ES2236693T3 - Anticuerpos recombinantes contra il4 utiles en el tratamiento de afecciones mediadas por il4. - Google Patents

Abstract

SE SUMINISTRAN MABS IL4 QUIMERICOS Y HUMANIZADOS DERIVADOS DE MABS CON ALTA AFINIDAD, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LOS CONTIENEN Y METODOS DE TRATAMIENTO.

Description

Anticuerpos recombinantes contra IL-4 útiles en el tratamiento de afecciones mediadas por IL-4.

La presente invención se refiere en general al campo de las proteínas de fusión, y a proteínas útiles en el tratamiento y diagnóstico de afecciones mediadas por IL-4 y producción excesiva de IgE, y más específicamente a anticuerpos de IL-4 quiméricos y humanizados.

Las enfermedades atópicas alérgicas comprenden desde las relativamente leves (tales como rinitis y conjuntivitis estacional, a las más graves, tales como dermatitis atópica y asma atópico, y amenazantes para la vida, tales como el choque anafiláctico). El enlace entre estas condiciones se encuentra en la respuesta inmunitaria del cuerpo a los alérgenos, respuesta que implica la producción de anticuerpos de inmunoglobulina E (IgE) en individuos genéticamente predispuestos (atopia). La inhibición de la producción de IgE ha constituido desde hace mucho tiempo una meta en la inmunoterapia específica de la enfermedad alérgica utilizando vacunas de insensibilización. No obstante, en los últimos años la seguridad y eficacia de la terapia con vacunas ha sido cuestionada, pero el deseo de reducir los niveles de IgE no ha disminuido.

La interleuquina 4 (IL-4) es un mediador proteínico en el sistema linfoide. Estudios de linfocitos de individuos atópicos han revelado la presencia de números de linfocitos T mayores que los normales con la capacidad de secretar IL-4 en respuesta a la estimulación, y mayores cantidades de IL-4 secretadas después de estimulación.

Se ha encontrado que el anticuerpo anti-IL-4 inhibe IgE pero no IgG_{1} o IgG_{2a} [Finkelman et al., Ann. Rev. Immunol., 8: 303 (1990)], y la producción de células T secretoras de IL-5 [Maggi et al., J. Immunol., 148: 2142 (1992)]. Adicionalmente, datos recientes sugieren que IL-4 puede afectar a la acumulación de eosinófilos en los tejidos. Véase, v.g. Tepper et al., Cell, 62: 457 (1990); Tepper et al., Cell, 57: 503 (1989).

Persiste necesidad en la técnica de un antagonista de IL-4 de afinidad alta, que pudiera reducir la inflamación eosinofílica a la vez por reducción de la proliferación de células secretoras de IL-5, y por inhibición de un mecanismo de adherencia por el cual los eosinófilos pueden acumularse en los tejidos, y que pueda utilizarse para tratar, prevenir o diagnosticar las reacciones alérgicas.

El uso de antígenos biotinilados para clasificar cultivos de hibridoma en cuanto a anticuerpos monoclonales de afinidad alta se describe en Hybridoma 12, 475, 8/93.

Dos anticuerpos monoclonales de afinidad alta contra IL-4 humana se dan a conocer en la Solicitud de Patente Japonesa No. JP-A-3187395 (Ono Yakuhin Kogyo Corp.). La utilidad principal de estos anticuerpos se describe como relacionada con inmuno-ensayos para IL-4 humana.

La Solicitud Internacional No. WO 93/17106 describe la clonación y expresión de anticuerpos monoclonales contra IL-4 humana para uso en kits y métodos para detectar, medir e inmunopurificar IL-4 humana, así como el tratamiento de enfermedades relacionadas con IL-4. Como se expone en la Tabla 5 de la página 66 del documento WO 93/17106, los anticuerpos monoclonales nativos y humanizados descritos en este documento tienen una afinidad de fijación para IL-4 humana caracterizada por un valor K_{d} de aproximadamente 1 x 10^{-9} M en el mejor de los casos.

La base de datos EMBL, Acc. No. N36222; la Solicitud de Patente Europea No. EP-A-327000 (Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute); y Geneseq. Acc. Núms. R66143, R66144 y Q04039 dan a conocer las secuencias de SEQ ID Núms. 22, 17, 16, 18 y 15 de la presente solicitud, respectivamente. Estas descripciones, sin embargo, no están relacionadas con anticuerpos monoclonales de IL-4.

La invención se define por el asunto de las reivindicaciones 1-33.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que tiene una afinidad de fijación para la interleuquina-4 humana que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) derivadas de un anticuerpo monoclonal (MAb) neutralizante no humano caracterizado por una constante de disociación igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana, y una primera pareja de fusión en la cual al menos una, y preferiblemente todas las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la primera pareja de fusión están reemplazadas por CDRs del anticuerpo monoclonal (MAb) no humano. El anticuerpo monoclonal neutralizante no humano puede seleccionarse del grupo constituido por 3B9 y 6A1 como se describe más completamente en la Descripción Detallada. Preferiblemente, la proteína de fusión está enlazada operativamente asimismo a una segunda proteína de fusión, que comprende la totalidad o una parte de una cadena constante de inmunoglobulina.

La presente memoria descriptiva describe CDRs derivadas de anticuerpos monoclonales (MAb) neutralizantes no humanos caracterizados por una constante de disociación igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana, y moléculas de ácido nucleico que codifican tales CDRs.

En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos humanizados que tienen al menos una, y preferiblemente seis, regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) derivadas de anticuerpos monoclonales (MAb) neutralizantes no humanos caracterizados por una constante de disociación igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana.

En otro aspecto adicional, se proporciona un anticuerpo quimérico que contiene regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas y regiones variables de cadena pesada y ligera derivadas de anticuerpos monoclonales (MAb) neutralizantes no humanos caracterizados por una constante de disociación igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana. En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene una (o más) de las proteínas de fusión o MAbs arriba descritos (v.g., humanizados, quiméricos, etc.) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente memoria descriptiva describe un método para tratar y/o prevenir afecciones alérgicas en humanos por administración a dichos humanos de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la invención

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para, y componentes útiles en, la producción recombinante de las proteínas de fusión, MAbs (v.g., humanizados, quiméricos, etc.), CDRs de los mismos, un Fab, o F(ab)_{2}, o un análogo de los mismos que se deriva de anticuerpos monoclonales (MAb) neutralizantes no humanos caracterizados por una constante de disociación igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana. Estos componentes incluyen secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican los mismos, reemplazadas por CDRs procedentes del anticuerpo monoclonal (MAb) no humano. El anticuerpo monoclonal neutralizante no humano puede ser producido por el hibridoma ECACC 93100620 como se describe más completamente en la Descripción Detallada. Preferiblemente, la proteína de fusión está enlazada operativamente también a una segunda proteína de fusión, que comprende la totalidad o una parte de una cadena constante de inmunoglobulina.

En un aspecto afín, la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden CDRs derivadas de anticuerpos monoclonales (MAb) neutralizantes no humanos caracterizados por una constante de disociación igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana, y moléculas de ácido nucleico que codifican tales CDRs. De acuerdo con ello, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

(a)

HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnPro-SerLeuLysSer: SEQ ID NO: 24, y

(b)

ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: SEQ ID NO: 26,

y una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

(a)

GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: SEQ ID NO: 28; y

(b)

GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: SEQ ID NO: 20.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se define en la reivindicación 1 que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada de inmunoglobulina, cuya secuencia se selecciona del grupo constituido por:

100

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se define en la reivindicación 1, y que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR) de cadena ligera de inmunoglobulina, cuya secuencia se selecciona del grupo constituido por:

101

En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos humanizados que tienen al menos una, y preferiblemente seis, regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) derivadas de anticuerpos monoclonales (MAb) neutralizantes no humanos caracterizados por una constante de disociación igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4. De acuerdo con ello, en un quinto aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, caracterizándose dicho anticuerpo por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana, en el cual las regiones de entramado de dichas cadenas pesada y ligera se derivan de al menos un anticuerpo humano seleccionado y las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de cada una de dichas cadenas se derivan de un anticuerpo monoclonal neutralizante no humano específico para IL-4 humana caracterizado por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana. En este aspecto, el anticuerpo está enlazado opcionalmente a un agente efector seleccionado del grupo constituido por una molécula portadora no proteínica, poliestireno, y perlas de plástico.

En otro aspecto adicional, se proporciona un anticuerpo quimérico que contiene regiones constantes de cadenas pesada y ligera humanas y regiones variables de cadenas pesada y ligera derivadas de anticuerpos monoclonales (MAb) neutralizantes no humanos caracterizados por una constante de disociación igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4
humana. De acuerdo con ello, en un sexto aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo quimérico que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, caracterizándose dicho anticuerpo por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana, en el cual las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de dicha cadena pesada y dicha cadena ligera se derivan de un anticuerpo monoclonal neutralizante no humano específico para IL-4 humana caracterizado por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana.

En otros aspectos adicionales, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene una (o más) de las proteínas de fusión o MAbs arriba descritos (humanizados, quiméricos, etc.) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con ello, en un séptimo aspecto la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto de la invención o el anticuerpo de acuerdo con el quinto o sexto aspectos de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un octavo aspecto, la presente invención proporciona la proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto de la invención o el anticuerpo de acuerdo con el quinto o sexto aspectos de la invención, para uso en el tratamiento de alergias y otras afecciones asociadas con la producción excesiva de IgE en un humano.

La presente solicitud describe también un método para tratar y/o prevenir afecciones alérgicas en humanos por administración a dichos humanos de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la invención.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para, y componentes útiles en, la producción recombinante de las proteínas de fusión, MAbs (v.g., humanizados, quiméricos, etc.), CDRs de los mismos, un Fab, o F(ab)_{2}, o análogo de los mismos que se deriva de anticuerpos monoclonales (MAb) neutralizantes no humanos caracterizados por una constante de disociación igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana. Estos componentes incluyen secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican los mismos, plásmidos recombinantes que contienen las secuencias de ácido nucleico bajo el control de secuencias reguladoras seleccionadas capaces de dirigir la expresión de los mismos en células hospedadoras, y células hospedadoras (preferiblemente de mamífero) transfectadas con los plásmidos recombinantes. El método de producción implica cultivar una línea de células hospedadoras transfectada de la presente invención en condiciones tales que un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo humanizado, se expresa en dichas células y aislar el producto expresado por el mismo. De acuerdo con ello, en un noveno aspecto la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que se selecciona del grupo constituido por:

(a)

una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto de la invención;

(b)

una secuencia de ácido nucleico complementaria a (a);

(c)

un fragmento o análogo de (a) o (b) que codifica una proteína caracterizada por tener una afinidad de fijación para interleuquina-4 humana caracterizada por un valor K_{d} igual a o menor que 2 x 10^{-10} M;

en donde dicha secuencia contiene opcionalmente un sitio de restricción.

En este aspecto, la secuencia codificante de la proteína de fusión puede comprender adecuadamente la secuencia de ácido nucleico de Fig. 5, SEQ ID NO: 13 o la secuencia de ácido nucleico de Fig. 4, SEQ ID NO: 11.

La presente memoria descriptiva describe una secuencia de ácido nucleico aislada que se selecciona del grupo constituido por:

(a)

una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR) en la cual dicha CDR se obtiene a partir de un anticuerpo monoclonal neutralizante murino específico para interleuquina-4 humana y que tiene una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M;

(b)

una secuencia de ácido nucleico complementaria a (a); y

(c)

un fragmento o análogo de (a) o (b) que codifica una proteína caracterizada por tener una afinidad de fijación para interleuquina-4 humana caracterizada por un valor K_{d} igual a o menor que 2 x 10^{-10} M.

La secuencia puede seleccionarse convenientemente del grupo de secuencias codificantes de regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada constituidas por:

1

NO: 56, o del grupo de secuencias codificantes de regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera constituidas por:

2

En aspectos adicionales, la invención proporciona un plásmido recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el noveno aspecto de la invención y una célula hospedadora transfectada con este plásmido recombinante, respectivamente.

En un aspecto decimotercero, la presente invención proporciona un proceso para producir un anticuerpo humanizado específico para interleuquina-4 humana que comprende cultivar una línea de células transfectada con dicho plásmido recombinante bajo el control de secuencias reguladoras seleccionadas capaces de dirigir la expresión del mismo en dichas células.

En otro aspecto adicional de la invención, se trata de un método para diagnosticar alergias y otras afecciones asociadas con una producción excesiva de inmunoglobulina E en un humano, que comprende poner en contacto una muestra de fluido biológico con las proteínas de fusión, MAbs (v.g., humanizados, quiméricos, etc.) y Fabs de la presente invención y ensayar respecto a la existencia de fijación entre dicha proteína de fusión, MAb o Fab e interleuquina-4 humana. De acuerdo con ello, en un decimocuarto aspecto, la presente invención proporciona un método de diagnóstico de alergias y otras afecciones asociadas con la producción excesiva de inmunoglobulina E en un humano, que comprende poner en contacto una muestra de fluido biológico con un anticuerpo caracterizado por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana y ensayar respecto a la existencia de fijación entre dicho anticuerpo monoclonal y la interleuquina humana.

La presente solicitud describe también un método para clasificar anticuerpos monoclonales que tienen un título elevado de interleuquina-4 humana que comprende:

(a) preparar una línea de células de hibridoma caracterizada por secreción de un anticuerpo monoclonal para interleuquina-4 humana; y (b) clasificar dicha línea de células de hibridoma con interleuquina-4 humana acoplada con aldehído o interleuquina-4 humana biotinilada. Preferiblemente, la línea de células de hibridoma se clasifica con interleuquina-4 humana biotinilada. De acuerdo con ello, en un aspecto decimoquinto la presente invención proporciona un método para clasificar anticuerpos monoclonales que se caracterizan por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para interleuquina-4 humana que comprende:

(a) preparar una línea de células de hibridoma caracterizada por secreción de un anticuerpo monoclonal para interleuquina-4 humana; y

(b) clasificar dicha línea de células de hibridoma con interleuquina-4 humana acoplada con aldehído.

