BG100480A - Рекомбинантни интерлевкин-4-антитела, използвани за лечение на интерлевкин-4- медиирани неразположения - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до химерни и хуманизираниинтерлевкин-4 моноклонални антитела, получени от високоафинитетни моноклонални антитела, до фармацевтични продукти, които ги съдържат, и до методи залечение.

Description

РЕКОМБИНАНТНИ ИНТЕРЛЕВКИН-4-АНТИТЕЛА, ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НАИНТЕРЛЕВКИН-4-МЕДИИРАНИ РАЗТРОЙСТВА Това заявление е отчасти продължение на U.S. Serial No.

08/138,783, изпълнено на 14. октомври 1993, което е продължение на U.S. Serial No 08/117,368, изпълнено на 7. септември 1993, като и двете са включени в него чрез препращане в тяхната цялост.

Област на приложението

Настоящото изобретение се отнася главно към областта на фузионните протеини и към протеините, употребяваните лечение и диагностика на състоянията, медиирани от IL4 и излишък на IgE продукция, и по-специално към химерни и хуманизирани IL4 антитела.

i

-2Предшестващо състояние на техниката

Атопичните алергични състояния варират от относително леки, като сенните ринити и конюнктивити, до по-сериозни, като атопичните дерматити и атопичната астма, и до застрашаващи живота, като анафилактичния шок. Свързващ тези състояния е имунният отговор на организма към алергени, който включва произвеждането на имуноглобулин Е (IgE) антитела в генетично предразположени индивиди (атопия). Инхибирането на IgE - продукцията дълго време е цел в специфичната имунотерапия на алергичното заболяване, чрез използуването на десенсибилизиращи ваксини. В последните години обаче, сигурността и ефикасността на ваксиналната терапия са поставени под въпрос, но желанието да се редуцират нивата на IgE не е намаляло.

Интерлевкин-4 (IL4) е протеинов медиатор в лимфоидната система. Изследвания на лимфоцити от атопични индивиди установяват наличието на по-голям брой от нормалния Т лимфоцити, способни да секретират IL4 в отговор на стимулация, и по-големи количества секретиран IL4 след стимулирането.

Установено е, че анти-11_4 антителата инхибират IgE, но не и lgG1 и lgG2a[Finkelman etal, Ann. Rev. Immunol.. 8:303 (1990)]4i продукцията на ILS секретиращи T клетки [Maggi etal, J. Immunol·. 148:2142 (1992)]. По-нататък съвременни данни дават основание да се предположи, че IL4 може да повлиява · · акумулирането на еозинофили втъканите. ВжTepper etal. Cell, 62:457 (1990); Tepper etal, Cell, 57:503 (1989),

Остава нуждата от високоафинитетен IL4 антагонист, който да редуцира еозинофилното възпаление, както намалявайки пролиферацията на IL5 секретиращи клетки, така и чрез инхибиране на адхерентния механизъм, чрез който еозинофилите могат да се акумулират в тъканите, и който да може да се използува за

• · ♦ • · · · • · · • · · • ·

-3лечение, предпазване или диагностика на алергични реакции.

Кратко описание на изобретението

В първи аспект настоящото изобретение осигурява фузионен белтък, който има свързващ афинитет към човешкия интерлевкин-4, включващ области, определящи комплементарността области (ООК), получени от не-човешко неутрализиращо моноклонално антитяло (МАЬ), характеризиращо се със дисоциационна константа равна или по-малка от 2хЮ-1°М за С човешки IL4, и първи фузионен партньор, в който поне една, но за предпочитане всички области, определящи комплементарността (ООК) са заместени с ООК от не-човешко моноклонално антитяло (МАЬ). Не-човешкото неутрализиращо МАЬ може да бъде подбрано от групата, състояща се от ЗВ9 и 6А1, както е описано по-пълно в детайлното описание. За предпочитане е фузионният белтък да е свързан към втори фузионен белтък, който съдържа цялата или част от константната имуноглобулинова верига.

В този аспект настоящото изобретение осигурява ООК. получени от не-човешки неутрализирани моноклонални антитела (MAbs), характеризиращи се със дисоциационна константа равна или по-малка от 2хЮ-1°М за човешки IL4 и молекула нуклеинова киселина, кодираща тези ООК.

ф От друг аспект изобретението осигурява хуманизирани антитела, имащи поне една, а за предпочитане 6 области определящи комплементарността (ООК), получени от не-човешки неутрализиращи моноклонални антитела (МАЬ), характеризиращи се със дисоциационна константа равна или по-малка от 2x10-1 °М за човешки IL4).

йАиАаь*и£ мш

Ϊ£

W^a».

• · · si - *Л ,. , ' *

F λ *» • · · • · · ·

-4Οτ друг аспект, осигурено е химерно антитяло, съдържащо константните области на човешки тежка и лека вериги и вариабилните области на тежки и леки вериги, получени от не-човешки неутрализиращи моноклонални антитела (МАЬ , характеризиращи се със дисоциационна константа равна или по-малка от 2x1 Οι °М за човешки IL4.

От друг аспект настоящото изобретение осигурява фармацевтичен продукт, съдържащ един (или повече) от описаните по-горе фузионни протеини или МАЬ (напр. хуманизирани, химерни и т.н.) и фармацевтично приемлив носител.

В по-нататъшен аспект настоящото изобретение осигурява метод за лечение и/или предпазване от алергични състояния при хора, чрез прилагане (на тези хора) на ефективно количество от фармацевтичната композиция на изобретението.

В друг аспект настоящото изобретение осигурява методи за рекомбинантно произвеждане на фузионния протеин и компоненти, използувани в него, моноклонални антитела (хуманизирани, химерни), техните ООК, Fab или F(ab)2 или техни аналози, които са получени от не-човешки неутрализиращи моноклонални антитела (МКА) .характеризиращи се със дисоциационна ’ константа равна или по-малка от 2x10-1 θΜ за човешки IL4.

Тези съставки включват изолирани последователности нуклеинова киселина, кодиращи същите, рекомбинантни плазмиди, съдържащи последователности нуклеинова киселина, под контрола на избрани регулаторни последователности, които могат да направляват тяхната експресия в клетките на гостоприемника и клетки на гостоприемник (за предпочитане от_; бозайници), трансфектирани с рекомбинантните плазмиди. Методът за получаване включва култивирането на трансфек6

-5тираната клетъчна линия на даденото изобретение при такива условия, при които антитяло (за предпочитане хуманизирано) се експресира в указаните клетки и изолирането на експресирания от тях продукт.

В друг аспект на изобретението стои метод за диагностициране на алергии и други условия, свързани със свръхпродукция на IgE у човека,който включва контакт на проба от биологична течност с фузионни протеини, моноклонални антитела (напр. хуманизирани, химерни и т.н.) и Fab фрагменти на самото изобретение и С изследване на наличието на свързване между посочените фузионни протеини, моноклонални антитела или Fab и човешки интерлевкин-4.

В друг свързан аспект е осигурен метод за скриниране на моноклонални антитела, които имат висок титър за човешки интерлевкин-4, който се състои от:

(а) приготвяне на хибридомна клетъчна линия, характеризираща се със секреция на моноклонално антитяло и човешки интерлевкин-4 и (б) скриниране на посочената хибридомна клетъчна линия с алдехид-свързан човешки интерлевкин-4 или биотинилиран човешки интерлевкин-4. Предпочита се хибридомната клетъчна линия да се скринира с биотинилиран човешки интерлевкин-4. ф Също са осигурени неутрализиращо моноклонално антитяло, имащо висок афинитет за интерлевкин-4, Fab фрагментили F(ab)2 фрагмент от него, получени чрез скриниране на библиотека от хибрцдрмни продукти с алдехид-куплиран човешки интерлевкин-4 или биотинилиран човешки интерлевкин-4.

В друг аспект настоящото изобретение осигурява неутрализира-, щи моноклонални антитела от гризачи, специфични за човешки

······ ··· ·· · · • · · · · · ··· • ···· · ··· · ···· ♦ ♦ · · · · ···· · ··· · • · · · · · · · ·· ··· ·· · ·· ··

-θинтерлевкин-4 и имащи свързващ афинитет, характеризиращ се със дисоциационна константа равна или по-малка от 2х10-¹⁰М за човешки IL4. Екземпляри от такива моноклонални антитела са миши ЗВ9 моноклонални антитела и плъши 6А1 моноклонални антитела и други моноклонални антитела, имащи същите идентификационни характеристики (т.е. свързващи се към същия епитоп(и) катоЗВ9 или 6А1 със специфичност за човешки интерлевкин-4 и характеризиращи се със дисоциационна константа равна или по-малка от 2х10-1°М за човешки IL4). Друг аспект на изобретението е хибридома 3426А11С1В9.

С Други аспекти и предимства на настоящото изобретение са описани по-нататък в детайлното описание на преференциалните му части.

Кратко описание на фигурите: Фиг. 1. (Последователности с идентификационен No 1 и 2) илюстрира вариабилната област на леката верига (аминокиселини 21-132) на мишо IL4 антитяло ЗВ9 и човешко/мишоЗВ9 химерно антитяло, както и нативната сигнална последователност (аминокиселини 1-20). Подчертаните части показват области, определящи комплементарността (последователности с идентифик. номера 15 и 18; последователности с идентифик. номера 17 и 18 и последователности с идент. номера 19 и 20). Фиг. 2. (Последователности с идентификационен No 3 и 4)

С илюстрира вариабилната област на тежката верига (аминокиселини 20-140) на мишо антитяло ЗВ9 и нативната сигнална последователност (аминокиселини 1-19). Подчертаните части показват области, определящи комплементарността (последователности с идентифик. номера 21 и 22; последовател-

ности c идент. номера 23 и 24 и последователности с идент. номера 25 и 26).

Фиг. 3. (Последователности с идентифик. No 9 и 10) илюстрира вариабилната област на тежката верига (аминокиселини 21-141) на човешко/мишо химерно антитяло ЗВ9 и неговата сигнална последователност (аминокиселини 1-19, последователности с идентифик. номера 5 и 6). Подчертаните части показват области, определящи комплементарността, получени от ЗВ9 (последователности с идентифик. номера 21 и 22;

последователности с идент. номера 23 и 24 и последователности с идентифик. номера 25 и 26).

Фиг. 4. (Последователности с идентифик. No 11 и 12) илюстрира вариабилната област на тежката верига (аминокиселини 20-141) на хуманизирано мишо антитяло ЗВ9 и нативната сигнална последователност (аминокиселини 1-19:последователности с идентифик. номера 5 и 6). Подчертаните части показват области, определящи комплементарността, получени от ЗВ9 (последователности с идентификационни номера 54 и 22; последователности с идентифик. номера 55 и 24 и последователности с идентифик. номера 56 и 26).

Фиг. 5. (Последователности с идентификационен No 13*и 14) илюстрира вариабилната област на леката верига (аминокиселини 21-131) на хуманизирано антитяло ЗВ9 и сигналната последователност (аминокиселини 1 20:последователности с идентификационни номера 7 и, 8),. Подчертаните части показват области, определящи комплементарността, получени от ЗВ9 (последователности с идентификационни номера 53 и 16; последователности с идент. номера 17 и 18 и последователности с идент. номера 27 и 28). :

>·· l№

-8Фиг. ΘΑ (Последователности с идентификационен No 5 и 6) е сигнална последователност на тежка верига, използувана в пример 4 по-долу.

Фиг. 6В (Последователности с идентификационен No 7 и 8) е сигнална последователност на лека верига, използувана в пример 4 по-долу.

Фиг. 7 е схематично изображение на плазмида plL4chhc3-pcd, който се използува за експресиране на химерна IL4 тежка верига в клетки на бозайници. Плазмидът съдържа ген за βлактамаза (BETA LAC), SV-40 -източник на репликация (SV-40), цитомегаловирусна промоторна секвенция (CMV). сигнална последователност, химерна вариабилна тежка верига на последователности с идентификаионни номера 9 и 10, константна област на човешка тежка верига, поли-А сигнал от говежди растежен хормон (BGH), бетаглобулинов промотор (beta glopro), дихидрофолатен редуктазен ген (DHFR), и друг BGH последователен поли-А сигнал в pUC19 основа.

Фиг. 8 е схематично изображение на плазмид plL4chlc-pcdn използуващ се за експресиране на вариабилната област на химерна IL4 лека верига на последователности с идентификационни номера 1 и 2 в клетки на бозайници. Плазмидътхе различава от този на фиг. 7 по това, че съдържа вариабилната област на химерна лека верига вместо тази на химерна тежка верига, константна област на човешка лека верига и , неомицинов ген (Neo), прибавени към DHFR.

Фиг. 9 е схематично изображение на плазмид plL4hzhc-1-pcd, който се използа за експресиране на синтетична вариабилна област на IL4 тежка верига на последователности с идентиф. No 11 и 12 в клетки от бозайници. Плазмидът се различава от -този на фиг. 7 по съдържанието на хуманизирана вариабилна област на тежка верига вместо тази химерна тежка верига.

·· ····

-9Фиг. 10 е схематично изображение на плазмид plL4hzlc1 -О-Рсп който се използва за експресиране на хуманизирана вариабилна област на IL4 лека верига на последователности с идентиф. No 13 и 14 в клетки от бозайници. Плазмидът се различава от този на фиг. 8 по съдържанието на хуманизирана вариабилна област на лека верига, вместо тази на химерна лека верига и не кодира DHFRreH.

Техническа същност на изобретението Настоящото изобретение осигурява разнообразие от антитела, техни фрагменти и фузионни белтъци, частично хуманизирани антитела, които се характеризират със свързваща активност спрямо човешки IL4, неутрализираща активност и висок афинитет за човешки IL4 като тези на миши МАЬЗВ или плъши МАЬ6А1. Тези продукти се използват в терапевтични и фармацевтични продукти за лечение на IL4 медиирани и IgE медиирани алергични реакции. Тези продукти се използват също за диагностика на IL4 медиирани състояния чрез измерване (обикн. чрез ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA) на циркулиращи ендогенни нива на IL4 при хора.

I. Определения (дефиниции). -.

“Фузионен протеин означава протеин, кодиран от фузионна молекула, която може да се получи чрез експресия в избрана клетка - гостоприемник. Такива фузионни протеини са конструирани антитела, напр. химерни или хуманизирана или фрагменти от антитела, на които липсва цялата или част от имуноглобулнновата константна област т.е. Fv, Fab или F(ab)g и сходни на тях.

Фузионна молекула означава последователност от нуклеинова киселина, кодираща областите, определящи

Μ

-10комплементарността (ΟΟΚ) за не-човешки имуноглобулини, които се включват в първия фузионен партньор, съдържащ човешки рамкови вариабилни последователности. По-избор първият партньор на фузията може да бъде свързан към втори фузионен партньор.

Първи фузионен партньор означава нуклеиново киселинна последователност, кодираща човешка рамкова или човешка имуноглобулинова вариабилна област в която нативните (или естествено намиращи се) ООК са заместени с такива на донорното антитяло.Човешката вариабилна област може да бъде имуноглобулинова тежка верига, лека верига (или и двете), техен аналог или фрагмент от тях. Такива ООК или части от тях, локализирани във вариабилната област на антителата (имуноглобулините) могат да бъдат установени с познати методи. Напр. Kabat et al., [Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health(1987)], разкрива правила за локализиране на ООК. В добавка могат да се използуват и компютърни програми, които са полезни за идентифициране на ООК области (структури).

Терминът висок титър“ се отнася до антитела, имащи свързващ афинитет, характеризиращ се с К^ равна или/1о-малка от 2 х 1СН°М за човешки IL4.

Под свързваща специфичност за човешки IL4 се разбира висок титър (или афинитет) за човешки, не-говежди и не-миши IL4. ·.Втори партньор на фузията се отнася до друга нуклеотидна последователност, кодираща протеин или полипептид към който се слива първият фузионен партньор в рамките или посредством факултативна конвенционална _; свързваща последователност (напр. оперативно свързана). За предпочитане това е имуноглобулин. Вторият фузионен партньор може да включва последователност от нуклеинова киселина, кодираща цялата константна област за същото антитяло, което ни интересува (т.е. хомоложна — първият и вторият фузионен

·· ··

-11предпочитане това е имуноглобулин. Вторият фузионен партньор може да включва последователност от нуклеинова киселина, кодираща цялата константна област за същото антитяло, което ни интересува (т.е. хомоложна — първият и вторият фузионен партньор се получават от един и същ източник) или добавъчна (т.е. хетероложна). Тя може да бъде тежка или лека имуноглобулинова верига (или и двете, като част от един полипептид). Вторият фузионен партньор не е ограничен относно определен имуноглобулинов клас или изотип. В добавка, вторият фузионен партньор може да съдържа част от константната област на имуноглобулин, както е установено в Fab u F(ab)2 т.е. дискретна част от подходяща човешка константна или рамкова област). Такъв втори фузионен партньор може също да съдържа последователност, кодираща интегрален мембранен протеин, разположен върху външната повърхност на клетката на гостоприемника, напр. като част от фаговата екранна библиотека или последователност, кодираща протеин за аналитично или диагностично определяне — напр. пероксидаза от хрян, βгалактозидаза и др.

Термините Fv, Fc, Fab или F(ab)2 се използуват с тяхното стандартно значение (вж напр. Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, 1988)).

