SK285556B6 - Fúzny proteín so špecifickou väzbou na ľudský IL-4, molekula nukleovej kyseliny, monoklonálne protilátky, farmaceutická kompozícia a použitie - Google Patents

Abstract

Fúzny proteín so špecifickou väzbou na ľudský interleukín-4 (IL4), obsahujúci komplementárnosť určujúce oblasti (CDRs), odvodené z neutralizačnej monoklonálnej protilátky, nepochádzajúcej od človeka,s disociačnou konštantou rovnajúcou sa alebo menšou ako 2.10-10 M pre IL4 človeka, a prvým fúznym partnerom. Molekula nukleovej kyseliny kódujúca fúzny proteín, monoklonálne protilátky, farmaceutickékompozície s ich obsahom a ich použitie.

Description

Vynález sa všeobecne vzťahuje na oblasť fúznych proteínov a na proteíny, užitočné na liečbu a diagnostiku stavov sprostredkovaných IL4 a nadbytočnou produkciou IgE; bližšie sa vynález vzťahuje na chimérové a humanizované 1L4 protilátky.

Doterajší stav techniky

Atopické alergické poruchy sa prejavujú pomerne mieme, ako je sezónna nádcha a zápal spojiviek, alebo pomerne vážne, napríklad dermatitída a atopická astma a ako poruchy ohrozujúce život, ako je anafylaktický šok. Spoločným znakom týchto stavov je imunitná odpoveď tela na alergény. Táto odpoveď vyvoláva produkciu imunoglobulínových E (IgE) protilátok u geneticky predisponovaných jedincov (atopikov). Za cieľ špecifickej imunoterapie alergickej poruchy sa dlhý čas považovala inhibícia IgE produkcie pomocou vakcíny, znižujúcej precitlivelo sť. V posledných rokoch sa však bezpečnosť a účinnosť vakcínovej terapie spochybňuje, hoci požiadavka na znižovanie hladiny IgE neklesá.

Interleukín 4 (IL4) je proteínový sprostredkovateľ (mediátor) v lymfoidnom systéme. Štúdie lymfocytov atopických jedincov potvrdili v porovnaní s normálnym stavom prítomnosť vyššieho počtu T-lymfocytov so schopnosťou vylučovať IL4 ako odpoveď na stimuláciu. Po stimulácii nastáva pri nich vylučovanie väčších množstiev IL4.

Zistilo sa, že proti-IL4 protilátky inhibujú produkciu IgE, ale nie IgGl alebo lgG₂ [Finkelman et al. Ann. Rev. Immunol., 8: 303 (1990)], a produkciu IL5 vylučujúcich T-buniek [Maggi et al., J. Immunol., 148: 2142 (1992)]. Posledné údaje ďalej poukazujú na to, že IL4 môže vplývať na akumuláciu eozinofilu v tkanive. Pozri napríklad Tepper et al., Celí, 62: 457 (1990); Tepper et al., Celí, 57: 503 (1989).

V danej oblasti však trvá požiadavka na vysokoafinitnú IL4 antagonistickú látku, ktorá by znižovala cozinofilový zápal tak znížením proliferácie IL5 vylučujúcich buniek, ako aj inhibíciou adherenčného mechanizmu, pričom sa eozinofily môžu zhromažďovať v tkanivách a môžu sa využiť na liečbu, prevenciu alebo diagnostiku alergických reakcií.

Použitie biotinylovaných antigénov na skríning hybridómových kultúr s vysoko afmitnými protilátkami je opísané v Hybridoma 12, 475, 8/93.

Dve vysoko afínitné protilátky proti ľudskému IL-4 sú opísané v japonskej prihláške vynálezu č. JP-A-3187395 (Ono Yakuhin Kogyo Corp.). Ako hlavné využitie týchto protilátok je opísané použitie v imunologických testoch pre ľudský IL-4.

Medzinárodná prihláška č. WO 93/17106 opisuje klonovanie aexpresiu monoklonálnych protilátok proti ľudskému IL-4 na použitie v kitoch a v spôsoboch na detegovanie, meranie a imunopurifíkáciu IL4, ako aj na liečenie porúch súvisiacich s IL-4. Ako je uvedené v tabuľke 55 na strane 66 vo WO 93/17106, natívne a humanizované monoklonálne protilátky opísané v tomto dokumente majú väzobnú afinitu pre ľudský IL-4 charakterizovanú K_d prinajlepšom s hodnotou približne 1 x 10'⁹ M.

EMBL databáza, Acc. č. M36222 opisuje SEQ ID NO. 22, Európska patentová prihláška č. EP-A-327000 (ChemoSero-Therapeutic Research Inštitúte) opisuje SEQ ID NO. 17, Geneseq. Acc. č. R66143 opisuje SEQ. ID. NO. 16, R66144 SEQ ID NO. 18 aQ04039 SEQ ID NO. 15. Tieto opisy sa však nezaoberajú s IL-4 monoklonálnymi protilátkami.

Podstata vynálezu

Tento vynález najprv predkladá fúzny protein, ktorý má väzbovú afinitu k ľudskému interleukínu-4, a ktorý obsahuje komplcmcntámosť určujúce oblasti (complementarity determining regions, CDRs), odvodené od neutralizujúcej monoklonovej protilátky (monoclonal antibody, MAb), nepochádzajúcej od človeka, charakterizovaný disociačnou konštantou rovnajúcou sa, alebo menšou ako 2.10'¹⁰ M pre ľudský IL4 a prvého partnera pre fúziu, v ktorom nejmenej jedna a výhodne všetky komplementámosť určujúce oblasti (CDRs) prvého fúzujúceho partnera sú nahradené CDRs z monoklonovej protilátky (MAb), nepochádzajúcej od človeka. Neutralizujúcou monoklonálnou protilátkou, nepochádzajúcou od človeka, je 6A1, ako sa úplnejšie opisuje v ďalej uvedenom podrobnom opise vynálezu. Výhodne sa fúzny protein účinne spája s druhým fúznym proteínom, ktorý obsahuje celý alebo iba časť imunoglobulínového stáleho reťazca.

Z podobného hľadiska tento vynález predkladá CDRs odvodené z neutralizujúcich monoklonových protilátok (MAb), nepochádzajúcich od človeka, vyznačujúce sa disociačnou konštantou rovnajúcou sa alebo menšou ako 2.10¹⁰ M pre IL4 človeka, a ďalej molekuly nukleových kyselín, kódujúcich takéto CDRs.

Z ďalšieho hľadiska tento vynález predkladá humanizovanc protilátky, ktoré majú najmenej jednu, a výhodne šesť komplementámosť určujúcich oblastí (CDRs), odvodených z neutralizujúcich monoklonových protilátok (MAb), nepochádzajúcich od človeka, vyznačujúce sa disociačnou konštantou rovnajúcou sa alebo menšou ako 2.10¹⁰ M pre IL4 človeka.

Z ešte ďalšieho hľadiska sa predkladá chimérová protilátka, obsahujúca ľudské ťažké a ľahké reťazce stálej oblasti a ťažké a ľahké reťazce premennej oblasti, odvodené z neutralizujúcich monoklonových protilátok (MAb), nepochádzajúcich od človeka, vyznačujúca sa disociačnou konštantou rovnajúcou sa alebo menšou ako 2.10'¹⁰ M pre IL4 človeka.

Z ešte ďalšieho hľadiska predkladá tento vynález farmaceutickú kompozíciu, ktorá obsahuje jeden (alebo viac) opísaných fúznych proteínov alebo MAbs (napríklad humanizované, chimérové a podobné) a farmaceutický prijateľný nosič.

Z ešte iného hľadiska predkladá tento vynález spôsob na rekombinantnú produkciu fúznych proteínov a zložky vhodné na uskutočnenie uvedeného spôsobu, MAbs (napríklad humanizované, chimérové a podobne), ich CDRs, Fab alebo F(ab)₂, alebo ich analóg, ktoré sú odvodené z neutralizujúcich monoklonových protilátok (MAbs), nepochádzajúcich od človeka, vyznačujúcich sa disociačnou konštantou rovnajúcou sa alebo menšou ako 2.1O'¹⁰ M pre IL4 človeka. Tieto zložky zahrnujú izolované kódové sekvencie nukleových kyselín, rekombinantné plazmidy obsahujúce uvedené sekvencie nukleových kyselín pod kontrolou vybraných regulačných sekvencii, schopných riadiť ich expresiu v hostiteľských bunkách, a hostiteľské bunky (najmä bunky cicavcov) transfektované rekombinantnými plazmidmi. Spôsob produkcie zahrnuje kultiváciu a transfektáciu hostiteľskej bunkovej línie podľa tohto vynálezu v podmienkach, v ktorých sa protilátka, výhodne humanizovaná protilátka, exprimuje v uvedených bunkách, a izoláciu produktu expresie z buniek.

Z ešte iného hľadiska predkladá tento vynález spôsob na diagnostikovanie alergií a iných stavov, spojených s nadbytočnou produkciou E imunoglobulínu u človeka, spôsob, ktorý zahrnuje uvedenie vzorky biologickej tekutiny do styku s fúznymi proteínmi, MAbs (napríklad humanizovanými, chimérovými a podobne) a Fab podľa tohto vynálezu, a vykonanie skúšky na vznik väzby medzi uvedeným fúznym proteínom, MAb alebo Fab a ľudským interleukínom 4.

Z iného podobného hľadiska sa predkladá spôsob na vytriedenie (skríning) monoklonových protilátok, ktoré majú vyšší titer pre ľudský interleukín-4, spôsob, ktorý zahrnuje: (a) prípravu hybridómového bunkového radu, vyznačujúceho sa sekréciou monoklonovej protilátky k ľudskému interleukínu-4; (b) vytriedenie uvedenej hybridómovej bunkovej línie s ľudským interleukínom-4, viazaným s aldehydom, alebo s biotinylovaným ľudským interleukínom-4. Vytriedenie hybridómovej bunkovej línie sa výhodne vykoná s biotinylovaným ľudským interleukínom-4.

Zahrnutá je tiež neutralizujúca MAb, ktorá má vysokú afinitu k IL4, k jeho fragmentom Fab alebo fragmentom F(ab')₂, vytvorená vytriedením knižnice produktov hybridómov s aldehydom viazaným ľudským interleukínom-4 alebo biotinylovaným ľudským IL4.

Z iného hľadiska predkladá tento vynález neutralizujúce monoklonové protilátky z hlodavcov, špecifické k ľudskému interleukínu-4, ktoré majú väzbovú afinitu, charakterizovanú disociačnou konštantou rovnajúcou sa alebo menšou ako 2.10'¹⁰ M. Príkladom takých monoklonových protilátok je krysia MAb, 6A1 alebo ďalšie MAbs, ktoré majú rovnaké identifikujúce charakteristiky (to znamená viažu sa k rovnakému epitopu (epitopom) ako 6A1 so špecifickosťou k ľudskému IL4 a s disociačnou konštantou rovnajúcou sa alebo menšou ako 2.10¹⁰ M). Z uvedeného hľadiska vynález zahrnuje hybridom ECACC 93100620.

Ďalšie hľadiská a prednosti predloženého vynálezu sa opisujú v ďalšom texte v nasledujúcom podrobnom opise výhodných uskutočnení vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 [Identifikačné čísla sekvencií: 1 a 2, v origináli: SEQ ID NOS: 1 a 2] znázorňuje premennú oblasť ľahkého reťazca (aminokyseliny 21 až 132) myšacej IL4 protilátky 3B9 a ľudskú/myšaciu 3B9 chimérovú protilátku, ako aj pôvodnú signálnu sekvenciu (aminokyseliny 1 až 20). Podčiarknuté úseky znamenajú CDRs [SEQ ID NOS: 15 a 16; SEQ ID NOS: 17 a 18; SEQ ID NOS: 19 a 20].

Obr. 2 [SEQ ID NOS: 3 a 4] znázorňuje premennú oblasť ťažkého reťazca (aminokyseliny 1 až 19). Podčiarknuté úseky znamenajú CDRs [SEQ ID NOS:21 a 22; SEQ ID NOS:23 a 24; a SEQ ID NOS: 25 a 26],

Obr. 3 [SEQ ID NOS: 9 a 10] znázorňuje premennú oblasť ťažkého reťazca (aminokyseliny 21 až 141) ľudskej/myšacej chimérovej protilátky a jeho signálnu sekvenciu (aminokyseliny 1 až 19; SEQ ID NOS: 5 a 6). Podčiarknuté úseky znamenajú CDRs odvodené z 3B9 [SEQ ID NOS: 21 a 22; SEQ ID NOS: 23 a 24; a SEQ ID NOS: 25 a 26],

Obr. 4 [SEQ ID NOS: 11 a 12] znázorňuje premennú oblasť ťažkého reťazca (aminokyseliny 20 až 141) humanizovanej 3B9 protilátky a signálnu sekvenciu (aminokyseliny 1 až 19: SEQ ID NOS: 5 a 6). Podčiarknuté úseky znamenajú CDRs, odvodené od 3B9 [SEQ ID NOS: 54 a 22; SEQ ID NOS: 55 a 24; a SEQ ID NOS: 56 a 26].

Obr. 5 [SEQ ID NOS: 13 a 14] znázorňuje premennú oblasť ľahkého reťazca (aminokyseliny 21 až 131) humanizovanej 3B9 protilátky a signálnu sekvenciu (aminokyseliny 1 až 20; SEQ ID NOS: 7 a 8). Podčiarknuté úseky znamenajú CDRs, odvodené od 3B9 [SEQ ID NOS: 17 a 18; a SEQ ID NOS: 27 a 28).

Obr. 6A [SEQ ID NOS: 5 a 6] znázorňuje signálnu sekvenciu ťažkého reťazca, použitú v ďalej uvedenom príklade 4. Obr. 6B [SEQ ID NOS: 7 a 8] je signálna sekvencia ľahkého reťazca, použitá v ďalej uvedenom príklade 4.

Obr. 7 je schematický náčrt plazmidu pIL4chhc3-pcd na expresiu chimérového IL4 ťažkého reťazca v bunkách cicavcov. Plazmid obsahuje beta laktamázový gén (BETA LAC), SV-40 počiatok replikácie (SV40), promótorovú sekvenciu cytomegalovírusu (CMV), signálnu sekvenciu, chimérový premenný ťažký reťazec s SEQ ID NOS: 9 a 10, stálu oblasť ťažkého reťazca človeka, poly A signál z bovinného rastového hormónu (BGH), betaglobínový promótor (beta glopro), dihydrofolátový reduktázový gén (DHFR) a iný BGH sekvenčný poly A signál na p^UC19 pozadí.

Obr. 8 je schéma plazmidu pIL4chlc-pcdn, použitého na expresiu chimérovej IL4 premennej oblasti ľahkého reťazca SEQ ID NOS: 1 a 2 v bunkách cicavcov. Tento plazmid sa odlišuje od plazmidu z obr. 7 tým, že obsahuje premennú oblasť chimérového ľahkého reťazca, stálu oblasť ľudského ľahkého reťazca a popri DHFR aj ncomycínový gén (Nco). Obr. 9 je schéma plazmidu pIL4hzhc-l-pcd, použitého na expresiu premennej oblasti syntetického IL4 ťažkého reťazca SEQ ID NOS: 11 a 12 v bunkách cicavcov. Tento plazmid sa odlišuje od plazmidu z obr. 7 tým, že obsahuje premennú oblasť humanizovaného ťažkého reťazca.

Obr. 10 je schéma plazmidu pIL4hzlc-0-Pcn, použitého na expresiu premennej oblasti humanizovaného IL4 ľahkého reťazca SEQ ID NOS: 13 a 14 v bunkách cicavcov. Tento plazmid sa odlišuje od plazmidu z obr. 8 tým, že obsahuje viac premennú oblasť humanizovaného ľahkého reťazca ako chimérového ľahkého reťazca a nekóduje DHFR gén.

Podstata vynálezu

Tento vynález predkladá skupinu protilátok, ich fragmentov a fúznych proteínov, najmä humanizovaných protilátok, ktoré sa vyznačujú špecifickou väzbou k ľudskému IL4, neutralizačnou účinnosťou a vysokou afinitou k ľudskému IL4, ako napríklad myšací MAb 3B9 alebo krysí MAb 6A1. Tieto produkty sú užitočné v terapeutických a farmaceutických kompozíciách na liečbu alergických reakcií, sprostredkovaných IL4 a IgE. Uvedené produkty sú tiež užitočné v diagnostike s IL4 sprostredkovaných stavov a to meraním (napríklad enzýmovou imunoadsorbentovou analýzou (ELISA)) endogénnych 1L4 hladín u ľudí.

I. Definície „Fúzny proteín“ znamená proteín, kódovaný fúznou molekulou, ktorá sa môže získať expresiou vo vybraných hostiteľských bunkách. Takéto fúzne proteíny sú protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, napríklad chimérové alebo humanizované protilátky, alebo fragmenty protilátok s chýbajúcimi všetkými alebo iba časťou imunoglobulínových stálych oblastí, napríklad Fv, Fab alebo F(ab)₂ a podobne.

Výraz „fúzna molekula“ sa vzťahuje na sekvenciu nukleových kyselín, kódujúcu komplementámosť určujúce oblasti (CDRs) z imunoglobulínu, nepochádzajúceho z človeka, ktoré sú vložené do prvého fúzneho partnera, ktorý ob3 sahuje premenné štruktúrne sekvencie človeka. Voliteľne sa prvý fúzny partner účinne pripája k druhému fúznemu partnerovi.

Výraz „prvý fúzny partner“ sa vzťahuje na sekvenciu nukleových kyselín, kódujúcich ľudské premenné štruktúrne sekvencie alebo ľudskú imunoglobulínovú premennú oblasť, v ktorej prirodzené (alebo prirodzene vznikajúce) CDRs sa nahradia s CDRs darcovskej protilátky. Ľudská premenná oblasť môže byť imunoglobulínový ťažký reťaz, ľahký reťaz (alebo obidva reťazce), ich analóg alebo ich fragmenty. Takéto CDRs alebo CDR oblasti, umiestené v premenných oblastiach protilátok (imunoglobulínov) sa môžu stanoviť v danej oblasti známymi spôsobmi. Napríklad Kabat et al.,[Sequences of Proteins od Immunological Interest, 4th. Ed., U.S.Department of Health and Human Services, National Inštitúte of Health (1987)] objavili pravidlo umiesťovania CDRs. Ďalej sú známe počítačové programy, užitočné na identifikáciu CDR oblastí/štruktúr.