Se describe también un MAb neutralizante que tiene afinidad alta para IL-4, un fragmento Fab o un fragmento
F(ab')_{2} del mismo, producido por clasificación de una genoteca de productos de hibridoma con interleuquina-4 humana acoplada con aldehído o IL-4 humana biotinilada. De acuerdo con ello, en un aspecto decimosexto la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal neutralizante que se caracteriza por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para interleuquina-4 humana, que puede obtenerse por clasificación de una genoteca de productos de hibridoma con interleuquina-4 humana acoplada con aldehído.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales neutralizantes de roedor específicos para interleuquina-4 humana y que tienen una afinidad de fijación caracterizada por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M. Ilustrativo de tales anticuerpos monoclonales es el MAb de rata 6A1, y otros MAbs que tienen las mismas características de identificación (es decir, se fijan al o los mismos epítope(s) que 6A1 con una especificidad para IL-4 humana y una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M). De acuerdo con ello, en un aspecto decimoséptimo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal neutralizante de roedor específico para interleuquina-4 humana y que tiene una afinidad de fijación caracterizada por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M. En este aspecto, el roedor puede ser convenientemente un ratón, en cuyo caso el anticuerpo monoclonal comprende adecuadamente la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 2, y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 4.
Alternativamente, el roedor puede ser una rata, en cuyo caso el anticuerpo monoclonal tiene convenientemente la especificidad de fijación para IL-4 humana del anticuerpo producido por el hibridoma EC ACC 93100621.

En un aspecto decimoctavo, la presente invención proporciona una línea de células de hibridoma que produce un anticuerpo de acuerdo con el aspecto decimoséptimo. El hibridoma EC ACC 93100620 es un aspecto adicional de la invención.

Estos aspectos y ventajas de la presente invención se describen adicionalmente en la descripción detallada que sigue de las realizaciones preferidas de la misma.

Fig. 1 [SEQ ID NOS: 1 y 2] ilustra la región variable de la cadena ligera (aminoácidos 21-132) para el anticuerpo de IL-4 murino 3B9, y el anticuerpo quimérico humano/murino 3B9 así como la secuencia nativa de señal (aminoácidos 1-20). Las porciones subrayadas indican las CDRs [SEQ ID NOS: 15 y 16; SEQ ID NOS: 17 y 18; y SEQ ID NOS: 19 y 20].

Fig. 2 [SEQ ID NOS: 3 y 4] ilustra la región variable de la cadena pesada (aminoácidos 20-140) del murino 3B9, y la secuencia nativa de señal (aminoácidos 1-19). Las porciones subrayadas indican las CDRs [SEQ ID NOS: 21 y 22; SEQ ID NOS: 23 y 24; y SEQ ID NOS: 25 y 26].

Fig. 3 [SEQ ID NOS: 9 y 10] ilustra la región variable de la cadena pesada (aminoácidos 21-141) del anticuerpo quimérico humano/murino 3B9 y su secuencia de señal (aminoácidos 1-19: SEQ ID NOS: 5 y 6). Las porciones subrayadas indican las CDRs derivadas de 3B9 [SEQ ID NOS: 21 y 22; SEQ ID NOS: 23 y 24; y SEQ ID NOS: 25 y 26].

Fig. 4 [SEQ ID NOS: 11 y 12] ilustra la región variable de la cadena pesada (aminoácidos 20-141) del anticuerpo humanizado 3B9 y una secuencia de señal (aminoácidos 1:19; SEQ ID NOS: 5 y 6). Las porciones subrayadas indican las CDRs derivadas de 3B9 (SEQ ID NOS: 54 y 22; SEQ ID NOS: 55 y 24; y SEQ ID NOS: 56 y 26].

Fig. 5 [SEQ ID NOS: 13 y 14] ilustra la región variable de la cadena ligera (aminoácidos 21-131) del anticuerpo humanizado 3B9 y una secuencia de señal (aminoácidos 1-20; SEQ ID NOS: 7 y 8). Las porciones subrayadas indican las CDRs derivadas de 3B9 [SEQ ID NOS: 53 y 16; SEQ ID Nos. 17 y 18; y SEQ ID NOS: 27 y 28].

Fig. 6A [SEQ ID NOS: 5 y 6] es una secuencia de señal de la cadena pesada utilizada en el Ejemplo 4 más adelante.

Fig. 6B [SEQ ID NOS: 7 y 8] es una secuencia de señal de la cadena ligera utilizada en el Ejemplo 4 más adelante.

Fig. 7 es un dibujo esquemático del plásmido pIL-4chhc3-pcd empleado para expresar una cadena pesada quimérica de IL-4 en células de mamífero. El plásmido contiene un gen de beta-lactamasa (BETA LAC), un origen de replicación de SV-40 (SV40), una secuencia promotora de citomegalovirus (CMV), una secuencia de señal, la cadena pesada variable quimérica de SEQ ID NOS: 9 y 10, una región constante de cadena pesada humana, una señal poli A de la hormona del crecimiento de los bovinos (BGH), un promotor de betaglobina (beta glopro), un gen de dihidrofolato-reductasa (DHFR), y otra señal poli A de la secuencia BGH de en un sustrato de pUC-19.

Fig. 8 es un dibujo esquemático del plásmido PIL-4chlc-pcdn empleado para expresar la región variable de la cadena ligera quimérica de IL-4 de SEQ ID NOS: 1 y 2 en células de mamífero. El plásmido difiere del de Fig. 7 por contener una región variable de cadena ligera quimérica en lugar de la correspondiente a la cadena pesada quimérica, una región constante de cadena ligera humana y un gen de neomicina (Neo) además de DHFR.

Fig. 9 es un dibujo esquemático del plásmido pIL-4hzhc-1-pcd empleado para expresar la región variable de la cadena pesada de IL-4 sintética de SEQ ID NOS: 11 y 12 en células de mamífero. El plásmido difiere del de Fig. 7 por contener una región variable de cadena pesada humanizada en lugar de la correspondiente a la cadena pesada quimérica.

Fig. 10 es un dibujo esquemático del plásmido pIL-4hzlc1-0-Pcn empleado para expresar la región variable de la cadena ligera de IL-4 humanizada de SEQ ID NOS: 13 y 14 en células de mamífero. El plásmido difiere del de Fig. 8 por contener una región variable de cadena ligera humanizada en lugar de la correspondiente a la cadena ligera quimérica y no codifica el gen de DHFR.

La presente invención proporciona una diversidad de anticuerpos, fragmentos de los mismos, y proteínas de fusión, particularmente anticuerpos humanizados, que se caracterizan por especificidad de fijación de IL-4 humana, actividad neutralizante, y afinidad alta para IL-4 humana como se ilustra en el MAb murino 3B9 o el MAb de rata 6A1. Estos productos son útiles en composiciones terapéuticas y farmacéuticas para el tratamiento de reacciones alérgicas mediadas por IL-4 y mediadas por IgE. Estos productos son útiles también en el diagnóstico de una afección mediada por IL-4 por medida (v.g., por ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA)) de niveles circulantes endógenos de IL-4 en humanos.

I. Definiciones

"Proteína de fusión" hace referencia a una proteína codificada por una molécula de fusión, que puede obtenerse por expresión en una célula hospedadora seleccionada. Tales proteínas de fusión son anticuerpos transformados por ingeniería genética, v.g., anticuerpos quiméricos o humanizados, o fragmentos de anticuerpo que carecen de la totalidad o una parte de una región constante de inmunoglobulina, v.g., Fv, Fab o F(ab)_{2} y análogos.

"Molécula de fusión" hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que codifica las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de una inmunoglobulina no humana que están insertadas en una primera pareja de fusión que comprende secuencias de entramado humanas variables. Opcionalmente, la primera pareja de fusión está enlazada operativamente a una segunda pareja de fusión.

"Primera pareja de fusión" hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que codifica un entramado humano o región variable de inmunoglobulina humana en la cual las CDRs nativas (o existentes naturalmente) están reemplazadas por las CDRs de un anticuerpo donante. La región variable humana puede ser una cadena pesada de inmunoglobulina, una cadena ligera (o ambas cadenas), un análogo o fragmentos funcionales de los mismos. Tales CDRs o regiones CDR, localizadas en el interior de la región variable de los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden ser determinadas por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Kabat et al., [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Institutos Nacionales de la Salud (1987)], dan a conocer reglas para localización de CDRs. Adicionalmente, se conocen programas de ordenador que son útiles para identificar regiones/estructuras CDR.

La expresión "título elevado" hace referencia a un anticuerpo que tiene una afinidad de fijación caracterizada por un valor K_{d} igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana.

Por "especificidad de fijación para IL-4 humana" se entiende un título elevado (o afinidad) para IL-4 humana, no bovina ni murina.

"Segunda pareja de fusión" hace referencia a otra secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un péptido al cual se fusiona la primera pareja de fusión en marco o por medio una secuencia enlazadora convencional opcional (es decir, enlazada operativamente). Preferiblemente, se trata de una inmunoglobulina. La segunda pareja de fusión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante entera para el mismo (es decir homólogo - las proteínas de fusión primera y segunda se derivan de la misma fuente) anticuerpo o un anticuerpo adicional (es decir, heterólogo) de interés. Puede tratarse de una cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina (o ambas cadenas, como parte de un solo polipéptido). La segunda pareja de fusión no está limitada a una clase o isotipo de inmunoglobulina particular. Adicionalmente, la segunda pareja de fusión puede comprender parte de una región constante de inmunoglobulina, tal como se encuentra en un Fab, o F(ab)_{2} (es decir, una parte discreta de una región constante o región de entramado humana apropiada). Dicha segunda pareja de fusión puede comprender también una secuencia que codifica una proteína integral de membrana expuesta en la superficie externa de una célula hospedadora, v.g., como parte de una genoteca de presentación de fago, o una secuencia codificante de una proteína para detección analítica o diagnóstica, v.g., peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, etc.

Los términos Fv, Fc, Fab, o F(ab)_{2} se utilizan con sus significados estándar (véase, v.g., Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

Tal como se utiliza en esta memoria, un "anticuerpo transformado por ingeniería genética" describe un tipo de proteína de fusión, es decir, un anticuerpo sintético (v.g., un anticuerpo quimérico o humanizado) en el cual una porción de los dominios variables de cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo aceptor seleccionado están reemplazados por partes análogas de uno o más anticuerpos donantes que tienen especificidad para el epítope seleccionado. Por ejemplo, tales moléculas pueden incluir anticuerpos caracterizados por una cadena pesada humanizada asociada con una cadena ligera no modificada (o cadena ligera quimérica), o viceversa. Los anticuerpos transformados por ingeniería genética pueden caracterizarse también por alteración de las secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones de entramado de los dominios variables ligeros y/o pesados del anticuerpo aceptor a fin de retener especificidad de fijación del anticuerpo donante. Estos anticuerpos pueden comprender reemplazamiento de una o más CDRs (preferiblemente todas) del anticuerpo aceptor con CDRs de un anticuerpo donante descrito en esta memoria.

Un "anticuerpo quimérico" hace referencia a un tipo de anticuerpo transformado por ingeniería genética que contiene una región variable existente naturalmente (cadena ligera y cadenas pesadas) derivada de un anticuerpo donante en asociación con regiones constantes de cadena ligera y pesada derivadas de un anticuerpo aceptor.

Un "anticuerpo humanizado" hace referencia a un tipo de anticuerpo transformado por ingeniería genética que tiene sus CDRs derivadas de una inmunoglobulina donante no humana, derivándose las partes restantes de la molécula derivadas de inmunoglobulina de una (o más) inmunoglobulina(s) humana(s). Adicionalmente, los residuos soporte del entramado pueden estar alterados para preservar la afinidad de fijación (véase, v.g., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10099-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421 (1991)).

La expresión "anticuerpo donante" hace referencia a un anticuerpo (policlonal, monoclonal, o recombinante) que aporta las secuencias de ácido nucleico de sus regiones variables, CDRs, u otros fragmentos funcionales o análogos del mismo a una primera pareja de fusión, a fin de proporcionar la molécula de fusión y dar como resultado una proteína de fusión expresada con la especificidad antigénica y la característica de actividad neutralizante del anticuerpo donante. Un anticuerpo donante adecuado para uso en esta invención, pero que no forma parte de la misma, es un anticuerpo monoclonal neutralizante no humano (a saber, murino) designado como 3B9. El anticuerpo 3B9 se define como un anticuerpo neutralizante de título alto específico de IL-4 humana (es decir, que no reconoce IL-4 bovina o murina), de isotipo IgG_{1} que tiene el DNA de la cadena ligera variable y las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1 y 2, y el DNA de la cadena pesada variable y las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 3 y 4 en una región constante de IgG murina adecuada.

La expresión "anticuerpo aceptor" hace referencia a un anticuerpo (policlonal, monoclonal, o recombinante) heterólogo para el anticuerpo donante, que aporta la totalidad (o alguna porción, pero preferiblemente la totalidad) de las secuencias de ácido nucleico codificantes de sus regiones de entramado de cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de cadena pesada y/o ligera a la segunda pareja de fusión. Preferiblemente, el anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano.

Las "CDRs" se definen como las secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo que son las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina. Véase, v.g., Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Institutos Nacionales de la Salud (1987). Existen tres CDRs (o regiones CDR) de cadena pesada y tres de cadena ligera en la porción variable de una inmunoglobulina. Así pues, "CDRs" tal como se utiliza en esta memoria hace referencia a las tres CDRs de la cadena pesada, o las tres CDRs de la cadena ligera (o a la vez a todas las CDRs de la cadena pesada y todas las CDRs de la cadena ligera, en caso apropiado).

Las CDRs proporcionan la mayoría de los residuos de contacto para la fijación del anticuerpo al antígeno o epítope. Las CDRs de interés en esta invención se derivan de secuencias variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo donante, e incluyen análogos de las CDRs existentes naturalmente, análogos que participan de o retienen también la misma especificidad de fijación de antígeno y/o capacidad neutralizante que el anticuerpo donante del que se derivan aquéllas.

Por "compartición de la especificidad de fijación o capacidad neutralizante del antígeno" se entiende, por ejemplo, que aunque MAb 3B9 puede caracterizarse por un cierto nivel de afinidad de antígeno, y una CDR codificada por una secuencia de ácido nucleico de 3B9 en un entorno estructural apropiado puede tener una afinidad menor o mayor, es de esperar que las CDRs de 3B9 en tales entornos reconozcan sin embargo el o los mismos epítopes que 3B9. CDRs ilustrativas de cadena pesada de 3B9 incluyen SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26; y CDRs ilustrativas de cadena ligera de 3B9 incluyen SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; y SEQ ID NO: 20.