Както е употребен тук, терминът конструрано антитяло предсавлява вид фузионен протеин, т.е. синтетично антитяло (например химерно или хуманизирано), в което част от лекои/или тежковерижните вариабилни домени на избрано.акцепторно антитяло са заменене с аналогични части от едно или повече донорни антитела, които са специфични за избрания епитоп. Например такава молекула може да включва антитела, характе·** . >£» • · · ·· · ·· · ризирани чрез хуманизирана тежка верига, асоциирана с немодифицирана (или химерна) лека верига или обратно. Конструираните антитела могат също да се характеризират с промяна на нуклеиново-киселинната последователност, кодираща рамковите области на леките или тежки вариабилни домени, с оглед да се запази свързващата специфичност на донорнсгго антитяло. Тези антитела могат да имат смяна на една или повече ООК (за предпочитане всичките) от акцепторното антитяло с ООК от донорното антитяло, описано тук.

“Химерно антитяло“ означава изкуствено конструирано антитяло, на което ООК са получени от не-човешки донорен имуноглобулин, а останалите имуноглобулинови части на молекулата произлизат от един или повече човешки имуноглобулини. В добавка рамковите поддържащи участъци, могат да бъдат променени така, че да предпазват афинитета на свързване (вж напр. Queen et al., Proc Natl Acad 8ci USA, 86: 10029 -10032 (1989), Hodgson etal., Biotechnology, 9:421 (1991)).

Терминът “донорно антитяло“ се отнася за антитяло (поликлонално, моноклонално или рекомбинантно), което придава нуклеиново-киселинни последователности от вариабилната си област, ООК или други функционални фрагменти или техни аналози към първия фузионен партньор, така че да осигурява на фузионната молекула и резултантния експресиран фузионен протеин антигенна специфичност и неутрализираща активност, характерна за донорното антитяло. Донорно антитяло, подходящо за използуване в настоящото изобретение е не-човешкото неутрализиращо моноклонално антитяло (т.е. мишо), обозначено като ЗВ9. АнтитялотаЗВ9 се определя като високотитърно, специфично за човешки-11_4 (т.е. не разпознава говежди или миши IL4), неутрализиращо антитяло л

9 ·99· • · • ··· • · • · · • ···· • ·· · • · • · от изотип lgG1, съдържащо вариабилна лека верига ДНК и аминокиселинни последователности с идентификационни номера 1 и 2, и вариабилна тежка верига ДНК и аминокиселинни последователности с идентификационни номера 3 и 4 върху подходяща миша IgG константна област.

Терминът “акцепторно антитяло“ означава антитяло (поликлонално, моноклонално или рекомбинантно), хетероложно спрямо донорното антитяло, което съдържа всички (или част, но за предпочитане е всички) последователности нуклеинови киселини, кодиращи рамковите области на неговата тежка и/или лека верига, а също и/или тежките и/или леките константни области към втория фузионен партньор. Препоръчва се акцепторното антитяло да е човешко.

ООК се дефинират като аминокиселинни последователности, определящи областите на комплементарност на дадено антитяло, които са хипервариабилните области на имуноглобулиновата лека и тежка верига. Вж пр. Kabat et al..Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health(1987). Във вариабилната област на един имуноглобулин има по три за тежката и за леката верига ООК. Следователно ООК както е дефинирано тук касае всичките три ООК на тежката или всичките ООК на леката верига (или и на двете, ако е подходящо).

ООК осигуряват мнозинството от контактните остатъци за свързване на антитялото към антиген или епитоп. ООК, които са обект на интерес в даденото изобретение се получават.фт. вариабилните последователности в тежката и лека верига на донорното антитяло^включват аналози на естествено съществуващите O0R, които аналози споделят или запазват същата антигенсвързваща специфичност и/или неутрализираща

способност като донорното антитяло, от което са получени. Под споделяне на антигенсвързващата специфичност или неутрализираща способност се разбира например, че въпреки, че МКА ЗВ9 могат да се характеризират с определено ниво на афинитет към антигена и ООК, кодирани от нуклеинови последователности в една подходяща структурна среда може да имат по-нисък или по-висок афинитет се очаква, че ООК на ЗВ9 ще разпознава същия епитоп катоЗВ9. Примерни ООК на тежка верига на ЗВ9 включват последователност с идентификационен номер 22; последователност с идентификационен номер 24; последователност с идентификационен номер 26; Примерни ООК на лека верига на ЗВ9 включват последователност с идентификационен номер 16; последователност с идентификационен номер 18; последователност с идентификационен номер 20; Функционален фрагмент е частична вариабилна последователност от тежка или лека верига (напр. минорни делеции при амино- или карбоксилния край на вариабилната област на имуноглобулина), която съдържа същата антигенсвързваща специфичност и/или неутрализираща способност, както антитялото от което е взет фрагмента. ''Аналог е аминокиселинна последователност с модифицирана поне една аминокиселина, като модификацията може дд бъде химична, субституция или разместване на няколко аминокиселини (не повече от десет) и която модификация позволява аминокиселинните последователности да запазят биологичните си характеристики, т.е. антигенната специфичност и високия титър или афинитет на немодифицираната последователност. Например мълчаливите мутации могат да се конструират чрез заместване така, че да се създадат места за рестрикция с ендонуклеаза във или около ООК.

Аналозите могат също да произлизат като алелни вариации.

.....

“Алелна вариация или модификация“© промяна в нуклеиновокиселинната последователност, кодираща аминокиселинните или пептидните последователности на изобретението. Такива вариации и модификации могат да се дължат на дегенерация в генетичния код или могат да бъдат специално конструирани, така че да осигуряват желани характеристики. Тези вариации или модификации могат да доведат или не до промени в дадена кодирана аминокиселинна последователност. Например аминокиселинните последователности в лековерижната ООК с идентиф. No 16 са идентични с нативните мишо и хибридизирано ЗВ9 антитяло. Тези ООК секвенции се кодират от двете последователности: с идентифик. номер 16 и 53. Сходно ООК с идентифик. No 22 се кодират от двете последователности: с идентифик. No 21 и 54; ООК с идентифик. No 24 се кодират от двете последователности: с идентифик. No 23 и 55; ООК с идентифик. No 26 се кодират от двете последователности: с идентифик. No 25 и 56.

Терминът “ефекторни агенти“ се отнася до непротеинови молекули - носители към които чрез конвенционални методи могат да бъдат асоциирани фузионните протеини и/или естествени или синтетични леки и тежки вериги на донорното антитяло или други негови фрагменти. Такива непротеинови носители могат да бъдат конвенционални носители, използувани в областта на диагностиката, напр. полистиренови или други пластмасови сферички, полизахариди, напр. използуваните в BIA core (Pharmacia) система, или други непротеинови субстанции, използувани в медицината и безопасни за прилагане към хора и животни. Други ефекторни агенти могат да включват макроцикъл за хелатиране на тежки метални атоми или радиоизотопи. Такива ефекторни агенти могат да бъдат полезни за повишаване времето на полуживот на фузионните протеини, напр. полиетиленгликол.

«''Ми * ·· ···· • · • ··· ·· ·

-16//. Високоафинитегни /L4 моноклонални антитела.

За конструирането на антитела, фрагменти или фузионни протеини в това изобретение могат да се използват клетки от организми, непринадлежащи към човешкия вид (напр. говежди, овчи, от примати, гризачи (мишки и плъхове) и т.н.) и да се генерират желаните имуноглобулини чрез представяне на нативен човешки IL4 или пептиден епитоп от него. За получаване на хибридомна клетъчна линия, секретираща не-човешко моноклонално антитяло към IL4 се използуват конвенционални лабораторни техники. Такива хибридоми след това се скринират, С чрез използуване на IL4, ковалентно свързан към 96-гЬездна плака или алтернативно с биотинилиран IL4 за прилагане в скриниращото изследване, както детайлно е описано в пример 2 по-долу. Следователно характерна черта на самото изобретение е метод за откриване на моноклонални антитела за човешки интерлевкин-4, в който опитната постановка избягва денатуриране на IL4. По този начин е установено, че могат да се откриват високотитърни (или високоафинитетни) моноклонални антитела към човешки IL4.

Като пример на първо време е показано получаването на • високотитърно, неутрализиращо моноклонално антитяло от миши донор MAb ЗВ9, което е исканото (донорно) антитяло за използване при развитието на химерно или хуманизирано антитяло. То е детайлно описано в Пример 1 по-долу. MAb ЗВ9 се ф характеризира с антигенсвързваща специфичност за човешкиI IL4 с Ка по-малка от 2.0 х 10-¹⁰М (около 1.8 х 10-¹⁰М) за 1Ц4_Л

Епитопът на това антитяло не може да бъде картиран към IL4 с линеарни пептиди, и следователно^ смята, че епитопът се ί свързва към несъседен епитоп. Начинът на свързване предполага свързваща страна при областта В-С бримка • · ···· * · · • · · · · · • ···· · ··· • ♦ · » · ····· • · · · • · · « • · • · · · ····· ·· ·

-17(остатьци 60-69)-» С спирала (остатъци 70-93). Тези области се отнасят до обозначенията на картата, дадени във Cook et al, J.Mol. Biol·. 218:675-678 (1991), Walter et al, J. Biol. Chem., 267:20371-20376 (1992), Wlodaver et al, FEBS Lett.. 309:59-64 (1992), Redfield et al, Biochem.. 30:11029-11035 (1991), Smith et al, JL Moi. Biol., 224:899-904 (1992), Garret et al,(1992), and Powers et al, Biochem. 31:4334-4346 (1992) and Science, 256:1673-1677 (1992), включени чрез справка тук.

Друго желано донорно антитяло е плъше MAb, 6А1.

Получаването на това антитяло се дава по-долу в Пример 7. Това моноклонално антитяло е от изотип lgG2 и има дисоциационна константа за човешки-!1_4 по-малка от 2.0 х 10-1°М (около 1.6 х10ЮМ) за IL4. Както при ЗВ9, епитопът мишена на 6А1 не може да се картира с IL4 линеарни протеини, поради което се смята, че е непоследователен (несъседен) и тридимензионален. Начинът на свързане към IL4 мутеини и неговата биологична активност показва свързване в D спирална област на човешки IL4 (аминокиселинни остатъци 109-127), най-вероятно около тирозина при аминокиселинен остатък #124.

Настоящото изобретение не се ограничава с използуването на моноклонални антитела ЗВ9,6А1 или техните хипервариабилни (т.е. ООК) последователности. Всяко друго високотитърно IL4 антитяло, характеризиращо се с дисоциационна константа равна или по-малка от 2.0 х 10-1°М за човешки IL4 и съответствуваща анти-11_4 ООК маже да ги замести. Където в последващото описание донорното антитяло се идентифицира като ЗВ9 или 6Д1, това обозначение се прави само за ^илюстриране и опростяване на описанието.

///. Анти тялови фрагмен ти <

Настоящото изобретение включва също използуването на

• · • ·

-18Fab- или F(ab')2 фрагменти, получени от моноклонални антитела, насочени срещу човешки IL4. Тези фрагменти са полезни in vivo като агенти, протективни срещу IL4 и lgE-медиирани състояния или in vitro като част от диагностиката на IL4. Fab фрагмента съдържа цялата лека верига и амино-крайния участък на тежката верига; F(ab')2 фрагмента е формиран от два Fab фрагмента, свързани чрез дисулфидни връзки. Mab ЗВ9,6А1 и други IL4 свързващи антитела със сходен висок афинитет, осигуряват източници на Fab- и F(ab')2 фрагменти, които могат да се получат чрез конвенционални методи, примерно чрез разграждане на моноклоналното антитяло с подходящи протеолитични ензими, папаин и/или пепсин или рекомбинантни методи. Тези Fab- и F(ab')2 фрагменти самите са полезни като терапевтични, профилактични и диагностични агенти, а също като донори на последователности, включващи вариабилните области и ООК използувани за формиране на рекомбинантни или хуманизирани антитела както е описано тук.

IV. Ahth-/L4 аминокиселинни и нуклеотидни последователности, които представляват интерес.

Моноклоналните ЗВ9 или други антитела описани по-горе могат да доставят последователности, например вариабилни тежки или леки пептидни последователности, рамкови последователности, ООК последователности, функционални фрагменти и теХнЙ аналози и нуклеиновокиселинни последователности, които ги кодират, използващи се в проектирането и получаването на различни фузионни протеини (включително коструирани антитела), които се характеризират с антиген-свързващата специфичност на донорното антитяло.

Като пример настоящото изобретение предоставя последователности от вариабилни лека и тежка верига на IL4 мишо

-19антитялоЗВ9 и последователности, получени от тях. Вариабилната област на тежката верига на ЗВ9 се характеризира от аминокиселинните остатъци от 20 до 140 на последователност с идентифик. No: 4. ООК областите са показани чрез подчертаване на фиг. 2 и са предоставени в последователности с идентифик. номера 22,24 и 26. Клон от вариабилната област на леката верига на ЗВ9 се характеризира с аминокиселинни остатъци от 21 до 132 от фиг.1 [последователност с идентификационен номер 2]. ООК са от аминокиселинните остатъци 44-58 [последователност с идентифик. No: 16]; 74-80 [последователност с идентифик. No: 18]и 113-121 [последователност с идентифик. No: 20].

Осигурени са химерна вариабилна област на тежката верига и сигнални нуклеотидна и аминокиселинна последователност. Тези последователности са идентични с тежката верига на ЗВ9 с изключение на сигналната последователност. Химерната сигнална последователност на тежката верига е дадена в последователности с идентифик. номера 5 и 6. ООК са показани чрез подчертаване на фиг. 3 и са идентични в аминокиселинните си последователности с нативните миши ООК [последователности с идентификационни номера 21-26]. Нуклеотидните и аадинокиселинните последователности на вариабилната област на химерната лека верига са идентични с немодифицираните последователности от ЗВ9 (аминокиселинни остатъци 21-132 от последователност с идентифик. No 2) използуват естествените миши сигнални секвенции (аминокиселинни остатъци 1-20 от последователност с идентифик. No 2).

Хуманизирана вариабилна област на тежка верига и сигнална последователност са илюстрирани на фиг. 4[последователноцти

i

-20с идентификационни номера 11-12].Сигналната последователност е дадена също в последователности с идентифик. номера 5 и 6. Други подходящи сигнални последователности, познати на професионалистите могат да заместят сигналните последователности, илюстрирани тук. ООК аминокиселинните последователности на тази конструкция са идентични с нативните миши ООК и ООК на химерната тежка верига и са дадени чрез последователности с идентифик. номера 22 (кодирана чрез последователност с идентифик. No:

С 54), 24 (кодирана чрез последователност с идентифик. No: 55) и (кодирана чрез последователност с идентифик. No: 56). Примерна (синтетична) хуманизирана вариабилна последователност на лека верига е илюстрирана на фиг.5 [последователности с идентификационни номера 13 и 14]. Сигналната последователност обхваща аминокиселинни остатъци от 1 до 19 на последователност с идентифик. No: 8. Последователностите на ООК на тази фигура са обозначени чрез подчертаване и се различават от нативните миши ООК по единична аминокиселина на последователност с идентифик. No: 20. Следователно ООК на хуманизираната лека верига са осигурени чрез последователности с идентифик. No:53 и 16, последователности с идентифик. No: 17 и 18 и последователности с идентифик. No: 27 и Έ8. Тази разлика е показана в детайли в Пример 3.

ф Нуклеиновокиселинните последователности на това изобретение или фрагментите от тях, кодиращи пептидните секвенции на вариабилните леки и тежки вериги се използуват в '·’ немодифицирана форма или се синтезират, за да им се придадат желани модификации, напр. места за рестрикция. Изолираните естествено съществуващи или алтернативно синтезирани • · • ·

-21нуклеиновокиселинни последователности, получени от MAb ЗВ9 или от други подходящи IL4 антитела може по избор да съдържат места за рестриктази, за да се постигне инсерция или лигиране в подходящи нуклеиновокиселинни последователности, например да се кодира по желание антитялова рамкова област, лигирани или мутагенизирани ООК или фузии с нуклеиновокиселинни последователности, кодиращи избран втори фузионен партньор.

Водейки сметка за дегенерацията на генетичния код, могат да бъдат конструирани различни кодиращи секвенции, които кодират аминокиселинни последователности на вариабилните леки или тежки вериги, ООК последователности на изобретението, както и функционални фрагменти и техни аналози, които имат антигенна специфичност като донорното антитяло. Изолираните нуклеиновокиселинни последователности на това изобретение, или техни фрагменти, кодиращи пептидите на вариабилноверижните секвенции или ООК, могат да бъдат използувани за получаване на фузионни протеини, химерни или хуманизирани антитела или други конструирани антитела на това изобретение, когато са оперативно свързани с втори фузионен партньор.

Тези последователности могат да бъдат също полезни^а мутагенно получаване на специфични изменения в нуклеиновокиселинните последователности, кодиращи ООК или рамковите области и за инкорпориране на получените модифицирани или фузионни нуклеиновокиселинни последователности в плазмиди за експресия. Например “мълчализи“ замествания в нуклеотидната последователност на рамковите и ООК кодиращите области се използват за създаване на места за смилане с рестрикционни ензими, които облекчават инсерцията на мутагенизирани ООК-

f.

'5 $ « >

K

I i ξ s

f s

• · · • ?♦»:-)·£ M • 4? ,-л*^· * • ^Λ·Ο“4

>

•ч *» i j?

.*

I

A ''

Тряб

4* ч

K’S^V, (и/или рамкови), области. Тези ООК се[Използуват при ^т тгруирането хуманизирано’’антитяло в това изобретение. ?

