, amely olyan komplementaritást (CDR) meghatározó régiókat tartalmaz, ahol a nehéz lánc komplementaritást meghatározó régióinak aminosavszekvenciái a (a) ThrSerGlyMetGlyValSer: 22. számú szekven- 55 cia, (b) HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: 24. számú szekvencia és (c) ArgGluThrValPheTyrTrpTyrPheAspVal: 26.

   számú szekvencia, 60 ahol a könnyű lánc komplementaritást meghatározó régióinak aminosavszekvenciái (a) LysAlaSerGlnSerVal AspTyr Asp GlyAspSerTyrMetAsn: 16. számú szekvencia, (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: 18. számú szekvencia és (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: 28. számú szekvencia, vagy ahol a könnyű lánc komplementaritást meghatározó régióinak aminosavszekvenciái (a) Lys AlaSerGlnSerVal AspTyr AspGlyAspSerTyrMetAsn: 16. számú szekvencia,

   HU 222 041 Β1 (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: 18. számú szekvencia és (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: 20. számú szekvencia, amelyeket egy nem humán monoklonális antitestből származó, a humán IL-4 tekintetében 2 χ 10“¹⁰ M-mel egyenlő vagy annál kisebb disszociációs konstanssal jellemezhető csoportok közül választunk ki, valamint egy első fúziós partnert tartalmaz, ahol az első fúziós partner aminosavszekvenciája a 12. számú szekvencia 21-50., 56-71., 88-119. és 131-141. számú aminosavait tartalmazó nehéz láncú aminosavszekvencia és a 14. számú szekvencia 20-42., 58-72., 80-111. és 121-131. számú aminosavait tartalmazó könnyű láncú aminosavszekvencia.
2. 2. Immunglobulin nehéz lánc komplementaritást meghatározó régiója (CDR), amelynek aminosavszekvenciáját az alábbi aminosavszekvenciákból álló csoportokból választjuk ki:

   (a) ThrSerGlyMetGlyValSer: 22. számú szekvencia, (b) HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: 24. számú szekvencia, és (c) ArgGluThrValPheTyrTrpTyrPheAspVal: 26. számú szekvencia.
3. 3. Immunglobulin könnyű lánc komplementaritást meghatározó régiója (CDR), amelynek aminosavszekvenciáját az alábbi aminosavszekvenciákból álló csoportokból választjuk ki:

   (a) LysAlaSerGlnSerVal AspTyr AspGlyAspSerTyrMetAsn: 16. számú szekvencia, (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: 18. számú szekvencia, (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: 28. számú szekvencia, és (d) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: 20. számú szekvencia.
4. 4. Immunglobulin nehéz lánc komplementaritást meghatározó (CDR)-régiót kódoló nukleinsavmolekula, amelynek szekvenciáját az (a) ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC: 21. számú, (b) CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC: 23. számú, (c) AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC: 25. számú, (d) ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: 54. számú, (e) CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC: 55. számú, és (f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT: 56. számú szekvenciákból álló csoportokból választjuk ki.
5. 5. Immunglobulin könnyű lánc komplementaritást meghatározó (CDR)-régiót kódoló nukleinsavmolekula, amelynek szekvenciáját (a) AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC: 15. számú, (b) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC: 53. számú, (c) GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT: 17. számú, (d) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: 19. számú és (e) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: 27. számú szekvenciákból álló csoportokból választjuk.
6. 6. Nehéz és könnyű láncot tartalmazó humanizált antitest, amely a humán IL-4 tekintetében 2 χ 10¹⁰ Mnál kisebb vagy avval egyenlő disszociációs konstanssal jellemezhető, amelyben az említett nehéz és könnyű lánc keretrégiói legalább egy kiválasztott humán antitestből származnak, és minden említett lánc komplementaritást meghatározó régiójának aminosavszekvenciái a humán IL-4 tekintetében 2 χ 10~¹⁰ M-nál kisebb vagy avval egyenlő disszociációs konstanssal jellemezhető, nem humán neutralizáló monoklonális antitestből származnak.
7. 7. A 6. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy opcionálisan egy nem protein hordozómolekulából polisztirolgyöngyből vagy plasztikgyöngyből álló csoportból kiválasztott effektoranyaggal kapcsolódik.
8. 8. Egy nehéz láncból és egy könnyű láncból álló kiméra antitest, amely antitest a humán IL-4 tekintetében 2 χ 10~¹⁰ M-lal egyenlő vagy annál kisebb disszociációs konstanssal jellemezhető, amelyben az említett nehéz lánc és könnyű lánc komplementaritást meghatározó régiók aminosavszekvenciái humán IL-4-specifikus, humán IL-4 tekintetében 2χ 10^-10 M-nál kisebb vagy avval egyenlő disszociációs konstanssal jellemezhető, és a 3B9 monoklonális antitestével azonos tulajdonságokkal jellemezhető, nem humán neutralizáló monoklonális antitestből származnak.
9. 9. Gyógyszerkészítmény, amely az 1. igénypont szerinti fúziós protein hatásos mennyiségét tartalmazza, és egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz.
10. 10. Eljárás humán interleukin-4-specifikus humanizált antitest előállítására, amely eljárás során olyan, a 4. és 5. igénypont szerinti nukleinsavmolekulákat tartalmazó plazmiddal, amely megfelelő gazdasejtben a fehérje expresszióját biztosítani képes szabályozószekvenciákkal operábilisan kapcsolt, COS- vagy CHOsejteket transzferálunk, és a sejteket tenyésztjük.
11. 11. Eljárás allergiák és más IgE-túltermeléssel kapcsolatos állapotok diagnosztizálására emberek esetében, amely egy biológiai folyadék mintájának egy, 2x10-¹⁰ M-nál kisebb vagy avval egyenlő disszociációs konstanssal jellemezhető kötőaffinitással rendelkező, magas titerű humán IL-4 elleni monoklonális antitesttel való érintkeztetéséből, és az említett monoklonális antitest és interleukin-4 közötti kötés előfordulásának méréséből áll.
12. 12. 2xl0“¹⁰ M-nál kisebb vagy avval egyenlő disszociációs konstanssal jellemezhető kötőaffinitással rendelkező humán interleukin-4 elleni neutralizáló monoklonális antitest vagy annak Fab’- vagy (Fab’)₂-frag36

    HU 222 041 Β1 mense, amely egy hibridómatermék-könyvtár aldehidkötött interleukin-4-gyel vagy biotinezett interleukin-4-gyel történő tesztelésével állítható elő.
13. 13. Egér neutralizáló monoklonális antitest, amely humán interleukin-4-specifikus és 2χ10~^1θ M-nál ki- 5 sebb vagy avval egyenlő disszociációs konstanssal jellemezhető kötőaffinitással rendelkezik.
14. 14. A 13. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy a 2. számú könnyű lánc aminosavszekvenciát tartalmazza.
15. 15. ECACC 93100620. számú hibridóma-sejtvonal, mely a 3425A11C1B9 sejtvonal azonosító jellemzőivel rendelkezik, és amelyet 1993. október 6-án az Európai Állati Sejtkultúrák Gyűjteményében helyeztünk letétbe.