Výraz „vysoký titer“ sa vzťahuje na protilátku, ktorá má väzbovú afinitu, vyznačujúcu sa K_d rovnajúcou sa alebo menšou ako 2.10'¹⁰ M pre ľudský IL4.

Výrazom „špecifická väzba na ľudský IL4“ sa rozumie vysoký titer (alebo afinita) k ľudskému IL4, ale nie k bovinnému alebo myšaciemu IL4.

Výraz „druhý fúzny partner“ znamená inú nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu proteín alebo peptid, ku ktorému je v štruktúre fúziovaný prvý fúzny partner, alebo pripojený pomocou voliteľnej bežnej linkerovej sekvencie (to znamená účinne pripojený). Výhodne to je imunoglobulín. Druhý fúzny partner môže zahŕňať sekvenciu nukleových kyselín, kódujúcu celú stálu oblasť pre rovnakú (to znamená homológnu - prvý a druhý fúzny proteín sú odvodené z rovnakého zdroja) alebo ďalšiu (to znamená heterológnu) predmetnú protilátku. Môže to byť imunoglobulínový ťažký reťazec alebo ľahký reťazec (alebo obidva reťazce ako časť samotného polypeptidu). Uvedený druhý fúzny partner nie je obmedzený na osobitný druh alebo izotyp imunoglobulínu. Druhý fúzny partner môže navyše obsahovať časť imunoglobulínovej stálej oblasti, ako sa zistilo v Fab alebo F(ab)₂ (inými slovami, určitá časť príslušnej ľudskej stálej oblasti alebo štruktúry). Uvedený fúzny partner môže tiež obsahovať sekvenciu, kódujúcu integrálny membránový proteín, vystavený na vonkajšom povrchu hostiteľskej bunky, napríklad ako časť vystavenej knižnice fága, alebo sekvenciu, kódujúcu proteín na analytickú alebo diagnostickú detekciu, napríklad chrenovú peroxidázu, β-galaktozidázu atď.

Výrazy Fv, Fc, Fab alebo F(ab)₂ sa používajú v ich bežnom význame (pozri napríklad Harlow et al., Antibodies A Laboratora Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

V texte používaný výraz „protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku“ [v origináli: engineered antibodies] opisuje typ fúzneho proteínu, to znamená syntetickú protilátku (napríklad chimérovú alebo humanizovanú), v ktorej časť ľahkého a/alebo ťažkého reťazca premenných domén vybranej prijímajúcej protilátky je nahradená podobnými časťami z jedného alebo viacerých darcovských protilátok, ktoré sú špecifické k vybranému epitopu. Takéto molekuly môžu napríklad zahŕňat protilátky, vyznačujúce sa humanizovaným ťažkým reťazcom, spojeným s nemodifikovaným ľahkým reťazcom (alebo chimérovým ľahkým reťazcom), alebo obrátený prípad. Protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku možno tiež charakterizovať odlišnou sekvenciou nukleových kyselín, kódujúcich ľahkú a/alebo ťažkú premennú doménovú štruktúrnu oblasť prijímajúcej pro tilátky tak, aby sa zachovala špecifická väzba darcovskej protilátky. Uvedené protilátky môžu obsahovať náhradu jednej alebo viacerých CDRs (výhodne všetkých) protilátky príjemcu (akceptora) s CDRs protilátky darcu (donora), opísaných ďalej.

„Chimérová protilátka“ sa vzťahuje na typ protilátok, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, ktoré obsahujú prirodzene sa vykytujúce premenné oblasti (ľahký reťaz a ťažké reťazce), odvodené od donorovej protilátky v spojení so stálymi oblasťami ľahkého a ťažkého reťazca, odvodených od akceptorovej protilátky.

Výraz „humanizovaná protilátka“ sa vzťahuje na typ protilátky, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku, a ktorá má zachované jej CDRs, odvodené od imunoglobulínu donora, nepochádzajúceho od človeka. Ostatné od imunoglobulínu odvodené časti molekuly sú odvodené od jedného (alebo viacerých) ľudských imunoglobulínov. Štruktúrne podporné zvyšky môžu byť navyše menené tak, aby sa zachovala väzbová afinita (pozri, napríklad, Qeen et al., Proc.National Acad. Sci USA, 86:10029 - 10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421 (1991)).

Výraz „donorová protilátka“ alebo „protilátka darcu“ sa vzťahuje na protilátku (polyklonovú, monoklonovú alebo rekombinantnú), ktorá prispieva sekvenciami nukleových kyselín jej premenných oblastí, CDRs, alebo ďalšími funkčnými fragmentárni alebo ich analógmi prvému fúznemu partnerovi, vytvárajúc tak fúznu molekulu a výsledný exprimovaný fúzny proteín s antigénovou špecifickosťou a neutralizačnou aktivitou, charakteristickou pre protilátku darcu. Jednou z donorových protilátok, vhodnou na použitie v tomto vynáleze, je neutralizujúca monoklonová protilátka, nepochádzajúca od človeka (napríklad myšacia), označovaná ako 3B9. Protilátka 3B9 je definovaná ako neutralizujúca protilátka s vysokým titrom, špecifická k ľudskému IL4 (to znamená, že nerozoznáva bovinný alebo myšací IL4), izotypu IgG, ktorá má premenný ľahký reťazec DNA a sekvencie aminokyselín SEQ ID NOS: 1 a 2, a premenný ťažký reťazec DNA a sekvencie aminokyselín SEQ ID NOS: 3 a 4 na vhodnej stálej oblasti IgG myši.

Výraz „akceptorová protilátka“ alebo „prijímajúca protilátka“ sa vzťahuje na protilátku (polyklonovú, monoklonovú alebo rekombinantnú), heterológnu k donorovej protilátke, ktorá prispieva celými (alebo nejakou časťou, ale výhodne celými) sekvenciami nukleových kyselín, kódujúcich jej ťažké a/alebo ľahké reťazce štruktúrnych oblastí a/alebo jej stále oblasti ťažkých a/alebo ľahkých reťazcov, k uvedenému druhému fúznemu partnerovi. Výhodnou akceptorovou protilátkou je protilátka človeka.

„CDRs“ sú definované ako komplementárnosť určujúce oblasti (úseky) aminokyselinových sekvencií protilátky, ktorými sú hypervariabilné oblasti imunoglobulínových ťažkých a ľahkých reťazcov. Pozri, napríklad, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th. Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Vo variabilnej časti imunoglobulínu sú CDRs (alebo CDR oblasti) s troma ťažkými reťazcami a troma ľahkými reťazcami. Potom sa v tomto texte výraz „CDRs“ vzťahuje na všetky tri ťažké reťazce CDRs alebo na všetky tri ľahké reťazce CDRs (prípadne na obidve skupiny reťazcov, ľahkých aj ťažkých).

CDRs poskytujú väčšinu kontaktných zvyškov na väzbu protilátky k antigénu alebo epitopu. CDRs v tomto vynáleze sú odvodené od sekvencií variabilných ťažkých a ľahkých reťazcov donorovej protilátky a zahrnujú analógy prirodzene sa vyskytujúcich CDRs, analógy, ktoré sa tiež zúčastňujú alebo uchovávajú väzbovú špecifickosť a/alebo neutralizačnú schopnosť donorovej protilátky, z ktorej boli odvodené.

Výrazom „zúčastňovať sa na špecifickej väzbe antigénu a/alebo neutralizačnej schopnosti“ sa rozumie, napríklad, že ak MAb 3B9 sa môže charakterizovať určitou úrovňou antigénovej afinity a potom CDR, kódovaná nukleovou sekvenciou 3B9 vo vhodnom štruktúrnom prostredí môže mať nižšiu alebo vyššiu afinitu, predpokladá sa, že CDRs z 3B9 v takom prostredí budú rozoznávať rovnaký(é) epitop(y) ako 3B9. Príkladom sú CDRs s ťažkými reťazcami z 3B9 vrátane SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 26; a CDRs s ľahkými reťazcami z 3B9 vrátane SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; a SEQ ID NO: 20.

„Funkčný fragment“ je čiastková variabilná sekvencia s časťami ľahkých alebo ťažkých reťazcov (napríklad malá delécia na amínovom alebo karboxylovom termináli imunoglobulínovej variabilnej oblasti), ktorá zachováva rovnakú väzbovú antigénovú špecifickosť a/alebo neutralizačnú schopnosť ako protilátka, z ktorej bol fragment odvodený.

„Analóg“ je aminokyselinová sekvencia, modifikovaná najmenej jednou aminokyselinou, kde uvedená modifikácia môže znamenať modifikáciu chemickú alebo substitučnú, alebo preusporiadanie niekoľkých málo kyselín (to znamená nie viac ako desiatich), modifikácia, ktorá dovoľuje, aby si uvedená aminokyselinová sekvencia zachovala určitú biologickú charakteristiku, napríklad antigénovú špecifickosť a vysoký titer afinity nemodifikovanej sekvencie. Napríklad možno substitúciou vybudovať tiché mutácie, čím vzniknú endonukleázové reštrikčné polohy v CDR oblastiach alebo okolo nich.

Analógy môžu vznikať tiež ako alelické varianty. „Alelická zmena alebo modifikácia“ je zmena v sekvencii aminokyselín, kódujúcej aminokyselínové alebo peptidové sekvencie podľa tohto vynálezu. Takéto zmeny alebo modifikácie môžu byť spôsobené degeneráciou genetického kódu, alebo môžu byť zámerne konštruované, aby sa získali vyžadované vlastnosti. Uvedené zmeny alebo modifikácie môžu byť, ale nemusia byť výsledkom zmien ktorejkoľvek kódovanej sekvencie aminokyselín. Napríklad aminokyselinové sekvencie CDR s ľahkými reťazcami SEQ ID NO: 16 sú zhodné s prirodzenou myšacou a humanizovanou 3B9 protilátkou. Uvedená CDR sekvencia je však kódovaná s dvoma sekvenciami SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 53. Podobne, CDR SEQ ID NO: 22 je kódovaná s dvoma sekvenciami SEQ ID NO: 21 a SEQ ID NO: 54; CDR sekvencia SEQ ID NO: 24 je kódovaná s dvoma SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 55; a CDR SEQ ID NO: 26 je kódovaná s dvoma SEQ ID NO: 25 a SEQ ID NO: 56.

Výraz „efektorové činidlá“ sa vzťahuje na neproteínové nosné molekuly, ku ktorým môžu byť bežným spôsobom pripojené fúzne proteíny a/alebo prirodzené, alebo syntetické, ľahké alebo ťažké reťazce donorovej protilátky, alebo iné fragmenty donorovej protilátky. Tieto neproteínové nosiče môžu zahŕňat bežné nosiče, používané v oblasti diagnostiky, napríklad polystyrénové perličky alebo perličky z iného plastu, polysacharidy, napríklad aké sa využívajú v systéme BIAcore [Pharmacia], alebo iné neproteínové látky, užitočné v lekárskej oblasti a bezpečné pri podávaní človeku a ďalším živočíchom. Ďalšie efektorové činidlá môžu zahŕňat makrocykly na cheláciu atómov ťažkých kovov alebo rádioizotopov. Tieto efektorové činidlá môžu byť užitočné na zvýšenie polčasu života fúznych proteínov; napríklad polyetylénglykol.

II. Vysoko afinitné IL4 monoklonové protilátky

Na konštrukciu protilátok, fragmentov a fúznych proteínov podľa tohto vynálezu sa na vznik vyžadovaného imunoglobulínu interakciou s prirodzeným ľudským IL4 alebo jeho peptidovým epitopom môžu použiť druhy nepochádzajúce z človeka (napríklad bovinné, ovinné, z primátov, hlodavcov, napríklad myší a krýs, atď.). Na získanie bunkovej línie hybridom, vylučujúcich MAb (nepochádzajúce od človeka) k IL4, použije sa bežná hybridómová technika. Takto získané hybridómy sa potom vyberajú s použitím IL4 kovalentne ukotveného v 96-jamkových platniach, alebo na použitie pri výberových skúškach voliteľne s biotinylovaným IL4, ako sa podrobne opisuje v ďalej uvedenom príklade 2. Potom jedným znakom tohto vynálezu je spôsob detekcie MAbs na ľudský IL4, v ktorom sa systém skúšky vyhýba denaturácii IL4. Týmto spôsobom sa zistilo, že sa môžu určovať MAbs s vysokým titrom (alebo vysokoafinitné) k ľudskému IL4.

Ako jeden príklad možno uviesť, že sa prvý raz zistila produkcia vysokotitrovej neutralizujúcej MAb z myšacieho donora. MAb 3B9, čo je vyžadovaná myšacia (donorová) protilátka na použitie pri vývoji chimérovej alebo humanizovanej protilátky, sa podrobne opisuje v ďalej uvedenom príklade 1. Uvedená 3B9 MAb sa vyznačuje antigénovou špecifickou väzbou k ľudskému IL4, s Kd menšou ako

2.10¹⁰ M (okolo l,8.10‘¹⁰ M) pre IL4. Disociačná konštanta K_d fragmentu Fab uvedenej 3B9 je menšia ako 3.1O'¹⁰ M. Epitop tejto protilátky nemôže mapovať IL4 lineárnymi peptidmi a preto prichádza do úvahy väzba uvedeného epitopu k nepriliehavému epitopu. Spôsob väzby dáva predpoklad väzbového miesta v oblasti B-C slučka (zvyšky 60 až 69) -> C špirála (zvyšky 70 až 93). Tieto oblasti sú vo vzťahu k označovaniu máp, uvedených v Cook et al., J.Mol.Biol., 218:675 až 678 (1991), Walter et al., J.Biol.Chem., 267: 20371 až 20376 (1992), Wlodaver et al., FEBS Lett., 309: 59 až 64 (1992), Redfield et al., Biochem., 30: 11029 až 11035, (1991), Smith et al., J.Mol. Biol., 224: 899 až 904 (1992), Garret et al., a Powers et al., Biochem., 3].: 4334 až 4346 (1992) a Science, 256: 1673 až 1677 (1992), ktoré sú tu zahrnuté týmito odkazmi.

Ďalšia vhodná donorová protilátka je krysia MAb 6A1. Príprava tejto protilátky je uvedená ďalej v príklade 7. Táto MAb sa vyznačuje tým, že je izotypom IgG_2a, a má disociačnú konštantu k IL4 menšiu ako 2,0.10¹° M (asi

1.6.10¹⁰ M). Podobne ako pri 3B9, epitop tejto 6A1 nemapuje lineárne peptidy IL4, a preto sa usudzuje, že tento epitop neprilieha a je trojrozmerný. Spôsob väzby k IL4 muteínom a jeho biologická aktivita poukazuje na väzbu v D oblasti špirály ľudskej 1L4 (aminokyselínové zvyšky 109 až 127), s najväčšou pravdepodobnosťou okolo tyrozínu a zvyšku aminokyseliny číslo 124.

Vynález nie je obmedzený iba použitím 3B9 MAb, 6A1 MAb alebo ich hypervariabilných (to znamená CDR) sekvencií. Môžu ich nahradiť akékoľvek príslušné vysokotitrové IL4 protilátky, vyznačujúce sa disociačnou konštantou rovnajúcou sa alebo menšou 2,0.10'¹⁰ M k ľudskému IL4 a zodpovedajúce anti-IL4 CDRs. Kdekoľvek sa v následujúcom opise uvádza, že ide o donorovú protilátku 3B9 alebo 6A1, rozumie sa toto označenie len ako príklad a zjednodušenie opisu.

III. Fragmenty protilátok

Predložený vynález zahrnuje tiež použitie Fab fragmentov alebo F(ab')₂ fragmentov, odvodených z MAbs, vedených proti ľudskému IL4. Uvedené fragmenty sú užitočné ako ochranné činidlá in vivo proti IL4 a IgE sprostredkovaným stavom, alebo in vitro ako súčasť diagnostiky IL4. Fab fragment obsahuje celý ľahký reťazec a amínovú terminálovú časť ťažkého reťazca; F(ab')₂ fragment je tvorený dvoma fragmentmi, viazanými disulfidovou väzbou. MAbs 3B9, 6A1 a ďalšie IL4 viažuce protilátky s podobnou vysokou afinitou sú zdrojom fragmentov Fab a fragmentov F(ab')₂, ktoré sa môžu získať bežným spôsobom, napríklad štiepením monoklonovej protilátky s vhodným proteolytickými enzýmami, papainom a/alebo pepsínom, alebo rekombinantnými spôsobmi. Uvedené Fab a F(ab')₂ fragmenty sú samy užitočné ako terapeutické, profylaktické alebo diagnostické látky a ako donory sekvencií, zahrnujúce variabilné oblasti a sekvencie CDR, užitočné pri vytváraní v texte opísaných rekombinantných alebo humanizovaných protilátok.

IV. Anti-IL4 aminokyselínové a nukleotidová sekvencie, zaujímavé z hľadiska tohto vynálezu

Uvedená monoklonová protilátka 3B9 alebo ďalšie protilátky, opísané skôr, môžu prispievať sekvenciami ako sú premenné ťažké a/alebo ľahké reťazce pcptidových sekvencii, štruktúrne sekvencie, CDR sekvencie, funkčné fragmenty a ich analógy, a ich kódujúce sekvencie nukleových kyselín, ktoré sú užitočné pri návrhu a príprave rôznych fúznych proteínov (vrátane protilátok, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku), ktoré sa vyznačujú antigénovou špecifickou väzbou donorovej protilátky.

Ako príklad sa v tomto vynáleze uvádzajú premenné sekvencie ľahkých reťazcov a premenných ťažkých reťazcov 1L4 myšacej protilátky 3B9 a z nej odvodené sekvencie. Premenná oblasť ťažkých reťazcov 3B9 sa vyznačuje aminokyselinovými zvyškami 20 až 140 s SEQ ID NO: 4. CDR oblasti sú vyznačené podčiarknutím v obraze 2 a sú v SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24; a SEQ ID NO: 26. Klonová premenná oblasť ľahkého reťazca 3B9 sa vyznačuje zvyškami aminokyselín 21 až 132 z obrazu 1 [SEQ ID NO:2], Uvedené CDR oblasti sú zo zvyškov aminokyselín 44 až 58 [SEQ ID NO: 16]; 74 až 80 [SEQ ID NO 18] a 113 až 121 [SEQIDNO: 20],

Uvádzajú sa premenné oblasti chimérových ťažkých reťazcov, signálne nukleotidy a sekvencie aminokyselín. Tieto sekvencie sú zhodné s 3B9 ťažkým reťazcom s výnimkou signálnej sekvencie. Uvedená signálna sekvencia chimérového ťažkého reťazca sa nachádza v SEQ ID NOS: 5 a 6. Uvedené CDR oblasti sú vyznačené podčiarknutím na obr. 3 a sú zhodné s sekvenciou aminokyselín prirodzených CDRs [SEQ ID NOS: 21 až 26]. Premenná oblasť ľahkého reťazca chimérového nukleotidu a sekvencie aminokyselín sú zhodné s nemodifíkovanými 3B9 sekvenciami (zvyšky aminokyselín 21 až 32 z SEQ ID NO: 2), čo umožňuje využitie myšacích signálnych sekvencií (zvyšky aminokyselín 1 až 20 z SEQ ID NO: 2).