)ва даса отбележи, че в, прибавка към изолираните : / ..^..леиновокиселинни последователности, кодиращи части от фузионния протеин и антителата, описани тук, могат да бъдат - използвш|дуинуклеиновокйсеАинни последователности, като напр|таЙ^^^омплементарнинанативните последователности. П0лезнЙЙ^оследовахеХностй:сасъщо тези, които ' *$РИД ' ^^еде^нМидизационнй условия [вж1у {.Molecular Cloning (^Laboratory Manual), Cold

I Spring HaiW )Qratory_; (1982) j стр. 387: до 389] към ДΗ К ч последователностите? Пример на такива строги хибридизаци< онниуслсжи^.хибридизирането при 4XSSC при 65°С, последва£ ноот миене йв 0*1 XSSCM един час. Алтернативно, пример за строгохибридизационноусдовие е 50% формамид 4XSSC при 42РС; За предпс^итанатези/хибридизиращи ДНК последоватеХностиса дйлги¹пон^18 нуклеотйди“ т.е. колкото размера на

..... .·

V. Фузионнимолекулнифузионнипротеини _;л Фузионните молекули могат да кодират фузионни протеини, г които включват конструирани антитела каквито са химфните и _t ^; хуманизираните антитела. Желателната фузионна молекула съдържа ООК, кодиращи пептиди, имащи антигенна специфичност на IL4 антитяло, за предпочитане високоафинитетно антитяло, както е осигурено в настоящото изобретение;·' · включено в първия фузионен партньор (човешка рамкова или човешка имуноглобулинова вариабилна област).

За предпочитане първият фузионен партньор е оперативно свързан към втори фузионен партньор. Вторият фузионен ^: парньор е дефиниран по-горе и може да включва последова-

jBk *>

• · · · • · • · · · • · • ···· • · телност, кодираща втора област от интерес в антитялото, напр. Fc област. Вторите фузионни партньори може също да включват последователности, кодиращи други имуноглобулини, към които константната област на леката или тежката верига е фузирана в рамка или чрез линкерна последователност. Конструираните антитела срещи функционални фрагменти или аналози на IL4 могат да бъдат проектирани да разкриват повишено свързване със самото антитяло.

Вторият фузионен партньор може също да бъде асоцииран с ефекторни агенти, както е дефинирано по-горе, включително непротеинови молекули— носители, към които вторият фузионен партньор може да бъде свързан чрез конвенционални методи. Фузията или свързването между втория фузионен партньор, напр. антитялова последователност и ефекторен агент може да стане чрез всякакви удобни методи, напр. чрез конвенционални ковалентни или йонни връзки, протеиново сливане или хетеробифункционални крос-линкери, напр. карбодиимид, глутаралдехид и подобни. Такива техники са познати в практиката и охотно описвани в конвенционалните химични и биохимични текстове.

В допълнение, конвенционалните линкерни секвенции,които просто осигуряват желаното пространство между втория фузионен партньор и ефекторния агент могат да бъдат конструиране във фузионната молекула. Проектирането на такива линкери е добре познато на професионалистите·.

В добавка, сигналните последователности за молекулите На изобретението могат да бъдат модифицирани така, че да повишават експресията. Като пример в желаният фузионен протеин, имащ последователност като тази на миша тежка верига, която е идентична с химерната вариабилна тежка верига (VH) на фиг.2 {последователност с идентифик. No: (4) • · • ·

оригиналният сигнален пептид е заместен със друга сигнална последователност, (аминокиселинни остатъци 1-20 от последователност с идентифик. No 6)

Един примерен фузионен протеин съдържа пептид или протеин от вариабилна тежка или лека верига, който има антигенната специфичност на MAb ЗВ9 т.е. VH [аминокиселинни остатъци 21-141 от последователности с идинтифик. No 9 и 10] и VL вериги [аминокиселинни остатъци 21-132 от последователности с идентифик. No 1 и 2]. Тъй като други желани фузионни протеини на това изобретение се характеризират с аминокиселинна секвенция, съдържаща поне една, а препоръчително всички ООК на вариабилната област на тежката и/или леката верига на мишо антитяло ЗВ9, а останалите му последователности са получени от човешки източник, или функционални фрагменти на техни аналози. Вж примерно хуманизираните VH u VL области на последователности с идентифик. номера 11 и 12 и последователности с идентифик. номера 13 и 14 (Фиг. 4 и 5).

В по-нататъшно формиране, конструираното антитяло на изобретението може да бъде прикрепено към добавъчен агент. Например процедурата на рекомбинантната ДНК технология може да се използва за получаване на конструирано антитяло на изобретението Fc фрагмента на СНЗ домена на пълната' антитялова молекула е заместен със ензим или друга откриваема молекула, (като ефекторна или репортерна молекула)

Вторият фузионен партньор може също да бъде оперативно свързан към неимуноглобулинов пептид, протеин или фрагмент от тях, хетероложен спрямо ООК съдържащата последователност, имаща антигенната специфичност на мишо ЗВ9. Резултантният протеин може да проявява както анти-И.4 антигенна специфичност, така и характеристика на не• · · · · · • · · · · · • ···· · · · · • · · · · ·*«··· • · · · · · ····· ·· · • · • · • · · · • · · · имуноглобулин по време на експресия. Това свойство на фузионния партньор може да бъде примерно функционално свойство, като друг свързващ или рецепторен домен, или терапевтично свойство, ако фузионният партньор сам по себе си е терапевтичен протеин, или допълнителна антигенна характеристика.

Друг желателен протеин на това изобретение може да съдържа пълна антитялова молекула, съдържаща тежки и леки вериги в пълната им дължина или някакъв дискретен фрагмент от тях, като Fab или F(ab)2 фрагменти, димер на тежка верига, или някакви минимални рекомбинантни фрагменти като Fv или едноверижно антитяло, или някаква друга молекула със същата специфичност като избраното донорно моноклонално антитяло, напр. МаЬЗВ9 или 6А1. Такъв протеин може да се използва за формиране на фузионен протеин или може да се използва в нефузирана форма.

Когато вторият фузионен партньор е получен от друго антитяло, например някакъв изотип или клас от имуноглобулинова рамкова или константна област, се получава конструирано антитяло. Конструираните антитела могат да включват имуноглобулинови константни области и вариабилни рамкови области от е&ин източник, примерно акцепторното антитяло, и една илиТТовече (за предпочитане всички) ООК от донорното антитяло, напр. анти-!!_4 антитялото, описано тук. В прибавка, измененията, т.е. делециите, субституциите или добавленията към рамковата област на вариабилните домени на тежката и/или леката' верига на акцепторното антитяло на нуклеиновокиселинно или аминокиселинно нива, или на донорните ООК могат да бъдат направени с цел да се запази антигенносвързващата специфичност на донорното антитяло. ’

-26Такива конструирани антитела са проектирани да използуват една (или и двете) вариабилни тежки или леки вериги на IL4 моноклоналното антитяло (по избор модифицирано както е описано) или една или повече от по-долу идентифицирани тежко или леко верижни ООК (вж Пример 3). Конструираните антитела на изобретението са неутрализиращи, т.е. те избирателно блокират свързването към рецептора на IL4 протеина. Например, конструираното антитяло, получено от МА63В9 е насочено срещу специфичен терциерен протеинов епитоп на човешкия IL4, за който се смята, че е при В-С бримката-^С спиралната област, както е описано по-горе.

Такива конструирани антитела могат да включват хуманизирано антитяло, съдържащо рамкови области на избран човешки имуноглобулин или субтип, или химерно антитяло, съдържащо константни области от човешка лека и тежка верига, фузирани към функционални фрагменти на IL 4 антитялото. Подходящо човешко (или от друго животно) акцепторно антитяло може да бъде селекционирано от конвенционалните базови данни, напр. базовите данни КАВАТ®, базовите данни в Лос Аламос, базовите данни на Swiss Protein, чрез хомология към нуклеотидните и аминокиселинните последователности на донорното ащитяло. Човешко антитяло, характеризиращо се с хомоложност спрямо рамковите области на донорното антитяло (или на аминокиселинна база) може да е подходящо за осигуряване на константната област на тежката верига и/или на вариабилната рамкова област на тежката верига за инсерция на донорните ООК. Подходящо акцепторно антитяло, способно да даде лековерижни константни или вариабилни области може да бъде избено по сходен начин. Трябва да се отбележи, че тежката и леката верига на акцептор; ното антитяло не се изисква да произлизат от същото акцепторно антитяло.

• ·

Желателно е хетероложните рамкова и константна области да се избират от човешките имуноглобулинови класове и изотипове, като IgG (субтипове от 1 до 1), IgM, IgA и IgE. Акцепторното антитяло няма нужда да съдържа само човешки имуноглобулинови протеинови последователности. Например може да бъде конструиран ген в който ДНК секвенция кодира част от човешка имуноглобулинова верига и е претърпяла фузия с ДНК секвенция, кодираща неимуноглобулинова аминокиселинна последователност като полипептидна ефекторна или репортерна молекула.

Пример за особено желано хуманизирано антитяло, съдържа ООК на ЗВ9, вмъкнати в рамковата област на избрана човешка антитялова последователност. За неутрализиращи хуманизирани антитела, една, две или за предпочитане три ООК от вариабилните области на леката и/или тежка верига на IL4 антитяло са вмъкнати в рамковата област на избрана човешка антитялова последователност, замествайки нативните ООК на последната. Предпочита се в хуманизирано антитяло, вариабилните домени в тежката и лека човешки вериги да бъдат конструирани с една или повече замени на ООК. Възможно е да се използват всичките шест ООК или различни комбинации от по-малко от шест ООК. Предпочита се да се заминят всичките шесТ ООК. Възможно е да се заменят ООК само в тежката човешка верига, използувайки като лека верига немодифицираната лека верига на човешкото акцепторно антитяло. Алтернативно също може да се използва съвместима лека верига, избрана от друго човешко антитяло, чрез прибягване до конвенционалните антитялови базови данни. Остатъкът от конструираното антитяло може да се получи от всеки подходящ акцепторен човешки имуноглобулин. Така конструираното хуманизирано антитяло има за предпочитане структура на естествено човешко антитяло или негов

фрагмент и съдържа комбинация от свойства, необходими за терапевтичното му използване, т.е. за лечение на IL4 медиирани възпалителни заболявания у човека или за диагностични цели. Като друг пример, конструираното антитяло може да съдържа три ООК от вариабилната област на леката верига на ЗВ9 [последователности с идентифик. номера 16,18,20 и 28] и три ООК от вариабилната област на тежката верига на ЗВ9 [последователности с идентифик. номера 22,24, и 26]. Полученото хуманизирано антитяло се характеризира с антигенсвързващата специфичност и висок афинитет на моноклоналното тяло ЗВ9.

^г Трябва да се разбере от специалистите, че конструираното антитяло може да бъде по-нататък модифицирано чрез промени в аминокиселините на вариабилните домени, без да е необходимо да се повлиява специфичността или високия афинитет на донорното антитяло (напр. аналог). Напримерхуманизирано моноклонално антитяло е конструирано така, че аминокиселинният остатък в леката верига при позиция 120 е аргинин [последователности с идентифик. номера 13 и 14] или треонин [последователности с идентифик. номера 57 и 58]. Предвижда се аминокиселини в леката и тежката верига да могат да-ре заместват с други аминокиселини даори в рамковите области на вариабилните домени и/или ООК.

В добавка, константната област може да се промени така, че да се повишат или намалят селективните свойства на молекулите на настоящото изобретение. Например димеризиране, свързване към Fc рецепторите или способност да се свързва и активира комплемент (вжАпда! et al., Mol. Immunol, 30:105-108 (1993), Xu et al-, J- Biol· Chem..269:3469-34 74 (1994), Winter et al., EP 307. 434-B). Фузионен протеин, който е химерно антитяло се различава от хуманизираните антитела, описани по-горе, поради това, че •29 осигурява изцяло не-човешко донорно антитяло с вариабилни области на леката и тежката верига, включително рамковите области в асоциация с човешки имуноглобулинови константни области за двата вида вериги. Предполага се, че химерните антитела, които съдържат допълнителни не-човешки последователности спрямо хуманизираните антитела могат да предизвикат значителен имунен отговор у хора.

Такива антитела са полезни за профилактика и лечение на 1L4 медиирани алергични разтройства, както се обсъжда по-долу.

VI. Получаване на фузионни протеини и конструирани антитела. За предпочитане е последователностите на вариабилните леки и/или тежки вериги и ООК на MAb ЗВ9 [последователности с идентифик. номера 18,18,20,22,24 и 28] или други подходящи донорни моноклонални антитела(напр. 6А1) и кодиращите ги нуклеиновокиселинни последователности да се използват за конструиране на фузионни протеини и инженерни антитела (за предпочитане хуманизирани) в това изобретение чрез използване на следния процес. Същите или сходни техники могат да се използват за получаване на други съставки на това изобретение.

Хибридома,^:продуцираща избрано донорно антитяло (в^астност моноклонално антитяло ЗВ9)се клонира конвенционално и ДНК на вариабилните области на нейните тежки и леки вериги се получават чрез техники, познати на специалистите, т.е.· .техники, описани в Sambrook et al.. Molecular Cloning (A Laboratory Manual). 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Вариабилните области на леката и тежката верига на ЗВ9, съдържащи поне ООК и тези части от рамковата област на вариабилните домени, на леката и/или тежката верига на акцепторното моноклонално антитяло, които са необходими за запазване на свързващата ···· · специфичност на донорното антитяло, както и останалите имуноглобулинови части на антитяловата верига, получени от човешки имуноглобулин се получават чрез използване на полинуклеотидни праймери и обратна транскриптаза. ООК се идентифицират чрез използване на позната база данни и чрез сравнение с други антитела.

Мишо/човешкото антитяло може след това да се приготви и изследва за свързваща способност. Такова химерно антитяло съдържа целите Vh u Vl области на не-човешкото донорно антитяло, свързани с човешки имуноглобулинови константни области от двете вериги.

Хомоложни рамкови области на тежковерижните вариабилни области от човешкото антитяло се идентифицират чрез използване на компютризирани бази данни, напр. КАВАТ® и като акцепторно антитяло се избира човешко антитяло, хомоложно на ЗВ9. Последователностите на синтетичните тежковерижни вариабилни области, съдържащи ООК на ЗВ9 в човешки антитялови рамки се оформят с незадължителни нуклеотидни размествания в рамковите области за да се инкорпорират места за рестрикция. Така оформената последователност след това се синтезира чрез припокриващи се олигонуклеотиди, амПХифицирани чрез полимеразна верижна реакция (PCR) и се коригират за грешки.

Подходяща лековерижна вариабилна рамкова област се оформя по сходен начин. '·-· '··

Хуманизирано антитяло може да се получи от химерно антитяло или за предпочитане да се приготви синтетично чрез подходящо включване на ООК от леки и тежки вериги на донорното антитяло в избрани рамки на леката и тежка вериги. Алтернативно, хуманизирано антитяло на изобретението може да се приготви

чрез използване на стандартни техники за мутагенеза. Така полученото хуманизирано антитяло съдържа човешки рамкови области и ООК на донорното моноклонално антитяло. Може да има последващо манипулиране на рамковите остатъци. Полученото хуманизирано антитяло може да бъде експресирано в рекомбинантни клетки от гостоприемник например COS и СНО клетки. Допълнителни подробности от тази процедурдса дадени в Пример 6. Други хуманизирани антитела могат да бъдат .получени чрез използване на тази техника върху други подходящи 11_4-специфични, неутрализиращи, не-човешки високотитърни антитела.

Конвенционален експресионен вектор или рекомбинантен пдазмид се получава чрез поставяне на кодиращите последователности за фузионния протеин в оперативна асоциация с конвенционалните регулаторни контролни последователности, способни да контролират репликацията и експресията в клетките на гостоприемника и секретирането от тях. Регулаторните последователности включват промоторна секвенция, напр. CMV промотор и сигнални последователности, които могат да бъдат получени от други познати антитела. Сходно, втори експресионен вектор се получава, ако имаме ДНК последователност, която кодира комплементарни антитялови лека и тежка верига. Препоръчва се вторият експресионен вектор да е идентичен на първия до такава степен, че кодиращите последователности и селективните маркери да подсигуряват доколкото е възможно всяка полипептидна верига функционално да се експресира. Избрана клетка - гостоприемник се ко-трансфектира по конвенционалнните техники с първия и втория вектори или просто се трансфектира с единичен вектор за да се създаде трансфектирана клетка - гостоприемник на даденото изобретение, която съдържа рекомбинантни или синтетични леки и тежки вериги. Трансфектираната клетка след това се култивира по конвенционалните техники за да се получи конструираното антитяло на изобретението. Хуманизираното антитяло, което включва асоциация на рекомбинантни тежки и/или леки вериги се скринира от културата по подходящ начин напр. ELISA или RIA. Сходни конвенционални техники могат да се използват за конструиране на други фузионни протеини и молекули на това изобретение.

Подходящи вектори за стъпките на клониране и субклониране, които се използват, могат да бъдат подбрани от специалист. Например мот ат да се използват конвенционалните pUC серии от клониращи вектори. Един от използваните вектори е pUC19, който може да се купи от търговските фирми като Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) или Pharmacia (Uppsala, Sweden). В прибавка, всеки вектор, който се реплицира охотно, има изобилие от клониращи места и маркиращи гени и се манипулира лесно, може да се използва за клониране. Селекцията на клониращ вектор не е лимитиращ фактор на това изобретение.

Сходно, векторите, използвани за експресия на конструирани антитела, съгласно настоящото изобретение могат да бъдат избирани от специалист от всеки конвенционален вектор. Векторите също съдържат избрани регулаторни последователности, които са в оперативна асоциация с ДНК кодиращите последователности на имуноглобулиновите области и са способни да направляват репликацията и експресията на хетероложни ДНК последователности в избрани клетки от гостоприемник като CMV промоторите. Тези вектори съдържат по-горе описаните ДНК последователности, които кодират конструираното антитяло или фузионната молекула. Алтернативно векторите могат да включват избраните муноглобулинови секвенции, модифицирани чрез инсерция на желани рестрикционни места за по-лесно манипулиране. Експресионните вектори могат също да се характеризират с маркиращи гени, удобни за амплифициране на експресията на хетероложните ДНК последователности, напр. дихидрофолатен редуктазен ген от бозайници (DHFR) или ген за резистентност към неомицин (neoR). Други предпочитани векторни последователности включват поли-А сигнална секвенция, като тази от говежди растежен хормон (BGH) и бетаглобулинова промоторна секвенция (betaglopro). Експресионните вектори, които се използват тук могат и да се синтезират чрез техники, познати на специалистите.

