MD4172199T2 - Anticorpi care leagă protofibrila de alfa-sinucleină - Google Patents

Abstract

Prezenta dezvăluire se bazează, în parte, pe descoperirea unor anticorpi care vizează selectiv agregatele de α-sinucleină umană, cum ar fi oligomerii/protofibrilele, cum ar fi BAN0805. BAN0805 are o tendinţă mai mică de a se lega de ţinta monomerică nedorită de α-sinucleină în comparaţie cu anticorpul monoclonal de şoarece mAb47.

Description

Traducerea brevetului european 4172199

CONTEXT

Cererea internaţională de brevet nr. WO2011/104696 A1 dezvăluie un anticorp IgG monoclonal murin mAb47, care se leagă de formele de protofibrilă ale αsinucleinei. Rămâne o nevoie de anticorpi care să se leagă selectiv de formele de protofibrilă ale α-sinucleinei, care să fie potriviţi pentru utilizare la oameni.

REZUMAT

Prezenta dezvăluire se referă la anticorpi cu afinitate ridicată pentru protofibrilele de α-sinucleină umană şi afinitate scăzută pentru monomerii de αsinucleină. În unele exemple de realizare, anticorpii descrişi aici vizează selectiv agregatele de α-sinucleină umană, cum ar fi oligomerii/protofibrilele, adică, cu o legare mult mai puternică la protofibrilele de α-sinucleină în comparaţie cu monomerul. În unele exemple de realizare, anticorpii descrişi aici au o selectivitate mai bună decât mAb47 atunci când se compară raporturile de legare dintre protofibrila şi monomerul de α-sinucleină. În unele exemple de realizare, anticorpii descrişi aici sunt anticorpi anti-α-sinucleină.

Într-un aspect, prezenta dezvăluire se referă la BAN0805, un anticorp monoclonal care cuprinde un lanţ greu cuprinzând o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 3 şi un lanţ uşor cuprinzând o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 4, care vizează selectiv agregatele de α-sinucleină umană, cum ar fi oligomerii/protofibrilele, cu afinitate mare pentru protofibrilele de αsinucleină umană şi afinitate scăzută pentru monomerii de α-sinucleină. Interesant este că BAN0805 prezintă, de asemenea, o legare mai mică a monomerului de αsinucleină decât mAb47, rezultând o selectivitate mai bună pentru BAN0805 decât pentru mAb47 atunci când se compară raporturile de legare dintre protofibrila şi monomerul de α-sinucleină. În plus, legarea la monomerul de β- şi γ-sinucleină sau la protofibrilele Aβ nu a fost detectată pentru BAN0805.

Prezenta dezvăluire se referă în plus la anticorpi pentru îmbunătăţiri în tratarea tulburărilor neurodegenerative cu patologie în α-sinucleină, inclusiv, dar fără a se limita la, boala Parkinson (BP). Orice referinţe din descriere la metode de tratament se referă la compuşii, compoziţiile farmaceutice şi medicamentele conform prezentei invenţii pentru utilizare într-o metodă de tratament a corpului uman (sau animal) prin terapie (sau pentru diagnostic).

SCURTĂ DESCRIERE A DESENELOR

FIG. 1 prezintă date privind stresul termic pentru BAN0805. Probele de anticorpi candidaţi purificaţi la 1 mg/ml au fost expuse la temperaturi de a) 4°C, b) 25°C, c) 37°C şi d) 50°C timp de două săptămâni. Probele au fost apoi analizate prin SECMALS pentru a verifica agregarea. Datele sugerează că nu există probleme de agregare pentru BAN0805 din cauza stresului termic.

FIG. 2 arată inhibarea ELISA cu valori IC50 pentru BAN0805 atunci când este legat de monomeri şi protofibrile (PF) de α-sinucleină. BAN0805 are o selectivitate de 910 ori mai bună pentru forma de protofibrilă a α-sinucleinei în comparaţie cu mAb47, care are o selectivitate de doar 340 de ori (neprezentată). Nivelul de protofibrilă a fost exprimat ca echivalent cu nivelul de monomer în concentraţie, iar dimensiunea protofibrilelor nu a fost luată în considerare. Multiplul de selectivitate a fost calculat prin împărţirea valorii IC50 pentru legarea monomerului la valoarea IC50 pentru legarea PF.

FIG. 3 prezintă legarea şi selectivitatea pentru BAN0805 în comparaţie cu mAb47 folosind Biacore SPR. Valorile KD pentru protofibrila de α-sinucleină au fost similare pentru mAb47 şi BAN0805, arătând că modificarea mAb47 nu a afectat legarea puternică la protofibrila de α-sinucleină, confirmând rezultatele testului ELISA de inhibare. Valorile KD măsurate cu SPR au dus la o selectivitate de 110.000 de ori, respectiv 18.000 de ori pentru PF faţă de monomer pentru BAN0805 şi mAb47. Sunt prezentate senzorgrame reprezentative ale măsurătorilor SPR pentru mAb47 şi BAN0805 pe Biacore 8K.