Na obr. 4 sú znázornené premenná oblasť humanizovaných ťažkých reťazcov a signálne sekvencie [SEQ ID NO: 11 a 12], Ako náhrada za uvedené sa môžu použiť ďalšie, v danej oblasti známe, vhodné signálne sekvencie. Sekvencie aminokyselín CDR s touto stavbou sú zhodné s prirodzeným myšacím a chimérovým ťažkým reťazcom CDRs a sú uvedené v SEQ ID NO: 22 (kódované s SEQ ID NO: 54), SEQ ID NO: 24 (kódované s SEQ ID NO: 55) a SEQ ID NO: 56 (kóduje SEQ ID NO:26).

Na obr. 5 sa ako príklad uvádza (syntetická) premenná sekvencia humanizovaného ľahkého reťazca [SEQ ID NOS: 13 a 14], Signálna sekvencia má rozpätie zvyškov aminokyselín 1 až 19 z SEQ ID NO: 8. CDR sekvencie z tohto obrazu sú vyznačené podčiarknutím a odlišujú sa od CDR prirodzeného myšacieho CDR jednodnoduchou aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID NO: 20. CDRs humanizovaných ľahkých reťazcov sa potom uvádzajú ako SEQ ID NO: 53 a 16, SEQ ID NO: 17 a 18 a SEQ ID NO: 27 a 28. Rozdiely sa podrobne opisujú v príklade 3.

Sekvencie nukleových kyselín v tomto vynáleze alebo fragmenty týchto sekvencií, kódujúce premenne ľahké reťazce a ťažké reťazce peptidových sekvencií sa používajú v nezmenenej forme, alebo sa syntetizujú, aby sa zaviedli vhodné modifikácie, napríklad reštrikčné miesta. Izolované, prirodzene sa vyskytujúce, alebo voliteľne syntetické sekvencie nukleových kyselín, ktoré sú odvodené od MAb 3B9, alebo od iných vhodných protilátok s vysokým titrom môžu voliteľne obsahovať reštrikčné miesta na uľahčenie vloženia alebo ligácie do vhodnej sekvencie nukleovej kyseliny, ako je kódovanie vhodnej protilátkovej štruktúrnej oblasti, ligácia s mutagenizovanými CDRs alebo fúzia so sekvenciou nukleovej kyseliny, kódujúcej vybraného druhého fúzneho partnera.

V súvislostiach s degeneráciou genetického kódu môžu sa vybudovať rôzne kódujúce sekvencie, ktoré kódujú premenné aminokyselínové sekvencie ťažkých a ľahkých reťazcov a CDR sekvencie tohto vynálezu, ako aj ich funkčné fragmenty a analógy, ktoré zachovávajú antigénovú špecifickosť donorovej protilátky. Na prípravu fúznych proteínov, chimérových alebo humanizovaných protilátok sa môžu použiť izolované sekvencie nukleových kyselín podľa tohto vynálezu alebo ich fragmenty, kódujúce premenné sekvencie reťazcov peptidov, alebo CDRs. Môžu sa použiť aj protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku podľa tohto vynálezu, ak sa účinne viažu k druhému fúznemu partnerovi.

Uvedené sekvencie sú užitočné tiež na mutagénne vkladanie špecifických zmien do sekvencií nukleových kyselín, kódujúcich uvedené CDRs alebo štruktúrne oblasti, a na zabudovanie výslednej modifikovanej alebo fúznej sekvencie nukleovej kyseliny do plazmidu na expresiu. Napríklad sa v nukleotidovej sekvencií štruktúry použili nemé substitúcie a CDR-kódujúce oblasti na vytvorenie reštrikčného enzýmového miesta, ktoré napomáha vloženiu mutagenizovaných CDR (a/alebo štruktúrnych) oblastí. Tieto CDR oblasti sa použili pri výstavbe humanizovanej protilátky podľa tohto vynálezu.

Treba poznamenať, že popri izolovaných sekvenciách nukleových kyselín, kódujúcich časti fúznych proteínov a v texte opisovaných protilátok, môžu sa použiť aj iné sekvencie nukleových kyselín; také, ktoré sú komplementárne k prirodzeným sekvenciám. Užitočné sekvencie DNA zahrnujú také sekvencie, ktoré hybridizujú za prísnych hybridizačných podmienok [pozri T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), strany 387 až 389]. Ako príklad prísnych hybridizačných podmienok možno uviesť hybridizáciu v 4XSSC pri 65 °C, následné, asi hodinové, premývanie v 0,lXSSC pri 65 °C. Iný príklad prísnych hybridizačných podmienok je hybridizácia 4XSSC pri 42 °C v 50 %-nom formamide. Tieto hybridizujúce DNA sekvencie majú dĺžku najmenej asi 18 nukleotidov, to znamená asi veľkosť CDR.

V. Fúzne molekuly a fúzne proteíny

Fúzne molekuly môžu kódovať fúzne proteíny, ktoré zahrnujú protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich \'zniku, ako sú chimérové protilátky a protilátky humanizované. Vhodná fúzna molekula obsahuje sekvencie CDR, kódujúce peptidy, ktoré majú antigénovú špecifickosť IL4 protilátky, výhodne vysoko afínitná protilátka, určená týmto vynálezom, vložená do prvého fúzncho partnera (ľudská štruktúra alebo ľudská imunoglobulínová premenná oblasť).

Výhodne sa prvý fúzny partner účinne pripojí k druhému fúznemu partnerovi. Druhý fúzny partner je určený vyššie a môže obsahovať sekvenciu, kódujúcu druhú protilátkovú oblasť, zaujímavú z hľadiska tohto vynálezu, napríklad Fc oblasť. Druhí partneri pre fúzie môžu tiež zahŕňat sekvencie, kódujúce iné imunoglobulíny, ku ktorým sú do štruktúry fúziované stále oblasti ľahkých alebo ťažkých reťazcov, alebo sú fúziované pomocou linkerovej sekvencie. Protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, usmernené proti funkčným fragmentom alebo analógom IL4, môžu byť tak navrhnuté, aby vyvolali posilnenie väzby s rovnakou protilátkou.

Druhý fúzny partner môže byť tiež spojený s efektorovým činidlom, ako je určené, zahrnujúc neproteínové nosné molekuly, ku ktorým sa môže druhý fúzny partner účinne pripojiť bežným spôsobom.

Fúzia alebo pripájanie medzi druhými fuznymi partnermi, napríklad protilátkovými sekvenciami, a medzi efektorovým činidlom, sa môže uskutočniť akýmkoľvek vhodným spôsobom, napríklad bežnou kovalentnou alebo iónovou väzbou, fúziami proteínov alebo hetero-bifunkčnými zosieťovačmi, napríklad karbodiimidom, glutaraldehydom a podobne. Tieto spôsoby sú v danej oblasti známe a dobre opísané v bežných chemických a biochemických textoch.

Do fúznej molekuly sa môžu navyše zabudovať bežné linkerové sekvencie, ktoré jednoducho zabezpečujú potrebný priestor medzi druhým fúznym partnerom a efektorovým činidlom. Navrhovanie uvedených linkerov je dobre známe skúseným odborníkom v danej oblasti.

Navyše sa môžu signálne sekvencie molekúl podľa tohto vynálezu modifikovať na posilnenie expresie. Ako príklad vhodného fúzneho proteínu, ktorý má sekvenciu aminokyselín, ako je sekvencia ťažkého reťazca myši, a táto sekvencia je zhodná s chimérovovým premenným ťažkým reťazcom (V_H) z obr. 2 [SEQ ID NO: 4], je proteín, v ktorom pôvodný signálny peptid bol nahradený inou signálnou sekvenciou (zvyšky aminokyselín 1 až 20) [SEQ ID NO: 6],

Ako príklad možno uviesť, že fúzny proteín obsahuje peptid s premenným ťažkým a/alebo ľahkým reťazcom, alebo proteínovú sekvenciu, ktorá má antigénovú špecifickosť protilátky 3B9, V_H [zvyšky aminokyselín 21 až 141 z SEQ ID NO: 9 a 10] a V_L reťazce [zvyšky aminokyselín 21 až 132 z SEQ ID NO: 1 a 2], Ešte iný vhodný fúzny proteín podľa tohto vynálezu sa vyznačuje sekvenciou aminokyselín, obsahujúcou najmenej jednu a výhodne všetky CDRs premenných oblastí ľahkých a/alebo ťažkých reťazcov myšacej protilátkovej molekuly 3B9 a ostatné sekvencie sú odvodené z človeka ako zdroja, alebo ich funkčný fragment, alebo ich analóg. Pozri napríklad humanizované V_H a V_L oblasti z SEQ ID NOS: 11 a 12 a SEQ ID NOS: 13 a 14 (obr. 4 a 5).

V ďalšom uskutočnení vynálezu môže protilátka, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku podľa tohto vynálezu byť pripojená k ďalšej látke. Napríklad sa môže použiť postup rekombinantnej DNA technológie na prípravu uvedenej protilátky podľa vynálezu, v ktorej sa Fc fragment alebo CH₃ doména úplnej protilátkovej molekuly nahradí enzýmom, alebo ďalšou stanoviteľnou molekulou (to znamená polypeptidovým efektorom alebo spravodajskou molekulou).

Druhý fúzny partner sa môže účinne pripájať tiež k neimunoglobulínovému peptidu, proteínu alebo ich fragmentu heterológne k CDR-obsahujúcej sekvencii, ktorá má antigénovú špecifickosť zhodnú s myšacou 3B9. Výsledný proteín môže mať pri expresii tak anti-IL4 antigénovú špecifickosť, ako aj neimunoglobulinové charakteristiky. Takýto fúzny partner môže mať charakter napríklad funkčný, ako je iná väzbová alebo receptorová doména, alebo terapeutický, ak fúzny partner je sám terapeutický proteín, alebo môže mať navyše iný antigénny charakter.

Ďalší vhodný proteín podľa tohto vynálezu môže obsahovať úplnú protilátkovú molekulu, ktorá má celú dĺžku ťažkého a ľahkého reťazca, alebo akýkoľvek ich fragment, ako sú Fab alebo F(ab')₂ fragmenty, dimér ťažkého reťazca alebo akékoľvek ich najmenšie rekombinantné fragmenty, ako je F_v alebo protilátka s jednoduchým reťazcom (SCA) alebo akákoľvek iná molekula s rovnakou špecifickosťou ako vybraný donor MAb, napríklad MAb 3B9 alebo 6A1. Takýto proteín sa môže použiť ako fúzujúci proteín, alebo sa môže použiť v nefúziovanej forme.

Kdekoľvek je druhý fúzujúci partner odvodený z inej protilátky, napríklad niektorý izotyp alebo druh imunoglobulinovej štruktúry, alebo stálej oblasti, vytvára sa protilátka, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku. Protilátka, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku, môže obsahovať imunoglobulinové (Ig) stále oblasti a premenlivé štruktúrne oblasti z jedného zdroja, napríklad akceptorovej protilátky, a jednu alebo viac (výhodne všetky) CDRs z donorovej protilátky, napríklad anti-IL4 protilátku, opísanú na inom mieste. Ďalej možno urobiť zmeny, napríklad delécie, substitúcie alebo adície na ľahkých a/alebo ťažkých variabilných doménach štruktúrnej oblasti akceptorovej monoklonovej protilátky (MAb) na úrovniach nukleových kyselín alebo aminokyselín, alebo sa donorové CDR oblasti môžu urobiť tak, aby uchovali antigénovú špecifickú väzbu donorovej protilátky.

Takéto protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, sú tak konštruované, aby sa použil jeden (alebo obidva) variabilný ťažký a/alebo ľahký reťazec monoklonovej protilátky IL4 (voliteľne modifikovaný tak, ako už bolo uvedené), alebo jeden, alebo viac ďalej určených ťažkých alebo ľahkých reťazcov CDRs (pozri príklad 3). Protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku podľa tohto vynálezu, sú neutralizujúce, to znamená, vhodne zamedzujú (blokujú) väzbu k receptoru IL4 proteínu. Napríklad protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, odvodené od MAb 3B9, sú usmernené proti špecifickému terciámemu proteínovému epitopu ľudského 1L4 a usudzuje sa, že sú v B - C slučke -* C oblasti špirály, ako sa opisuje.

Uvedené protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, môžu zahrnovať humanizovanú protilátku, obsahujúcu štruktúrne oblasti vybraného ľudského imunoglobuiínu alebo subtypu, alebo chimérovú protilátku, obsahujúcu ľudské stále oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov, fúziované k IL4 protilátkovým funkčným fragmentom. Vhodná ľudská (alebo iná živočišná) akceptorová protilátka sa môže vybrať z bežnej banky dát, napríklad z KABAT® databázy, Los Alamos Database, a z Swiss Proteín database podľa homológie k nukleotidovým a aminokyselinovým sekvenciám protilátky donora. Ľudská protilátka, vyznačujúca sa homológiou k štruktúrnym oblastiam protilátky donora (na základe aminokyselín), môže byť vhodná na poskytnutie stálej oblasti s ťažkým reťazcom a/alebo premennej štruktúrnej oblasti s ťažkým reťazcom na vloženie donorových CDRs. Podobným spôsobom sa môže vybrať vhodná akceptorová protilátka, schopná dodávať stále alebo premenlivé štruktúrne oblasti s ľahkými reťazcami. Treba poznamenať, že sa nevyžaduje, aby akceptorové protilátkové ťažké a ľahké reťazce pochádzali z tej istej akceptorovej protilátky.

Heterológne štruktúrne a stále oblasti sa vhodne vyberú z ľudských imunoglobulínových druhov a izotypov, ako je IgG (subtypy 1 až 4), IgM, IgA a IgE. Akceptorová protilátka však nemusí obsahovať iba ľudské imunoglobulínové proteínové sekvencie. Napríklad sa môže konštruovať gén, v ktorom DNA sekvencia, kódujúca časť ľudského imunoglobulínového reťazca je fúziovaná k DNA sekvencii, kódujúcej neimunoglobulínovú aminokyselinovú sekvenciu, ako je polypeptidový efektor alebo spravodajská molekula.

Príklad osobitne vhodnej humanizovanej protilátky zahrnuje CDRs z 3B9, vloženej na štruktúrne oblasti vybranej ľudskej protilátkovej sekvencie. Na neutralizáciu humanizovaných protilátok sa vložia do štruktúrnych oblastí vybranej ľudskej protilátkovej sekvencie jedna, dve alebo výhodne tri CDRs z IL4 protilátkových premenných oblastí s ťažkými a/alebo ľahkými reťazcami, nahradzujúce prirodzené CDRs uvedenej protilátky.

V humanizovanej protilátke sa výhodne vytvoria jednou alebo viacerými CDR náhradami variabilné domény oboch ťažkých a ľahkých reťazcov. Možno použiť všetkých šesť CDRs alebo rôzne kombinácie menej ako šiestich CDRs. Výhodne sa nahradí všetkých šesť CDRs. Možno nahradiť CDRs iba v ľudskom ťažkom reťazci použitím ako ľahkého reťazca nemodifikovaný ľahký reťazec z ľudskej akceptorovej protilátky. Ešte alternatívne sa môže kompatibilný ľahký reťazec vybrať z inej ľudskej protilátky pomocou bežných protilátkových bánk údajov. Zvyšok cieľavedome konštruovanej protilátky sa môže odvodiť z ktoréhokoľvek vhodného ľudského imunoglobulínu.

Humanizovaná protilátka, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku, má teda výhodne štruktúru prirodzenej ľudskej protilátky alebo jej fragmentu a poskytuje kombináciu vlastností, vyžadovaných na účinné terapeutické použitie, napríklad na liečbu IL4 sprostriedkovaných zápalových ochorení človeka alebo na diagnostické použitie.

Ako ďalší príklad môže protilátka, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku, obsahovať tri CDRs variabilnej oblasti ľahkého reťazca z 3B9 [SEQ ID NO: 16, 18, 20 a 28] a tri CDRs variabilné oblasti ťažkého reťazca z 3B9 [SEQ ID NO: 22, 24 a 26], Výsledná humanizovaná protilátka sa vyznačuje antigénovou špecifickou väzbou a vysokou afinitou protilátky 3B9.

Skúseným v danej oblasti bude zrejmé, že protilátka, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku, sa môže ďalej modifikovať zmenami variabilných domén aminokyselín bez nevyhnutného ovplyvnenia špecifickosti a vysokej afinity donorovej protilátky (to znamená analóga). Napríklad sa konštruovali humanizované monoklonové protilátky, v ktorých aminokyselinový zvyšok ľahkého reťazca v polohe 120 bol arginín [SEQ ID NO: 13 a 14] alebo treonin [SEQ ID NO: 57 a 58]. Očakáva sa, že aminokyseliny ľahkých a ťažkých reťazcov možno substituovať inými aminokyselinami, buď v premenných doménových štruktúrach, alebo v CDRs, alebo v obidvoch.

Stále oblasti sa navyše môžu pozmeniť na zvýšenie alebo zníženie určitých vybraných vlastností molekúl podľa tohto vynálezu. Napríklad zmeny dimerizáciou, väzbou k Fc receptorom, alebo schopnosť viazať a aktivovať komplement (pozri, napríklad, Angal et al., Mol.lmmunol., 30: 105 až 108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem.. 269: 3469 až 3474 (1994), Winteret al., EP 307.434-B).