Компонентите на такива вектори, т.е. репликони, селективни гени, умножители (енхансери), промотори, сигнални последователности и т.н. могат да се получат от естествени източници или да се синтезират чрез познати процедури за използване за направляване на експресията и/или секрецията на продукта на рекомбинантната ДНК в избрания гостоприемник. Други подходящи експресионни вектори, на които се знаят типовете номера са познати в областта и се използват за тази цел у бозайници, бактерии, насекоми, дрожди и гъби.

Настоящото изобретение също включва клетъчна линия, трансфектирана с рекомбинантен плазмид, съдържащ кодиращи те последователности на конструираното антитяло или фузионните му молекули. Клетките на гостоприемник, използвани за клониране и други манипулации също са конвенционални. ' С наи-голямо предпочитание за репликация на клониращите вектори и другите етапи на конструирането на фузионните протеини се използуват клетки στ различни щамове Е. co!i. Подходящи клетки · гостоприемници или клетъчни линии за •· ···· ♦ · · • · · · · · • ···· · ··· • · · · 9 999999 • · · · · · ····· ·· · • ·· • ·· · · • · · 99

99

99 9

-34екснресия на конструираното антитяло или фузионния протеин на изобретението са предпочитаните еукариогни клетки като СНС), COS, фибробластни клетки (примерно ЗТЗ) и други миел.оидни клетки, а най се предпочитат клетки от бозайници като СНО и миелоидни клетки. Човешки клетки могат да се използват, като дават възможност на молекулата да бъде wtгдифицирана чрез гликозилиране. Също се използват и други еукариотни клетъчни линии. Селекцията на подходящи клетки от (юзайнизи за гостоприемник и методите за трансформация, култивиране, амплифициране, скрининг и получаване на ! н?'?дук ’ а и неговото пречистване са познати. Вж Sambrook et al, цитирани но· rope.

бактериалните клетки могат да бъдат полезни за гостоприемник а * скснреспя на моноклонални антитела на настоящото изобрети <ие обаче съгласно тенденцията на протеините, експресира> !и в бак! ериални клетки да бъдат в ненагъната или неправилно ίini ьш!1 а форма или в негликозилирана форма, всяко рекомби!оч> πιο ентигяло получено в бактериална клетка трябва да бъде скринирпно за запазване на антигенсвързващата способност. Лко^лекулше, експресирани от бактериални клетки се получат ? правилно па? ъната форма, бактериалната клетка е желан * осгоприемник. Например различните щамове Е. coli и-чползувани за експресия са добре познати като клетки на «осгоириемник в полет на биотехнологията. Различни щамове В. subtiiis, Streptomyces, други бацили и сходни могат да се използваг в този метод.

Кааго е желателно, щамове дрожди, познати на специалистите също могат да се използват като гостоприемници, както и клетки от насекоми, напр Drosophila u Lepidoptera и вирусни експресиенни сис1еми. Виж Miller et al., Genetic Engeneering, 8:277-298, РЬгшт Press (198Θ) и цитатите в нея.

-35Глзвните методи, чрез които векторите на изобретението могат да се конструират, методите за трансфекция за получаване на клетки на гостоприемник на изобретението и методите за култивиране, необходими за получаване на фузионни протеини и на конструирани антитела на изобретението от същия ’ гостоприемник, всички са конвенционални техники. По този начин, веднъж получен, фузионния протеин или конструираното антитяло могат да се пречистят от клетъчната култура, съгласно стандартни процедури, включващи преципитация с амониев сулфат, афини гетни колони, колонна хроматография, гел електрофореза и сходни Тези техники са общоприети и не ограничават изобретението.

Друг метод за експресия на хуманизирани антитела може да използва експресията в трансгенни животни, както е описано в U.S. Patent No. 4,873,31G. Той се отнася до експресионна система, съдържаща човешки казеинов промотор, който когато се включи трансгенно в бозайници дава възможно женските да продуцират желания рекомбинантен протеин в млякото си. Веднъж експресирано по желания метод, конструираното антитяло се изпробва за in vitro активност чрез подходящо изследване. Понастоящем се използват конвенционални ELISA набори за изпитване на качественото и количествено свързване на конструираното антитяло към IL4 епитоп. В допълнение могат да се използват и други in vitro методи като.В1Асоге (Pharmacia) за потвърждаване на неутрализиращата ефикасност преди понататъшните клинични изследвания при хора, правени за да се установи персистирането на конструираното антитяло в организма, въпреки обикновените механизми на клирънс. Следвайки процедурите, описани за хуманизирани антитела получени от ЗВ9, специалистите могат да конструират хуманизирани антитела от други донорни IL4 антитела, ·

-3θ последователности от вариабилни области и ООК пептиди, описани тук. Конструирани антитела могат да се получат чрез рамки на вариабилна област, потенциално разпознавани като ^йсвои^й от реципиента на конструираното антитяло. Минорни модификации на рамките на вариабилните области могат да бъдат осъществени за да предизвикат голямо повишение на антенното свързване без забележимо увеличение на имуногенноста у реципиента. Такива конструирани антитела могат ефективно да повлияват човек при IL4 медиирани състояния. Те могат да бъдат също така полезни за диагнозата на тези състояния.

V77. 1'ерапевтично/профилактично използване

Т ова изобретение се отнася също така до метод за лечение на хора, показващи алергични разтройства, който се състои в прилагане на ефективна доза антитела, включващи едно или повече от конструираните антитела или фузионни протеини, описани тук или фрагменти от тях.

Терапевтичният отговор, предизвикан чрез използване на молекулите на това изобретение се получава чрез свързване към човешкия IL4 и впоследствие блокиране на освобождаването на IgE. Така молекулите на настоящотоизобретение, в препарати и форми, подходящи за терапевтично използване са много желани за тези индивиди, които проявяват алергичен отговор като алергечни ринити, конюнктивити, дерматити, атопична астма и анафилактичен шок.

Фузионният протеин, антителата, конструираните антитела и техните фрагменти от това изобретение могат да се използват в съчетание с други антитела, особено човешки моноклонални антитела, реагиращи с други маркери (епитопи), отговорни за състоянието, срещу които конструираното антитяло на • Λ ···· • · ·..9 • 9 9··· • . · -. ·. ·.9 • 9 9· '·

J» • ·· • ··· • · ·· •· til h:

у· . ._;1у.

' - .......

ж ?ί· изобретението е насочено. Сходно, моноклонални антитела, реагиращи с епитопи, отговорни за състоянието в избрано животно, срещи които антитялото на изобретението е насочено могат да се използват във ветеринарната практика. Терапевтичните агенти на това изобретение се смята, че са желани за лечение на алергични състояния в продължение на 2 дни до 3 седмици или колкото е необходимо. Например по-дълго лечение може да е желателно, когато се лекува сезонен ринит или сходно състояние. Това представлява значително преимущество пред понастоящем използваните инфузионни средства за лечение на IL4 медиирани разтройства. Дозата и продължението на лечението са свързани с присъствието на молекули те на настоящото изобретение в циркулацията при човека и могат да бъдат нагласявани от специалисти в зависимост от състоянието, което се лекува и общото здравословно състояние на пациента.

Начинът на прилагане на терапевтичния агент на изобретението , може да бъде всеки подходящ път, който доставя агента на приемателя (пациента), фузионните протеини, антителата, конструираните антитела и фрагментите ог тях и фармацев- _г тичните продукти на изобретението са особено полезни за ' ^: парентерално приложение, те. подкожно, интрамускулно, интравенознд или интраназално. · i - / . /

Iерапевтичните агенти на изобретението могат да се приготвят : като фармацевтични продукти, съдържащи ефективно . количество от конструираното (т.е. хуманизирано) антитялощат! л изобретението.като активна съставка във фармацевтично 'чМ? λ > < приемлив носител. В профилактичните агенти на изобретението, се използва водна суспенсия или разтвор, съдържащ конструираното антитяло, за предпочитане буфериран при физиологично pH, готов за инжектиране. Композицията за . :' ^; ' . ..;· . ' Г >

’ ·· 1 ffc :5¾ ш

Т парентерално прилагане обикновено ci състои от разтвор на конструираното антитяло на изобретението или коктейл от него, разтворен във фармацевтично приемлив носител, обикновено воден носител. Могат да се използват варианти на водни носители, например 0.4% разтвор на натриев хлорид, 0.3% глицин и сходни. Тези разтвори са стерилни и обикновено не съдържат твърди частици. Разтворите могат да се стерилизират с конвенционални, добре познати стерилизационни техники (напр. филтрация). Продуктите могат да съдържат фармацевтично приемливи добавъчни субстанции, според изискванията на физиологичните условия, като вещества нагласящи pH, буфериращи агенти и т.н. Концентрацията на антитялото на изобретението в такива фармацевтични форми може да варира широко, т е. от по-малко от 0.5%, обикновено поне 1 % до 15-20 тегловни проценти и може да се избира съгласно обема на течността, вискозитета и т.н. съгласно избрания метод на прилагане.

Така, фармацевтичните продукти на изобретението за интрамускулно инжектиране могат да бъдат приготвени да съдържат 1 мл стерилна буферирана вода и в нея от 1 ng до 100 mg, г.е. около 50ng до 30 мд или за предпочитане от около 5 mg до 25 mg от конструираното антитяло на изобретението. Сходно, фармацевтичните препарати на изобретението за интравенозно инжектиране могат да съдържат до 250 мл разтвор на Рингер и or 1 до 30 или за предпочитане 5 до 25 mg от конструираното антитяло на изобретението. Актуални методи за приготвяне на парентерално приложими композиции са познати на специалистите и са описани по-детайлно в примерно Remington’s Pharmaceutical Science, 5th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.npeflno4HTa се терапевтичният

агент на изобретението, когато е във фармацевтичен препарат, да бъде даден под формата на единици доза. Подходящата терапевтична доза може да се определи лесно от специалисти. За ефективно лечение на възпалителни заболявания при човека и животните една доза е приблизително 0.1 mg до 20 mg протеин или антитяло за 70 кг телесно тегло, която може да бъде приложена парентерално, за предпочитане интрамускулно. Такава доза може, ако е необходимо да се повтори след οι щеделени интервали от време, според лекуващия лекар по време на възпалителния отговор.

Изобретението също съдържа приложението на IL4 фузионни протеини на изобретението, конкурентно или последователно с други ант итела или фузионни протеини, които се характеризират с анти-!14 активност, като анти-туморен некротичен фактор или други фармацевтични съставки, съвместими с IL4 рецепторсвързващата способност на фузионните протеини на това изобретение. Такива други антитела са достъпни по търговски път или могат да бъдат оформени по методите, описани тук. Фузионните протеини и конструираните антитела на това изобретение могат да бъдат също така използвани в диагностични режими, като за определяне на IL4 медиирани разтройства или трасирайки успеха за лечение на такива разтройства. Като диагностични реагенти тези фузионни протеини могат да бъдат конвенционално белязани за използване чрез ELISA и други конвенционални методи за измерване нивата на IL4 в серума, плазмата или друга подходяща тъкан. Естеството на тези изследвания, в които се използват фузионните протеини е конвенционално и те не ограничават писаното тук.

···· • ···

-40Антителата, конструираните антитела и фрагментите от тях, описани тук могат да бъдат лиофилизирани за съхранение и възстановени в подходящ носител преди употреба. С обикновени имуноглобулини е показано, че тази техника е ефективна и познатите лиоф^илизационни и въстановителни методи могат да се използват.

Следните примери илюстрират различните аспекти на това изобретение, включвайки конструирането на екземпляри от инженерни антитела и тяхната експресия в подходящи вектори и клетки - гостоприемници, които не ограничават обхвата на това < изобретение. Всички аминокиселини са идентифицирани чрез конвенционалните три букви или чрез еднобуквен код. Всички необходими рестрикционни ензими, плазмиди и други реагенти и други материали се получават от търговски източници, ако не е написано друго. Всички основни клониращи свързвания(лигатури) и други рекомбинантни ДНК методи са направени по Maniatis et а!., цитиран по-горе, както и от неговото второ издание от Samlrook etal.

Пример 1 — Получаване на моноклонално антитяло ЗВ9

А. Имунизационна процедура

Четири мишки (F1 хибриди на Balb/c u C57BL/6 се имунизират подкожно с 50 дд рекомбинантен Е. cdi човешки IL4 в пълен адювант на Freund и четири седмици по-късно се инжектират с 50 mg IL4 в непълен адювант на Freund. На базата на добър серумен титър на антитяло към IL.4 едната мишка получава понататъшна имунизация с 200 mg IL4 (i.p. във физиологичен разтвор)на осмата седмица,два дни по-късно със 100 mg IL4(ί.ρ. във физиологичен разтвор) и два дни по късно с 50 mg IL4 (i.p. въз физиологичен разтвор). Два дни след последната имунизация се прави спленектомия.

” *5, - ·

• ·	• · · ·	• ·	•	• ·	• ·
•	•	•	• ·	•	•		•	•
•	•	• · ·	• ·	• ·	•		•	···
•	•	•	• · ·	• · · · ·	•	•	•	• ·
•	•	•	• ·	•			•	• ·
··		• · ·	• ·	•	•	•		• ·

-41В. Фузионна процедура и скринингова система Мишите далачни клетки се използват за да се получат хибридоми (чрез стандартни процедури, както е описано err Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), от които повече от 250 клона клетки се скринират за секреция на антитела към IL4, използвайки търговски достъпната BIAcore система и ELISA изследвания, както е описано по-долу, за свързване с IL4. Пет гнезда дават положителни резултати. Само един клон от мишите, ЗВ9, е силно положителен. Всички вторични клонове στ ЗВ9 са положителни.

Пример 2 — ELISA изследвания и афинитетни константи

A. EL.ISA

Скриниращото изследване, направено както следва е оформено за измерване на афинитета към човешки IL4. За експеримента, една 96-гнездна плака, активирана с алдехид се покрива с IL4 в концентрация 1 gg/mL, 100 дд/гнездо, 0.1 М боратен буфер, pH 8.5 и се инкубира през нощта при стайна температура. Човешкият IL4 се свързва ковалентно с плаката. Разтворът на IL4 се изсмуква и неспецифичните места за свързване се блокират с 1 % говежди серумен албумин в TBS-буфер (50mM Тris, 150 mM NaCI, 1 гпМ МдС1з,0.02% ΝβΝθ, pH 7.4) за 60 минути при 37ОС. Следвайки това и всяко от следващите стъпала, плаката се измива четирикратно с миещ буфер (10mM Tris, 150 mM NaCI, 0.05% Tween 20,0.02% №N3, pH 7.4). После се прибавят 50 μΙ хибридомна среда (или пречистено ЗВ9 или Fab фрагменти) и 50 μ’ работен буфер (0.5% говежди гама глобулин в TBS буфер) и плаките се инкубират за 60 минути при 37°С. 100 μΙ Счютинилирано анти-мишо антитяло се прибавят за гнездо в работен буфер и се инкубират както преди. 100 μΙ алкална фосфатаза, конюгирана със стрептавидин се прибавя за гнездо и се инкубира 30 минути при 37°С. 100 μΙ за гнездо ΡΝΡ субстрат се прибавят и се инкубира 30 минути при 37ОС.

Отчитанията се правят при дължина на вълната 405 nm.

За експеримент 2, плаки покрити със стрептавидин (100 μί/гнездо, 1 pg/mL във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) се инкубират до следващия ден при 4°С и се изследват както следва. Стрептавидиновият разтвор се аспирира, неспецифичните места на свързване се блокират с 1% BSA в ТBS буфер (60 минути при 37°С). След това и всяко следващо стъпало плаките се мият 4 пъти с миещ буфер. 50 μΐ био’ инилиран IL4 се прибавят с 50 pL работен буфер и се hi жубират 30 минути при 37°С.

След това се прибавят 50 ц1 пречистен ЗВ9 IgG или Fab фрагмент (или хибридомна среда) плюс 50 pL работен буфер и се инкубира 60 минути при 37оС. 100 цбанти мишо-IgG, конюгирано с алкална фосфатаза се прибавя и се инкубира 60 минути при 37°С. 100 μ6 ΡΝΡ субстрат се прибавя и се инкубира 30 минути при 37°С. Отчитането се провежда както по-горе.

В. Пресмятане на афинитета на ЗВ9 към IL4

Използвайки резултатите от експериментите, описани по-горе и сумирани както следва, се изчислява Ка за ЗВ9 както е описано от Beatty et al. J. Immunol. Methods. 100:173-179 (1987):

Ab *= концентрацията антитела, свързани c 150 ng/ml биотинилиран hlL4

Ab = концентрацията антитела, свързани c 300 ng/ml биотинилиран h!L4

Дисоциационната константа се изчислява от връзката ^aff

Експеримент 1: ELISA изследване на покрити със стрептавидин

96-гнездни плаки (100 ng/гнездо). Ка == 22 х 10-1°М (ЗВ9 Fab). *.

« · ·

-43Експеримент 2: ELISA изследване на покрити със стрептавидин 96-пюздни плаки (100 ng/гнездо). K<j = 1,4 х10*¹⁰М (ЗВ9 IgG).