FIG. 4 prezintă reactivitatea încrucişată a BAN0805, denumită aici hu47-IgG4, la monomerul de α-sinucleină, monomerul de β-sinucleină, monomerul de γ-sinucleină şi Aβ-protofibrilă utilizând testul ELISA de inhibare. Rezultatul nu a arătat nicio legare detectabilă la monomerul de β- sau γ-sinucleină sau la Aβ-protofibrilă.

DESCRIERE DETALIATĂPrezenta dezvăluire se referă la anticorpi cu

afinitate ridicată pentru protofibrilele de α-sinucleină umană şi afinitate scăzută pentru monomerii de αsinucleină.

Aşa cum este dezvăluit aici, prezenta dezvăluire se referă la următoarele exemple de realizare.

Exemplul de realizare 1. Un anticorp care cuprinde un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 1 şi un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 2.

Exemplul de realizare 2. Anticorpul din exemplul de realizare 1, în care anticorpul este de izotipul IgG.

Exemplul de realizare 3. Anticorpul din exemplul de realizare 1, în care anticorpul este de izotipul IgG4.

Exemplul de realizare 4. Anticorpul conform oricăruia dintre exemplele de realizare 1-3, în care anticorpul are o valoare KD pentru legarea formei de protofibrilă a α-sinucleinei de cel puţin 110.000 de ori mai mică decât valoarea KD pentru legarea formei de monomer a α-sinucleinei.

Exemplul de realizare 5. Anticorpul conform oricăruia dintre exemplele de realizare 1-3, în care anticorpul are o valoare KD pentru legarea formei de protofibrilă a α-sinucleinei de cel mult 18 pM şi o valoare KD pentru legarea formei de monomer a α-sinucleinei de cel puţin 2200 nM.

Exemplul de realizare 6. Anticorpul conform exemplului de realizare 4 sau 5, în care valoarea KD a anticorpului menţionat pentru legarea la forma de protofibrilă a α-sinucleinei şi valoarea KD a anticorpului menţionat pentru legarea la forma de monomer a α-sinucleinei sunt măsurate prin SPR.

Exemplul de realizare 7. Un anticorp care cuprinde un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 3 şi un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 4.

Exemplul de realizare 8. Anticorpul conform exemplului de realizare 7, în care anticorpul cuprinde două lanţuri grele şi două lanţuri uşoare.

Exemplul de realizare 9. Unul sau mai mulţi acizi nucleici care codifică anticorpul conform oricăruia dintre exemplele de realizare de la 1 până la 8. Exemplul de realizare 10. Unul sau mai mulţi acizi nucleici din exemplul de realizare 9, în care

(a) respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 11 şi 12, (b) respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 13 şi 14, (c) respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 17 şi 18, sau (d) respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 19 şi 20.

Exemplul de realizare 11. Unul sau mai mulţi vectori care cuprind acidul (acizii) nucleic(i) conform oricăruia dintre exemplele de realizare 9 şi 10.

Exemplul de realizare 12. O celulă gazdă care cuprinde acidul (acizii) nucleic(i) conform oricăruia dintre exemplele de realizare de la 9 până la 10. Exemplul de realizare 13. O celulă gazdă care cuprinde unul sau mai mulţi vectori din exemplul de realizare 11.

Exemplul de realizare 14. O celulă gazdă care exprimă anticorpul conform oricăruia dintre exemplele de realizare 1-8.

Exemplul de realizare 15. O compoziţie care cuprinde cel puţin un anticorp conform oricăruia dintre exemplele de realizare 1-8 şi un purtător acceptabil farmaceutic.

Într-un aspect, prezenta dezvăluire se referă la un anticorp care are o afinitate ridicată pentru protofibrilele de α-sinucleină umană şi o afinitate scăzută pentru monomerii de α-sinucleină şi care cuprinde un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 1 şi un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 2.

Într-un exemplu de realizare, anticorpii furnizaţi aici cuprind un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 1 şi un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 2.

Într-un exemplu de realizare, anticorpii furnizaţi aici cuprind un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 3 şi un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 4. În unele exemple de realizare, anticorpii furnizaţi aici cuprind două lanţuri grele şi două lanţuri uşoare.

Într-un exemplu de realizare, anticorpul descris în prezenta invenţie este de izotip IgG, în special izotip IgG umană. Într-un alt exemplu de realizare, anticorpul este de izotip IgG4.