Un "fragmento funcional" es una secuencia variable parcial de cadena pesada o ligera (v.g., con deleciones menores en el término amino o carboxi de la región variable de inmunoglobulina) que retiene la misma especificidad de fijación y/o capacidad de neutralización de antígeno que el anticuerpo del que se derivó el fragmento.

Un "análogo" es una secuencia de aminoácidos modificada por al menos un aminoácido, en la cual dicha modificación puede ser química o una sustitución o un reordenamiento de un pequeño número de aminoácidos (es decir, no más de 10), modificación que permite que la secuencia de aminoácidos retenga las características biológicas, v.g., especificidad de antígeno y título o afinidad altos, de la secuencia no modificada. Por ejemplo, pueden construirse mutaciones silenciosas, por la vía de sustituciones, para crear sitios de restricción por endonucleasas dentro de o alrededor de las regiones CDR.

Los análogos pueden generarse también como variaciones alélicas. Una "variación o modificación alélica" es una alteración en la secuencia de ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos o péptidos de la invención. Variaciones o modificaciones de este tipo pueden ser debidas a degeneraciones en el código genético o pueden ser producidas deliberadamente por ingeniería genética para proporcionar características deseadas. Estas variaciones o modificaciones pueden dar o no como resultado alteraciones en cualquier secuencia de aminoácidos codificada. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena ligera SEQ ID NO: 16 son idénticas para el anticuerpo 3B9 murino nativo y humanizado. Sin embargo, esta secuencia CDR es codificada tanto por SEQ ID NO: 15 como por SEQ ID NO: 53. Análogamente, la CDR SEQ ID NO: 22 es codificada a la vez por SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 54; la CDR SEQ ID NO: 24 es codificada a la vez por SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 55; y la CDR SEQ ID NO: 26 es codificada a la vez por SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 56.

La expresión "agentes efectores" hace referencia a moléculas portadoras no proteínicas a las cuales pueden asociarse las proteínas de fusión, y/o la cadena ligera o pesada natural o sintética del anticuerpo donante u otros fragmentos del anticuerpo donante, por medios convencionales. Tales portadores no proteínicos pueden incluir portadores convencionales utilizados en el campo diagnóstico, v.g., perlas de poliestireno u otros plásticos, polisacáridos, v.g., tal como se utilizan en el sistema BIAcore [Pharmacia], u otras sustancias no proteínicas útiles en el campo médico y seguras para administración a humanos y animales. Otros agentes efectores pueden incluir un macrociclo, para formación de quelatos con un átomo de metal pesado, o radioisótopos. Tales agentes efectores pueden ser útiles también para aumentar la semi-vida de las proteínas de fusión, v.g., el polietilen-glicol.

II. Anticuerpos Monoclonales de IL-4 de Afinidad Alta

Para uso en la construcción de los anticuerpos, fragmentos y proteínas de fusión de esta invención, puede emplearse una especie no humana (por ejemplo bovino, ovino, primate, roedor (v.g., murino y rata), etc.) a fin de generar una inmunoglobulina deseable después de presentación con IL-4 humana nativa o un epítope peptídico de la misma. Se emplean técnicas convencionales de hibridoma para proporcionar una línea de células de hibridoma que secreta un MAb no humano para IL-4. Tales hibridomas se clasifican luego utilizando IL-4 unida covalentemente a placas de 96 pocillos o alternativamente con IL-4 biotinilada para uso en un ensayo de clasificación, como se describe en detalle en el ejemplo 2 más adelante. Así pues, una característica de la presente invención es un método para detectar MAbs para IL-4 humana en el cual los sistemas de ensayo evitan la desnaturalización de IL-4 De este modo, se descubrió que pueden detectarse MAbs de título alto (o afinidad alta) para IL-4 humana.

Como un ejemplo, se describe por primera vez la producción de un MAb neutralizante de título alto a partir de un donante murino. MAb 3B9, que es un anticuerpo murino deseable (donante) para uso en el desarrollo de un anticuerpo quimérico o humanizado, se describe en detalle en el Ejemplo 1 más adelante. El MAb 3B9 se caracteriza por una especificidad de fijación de antígeno para IL-4 humana, con un valor K_{d} menor que 2,0 x 10^{-10} M (aproximadamente 1,8 x 10^{-10} M) para IL-4. El K_{d} para IL-4 de un fragmento Fab de este 3B9 es menor que aproximadamente 3 x 10^{-10} M. El epítope de este anticuerpo no pudo mapearse a IL-4 con péptidos lineales, y por tanto se considera que el epítope se fija a un epítope no contiguo. El patrón de fijación sugiere un sitio de fijación en la región del bucle B-C (residuos 60-69) \rightarrow hélice C (residuos 70-93). Estas regiones hacen referencia a las designaciones en el mapa proporcionadas en Cook et al., J. Mol. Biol., 218: 675-678 (1991), Walter et al., J. Biol. Chem., 267: 20371-20376 (1992), Wlodaver et al., FEBS Lett., 309: 59-64 (1992), Redfield et al., Biochem., 30: 11029-11035 (1991), Smith et al., J. Mol. Biol., 224: 899-904 (1992) Garrett et al. (1992), y Powers et al., Biochem., 31: 4334-4346 (1992) y Science, 252: 1673-1677 (1992), que se incorporan por referencia en esta memoria.

Otro anticuerpo donante deseable es el MAb de rata 6A1. La producción de este MAb se aporta más adelante en el Ejemplo 7. Este MAb se caracteriza por tener el isotipo IgG_{2a}, y por tener una constante de disociación para hIL-4 menor que 2,0 x 10^{-10} M (aproximadamente 1,6 x 10^{-10} M). Como en el caso de 3B9, el epítope diana de este 6A1 no mapea con los péptidos lineales de IL-4, y se considera por tanto que el epítope es no contiguo y tridimensional. El patrón de fijación a las muteínas de IL-4 y su actividad biológica indica fijación en la región de la hélice D de IL-4 humana (residuos de aminoácidos 109-127), muy probablemente alrededor de la tirosina en el residuo de aminoácido #124.

Esta invención no está limitada al uso del MAb 3B9, el MAb 6A1, o sus secuencias hipervariables (es decir, CDR). Cualesquiera otros anticuerpos de IL-4 de título alto caracterizados por una constante de disociación igual a o menor que 2,0 x 10^{- 10} M para IL-4 humana y las CDRs anti-IL-4 correspondientes pueden emplearse en sustitución de aquéllos. Dondequiera que en la descripción siguiente el anticuerpo donante se identifica como 3B9 o 6A1, esta designación se hace únicamente para ilustración y simplicidad de descripción.

III. Fragmentos de Anticuerpo

La presente invención incluye también el uso de fragmentos Fab o fragmentos F(ab')_{2} derivados de MAbs dirigidos contra IL-4 humana. Estos fragmentos son útiles como agentes protectores in vivo contra afecciones mediadas por IL-4 e IgE o in vivo como parte de un diagnóstico de IL-4. Un fragmento Fab contiene la cadena ligera entera y la porción amino-terminal de la cadena pesada; y un fragmento F(ab')_{2} es el fragmento formado por dos fragmentos Fab unidos por enlaces disulfuro. Los MAbs 3B9, 6A1, y otros anticuerpos similares de alta afinidad de fijación de IL-4 proporcionan fuentes de fragmentos Fab y fragmentos F(ab')_{2} que pueden obtenerse por medios convencionales, v.g., escisión del MAb con las enzimas proteolíticas apropiadas, papaína y/o pepsina, o por métodos recombinantes. Estos fragmentos Fab y F(ab')_{2} son útiles en sí mismos como agentes terapéuticos, profilácticos o diagnósticos, y como donantes de secuencias que incluyen las regiones variables y secuencias CDR útiles en la formación de anticuerpos recombinantes o humanizados como se describe en esta memoria.

IV. Secuencias de Interés de Aminoácidos y Nucleótidos Anti-IL-4

El MAb 3B9 u otros anticuerpos descritos anteriormente pueden aportar secuencias, tales como secuencias peptídicas de cadenas pesada y/ ligera variables, secuencias de entramado, secuencias CDR, fragmentos funcionales, y análogos de los mismos, y las secuencias de ácido nucleico que codifican las mismas, útiles en el diseño y la obtención de diversas proteínas de fusión (con inclusión de anticuerpos transformados por ingeniería genética) que se caracterizan por la especificidad de fijación de antígeno del anticuerpo donante.

Como un ejemplo, la presente invención proporciona, así pues, secuencias de cadena ligera variable y cadena pesada variable del anticuerpo murino 3B9 de IL-4 y secuencias derivadas de ellas. La región variable de la cadena pesada de 3B9 se caracteriza por los residuos de aminoácidos 2 a 140 de SEQ ID NO: 4. Las regiones CDR se indican por subrayado en Fig. 2 y se proporcionan en SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24; y SEQ ID NO: 26. La región variable del clon de la cadena ligera de 3B9 se caracteriza por los residuos de aminoácidos 21 a 132 de Fig. 1 [SEQ ID NO: 2]. Las regiones CDR corresponden a los residuos de aminoácidos 44-58 [SEQ ID NO: 16]; 74-80 [SEQ ID NO: 18]; y 113-121 [SEQ ID NO: 20].

Se proporcionan secuencias de región variable de cadena pesada quiméricas y secuencias de señal de nucleótidos y aminoácidos. Estas secuencias son idénticas a la cadena pesada de 3B9 con la excepción de la secuencia de señal. La secuencia de señal de la cadena pesada quimérica se proporciona en SEQ ID NOS: 5 y 6. Las regiones CDR están indicadas por subrayado en Fig. 3 y son idénticas en secuencia de aminoácidos a las CDRs nativas murinas [SEQ ID NOS: 21-26]. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera quimérica son idénticas a las secuencias 3B9 no modificadas (residuos de aminoácidos 21-132 de SEQ ID NO: 2), haciendo uso de las secuencias de señal naturales de ratón (residuos de aminoácidos 1-20 de SEQ ID NO: 2).

Una región variable de cadena pesada humanizada y secuencias de señal se ilustran en Fig. 4 [SEQ ID NO: 11 y 12]. La secuencia de señal se proporciona también en SEQ ID NO: 5 y 6. Otras secuencias de señal adecuadas, conocidas por los expertos en la técnica, pueden emplearse en sustitución de las secuencias de señal ilustradas en esta memoria. Las secuencias de aminoácidos CDR de esta construcción son idénticas a las CDRs de cadena pesada murina nativa y quiméricas y se proporcionan por SEQ ID NO: 22 (codificada por SEQ ID NO: 54), SEQ ID NO: 24 (codificada por SEQ ID NO: 55), y SEQ ID NO: 56 (que codifica SEQ ID NO: 26).

Una secuencia variable de cadena ligera humanizada (sintética) ilustrativa se representa en Fig. 5 [SEQ ID NOS: 13 y 14]. La secuencia de señal abarca los residuos de aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 8. Las secuencias CDR de esta figura se designan por subrayado y difieren de la CDR de la CDR murina nativa por un solo aminoácido de SEQ ID NO: 20. Así, las CDRs de la cadena ligera humanizada se proporcionan por SEQ ID NO: 53 y 16, SEQ ID NO: 17 y 18, y SEQ ID NO: 27 y 28. Esta diferencia se describe en detalle en el Ejemplo 3.

Las secuencias de ácido nucleido de esta invención, o fragmentos de las mismas, que codifican las secuencias peptídicas variables de cadena ligera y cadena pesada se utilizan en forma no modificada o se sintetizan para introducir modificaciones deseables, v.g., sitios de restricción. Las secuencias de ácido nucleico aisladas existentes naturalmente o, alternativamente, sintéticas, que se derivan de MAb 3B9 o de otros anticuerpos de IL-4 de título alto deseados pueden contener opcionalmente sitios de restricción para facilitar la inserción o ligación en una secuencia de ácido nucleico adecuada tal como codificación de una región de entramado de anticuerpo deseada, ligación con CDRs mutagenizadas o fusión con una secuencia de ácido nucleico codificante de una segunda pareja de fusión seleccionado.

Teniendo en cuenta la degeneración del código genético, pueden construirse diversas secuencias codificantes que codifican las secuencias de aminoácidos variables de cadena pesada y ligera, y secuencias CDR de la invención así como fragmentos funcionales y análogos de los mismos que comparten la especificidad de antígeno del anticuerpo donante. Las secuencias de ácido nucleico aisladas de esta invención, o fragmentos de las mismas, que codifican las secuencias peptídicas de cadena variable o CDRs pueden utilizarse para producir proteínas de fusión, anticuerpos quiméricos o humanizados, u otros anticuerpos transformados por ingeniería genética de esta invención cuando se combinan operativamente con una segunda pareja de fusión.

Estas secuencias son útiles también para introducción mutagénica de cambios específicos dentro de las secuencias de ácido nucleido codificantes de las CDRs o regiones de entramado, y para incorporación de la secuencia de ácido nucleico modificada o de fusión resultante en un plásmido para expresión. Por ejemplo, se utilizaron sustituciones silenciosas en la secuencia de nucleótidos de las regiones de entramado y codificantes de CDR para crear sitios de enzimas de restricción que facilitaban la inserción de regiones CDR mutagenizadas (y/o de entramado). Estas regiones CDR se utilizaron en la construcción de un anticuerpo humanizado de esta invención.

Debe indicarse que, además de las secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican porciones de la proteína de fusión y anticuerpos descritos en esta memoria, pueden emplearse otras secuencias de ácido nucleico de este tipo, tales como las complementarias para las secuencias nativas. Secuencias de DNA útiles incluyen aquellas secuencias que se hibridan en condiciones de hibridación severas [véase, T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389] a las secuencias de DNA. Un ejemplo de una condición de hibridación severa de este tipo es hibridación a 4XSSC a 65ºC, seguida por un lavado en 0,1XSSC a 65ºC durante una hora. Alternativamente, una condición de hibridación severa ilustrativa es en formamida al 50%, 4XSSC a 42ºC. Preferiblemente, estas secuencias de DNA hibridantes tienen una longitud de al menos aproximadamente 18 nucleótidos, es decir, aproximadamente el tamaño de una CDR.