С. Специфичност

Ма юклоналното антитяло ЗВ9 разпознава човешки IL4, но не разпознава говежди или миши IL4. Това се установява по следния .< шии. Провежда се ELISA изследване на 96-гнездни плаки, покрити с анти-мишо IgG и след това блокирани с говежди серумен албумин, като във всяко гнездо има 50 μ! ЗВ9 (100 ng/mL), 25 pL не-човешки IL4 и 25 pL6motmh-IL4. Инкубират се 60 мин при '37°С, следва миене, конюгирана със стрептавидин алкална фосфатаза и ΡΝΡ.

Сходно се намира, че MAb 6А1 не разпознава говежди или миши IL4, С

Пример 3 — Хуманизирано антитяло

Хуманизираното антитяло се оформя така, че да съдържа миши ООК в човешка антитялова рамка. Хуманизираната версия на IL4 специфично мишо антитяло ЗВО се приготвя чрез следните манипулации:

А. Клониране на кДНК кДНК клоновете са получени от тежки и леки вериги на ЗВ9 чрез мРНК, екстрахирана от ЗВ9 хибридомна клетъчна линия [Пример 1 ], използвайки набор от Boehringer Mannheim. Праймери, специфични едновременно за мишата шарнирна област или за кконстантната област се използват за синтеза на първата верига, к -верижният праймер е (последователност с йдентифик. No: 29): · 5*-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3’

-верижният праймер е (последователност с идентифик. No: 30): ’ SMITACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC-S'.

• · · • ·

-44.

Двойноверижната кДНК се клонира директно в плазмидите )GEM7f+[Promega], които се трансформират в Е. coli DH5-a Bethesda Research Labs].

3. Секвениране на ДНК

Секвенират се осем тежко- и един лековерижен кДНК клона от точка А. Резултатите от секвенирането на вариабилната област на тези клонове са показани в последователности с идентифик. No: 1,2,3 и 4. Всеки клон, съдържа консервативни аминокиселини,които се намират между мишата тежко или лековерижна вариабилна област и мишите сигнални последователности. ООК на аминокиселинните последователности са изброени по-долу,

ООК за тежката верига са последователности с идентифик. No: 22,24 и 26 (аминокиселини 50-56,71-86 и 119-129 на последователност с идентифик. No:4). Вжфиг. 2. Тези секвенции се кодират от последователности с идентифик. No: 21,23 и 25 респективно. ООК за леката верига са последователности с идентифик. No: 16,18 и 20 (аминокиселини 45-58,74-80 и 113-121 на последователност с идентифик. No: 2). Вж Фиг. 1. Тези секвенции се кодират от последователности С идентифик. No: 15, 17 и 19 респективно.

С Селекция на човешките рамкови участъци (области).

След клонирането на ЗВ9, аминокиселинните последователности на вариабилната област (аминокиселини 21 -132на ик. No:2 и аминокиселини 20-140 на ик. No:4) се сравняват с човешките имуноглобулинови последователности от базата данни, използвайки КАВАТ® и SWISS за да се идентифицира човешката рамкова област за леката и тежка верига, която найтясно ще съвпадне с мишия родител по хомоложност на последователностите. В прибавка на това търсене за хомоложност на последователност с иденти последователност с иденти v

-45последователностите, тежката и лека вериги също се изследват срещу позиционни базови данни, получени от структурни модели на Fab домена за да се преценят потенциални конфликти, дължащи се на аминокиселинни замествания, които могат да повлияят ООК. В настоящия случай такива очевидни конфликти не са отбелязани, следователно кодиращата ДНК съгласно дедукция с аминокиселинната последователност може да се използва.

Използват се тежковерижните рамкови области на дадено ан ги тяло, получено от човешки миеломен имуноглобулин (COR) [Е. М. Press u N.M. Hogg, Biochem. J..117:641-660 (1970)].

Намерено е, че тази последователност е близо 77% хомоложна (69.4% идентичност) на вариабилната област на ЗВ9 на аминокиселинно ниво. За подходяща лековерижна рамкова област се използва лековерижната рамкова последователност на антитялото, идентифицирано в H.G. Klobeck et al, Nucl. Acids Res., 13:6515-6529 (1965). Установено е, че човешката антитялова последователност е приблизително 80.2% хомоложна (72.0% идентичност) на вариабилната лековерижна област на змингжиселинно ниво.

Давайки мишите ЗВ9 ООК ((последователностг с идентифик. No: 15-26] и последователностите на човешкото антитяло, е получена синтетична тежка верига и се прилага PCR за да се запълни и умножи ДНК. Гези последователности се синтезират чрез следните припокриващи се нуклеотиди и се умножават с PCR: Последователности с идентифик. No: 31-37 осигуряват пет припокриващи се олигонуклеотиди и два PCR праймера.

Оди! о(нуклеотидна) 1 (последователност с идентифик. No: 31) е намерено че се простира от бази 5 до 121. Олиго 2 (последователност с идентифик. No: 32) обхваща бази 122-241, а олиго 3 (последователност с идентифик. No: 33)обхваща бази

-4β·

242-361. Двата праймера на долния край на веригата (последователност с идентифик. No: 34 и последователност с идентифик.

No 35) обхващат бази 134-110 и 253-230. Всяка грешка в картираните субстанции, получена следствие PCR е коригирана. PCR огноео се провежда, използвайки 5' праймерни нуклеотиди 1-25 ( последователност с идентифик. No: 36) и 3' праймерни нуклеотиди 361 -341 (последователност с идентифик. No: 37). Синтетичната вариабилна област се лигира в експресионен век тор pCD по дължината със синтетичната сигнална последователност (последователност с идентифик. No: 5 и 6) от химерната тежковерижна конструкция с lgG1 човешка константна област. Синтетичната Уц и сигналните нуклеотидна и аминокиселинна последователности са дадени на Фиг. 4: (последователност с идентифик. No: 11 и 12). Аминокиселинните последователности на ООК (последователности с идентифик. No: 22,24 и 26) са идентични на мишите ЗВ9 ООК. Обаче кодиращите последователности за тези ООК (последователности с идентифик. No: 54,55 и 56) се различават от мишите последователности, кодиращи ЗВ9 (последователности с идентифик. No: 21,23 и 25). Резултантният експресионен вектор, !L4zhc1-1-Pcd е показан на фиг. 9.

ООК областите на предварително съществуващата рамкова област са подложени на смилане с рестриктази и заменени със следните синтетични IL4 ООК гени, получени по изкуствен начин. ЗаООКГ

Последователност с идентификационен No:38:5’CTAGCTGTGT CTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGG 3' Последователност с идентификационен No: · 39:CCTTGCAGTTGATGGTGGCCCTCTCGCCCAGAGACACAG Последователност с идентификационен No:40: TCGAGAGGCCTCCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATAT GAACTGGT ATCAGCAGAAACCC

-47Последователност с идентификационен No: 41: GGGTTTCTGCTGATACCAGTTCATATAACTATCACCATCATAATCA ACACTTTGGGAGGCCTC

За ООК 2:

Последователност с идентификационен No: 44: GGGCAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTACGCTGCATCCAATCTAGAA TCTGGGGTAC

Последователност с идентификационен No: 45: CCCAGATTCTAGATTGGATGCAGCGTAAATGAGCAACTTAGGAG

GCTGCCC

За ООК 3:

Последователност с идентификационен No:42: ATACTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCCGAGGTTCGGCG GAGGGAC

Последователност с идентификационен No: 43: CTTGGTCCCTCCGCCGAACCTCGGAGGATCCTCATTACTTTGCTG ACAGTAGT

Нуклеотидните и аминокиселинни последователности за синтетичните VL и сигнални секвенции са дадени на Фиг. 5 (последователности с идентифик. No 13 и 14). Аминокиселинните последователности на първите две ООК (последователности с идентифик. No 16 и 18) са идентични за съответните миши ЗВ9 ООК. Обаче кодиращата последователност на първата ООК (последователност с идентифик. No 53)се различава от мишата 389 кодираща секвенция (последователност с идентифик. No 15). По-нататък в последната ООК се конструират два хуманизирани участъка от мишата ЗВ9 последователност. Единият (последователност с идентифик. No 28) се различава по една >

-48аминокиселина (последователност с идентифик. No 20) στ нативната миша ЗВ9 секвенция. Последователност с идентифик. No 128 се кодира от последователност с идентифик. No 27. Синтетичната лековерижна вариабилна област се лигира в експресивния вектор, по посоката на сигналната секвенция (последователности с идентифик. No 7 и 8). Един от получените ексгюесионни вектори, IL4zhc1-0-Pcn е даден на фиг. 10. Тези синтетични вариабилни последователности на леката или тежка верига се използват в конструирането на хуманизирано ан гитяло.

Пример 4 - Експресия на хуманизирано моноклонално анитяло в COS uCHO клетки.

Правят се субклонове на pUC18 за Vh, за да се прибави сигнална последователност от човешко антитяло (последователност с идентифик. No: 5). За Vl pUC18 субклоновете се правят за да се прибави сигнална секвенция (последователност с идентифик. No: 7).

Хуманизираната тежка верига, получена от lgG1 изотип проявява 89.3% хомоложност (83.4%идентичност) на аминокиселинно ниво с мишата тежка верига от ЗВ9. Тази синтетична^н е осигурена в аминокиселини 20-141 на (последователности с идентифик. No: 11 и 12).

Хуманизираната лека верига, човешка капа-верига показва 92.0% хомоложност (86.6% идентичност) с ЗВ9 на аминокиселинно ниво. Синтетичната Vl (аминокиселини 21 -131 на последователности с идентифик. No:13 и 14) съдържа ЗВ9 ООК и е оформена и синтезирана както е описано по-горе за синтетични тежки вериги.

ДНК фрагментите, съдържащи техния съответен сигнал, свързан към вариабилната област на тежката или лека верига се включва в експресионни плазмиди, базиращи се на pUC19 в клетка от

-49бозайници, съдържащи CMW промогори и константни области на човешки тежка или лека вериги на химера, получена в Пример 5 по-долу чрез конвенциални методи (Maniatis et al, цитирано погоре за № се получат плазмидите и IL4hzhc1-1 -Ped (тежка верига) (Фиг. 9.) и IL4zhlc1-0-Pcn (лека верига)(Фиг. 10). HZHC и HZLC се ко-трансфектират в COS клетките и супернатантите се изследват чрез ELISA, както е описано непосредствено по-горе за присъствие на хуманизирано антитяло след три и пет дни. Друго хуманизирано антитяло е конструирано с lgG4 изотип.

Горните примери описват получаването на примерно конструирано антитяло. Сходни процедури могат да се следват за получаването на други конструирани антитела, чрез използване на други анти-114 антитела (напр. 6А1-Пример 7), получено по сходен начин .

Пример 5 - Конструиране на химерно антитяло

А Химерната тежка верига се конструира чрез изолиране на миша вариабилна тежковерижна област от оригинално мишо MAb ЗВ9 като EcoRI-Bstll рестрикционен фрагмент. Малък ДНК олигомер е оформен и синтезиран за свързване на мишата вариабилна област с човешката lgG1 константна област (BstllAeai):

5' праймер: Поел, с идентиф. No50: GTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGC 3' праймер: Поел, с идентиф. No51: CH GGTGCTAGCTGAGGAG ACG

Тези два фрагмента се лигират в плазмид рС0(вж фиг. 7) (обработен с EcoRI и Apal). който вече кодира човешката lgG1 константна област Този клон не се експресира, следователно дивият тип 5'UTR и синалната последователност са отделени и пренесени със Поел, с идентиф. No 5 и 6.

*v **--5

Тъй като няма удобно място за рестриктаза при 3‘ края на сигналната последователност, се вмъква BstEII място (т.е. Шлчалива* мутация) чрез PCR. Използват се следните PCR праймери: .

5* праймер: Поел, с идентиф. No: 48: 5‘CAGGTTACCCTGAAAGAGTC 3‘ 3' праймер: Поел, с идентиф. No: 49: 5'GAAGTAGTCCTTGACCAG 3’ Рестрикционният фрагмент Bstll - Pstl след това се изолира от този плазмид. Оформя се и се синтезира нова сигнална последователност и 5 ' UTR имащи EcoRI u BstEII краища.

6' праймер: Поел, с идентиф. No: 46: AATTCGAGGACGCCAGCACATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCA ί TTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGCAG

3' праймер: Поел, с идентиф. No: 47:

GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGAGCAACAGAGAAAT GAAGACCTGGGTCTGCAACACCATGTTGCTGGCGTCCTCQ Химерната лека верига се конструира, чрез използване на PCR техника към оригиналната миша ЗВ9 лека верига, която е клонирана в pGEM72f(+) [Promega]. Използваните праймери са търговски достъпните pUC18 универсален обратен праймер при 5* края( EcoRI) и 3‘ праймер, който придава Narl участък.

[5‘CATCTAGATGGCGCCGCCACAGTACGTTTQATCTCCAGCTTGG ТСССЗ¹ Поел, с идентифик. No: 52], който се използва за фузиране на мишата вариабилна област към човешката константна област. Тази вариабилна област след това се лигира към експресионен вектор р CDN( EcoRI NarlKOnr. 8), която вече съдържа човешка капа-област.

Супернатантите на средата се събират на третия и на петия ден и се изследват с ELISA, както следва: ELISA плаки, покрити с 0.1 •51 pg козе антитяло, специфично за Fc областта на човешките антитела. Супериатантите се прибавят за един час. Прибавя се хрянова пероксидаза, конюгирана с козе антитяло, специфично за целия човешки IgG. След това се прибавя пероксидазен субстрат АВТС (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) за един час. Отчита се експресията на химерното антитяло. Във втора EUSA, супери атантата от COS клетки се свързва специфично към рекомбинантния човешки IL4 протеин. Този резултат потвърждава, че са клонирани гени, кодиращи антитяло, специфично за IL4.

В. От тази хи мерна тежка верига може също да се получи хуманизирана тежка верига. Хуманизираната тежка верига се оформя чрез вмъкване на миши ООК в човешка рамкова област. Избраната човешка рамка е. както е описано по-горе, найхомоложната протеинова последователност от швейцарската колекция, базираща се на миша ЗВ9 Уц (аминокиселини 20-140 от Поел, с идентифик. No: 4). Тази хуманизирана последователност от тежката верига (EcoRI Apal) се получава синтетично и се провежда PCR за да се запълни и умножи ДНК, както е описано по-горе. Тази синтетична вариабилна област се лигира върху експресионния вектор pCD (EcoRIApal) заедно със синтетичната сигнална последователност Поел, идентифик. No 5 · и 6 от химерната тежковерижна конструкция и константната област от човешко lgG1.

Сходно, хуманизирана лека верига може да се получи от химерна лека верига, както е описано за тежката верига. Този ген (EcoRV Nad) също се получава синтетично. Хуманизираната V_L се лигира в експресионния вектор pCN, изрязан с EcoRV Narl. заедно със сигналната последователност (EcoRV EcoRV). Експресионният вектор осигурява човешката капа константна област.

-52Пример 6 - Пречистване и термодинамика -хуманизирани моноклонални антитела.

Пречистването на СНО експресирани химерни и хуманизирани ЗВ9 може да се постигне с конвенционална протеин А (или G) афинигетна хроматография, следвана от йонообменна и молекулно-ситова хроматография. Сходни процеси успешно се използват за пречистване на други моноклонални антитела с чистота >95% (например към респираторен синцитиален вирус и малариен спорозоитен антиген).

Афинитета и детайлната термодинамика на свързването на IL4 към хуманизираноЗВ9 и мишоЗВ9 (Пример 1) се опредерят чрез титриране микрокалориметрично. Този метод измерва свързващите реакции чрез топлината на реакцията (вж Wiseman et al., Anal. Biochem. 179:131-137 (1989). Намерено е, че афинитета на двете антитела е толкова голям, че не може да се измерва директно при околната температура. Изследвани са две положения: I) афинитета е измерен при 60°С, където афинитета е достатъчно слаб, за да бъде измерен директно, и II) температурната зависимост от свързващата енталпия е измерена при 30-60°С. Заедно тези данни позволяват пресмятането на афинитета в голям температурен обхват, като се използва уравнението на Гибс-Хелмхолц. Обобщение от тсрмодинамиката на свързване на IL4 с хуманизирани и миши ЗВ9 са представени на Таблица 1. Основавайки се на промените в свободната енергия, енталпията, ентропията и топлинния капацитет на тези две моноклонални антитела, термодинамиките им на свързване не се различават.

-53i

Термоаинамика на свързването на IL4 към хуманиирано и мишоЗВ9 антитяло при pH 7.4,150 mM NaCL и 25оС.

*d	dG	dH	-TDS	dC
ПИКОМОЛОРО	kcal/ mol IL4	kcal/ mol IL4	kcal/ mol IL4	cal mol IL4/oK

хуи<чимзя|)а1Ю мишо 3!59

-13.0+0 6 -21.8±2 8.2±2.1 -580+160

-133+06 -20.5±1 7.2±1.2 -660±200

»ΐ хумяни:м«|ж»ю ими11юЗВ9вн1И1ялосоизмори четирикратно и др.укратио, |юспоктив1к>.

Пример 7 - Получаване и характеризиране на плъше моноклонално антитяло.

Mab 8ΑΪ, избрано за високоафинитетно свързване се получава ст имунизиран плъх, като се използва същия имунизационен протокол, както е описано за мишка в Пример 1.6А1 се селекционира от хибридоми (специално хибридома 3428АТ1С1В9), получена от плъх, имунизиран с човешки IL4.

K_d за GA1 се изчислява както е описано or Beatty et al.,jl immuno!. Methods, 100:173-179 (1987) и е 2 x 1Q-1°M.

Хибридома 3426А11С1В9 е депозирана в Европейската колекция за животински клетъчни култури (ЕСАСС), Public Health Laboratory Service Cenntre for Applied Microbiology & Research, Portai Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, United Kingdom, под No 93100620, и е приета като патентен депозит в съответствие с

-54Договора от Будапеща от 1977 година, отнасящ се до депозита на микроорганизми за целите на патентните процедури.