În cadrul prezentei dezvăluiri, afinitatea ridicată faţă de protofibrilele de αsinucleină umană se referă la o constantă de disociere KD mai mică de 10-7 M pentru protofibrile de α-sinucleină umană. În consecinţă, într-un exemplu de realizare, anticorpii descrişi în prezenta dezvăluire au o valoare KD mai mică de 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 M, sau 10-12 M pentru protofibrile de α-sinucleină umană. În exemple de realizare specifice, anticorpii cuprind un lanţ greu cuprinzând o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 1 şi un lanţ uşor cuprinzând o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 2 şi au o valoare KD de 11,2 până la 25,8 pM pentru protofibrilele de α-sinucleină umană.

Într-un alt exemplu de realizare, anticorpii cuprind un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 1 şi un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 2 şi au o afinitate scăzută faţă de monomerul de αsinucleină umană. De exemplu, valoarea KD a anticorpilor descrişi în prezenta dezvăluire pentru legarea la forma de monomer a α-sinucleinei este de cel puţin 1500 nM, cel puţin 1600 nM, cel puţin 1700 nM, cel puţin 1800 nM, cel puţin 1900 nM, cel puţin 2000 nM, cel puţin 2100 nM, cel puţin 2200 nM, cel puţin 2300 nM, cel puţin 2400 nM, cel puţin 2500 nM, cel puţin 2600 nM, cel puţin 2700 nM, cel puţin 2800 nM, cel puţin 2900 nM sau cel puţin 3000 nM. În exemple de realizare specifice, anticorpii cuprind un lanţ greu cuprinzând o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 1 şi un lanţ uşor cuprinzând o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 2 şi au o valoare KD de la 1650 nM până la 2730 nM pentru monomerul de α-sinucleină umană.

Într-un exemplu de realizare, anticorpii cuprind un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 1 şi un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 2 şi au o selectivitate de peste 80.000 de ori, peste 90.000 de ori, peste 100.000 de ori, peste 110.000 de ori sau peste 120.000 de ori faţă de protofibrila de α-sinucleină umană faţă de α-sinucleina monomerică. În exemple de realizare specifice, anticorpii cuprind un lanţ greu cuprinzând o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 1 şi un lanţ uşor cuprinzând o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 2 şi au o selectivitate de 64.000 de ori până la 244.000 de ori faţă de protofibrila de α-sinucleină umană comparativ cu α-sinucleina monomerică.

Într-un exemplu de realizare, aceste afinităţi de legare sunt măsurate folosind ELISA de inhibare, de exemplu, aşa cum este descris în exemplul 3. Într-un alt exemplu de realizare, aceste afinităţi de legare sunt măsurate prin Rezonanţă Plasmonică de Suprafaţă (SPR), de exemplu, aşa cum este descris în exemplul 3. Într-un alt aspect, aici sunt prezentaţi unul sau mai mulţi acizi nucleici care codifică un anticorp conform invenţiei. Într-un exemplu de realizare, respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 11 şi 12. Într-un alt exemplu de realizare, respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 13 şi 14. Într-un exemplu de realizare, respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 17 şi 18. Într-un exemplu de realizare, respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 19 şi 20.

Într-un alt aspect, aici sunt furnizaţi vectori care cuprind acizi nucleici care codifică un anticorp aşa cum este descris aici. Astfel de vectori includ, dar nu se limitează la, vectori de clonare sau vectori de exprimare. Într-un aspect, unul sau mai mulţi vectori furnizează codificarea unui anticorp conform invenţiei. Într-un exemplu de realizare, respectivul unul sau mai mulţi vectori cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 11 şi 12. Într-un alt exemplu de realizare, respectivul unul sau mai mulţi vectori cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 13 şi 14. Într-un exemplu de realizare, respectivul unul sau mai mulţi vectori cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 17 şi 18. Într-un exemplu de realizare, respectivul unul sau mai mulţi vectori cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 19 şi 20.

Într-un alt aspect, aici sunt prezentate celule gazdă care cuprind acizi nucleici care codifică un anticorp conform invenţiei. Celulele gazdă descrise aici pot fi celule de mamifere, cum ar fi celulele B, hibridoamele sau celulele CHO. Într-un exemplu de realizare, celulele gazdă descrise aici sunt celule umane.

Într-un alt aspect, aici este prezentată o compoziţie care cuprinde un anticorp conform invenţiei şi un excipient acceptabil farmaceutic.