Fúzny proteín, ktorý je chimérová protilátka, sa odlišuje od humanizovaných protilátok, opísaných, tým, že má premenlivé oblasti ťažkého reťazca a ľahkého reťazca donorovej protilátky, ako celok nepochádzajúcej od človeka, vrátane štruktúrnych oblastí, spojené s ľudskými imunoglobulínovými stálymi oblasťami obidvoch reťazcov. Usudzuje sa, že chimérové protilátky, ktoré navyše zachovávajú sekvencie, nepochádzajúce od človeka, môžu v porovnaní s humanizovanými protilátkami v ľuďoch vyvolať významnú imunitnú odpoveď.

Také protilátky sú užitočné v prevencii a liečbe IL4 sprostriedkovaných alergických porúch, ako sa diskutuje v ďalšom texte.

VI. Príprava fúznych proteínov a protilátok, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku

Na konštrukciu fúznych proteínov a protilátok, ktoré vzniknú náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, výhodne humanizovaných protilátok, sa v ďalej uvedenom spôsobe podľa tohto vynálezu výhodne použijú premenné sekvencie ľahkých a/alebo ťažkých reťazcov a CDRs z MAb 3B9 [SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24 a 26] alebo iné vhodné donorové MAbs (napríklad 6A1), alebo ich kódujúce sekvencie nukleových kyselín. Na ďalšie uskutočnenia podľa tohto vynálezu sa môže využiť rovnaký spôsob prípravy alebo obdobné spôsoby.

Bežným spôsobom sa klonuje hybridom, produkujúci vybraný donor MAb, napríklad protilátku 3B9 myši, a získajú sa DNA z premenných oblastí jeho ťažkých a ľahkých reťazcov technikou, známou skúseným odborníkom v danej oblasti, napríklad technikou opísanou v Sambrook et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Použitím polynukleotidových primérov a reverznou transkriptázou sa získajú premenné ľahké a ťažké oblasti z 3B9, obsahujúce prinajmenšom vyžadované CDRs, a také časti ľahkej a/alebo ťažkej premennej doménovej štruktúrnej oblasti akceptorovej MAb, ktoré sa vyžadujú na uchovanie donorovej MAb väzbovej špecifickosti, ako aj ostatné od imunoglobulínu odvodené časti protilátkového reťazca, odvodeného z ľudského imunoglobulínu. Uvedené CDRs sa identifikujú pomocou známej banky údajov a porovnaním s inými protilátkami.

Chimérová protilátka myši/človeka sa potom môže pripraviť a skúšať na schopnosť väzby. Uvedená chimérová protilátka obsahuje celé donorové protilátkové V_H a V_L oblasti, nepochádzajúce od človeka, v spojení so stálou oblasťou Ig človeka v obidvoch reťazcoch.

Homológne štruktúrne oblasti premennej oblasti ťažkého reťazca z protilátky človeka sa identifikovali použitím počítačových bánk údajov, napríklad KABAT® a ako akceptorová sa vybrala protilátka človeka s homológiou k 3B9. Uvedené sekvencie syntetických premenných oblastí ťažkého reťazca, obsahujúce uvedené 3B9 CDRs v rámci štruktúry protilátky človeka, sa navrhli s voliteľným nahradzovaním v štruktúrnych oblastiach na zabudovanie reštrikčných miest. Táto navrhnutá sekvencia sa potom syntetizuje prekrytím oligonukleotidov, znásobená reakciou s polymerázovým reťazcom (PCR) a opravením chýb.

Vhodná premenná štruktúrna oblasť ľahkých reťazcov sa budovala obdobne.

Humanizovaná protilátka sa môže odvodiť od chimcrovej protilátky alebo sa výhodne môže vyrobiť synteticky vložením donorových MAb CDRs z ťažkých a ľahkých reťazcov do vybranej štruktúry ťažkých a ľahkých reťazcov.

Alternatívne sa humanizovaná protilátka podľa tohto vynáSK 285556 B6 lezu môže pripraviť použitím bežnej techniky mutagenézy. Výsledná humanizovaná protilátka potom obsahuje štruktúrne oblasti človeka a donorové MAb CDRs. Môže sa vykonať následná manipulácia v štruktúrnych skupinách. Výsledná humanizovaná protilátka sa môže exprimovať v rekombinantných hostiteľských bunkách, napríklad v COS alebo CHO bunkách. Ďalšie podrobnosti tohto spôsobu sa uvádzajú v príklade 4. Iné humanizovaná protilátky sa môžu pripraviť použitím tohto spôsobu prípravy z iných vhodných IL4-špecifických, neutralizačných, vysokotitrových protilátok, nepochádzajúcich od človeka.

Bežný expresný vektor alebo rekombinantný plazmid sa pripraví umiestením uvedených kódujúcich sekvencií pre fúzny proteín do účinného spojenia s bežnými regulačnými sekvenciami, schopnými riadiť replikáciu a expresiu v, alebo sekréciu z, hostiteľskej bunky. Regulačné sekvencie zahrnujú sekvencie promótorov, napríklad CMV promótora, a signálne sekvencie, ktoré sa môžu odvodiť od známych protilátok. Podobne sa pripraví druhý expresný vektor, ktorý má sekvenciu DNA, ktorá kóduje komplementárny protilátkový ľahký alebo ťažký reťazec. Tento druhý expresný vektor je prednostne zhodný s prvým s výnimkou, že kódujúce sekvencie a voliteľné markery sa sústreďujú tak, aby čo najviac zabezpečili, že by každý polypeptidový reťazec bol funkčne exprimovaný.

Vybraná hostiteľská bunka sa ko-transfektuje bežnými spôsobmi s obidvoma vektormi, teda s prvým aj druhým vektorom, alebo sa jednoducho transfektuje jedným vektorom a vytvorí transfektovanú hostiteľskú bunku podľa tohto vynálezu, ktorá obsahuje obidva rekombinantnc alebo syntetické ľahké a ťažké reťazce. Transfektovaná bunka sa potom kultivuje bežnými spôsobmi, aby sa podľa tohto vynálezu získala protilátka, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku. Humanizovaná protilátka, ktorá zahŕňa spoločne obidva rekombinantný ťažký reťazec a/alebo ľahký reťazec sa podrobí výberu z kultivačného prostredia príslušným skúšobným postupom, ako je ELISA alebo RIA. Na vybudovanie iných fúznych proteínov a molekúl podľa tohto vynálezu sa môžu použiť podobné bežné spôsoby prípravy.

Vhodné vektory na klonovanie a použitie subklonovacích krokov v spôsoboch a budovaní kompozícií podľa tohto vynálezu môžu vybrať odborníci, skúsení v tejto oblasti. Napríklad sa môžu použiť bežné pUC série klonovacích vektorov. Jeden použitý vektor je pUC19, ktorý je komerčne dostupný od dodávateľov, ako je Amersham (Buckinghamshire, UK) alebo Pharmacia (Uppsala, Švédsko). Na klonovanie sa navyše môže použiť akýkoľvek vektor, ktorý je schopný ľahkej replikácie, ktorý má veľký počet klonovacích miest a značkových génov a je ľahko manipulovateľný. Vynález tak nijako nie je obmedzený výberom klonovacieho vektora.

Vektory použité na expresiu protilátok, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku podľa tohto vynálezu sa môžu podobne vybrať z bežných vektorov odborníkom, skúseným v danej oblasti. Vektory teda obsahujú vybrané regulačné sekvencie, ktoré sú účinne spojené s DNA kódujúcimi sekvenciami imunoglobulínových oblastí a sú schopné riadiť replikáciu a expresiu heterológnych sekvencií vo vybraných hostiteľských bunkách ako CMV promótory. Tieto vektory obsahujú opísané DNA sekvencie, ktoré kódujú pre protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku alebo fúzne molekuly. Na ľahkú manipuláciu s vektormi môžu mať uvedené vektory alternatívne vstavané vybrané imunoglobulínové sekvencie, modifikované vložením vhodných reštrikčných miest.

Expresné vektory sa môžu tiež charakterizovať značkovými génmi, vhodnými na znásobovanie expresie heterológnych DNA sekvencií, napríklad dihydrofolátový reduktázový gén (DHFR) cicavca alebo neomycínu odolný gén (neo^R). Ďalšie uprednostnené vektorové sekvencie zahrnujú Poly A signálnu sekvenciu, ako je bovinný rastový hormón (BGH) a betaglobínová promótorová sekvencia (betaglopro). Uvedené užitočné expresné vektory sa môžu syntetizovať spôsobmi, ktoré sú dobre známe odborníkom v tejto oblasti.

Zložky týchto vektorov, napríklad replikóny, selekčné gény, posilňovače - enhancery, promótory, signálne sekvencie a podobné sa môžu získať z prirodzených zdrojov, alebo sa môžu syntetizovať známymi spôsobmi na použitie na riadenie expresie a^zalebo sekrécie produktu rekombinantnej DNA vo vybranom hostiteľovi. Na tento účel sa môžu vybrať ďalšie vhodné expresné vektory z celého radu vektorov, ktorých je v odbore známy značný počet typov na expresiu u cicavcov, baktérií, hmyzu, kvasiniek a húb.

Tento vynález tiež zahrnuje bunkovú líniu transfektovanú s rekombinantným plazmidom, obsahujúcim kódujúce sekvencie protilátok, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku alebo ich fúznych molekúl. Bežné sú tiež hostiteľské bunky na klonovanie a ďalšie manipulácie uvedených klonovacích vektorov. Na replikáciu klonovacích vektorov a na ďalšie kroky pri budovaní fúznych proteínov podľa tohto vynálezu sú však najvhodnejšie bunky rôznych kmeňov E. coli.

Vhodné hostiteľské bunky alebo bunkové línie na expresiu protilátky, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku alebo fúziou proteínu podľa tohto vynálezu výhodne sú eukaryotické bunky, ako medzi inými je CHO, COS, fibroplastová bunka (napríklad 3T3) a myeloidné bunky a navyše výhodná je bunka cicavca, ako je CHO bunka alebo myeloidná bunka. Môžu sa použiť bunky človeka, čo umožňuje modifikáciu molekuly ľudským glykosylačným štruktúrnym motívom. Alternatívne sa môžu použiť ďalšie eukaroytické bunky. Výber vhodných hostiteľských buniek cicavca, spôsoby transformácie, kultivácie, násobenia, výberu a prípravy produktu a jeho čistenie sú v danej oblasti techniky známe. Pozri napríklad Sambrook et al., citované skôr.

Na expresiu rekombinantných MAbs podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné ako hostiteľské aj vhodné bakteriálne bunky. V dôsledku tendencie proteínov, exprimovaných v bunkách baktérií, vytvárať neuložené alebo nesprávne zložené tvary, alebo exprimovať v neglykosylovanej forme, na retenciu antigéne vej väzbovej afinity sa nevyberá nijaká rekombinantná MAb, produkovaná v bakteriálnej bunke. Ak sa expresiou v bakteriálnej bunke pripraví exprimovaná molekula v správnej forme, potom taká bakteriálna bunka je vhodným hostiteľom. Napríklad, rôzne kmeňe E. coli, použité na expresiu, sú v odbore biotechnológie dobre známe hostiteľské bunky. V tomto spôsobe sa môžu tiež použiť rôzne kmeňe z B. subtilis, Streptomyces, ďalšie bacily a podobne.

Ak sa vyžaduje, môžu sa ako vhodné hostiteľské bunky použiť tiež kmeňe kvasinkových buniek, známe skúseným odborníkom v uvedenej oblasti, ako aj bunky hmyzu, napríklad Drosophila a Lepidoptera a vírusové expresné systémy. Pozri, napríklad Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277 až 298, Plénum Press (1986) a odkazy v ňom citované.

Transfekčný spôsob prípravy, ako všeobecný spôsob, ktorým sa môžu konštruovať vektory podľa tohto vynálezu, vyžaduje produkciu hostiteľských buniek podľa tohto vynálezu a kultivačné spôsoby, nevyhnutné na prípravu fúzneho proteínu alebo protilátky, ktorá vznikla náročným a cieľa9 vedomým riadením jej vzniku podľa tohto vynálezu z takých hostiteľskej bunky. Všetky uvedené spôsoby prípravy sú dobre známe. Podobne sa fúzne proteíny alebo protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, raz pripravené, môžu oddeliť z kultivačného prostredia a čistiť bežnými postupmi, známymi v danej oblasti, vrátane zrážania síranom amónnym, afinitnou chromatografiou, stĺpcovou chromatografíou, gélovou elektroforézou a podobne. Uvedené postupy sú známe skúseným odborníkov v danej oblasti techniky a nijako neobmedzujú tento vynález.

Ešte ďalší spôsob expresie humanizovanej protilátky môže využívať expresiu v transgénovom živočíchovi, ako sa opisuje v Patente USA číslo 4 873 316. Tento sa vzťahuje na systém expesie s použitím zvieracieho kazeinového promótora, ktorý, ak je transgénne zabudovaný do cicavca, dovoľuje, aby samička v jej mlieku produkovala vyžadovaný rekombinantný proteín.

Vhodným spôsobom raz exprimovaná protilátka, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku, sa potom skúša na jej in vitro účinnosť, použitím vhodnej skúšky. V súčasnosti sa na kvalitatívne a kvantitatívne zhodnotenie väzby protilátky, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku, k IL4 epitopu využíva enzýmová imunoanalýza ELISA. Navyše sa na verifikáciu neutralizačnej účinnosti pred následujúcimi klinickými skúškami na človeku môžu použiť ďalšie in vitro skúšky napríklad BIAcore [Pharmacia], aby sa zhodnotila perzistencia protilátky, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku, v tele, napriek bežnému mechanizmu čistenia.

Podľa postupov, opísaných na prípravu humanizovaných protilátok z 3B9, môže skúsený v danom odbore konštruovať tiež humanizované protilátky z iných donorových IL4 protilátok, variabilných oblastí sekvencií a CDR peptidov, v tomto texte opísaných. Protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku sa môžu pripraviť s variabilnými oblasťami štruktúry, potenciálne rozoznávanými príjemcom protilátky ako „samy seba“ (,,self‘). Na značné zvýšenie antigénovej väzby sa môžu bez výrazného zvýšenia imunogenicity príjemcu vykonať malé úpravy variabilných oblastí štruktúry. Takéto protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, môžu účinne liečiť s IL4 sprostriedkované stavy človeka. Takéto protilátky môžu byť tiež užitočné pri diagnostike uvedených stavov.

VII. Terapeutické/profylaktické použitie

Tento vynález sa tiež vzťahuje na spôsob liečby ľudí trpiacich alergickými poruchami, zahrnujúci podávanie účinnej dávky protilátok, vrátane jednej alebo viacerých protilátok, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, alebo fúznych proteinov, opísaných v texte, alebo ich fragmentov.

Terapeutická odozva, vyvolaná použitím molekúl podľa tohto vynálezu, sa vyvolá väzbou na ľudský IL4 a následným blokovaním uvoľňovania IgE. Tak molekuly podľa tohto vynálezu, ak sú vo vhodnom preparáte a formulácii na terapeutické použitie, sú výnimočne vhodné pre osoby, ktoré trpia na alergické odozvy, ako sú alergická nádcha, zápal spojiviek, atopické dermatitídy, atopická astma a anafylaktický šok.

Uvedené fúzne proteíny, protilátky, ďalej protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, alebo ich fragmenty, podľa tohto vynálezu, môžu sa tiež použiť v kombinácii s ďalšími protilátkami, osobitne s MAbs človeka, reaktívnymi s ďalšími markermi (epitopmi), vyvolávajúce stavy, proti ktorým sú určené protilátky podľa tohto vynálezu. Podobne sa môžu vo veterinárnych kompozíciách použiť MAbs, reaktívne s epitopmi, vyvolávajúcimi pri vybraných živočíchoch uvedený stav, proti ktorému je určená protilátka podľa tohto vynálezu.

Terapeutické činidlá podľa tohto vynálezu sa považujú za vhodné na liečbu alergických stavov od asi dvoch dní až do asi 3 týždňov, alebo podľa potreby. Napríklad dlhšie liečenia môžu byť vhodné na liečbu sezónej nádchy a podobných stavov. Táto skutočnosť predstavuje výrazný pokrok vzhľadom na doteraz používané infúzne protokoly liečby IL4 sprostredkovaných porúch. Dávka a trvanie liečby je vo vzťahu s relatívnou trvanlivosťou molekúl, určených týmto vynálezom, v obehu človeka a môžu sa nastaviť odborníkom, skúseným v tejto oblasti podľa stavu, ktorý sa má liečiť a podľa všeobecného stavu pacienta.

Spôsob podávania terapeutickaj látky, určenej týmto vynálezom, môže byť akýkoľvek spôsob, ktorý dodáva látku hostiteľovi. Uvedené fúzne proteíny, protilátky, ďalej protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, alebo ich fragmenty, a farmaceutické kompozície, určené týmto vynálezom, sú osobitne užitočné na parenterálne podávanie, to znamená subkutánne, intramuskulárne, intravenózne alebo intranazálne.

Terapeutické látky podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť ako farmaceutické kompozície, obsahujúce účinné množstvo protilátky, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku (napríklad humanizovanej protilátky) podľa tohto vynálezu, ako účinnú súčasť vo farmaceutický prípustnom nosiči. Ako profylaktické činidlo podľa tohto vynálezu sa uprednostňuje vodná suspenzia alebo roztok, obsahujúci protilátku, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku, výhodne pufrovaný na fyziologické pH a vo forme pripravenej na vstreknutie. Kompozície na parenterálne podávanie budú bežne pozostávať z roztoku protilátky, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku, podľa tohto vynálezu, alebo z jej koktailu, rozpustenom vo farmaceutický prípustnom nosiči, výhodne vo vodnom nosiči. Môžu sa použiť rôzne druhy vhodných nosičov, napríklad 0,4 %-ný roztok soli, 0,3 %-ný roztok glycinu a podobné. Tieto roztoky sú sterilné a všeobecne bez cudzích látok. Tieto roztoky sa môžu sterilizovať bežnými, dobre známymi sterilizačnými spôsobmi (napríklad filtráciou). Uvedené kompozície môžu obsahovať farmaceutický prípustné pomocné látky, ako sa vyžaduje na priblíženie sa fyziologickým podmienkám, ako sú látky na nastavenie pH a pufrovacie látky, atď. Koncentrácia uvedenej protilátky, určenej týmto vynálezom, môže sa v týchto farmaceutických formuláciách meniť v širokom rozmedzí, napríklad od menej ako 0,5 %, zvyčajne od, alebo najmenej od 1 % až po 15 alebo 20 % (hmotnostné) a vyberie sa na základe objemov kvapalín, viskozít a podobne, vzhľadom na vybraný spôsob podávania.