ί !ример 8 - Биологична активност на моноклоналните антитела: ЗВ9(хуманизирано), 9В9 (мишо) и 6А1

Провеждат се следните изследвания, като се използва процедурата, описана по-долу.

A. Свързване към гликозилиран rhlL4

По-горе идентифицираните антитела се получават към негликозилиран рекомбинантен човешки IL4, произведен в Е. colk Тъй като нативният човешки IL4 е гликозилиран, то важно е да се потвърди свързването към продукт, секретиран от клетъчна линия на бозайник. ЗВ9 се свързва еднакво добре към гликозилиран и негликозилиран рекомбинантен човешки IL4 и следователно не е насочен към епитоп, който е маскиран върху естествения човешки IL4.

B. Инхибиране на IL4 свързването към рецептор Способността на ЗВ9 да инхибира свързването на IL4 към неговия рецептор е изучено със използването на 125|-rhlL4 свързващ се към клетъчна линия на гибон MLA [ATCC TIB201 ], която има приблизително по 6000 рецептора на клетка. MLA клетките се инкубират с 1²⁵l-1L4 за 30 мин при 37°С. Поглъщането на радиоактивността се определя в гама-брояч, след отделяне на клетките, свързали 125I-IL4 чрез центрофугиране в маслен градиент. Неспецифичното свързване се определя чрез инкубиране в стократен моларен излишък на немаркиран IL4 [Park et al, J. Exp. Med.166:476-488 (1987)]. IC50 стойността за немаркиран IL4 в това изпитване е 22 рМ, докато сумата от (прибавения) IL 4 е 83 рМ. За интактното мишо (IgG) 9В9 1С50 θ рМ и 93 рМ за Fab фрагмента. При друга концентрация на IL4 (218 рМ), сумата за мишо (IgG) ЗВ9 е 109 рМ.

·· ·

-55С. Инхибиране на лимфоцитната пролиферация.

Използва се метода, описан от Spits et al, J.lmmunol..139:11421147 (1987). Човешки лимфоцити от периферна кръв се инкубират за три дни с фитохемаглутинин (Т клетъчен митоген) за да се дезорганизира IL4 рецептора.Получените бластни клетки се шимулират след това три дни с IL4. Пролиферацията се измерва чрез включването на ³Н тимидин. В клетъчната пролиферация се измерва по метода на Callard et al, in Lvmphokines and Interferons. A Practical Approach, Ch. 19. p.345, модифициран както следва. Пречистени човешки тонзиларни В клетки се стимулират три дни с Н 4 и имобилизирано анти- 1дМ.Пролиферацията се измерва чрез включването на ³Н тимидин.

339 (мишо) инхибира инкорпорирането на ЗН тимидин в човешките Т лимфоцити, стимулирани с 133рМ IL4 и човешки тонзиларни В лимфоцити, стимулирани с 167 рМ IL4. IL2стимулирани Т лимфоцити не се повлияват. IC50 за инхибирането

Т клетъчната пролиферация е 30 рМ, а за В клетъчната пролиферация 103 рМ. Съответстващите стойности за Fab фрагмента на ЗВ9 (мишо) са 108 и 393 рМ.

D Инхибиране на CD23 индукцията.

CD23 е нискоафинитетен рецептор за IqE(FcERII) и се индуцира върху мембраната на почиващи В лимфоцити чрез ниски концентрации на IL4, кто е необходимо условие за продукция на IgE. Пречистени човешки тонзиларни В клетки се стимулират за дни с IL4. Процентът на клетките, експресиращи CD23 клетките се определя чрез флоу-цитометрия (Defrance et al, J. Exp. Med. . 185:1459-1467 (1987)). 3B9 (мишо) инхибира CD23 експресията върху човешки тонзиларни В лимфоцити, стимулирани с 8.3 рМ

114 със стойност на IC50 от 136 рМ.

-56Е. Инхибиране на IgE секрецията.

За разлика от другите изследвания, където IL4 се прибавя в ЕС50 концентрации [Perе et al, Proc, Natl. Acad. Sei, 85:68806884(1988)], IgE секрецията се измерва в присъствието на концентрации от IL4, даващи максимална секреция, с цел да се редуцира ιтроменливостта, присъща на тази система. Тклетъчната пролиферация се измерва както следва. Човешки лимФоцити от периферна кръв се инкубират с IL4 от 10 до 18, за предпочитане 12 дни. Концентрацията на IgE в супернатантата на културата се определя с ELISA.

igE секрецията се инхибира от ЗВ9 (мишо) и Fab фрагмент от ЗВ9 в присъствието на 1.7 пМ IL4 , даващ IC50 стойности στ 1.9. и 5.0 пМ респективно. Експериментът се повтаря, използвайки пониска концентрация на IL 4,667 рМ, редуциращи стойността на IC50 до 0.65 пМ заЗВ9 (мишо).

г. Резюме и интерпретация на данните

Модерните отношения на IL4 към различни антитела, изисквани за инхибиране на функцията 50% в биоизследвания са дадени на Табл.2.

·· ····

·· ··· • ·

Таблица 2. Сравнителна активност на ЗВ9,6А1 и хуманизирано ЗВ9 (lgG1 u lgG4 варианти )в IL4 зависими биоизследвания

Иаследячнв		IC50 (рМ) [обхват! п
	МишоЗВ9	Мишо (Fab)	ЗВ9 Плъше 6А1	Хуманизирано ЗВ9
				IgGl	lgG4*
ИВА	63(17-109]2	93	>5000
Т клетки	ЗфОЛОЦ	108	87	44(30 56]3	40
В клетки	!03[79 120]3	393	187	47[10-80]3	79
CD23 индукция	136[53 272J4	216	80	333
IgE синтеза	G58[3701070]6J170	623 [412 833И	54(35- 83]3___

п брой на проводените тестове * -IgG 1 u lgG4 вариантите са изследвани по различно време/

Във всички изследвания, с изключение на IgE секрецията IL4 се прибавя в приблизително ED50 концентрации. Моларните отношения на антитялото към IL4, необходими за 50% инхибиране са сходни за хуманизирано ЗВ9, мишоЗВ9 и 6А1 в две изследвания на лимфоцитната пролиферация, но са повисоки за хуманизирано ЗВ9 в изследването на CD23 ф

·· ···· • · ♦ · · · ·· *·· ·· · • · • · « • ···· • · • ··· ··· · • · «· ·· •58 инцукцияга. Последният метод е много чувствителен и изисква много ниско (ок.5%) окупиране на рецепторите (Kruse et al, EMBOJ. 12.5121 1993) и както се вияода от резултатите, получени с мишо 389, дължащи се на вариации вътре в изследването. Сравнение на активностите на плъше 6А1 и мишоЗВ9 антитела демонстрира сходен профил на функционално действие, но и един неочакван неуспех на 6а1 да инхибира напълно свързаното на радиойодиран IL4 към неговия рецептор. Радиойодирания IL4, използван в това изследване се приема, че е йодиран в достъпния тирозинов остатък 124. Когато способността на 6А1 да инхибира експресията на CD23, индуциране от небелязан или йодиран IL4 се сравнява, то се вижда, че инхибирането е помалко ефикасно срещу йодирания лиганд. Тези резултати показват, че 6А1 се свързва с IL4 в района на тирозиновия остатък 124, но не специфичнос него.

Съгласно настоящите данни, 8А1 е неутрализиращо антитяло, с висок афинитет, което се свързва с IL4 в област много различна от тази на ЗВ9.

Пример 9 - фармакокинетика Фармакокинетиката на човешкото ЗВ9 се изследва в мъжки плъхове от линия Sprague Dawley. Хуманизирано ЗВ9 се прилага на четири ηψιβοτηπ като iv компактна доза 1 мг/кг тегло. Събирането на кръв продължава 5 седмици след дозата. Концентрациите на хуманизирано ЗВ9 в човешка плазма се определят с ELISA като се използва сандвичев метод с IL4/ античовешко IgG. Опитът се провежда така, че да се потвърди не само присъствието на циркулиращ човешки IgG, но също и неговата способност да се свързва към рекомбинантен човешки IL4.

-53Резултатите от това изследване са дадени в таблица 3. Таблица 3 фармакокинетика на хуманизираноЗВ9 в мъжки плъхове от линия Sprague Dawley (доза: 1 mg/kg iv цяла)

Clp (mL/h/kg)

Плъх 1	0.442
Плъх 2	0.655
Плъх 3	0.555
Плъх 4	0.447
Средно	0.525
Стандартно	0.101
отклонение

Стжращението на фармакокинетичния параметън е следното:

Сю - проявен плазмен клирънс

Данните, показват, че вариациите между отделните животни са относително малки и че изчистването на ЗВ9 от кръвната плазма изглежда има две фази. Забележимия плазмен клирънс е нисък (0.5 mL/h/kg). Полуживотът изглежда е 11 дни. Така фармакокинетичните характеристики на хуманизираноЗВ9 антитяло от СНО клетки са съвместими с другите хуманизирани моноклонални антитела у плъхове. Дългият полуживот нахуманизиранотоЗВ9

антитяло в плъхове също показва, че когато се приложи у хора, то вероятно ще бъде активно за продължителен период от време.

Многобройни вариации и модификации на настоящото изобретение са включени в по-горе установените спесификации и се очаква да са очевидни за специалистите. Например човешките рамкови области или техни модификации, различни от тези, описани по-горе, могат да се използват при конструирането на хуманизирани антитела. Такива модификации и промени на съставките и процесите на настоящото изобретение се смята че са включени в обхвата на патентните претенции, приложени тук.

···♦·· ·· · ·· • · · ··· ··· • · ··· · · · · · · · • · · · · · ···· · ·· · _61_

ИЗБРОЯВАНЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:

(I) ЗАЯВИТЕЛ: Holmes, Stephen D.

Gross, Mitchell S. Sylvester, Daniel R.

(II) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: РЕКОМБИНАНТНИ ИНТЕРЛЕВКИН-4-АНТИТЕЛА, ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ИНТЕРЛЕВКИН-4-МЕДИИРАНИ РАЗТРОЙСТВА ' · (III) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 58 t , (IV) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:

(A) Адресант: Smith Kline Beecham Corporation (B) Улица: Corporate Intellectual Property, UW2220-709

Swedeland Rd.

(C) Град: King of Prussia (D) Щат: PA (E) Държава: USA (F) Код: 19406 - 2799 (V) ФОРМА ЗА КОМПЮТЪРНО ЧЕТЕНЕ:

(A) Вид на средата: Дискета (B) Компютър: IBM PC съвместим (C) Оперативна система: PC-DOS/MS-DOD (D) Софтуер: Patent In Releasen #1.0, Version #1.25 (VI) ТЕКУЩИ ДАННИ ЗА ЗАЯВКАТА:

(A) Номер на заявката: US 08/117,366 (B) Дата на попълване: 07-SEP-1993 (C) Класификация:

• ·

(A) Номер на заявката: US 08/136,783 (B) Дата на попълване: 14-ОКТ-1993 (C) Класификация:

(VIII) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ОТГОВОРНОТО ЛИЦЕ/АГЕНТ:

(A) Име: Sutton, Jeffrey А.

(B) Регистрационен номер: 34,028 (C) Справочен/номер: Р50186-2 (IX) ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИЯ:

(A) Телефон: (215) 270-5024 (B) Телефакс: (215) 270-5090

V (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:1 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:396 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .396 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:1 :

w

ATG GAG АСА GAC АСА ATC CTG СТА TGG GTG CTG CTG СТС TGG GTT ССА Met Glu Thr Asp Thr He Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pro 1 5 10 15 i

' GGC TCC ACT GGT GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT iGly Ser Thr Gly Asp lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala

25 30 i'GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT ; Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser i

144

• · · · · · • ·

WO 95/01301

-63PCT/US94/10308

40 45

GIT GAT TAT

GAT GGT GAT

AGT Ser 55

TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA

192

Vai Asp 50

Tyr

Asp Gly

Asp

Tyr

Met

Asn Trp

Tyr 60

Gin Gin

Lys

Pro

GGA

CAG

CCA

CCC

AAA

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

240

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

He

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

65

70

75

80

GGG

ATC

CCA

GCC

AGG

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

288

Gly

lie

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

85

90

95

CTC

AAC

ATC

CAT

CCT

GTG

GAG

GAG

GAG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

TAC

TGT

336

Leu

Asn

He

His

Pro

val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

100

105

110

CAG

CAA

AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CCG

ACG

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

384

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

' Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

.115 120 125

GAA ATC AAA CGG 396

Glu lie Lys Arg

130 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:2

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 132 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:2

Met Glu Thr Asp Thr He Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pro

5 10 15

• · · · ♦ · • ·

WO 95/07301 «648 • · · · · · • ··· · ···· • ······ · · · · · • · · · · · • · · · · · ·

PCT/US94/10308

Gly

Ser

Thr

Gly Asp lie 20

Vai

Leu

Thr 25

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser 30

Leu

Ala

Vai

Ser

Leu 35

Gly Gin Arg

Ala

Thr 40

He

Ser

Cys

Lys

Ala 45

Ser

Gin

Ser

Vai

Asp 50

Tyr Asp

Gly Asp

Ser 55

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr 60

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 65

Gin

Fro

Pro

Lys Leu 70

Leu

lie

Tyr

Ala

Ala 75

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser 80

Gly

lie

Fro

Ala

Arg Phe 85 .

Ser

Gly

Ser

Gly 90

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 95

Thr

Leu

Asn

He

His 100

Pro Vai

Glu

Glu

Glu 105

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr 110

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser 115

Asn

Glu Asp

Pro

Pro 120

Thr

Phe

Gly Gly

Gly 125

Thr

Lys

Leu

Glu lie Lys Arg

130 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:3 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:483 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(А) ИМЕ/КОД: CDS ί (В) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 64. .483

• · • · · · ···

WO 95/07301 • ···« · · · · • · « · · · ···· · ··· · · ·· · · · · · · · • · ··· ·· · ·· ··

-gb- PCT7US94/10308 (XI) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:3

GAATTCGCGG CCGCTATGCA GGGACAATCA GCAGCAGCAA TGAGGAAGTA AGCCTGTGCA

GAT ATG Met 1

AAC Asn

AGG Arg

CTT ACT TCC TCA

TTG CTG CTG CTG ATT GTC CCT GCA

108

Leu

Thr 5

Ser Ser

Leu

Leu

Leu 10

Leu

He Vai Pro

Ala 15

TAT

GTC

CTG

TCC

CAG

GTT

ACT

CTG

AAA

GAG

TCT

GGC

CCT

GGG

ATA

TTG

156

Tyr

Vai

Leu

Ser

Gin

Vai

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

He

Leu

20

25

30

CAG

CCC

TCC

CAG

ACC

CTC

AGT

CTG

ACT

TGT

TCT

TTC

TCT

GGG

TTT

TCA

204

Gin

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

CTG

AGC

ACT

TCT

GGT

ATG

GGT

GTG

AGC

TGG

ATT

CGT

CAG

CCT

TCA

GGA

252

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Vai

Ser

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

50

55

60

AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

CTG

GCA

CAC

ATT

TAC

TGG

GAT

GAT

GAC

AAG

CGC

300

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

lie

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

65

70

75

TAT

AAC

CCA

TCC

CTG

AAG

AGC

CGG

CTC

ACA

ATC

TCC

AAG

GAT

ACC

TCC

348

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

He

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

80

85

90

95

чЛл

AGC

AAC

CAG

GTA

TTC

CTC

AAG

ATC

ACC

AGT

GTG

GAC

ACT

GCA

GAT

ACT

396

Ser

Asn

Gin

Vai

Phe

Leu

Lys

He

Thr

Ser

Vai

Asp

Thr

Ala

Asp

Thr

100

105

110

GCC

ACA

TAC

TAC TGT

GCT

CGA

AGA

GAG

ACT

GTG

TTC

TAC

TGG

TAC

TTC

444

Ala

Thr

Tyr

Tyr Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Vai

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

115

120

125

GAT

GTC

TGG

GGC.GCA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

483

Asp

Vai

Trp

Gly Ala

Gly

Thr

Thr

Vai

Thr

Vai

Ser

Ser

WO 95/07301 «

« « · • · · · • ·« • · ·· · • ··· ·· • · · • · • · „ · • · • · • · PCITUS94/1W08 'x

I

I r'i

130

135

140

0) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 140 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселинен (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (II) ТИП HA МОЛЕКУЛАТА: протеин (XI) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:4

Met Asn Arg Leu Thr

Ser

Ser Leu Leu

Leu Leu He Vai Pro Ala Tyr

1

5

10

15

Vai

Leu

Ser

Gin

Vai

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

He

Leu

Gin

20

25

30

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

35

40

45

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Vai

Ser

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

Lys

50

55

60

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

lie

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

Tyr

65

70

75

80

Asn

Pro

Ser

Leu

LyS

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Ser

85

90

95

:

Asn

Gin

Vai

Phe

Leu

Lys

lie

Thr

Ser

val

Asp

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

100

105

110

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

Asp

115

120

125

Vai

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr

Thr

Vai

Thr

Val

Ser

Ser

I * i*

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:5:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 60 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .60

(XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:5:

ATG

GTG

TTG GAG

ACC

CAG

GTC’ TTC

ATT

TCT

CTG

TIG CTC TGG

ATC

TCT

48

Met

Vai

Leu Gin

Thr

Gin

Vai Phe

lie

Ser

Leu

Leu Leu Trp

He

Ser

1

5

10

15

GGT

GCC

TAC GGG

60

Gly Ala

Tyr Gly

20

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:6:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 аминокиселини (B) ТИП аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин • I (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:6?:- .·

Met Vai Leu Gin Thr

Gin Vai Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser

I ~ 1 iGly Ala Tyr Gly

15

·***«*» .
	,. z -. rii .