V. Moléculas de Fusión y Proteínas de Fusión

Las moléculas de fusión pueden codificar proteínas de fusión que incluyen anticuerpos transformados por ingeniería genética tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Una molécula de fusión deseada contiene secuencias CDR que codifican péptidos que tienen la especificidad de antígeno de un anticuerpo de IL-4, preferiblemente un anticuerpo de afinidad alta tal como se proporciona por la presente invención, insertado en una primera pareja de fusión (una región variable de entramado humano o región variable de inmunoglobulina humana).

Preferiblemente, la primera pareja de fusión está enlazado operativamente a una segunda pareja de fusión. La segunda pareja de fusión se ha definido anteriormente, y puede incluir una secuencia codificante de una segunda región de anticuerpo de interés, por ejemplo una región Fc. Las segundas parejas de fusión pueden incluir también secuencias codificantes de otras inmunoglobulinas a las cuales se fusiona la región constante de la cadena ligera o pesada en marco o por medio de una secuencia enlazadora. Anticuerpos transformados por ingeniería genética dirigidos contra fragmentos funcionales o análogos de IL-4 pueden diseñarse para provocar fijación incrementada con el mismo anticuerpo.

La segunda pareja de fusión puede estar asociada también con agentes efectores como se han definido arriba, con inclusión de moléculas portadoras no proteínicas, a las cuales puede estar enlazado operativamente la segunda pareja de fusión por medios convencionales.

La fusión o unión entre las segundas parejas de fusión, v.g., secuencias de anticuerpos, y el agente efector puede hacerse por cualquier medio adecuado, v.g., por enlaces covalentes o iónicos convencionales, fusiones de proteínas, o reticuladores hetero-bifuncionales, v.g., carbodiimida, aldehído glutárico, y análogos. Dichos métodos se conocen en la técnica y están descritos fácilmente en los textos convencionales de química y bioquímica.

Adicionalmente, secuencias enlazadoras convencionales que proporcionan simplemente una cantidad deseada de espacio entre la segunda pareja de fusión y el agente efector pueden construirse también en la molécula de fusión. El diseño de tales enlazadores es bien conocido por los expertos en la técnica.

Adicionalmente, las secuencias de señal para las moléculas de la invención pueden modificarse para mejorar la expresión. Como un ejemplo de una proteína de fusión deseada que tiene una secuencia de aminoácidos de la secuencia de la cadena pesada murina, que es idéntica a la cadena pesada variable (V_{H}) quimérica de Fig. 2 [SEQ ID NO: 4], tenía el péptido de señal original reemplazado con otra secuencia de señal (residuos de aminoácidos 1-20) [SEQ ID NO: 6].

Una proteína de fusión ilustrativa contiene una secuencia de péptidos o proteínas de cadena pesada y/o ligera variable que tiene la especificidad del antígeno de MAb 3B9, v.g., las cadenas V_{H} [residuos de aminoácidos 21-141 de SEQ ID NO: 9 y 10] y V_{L} [residuos de aminoácidos 21-132 de SEQ ID NOS: 1 y 2]. Otra proteína de fusión deseable adicional de esta invención se caracteriza por la secuencia de aminoácidos que contiene al menos una, y preferiblemente la totalidad de las CDRs de la región variable de las cadenas pesada y/o ligera de la molécula del anticuerpo murino 3B9, derivándose las secuencias restantes de una fuente humana, o un fragmento funcional o análogo de la misma. Véanse, v.g., las regiones humanizadas V_{H} y V_{L} de SEQ ID NOS: 11 y 12 y SEQ ID NOS: 13 y 14 (Figs. 4 y 5).

En otra realización adicional, el anticuerpo transformado por ingeniería genética de la invención puede tener fijado al mismo un agente adicional. Por ejemplo, puede utilizarse el procedimiento de tecnología de DNA recombinante para producir un anticuerpo transformado por ingeniería genética de la invención en el cual el fragmento Fc o dominio CH3 de una molécula de anticuerpo completa ha sido reemplazado por una enzima u otra molécula detectable (es decir, un efector o molécula informadora polipeptídico(a)).

La segunda pareja de fusión puede estar enlazado también operativamente a un péptido, proteína o fragmento de la misma distinto de una inmunoglobulina, heterólogo para la secuencia que contiene CDR que tiene la especificidad de antígeno de 3B9 murino. La proteína resultante puede exhibir a la vez especificidad de antígeno anti-IL-4 y características de la molécula no inmunoglobulínica después de la expresión. Dicha característica de la pareja de fusión puede ser, v.g., una característica funcional tal como otro dominio de fijación o receptor, o una característica terapéutica si la pareja de fusión es en sí misma una proteína terapéutica, o características antigénicas adicionales.

Otra proteína deseable de esta invención puede comprender una molécula de anticuerpo completa, que tenga cadenas pesada y ligera de longitud total, o cualquier fragmento discreto de la misma, tal como los fragmentos Fab o F(ab')_{2}, un dímero de cadena pesada, o cualesquiera fragmentos recombinantes mínimos de los mismos tales como un F_{v} o un anticuerpo de cadena simple (SCA) o cualquier otra molécula que tenga la misma especificidad que el MAb donante seleccionado, v.g., MAb 3B9 o 6A1. Dicha proteína puede utilizarse en la forma de una proteína de fusión, o puede utilizarse en su forma no fusionada.

Siempre que la segunda pareja de fusión se deriva de otro anticuerpo, v.g., cualquier isotipo o clase de entramado o región constante de inmunoglobulina, resulta un anticuerpo transformado por ingeniería genética. Los anticuerpos transformados por ingeniería genética pueden comprender regiones constantes de inmunoglobulina (Ig) y regiones de entramado variables de una sola fuente, v.g., el anticuerpo aceptor, y una o más (preferiblemente todas) las CDRs del anticuerpo donante, v.g., el anticuerpo anti-IL-4 descrito en esta memoria. Adicionalmente, alteraciones, v.g. deleciones, sustituciones, o adiciones, de la región de entramado de dominio variable ligera y/o pesada del MAb aceptor en los niveles de ácido nucleico o aminoácidos, o las regiones CDR donantes pueden producirse a fin de retener especificidad de fijación de antígeno del anticuerpo donante.

Tales anticuerpos transformados por ingeniería genética están diseñados para emplear una (o ambas) de las cadenas variables pesada y/o ligera del MAb de IL-4 (modificadas opcionalmente como se ha descrito) o una o más de las CDRs de cadena pesada o ligera identificadas más adelante (véase el Ejemplo 3). Los anticuerpos transformados por ingeniería genética de la invención son neutralizantes, es decir, los mismos bloquean deseablemente la fijación al receptor de la proteína IL-4. Por ejemplo, el anticuerpo transformado por ingeniería genética derivado de MAb 3B9 está dirigido contra un epítope proteínico específico terciario de IL-4 humana que se cree se encuentra en la región bucle B-C \rightarrow hélice C, como se ha descrito arriba.

Tales anticuerpos transformados por ingeniería genética pueden incluir un anticuerpo humanizado que contiene las regiones de entramado de una inmunoglobulina humana o subtipo seleccionado, o un anticuerpo quimérico que contiene las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas fusionadas a los fragmentos funcionales del anticuerpo de IL-4. Un anticuerpo aceptor humano (o de otro animal) adecuado puede ser uno seleccionado de una base de datos convencional, v.g., la base de datos KABAT®, base de datos de Los Álamos, y base de datos Swiss Protein, por homología a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del anticuerpo donante. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología a las regiones de entramado del anticuerpo donante (sobre una base de aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de cadena pesada y/o una región de entramado variable de cadena pesada para inserción de las CDRs donantes. Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones de entramado constantes o variables de cadena ligera puede seleccionarse de manera similar. Debe indicarse que no es preciso que las regiones pesada y ligera del anticuerpo aceptor procedan del mismo anticuerpo aceptor.

Deseablemente, las regiones de entramado y constantes heterólogas se seleccionan de clases e isotipos de inmunoglobulina humana, tales como IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA e IgE. Sin embargo, no es necesario que el anticuerpo aceptor comprenda únicamente secuencias proteínicas de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, puede construirse un gen en el cual una secuencia de DNA que codifica parte de una cadena de inmunoglobulina humana está fusionada a una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos no inmunoglobulínica tal como una molécula efectora o informadora polipeptídica.

Un ejemplo de un anticuerpo humanizado particularmente deseable contiene CDRs de 3B9 insertadas en las regiones de entramado de una secuencia de anticuerpo humano seleccionada. Para la neutralización de anticuerpos humanizados se insertan una, dos o preferiblemente tres CDRs procedentes de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo de IL-4 en las regiones de entramado de la secuencia del anticuerpo humano seleccionada, reemplazando las CDR nativas del último anticuerpo.

Preferiblemente, en un anticuerpo humanizado, los dominios variables en ambas cadenas pesada y ligera se han transformado por ingeniería genética por una o más sustituciones de CDR. Es posible utilizar las seis CDRs, o diversas combinaciones de menos de las seis CDRs. Preferiblemente se reemplazan las seis CDRs. Es posible reemplazar las CDRs únicamente en la cadena pesada humana, utilizando como cadena ligera la cadena ligera sin modificar del anticuerpo aceptor humano. En otra alternativa, puede seleccionarse una cadena ligera compatible procedente de otro anticuerpo humano recurriendo a las bases de datos convencionales de anticuerpos. El resto del anticuerpo transformado por ingeniería genética puede derivarse de cualquier inmunoglobulina humana aceptora adecuada.

El anticuerpo humanizado transformado por ingeniería genética tiene, así pues, preferiblemente la estructura de un anticuerpo humano natural o un fragmento del mismo, y posee la combinación de propiedades requerida para uso terapéutico eficaz, v.g. tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por IL-4 en el hombre, o para usos diagnósticos.

Como otro ejemplo, un anticuerpo transformado por ingeniería genética puede contener tres CDRs de la región variable de la cadena ligera de 3B9 [SEQ ID NO: 16, 18, 20 y 28] y tres CDRs de la región variable de la cadena pesada de 3B9 [SEQ ID NO: 22, 24 y 26]. El anticuerpo humanizado resultante se caracteriza por la especificidad y afinidad alta de fijación de antígeno de MAb 3B9.

Se comprenderá por los expertos en la técnica que un anticuerpo transformado por ingeniería genética puede modificarse adicionalmente por cambios en aminoácidos de dominio variable sin afectar necesariamente a la especificidad y afinidad alta del anticuerpo donante (es decir, un análogo). Por ejemplo, se han construido anticuerpos monoclonales humanizados en los cuales el residuo del aminoácido de cadena ligera en la posición 120 era una arginina [SEQ ID NO: 13 y 14] o treonina [SEQ ID NOS: 57 y 58]. Se anticipa que los aminoácidos de las cadenas pesada y ligera pueden ser sustituidos por otros aminoácidos sea en los entramados de dominio variable o las CDRs, o en am-
bos.

Adicionalmente, la región constante puede alterarse para aumentar o disminuir las propiedades selectivas de las moléculas de la presente invención. Por ejemplo, dimerización, fijación a receptores Fc, o la capacidad para fijar y activar el complemento (véase, v.g., Angal et al., Mol. Immunol., 30: 105-108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem., 269: 3469-3474 (1994), Winter et al., documento EP 307.434-B).

Una proteína de fusión que es un anticuerpo quimérico difiere de los anticuerpos humanizados arriba descritos por proporcionar las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo donante no humano enteras, con inclusión de regiones de entramado, en asociación con regiones constantes de inmunoglobulina humana para ambas cadenas. Se anticipa que los anticuerpos quiméricos que retienen secuencia adicional no humana con relación a los anticuerpos humanizados de esta invención pueden provocar una respuesta inmune importante en humanos.

Dichos anticuerpos son útiles en la prevención y el tratamiento de trastornos alérgicos mediados por IL-4, como se expone más adelante.

VI. Producción de Proteínas de Fusión y Anticuerpos Transformados por Ingeniería Genética

Preferiblemente, las secuencias de cadena ligera y/o pesada variables y las CDRs de MAb 3B9 [SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24 y 26] u otros MAbs donantes adecuados (v.g., 6A1), y sus secuencias codificantes de ácido nucleico, se utilizan en la construcción de proteínas de fusión y anticuerpos transformados por ingeniería genética, preferiblemente anticuerpos humanizados, de esta invención, por el proceso siguiente. Pueden emplearse también la misma técnica o técnicas similares, para generar otras realizaciones de esta invención.

Un hibridoma productor de un MAb donante seleccionado, v.g., el anticuerpo murino 3B9, se somete convencionalmente a clonación, y el DNA de sus regiones variables de cadena pesada y ligera se obtiene por métodos conocidos por un experto en la técnica, v.g., los métodos descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Las regiones variables pesadas y ligeras de 3B9 que contienen al menos las CDRs y aquellas porciones de la región de entramado del dominio variable ligero y/o pesado del MAb aceptor requeridas a fin de retener la especificidad de fijación del MAb donante, así como las partes restantes derivadas de inmunoglobulina de la cadena de anticuerpo derivada de una inmunoglobulina humana se obtienen utilizando iniciadores polinucleotídicos y transcriptasa inversa. Las CDRs se identifican utilizando una base de datos conocida y por comparación con otros anticuerpos.

Un anticuerpo quimérico de ratón/humano puede prepararse y ensayarse luego en cuanto a capacidad de fijación. Dicho anticuerpo quimérico contiene las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo donante no humano enteras, en asociación con regiones constantes de Ig humana para ambas cadenas.

Las regiones de entramado homólogas de una región variable de cadena pesada procedente de un anticuerpo humano se identificaron utilizando bases de datos computerizadas, v.g., KABAT®, y se seleccionó un anticuerpo humano que tenía homología para 3B9 como el anticuerpo aceptor. Las secuencias de las regiones variables de cadena pesada sintéticas que contenían las CDRs de 3B9 dentro de los entramados del anticuerpo humano se diseñaron con reemplazamientos nucleotídicos opcionales en las regiones de entramado para incorporar sitios de restricción. Esta secuencia diseñada se sintetiza luego por solapamiento de oligonucleótidos, se amplifica por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y se corrige en caso de errores.

Se diseñó de manera similar una región de entramado variable de cadena ligera adecuada.