Tak sa môže pripraviť farmaceutická kompozícia podľa tohto vynálezu na intramuskuláme injekcie s obsahom 1 ml pufrovanej vody a medzi asi 1 ng až po 100 mg, napríklad asi 50 ng až 30 mg, alebo výhodnejšie asi 5 mg až do 25 mg protilátky, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku podľa tohto vynálezu. Podobne sa môže pripraviť farmaceutická kompozícias podľa tohto vynálezu na intravenóznu infúziu s obsahom 250 ml sterilného Ringerovho roztoku a 1 mg až 30 mg a výhodne 5 mg až 25 mg protilátky, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku podľa tohto vynálezu. Vhodné spôsoby na prípravu parenterálne podávateľných kompozícií sú dobre známe, alebo sú zrejmé odborníkom v danej oblasti a sú podrobne opísané napríklad v Remmgton's Pharmaceutical Science, 15th. Mack Publishing Company, Easton, Pensylvania, USA.

Je výhodné, keď terapeutická látka podľa tohto vynálezu je vo farmaceutickom prípravku prítomná v forme jednotlivých dávok. Vhodnú terapeuticky účinnú dávku môže ľahko určiť odborník, skúsený v danom odbore. Na účinnú liečbu zápalových porúch človeka alebo iného živočícha má sa parenterálne podávať jedna dávka približne 0,1 mg až 20 mg proteínu alebo protilátky podľa tohto vynálezu na 70 kg telesnej hmotnosti, výhodne i. m. (intramuskuláme). Ak treba, táto dávka sa môže opakovane podávať vo vhodných intervaloch, určených lekárom počas odozvy zápalu.

Vynález tiež zahrnuje podávanie IL4 fúznych proteínov podľa tohto vynálezu konkurenčne alebo následne, s inými protilátkami alebo fúznymi proteínmi, vyznačujúcimi sa anti-IL4 účinnosťou, ako je faktor antitumorovej nekrózovej aktivity alebo ďalšie farmaceutické aktívne látky, porovnávateľné s receptorovou IL4 schopnosťou väzby fúznych proteínov podľa tohto vynálezu. Takéto ďalšie protilátky sú komerčne prístupné alebo sa môžu navrhnúť a skonštruovať podobným spôsobom, ako je tu uvedený.

Uvedené fúzne proteíny a protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku podľa tohto vynálezu možno tiež použiť v diagnostickom režime, ako na stanovenie IL4 sprostredkovaných porúch alebo na sledovanie postupu liečby takýchto porúch. Na použitie ako diagnostické činidlá môžu byť fúzne proteíny značkované na použitie v imunoanalýze ELISA a v ďalších bežných systémoch skúšok na meranie hladiny IL4 v sére, plazme alebo vo vhodných tkanivách. Podstata skúšok, v ktorých sa používajú fúzne proteíny, je bežná a nijako neobmedzuje tento vynález.

Uvedené protilátky, ďalšie protilátky, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, alebo ich fragmenty sa môžu lyoftlizovať pred uskladnením a rekonštituovať vo vhodnom nosiči pred ich použitím. Tento postup sa ukázal ako účinný s bežnými imunoglobulínmi. Môže sa využiť v danej oblasti známa technika lyofilizácie a rekonštitúcie.

Ďalej uvedené príklady ozrejmujú rôzne hľadiská tohto vynálezu vrátane príkladov konštrukcie protilátok, ktoré vznikli náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku a ich expresie s vhodnými vektormi a hostiteľskými bunkami. Príklady sa neuvádzajú preto, aby obmedzovali rozsah tohto vynálezu. Všetky aminokyseliny sú identifikované bežnými trojpísmenovými alebo jednopísmenovými kódmi. Všetky potrebné enzýmy, plazmidy a ďalšie činidlá a materiály sa získali z komerčných zdrojov, pokiaľ nie je uvedené inak. Všetky všeobecné klonové ligácie a ďalšia metodológia rekombinantných DNA sa použila podľa toho, ako sa uvádza v T. Maniatis et al., už citované, alebo v jej druhom vydaní (1989), eds. Sambrook et al., rovnaký vydavateľ ako u „Sambrook et al.“.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava MAb 3B9

A. Postup imunizácie

Štyri myši (hybridy F1 Balb/c a C57BL/6) sa subkutánne imunizovali s 50 gg rekombinantu E. coli a ľudského IL4 v Freundovom úplnom adjuvante a po 4 týždňoch sa prevakcinovali intraperitoneálne (i.p.) s 50 pg IL4 vo Freundovom neúplnom adjuvante. Po dosiahnutí dobrej hod noty titra protilátky séra k IL4, obdržala jedna myš ďalšie imunizácie 200 gg IL4 (i.p. v roztoku soli) v 8. týždni, dva dni neskôr 100 pg IL4 (i.p. v roztoku soli) a dva dni neskôr 50 pg IL4 (i.p. v roztoku soli). Po dvoch dňoch od poslednej imunizácie sa vykonala splenektómia.

B. Postup fúzie a spôsob vytriedenia

Na prípravu hybridom (bežným spôsobom, opísaným napríklad Kohlerom et al., Náture, 256: 495 (1975)) sa použili slezinové bunky myši, z ktorých sa >250 klonov buniek vytriedilo na základe sekrécie protilátky k IL4 s použitím komerčne dostupného systému BIAcore, a na základe väzby IIA podľa skúšky ELISA. Päť jamiek poskytlo pozitívnu odpoveď. Iba jeden kloň myši, 3B9, bol výrazne pozitívny. Všetky druhotné klony od 3B9 boli pozitívne.

Príklad 2

Skúška ELISA a konštatnty afinity

A. ELISA

Výberová skúška, vykonaná opísaným spôsobom, sa navrhla tak, aby bola mierou afinity pre prirodzený IL4 človeka.

Pre pokus 1 sa pripravili aldehydom aktivované 96-jamkové platne pokryté s IL4 pri 1 μg/ml, 100 μΐ/jamku v 0,1 M boritanovom pufri, pH 8,5 a cez noc sa inkubovali pri teplote miestnosti. hIL4 sa kovalentne viazal k platni. Roztok IL4 sa ašpiroval a nešpecifické väzbové (NSB - non-specific binding) miesta sa blokovali s 1 %-ným bovinným albuminovým sérom (BSA) v TBS pufri (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0,02 % NaN₃, pH 7,4) 60 minút pri 37 °C. Po tomto a vždy po každom ďalšom kroku sa platne opláchli 4 razy premývacím pufrom (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20, 0,02 % NaN₃, pH 7,4). Potom sa pridalo 50 μΐ hybridómového prostredia (alebo čistenej 3B9, alebo Fab fragmentov) a 50 gl skúšobného pufra (0,5 %-ný bovinný gamaglobulín v TBS pufri) a platne sa inkubovali pri 37 °C počas 60 minút. Pridalo sa sto mikrolitrov/jamku biotinylovanej proti-myšacej protilátky v skúšobnom pufri a rovnako sa inkubovalo pri 37 °C 60 minút. Pridalo sa 100 μΐ/jamku streptavidínu, konjugovaného alkalickou fosfatázou a inkubovalo sa (30 minút pri 37 °C). Pridalo sa 100 μΐ/jamku substrátu PNP a inkubovalo sa 30 minút pri 37 °C. Merala sa optická hustota pri 405 nm.

Pre pokus 2 sa inkubovali platne pokryté streptavidínom (100 gg/jamku, 1 gg/ml v fosfátovom soľnom pufri (PBS)) cez noc pri 4 °C, ktoré sa použili v ďalej opísanej skúške. Roztok streptavidínu sa ašpiroval, NSB miesta sa blokovali s 1 %-ným roztokom TBS pufra (60 minút pri 37 °C). Po tomto kroku a po každom ďalšom kroku sa platne premyli štyrikrát premývacím pufrom. Pridalo sa 50 μΙ biotinylovaného IL4 a 50 μΐ skúšobného pufra a inkubovalo sa 30 minút pri 37 °C. Potom sa pridalo 50 μΐ čisteného 3B9 IgG alebo Fab fragmentu (alebo hybridómového prostredia) s 50 gl skúšobného pufra, inkubovalo sa 60 minút pri 37 °C. Pridalo sa 100 μΐ proti-myšacieho IgG alkalického fosfatázového konjugátu a inkubovalo sa 60 minút pri 37 °C. Pridalo sa 100 μΐ PNP substrátu a inkubovalo sa 30 minút pri 37 °C. Merania sa vykonali ako hore.

B. Výpočet 3B9 afinity pre IL4

Použili sa výsledky meraní z uvedených skúšok a zhrnuli sa vo výpočte K_d pre 3B9 spôsobom, aký opisuje Beatty et al., J. Immunol. Methods, 100: 173 až 179 (1987):

i ^aff⁼ (2(Ab*J - [Ab]) kde Ab* je koncentrácia viazanej Ab pri 150 ng/ml biotinylovanom hlL4,

Ab je koncentrácia viazaného Ab pri 300 ng/ml biotinylovaného hIL4.

Dosociačné konštanty K_d sa vypočítali zo vzťahu:

K_{d =} ^Kaff

Pokus 1: skúška ELISA na streptavidínom pokrytých 96-jamkových platniach (100 ng/jamku). Kj = 2,2 . 1O¹⁰ M (3B9 Fab).

Pokus 2: skúška ELISA na streptavidínom pokrytých 96-jamkových platniach (100 ng/jamku). Kj = 1,4 . 10’¹⁰ M (3B9 IgG).

C. Špecifickosť

MAb 3B9 rozoznáva ľudský IL4, ale nerozoznáva bovinný alebo myšací IL4. Uvádza sa jeden zo spôsobov stanovenia uvedenej vlastnosti. Môže sa použiť ELISA s využitím 96-jamkovej platne, pokrytej protimyšacím IgG a následne blokovanej bovinným sérovým albumínom, na ktorý sa inkubovali 50 gl 3B9 (100 ng/ml), 25 gl IL4, nepochádzajúceho od človeka a 25 gl biotín-IL4 počas 60 minút pri 37 °C. Nasledovalo premytie, streptavidínová konjugovaná alkalická fosfatáza a PNP.

Podobne sa stanovilo, že aj MAb 6A1 nerozoznáva bovinný alebo myšací IL4.

Príklad 3

Humanizovaná protilátka

Navrhla sa jedna humanizovaná protilátka tak, aby obsahovala myšacie CDRs v štruktúre protilátky človeka. Táto humanizovaná verzia IL4 špecifickej myšacej protilátky 3B9 sa pripravila vykonaním nasledujúcich manipulácií.

A. cDNA klonovanie cDNA klony sa pripravili z 3B9 ťažkých a ľahkých reťazcov z mRNA, extrahovanej z 3B9 hybridómovej línie buniek [príklad 1] s použitím súpravy Boehringer Mannheim. Na syntézu prvej vetvy sa použili priméry, špecifické buď pre myšaciu príveskovú oblasť, alebo pre kappa-konštantnú oblasť.

Kappa(x)-reťazovýprimérje [SEQ ID NO: 29]: 5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3'

Primér s gama ťažkým reťazcom je [SEQ ID NO:30]: 5'GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC 3'.

Dvojvláknové cDNA sa klonovali priamo do plazmidov pGEM7f+ [Promega], ktoré sa potom transformovali do E. coli DH5-a [Bethesda Research Labs].

B. Sekvenovanie DNA

Sekvenovali sa myšacie cDNA klony s ôsmimi ťažkými a jedným ľahkým reťazcom z časti A. Výsledky sekvenovania premenných oblastí týchto klonov sú zrejmé v SEQ ID NO: 1, 2 a 4. Každý kloň obsahoval aminokyseliny, známe ako zachytené medzi myšacími premennými oblasťami s ťažkými reťazcami alebo s ľahkými reťazcami a medzi myšacími signálnymi sekvenciami. Súpis uvedených CDR aminokyselinových sekvencií je uvedený.

Uvedené CDR oblasti pre ťažké reťazce sú SEQ ID NO: 22, 24 a 26 (aminokyseliny 50 až 56, 71 až 86 a 119 až 129 z SEQ ID NO:4). Pozri obr. 2. Tieto sekvencie sú kódované s SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 a s SEQ ID NO:

25. Uvedené CDR oblasti pre ľahké reťazce sú SEQ ID NO: 16, 18 a 20 (aminokyseliny 45 až 58, 74 až 80 a 113 až 121 z SEQ ID NO: 2). Pozri obr. 1. Tieto sekvencie sú kódované s SEQ ID NO: 15, 17 a 19.

C. Výber štruktúr človeka

Po klonovaní 3B9 sa aminokyselinové sekvencie premennej oblasti (aminokyseliny 21 až 132 z SEQ ID NO: 2 a aminokyseliny 20 až 140 z SEQ ID NO: 4) porovnali s údajmi v banke údajov imunoglobulínových sekvencií človeka s použitím databázy KABAT® a databázy SWISS, s cieľom identifikovať štruktúru ľudských ťažkých a ľahkých reťazcov, ktoré by mali sekvenčnú homológiu čo najviac zhodnú s myšacím pôvodom. Popri týchto prieskumoch sekvenčnej homológie sa vyhodnocovali tiež ťažké a ľahké reťazce vzhľadom na polohovú databázu, vytváranú zo štruktúrnych modelov Fab domén na zistenie prípadného rozporu v dôsledku substitúcie aminokyselín, ktoré by mohli vplývať na zobrazenie CDR. V tomto prípade sa pri prieskume štruktúry nezistili nijaké výrazné rozpory. Preto sa použilo DNA kódovanie, odvodené zo záverov prieskumu sekvenčnej homológie.

Použili sa štruktúrne oblasti ťažkých reťazcov protilátky, získanej z myelómového imunoglobulínu (COR) človeka [E. M. Press a N. M. Hogg, Biochem. J., 117: 641 až 660 (1970)]. Zistilo sa, že táto sekvencia na úrovni aminokyselín bola približne na 77 % homológna (69,4 % zhodná) k 3B9 oblasti premenných reťazcov.

Ako vhodná premenná štruktúrna oblasť ľahkých reťazcov sa použila premenná štruktúrna sekvencia ľahkých reťazcov protilátky človeka, identifikovanej v H. G. Klobeck et al., Nucl. Acids Res., 13: 6515 až 6529 (1985). Zistilo sa, že uvedená sekvencia protilátky človeka je na úrovni aminokyselín približne na 80,2 % homológna (72 % zhodná) s myšacou 3B9 premennou oblasťou ľahkých reťazcov.

Z daných myšacích CDRs [SEQ ID NO: 15 až 26] a z uvedenej sekvencie protilátky človeka sa pripravil syntetický ťažký reťazec a vykonala sa PCR na doplnenie a znásobenie DNA. Tieto sekvencie sa syntetizovali nasledovným prekrývaním oligonukleotidov a znásobením pomocou PCR. SEQ ID NO: 31 až 37 poskytuje päť prekrývajúcich oligomérov a 2 PCR priméry. Zistilo sa, že oligo 1 [SEQ ID NO: 31] má rozsah báz 5 až 121, oligo 2 [SEQ ID NO:32] má rozsah báz 122 až 241 a oligo 3 [SEQ ID NO:33] ma rozsah báz 242 až 361. Uvedené dva spodné priméry SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 35 majú rozsahy báz 134 až 110 a 253 až 230. Všetky chyby mapovanej sekvencie, ktoré sa vniesli s PCR, sa opravili. PCR sa znova použila s využitím 5' primérových nukleotidov 1 až 25 SEQ ID NO 36 a ako 3' primérové nukleotidy sa použili nukleotidy 361 až 341 SEQ ID NO: 37.

Syntetická premenná oblasť sa podrobila ligácii do expresného vektora pCD pozdĺž signálnej sekvencie SEQ ID NO: 5 a 6 konštrukcie chimérového ťažkého reťazca pozdĺž IgGl konštantnej oblasti človeka. Syntetický V_H, nukleotid signálnej sekvencie a sekvencia aminokyselín sú na obr. 4 [SEQ ID NO:11 a 12]. Uvedené sekvencie aminokyselín z CDRs [SEQ ID NOS: 22, 24 a 26] sú zhodné s myšacími 3B9 CDRs. Kódujúce sekvencie pre tieto CDRs [SEQ ÍD NO: 54, 55 a 56] sa však odlišujú od myšacích 3B9 kódujúcich sekvencií [SEQ ID NOS: 21, 23 a 25], Výsledný expresný vektor IL4hzhcl-l -Pcd je znázornený na obr. 9.

Uvedené CDR génové oblasti predjestvujúcej ľahkej reťazcovej štruktúry boli odstránené reštrikciou a nahradené ďalej uvedenými IL-4 CDR génmi, ktoré sa pripravili synteticky.

Pre CDR 1:

SEQ ID NO: 38: 5'CTAGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCA ACTGCAAGG3'

SEQ ID NO: 39: CCTTGCAGTTGATGGTGGCCCTCTCGCCCAGAGAC ACAG

SEQ ID NO: 40 TCGAGAGGCCTCCCAAAGTGTTGATTATGATGGTG ATAGTTATATGAACTGGTATCAGCAGAAACCC SEQ ID NO: 41: GGGTTTCTGCTGATACCAGTTCATATAACTATCAC CATCATAATCAACACTTTGGGAGGCCTC

Pre CDR 2:

SEQ ID NO: 44: GGGCAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTACGCTGCATC CAATCTAGAATCTGGGGTAC

SEQ ID NO: 45: CCCAGATTCTAGATTGGATGCAGCGTAAATGAGCA ACTTAGGAGGCTGCCC

Pre CDR 3:

SEQ ID NO: 42: ATACTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCCGA GGTTCGGCGGAGGGAC

SEQ ID NO: 43: CTTGGTCCCTCCGCCGAACCTCGGAGGATCCTCAT TACTTTGCTGACAGTAGT

Uvedený syntetický V_L, nukleotid signálnej sekvencie a sekvencie aminokyselín sú na obr. 5 [SEQ ID NOS: 13 a 14], Uvedené sekvencie prvých dvoch CDRs [SEQ ID NOS: 16 a 18] sú zhodné so zodpovedajúcimi myšacími 3B9 CDRs. Kódujúca sekvencia pre prvú CDR [SEQ ID NO: 53] sa odlišuje od myšacej 3B9 kódujúcej sekvencie [SEQ ID NO: 15]. Ďalej, v poslednej CDR sa konštruovali dve humanizované zoskupenia z 3B9 aminokyselinovej sekvencie. Jedna [SEQ ID NO: 28] sa odlišuje jednou aminokyselinou [SEQ ID NO: 20] od prirodzenej myšacej sekvencie 3B9. SEQ ID NO: 28 je kódovaná s SEQ ID NO: 27. Uvedené premenné oblasti s ľahkými reťazcami sa podrobili ligácii do expresného vektora pozdĺž signálnej sekvencie [SEQ ID NO: 7 a 8]. Jeden z výsledných expresných vektorov IL4hzlc-1-Pen je znázornený na obr. 10.