·· · ·· ·· • · · · · · · · · • ···· · ··· · ···· • · · » · ····· · ···· · • · · · · · ·· · ·· ··· ·· · ·· ··

-68(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:7:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:57 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .57 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:7:

ATG GGA TGG AGC TGT АТС АТС СТС ТТС TIG GTA GCA АСА GCT АСА GGT48

Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly

5 1015 .

j GTC CAC TCC j Val His Ser(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:8:

(!) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 19 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин

·· ···· ·· · ·· ·· ··· · · · ··· • ···· · · · · · · ··· • · ··· ······ ··· · · WO 95/07301 *··*··· ·· PCI7US94H0309

-69f (XI) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:8:

Met Gly Trp Ser Суз He lie Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly

5 10 15

Vai His Sec (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:9 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:423 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .423 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:9:

ATG GIG TIG CAG ACC CAG GTC TTC ATT TCT CIG TTG

CTC TGG ATC TCT

48

Met Vai Leu Gin Thr Gin Vai Phe He Ser

Leu Leu

Leu

Trp He 15

Ser

1

5

10

GGT

GCC

TAC

GGG

CAG

GTT

ACC

CTG

AAA

GAG

TCT

GGC

CCT

GGG

ATA

TTG

96

Gly

Ala

Tyr

Gly

Gin

Vai

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

He

Leu

20

25

30

CAG

CCC

TCC

CAG

ACC

CTC

AGT

CTG

ACT

TGI

TCT

TTC

TCT

GGG

TTT

TCA

144

Gin

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

CTG

AGC

ACT

TCT

GGT

ATG

GGT

GTG

AGC

TGG

ATT

CGT

CAG

CCT

TCA

GGA

192

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Vai

Ser

Trp

He

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

50

55

60

i

WO 95/07301 ·· · • · ····· · · · · ·· ··· • · · · · · ···· · ··· · · • · · · · ··· ····· ·· · ·· · ·

PCT7US94/10308

AAG Lys 65

GGT CTG GAG TGG Gly Leu Glu Trp

CTG GCA CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC

240

Leu Ala 70

His

lie Tyr

Trp 75

Asp Asp

Asp Lys

Arg 80

TAT

AAC

CCA

TCC

CTG

AAG

AGC

CGG

CTC

ACA

ATC

TCC

AAG

GAT

ACC

TCC

288

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp Thr

Ser

85

90

95

AGC

AAC

CAG

GTA

TTC

сте-

AAG

ATC

ACC

AGT

GTG

GAC

ACT

GCA

GAT

ACT

336

Ser

Asn

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Xie

Thr

Ser

Val

Asp

Thr

Ala

Asp

Thr

100

105

110

GCC

ACA

TAC

TAC

TGT

GCT

CGA

AGA

GAG

ACT

GTG

TTC

TAC

TGG

TAC

TTC

384

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

115

120

125

GAT

GTC

TGG

GGC

GCA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

423

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:10:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

I (А) ДЪЛЖИНА: 141 аминокиселини (В) ТИП:аминокиселинен (D) ТОПОЛОГИЯ: динеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин ·_ν (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:10:(2) *

Met val Leu Gin Thr Gin Vai Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser

5 10 15

Gly Ma Tyr Gly Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu

I

• •

• · · • ·

• ·

·· • ·

• •

·· • ·

• · •

•

• · ·

•

• ·

• ·

• ·

···

•

•

• ·

• ·

···· · ···

• ·

•

•

•

* «

•

• ·

WO 95/07301

•

• · ·

•

··

ЛгЛЮЙЛозЛГ

-71-

Gin

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Vai

Ser

Trp

lie

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

50

*

55

60

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

lie

Tyr

Trp

Asp

Asp

ASp

Lys

Arg

65

70

.75

80

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Asn

Gin

Vai

Phe

Leu

Lys

lie

Thr

Ser

Vai

Asp

Thr

Ala

Asp

Thr

100

105

110

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Vai

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

115

120

125

Asp

Vai

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr

Thr

Vai

Thr

Vai

Ser

Ser

130

13S

140

ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:11 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:423чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна ' (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК i

i (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .423 ί (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:11:

I

ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC TTC ATT TCT CTG TTG СТС TGG ATC TCT

WO 95/07301

-72.РСТ/П394/10308

Met Val 1

Leu

Gin Thr 5

Gin Val

Phe He Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser

10

15

GGT

GCC

TAC

GGG

CAG

GTT

ACC

CTG

CGT

GAA

TCC

GGT

CCG

GCA

CTA

GTT

96

Gly

Ala

Tyr

Gly

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

20

25

30

AAA

CCG

ACC

CAG

ACC

CTG

ACG

TTA

ACC

TGC

ACC

TTC

TCC'

GGT

TTC

TCC

144

Lys

Pro

Thr

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

CTG

TCG

ACC

TCC

GGT

ATG

GGT

GTT

TCC

TGG

ATC

CGT

CAG

CCG

CCG

GGT

192

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

He

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

50

55

60

AAA

GGT

CTA

GAA

TGG

CTG

GCT

CAC

ATC

TAC

TGG

GAC

GAC

GAC

AAA

CGT

240

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

lie

Tyr

Trp Asp

Asp

Asp Lys

Arg

65

70

75

. - ·,.

. ·.

80

TAC

AAC

CCG

AGC

CTG

AAA

TCC

CGT

CTG

ACG

ATA

TCC

AAA

GAC

ACC

TCC

288 '

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lie

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

85

90

95

CGT

AAC

CAG

GTT

GTT

CTG

ACC

ATG

ACT

AAC

ATG

GAC

CCG

GTT

GAC

ACC

336

Arg

Asn

Gin

Val

Val

Leu

Thr

Met

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Val

Asp

Thr

100

105

110

GCT

ACC

TAC

TAC

TGC

GCT

CGA

CGC

GAA

ACC

GTT

TTC

TAC

TGG

TAC

TTC

384

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp Tyr

Phe

115

120

125

GAC

GTT

TGG

GGT

CGT

GGT

ACC

CCA

GTT

ACC

GTG

AGC

TCA

423 ‘ ·

Asp

Val

Trp

Gly

Arg

Gly

Thr

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Sex

130

135

140

•4.

WO 95/07301 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:12:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:141 аминокиселини (B) ТИП:аминокиселинен (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА:протеин (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:12:

Met Vai 1

Leu Gin

Thr Gin Vai Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp Xie Ser

5

10

15

Gly

Ala

Tyr

Gly

Gin

Vai

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Fro

Ala

Leu

Val

20

25

30

Lys

Pro

Thr

Gin

Thr

Leu

Thr

Leii

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

w

35

40

45

Leu

Ser

Thr Ser Gly

Met

Gly

Vai

Ser

Trp

He

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

50

55

60

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

He

Tyr

Trp

Asp Asp Asp

Lys

Arg

65

70

75

80

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

He

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

ί

85

90

95

Arg

Asn

Gin

Vai

Vai

Leu

Thr

Met

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

val

Asp

Thr

100

105

110

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Vai

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

/¾

115

120

125

Asp

Vai

Trp

Gly

Arg

Gly

Thr

Pro

Vai

Thr

Vai

Ser

Ser

130 135 140

······ ··· ·· · · ··· · · · ·· · ···· · · · · ·· ···

9 9 9 9 9 9·99 9 999 99

9 9 9 9 9 9 99

999 99 9 99 99

WO 95/07301 „ . PCT/US94/10308

-74(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:13 :

0) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:393 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(А) ИМЕ/КОД: CDS (В) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .393 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:13

' — ATG w/ Met 1

GGA TGG AGC

TGT ATC ATC CTC

TIC Phe

TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly

48

Gly Trp

Ser

Cys 5

lie

lie Leu

10

15

GTC

CAC

TCC

GAT

ATC

GTG

ATG

ACC

CAG

TCT

CCA

GAC

TCG

CTA

GCT

GTG

96

Vai

His

Ser

Asp

He

Vai

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu

Ala

Vai

20

25

• 30

TCT

CTG

GGC

GAG

AGG

GGC

ACC

ATC

AAC

TGC

AAG

GCC

TCC

CAA

AGT

GTT

144

Sec

Leu

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

He

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Vai

35

40

45

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

CCC

GGG

192

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

50

55

60

CAG

CCT

CCT

AAG

TTG

CTC

ATT

TAC

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

GGG

240

J**·

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

He

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

• i

65

70

75

80

.» *.*’

GTA

CCT

GAC

CGA

TIC

AGT

GGC

AGC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT. CTC

288

val

Pro

Asp

Arg

Phe

9er

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

85

90

95

ACC

ATC

AGC

AGC

CTG

CAG

GCT

GAA

GAT

GTG

GCA

GTA

TAC

TAC

TGT

CAG

336

Thr

He

Ser

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

WO 95/07301 .

• · · · « · · ·· ··· ·· · ·· ·· • · · · · · • « · · · · · · · • · ···· · ··· · · • · · · · · ·· · ·· ··

FCT/US94/10308

-75100 105110

CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG384

Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu

115 120 125.

ATC AAA CGT393 lie Lys Arg

130 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:14 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 131 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселинен (D) ТОПОЛОГИЯ:линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:14:

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

lie

He

Leu

Phe

Leu

Vai

Ala

Thr

Ala

Thr Gly

1

5

10

• ; .-

15

Vai

His

Ser

Asp

lie

Vai

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu

Ala Vai

20

25

30

Ser

Leu

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

He

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser Vai

35

40

45

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Het

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro Gly

50

55

60

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

lie

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser Gly

65

70

75

80

WO 95/07301

PCT/US94/10308

-76Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

90 .95

Thr He Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr CysGin

100 105110

Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu 115 120 125.

lie Lys Arg

130

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:15 :

(!) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:45 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .45 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:15:

AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG ААС Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:16 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

·· ···· ·· · ·· ·· • · · · · · ··· • · ··· · · · · · · ··· • · · · · · ···· · ··· · · • · ···· · · · ·· ··· ·· · ·· ·· (A) ДЪЛЖИНА: 15 аминокиселини (B) ТИП:аминокиселинен (D) ТОПОЛОГИЯ:линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:16:

Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn ¹⁵ 10 is (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:17 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:21 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .21 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:17

GCT GCA ТСС ААТ СТА GAA ТСТ

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:18 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 7 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна ·***·« чр *

-78(II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин (ΧΪ) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:18:

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:19:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:27чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .27 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:19:

i CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG | Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr

Il 5 · r- - · (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:20 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 9 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна / (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин

(XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQID N0:20:

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:21 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:21 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГ ИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .21 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:21:

ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC

Thr Ser Gly Met Gly Vai Ser

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:22 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 7 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселинен (D) Т ОТ ОЛОГ ИЯ: линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:22:

Thr Ser Gly Met Gly Vai Ser

I 1 5 ···· (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:23 :

0) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:48 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна

01) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА; кДНК

0Х) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .48 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:23:

JcAC АТТ ТАС TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA ТСС CTG AAG AGC 48

His lie Tyr Trp Азр Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Sex ί 1 5 10 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:24 :

0) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:24:

• .· . · ¹

His Не Туг Тгр Азр Азр Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

10 15

-81(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:25 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:33 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .33 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:25:

AGA GAG ACT GTG TIC TAC TGG TAC TTC GAT GTC Arg Glu Thr Vai Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Vai | ¹ 5 . 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:26:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 11 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:26:

д * · t

Arg Glu Thr Vai Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Vai

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:27 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:27 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .27 (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:27:

CAG CAA AGT ААТ GAG GAT ССТ CCG AGG 27

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg ¹⁵ .

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:28:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 9 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:28:

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg

5

I (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:29 :

·· · • · (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 36 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:29:

СТААСАСТСА TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG 36 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:30:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:29 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:30:

! GTACATATGC AAGGCTTACA АССАСААТС 29 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:31 :

Т* ” (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА :117 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна ^J‘^:' ‘¹‘

• · · • · · · · · • · · · · · ··· • · · · · · · · · · ····· · · ·

-84(II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (X!) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:31:

GGTTACCCTG CGTGAATCCG GTCCGGCACT AGTTAAACCG ACCCAGACCC TGACGT.TAAC 60

I | CTGCACCTTC TCCGGTTTCT CCCTGTCGAC CTCCGGTATG GGTGTTTCCT GGATCCG 117 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:32 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:120 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:32:

TCAGCCGCCG GGTAAAGGTC TAGAATGGCT GGCTCACATC TACTGGGACG ACGACAAACG 60

TTACAACCCG AGCCTGAAAT CCCGTCTGAC GATATCCAAA GACACCTCCC GTAACCAGGT 120 > ................... _.............

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:33 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:120 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна

• · · • · · ♦ • · · · · ······ • · · · · · • · ··· ·· ·

-85(II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:33:

TGTTCTGACC ATGGACCCGG TTGACACCGC TACCTACTAC TGCGCTCGTC GCGAAACCGT БО

TTTCTACTGG TACTTCGACG TTTGGGGTCG TGGTACCCCA GTTACCGTGA GCTCCCAACC 120 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:34 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 25 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:34:

I ACCCGGCGGC TGACGGATCC AGGAA 25

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:35 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) ♦ f (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:35» -.· i

i ......... - ! ATGGTCAGAA CAACCTGGTT ACGG

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:36 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 25 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:36:

/

TTCGGG7TAC CCTGCGTGAA TCCGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:37 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:37:

I CCAACCCTCG AGTGCCATTG А (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:38 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 43 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина ··:· (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна

• · • · · · • · · • · (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQID N0:38:

! CTAGCTGTGT CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:39 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 39 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:39:

I CCTTGCAGTT GATGGTGGCC CTCTCGCCCA GAGACACAG 39 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:40 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 67чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна' (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) • t (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQID N0:4Q;

TCGAGAGGCC TCCCAAAGTG TTGATTA£GA TGGTGATAGT TATATGAACT GGTATCAGCA60

GAAACCC ’67 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:41 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 63 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:41:

GGGTTTCTGC TGATACCAGT TCATATAACT ATCACCATCA TAATCAACAC TTTGGGAGGC 60

СТС 63 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:42 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 51 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:42:

: ATACTACTGT CAGCAAAGTA ATGAGGATCC TCCGAGGTTC GGCGGAGGGA С ⁵¹ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:43 :

(!) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: .·;.·>· (A) ДЪЛЖИНА: 53чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна • · · · • · • · · · • · • · • · · • ·· • · ·· • · · · ·· • · · · • · • · · · • · · ·· • ·· • ·

-89(II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:43:

CTTGGTCCCT CCGCCGAACC TCGGAGGATC СТСАТТАСТТ TGCTGACAGT AGT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:44 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 55чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:44:

GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACGCT GCATCCAATC TAGAATCTGG GGTAC 55 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:45 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 51 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:45:

.............. -· · t

CCCAGATTCT AGATTGGATG CAGCGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C ,.-..5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:46 :

• ·

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 83 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:46:

I AATTCGAGGA CGCCAGCAAC ATGGTGTTGC AGACCCAGGT СТТСАТТТСТ CTGTTGCTCT 60 i

: ; GGATCTCTGG TGCCTACGGG CAG 83

I > . . ...............

♦ -- . ............