Un anticuerpo humanizado puede derivarse del anticuerpo quimérico, o preferiblemente, producirse sintéticamente por inserción adecuada de las CDRs del MAb procedentes de las cadenas pesada y ligera en el entramado de cadenas pesada y ligera seleccionado. Alternativamente, puede prepararse un anticuerpo humanizado de la invención utilizando técnicas de mutagénesis estándar. De este modo, el anticuerpo humanizado resultante contiene regiones de entramado humanas y CDRs del MAb donante. Puede existir manipulación subsiguiente de los residuos de entramado. El anticuerpo humanizado resultante puede expresarse en células hospedadoras recombinantes, v.g., células COS o CHO. Detalles adicionales de este procedimiento se proporcionan en el Ejemplo 4. Pueden prepararse otros anticuerpos humanizados utilizando esta técnica con otros anticuerpos no humanos específicos de IL-4, neutralizantes y de título alto adecuados.

Un vector de expresión convencional o plásmido recombinante se produce poniendo estas secuencias codificantes para la proteína de fusión en asociación operativa con secuencias de control reguladoras convencionales capaces de controlar la replicación y expresión en, y/o la secreción por, una célula hospedadora. Secuencias reguladoras incluyen secuencias promotoras, v.g., el promotor CMV, y secuencias de señal, las cuales pueden derivarse de otros anticuerpos conocidos. Análogamente, se produce un segundo vector de expresión que tenga una secuencia de DNA que codifica una cadena ligera o pesada de anticuerpo complementaria. Preferiblemente, este segundo vector de expresión es idéntico al primero, excepto en lo que respecta a las secuencias codificantes y marcadores seleccionables a fin de asegurar en la mayor medida posible que cada cadena polipeptídica se exprese funcionalmente.

Una célula hospedadora seleccionada se somete a co-transfección por técnicas convencionales a la vez con los vectores primero y segundo o se somete a transfección simplemente por un solo vector para crear la célula hospedadora transfectada de la invención que comprende a la vez las cadenas ligera y pesada recombinantes o sintéticas. La célula transfectada se cultiva luego por técnicas convencionales para producir el anticuerpo transformado por ingeniería genética de la invención. El anticuerpo humanizado que incluye la asociación a la vez de la cadena pesada y/o la cadena ligera recombinantes se clasifica a partir del cultivo por un ensayo apropiado, tal como ELISA o RIA. Pueden emplearse técnicas convencionales similares para construir otras proteínas y moléculas de fusión de esta
invención.

Vectores adecuados para los pasos de clonación y subclonación empleados en los métodos y la construcción de las composiciones de esta invención pueden ser seleccionados por una persona que posea experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse la serie convencional pUC de vectores de clonación. Un vector utilizado es pUC19, que está disponible comercialmente de empresas suministradoras, tales como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Adicionalmente, puede utilizarse para la clonación cualquier vector que sea capaz de replicarse fácilmente, posea abundancia de sitios de clonación y genes marcadores, y se manipule fácilmente,. Así pues, la selección del vector de clonación no es un factor limitante en esta invención.

Análogamente, los vectores empleados para expresión de los anticuerpos transformados por ingeniería genética de acuerdo con esta invención pueden ser seleccionados por una persona son experiencia en la técnica a partir de cualquier vector convencional. Los vectores contienen también secuencias reguladoras seleccionadas que se encuentran en asociación operativa con las secuencias codificantes de DNA de las regiones de inmunoglobulina y son capaces de dirigir la replicación y expresión de secuencias de DNA heterólogas en células hospedadoras seleccionadas, tales como promotores CMV. Estos vectores contienen las secuencias de DNA arriba descritas que codifican el anticuerpo transformado por ingeniería genética o la molécula de fusión. Alternativamente, los vectores pueden incorporar las secuencias de inmunoglobulina seleccionadas modificadas por la inserción de sitios de restricción deseables para manipulación fácil.

Los vectores de expresión pueden caracterizarse también por genes marcadores adecuados para amplificación de la expresión de las secuencias de DNA heterólogas, v.g., el gen de dihidrofolato-reductasa (DHFR) de mamífero o el gen de resistencia a la neomicina (Neo®). Otras secuencias vectoras preferibles incluyen una secuencia de señal poli A, tal como la de la hormona del crecimiento de los bovinos (BGH) y la secuencia promotora de betaglobina (betaglopro). Los vectores de expresión útiles en esta invención pueden ser sintetizados por métodos bien conocidos por las personas expertas en esta técnica.

Los componentes de tales vectores, v.g. replicones, genes de selección, intensificadores, promotores, secuencias de señal y análogos, pueden obtenerse de fuentes naturales o sintetizarse por procedimientos conocidos para uso en el direccionamiento de la expresión y/o secreción del producto del DNA recombinante en un hospedador seleccionado. Otros vectores de expresión apropiados de los cuales se conocen en la técnica numerosos tipos para expresión en mamífero, bacterias, insectos, levaduras, y hongos pueden seleccionarse también para este propósito.

La presente invención abarca también una línea de células transfectada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias codificantes de los anticuerpos transformados por ingeniería genética o moléculas de fusión de los mismos. Células hospedadoras útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores de clonación son también convencionales. Sin embargo, de modo muy deseable, se utilizan células procedentes de diversas cepas de E. coli para replicación de los vectores de clonación y otros pasos en la construcción de las proteínas de fusión de esta invención.

Células o líneas de células hospedadoras adecuadas para la expresión del anticuerpo transformado por ingeniería genética o proteína de fusión de la invención son preferiblemente una célula eucariota tal como CHO, COS, una célula fibroblástica (v.g. 3T3), y células mieloides entre otras, y muy preferiblemente una célula de mamífero, tal como una célula CHO o una célula mieloide. Pueden utilizarse células humanas, permitiendo así que la molécula se modifique con patrones de glicosilación humanos. Alternativamente, pueden emplearse otras líneas de células eucariotas. La selección de células hospedadoras de mamífero y los métodos para transformación, cultivo, amplificación, clasificación y producción y purificación de los productos se conocen en la técnica. Véase, v.g., Sambrook et al., citado anteriormente.

Las células bacterianas pueden demostrar utilidad como células hospedadoras adecuadas para la expresión de los MAbs recombinantes de la presente invención. Sin embargo, debido a la tendencia de las proteínas expresadas en células bacterianas a encontrarse en una forma no plegada o plegada inadecuadamente o en una forma no glicosilada, cualquier MAb recombinante producido en una célula bacteriana tendría que ser clasificado con respecto a la retención de la capacidad de fijación de antígeno. Si la molécula expresada por la célula bacteriana se produjera en una forma plegada adecuadamente, dicha célula bacteriana sería un hospedador deseable. Por ejemplo, diversas cepas de E. coli utilizadas para expresión son bien conocidas como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. Diversas cepas de B. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y análogas pueden emplearse también en este método.

En caso deseado, cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica están disponibles también como células hospedadoras, así como células de insecto, v.g. Drosophila y Lepidoptera y sistemas de expresión víricos. Véase, v.g. Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986) y las referencias citadas en dicho lugar.

Los métodos generales por los cuales pueden construirse los vectores de la invención, los métodos de transfección requeridos para producir las células hospedadoras de la invención, y los métodos de cultivo necesarios para producir la proteína de fusión o el anticuerpo transformado por ingeniería genética de la invención a partir de dicha célula hospedadora, son todos ellos técnicas convencionales. Análogamente, una vez producidas, las proteínas de fusión o los anticuerpos transformados por ingeniería genética de la invención pueden purificarse a partir de los contenidos del cultivo celular de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, con inclusión de precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel, etcétera. Dichos métodos se encuentran dentro de la experiencia en la técnica y no limitan esta invención.

Otro método de expresión adicional de los anticuerpos humanizados puede utilizar la expresión en un animal transgénico, tal como se describe en la Patente U.S. No. 4.873.316. Este documento se refiere a un sistema de expresión que utiliza el promotor de caseína del animal que, una vez incorporado transgénicamente en un mamífero, permite que la hembra produzca la proteína recombinante deseada en su leche.

Una vez expresado por el método deseado, el anticuerpo transformado por ingeniería genética se examina luego con respecto a actividad in vitro mediante el uso de un ensayo apropiado. Actualmente se emplean formatos de ensayo ELISA convencionales para evaluar la fijación cualitativa y cuantitativa del anticuerpo transformado por ingeniería genética a un epítope de IL-4. Adicionalmente, otros ensayos in vitro, v.g. BIAcore [Pharmacia], pueden utilizarse también para comprobar la eficacia neutralizante antes de la realización de estudios clínicos subsiguientes en humanos para evaluar la persistencia del anticuerpo transformado por ingeniería genética en el cuerpo a pesar de los mecanismos de aclaramiento habituales.

Después de los procedimientos descritos para anticuerpos humanizados preparados a partir de 3B9, una persona con experiencia en la técnica puede construir también anticuerpos humanizados a partir de otros anticuerpos de IL-4 donantes, secuencias de región variable y péptidos CDR descritos en esta memoria. Los anticuerpos transformados por ingeniería genética pueden producirse con entramados de región variable reconocidos potencialmente como "propios" por los receptores del anticuerpo transformado por ingeniería genética. Pueden hacerse modificaciones menores en los entramados de región variable para conseguir grandes aumentos en la fijación de antígeno sin inmunogenicidad incrementada apreciable para el receptor. Tales anticuerpos transformados por ingeniería genética pueden tratar eficazmente un humano respecto a afecciones mediadas por IL-4. Dichos anticuerpos pueden ser útiles también en el diagnóstico de tales afecciones.

VII. Usos Terapéuticos/Profilácticos

Esta invención se refiere también a un método de tratamiento de humanos que padecen un trastorno alérgico, que comprende administrar una dosis eficaz de anticuerpos que incluyen uno o más de los anticuerpos transformados por ingeniería genética o proteínas de fusión descritos en esta memoria, o fragmentos de los mismos.

La respuesta terapéutica inducida por el uso de las moléculas de esta invención se produce por la fijación a IL-4 humana y, por tanto, el bloqueo subsiguiente de la liberación de IgE. Así pues, las moléculas de la presente invención, cuando se encuentran en preparaciones y formulaciones apropiadas para uso terapéutico, son sumamente deseables para aquellas personas que sufren una respuesta alérgica, tal como rinitis alérgica, conjuntivitis, dermatitis atópica, asma atópico, y choque anafiláctico.

Las proteínas de fusión, anticuerpos, anticuerpos transformados por ingeniería genética o fragmentos de los mismos de esta invención pueden utilizarse también en asociación con otros anticuerpos, particularmente MAbs humanos reactivos con otros marcadores (epítopes) responsables de la afección contra la cual está dirigido el anticuerpo transformado por ingeniería genética de la invención. Análogamente, pueden emplearse también en composiciones veterinarias MAbs reactivos con epítopes responsables de la afección en un animal seleccionado contra el cual está dirigido el anticuerpo de la invención.

Se cree que los agentes terapéuticos de esta invención son deseables para tratamiento de afecciones alérgicas durante un periodo comprendido entre aproximadamente 2 días y aproximadamente 3 semanas, o durante el tiempo que sea necesario. Por ejemplo, pueden ser deseables tratamientos más largos cuando se trata de rinitis estacional o afecciones análogas. Esto representa un avance considerable en comparación con el protocolo de infusión utilizado actualmente con los tratamientos de la técnica anterior de los trastornos mediados por IL-4. La dosis y duración del tratamiento está relacionada con la duración relativa de las moléculas de la presente invención en la circulación humana, y puede ser ajustada por una persona con experiencia en la técnica dependiendo de la afección de que se trate y el estado general de salud del paciente.

El modo de administración del agente terapéutico de la invención puede ser cualquier ruta adecuada que suministre el agente al hospedador. Las proteínas de fusión, anticuerpos, anticuerpos transformados por ingeniería genética, y fragmentos de los mismos, así como las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para administración parenteral, es decir, subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intranasal.

Los agentes terapéuticos de la invención pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo transformado por ingeniería genética (v.g., humanizado) de la invención como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En el agente profiláctico de la invención, se prefiere una suspensión o solución acuosa que contenga el anticuerpo transformado por ingeniería genética, preferiblemente tamponado al pH fisiológico, en una forma lista para inyección. Las composiciones para administración parenteral comprenderán comúnmente una solución del anticuerpo transformado por ingeniería genética de la invención o un cóctel de los mismos disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Puede emplearse una diversidad de vehículos acuosos, v.g., solución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, y análogos. Estas soluciones son estériles y están generalmente exentas de materia particulada. Dichas soluciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas (v.g., filtración). Las composiciones pueden contener sustancias adyuvantes farmacéuticamente aceptables en caso requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajuste del pH y agentes de tamponamiento, etc. La concentración del anticuerpo de la invención en dicha formulación farmacéutica pueden variar ampliamente, a saber, desde menos de aproximadamente 0,5%, usualmente a o al menos aproximadamente 1% hasta valores tan elevados como 15 o 20% en peso, y se seleccionará fundamentalmente sobre la base de los volúmenes líquidos, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.

Así, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular podría prepararse de modo que contuviera 1 ml de agua estéril tamponada, y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg, v.g. aproximadamente 50 ng hasta aproximadamente 30 mg o, de modo más preferible, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de un anticuerpo transformado por ingeniería genética de la invención. Análogamente, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa podría prepararse de modo que contuviera aproximadamente 250 ml de solución estéril de Ringer, y aproximadamente 1 a aproximadamente 30, y preferiblemente 5 mg a aproximadamente 25 mg de un anticuerpo transformado por ingeniería genética de la invención. Los métodos actuales para la preparación de composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidos o serán evidentes para los expertos en la técnica y se describen con mayor detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, edición 15ª, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Se prefiere que el agente terapéutico de la invención, cuando se encuentra en una preparación farmacéutica, esté presente en formas de dosis unitaria. La dosis terapéuticamente eficaz apropiada puede ser determinada fácilmente por los expertos en la técnica. Para tratar eficazmente un trastorno inflamatorio en un humano u otro animal, debería administrarse por vía parenteral una dosis de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg por peso corporal de 70 kg de una proteína o un anticuerpo de esta invención, con preferencia i.m. (intramuscular). Dicha dosis puede repetirse, en caso necesario, a intervalos de tiempo apropiados seleccionados como adecuados por un médico durante la respuesta inflamatoria.