Uvedené syntetické sekvencie ľahkých a/alebo ťažkých reťazcov sa použijú na konštrukciu humanizovanej protilátky.

Príklad 4

Expresia humanizovanej MAb v COS a CHO bunkách

Urobili sa pUC18 subklony V_H na pridanie signálnej sekvencie, pôvodne získanej z protilátky človeka SEQ ID NO: 5. Pre V_L sa urobili pUC18 subklony na pridanie signálnej sekvencie SEQ ID NO: 7.

Humanizovaný ťažký reťazec, odvodený z IgGj izotypu má na úrovni aminokyselín 89,3 %-nú homológiu (84,3 % zhody) s ťažkým reťazcom z 3B9 myši. Tento syntetický V_H predstavuje aminokyseliny 20 až 141 z SEQ ID NOS: 11 a 12.

Humanizovaný ľahký reťazec, ľudský kapa (k) reťazec, má 92,0 %-nú homológiu (86,6 % zhody) s 3B9 na úrovni aminokyselín. Tento syntetický V_L [aminokyseliny 21 až 1312 z SEQ ID NOS: 13 a 14], obsahujúci uvedené 3B9

CDRs sa navrhol a syntetizoval tak, ako sa uviedlo pre syntetické ťažké reťazce.

DNA fragmenty s príslušným signálom, pripojeným buď k humanizovaným ťažkým, alebo ľahkým premenným úsekom, sa vložili do expresných plazmidov, založených na pUC19, buniek cicavcov, obsahujúcich CMV promótory. Stále oblasti ťažkých reťazcov človeka alebo stále oblasti ľahkých reťazcov človeka z chiméry, vyrobené v príklade 5 (uvedený ďalej), sa spracovali bežnými spôsobmi [Maniatis et al., citácia hore] na získanie plazmidov IL4hzhcl-l-Pcd (ťažký reťazec) [obr. 9] a IL4hzlcl-o-Pcn (ľahký reťazec) [obr. 10]. Uvedené HZHC a HZLC plazmidy sú kotransfektované do COS buniek. Skúšky supematantov na prítomnosť humanizovanej protilátky pomocou opísanej ELISA sa vykonali po troch a piatich dňoch. Konštruovala sa aj ďalšia humanizovaná protilátka, ale s IgG4 izotypom.

Uvedené príklady opisujú príklady prípravy protilátky, ktorá vznikla náročným a cieľavedomým riadením jej vzniku. Podobnými postupmi prípravy sa môže postupovať pri vývoji ďalších protilátok, ktoré vzniknú náročným a cieľavedomým riadením ich vzniku, s použitím ďalších anti-IL4 protilátok (napríklad 6A1 - príklad 7), bežnými vývojovými spôsobmi.

Príklad 5

Konštrukcia chimérovej protilátky

A. Chimérový ťažký reťazec sa konštruoval izoláciou premennej oblasti ťažkých reťazcov myši z pôvodnej MAb 3B9 myši ako EcoRI-BstEII reštrikčný fragment. Navrhol sa a syntetizoval malý DNA oligomér na spojenie premennej oblasti myši a ľudskou IgGl stálou oblasťou (BstEII-ApaD:

5'primér: SEQ ID NO: 50: GTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGC 3'primér: SEQ ID NO: 51: CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACG

Tieto dva fragmenty sa podrobili ligácii do plazmidu pCD (pozri obr. 7) (digerovaním s EcoRI a Apal ). ktorý už kóduje stálu oblasť ľudského IgGl. Tento kloň neexprimuje; preto sa deletujú divoký typ 5'UTR a signálna sekvencia a nahradia sa s SEQ ID NO: 5 a 6.

Nakoľko nie sú dosažiteľné príhodné reštrikčné endonukleázové miesta na konci 3'signálnej sekvencie, vloží sa BstEll miesto (to znamená tichá mutácia) pomocou PCR. Použijú sa ďalej uvedené PCR priméry:

SEQ ID NO: 48: 5' primér: 5OAGGTTACCCTGAAAGAGTC3' SEQIDNO: 49: 3'primér: 5'GAAGTAGTCCTTGACCAG3'.

BstEII reštrikčný fragment sa potom izoloval z tohto plazmidu. Navrhla sa a syntetizovala nová signálna sekvencia a nový 5'UTR, ktoré majú EcoRI a BstEII konce. SEQ ID NO: 46: 5' primér: AATTCGAGGACGCCAGCAACATGGTGTTGCAGAC CCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGG TGCCTACGGGCAG SEQ ID NO: 47: 3' primér: GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGAGCA ACAGAGAAATGAAGACCTGGGTCTGCAACACCAT GTTGCTGGCGTCCTCG

Chimérový ľahký reťazec sa konštruoval využitím PCR spôsobu na pôvodný ľahký reťazec z 3B9 myši, ktorý sa klonoval do pGEM72f(+) [Promega], Použité priméry boli komerčne dostupné: pUC18 univerzálny reverzný primér v

5' konci (EcoRI) a 3' primér, ktorý vkladá NarI miesto [5'CATCTAGATGGCGCCGCCACAGTACGTTTGATCT

CCAGCTTGGTCCC3', SEQ ID NO: 52], zvyčajne použité na fúziu premennej oblasti myši k stálej oblasti človeka. Táto premenná oblasť sa potom podrobila ligácii do expresného vektora pCDN (ECORI Narl) (obr. 8), ktorý už obsahuje kappa oblasť človeka.

Supernatanty prostredia sa odoberali po troch a piatich dňoch a analyzovali pomocou ELISA nasledovne: ELISA platne sa pokryli s 0,1 gg protilátky kozy, špecifickej k Fc oblasti protilátkam človeka. Supemantanty prostredia sa pridali na jednu hodinu. Pridala sa chrenovou peroxidázou konjugovaná kozia protilátka, špecifická k úplnej ľudskej IgG protilátke. Potom nasledovalo pridanie ABTS peroxidázového substrátu (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) na jednu hodinu. Zistila sa expresia chimérovej protilátky. V druhej skúške ELISA sa COS bunkový supematant, obsahujúci chimérovú protilátku viazal špecificky k rekombinantnému ľudskému IL4 proteínu. Tento výsledok potvrdil, že sa kódujúce gény pre protilátku špecifickú k IL4 klonovali.

B. Humanizovaný ťažký reťazec sa môže tiež získať z uvedeného chimérového ťažkého reťazca. Humanizovaný ťažký reťazec sa z neho navrhol tak, že sa vložia CDRs myši do štruktúry z človeka. Zvolená ľudská štruktúra je rovnaká, ako sa už opísala a podľa údajov v banke proteínových údajov SWISS má najväčšiu homológiu proteínovej sekvencie vzhľadom na 3B9 V_H myši (aminokyseliny 20 až 140 z SEQ ID NO: 4). Táto humanizovaná sekvencia ťažkého reťazca (EcoRI Apal) sa pripravila synteticky a použila sa PCR na doplnenie a znásobenie DNA, ako sa už opísalo. Táto syntetická premenná oblasť sa podrobila ligácii do expresného vektora pCD (EcoRI Apaľ) spolu so signálnou sekvenciou SEQ ID NOS: 5 a 6 z chimérovej konštrukcie ťažkého reťazca a z IgGi stálej oblasti z človeka.

Podobne ako pre ťažký reťazec sa môže odvodiť humanizovaný ľahký reťazec z chimérového ľahkého reťazca. Tento gén (EcoRV Narl] sa tiež pripravil synteticky. Humanizovaný VL sa podrobil ligácii do expresného vektora pCN, digeroval sa s EcoRI Narl zároveň so signálnou sekvenciou (EcoRI EcoRV). Uvedený expresný vektor predstavuje kapa stálu oblasť z človeka.

Príklad 6

Čistenie a termodynamika - Humanizovaná MAb

Čistenie CHO exprimovanej chimérovej a humanizovanej 3B9 sa môže dosiahnuť bežnou proteínovou A (alebo G) afinitnou chromatografiou s iónovou výmennou a chromatografiou s molekulovým sitom. Obdobne postupy sa úspešne použili na čistenie na >95 %-nú čistotu iných MAbs (napríklad antigénov respiračného syncytiálneho vírusu a cirkumsporozoitov malárie).

Afinita a podrobná termodynamika väzby IL4 k humanizovanej protilátke 3B9 ak 3B9 myši (príklad 1) sa stanovila titračnou mikrokalorimetriou. Týmto spôsobom sa stanovujú väzbové reakcie veľkosťou ich skutočných reakčných tepiel (pozri napríklad, Wiseman et al., Anál. Biochem., 179: 131 až 137 (1989). Zistilo sa, že afinity obidvoch MAbs sú príliš malé, aby sa merali pri teplote okolia. Potom sa zvolií nasledujúci termodynamický prístup: i) afinita sa merala pri 60 °C, kedy už je dostatočná na priame meranie a ii) merala sa teplotná závislosť entalpie väzby od 30 do 60 °C. Uvedené údaje potom spolu umožnili výpočet afinity v širokom rozsahu teplôt s využitím Gibbsovej-Helmholzovej rovnice.

V tabuľke 1 je zhrnutá termodynamika väzby 1L4 humanizovaných protilátok a protilátok 3B9 myši. Na základe zmien Gibbsovej energie, entalpie, entrópie a tepelnej kapacity uvedených dvoch protilátok, je termodynamika ich väzby nerozlišiteľná.

Tabuľka 1

Termodynamika hIL-4 väzby k humanizovanému 3B9 a k 3B9 myši pri pH 7,4, 150 mM NaCl a pri teplote 25 °C
Parameter	Humanizovaná 3B9	3B9 myši
Kd/picomoly	11	19
Zmeny:
Gibbsovej energie kJ/mol IL4	57 ± 2,5	56 ± 2,5
Entalpie, kJ/mol IL4	91 ±8	86 ±4
-T. delta S,
kJ/mol IL4	34 ±9	30±5
tepelnej kapacity J/molIL4.K	2430 ± 670	2760 ± 840

IL4 afinity humanizovaného 3B9 sa merali štvormo a 3B9 myši a dvojmo.

Príklad 7

Príprava a chrakterizácia MAb krysy

MAb 6A1, ktorá sa vybrala vzhľadom na jej vysokú afinitu väzby, odvodila sa z imunizovanej krysy, použitím rovnakého imunizačného protokolu, ako sa opísalo v príklade 1 pre myš. 6A1 sa vybrala z hybridómov (bližšie z hybridómu 3426A11C1B9), pripravených z krýs, imunizovaných ľudským IL4.

Disociačná konštanta K_c pre 6A1 sa vypočítala spôsobom, uvedenom v Beatty et al., J. Immunol. Methods, 100: 173 až 179 (1987) a bola 2.IO'¹⁰M.

Hybridom 3426A11C1B9 sa uložil 6. októbra 1993 v Európskej zbierke živočišných bunkových kultúr (ECACC), Public Health Laboratory Service Center for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdom pod prístupovým číslom 93100620 a bol uznaný ako patentový depozit v súlade s Budapeštianskou dohodou z 1977, upravujúcou ukladanie mikroorganizmov na účely patentového pokračovania.

Príklad 8

Biologická účinnosť MAbs: 3B9 (humanizovanej), 3B9 (myši) a 6A1

Vykonali sa skúšky opísaným spôsobom.

A. Väzba ku glykosylovanému rhIL4

Vyznačené protilátky sa pestovali s neglykosylovaným rekombinantným ľudským IL4 (rhIL4), ktorý je produkovaný E. coli. Pretože prirodzený ľudský IL4 je glykosylovaný, bolo dôležité potvrdiť väzbu k bunkami cicavcov sekretovanému materiálu. 3B9 sa viaže rovnako dobre k obidvom glykosylovanému a neglykosylovanému ľudskému rekombinantnému IL4 a nie je preto usmernený na epitop, ktorý by bol maskovaný na prirodzený ľudský IL4.

B. Inhibícia väzby IL4 k receptoru

Schopnosť 3B9 inhibovať väzbu IL4 k jeho receptoru sa študovala s využitím ¹²⁵I - rhIL4 väzby k bunkovej línii gibona MLA [ATCC TIB201], ktorá je nositeľom približne 6000 receptorov na jednu bunku. MLA bunky sa inkubovali s ¹²⁵I - IL4 počas 30 minút pri 37 °C . Rádioktivita sa stanovovala gama-snímačom po oddelení bunkami viazaného ^,25I - IL4, odstredením s gradientom oleja. Nešpecifické väzby sa stanovili inkubáciou za prítomnosti 100 násobného molového nadbytku neznačkovaného IL4 [Park et al., J. Exp. Med., 166: 476 až 488 (1987)]. Hodnoty IC₅₀ pre neznačkovaný IL4 v tejto skúške boli 22 pM, ak množstvo (pridaného) IL4 bolo 83 pM. Neporušený myšací (IgG) 3B9 mal IC₅₀ hodnotu 63 pM, a 93 pM mal fragment Fab. Pri inej koncentrácii IL4 (218 pM) výsledok skúšky pre myšací (IgG) 3B9 bol 109 pM.

C. Inhibícia lymfocytovej proliferácie

Použitím spôsobu, opísaného v Spits et al., J.Immunol. 139: 1142 až 1147 (1987) sa periférne krvné lymfocyty človeka inkubovali tri dni s fytohemaglutinínom a T-bunkovým mitogénom na reguláciu IL4 receptora. Výsledné blastové bunky sa potom stimulovali ďalšie tri dni s IL4. Proliferácia sa merala pomocou vloženého ³H tymidínu. Proliferácia B buniek sa merala skúšobným postupom podľa Callarda et al., v Limphokines and Interferons, A Practical Approach, kapitola 19, strana 345, upraveným, ako je uvedené v ďalšom texte. Čistené tonsiláme B bunky človeka sa stimulujú počas 3 dní s IL4 a imobilizujú pomocou anti-IgM. Proliferácia sa merala pomocou vloženia ³H tymidínu.

3B9 (myši) inhiboval zabudovanie ³H tymidínu periferálnymi krvnými T lymfocytmi človeka, stimulovanými s 133 pM IL4 a tonsilámymi B lymfocytmi, stimulovanými s 167 pM IL4. IL2-stimulované T lymfocyty neboli ovplyvnené. Hodnota IC₅o pre inhibíciu proliferácie T buniek bola 30 pM a pre proliferáciu B buniek bola 103 pM. Uvedené hodnoty pre fragment Fab z 3B9 (myši) boli 108 a 393 pM.

D. Inhibícia indukcie CD23

CD23 je receptor s nízkou afinitou k IgE(FcERIl) a je na membráne ostávajúcich B lymfocytov indukovaný nízkou koncentráciou IL4 ako nevyhnutného predpokladu produkcie IgE. Čistené tonsiláme B bunky človeka sa stimulovali počas dvoch dní s IL4. Prietokovou cytometriou [Defrance et al., J.Exp.Med., J_65: 1459 až 1467 (1987] sa stanovil percentuálny podiel buniek, exprimujúcich receptor CD23. 3B9 (myši) inhiboval expresiu CD23 na tonsilámych B lymfocytov človeka, stimulovaných s 8,3 pM IL4 a IC₅₀ hodnotou 136 pM.

E. Inhibícia sekrécie IgE

Na rozdiel od ostatných skúšok, v ktorých sa IL4 pridával v ED₅₀ koncentráciách [Pere et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 6880 až 6884 (1988)] a v snahe znížiť rozptyl meraní, vlastný týmto systémom, sekrécia IgE sa hodnotila za prítomnosti takej koncentrácie IL4, pri ktorej nastávala najväčšia sekrécia. Proliferácia T buniek sa merala ďalej uvedeným spôsobom. Periférne krvné lymfocity človeka sa inkubovali s IL4 v čase od 10 do 18 dní, prednostne 12 dní. V kultúre supematanta sa koncentrácia IgE stanovila spôsobom ELISA.

Sekrécia IgE sa inhibovala s 3B9 (myši) a Fab fragmentom z 3B9; za prítomnosti 1,7 nM IL4 sa získali IC₅₀ hodnoty 1,9 a 5,0 nM. Pokus sa opakoval s použitím koncentrácie 667 pM 1L4, čím sa znížila IC₅₀ hodnota pre 3B9 (myši) na 0,65 nM. Molový pomer protilátky (IgG) k 1L4 ostal nezmenený (1:1) v celom rozsahu skúšaných koncentrácií.

F. Súhrn a interpretácia údajov

Molové pomery IL4 k rôznym protilátkam, nevyhnutné na 50 %-nú inhibíciu funkcie v biopokusoch, sa uvádzajú v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Porovnávacie aktivity mAbs 3B9, 6A1 a humanizovaného 3B9 [varianty IgGl a IgG4] b IL4 závislých bioskúškach
Skúška	| IC50 (pM)[rozsah]„
	3B9 (myši)	(Fab) 3B9 myši	6A1 krysy	H+-3B9
				IgGl	IgG4*
RBA	63[17-109]2	93	>5000
T bunka	30[10-40]4	108	87	44[60-56]j	40
B bunka	103[79-120],	393	187	47[10-80]3	79
CD23 indukcia	136[53-272]4	216	80	333
IgE syntéza	658[370-1070]6	1170	623[412-833]2	54[35-83]3	406

n - počet oddelene vykonaných skúšok * - varianty IgGl a IgG4 sa skúšali v rozdielnych časoch H+ = humanizovaný

Pri všetkých skúškach s výnimkou sekrécie IgE sa pridal IL4 v približne ED₅₀ koncentráciách. Molové pomery protilátky k IL4, potrebné na 50 %-nú inhibíciu, boli podobné pri humanizovanom 3B9, myšacom 3B9 a 6A1 v dvoch lymfocytových proliferačných skúškach, ale boli vyššie pri humanizovanom 3B9 pri skúške indukcie CD23. Posledne uvedená je osobitne citlivá skúška vyžadujúca skutočne veľmi nízku (5 %) receptorovú obsadenosť (Kruse et al., EMBO J., 12: 5121 (1993)) a ako je zrejmé zo získaných výsledkov s 3B9 myši, vnútorný rozptyl skúšky je značný.