ί ί

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:47 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 84 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:47:

GTAACCTGCC CGTAGGCACC AGAGATCCAG AGCAACAGAG AAATGAAGAC CTGGGTCTGC 60

I i

AACACCATGT TGCTGGCGTC CTCG 84

C (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:48 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна • · • · · · • · · · • · • · · ·

-91(II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:48:

CAGGTTACCC TGAAAGAGTC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:49 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 18 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQID N0:49:

! GAAGTAGTCC TTGACCAG ! 18 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:50 ;

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 31 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ, неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:50:

GTCACCGTCT CCTCAGCTAG CACCAAGGGG С ’’ 31 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:51 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(А) ДЪЛЖИНА: 22 чифта бази ·· ··· ··· ···· · ··· · · ·· · • · · · · ···· · ··· t · • ···· ··· • · · · · · · · ·· (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:51:

iCTTGGTGCTA GCTGAGGAGA CG ²² (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:52 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 47 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:52:

I • CATCTAGATG GCGCCGCCAC AGTACGTTTG ATCTCCAGCT TGGTCCC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:53 :

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 45 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНрСТТА; ЗЕО ID N0:53:

I

I AAGGCCTCCC AAAGTGTTGA TTATGATGGT GATAGTTATA TGAAC

-93(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:54 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:54:

ACCTCCGGTA TGGGTGTTTC С (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:55 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 48 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ; двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:55:

САСАТСТАСТ GGGACGACGA CAAACGTTAC AACCCGAGCC TGAAATCC ⁴ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:56 :

С (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(А) ДЪЛЖИНА: 33 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА; кДНК (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:56:

CGCGAAACCG TTTTCTACTG GTACTTCGAC GTT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:57 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА:393 чифта бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: кДНК (IX) ОТЛИЧИТЕЛЕН БЕЛЕГ:

(A) ИМЕ/КОД: CDS (B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 1. .393

; ATG ; Met ; 1	GGA TGG AGC TGT ATC ATC
Gly Trp	Ser Cys 5	He	He
1 ; ! GTC	CAC	TCC	GAT	ATC	GTG	ATG
i ! Vai	H13	Ser	Asp	He	Vai	Met
1 !			20
тст	CTG	GGC	GAG	AGG	GCC	ACC
; Ser	Leu	Gly	Glu	Arg	Ala	Thr
i ι 1		35

CTC	TTC	TTG	GTA	GCA ACA GCT ACA GGT	48
Leu	Phe	Leu	Vai	Ala	Thr Ala Thr Gly
		10				15
ACC	CAG	TCT	CCA	GAC	TCG	CTA GCT	GTG	96
Thr	Gin	Ser	Pro	Asp	Ser	Leu Ala	Vai
	25					.30
ATC	AAC	TGC	AAG	GCC	TCC	CAA AGT	GTT	144
lie	Asn	Cys	Lys	Ala	Ser	Gin Ser	Vai
40					45

·· ····

WO 95/07301

-95• · · ··· ·»· • ···· · · · · · · ··· • · · · · · ···· · ··· · · rtr/USJdUftJl»·

GAT TAT GAT

GGT GAT AGT

TAT Tyr 55

ATG AAC TGG TAT CAG CAG AAA CCC GGG

192

Asp Tyr 50

Asp

Gly Asp

Ser

Met

Asn

Trp Tyr

Gin 60

Gin Lys Pro Gly

CAG

CCT

CCT

AAG

TTG

CTC

ATT

TAC

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

GGG

240

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

He

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

65

70

75

80

GTA

CCT

GAC

CGA

TTC

AGT

GGC

AGC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

288

Vai

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

85

90

95

ACC

ATC

AGC

AGC

CTG

CAG

GCT

GAA

GAT

GTG

GCA

GTA

TAC

TAC

TGT

CAG

336

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Vai

Ala

Vai

Tyr

Tyr Cys

Gin

100

105

110

CAA

AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CCG

ACG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAA

GTG

GAG

384

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly Gly

Thr

Lys Vai

Glu

115 120 125

ATC AAA CGT lie Lys Arg

130

393 ' (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ N0:58 :

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 131 аминокиселини (B) ТИП; аминокиселинен (D) ТОПОЛОГИЯ .линеарна (II) ТИП НА МОЛЕКУЛАТА: протеин _·.’ (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:58;

Met Gly Trp Ser Cys lie He Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly

5 10 15

WO 95/07301

·· · · ·· ·· • · · · · • · · · · · ·

: .РСТфК&ЛМОв

• · ♦ · · ·

• · · ·

• · · · · ·

• · · · ·

•

• · ·

• · · · · · ·

«

• · · ·

-96

-

f

Val

His

Ser

Asp

He

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro Asp Ser Lou 30

Ala

Val

20

25

Sec

Leu

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

He

Asn

Cys

Lys Ala Ser Gin

Ser

Val

35

40

45 ·»

•

Asp

Tyr

Asp

Gly Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr Gin Gin Lys

Pro

Gly

50

55

60

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

He

Tyr

Ala

Ala

Ser Asn Leu Glu

Ser

Gly

65

70

75

80

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly Thr Asp Phe

Thr

Leu

1 »‘r r

85

90

-

95

Thr

lie

Ser

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Val

’ Ala Val Tyr.Tyr Cys

Gin

100

105

110

-> -

Gin

Ser

Asn - X»-w-

Glu

Asp

Pro

Pro’

Thr

Phe

. ’ J Gly Gly Gly Thr Lys

Val

Glu

ΪΪ5

120

125

•

He

Lys

Arg

130 »

····· · ··· · • · · · • · · · · · ·

-97Сп|ПйОЧ9Н НОМ9р Ю ЗПЯВИГОЛЯ

Международен номер на заявителя

ДОКУМЕНТ ЗА ДЕПОЗИТ НА МИКРООРГАНИЗЪМ

Д Определенията, нантвени по-долу се отнасят за микроорганизма, он onap.un на списанието на стр. 32 ред 14 (or оригинала).

В ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА ДЕПОЗИТА

Понататъшните депозити са идентифицирани на допълнителна страница.

Име !□ депозиращата институция

Европейска колекция за животински клетъчни култури (ЕСАСС)

Лдпрс на депозиращата институция (вкл. пощенския код и страната)

Р ut ten Down

SAi'abury

WhU, 9P4 OJG

United Kingdom

/.Ι,πτα i in депозита Входящ номер

TO Ю1993 93100620··

C. Допъл* штелн11 обяснения (ос iaви призно, ако не е необходимо)

Рл 5 ерт ?кп с поета! ютките на европейските и австралийските патенти, или > ези на други държави, имащи същите постановки, проба от депозирания микрон: ат тизьм ще бъде направена докато излезе уверението за пагешовано, или до датата на отказа или изтеглянето на документите, само ери изискването на такава проба от експерт, упоменат от личността, която t о изисква.

Ό. Обозначени страни, за които са направени обясненията (ако но са за г!пр:ц:сло!М cqnra)

Всички

Е. Допь лнително оборудване на обясненията

Обясненията, направени по-долу ще бъдат предадени на международното бюро по късно (да се определи общата природа на обясненията напр. Вх. No

Само за приемащото бюро Само за патентното бюро

Лисга с получаи гяодно с международната заявка Лиша е подучено! международно го бюро вя

Claims (35)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Фузионен протеин, имащ свързваща специфичност за “(••’’.ешки ηηί ерлевкин-4 (|L4), който се състои от области, определящи комплементарността, получени от не-човешко неуфализиращо моноклонално антитяло, характеризиращи се с дисоциационна константа, еднаква или по-малка от 2 х 1fr¹⁰ и първи фузионен партньор.
2. 2. фузионният протеин, съгласно Претенция 1.. който е оперативно свързан към втори фузионен партньор.
3. 3 Фузионният протеин, съгласно Претенция 1.,в който т.

   I sap. I ?е -човешко неутрализиращо моноклонално антитяло е избрано от групата, състояща се от ЗВ9 и 6А1.
4. 4 .Фузионният протеин, съгласно Претенция 2.,в който т.

   нар. втори фузионен партньор съдържа всички или част от константните имуноглобулинови тежки или леки вериги или и двете.
5. 5 Фузионниятпротеин,съгласноПретенция1.,вкойто последователността на т. нар. първи фузионен партньор е тежкеверижна последователност ог: аминокиселини 21-50,5671,88-119 и 131-141 на ПОСА. ИД. No 12.
6. 6. Фузионният протеин, съгласно Претенция 1 ,,в който последователността на т. нар. първи фузионен партньор е лековерижна последователност от: аминокиселини 20-42,58-72, 80-111 и 121-13! на ПОСА. ИД. No 14.

   *
7. 7. Фузионният протеин, съгласно Претенция 1.,в който т. нар. аминокиселинни проследователности на областите, опоеделящи комплементарността за тежка верига са:

   (a) ThrSerGlyMelGlyValSernOCA. ИД. No 22.

   (b) Hislle Т yrT rpAspAspAspLysArgT yrAsnProSerLeuLysSer: ПОСЛ. ИД. No 24 или (c) ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: ПОСЛ. ИД. No 26.
8. 8. фузионният протеин, съгласно Претенция 1.,в който т. нар. аминокиселинни проследователности на областите, определящи комплементарността за лека верига са:

   (a) LeuAlaSerGInSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn:

   (b) A!aAlaSerAsnLeuGluSer:nOCA. ИД. No 18, или (c) GinGinSerAsnG!uAspProProArg:nOCA. ИД. No 28.
9. 9. фузионният протеин, съгласно Претенция 1.,в койтот. нар. аминокиселинни проследователности на областите, определящи комплементарността за лека верига са:

   (a) I. euAlaSerGInSerValAspT yrAspGlyAspSerT yrMetAsn: ПОСЛ. ИД No 16, (b) AlaAiaSerAsnLeuGluSer:ПОСЛ. ИД. No 18, или (c) G!nGlnSerAsnGluAspProProThr:nOCA. ИД. No20.
10. 10. Имуноглобулинова тежковерижна област, определяща комплементарността (ООК), аминокиселинната последователност на която е избрана от групата, състояща се (a) ThrSerGlyMetGlyValSernOCA. ИД. No22.

    (b) HislleT yrT rpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: ПОСЛ. ИД. No 24 или • · · · · ··· · · » · · t* ·»· • s · ^:!Γ· it

    St·· s· ··

    4· ·· ··· (c) ArgGluThrVaiPheTyrTrpPheAspVal: ПОСЛ. ИД. No 26.
11. 11 Имуноглобулинова лековерижна област, определяща комплементарността (ООК), аминокиселинната последователност на която е избрана от групата, състояща се ог (a) AlaAlaSerAsnLeuGiuSer.nOCA. ИД. No 18, или (b) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg:nOCA. ИД. No28.

    (c) (с) GlnGInSerAsnGluAspProProThr.nOCA. ИД. No 20.
12. 12. Молекула нуклеинова киселина, кодираща област, ?.'< !ределяща комплементарността (ООК) на имуноглобулинова тежка верига, последователността на която е избрана от групата, сьпьпжагца:

    ACT ТСТ GGT ATG GGT GTG AGC: ПОСЛ. ИД. No 21.

    (b) САС АГ Г ТAC TGG GATGAT GAC AAG CGC ТАТ AACCCATCCCTGAAGAGC: ПОСЛ. ИД. No 23.

    (c) AGA GAG ACT GTG ТСТ TAG TGG TAG TTC GAT GTC: ПОСЛ. ИД. No 25.

    (di ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: ПОСЛ. ИД. No 54.

    (Щ CAC ΛΪΟ ГАС TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC COG AGC CTG AAA TCC: ПОСЛ. ИД. No 55 и (() CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT : ПОСЛ. ИД. No 56.

    ГЗ. Молекула нуклеинова киселина, кодираща област, ο; »р'-’деляща комплементарността (ООК) на имуноглобулинова лека верига, последователността на която е избрана от групата, съдържаща: · (a) AAG GCC AGC САА AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGs TAT AiG ААС ПОСЛ. ИД. Νο:15 (b) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT

    AG ί TAT ATG AGC : ПОСЛ. ИД. No 53

    Ф) GCT GCA TCC AAT CTA GAA ТСТ:ПОСА. ИД. No 17 (djcAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: ПОСЛ. ИД. рЩ IQ (e) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG:flOCA. ИД No 2 7
13. 14. Хуманизирано антитяло, съдържащо тежка и лека вериги, характеризиращо се с дисоциационна константа, равна иди по-малка от 2 х 10 ^,0М за човешки IL4, в което рамковите области на споменатите тежка и лека вериги се получават от поне едно избрано човешко антитяло и аминокиселинните последователности на областите, определящи комплементарността на всяка от споменатите вериги,е получена от не-човешко неутрализиращо моноклонално антитяло, специфично за човешки iL4, характеризиращо се с дисоциационна константа, равна или по-малка от 2 х ΚΗθΜ за човешки IL4.
14. 15. Антитялото, съгласно Претенция 14., когаготое факултативно свързано към ефекторен агент, избран от група непротеинови молекули —носители, полистирен и пластмасови частички.
15. 16. Химерно антитяло, състоящо се от тежка и лека вериги, характеризиращо се с дисоциационна константа, равна или помалка or 2 х 10 ¹⁰М за човешки IL4.
16. 17. Фармацевтичен продукт, характеризиращ се с това, че съдържа фузионния протеин от Претенция 1 и фармацевтично приемлив носител.

    • · · • · ·· · • · • · · · • · • · ·· *· t* ··· • 4·

    ·.··· s· ··
17. 18 Метод за лечение на алергии и други състояния, свързани със свръхпродукция на IgE у човека, характеризиращ се с етапа на прилагането при нужда на ефективно количество са фузионния протеин, отговарящ на Претенция 1.
18. 19 Изолирана нуклеиново киселинна последователност, избрана аг групата, състояща се от (a) Нуклеиново киселинна последователност, кодираща фузионния протеин, отговарящ на Претенция 1;

    (b) Нуклеиново киселинна последователност, комплементарна на (а);

    (c) Нуклеиново киселинна последователност от 18 и повече нуклеотиди, способна да се хибридизира с (а) или (Ь) при строго определени условия и (d) фрагмент или аналог на (а),(Ь) или (с), кодиращ протеин, който се характеризира с това, че има специфичност към човечжи IL4;

    и факултативно съдържаща място за въздействие с ресфикционни ензими.
19. 20. Изолираната нуклеиново киселинна последователност, о« товарища на Претенция 19.,в която последователността, кодираща фузионния протеин включва нуклиеновокиселинната последвагелност на фиг. 5.ПОСЛ. ИД. No 13.
20. 21 Изолираната нуклеиново киселинна последователност, оионаряща на Претенция 19.,в която последователността, кодираща фузионния протеин включва нуклиеновокиселинната гкн:л^довзт«лноот на фиг. 4.:ПОСЛ. ИД. No 11.
21. 22. Изолирана нуклеиновокиселинна последователност, избрана от групата, състояща се от:

    (а) нуклеиновокиселинна последователност, кодираща област определяща комплементарността(ООК), в която тази ООК е получена от неутрализиращо мишо моноклонално а? 1 f ит яло, специфично за човешки IL4, характеризиращо се с днспцнзцисшш константа, равна или по-малка от 2 х ΚΗθΜ;

    ф) Нуклеиновокиселинна последователност, комплементарна на (а);

    (е) Нуклеиновокиселинна последователност στ 18 и повече С иуклеотнди, способна да се хибридизира с (а) или (Ь) при строго определе: sn услови я и (d) фрагмент или аналог на (а), (Ь) или (е), който кодира протеин, характеризиращ се с това, че е специфичен за човешки !LА
22. 23. Изолираната нуклеиновокиселинна последователност, съобразно претенция 22, която последователност е избрана от групата тежковерижни области, определящи комплемгя ιταριюстта, съставена от;

    (a) ACT I CT GGT ATG GGT GTG AGC: ПОСЛ. ИД. No 21.

    (b) СДС ЛТТ TAG TGG GATGAT GAC AAG CGC ТАТ

    AACCCATCCCTGAAGAGC: ПОСЛ. ИД. No23.

    iс) AGA. GAG ACT GTG TCT TAC TGG TAC TTC GAT © G IG: ПОСЛ. ИД. No 25.

    (di ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: ПОСЛ. ИД. No 54 ф) ¢. AC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC: ПОСЛ. ИД. No 55 и

    Ф CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT : ПОСЛ. ИД. No 56.

    • 4 • · · · • 4 • · ·· *

    ·· ··· • · · • · ·· • * ·· ·· • · • · · · ··· · • · ·· ·· • ·

    I· * ·· · ч • · ·4 ·· ·· • ·» ·♦ · • · « ··· ··' • · • · ·· • <

    »· · ··· ·«*· · •••••I !<· ·«· • ·*· ’.*>··· •им ·ι _Λ·*· ·· «·· **· tig
23. 24. Изолираната нуклеиновокиселинна последователност, съобразно претенция 22, която последователност е избрана от групата лековерижни области, определящи комплементарността, съставена от:

    (a) AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG ААС :ПОСА. ИД. No :15, (b) AAG GCC ТСС CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AGC :ПОСА. ИД. No53, (c) GOT GCA ТСС ААТ СТА GAA ТСТ:ПОСЛ. ИД. No 17, (d) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: ПОСЛ. ИД. No 19, (e) GAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG:nOCA. ИД. No 27.
24. 25. Рекомбинантен плазмид, характеризиращ се с нуклеиновокиселинната последователност на Претенция 19.
25. 26. Рекомбинантен плазмид, характеризиращ се с нуклеиновокиселинната последователност на Претенция 22. _;;
26. 27. Клетка-гостоприемник, трансфектирана с рекомбинантен плазмид от Претенция 25. _л . ..
27. 28. Клетка гостоприемник, трансфектирана с рекомбинантен плазмид от Претенция 2Θ.^:
28. 29. Процес за получаване на хуманизирано антитяло, „ > 1 специфично за човешки интерлевкин-4, характеризиращ се с ·.. култивиране на клетъчна линия, трансфектирана с рекомбинантния плазмид от Претенция 25, под контрола на избрана регулаторна последователност, способна да направлява експресията му в дадената клетка.

    6^· ·· *· • · · и · ·· ·*· · ·· ·· ·*»···· »»t ·· ·· ··· ·· • · * · ♦ ·
29. 30. Метод за диагностициране на алергии и други състояния, свързани със свръхпродукция на IgE у човека, характеризиращ се с влизането в контакт на проба от биологична течност с висок тигър на моноклонални антитела за човешки JL4 и изследващ за наличие на свързване между казанот о моноклонално антитяло и човешкия интерлевкин-4.
30. 31. Метод за скриниране на моноклонални антитела, имащи висок ти гър за човешки интерлевкин-4, който се характеризира 7 със следното: ' ' · £·>-.

    (a) получаване на хибридомна клетъчна линия, характеризираща се със секретиране на моноклонално антитяло . за човешки интерлевкин-4; и (b) скриниране на тази хибридомна клетъчна линия с куплиран с алдехид човешки интерлевкин-4 или биотинилиран човешки интерлевкин-4. < <.
31. 32. Неутрализиращо моноклонално антитяло, имащо висок титьр за човешки интерлевкин-4, Fab фрагмент или F(ab)2 Фрагмент от него, получено чрез скриниране на библиотека от , _{ хибридомни продукти с куплиран с алдехид човешки интерлевкин-4 или биотинилиран човешки интерлевкин-4.
32. 33. Неутрализиращо моноклонално антитяло от гризачи, специфично за интерлевкин-4 и характеризиращо се с . -¾
33. 35. Моноклоналното антитяло съгласно Претенция 34, което съдържа лековерижната аминокиселинна последователност с ИД No 2 и тежковери>Ю1ата аминокиселинна последователност с ИД No 4. / .<;
34. 36 Моноклоналното антитяло съгласно Претенция 33, в което указаният гризач е плъх.
35. 37. Моноклоналното антитяло съгласно Претенция 3Θ, имащо идентификационна характеристика на 6А1.

    Зв Хибридома, имаща хибридизационните характеристики на клетъчна линия 342ВА11С1В9.