Esta memoria describe también la administración de las proteínas de fusión de IL-4 de esta invención simultánea o secuencialmente con otros anticuerpos o proteínas de fusión caracterizados por actividad anti-IL-4, tales como la actividad anti-factor de necrosis tumoral u otras actividades farmacéuticas compatibles con la capacidad de fijación del receptor de IL-4 de las proteínas de fusión de esta invención. Dichos otros anticuerpos están disponibles comercialmente o pueden ser diseñados de manera similar a la descrita en esta memoria.

Las proteínas de fusión y los anticuerpos transformados por ingeniería genética de esta invención pueden utilizarse también en regímenes de diagnóstico, tales como para la determinación de trastornos mediados por IL-4 o el seguimiento del progreso de tratamiento de dichos trastornos. Como reactivos de diagnóstico, estas proteínas de fusión pueden marcarse convencionalmente para uso en formatos de ensayo ELISA y otros formatos de ensayo convencionales para la medida de los niveles de IL-4 en suero, plasma u otro tejido apropiado. La naturaleza del ensayo en el que se utilizan las proteínas de fusión son convencionales y no limitan esta descripción.

Los anticuerpos, anticuerpos transformados por ingeniería genética o fragmentos de los mismos descritos en esta memoria pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de su utilización. Esta técnica ha resultado eficaz con inmunoglobulinas convencionales, y pueden emplearse métodos de liofilización y reconstitución conocidos en la técnica..

Los ejemplos siguientes ilustran diversos aspectos de esta invención que incluyen la construcción de anticuerpos ilustrativos transformados por ingeniería genética y la expresión de los mismos en vectores y células hospedadoras adecuados, y no deben interpretarse como limitantes del alcance de esta invención. Todos los aminoácidos se identifican por sus códigos convencionales de tres letras o de una sola letra. Todas las enzimas de restricción, plásmidos, y otros reactivos y materiales necesarios se obtuvieron de fuentes comerciales a no ser que se indique otra cosa. Toda la metodología de clonación, ligación y otra metodología de DNA recombinante general fueron como se expone en T. Maniatis, et al., arriba citado, o en la segunda edición de dicha obra (1989), compiladores Sambrook et al., por el mismo editor ("Sambrook et al.").

Ejemplo 1 Producción de MAb 3B9 A. Procedimiento de inmunización

Cuatro ratones (híbridos F1 de Balb/c y C57BL/6) se inmunizaron subcutáneamente con 50 \mug de IL-4 humana recombinante E. coli en adyuvante completo de Freunds y cuatro semanas más tarde se reforzaron intraperitonealmente (i.p.) con 50 \mug de IL-4 en adyuvante incompleto de Freunds. Sobre la base de un título satisfactorio de anticuerpos en suero para IL-4, un solo ratón recibió inmunizaciones ulteriores de 200 \mug de IL-4 (i.p. en solución salina) a las 8 semanas, dos días después con 100 \mug de IL-4 (i.p. en solución salina) y dos días más tarde con 50 \mug de IL-4 (i.p. en solución salina). Dos días después de la inmunización final se realizó una esplenectomía.

B. Procedimiento de Fusión y Sistema de Clasificación

Se utilizaron células de bazo de ratón para preparar hibridomas (por procedimientos estándar, v.g. como ha sido descrito por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)) a partir de los cuales se clasificaron más de 250 clones de células para secreción de anticuerpo para IL-4, utilizando el sistema BIAcore disponible comercialmente, y ensayos ELISA como se describe más adelante, para la fijación de IL-4. Cinco pocillos dieron una respuesta positiva. Solamente 1 clon de ratones, 3B9, era fuertemente positivo. Todos los clones secundarios derivados de 3B9 eran positivos.

Ejemplo 2 Ensayos ELISA y Constantes de Afinidad A. ELISA

El ensayo de clasificación, realizado como sigue, se diseñó para medir la afinidad para IL-4 humana nativa. Para el experimento 1, placas de 96 pocillos activadas con aldehído se recubrieron con IL-4 a 1 \mug/ml, 100 \mul/pocillo en tampón de borato 0,1M, pH 8,5, y se incubaron durante una noche a TA. La hIL-4 se fijaba covalentemente a la placa. La solución de IL-4 se aspiró y se bloquearon los sitios de fijación inespecífica (NSB) con seroalbúmina bovina (BSA) al 1% en tampón TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM, NaN_{3} al 0,02%, pH 7,4) durante 60 minutos a 37ºC. Después de éste y cada uno de los pasos siguientes, la placa se lavó cuatro veces en tampón de lavado (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05%, NaN_{3} al 0,02%, pH 7,4). Después de esto, se añadieron 50 \mul de medio de hibridoma (o 3B9 o fragmentos Fab purificados) y 50 \mul de tampón de ensayo (gamma-globulina bovina al 0,5% en tampón TBS) y las placas se incubaron durante 60 minutos a 37ºC. Se añadieron 100 \mul de anticuerpo biotinilado anti-ratón por pocillo en tampón de ensayo y se incubó como anteriormente. Se añadieron 100 \mul de estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina por pocillo y se incubó (30 minutos a 37ºC). Se añadieron 100 \mul/pocillo de sustrato PNP y se incubó 30 minutos a 37ºC. Se tomaron las lecturas a una densidad óptica de 405 nm.

Para el experimento 2, se incubaron placas recubiertas con estreptavidina (100 \mul/pocillo, 1 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) durante una noche a 4ºC y se ensayaron como sigue. Se aspiró la solución de estreptavidina, se bloquearon los sitios NSB con BSA al 1% en tampón TBS (60 minutos a 37ºC). Después de este paso, y de cada uno de los pasos que siguen, se lavaron las placas 4 veces en tampón de lavado. Se añadieron 50 \mul de IL-4 biotinilada con 50 \mul de tampón de ensayo y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Después de esto, se añadieron 50 \mul de 3B9 IgG o fragmento Fab purificados (o medio de hibridoma) más 50 \mul de tampón de ensayo, y se incubó 60 minutos a 37ºC. Se añadieron 100 \mul de conjugado IgG anti-ratón-fosfatasa alcalina y se incubó durante 60 minutos a 37ºC. Se añadieron 100 \mul de sustrato PNP y se incubó 30 minutos a 37ºC. Se tomaron las lecturas como anteriormente.

B. Cálculo de la Afinidad de 3B9 para IL-4

Utilizando los resultados de los experimentos arriba descritos, y resumidos como sigue, se calculó el valor K_{d} para 3B9 como se describe en Beatty et al., J. Immunol. Methods, 100: 173-179 (1987):

K_{af} = \frac{1}{2(2[Ab*]-[Ab])}

Ab* = concentración de Ab fijado a 150 ng/ml de hIL-4 biotinilada

Ab = concentración de Ab fijado a 300 ng/ml de hIL-4 biotinilada

Las constantes de disociación, K_{d} se calcularon a partir de la relación:

K_{d} = \frac{1}{K_{af}}

\newpage

Experimento 1: Ensayo ELISA en una placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina (100 ng/pocillo). K_{d} = 2,2 x 10^{-10} M (Fab de 3B9)

Experimento 2: Ensayo ELISA en una placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina (100 ng/pocillo). K_{d} = 1,4 x 10^{-10} M (IgG de 3B9)

C/C. Especificidad

MAb 3B9 reconoce la IL-4 humana, pero no reconoce la IL-4 bovina o murina. Una forma de determinar esto es como sigue. Puede realizarse un ELISA utilizando una placa de 96 pocillos recubierta con IgG anti-ratón, y bloqueada subsiguientemente con seroalbúmina bovina, después de lo cual se incubaron 50 \mul de 3B9 (100 ng/ml), 25 \mul de IL-4 no humana, y 25 \mul de biotina-IL-4 durante 60 minutos a 37ºC, seguido por un lavado, fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina y PNP.

Análogamente, se encontró que MAb 6A1 no reconocía IL-4 bovina o murina.

Ejemplo 3 Anticuerpo Humanizado

Se diseñó un anticuerpo humanizado que contiene CDRs murinas dentro de un entramado de anticuerpo humano. Esta versión humanizada del anticuerpo 3B9 de ratón específico de IL-4 se preparó realizando las manipulaciones siguientes.

A. Clonación de cDNA

Se prepararon clones de cDNA de las cadenas pesada y ligera de 3B9 a partir de mRNA extraído de la línea de células de hibridoma 3B9 [Ejemplo 1] utilizando un kit de Boehringer-Mannheim. Se utilizaron iniciadores específicos para la región bisagra de ratón o la región constante kappa para la síntesis de la primera cadena.

El iniciador de la cadena kappa es [SEQ ID NO: 29]:

5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3'

El iniciador de la cadena pesada gamma es [SEQ ID NO: 30]:

5'GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC3'.

El cDNA bicatenario se clonó directamente en plásmidos pGEM7f+[Promega] que se transformaron luego en E. coli DH5-\alpha [Bethesda Research Labs].

B. Secuenciación del DNA

Se secuenciaron 8 clones de cDNA murino de cadena pesada y un clon de cadena ligera procedentes de la Parte A anterior. Los resultados de la secuenciación de las regiones variables de estos clones se muestran en SEQ ID NO: 1 y 2 y 3 y 4. Cada clon contenía aminoácidos que se sabe están conservados entre las regiones variables de cadena pesada o las regiones variables de cadena ligera de ratón, y secuencias de señal de murino. Las secuencias de aminoácidos de las CDR se enumeran a continuación.

Las regiones CDR para la cadena pesada son SEQ ID NO: 22, 24 y 26 (aminoácidos 50-76, 71-86 y 119-129 de SEQ ID NO: 4). Véase Fig. 2. Estas secuencias están codificadas por SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y p 25, respectivamente. Las regiones CDR para la cadena ligera son SEQ ID NO: 16, 18 y 20 (aminoácidos 45-58, 74-80, y 113-121 de SEQ ID NO: 2). Véase Fig. 1. Estas secuencias están codificadas por SEQ ID NO: 15, 17, y 19, respectivamente.

C. Selección de Entramados Humanos

A continuación de la clonación de 3B9, las secuencias de aminoácidos de la región variable (aminoácidos 21-132 de SEQ ID NO: 2 y aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 4) se compararon con la base de datos de secuencias de inmunoglobulina humanas utilizando las bases de datos KABAT® y SWISS a fin de identificar un entramado humano para ambas cadenas pesada y ligera que coincidiera más estrechamente con el parental murino en homología de secuencia. Además de estas búsquedas para homología de secuencia, las cadenas pesada y ligera se evaluaron también contra una base de datos posicional generada a partir de modelos estructurales del dominio Fab para valorar conflictos potenciales debidos a sustituciones de aminoácidos que pudieran influir en la presentación de las CDR. Para el caso presente, no se detectó conflicto evidente alguno en la búsqueda estructural; por ello, se utilizó el DNA codificante deducido de las búsquedas de homología de secuencia de aminoácidos.

Se utilizó la región de entramado de la cadena pesada de un anticuerpo obtenido a partir de una inmunoglobulina de mieloma humano (COR) [E.M. Press y N.M. Hogg, Biochem J., 117: 641-660 (1970)]. Se encontró que esta secuencia era homóloga aproximadamente en un 77% (identidad de 69,4%) a la región de la cadena variable de 3B9 al nivel de aminoácidos.

Para una región de entramado variable de cadena ligera adecuada, se utilizó la secuencia de entramado variable de la cadena ligera del anticuerpo humano identificado en H.G. Klobeck et al., Nucl. Acids Res., 13: 6515-6529 (1985). Se encontró que la secuencia del anticuerpo humano era homóloga aproximadamente en un 80,2% (identidad 72,0%) a la región variable de cadena ligera de 3B9 murino al nivel de aminoácidos).

Dadas las CDRs de 3B9 murino [SEQ ID NO: 15-26] y la secuencia del anticuerpo humano, se construyó una cadena pesada sintética y se realizó una PCR para completar y amplificar el DNA. Estas secuencias se sintetizaron por los oligonucleótidos solapantes siguientes y se amplificaron por PCR. SEQ ID NO: 31-37 proporciona 5 oligómeros solapantes y 2 iniciadores PCR. Se encuentra que el oligómero 1 [SEQ ID NO: 31] abarca las bases 5-121. Se encuentra que el oligómero 2 [SEQ ID NO: 32] abarca las bases 122-241, y se encuentra que el oligómero 3 [SEQ ID NO: 33] abarca las bases 242-361. Los dos iniciadores de la cadena del fondo SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 abarcan las bases 134-110 y las bases 253-230. Se corrigieron cualesquiera errores en la secuencia mapeada que se insertaron por PCR. Se realizó de nuevo una PCR utilizando como los nucleótidos 1-25 del iniciador 5' SEQ ID NO: 36 y como los nucleótidos 361-341 del iniciadores 3' SEQ ID NO: 37.

La región variable sintética se ligó al vector de expresión pCD junto con la secuencia de señal sintética SEQ ID NO: 5 y 6 a partir de la construcción de la cadena pesada quimérica junto con una región constante humana de IgG_{1}. Las secuencias sintéticas de nucleótidos y aminoácidos de V_{H} y la secuencia de señal se proporcionan en Fig. 4 [SEQ ID NOS: 11 y 12]. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs [SEQ ID NOS: 22, 24 y 26] son idénticas a las CDRs murinas de 3B9. Sin embargo, las secuencias codificantes para estas CDRs [SEQ ID NOS: 54, 55 y 56] difieren de las secuencias codificantes de 3B9 murino [SEQ ID NOS: 21, 23 y 25]. El vector de expresión resultante, IL4hzhc1-1-Pcd se muestra en Fig. 9.

Las regiones del gen CDR de un entramado pre-existente de cadena ligera se eliminaron por restricción de digestión y se reemplazaron con los genes de CDR de IL-4 sintéticos siguientes, que se produjeron por síntesis.

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Las secuencias sintéticas de nucleótidos y aminoácidos de V_{L} y la secuencia de señal se proporcionan en Fig. 5 [SEQ ID NOS: 13 y 14]. Las secuencias de aminoácidos de las dos primeras CDRs [SEQ ID NOS: 16 y 18] son idénticas a las CDRs correspondientes de 3B9 murino. Sin embargo, la secuencia codificante para la primera CDR [SEQ ID NO: 53] difiere de la secuencia codificante de 3B9 murino [SEQ ID NO: 15]. Adicionalmente, en la última CDR, se construyeron dos construcciones humanizadas de la secuencia de aminoácidos de 3B9. Una, [SEQ ID NO: 28], difiere por un solo aminoácido [SEQ ID NO: 20] de la secuencia nativa de murino3B9. SEQ ID NO: 28 es codificada por SEQ ID NO: 27. Las regiones ligeras variables sintéticas se ligaron al vector de expresión junto con la secuencia de señal [SEQ ID NOS: 7 y 8]. Uno de los vectores de expresión resultantes, IL4hzlc1-O-Pcn se ilustra en Fig. 10.