Porovnanie účinností 6A1 krysy a 3B9 myši dáva podobný profil funkčných vplyvov, ale s neočakávaným účinkom 6A1 na úplnú inhibíciu väzby rádiojódom značkovaného IL4 k jeho receptoru. Rádiojódovaný IL4, použitý v skúške väzby na receptor, sa považuje za jódovaný v prístupnom tyrozíne, zvyšok 124. Keď sa porovnala schopnosť 6A1 inhibovať CD23 expresiu, vyvolanú buď neznačkovaným, alebo jódovaným IL4, sa zistilo, že inhibícia bola menej účinná proti jódovanému ligandu. Tieto výsledky poukazujú na to, že 6A1 viaže k IL4 v oblasti tyrozínu 124, ale nie špecificky.

Tak podľa súčasných údajov je 6A1 neutralizačnou protilátkou s vysokou afinitou, ktorá sa viaže k značne rozdielnej oblasti IL4 ako 3B9.

Príklad 9

Farmakokinetika

Farmakokinetika humanizovaného 3B9 sa skúmala na samčekoch krysy Sprague Dawley. Humanizovaná 3B9 sa podávala štyrom zvieratám iv bolusová dávka 1 mg/kg. Krv sa vzorkovala nepretržite 5 týždňov po podaní dávky. Koncentrácie plazmy humanizovanej 3B9 sa stanovovali použitím IL-4/anti-humánnej IgG sendvičovou ELISA skúškou, navrhnutej tak, aby potvrdila nielen prítomnosť cirkulujúceho ľudského IgG, ale tiež jeho schopnosť viazať sa k rekombinantnému ľudskému 1L4.

Výsledky tohto štúdia sú zhrnuté v tabuľke 3.

Tabuľka 3

Farmakokinetika humanizovaného 3B9 v samčekoch krýs Sprague-Dawley (dávka: 1 mg/kg iv bolusy)

	Clp (ml/h . kg)
Krysa 1	0,442
Krysa 2	0,655
Krysa 3	0,555
Krysa 4	0,447
stredná hodnota	0,525
štandardná odchýlka	0,101

Skratka farmakokinetického parametra Clp je zdanlivá čistota plazmy (plasma clearance)

Údaje ukazujú, že rozptyl skúšky medzi jednotlivými zvieratmi je pomerne malý a úbytok humanizovenej 3B9 z plazmy sa javil ako dvojfázový. Zdanlivá čistota plazmy bola nízka (0,5 ml/h.kg). Polčas životnosti bol 11 dní. Farmakokinetické charakteristiky od CHO buniek odvodeného humanizovaného 3B9 sú konzistentné s ostatnými humanizovanými monoklonovými protilátkami v krysách. Dlhá životnosť humanizovaného 3B9 v kryse tiež umožňuje predpokladať, že pri podávaní človeku bude humanizovaná 3B9 tiež podobne účinná v predĺženom časovom úseku.

Početné úpravy a zmeny tohto vynálezu sú zahrnuté v opísaných určeniach a prepokladá sa, že sú zrejmé odborníkovi, skúsenom v danej oblasti. Na konštrukciu humanizovaných protilátok sa napríklad môžu použiť štruktúrne oblasti človeka alebo ich modifikácie, iné ako sú príkladné opísané protilátky. Takéto modifikácie alebo zmeny v zložení, alebo spôsoboch podľa tohto vynálezu sa považujú za zahrnuté v rozsahu pripojených nárokov.

Zoznam sekvencii (1) Všeobecná informácia:

(i) Prihlasovateľ: Holmes, Stephen D.

Gross, Mitchell S. Sylvester, Daniel R.

(ii) Názov vynálezu: Fúzny proetín so špecifickou väzbou na ľudský interleukín-4 a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom (iii) Počet sekvencii 58 (iv) Adresa na korešpondenciu:

(A) Adresát: SmithKline Beecham Corporation (B) Ulica: Corporate Intellectual Property, UW2220-709 Wwedeland Rd.

(C) Mesto: King of Prussia (D) Štát: Pensylvania (E) Krajina: USA (F) Poštový kód ZIP: 19406-2799 (v) Počítačom čitateľná forma:

(A) Typ média: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln Release#1.0, Verzia#1.25 (vi) Údaje tejto prihlášky:

(A) Číslo prihlášky: US 08/117,336 (B) Dátum podania: 7. september 1993 (C) Zatriedenie:

(A) Číslo prihlášky: US 08/136,783 (B) Dátum podania: 14. október 1993 (C) Zatriedenie:

(vii) Informácie o právnom zástupcovi/agcntovi (A) Meno: Sutton, Jeffrey A.

(B) Registračné číslo: 34.028 (C) Jednacie číslo: P50186-2 (ix) Telekomunikačná informácia:

(A) Telefón: (215) 270-5024 (B) Fax: (215)270-5090

2. Informácia o SEQ ID NO: 1:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 396 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...396 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

ATG

GAG ACA

GAC

ACA

ATC

CTG

CTA

TGG

GTG

CTG

C7G

CTC

TGG

GTT

CCA

48

Met

Glu Thr

Asp

Thr

íle

Leu

Leu

Trp

val

Leu

Leu

Leu

Trp

val

Pro

1

$

10

15

GGC

TCC ACT

GGT

GAC

AT?

GTG

CTG

ACC

CAA

TCT

CCA

GCT

TCT

T7G

GCT

96

Gly

Ser Thr

Gly

Asp

íle

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

20

25

30

GTG

TCT CTA

GGG

CAG

AGG

GCC

ACC

ATC

TCC

TGC

AAG

GCC

AGC

CAA

AGT

144

Val

Ser Leu

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

Tie

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

GTT

GAT TAT

GAT

GCT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCA

192

Val

Asp Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

50

S5

60

GGA

CAG CCA

CCC

AAA

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

240

Gly

Gin Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

íle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

65

70

75

80

GGG

ATC CCA

GCC

AGG

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

288

Gly

íle Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

as

90

95

CTC

AAC ATC

CAT

cct

GTG

GAG

GAG

GAG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

TAC

TGT

336

Leu

Asn íle

His

Pxo

Val

Glu

Glu

Glu

Aap

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

100

105

110

CAG

CAA AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CCG

ACG

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

384

Gin

Gin Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

115 120 125

GAA ATC AAA CGG

Glu íle Lys Arg

130 (2) Informácia o SEQ ID NO: 2:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 132 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna

396 (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

Met Glu Thr Asp Thr íle Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pre

J

10

15

Gly

Ser

Thr

Gly

ASp

íle

val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

20

25

30

Val

Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

11«

Ser

cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Het

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

50

55

60

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

11«

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

65

70

?S

80

Gly

íle

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

85

90

95

Leu

Asn

Zle

H1S

PrO

Val

G1U

Glu

Glu'

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

100

105

110

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly'

Thr

Lys

Leu

115

120

125

Glu íle Lys Arg

130 (2) Informácia o SEQ ID NO: 3:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 483 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 64...483 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

(A) Dĺžka: 240 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

Met

Asn

Arg

Leu

Thr

Ser

Ser

Leu

Leu

Leu

Leu

íle

val

Pro

Ala

Tyr

1

5

10

15

Val

Leu

Ser

Gin

Val

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

íle

Leu

Gin

20

25

30

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

35

40

45

Ser

Thr

Ser

Gly

Mat

Gly

Val

Ser

Trp

íle

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

Lys

50

55

60

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

íle

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

Tyr

65

70

75

80

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

íle

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Ser

85

90

95

Asn

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

íle

Thr

Ser

Val

Asp

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

100

105

110

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg.

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

Asp

115

120

125

Val

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

135

140

(2) Informácia o SEQ ID NO: 5:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 60 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...60 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:

GAATTCGCGG CCGCTATGCA GGGÁCAAICX GCAGCAGČAA TGAGGAAGTA AGCCTGTGCA $0

GAI ATG

AAC

AGG Arg

CTT ACT

TCC TCA Ser Ser

TTG CTG CTG CTG ATT GTC CCT GCA

108

Het X

Uu

Thr 5

Uu Leu

Uu Leu 10

íle Vel Pro Ala 15

TAT

GTC

CTG

TCC

CAG

GTT

ACT

CTG

AAA

GAG

TCT

GGC

CCT

GGG

ΑΤΛ

TTG

156

Tyr

val

Leu

Ser

Gin

Val

Thr

Uu

lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

íle

Uu

20

25

30

CAG

CCC

TCC

CAG

ACC

CTC

AGT

CTG

ACT

TGT

TCT

TTC

TCT

CGG

TTT

TCA

204

Gin

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Uu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

CTG

AGC

ACT

TCT

GGT

ATG

GGT

GTG

AGC

TGG

ATT

CGT

CAG

CCT

TCA

GGA

252

Uu

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

val

Ser

Trp

íle

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

SO

55

60

AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

CTG

GCA

CAC

ATT

TAC

TGG

GAT

GAT

GAC

AAG

CGC

300

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Uu

Ala

His

íle

Tyr

Trp

Asp

A«P

Asp

Lys

Arg

6‘

70

75

TAT

AAC

CCA

TCC

CTG

AAG

AGC

CGG

CTC

ACA

ATC

TCC

AAG

GAT

ACC

TCC

348

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Uu

Thr

íle

set

LyS

ASp

Thr

Ser

80

85

90

95

AGC

AAC

CAG

GTA

TTC

CTC

AAG

ATC

ACC

AGT

GTG

GAC

ACT

GCA

GAT

ACT

396

Ser

Asn

Gin

val

Phe

Uu

Lys

íle

Thr

Ser

Val

AJp

Thr

Ala

Asp

Thr

100

105

110

GCC

ACA

TAC

TAC

TCT

GCT

CGA

AGA

GAG

ACT

GTG

TTC

TAC

TGG

TAC

ITC

444

Ala

Thr

Ty‘r

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

11S

120

125

GAT

GTC

TGG

CGCGCA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

4B3

Asp

Val

Trp

Gly Ala

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

ATG GTC TTG CAG ACC CAG GTC· TTC ATT TCT CTG TTG CTC TGG ATC TCT 48

Het Val Leu Gin Thr Gin Val Phe íle Ser Leu Leu Leu Trp íle Ser

5 10 15

GGT GCC TAC GGG

Gly Ala Tyr Gly (2) Informácia o SEQ ID NO: 6:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:

Het Val Leu Gin Thr Gin Val Phe íle Ser Leu Leu Leu Trp íle Ser

Gly Ala Tyr Gly (2) Informácia o SEQ ID NO: 4:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(2) Informácia o SEQ ID NO: 7: (i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 57 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...57 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 7:

(2) Informácia o SEQ ID NO: 10:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 141 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:

ATG	GGA	TGG AGC	TGT	ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT	ACA	GGT	48
MíC	Gly	Trp Ser	Cya	11« 11« Leu.Phe Uu Val Ala Thr Ala	Thr	Gly
1			5	10	15
GTC	CAC	TCC					57
Val	His	Ser

(2) Informácia o SEQ ID NO: 8:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 19 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:

Met Gly Trp Ser Cys íle íle Leu Phe Leu Val Ala Thr Ale Thr Gly 15 10 1S

Val His Sex

Met

Val

Leu

Gin

Thr

Gin

val

Phe

íle

Ser

Leu

Uu

Leu

Trp

íle

Ser

1

5

10

15

Gly

Ala

Tyr

Gly

Gin

Val

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

íle

Leu

20

25

30

Gin

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Uu

Thr

Cys

Ser

Phe

Sex

Gly

Phe

Ser

35

40

45

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Nec

Gly

Val

Ser

Trp

íle

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

50

55

60

Lys

Cly

Uu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

íle

Tyr

Trp

Asp

A3p

Asp

Lys

Arg

65

70

75

80

Tyr

Mn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ila

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Asn

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

íle

Thr

Ser

val

Asp

Thr

Ala

ASp

Thr

100

105

110

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

T£p

Tyr

Phe

115

120

125

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

130

135

140

(2) Informácia o SEQ ID NO: 9:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 423 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...423 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:

ATG GTG TTG

CAG ACC CAG GTC TTC

ATT TCT CTG TTG CTC TGG ATC TCT

48

Nec 1

Val

Leu

Gin Thr Gin 5

Val Phe

íle

Ser 10

Leu Leu

Uu

Trp

11« 15

Ser

GGT

GCC

TAC

GGG

CAG

GTT

ACC

CTG

AAA

GAG

TCT

GGC

CCT

GGG

ATA

TTG

$6

Gly

Ala

Tyr

Gly

Gin

Val

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

íle

Leu

20

25

30

CAG

CCC

TCC

CAG

ACC

CTC

AGT

CTG

ACT

TGT

TCT

TTC

TCT

GGG

TTT

TCA

144

Gin

Pro

Ser

Gin

Thr

Uu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

CTG

AGC

act

TCT

GGT

ATG

GGT

GTG

AGC

TGG

ATT

CGT

CAG

CCT

TCA

GGA

192

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Het

Gly

Val

Ser

Trp

íle

Arj

Gin

Pro

Ser

Gly

50

SS

60

AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

CTG

GCA

CAC

ATT

TAC

TGG

GAT

GAT

GAC

AAG

CGC

240

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

his

íle

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

65

70

75

80

TAT

AAC

CCA

TCC

CTG

AAG

AGC

CGG

CTC

ACA

ATC

TCC

AAG

GAT

ACC

TCC

2ΘΒ

Tyr

Asn

Pro

Ser

Uu

Lys

Ser

Arg

Uu

Thr

11«

Ser

lys

Asp

Thr

Ser

85

90

95

AGC

AAC

CAG

GTA

TTC

CTC

AAG

ATC

ACC

AGT

GTG

GAC

ACT

GCA

GAT

ACT

336

Ser

Asn

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

íle

Thr

Ser

val

Asp

Thr

Ala

Asp

Thr

100

105

110

GCC

ACA

TAC

TAC

TGT

GCT

CGA

AGA

GAG

ACT

GTG

TTC

TAC

TGG

TAC

TTC

334

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

115

120

125

GAT

GTC

TGG

GGC

GCA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

423

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr

Thr

val

Thr

Val

Ser

Sex

(2) Informácia o SEQ ID NO: 11:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 423 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...423 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 11:

130 135 140

ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC TTC A7T

Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe11«

GCT GCC TAC GGG CAG GIT ACC CTGCGT

Gly Alt Tyr Gly Gin Val Thr La uArg

2025

AAA CCG ACC CAG ACC CTG ACC TTA ACC Lys Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr 3540

CTG TCG ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser SOS5

AAA GGT CTA GAA TGG CTG GCT CAC ATC Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Wls Ila 6570

TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC CGT CTG Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu 05

CGT AAC CAG GTT GTT CTG ACC ATG ACT

Axg Asn Gin Val Val Leu Thr Met Thr

100 105

TCT CTG TTG CTC TGG ATC TCT4 B

Ser Leu Leu Leu Trp íle Ser

1015

GAA TCC GGT CCG GCA CTA GTT96

Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val

TGC ACC TTC TCC-GGT TTC TCC144 cys Thr Phe Ser Gly Phe ser

TGG ATC CCT CAG CCG CCG GGT192

Trp Íle Arg Gin Pro Pro Gly

TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT240

Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg

7580

ACC ATA TCC AAA GAC ACC TCC288

Thr íle Ser Lys Asp Thr Ser

9095

AAC ATG GAC CCG GTT GAC ACC336

Asn Met Asp Pro Val Asp Thr

110

CCT ACC TAC TAC TGC GCT CGA CGC GAA ACC Gt

TTC TAC TGG TAC TTC

384

115

Arg Arg Glu

120 rhr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe

125

GAC CTT TGG GGT CGT GGT ACC CCA GTT ACC GTG AGC TCA Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

423

130

13$

140 (2) Informácia o SEQ ID NO: 12:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 141 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:

(B) Polohy: 1...393 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 13:

ATG Met 1

GGA TGG

AGC TGT Ser Cys s

ATC íle

ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT

4Θ

Gly

Trp

íle

Leu

Phe

Leu val 10

Ala Thr

Ala Thr Gly 15

GTC

CAC

7CC

GAT

ATC

GTG

ATG

ACC

CAG

TCT

CCA

GAC

TCG

CTA

GCT

CTG

96

val

His

Ser

Asp

11«

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

A»P

Ser

Leu

Ala

val

20

25

30

TCT

CTG

GGC

GAG

AGG

GCC

ACC

ATC

AAC

TGC

AAG

GCC

TCC

CAA

AGT

GTT

144

Sex

Leu

Cly

Clu

A*g

Ala

Thr

11«

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Sex

Val

3S

40

<5

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

CCC

GGG

192

Asp

Tyr

Α’Ρ

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

50

55

50

CAG

CCT

CCT

AAG

TTG

CTC

ATT

TAC

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

GGG

240

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

íle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

65

70

75

80

GTA

CCT

GAC

CGA

TTC

AGT

GGC

AGC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTG

2B8

Val

Pro

ASp

Axg

Phe

Sex

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

83

90

95

ACC

ATC

AGC

AGC

CTG

CAG

GCT

GAA

GAT

GTG

GCA

GTA

TAC

TAC

TGT

CAG

336

Thr

íle

Ser

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

cys

Gin

100

105

110

CAA

AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CCG

AGG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAG

384

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pxo

Arg

Phe

Gly Gly Gly

Thr

Lys

Val

Glu

115

120

125

ATC AAA CGT 3J3 tie Lys Arg

130 (2) Informácia o SEQ ID NO: 14:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 131 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 14:

Met

Val

Leu

Gin

Thr

Gin

Val

Phe

íle

Ser

Leu

Leu

Leu

Trp

Zle

Ser

1

5

10

13

Gly

Ala

Tyr

Gly

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pre

Ala

Leu

Val

20

25

30

Lys

Pro

Thr

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

3S

40

45

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

val

Ser

Trp

íle

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

50

55

60

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

Zle

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

65

70

75

eo

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Zle

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

85

90

95

Arg

Asn

Gin

Val

Val

Leu

Thr

Met

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Val

Asp

Thr

100

105

110

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

115

120

125

Asp

val

Trp

Gly

Arg

Gly

Thr

?ro

val

Thr

val

Ser

Ser

130

135

140

Met

Gly

Trp

ser

Cys

íle

íle

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr Ala

Thr

Gly

1

5

10

15

Val

His

Ser

Asp

íle

val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Ser Leu

Ala

Val

20

25

30

Ser

Leu

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Zle

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser Gin

Ser

val

35

40

45

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Tip

Tyr

Gin

Gin Lys

Pro

Gly

50

55

60

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

íle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu Glu

Ser

Gly

65

70

75

80

Val

Pro

ASp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp Phe

Thr

Leu

85

90

95

Thr

íle

Ser

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

ASp

Val

Ala

Val

Tyr Tyr

Cys

G'ln

100

105

110

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Arg

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr Lys

Val

Glu

115

120

125

íle Lys Arg

130 (2) Informácia o SEQ ID NO: 13:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 393 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (2) Informácia o SEQ ID NO: 15:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 45 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...45 (xi) Opis sekvencie: SEQ IDNO: 15:

XAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GM GGT GAT AGT TAT ATG AAC

Lys Ala Ser Gin Ser val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

S 10 ¹⁵ (2) Informácia o SEQ ID NO: 16:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 15 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 16:

Lys Ala Sex Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Set Tyr Het Asn

10 I⁵ (2) Informácia o SEQ ID NO: 17:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 21 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...21 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 17:

GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Sex

S (2) Informácia o SEQ IDNO: 18:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 7 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 18:

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

5 (2) Informácia o SEQ ID NO: 19:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1 ...27 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 19:

CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr 1 5 (2) Informácia o SEQ ID NO: 20: (i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 9 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 20:

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr

5 (2) Informácia o SEQ ID NO: 21:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 21 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...21 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 21:

ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC Thr Ser Gly Met Gly Val Ser 1 S (2) Informácia o SEQ ID NO: 22:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 7 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 22:

Thr Ser Gly Met Gly Val Ser

5 (2) Informácia o SEQ ID NO: 23:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 48 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...48 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 23:

CAC ATT TAC TGC GAT GAT CAC AAC CGC TAT AAC CCA TCC CTC AAC AGC <8

Ris íle Tyr Trp A»p Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Sex 15 10 is (2) Informácia o SEQ ID NO: 24:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 16 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 24:

His íle Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

10 is (2) Informácia o SEQ ID NO: 25:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 33 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...33 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 25:

AGA GÄG ACT STG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC Arg Glu Thr Val the Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO: 26:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 26:

Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO: 27:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...27 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 27:

CAG CAA AGT ΛΛΤ GAG GAT CCC CCG AGG

Gin Gin Sér Asn Glu Asp Pro Pro Arg

5 (2) Informácia o SEQ ID NO: 28:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 9 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 28:

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg

5 (2) Informácia o SEQ ID NO: 29:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 36 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 29:

CTAACAC7CA TTCCTGTTGA agctcttgac aatggg (2) Informácia o SEQ ID NO: 30:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 29 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 30:

gtacatatgc aaggcttaca accacaatc (2) Informácia o SEQ ID NO: 31:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 117 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 31:

GGTTACCC7G CGTGAA7CCG G7CCGGCACT AGTTAAACCG ACCCAGACCC TGACGTTAAC 60

CTGCACCT7C TCCGGI7TC7 CCCTGTCGAC C7CCGGTA7G GGTGTTTCCT GGATCCG 117 (2) Informácia o SEQ ID NO: 32:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 120 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 32:

TCAGCCGCCG GGTAAAGGTC 7AGAATGGC7 GGCTCACATC TACTGGGACG ACGAĽAAACG 60

TTACŕ-ACCCG AGCCTGAAAT CCCGTCTGAC GATAICCAAA GACACCTCCC GTAACCAGGT 120 (2) Informácia o SEQ ID NO: 33:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 120 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 33:

TG77CTGACC ATGGACCCGG TTGACÄCCGC TACCTAC1AC 7GCCCTCGTC GCGAAACCGT 60

TTTCTAC7GG TACTTCGACG TTTGGGGTCG ŤGGTACCCCA GTTACCGTGA GCICCCAACC J20 (2) Informácia o SEQ ID NO: 34:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 25 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 34:

ACCCGGCGGC 7GACGGATCC AGGAA ²5 (2) Informácia o SEQ ID NO: 35:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 35:

ATGGTCAGAA CAACCTGGTT ACGS ²⁴ (2) Informácia o SEQ ID NO: 36:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 25 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 36:

TTCGGGÄTAC CCTGCGTGAA TCCGG 2S (2) Informácia o SEQ ID NO: 37:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 21 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 37:

CCAACCCTCG AGTGCCATTG A 21 (2) Informácia o SEQ ID NO: 38:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 43 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 38:

CTAGCTGTGT CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGG 43 (2) Informácia o SEQ ID NO: 39:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 39 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 39:

CCTTGCAGTT GATGGTGGCC CTCTCGCCCA GAGACACAG ³³ (2) Informácia o SEQ ID NO: 40:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 67 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 40:

TCGAGAGGCC TCCCAAAGTG TTGAT7ATCA TGCTCATAGT TATATGAACÍ GGTATCAGCA €0

GAAACCC ⁶⁷ (2) Informácia o SEQ ID NO: 41:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 63 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 41:

GGGTTTCTGC TCXTACCAGT TCATATAACT ATCACCATCA TAA1CAACAC TTTGGGAGGC 60 (2) Informácia o SEQ ID NO: 42:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 51 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 42:

ATACTACIGT CAGCAAAGTA ATGXGGXTCC GCCGAGGTTC GGCGGAGGGA C SI (2) Informácia o SEQ ID NO: 43:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 53 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 43:

CTTGGTCCCT CCGCCGAACC TCGGAGGATC CTCATTACTT TGCTGACACT AGT 53 (2) Informácia o SEQ ID NO: 44:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 55 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 44:

GGGCXGCCTC CTAAGTTGCT CXTTTACGCT GCATCCAATC TAGAATCTGG GGTAC Ó5 (2) Informácia o SEQ ID NO: 45:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 51 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 45:

CCCAGATTCT AGATTGGATG CAGCGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C (2) Informácia o SEQ ID NO: 46:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 83 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 46:

AATTCCAGGA CGCCAGCAAC ATGGTGTTOC AGACCCAGGI C7TCA1TTCT CTGTTGCTCT 60

GGATCTCTGG TGCCTACGGG CAG 83 (2) Informácia o SEQ ID NO: 47:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 84 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 47:

G7AACCTGCC CG7AGGCACC AGAGATCCAG AGCAACAGAG AAATGAAGAC CTGGGTC7GC 60

AACACCATGT TGCTGGCGTC CICG ⁶⁴ (2) Informácia o SEQ ID NO: 48:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 48:

CAGGTTACCC TGŕAAGAGTC ²⁰ (2) Informácia o SEQ ID NO: 49:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 18 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 49:

GAAGTAGTCC TTGACCAG ¹³ (2) Informácia o SEQ ID NO: 50:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 31 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 50:

GTCACCGTCG CCTCAGCTAG CACCAAGGGG C ³¹ (2) Informácia o SEQ ID NO: 51:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 22 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 51:

CTTGGTGCTA GCTGAGGAGA CG (2) Informácia o SEQ ID NO: 52:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 47 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jedno vlákno (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: DNA (genómická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 52:

CAGCTAGATG GCCCCGCCAC AGTACGTTTC ATCTCCACCT TCG7CCC (2) Informácia o SEQ ID NO: 53:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 45 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 53:

AAGGCCTCCC AAAGTGTTGA TTATGATGGT GATAGTTATA TGAAC (2) Informácia o SEQ ID NO: 54:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 21 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 54:

ACCrCCGGTA 7GGCTGTTTC C (2) Informácia o SEQ ID NO: 55:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 48 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 55:

CACATCTAC7 GCGACGACGA CAAACGTTAC AACCCGAGCC TGAAATCC (2) Informácia o SEQ ID NO: 56:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 33 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 56:

CGCGAAACCG TTTTCTACTG GTACTTCGAC GTT (2) Informácia o SEQ ID NO: 57:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 393 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojitá (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: cDNA (ix) Vlastnosti (A) Meno/kľúč: CDS (B) Polohy: 1...393 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 57:

ATG rtít 1

GGA TGG

AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT

48

Gly

Trp

Ser

Cys íle 5

íle

Leu

Phe Leu 10

Val

kla

Thr

hla Thr Gly 15

GTC

CAC

tcc

GAT

ATC

CTG

ATG

ACC

CAC

TCT

CCA

GAC

TCG

CTA

GCT

GTG

9€

val

His

Ser

Asp

11«

val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu

Ala

Val

20

25

30

TCT

CTG

GGC

GAG

AGG

GCC

ACC

ATC

AAC

TCC

AAG

GCC

TCC

CAA

AGT

GTT

14 4

Ser

Leu

Cly

Glu

Arg

Ala

Tnr

íle

Asn

Cys

bys

Ala

Ser

Gin

Ser

val

35

40

45

G AT

TAT

GAT

GGT

GAT

AG?

TAT

ATG

AAC

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

CCC

GGG

192

ASp

Tyr

Asp

Gly Asp

Sa r

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

SO

55

60

CAG

CCT

CCT

AAG

TTG

CTC

AT T

TAC

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

GGG

240

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

íle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

65

70

75

80

GTA

CCT

GAC

CGA

TTC

AGT

GGC

AGC

GGC

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CIC

28Θ

Val

Pro

Asp

*rg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Cly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

85

90

85

ACC

ATC

AGC

AGC

CTG

CAG

GCT

GAA

GAT

GTG

GCA

GTA

TAC

TAC

TGT

CAG

336

Thr

11·

ser

Ser

Lau

Gin

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

íoo

10S

110

CAA

AGT

AAT

GAG

GA7

CCT

CCG

ACG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAA

GTG

GAG

384

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

115

120

125

ATC AAA CGT íle Lys Arg

130

393 (2) Informácia o SEQ ID NO: 58:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 131 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: neznáma (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 58:

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

íle

íle

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

1

5

10

15

Val

His

Ser

ASP

íle

Val

Het

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu

Ala

Val

20

25

30

Ser

Leu

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

íle

Asn

cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

35

40

45

ASp

Tyr

Asp

Gly

ASp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

50

55

60

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

íle

Tyr

Ala

Ala

sér

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

55

70

75

80

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

85

$0

95

Thr

íle

Ser

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

100

105

110

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

val

Glu

115

120

125

íle Lys Arg

Claims (33)

1. Fúzny proteín so špecifickou väzbou na ľudský interIeukín-4 (IL4), vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje komplementámosť určujúce oblasti (CDRs), odvodené z neutralizačnej monoklonovej protilátky, nepochádzajúcej od človeka, s disociačnou konštantou rovnajúcou sa, alebo menšou ako 2.10'¹⁰ M pre IL4 človeka, a prvým fúznym partnerom.

2. Fúzny proteín podľa nároku 1, ktorý je účinne pripojený k druhému fúznemu partnerovi.

3. Fúzny proteín podľa nároku 2, v ktorom uvedený druhý fúzny partner zahrnuje celý alebo časť imunoglobulínového stáleho ťažkého reťazca, alebo imunoglobulínového stáleho ľahkého reťazca, alebo obidvoch reťazcov, ľahkých aj ťažkých.

4. Fúzny proteín podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom je nehumánnou neutralizačnou monoklonálnou protilátkou 6A1, produkovaná hybridómom ECACC 93100620.

5. Fúzny proteín podľa nároku 1, v ktorom sekvencia uvedeného prvého fúzneho partnera je sekvencia ťažkého reťazca z: aminokyselín 21 až 50, 56 až 71,88 až 119 a 131 až 141 z SEQ ID NO: 12.

6. Fúzny proteín podľa nároku 1, v ktorom sekvencia uvedeného prvého fúzneho partnera je sekvencia ľahkého reťazca z: aminokyselín 20 až 42, 58 až 72, 80 až 111 a 121 až 131 z SEQ ID NO: 14.

7. Fúzny proteín podľa nároku 1, v ktorom uvedené sekvencie aminokyselín komplementámosť určujúcich oblasti pre ťažký reťazec sú:

(a) ThrSerGlyMetGlyValSer: SEQ ID NO: 22, (b) HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: SEQ ID NO: 24, alebo (c) ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: SEQ ID NO:

26.

8. Fúzny proteín podľa nároku 1, v ktorom uvedené sekvencie aminokyselín komplementámosť určujúcich oblastí pre ľahký reťazec sú:

(a) LeuAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: SEQIDNO: 16, (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: SEQ ID NO: 18, alebo (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: SEQ ID NO: 28.

9. Fúzny proteín podľa nároku 1, v ktorom uvedené sekvencie aminokyselín komplementámosť určujúcich oblastí pre ľahký reťazec sú:

(a) LeuAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: SEQIDNO: 16, (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: SEQ ID NO: 18 alebo (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: SEQ ID NO: 20.

10. Fúzny proteín podľa nároku 1, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny, ktorá pozostáva z:

(a) His IlcTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: SEQ ID NO: 24 a (b) ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: SEQ ID NO:

26.

11. Fúzny proteín podľa nároku 1, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny, ktorá pozostáva z:

(a) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: SEQ ID NO: 28 a (b) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: SEQ ID NO: 20.

12. Molekula nukleovej kyseliny, kódujúca fúzny proteín podľa nároku 1, obsahujúci komplementámosť určujúcu oblasť (CDR) imunoglobulínového ťažkého reťazca, ktorej sekvencia je vybraná zo skupiny, pozostávajúcej z:

(a) ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC: SEQ ID NO: 21, (b) CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC: SEQ ID NO: 23, (c) AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC: EQ ID NO: 25, (d) ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: SEQ ID NO 54, (e) CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC: SEQ ID NO: 55 a (f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT: SEQ ID NO: 56.

13. Molekula nukleovej kyseliny, kódujúca fúzny proteín podľa nároku 1, obsahujúci komplementámosť určujúcu oblasť (CDR) imunoglobulínového ľahkého reťazca, ktorej sekvenciaje vybraná zo skupiny, pozostávajúcej z:

(a) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC: SEQ ID NO: 53, (b) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: SEQIDNO: 19, a (c) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: SEQ ID NO: 27.

14. Izolovaná sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá je vybraná zo skupiny, pozostávajúcej z:

(a) sekvencie nukleovej kyseliny, kódujúcej fúzny proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9;

(b) sekvencie nukleovej kyseliny, komplementárnej k (a);

(c) fragmentu alebo analógu k (a) alebo (b), ktorý kóduje proteín, charakteristickému tým, že má väzobnú afinitu k ľudskému interleukínu-4; a charakteristickému tým, že má rovnajúcu sa alebo menšiu ako 2 x 10 ¹³ M.

15. Izolovaná sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 14, v ktorej fúzny proteín obsahuje sekvenciu, znázornenú na obr. 5, SEQ ID NO: 13.

16. Izolovaná sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 14, v ktorej fúzny proteín obsahuje sekvenciu znázornenú na obr. 4, SEQ ID NO: 11.

17. Rekombinantný plazmid, obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 14 až 16.

18. Hostiteľská bunka transfektovaná rekombinantným plazmidom podľa nároku 17.

19. Spôsob prípravy humanizovanej protilátky, špecifickej k ľudskému interleukínu-4, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa kultiváciu bunkovej línie, transfektovanej rekombinantným plazmidom podľa nároku 17, pod kontrolou vybranej regulačnej sekvencie, schopnej riadiť jeho expresiu v uvedených bunkách.

20. Spôsob určenia diagnózy alergií a ďalších stavov, spojených s nadbytočnou produkciou imunoglobulinu E, u človeka, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa uvedenie vzorky biologickej tekutiny do styku s monoklonálnou protilátkou, ktorej disociačná konštanta pre ľudský IL4 sa rovná alebo je menšia ako 2 x 1O¹⁰ M, a testovanie na prítomnosť väzby medzi uvedenou monoklonovou protilátkou a ľudským interleukinom 4.

21. Spôsob skríningu monoklonových protilátok, ktoré majú dosociačnú konštantu pre ľudský interleukín 4 rovnajúcu sa alebo menšiu ako 2 x 1O’¹⁰ M, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa:

(a) prípravu hybridómovej bunkovej línie vylučujúcej monoklonálnu protilátku proti ľudskému interlukínu 4; a (b) skríning tejto hybridómovej bunkovej línie s ľudským interleukínom-4 spojeným s aldehydom.

22. Neutralizačná monoklonálna protilátka získateľná spôsobom podľa nároku 21, ktorej disociačná konštanta pre ľudský intereukín-4 sa rovná 2 x 1O'¹⁰ M.

23. Neutralizačná monoklonálna protilátka podľa nároku 22, ktorá je odvodená od hlodavca.

24. Monoklonová protilátka podľa nároku 23, kde hlodavcom je myš.

25. Monoklonová protilátka podľa nároku 24, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu ľahkého reťazca, SEQ ID NO: 2, a aminokyselinovú sekvenciu ťažkého reťazca, SEQ ID NO: 4.

26 Monoklonová protilátka podľa nároku 23, kde hlodavcom je potkan.

27. Hybridom, schopný produkovať protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 23 až 26.

28. Hybridom podľa nároku 27, ktorým je ECACC 93100620.

29. Humanizovaná protilátka, obsahujúca ťažký reťazec a ľahký reťazec, ktorej disociačná konštanta pre ľudský IL4 sa rovná alebo je menšia ako 2 x 10'¹⁰ M, pričom rámcové oblasti ťažkého a ľahkého reťazca sú odvodené od najmenej jednej vybranej ľudskej protilátky, a aminokyselinové sekvencie komplementaritu určujúcich oblastí ťažkého a ľahkého reťazca sú odvodené od neutralizujúcej monoklonálnej protilátky podľa nároku 23.

30. Protilátka podľa nároku 29, ktorá je voliteľne pripojená k efektorovej látke, vybranej zo skupiny, pozostávajúcej z neproteínových nosných molekúl, polystyrénu a perličiek plastu.

31. Chiméma protilátka obsahujúca ťažký a ľahký reťazec, ktorej disociačná konštanta pre ľudský IL4 sa rovná alebo je menšia ako 2xlO‘¹⁰ M, pričom aminokyselinové sekvencie komplementaritu determinujúcich oblastí ťažkého a ľahkého reťazca sú odvodené od neutralizujúcej monoklonálnej protilátky podľa nároku 23.

32. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje fúzny proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, alebo protilátku podľa nárokov 29, 30 alebo 31, a farmaceutický prijateľný nosič.

33. Fúzny proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, alebo protilátka podľa nároku 29, 30 alebo 31, na použitie na liečenie alergií a iných stavov asociovaných s nadmernou produkciou IgE u človeka.