Estas secuencias variables sintéticas de cadena ligera y/o pesada se emplean en la construcción de un anticuerpo humanizado.

Ejemplo 4 Expresión del MAb Humanizado en Células COS y CHO

Se prepararon subclones de pUC18 para la V_{H} a fin de añadir una secuencia de señal obtenida originalmente a partir de un anticuerpo humano SEQ ID NO: 5. Para la V_{L}, se prepararon subclones de pUC18 a fin de añadir una secuencia de señal SEQ ID NO: 7.

La cadena pesada humanizada, derivada de una IgG_{1} isotipo, exhibe 89,3% de homología (84,3% de identidad) al nivel de aminoácidos con la cadena pesada murina de 3B9. Esta V_{H} sintética se proporciona en los aminoácidos 20-141 de SEQ ID NOS: 11 y 12.

La cadena ligera humanizada, una cadena kappa humana, exhibe 92,0% de homología (86,6% de identidad) con 3B9 al nivel de aminoácidos. Esta V_{L} sintética [aminoácidos 21 a 31 de SEQ ID NOS: 13 y 14] que contiene las CDRs de 3B9 se diseñó y sintetizó como se ha descrito arriba para las cadenas pesadas sintéticas.

Los fragmentos de DNA que contenían su señal respectiva enlazada a las regiones variables pesadas o ligeras humanizadas se insertaron en plásmidos de expresión en células de mamífero basados en pUC19 que contenían promotores CMV y las regiones constantes de cadena pesada humana o cadena ligera humana de la quimera producida en el Ejemplo 5 siguiente, por métodos convencionales [Maniatis et al., citado anteriormente] para proporcionar los plásmidos IL4hzhc1-1Pcd (cadena pesada) [Figura 9] e IL4hzlc1-o-Pcn (cadena ligera) [Figura 10]. Los plásmidos HZHC y HZLC se someten a co-transfección en células COS y los sobrenadantes se ensayan por el método ELISA descrito inmediatamente arriba en cuanto a la presencia de anticuerpo humanizado después de 3 y 5 días. Se construyó otro anticuerpo humanizado pero con un isotipo IgG4.

El ejemplo anterior describe la preparación de un anticuerpo ilustrativo transformado por ingeniería genética. Pueden seguirse procedimientos similares para el desarrollo de otros anticuerpos transformados por ingeniería genética, utilizando otros anticuerpos anti-IL-4 (v.g., 6A1 - Ejemplo 7) desarrollados por medios convencionales.

Ejemplo 5 Construcción de un Anticuerpo Quimérico

A. Se construyó una cadena pesada quimérica por aislamiento de la región variable de la cadena pesada murina a partir del MAb 3B9 original de ratón como un fragmento de restricción EcoRI-BstEII. Se diseñó y sintetizó un oligómero pequeño de DNA para enlazar la región variable de ratón con la región constante de IgG1 humana (BstEII - ApaI):

iniciador 5': SEQ ID NO: 50: GTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACC-AAGGGGC

Iniciador 3': SEQ ID NO: 51: CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACG

Estos dos fragmentos se ligaron al plásmido pCD (véase Fig. 7) (digerido con EcoRI y ApaI) que codifica ya la región constante de IgG1 humana. Este clon no se expresaba; por esta razón, se delecionaron la 5'UTR de tipo salvaje y la secuencia de señal y se reemplazaron con SEQ ID NO: 5 y 6.

Debido a que no estaba disponible un sitio conveniente de endonucleasa de restricción en el extremo 3' de la secuencia de señal, se introdujo un sitio BstEII (es decir, una mutación silenciosa) por PCR. Se utilizaron los iniciadores PCR siguientes:

SEQ ID NO: 48: Iniciador 5': 5'CAGGTTACCCTGAAAGAGTC 3'

SEQ ID NO: 49: Iniciador 3': 5'GAAGTAGTCCTTGACCAG 3'

\newpage

Se aisló luego un fragmento de restricción BstEII - PstI a partir de este plásmido. Se diseñaron y sintetizaron luego una nueva secuencia de señal y 5'UTR que tenían extremos EcoRI y BstEII.

SEQ ID NO: 46: Iniciador 5': AATTCGAGGACGCCAGCAACATGGTGTTCAGACCCAGGTCTTCATTTCTC
TGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGCAG

SEQ ID NO: 47: Iniciador 3': GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGAGCAACAGAGAAATGAAGA
CCTGGGTCTGCAACACCATGTTGCTGGCGTCCTCG

La cadena ligera quimérica se construyó por aplicación de la técnica PCR a la cadena ligera original de 3B9 murino que se clonó en pGEM72f(+) [Promega]. Los iniciadores utilizados eran el iniciador inverso universal pUC18 disponible comercialmente en el extremo 5' (EcoRI) y un iniciador 3' que introduce un sitio NarI [5'CATCTAGATGGCG-CCGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3' SEQ ID NO: 52], utilizado para fusionar la región variable de ratón con la región constante humana. Esta región variable se ligó luego al vector de expresión pCDN (EcoRI NarI) (Fig. 8) que contiene ya la región kappa humana.

Se recogieron los sobrenadantes del medio 3 y 5 días después y se ensayaron por el método ELISA descrito como sigue: se recubrieron placas ELISA con 0,1 \mug de un anticuerpo de cabra específico para la región Fc de los anticuerpos humanos. Se añadieron durante 1 hora los sobrenadantes del medio. Se añadió un anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante, específico para un anticuerpo IgG humano entero. Esto fue seguido por adición de sustrato de peroxidasa ABTS (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) durante 1 hora. Se detectó la expresión del anticuerpo quimérico. En un segundo ensayo ELISA, los sobrenadantes de células COS que contenían el anticuerpo quimérico se fijaban específicamente a la proteína IL-4 humana recombinante. Este resultado confirmó que se habían clonado genes codificantes de un anticuerpo específico para IL-4.

B. Puede obtenerse también una cadena pesada humanizada a partir de esta cadena pesada quimérica. Se diseñó a partir de ella la cadena pesada humanizada por inserción de las CDRs murinas en un entramado humano. El entramado humano seleccionado era, como se ha descrito arriba, la secuencia de proteína más homóloga en la base de datos de proteínas SWISS a la V_{H} de 3B9 murina (aminoácidos 20-140 de SEQ ID NO: 4). Esta secuencia de cadena pesada humanizada (EcoRI ApaI) se preparó por síntesis y se realizó una PCR para completar y amplificar el DNA como se ha descrito arriba. Esta región variable sintética se ligó al vector de expresión pCD (EcoRI ApaI) junto con la secuencia de señal sintética SEQ ID NOS: 5 y 6 a partir de la construcción de la cadena pesada quimérica y una región constante humana de IgG_{1}.

Análogamente, puede derivarse una cadena ligera humanizada de la cadena ligera quimérica como se ha descrito para la cadena pesada. Este gen (EcoRV NarI) se preparó también sintéticamente. La V_{L} humanizada se ligó al vector de expresión pCN, digerido con EcoRI NarI, junto con una secuencia de señal (EcoRI EcoRV). El vector de expresión proporcionó la región constante kappa humana.

Ejemplo 6 Purificación y Termodinámica - MAb Humanizado

La purificación de 3B9 quimérico y humanizado expresado en CHO puede realizarse por cromatografía de afinidad convencional con proteína A (o G) seguida por cromatografía de intercambio iónico y cromatografía con tamices moleculares. Procesos similares han sido empleados con éxito para la purificación hasta pureza mayor que 95% de otros MAbs (v.g., para los antígenos del virus sincitial respiratorio y los antígenos de circumsporozoítos de la malaria).

Las termodinámicas de afinidad y de detalle de la fijación de IL-4 a MAb 3B9 humanizado y 3B9 murino (Ejemplo 1) se determinaron por microcalorimetría de titulación. Este método mide las reacciones de fijación en virtud de sus calores de reacción intrínsecos (véase, v.g., Wiseman et al., Anal. Biochem. 179: 131-137 (1989). Se encontró que la afinidad de ambos MAbs era demasiado fuerte para medirla directamente a la temperatura ambiente. Por ello, se adoptó un enfoque termodinámico: i) se midió la afinidad a 60ºC, en cuyas condiciones la misma es lo suficientemente débil para ser medida directamente; y ii) se midió la dependencia de la entalpía de fijación con respecto a la temperatura entre 30 y 60ºC. En conjunto, estos datos permiten el cálculo de la afinidad en un intervalo amplio de temperaturas utilizando la ecuación de Gibbs-Helmholz.

Un resumen de la termodinámica de fijación de IL-4 de los anticuerpos 3B9 humanizado y de ratón se presenta en la Tabla 1. Sobre la base de los cambios en energía libre, entalpía, entropía y capacidad calorífica de los dos MAbs, las termodinámicas de fijación son indistinguibles.

TABLA 1

4

Las afinidades para IL-4 de 3B9 humanizado y 3B9 murino se midieron por cuadruplicado y duplicado, respectivamente.

Ejemplo 7 Producción y Caracterización de MAb de Rata

El MAb 6A1, seleccionado por su fijación de alta afinidad, se obtuvo a partir de una rata inmunizada, utilizando el mismo protocolo de inmunización que se ha descrito para el ratón en el Ejemplo 1. Se seleccionó 6A1 a partir de hibridomas (específicamente, el hibridoma 3426A11C1B9) preparados a partir de ratas inmunizadas con IL-4 humana.

El K_{d} para 6A1 se calculó como se ha descrito en Beatty et al. J. Immunol. Methods, 100: 173-179 (1987), encontrándose un valor de 2 x 10^{-10} M.

El hibridoma 3426A11C1B9 se depositó en fecha 6 de octubre de 1993 con la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC), Centro del Servicio de Laboratorio de la Salud Pública para Microbiología & Investigación Aplicada (Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido, bajo el número de acceso 93100620, y ha sido aceptado como depósito de patente, de acuerdo con el Tratado de Budapest de 1977 que rige el depósito de microorganismos para los propósitos de procedimientos de patente).

Ejemplo 8 Actividad Biológica de los MAbs: 3B9 (Humanizado), 3B9 (Murino) y 6A1

Se realizaron los ensayos siguientes utilizando los procedimientos descritos a continuación.

A. Fijación a rhIL-4 Glicosilada

Los anticuerpos arriba identificados se generaron para IL-4 humana recombinante (rhIL-4) no glicosilada que se produjo en E. coli. Dado que la IL-4 humana nativa está glicosilada, era importante confirmar la fijación al material secretado por una línea de células de mamífero. 3B9 se fija igualmente bien a la IL-4 recombinante humana tanto glicosilada como no glicosilada, y por consiguiente no está dirigido a un epítope que pudiera estar enmascarado en la IL-4 humana natural.

B. Inhibición de la Fijación de IL-4 al Receptor

La capacidad de 3B9 para inhibir la fijación de IL-4 a su receptor se estudió utilizando la fijación de ^{125}I-rhIL-4 a la línea de células de gibón, MLA [ATCC TIB201], que soporta aproximadamente 6000 receptores por célula. Se incubaron células MLA con ^{125}I-IL-4 durante 30 minutos a 37ºC. Se determinó la absorción de radiactividad en un contador gamma después de la separación de ^{125}I-IL-4 fijada a las células por centrifugación a través de un gradiente de aceite. Se determinó la fijación inespecífica por incubación en presencia de un exceso molar de 100 veces de IL-4 sin marcar [Park et al., J. Exp. Med., 166: 476-488 (1987)]. El valor CI_{50} para IL-4 sin marcar en este ensayo era 22 pM cuando la cantidad de IL-4 (añadida) era 83 pM. Para 3B9 (IgG) murino intacto, el valor CI_{50} era 63 pM, y 93 pM para el fragmento Fab. A otra concentración de IL-4 (218 pM), la cantidad obtenida por ensayo para 3B9 (IgG) murino era 109 pM.

C. Inhibición de la Proliferación de Linfocitos

Utilizando el método descrito en Spits et al., J. Immunol., 139: 1142-1147 (1987), se incuban linfocitos de sangre periférica humana durante 3 días con fitohemaglutinina, un mitógeno de las células T, para regular en sentido creciente el receptor de IL-4. Los blastocitos resultantes se estimulan luego durante 3 días más con IL-4. La proliferación se mide por la incorporación de ^{3}H-timidina. La proliferación de las células B se midió por el ensayo de Callard et al., en Lymphokines and Interferons. A Practical Approach, cap. 19, p. 345, modificado como sigue. Células B amigdalares humanas purificadas se estimulan durante 3 días con IL-4 y anti-IgM inmovilizada. La proliferación se mide por la incorporación de ^{3}H-timidina.

3B9 (murino) inhibía la incorporación de ^{3}H-timidina por los linfocitos T de la sangre periférica humana estimulados con 133 pM de IL-4 y los linfocitos B amigdalares humanos estimulados por 167 pM de IL-4. Los linfocitos T estimulados por IL-2 no se veían afectados. El valor CI_{50} para inhibición de la proliferación de las células T era 30 pM, y para la proliferación de las células B 103 pM. Los valores correspondientes para el fragmento Fab de 3B9 (murino) eran 108 y 393 pM.

D. Inhibición de la Inducción de CD23

CD23 es el aceptor de afinidad baja para IgE (FcERII) y es inducido en la membrana de los linfocitos B en reposo por bajas concentraciones de IL-4 como un requisito previo necesario para la producción de IgE. Las células B amigdalares humanas purificadas se estimulan durante 2 días con IL-4. El porcentaje de células que expresan el receptor CD23 se determina por citometría de flujo [Defrance et al., J. Exp. Med., 165: 1459-1467 (1987)]. 3B9 (murino) inhibía la expresión de CD23 en los linfocitos B amigdalares humanos estimulados con 8,3 pM de IL-4 con un valor CI_{50} de 136 pM.

E. Inhibición de la Secreción de IgE

Al contrario que otros ensayos en los cuales se añadió IL-4 a concentraciones CE_{50} [Pere et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 6880-6884 (1988)], se investigó la secreción de IgE en presencia de concentraciones de IL-4 que daban secreción máxima a fin de reducir la variabilidad inherente en este sistema. La proliferación de las células T se midió como sigue. Se incuban linfocitos de sangre periférica humana con IL-4 durante un periodo comprendido entre 10 y 18, preferiblemente 12, días. la concentración de IgE en el sobrenadante de cultivo se determina por ELISA.

La secreción de IgE era inhibida por 3B9 (murino), y el fragmento Fab de 3B9, en presencia de 1,7 nM de IL-4, dando valores CI_{50} de 1,9 y 5,0 nM respectivamente. El experimento se repitió utilizando una concentración menor de IL-4, 667 pM, que reducía el valor CI_{50} a 0,65 nM para 3B9 (murino). La relación molar de anticuerpo (IgG) a IL-4 se mantenía inalterada (1:1) a lo largo de los intervalos de concentración examinados.

F. Sumario e Interpretación de los Datos

Las relaciones molares de IL-4 a diversos MAbs requeridas para 50% de inhibición de la función en los bio-ensayos se dan en la Tabla 2.

5

En todos los ensayos, excepto la secreción de IgE, se añadió IL-4 a concentraciones DE_{50} aproximadas. Las relaciones molares de anticuerpo a IL-4 requeridas para 50% de inhibición eran similares para 3B9 humanizado, 3B9 murino, y 6A1 en los dos ensayos de proliferación de linfocitos, pero mayores para 3B9 humanizado en el ensayo de inducción de CD23. El último es un ensayo particularmente sensible que requiere aparentemente una ocupación muy baja (\sim 5%) del receptor (Kruse et al., EMBO J., 12: 5121, 1993) y, como se resulta evidente a partir de los resultados obtenidos con 3B9 murino, está sujeto a variación entre ensayos.

Una comparación de las actividades de 6A1 de rata y 3B9 murino demostró un perfil similar de efectos funcionales, excepto un fallo inesperado de 6A1 para inhibir completamente la fijación de IL-4 radioyodada a su receptor. Se cree que la IL-4 radioyodada utilizada en el ensayo de fijación del receptor está yodada en la tirosina accesible, residuo 124. Cuando se comparó la capacidad de 6A1 para inhibir la expresión de CD23 inducida por IL-4 no marcada o yodada, se encontró que la inhibición era menos eficiente contra el ligando yodado. Estos resultados indican que 6A1 se fija a IL-4 en la región de la tirosina 124, pero no específicamente a ella.

Así pues, de acuerdo con los datos actuales, 6A1 es un anticuerpo neutralizante de alta afinidad, que se fija a una región muy diferente de IL-4 que 3B9.

Ejemplo 9 Farmacocinética

La farmacocinética de 3B9 humanizado se investigó en la rata macho Sprague Dawley. Se administró 3B9 humanizado a cuatro animales como una dosis de bolus iv a 1 mg/kg, y se continuó la toma de muestras de sangre durante 5 semanas después de la dosificación. Se determinaron las concentraciones de 3B9 humanizado en plasma utilizando un ELISA sándwich de IL-4/IgG anti-humana diseñado para confirmar no sólo la presencia de IgG humana circulante, sino también su capacidad para fijarse a IL-4 humana recombinante.

Los resultados de este estudio se resumen en la Tabla 3.

TABLA 3

Farmacocinética de 3B9 humanizado en las ratas macho Sprague-Dawley
(dosis: 1 mg/kg, bolus iv)

6

La abreviatura del parámetro farmacocinético es como sigue: Clp, aclaramiento aparente en plasma.

Los datos indicaron que la variabilidad inter-animales era relativamente pequeña y la desaparición de 3B9 humanizado del plasma parecía ser bifásica. El aclaramiento aparente en plasma era bajo (0,5 ml/h/kg). La semi-vida parecía ser 11 días. Así pues, las características farmacocinéticas del 3B9 humanizado derivado de células CHO son consistentes con otros anticuerpos monoclonales humanizados en ratas. La larga semi-vida circulante de 3B9 humanizado en la rata sugiere también que cuando se administra al hombre, 3B9 humanizado debe ser eficaz probablemente a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.

Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención se incluyen en la memoria descriptiva arriba identificada y se espera que sean evidentes para una persona con experiencia en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse regiones de entramado humanas o modificaciones de las mismas, distintas de los anticuerpos ilustrativos descritos anteriormente, en la construcción de anticuerpos humanizados. Se cree que tales modificaciones y alteraciones a las composiciones y procesos de la presente invención están abarcadas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas a este documento.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Holmes, Stephen D.

\hskip3,9cm Gross, Mitchell S.

\hskip3,9cm Sylvester, Daniel R.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos de IL-4 Recombinantes Útiles en el Tratamiento de Trastornos Mediados por IL-4

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 58

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Smithkline Beecham Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Corporate Intellectual Property, W2220-709 Swedeland Rd.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: King of Prussia

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: PA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 19406-2799

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, version #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/117.366

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-Sep-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACION:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/136.783

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-Oct-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACION:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE PROCURADOR/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Sutton, Jeffrey A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34.028

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: P50186-2

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO:(215) 270-5024

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (215) 270-5090

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 396 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..396

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 132 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 483 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 64..483

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 140 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..60

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser}

\sac{Gly Ala Tyr Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..57

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly}

\sac{Val His Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 423 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..423

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 141 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 423 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..423

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 141 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 393 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..393

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 131 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..45

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..27

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Met Gly Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..48

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..33

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..27

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACATATGC AAGGCTTACA ACCACAATC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTTACCCTG CGTGAATCCG GTCCGGCACT AGTTAAACCG ACCCAGACCC TGACGTTAAC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCACCTTC TCCGGTTTCT CCCTGTCGAC CTCCGGTATG GGTGTTTCCT GGATCCG

\hfill

117

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 120 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGCCGCCG GGTAAAGGTC TAGAATGGCT GGCTCACATC TACTGGGACG ACGACAAACG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTACAACCCG AGCCTGAAAT CCCGTCTGAC GATATCCAAA GACACCTCCC GTAACCAGGT

\hfill

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 120 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTTCTGACC ATGGACCCGG TTGACACCGC TACCTACTAC TGCGCTCGTC GCGAAACCGT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCTACTGG TACTTCGACG TTTGGGGTCG TGGTACCCCA GTTACCGTGA GCTCCCAACC

\hfill

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCGGCGGC TGACGGATCC AGGAA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGTCAGAA CAACCTGGTT ACGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCGGGTTAC CCTGCGTGAA TCCGG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAACCCTCG AGTGCCATTG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCTGTGT CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGG

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTGCAGTT GATGGTGGCC CTCTCGCCCA GAGACACAG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genónmico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAGAGGCC TCCCAAAGTG TTGATTATGA TGGTGATAGT TATATGAACT GGTATCAGCA

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAACCC

\hfill

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 63 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTTTCTGC TGATACCAGT TCATATAACT ATCACCATCA TAATCAACAC TTTGGGAGGC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTC

\hfill

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATACTACTGT CAGCAAAGTA ATGAGGATCC TCCGAGGTTC GGCGGAGGGA C

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGGTCCCT CCGCCGAACC TCGGAGGATC CTCATTACTT TGCTGACAGT AGT

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACGCT GCATCCAATC TAGAATCTGG GGTAC

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAGATTCT AGATTGGATG CAGCGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCGAGGA CGCCAGCAAC ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCTCTGG TGCCTACGGG CAG

\hfill

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAACCTGCC CGTAGGCACC AGAGATCCAG AGCAACAGAG AAATGAAGAC CTGGGTCTGC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACACCATGT TGCTGGCGTC CTCG

\hfill

84

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGTTACCC TGAAAGAGTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGTAGTCC TTGACCAG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCACCGTCT CCTCAGCTAG CACCAAGGGG C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGGTGCTA GCTGAGGAGA CG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCTAGATG GCGCCGCCAC AGTACGTTTG ATCTCCAGCT TGGTCCC

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGCCTCCC AAAGTGTTGA TTATGATGGT GATAGTTATA TGAAC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCTCCGGTA TGGGTGTTTC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACATCTACT GGGACGACGA CAAACGTTAC AACCCGAGCC TGAAATCC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGAAACCG TTTTCTACTG GTACTTCGAC GTT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 393 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..393

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 131 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

25

Claims (33)

1. Una proteína de fusión que tiene especificidad de fijación para la interleuquina-4 (IL-4) humana que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) derivadas de un anticuerpo monoclonal neutralizante no humano caracterizado por una constante de disociación igual a o menor que 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana, y una primera pareja de fusión.

2. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 que está enlazada operativamente a una segunda pareja de fusión.

3. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual dicha segunda pareja de fusión comprende la totalidad o parte de una cadena pesada constante de inmunoglobulina o cadena ligera constante de inmunoglobulina, o ambas.

4. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la cual dicho anticuerpo monoclonal neutralizante no humano es 6A1, producido por el hibridoma ECACC 9310662... .

5. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la cual dicha secuencia de la primera pareja de fusión es la secuencia de la cadena pesada de: aminoácidos 21-50, 56-71, 88-119, y 131-141 de SEQ ID NO: 12.

6. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la cual dicha secuencia de la primera pareja de fusión es la secuencia de la cadena ligera de: aminoácidos 20-42, 58-72, 80-111, y 121-131 de SEQ ID NO: 14.

7. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la cual dichas secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad para la cadena pesada son:

(a)

ThrSerGlyMetGlyValSer: SEQ ID NO: 22,

(b)

HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnPro-SerLeuLysSer: SEQ ID NO: 24, o

(c)

ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: SEQ ID NO: 26.

8. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la cual dichas secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad para la cadena ligera son:

(a)

LeuAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: SEQ ID NO: 16,

(b)

AlaAlaSerAsnLeuGluSer: SEQ ID NO:18, o

(c)

GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: SEQ ID NO: 28.

9. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 en la cual dichas secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad para la cadena ligera son:

(a)

LysAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: SEQ ID NO: 16,

(b)

AlaAlaSerAsnLeuGluSer: SEQ ID NO: 18, o

(c)

GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: SEQ ID NO: 20.

10. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

(a)

HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnPro-SerLeuLysSer: SEQ ID NO: 24, y

(b)

ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: SEQ ID NO: 26.

11. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

(a)

GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: SEQ ID NO: 28; y

(b)

GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: SEQ ID NO: 20.

12. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la reivindicación 1 que comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada de inmunoglobulina (CDR), cuya secuencia se selecciona del grupo constituido por:

26

13. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR) de cadena ligera de inmunoglobulina, cuya secuencia se selecciona del grupo constituido por:

103

14. Una secuencia de ácido nucleico aislada que se selecciona del grupo constituido por:

(a)

una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;

(b)

una secuencia de ácido nucleico complementaria a (a); y

(c)

un fragmento o análogo de (a) o (b) que codifica una proteína caracterizada por tener afinidad de fijación para la interleuquina-4 humana;

caracterizado por un valor K_{d} igual a o menor que 2 x 10^{-10} M.

15. La secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 14, en la cual la secuencia codificante de la proteína de fusión comprende la secuencia de ácido nucleico de Fig. 5, SEQ ID NO: 13.

16. La secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 14, en la cual la secuencia codificante de la proteína de fusión comprende la secuencia de ácido nucleico de Fig. 4, SEQ ID NO: 11.

17. Un plásmido recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.

18. Una célula hospedadora transfectada con el plásmido recombinante de la reivindicación 17.

19. Un proceso para producir un anticuerpo humanizado específico para interleuquina-4 humana que comprende cultivar una línea de células transfectada con el plásmido recombinante de la reivindicación 17 bajo el control de secuencias reguladoras seleccionadas capaces de dirigir la expresión del mismo en dichas células.

20. Un método para diagnosticar alergias y otras afecciones asociadas con una producción excesiva de inmunoglobulina E en un humano, que comprende poner en contacto una muestra de fluido biológico con un anticuerpo monoclonal caracterizado por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana, y ensayar con respecto a la existencia de fijación entre dicho anticuerpo monoclonal y la interleuquina-4 humana.

21. Un método para clasificar anticuerpos monoclonales que se caracterizan por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M respecto a interleuquina-4 humana, que comprende:

a)

preparar una línea de células de hibridoma caracterizada por secreción de un anticuerpo monoclonal para interleuquina-4 humana; y

b)

clasificar dicha línea de células de hibridoma con interleuquina-4 humana acoplada con aldehído.

22. Un anticuerpo monoclonal neutralizante que puede obtenerse por el método de la reivindicación 21, que se caracteriza con una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para interleuquina-4 humana.

23. El anticuerpo monoclonal neutralizante de la reivindicación 22, en el cual dicho anticuerpo monoclonal neutralizante se deriva de un roedor.

24. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual dicho roedor es un ratón.

25. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 2, y la secuencia de amino-ácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 4.

26. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 23, en la cual dicho roedor es una rata.

27. Un hibridoma capaz de producir un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26.

28. El hibridoma de acuerdo con la reivindicación 27, en el cual dicho hibridoma es ECACC 93100620.

29. Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada y una cadenaligera, caracterizándose dicho anticuerpo humanizado por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana, en el cual las regiones de entramado de dichas cadenas pesada y ligera se derivan de al menos un anticuerpo humano seleccionado y las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de dicha cadena pesada y dicha cadena ligera se derivan del anticuerpo monoclonal neutralizante de acuerdo con la reivindicación 23.

30. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 29 en el cual dicho anticuerpo está enlazado opcionalmente a un agente efector seleccionado de grupo constituido por una molécula portadora no proteínica, poliestireno, y perlas de plástico.

31. Un anticuerpo quimérico que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, caracterizándose dicho anticuerpo quimérico por una constante de disociación igual a o menor que aproximadamente 2 x 10^{-10} M para IL-4 humana, en el cual las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de dicha cadena pesada y dicha cadena ligera se derivan del anticuerpo monoclonal neutralizante de acuerdo con la reivindicación 23.

32. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el anticuerpo de la reivindicación 29, 30, ó 31, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

33. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el anticuerpo de la reivindicación 29, 30 ó 31, para uso en el tratamiento de alergias y otras afecciones asociadas con una producción excesiva de IgE en un humano.