EXEMPLE Exemplul 1 - Generarea de candidaţi anticorpi

Variantele iniţiale ale mAb47 au fost generate prin grefarea directă a CDRurilor mAb47 la secvenţele cadrului uman şi prin efectuarea de mutaţii inverse la reziduurile de şoarece în diferite poziţii. Niciuna dintre variantele iniţiale nu a prezentat proprietăţile de legare dorite la α-sinucleină. Prin urmare, a fost construit şi analizat un nou model pentru a găsi mai multe mutaţii posibile pentru generarea de noi variante.

În a doua încercare de îmbunătăţire a mAb47, au fost verificate reziduurile mai puţin probabile care interacţionează cu ţinta şi reziduurile de la 4Å din CDR-urile determinate. O variantă de anticorp având o secvenţă de lanţ greu prezentată în SECV ID NR: 3 şi o secvenţă de lanţ uşor prezentată în SECV ID NR: 4 a fost generată şi denumită BAN0805. S-a constatat că mutaţiile inverse V71K şi R94K, deşi prezente simultan în BAN0805, sunt esenţiale pentru capacitatea de legare a acestor anticorpi, deoarece eliminarea lor în celelalte variante a dus la o pierdere a legării.

Întrucât BAN0805 are cu o mutaţie inversă mai puţin decât o variantă comparabilă şi a demonstrat legare şi selectivitate pentru protofibrile faţă de speciile monomerice, BAN0805 a fost ales ca şi candidat principal.

Exemplul 2 - Caracterizarea candidaţilor anticorpi

Pentru a determina stabilitatea termică, anticorpii au fost supuşi la temperaturi mai ridicate timp de 10 minute, răciţi la 4°C şi utilizaţi într-un test ELISA la concentraţia EC80 a fiecărui candidat (de obicei 5-50 ng/ml). BAN0805 a fost stabil, păstrându-şi capacitatea de legare la α-sinucleină până la 75°C, unde a început să scadă, în timp ce legarea anticorpului himeric de şoarece c47 sau cmAb47 (himera care combină IgG4 umană şi regiunea variabilă a mAb47) a scăzut drastic cu aproximativ 5°C mai devreme.

Pentru a determina temperatura de topire a anticorpilor, cmAb47 a fost testat în raport cu BAN0805 într-un test de deplasare termică. Datele privind temperatura de topire indică faptul că Tm pentru BAN0805 a fost calculată la 65-65,4°C, mai mică decât cea pentru himeră la 70°C.

În plus, probele purificate la 1 mg/ml au fost injectate la 0,4 ml/min într-o coloană de excludere pe baza dimensiunii într-un sistem HPLC şi analizate prin împrăştierea luminii în unghiuri multiple pentru a determina masele molare absolute şi a verifica agregarea. Datele sugerează că nu au existat probleme de agregare pentru BAN0805. BAN0805 a fost monodispersat (Mw/Mn < 1,05). Recuperarea masei a fost de 100% (masa calculată faţă de masa injectată), ceea ce indică o recuperare bună a proteinelor.

Cromatografia de interacţiune încrucişată utilizând IgG policlonală umană purificată în masă este o tehnică de monitorizare a interacţiunilor proteină-proteină nespecifice şi poate fi utilizată pentru a discrimina între anticorpii solubili şi insolubili.

Un indice de retenţie (k') ridicat indică o tendinţă de auto-interacţiune şi o solubilitate scăzută. BAN0805 a prezentat un indice de retenţie de 0,025, care este sub 0,035 pentru cmAb47, indicând o tendinţă scăzută pentru interacţiuni nespecifice şi o solubilitate bună.

Pentru analiza stresului indus de îngheţare/dezgheţare, probele de anticorpi candidaţi purificaţi la 1 mg/ml au fost supuse la 10 cicluri de 15 minute la -80°C, urmate de dezgheţare timp de 15 minute la temperatura camerei. Pentru analiza stresului indus de căldură, probele de anticorpi candidaţi purificaţi la 1 mg/ml au fost expuse la temperaturi de a) 4°C, b) 25°C, c) 37°C şi d) 50°C timp de două săptămâni. Probele au fost apoi analizate prin SEC-MALS pentru a verifica agregarea. Datele sugerează că ciclurile de îngheţare-dezgheţare şi stresul termic nu au cauzat agregare în BAN0805. Vezi FIG. 1.

BAN0805 a fost analizat şi comparat cu cea mai apropiată linie germinală (IGVH4-59*03/IGHJ3*01 pentru HK şi IGVK2-28*01/IGKJ2*02 pentru KA) urmând definiţiile CDR IMGT şi instrumentul DomainGapAlign. Identitatea generală cu linia germinală umană a fost de 86,5% pentru lanţul uşor, peste pragul de 85% pentru a fi considerat umanizat pentru această analiză. Pentru lanţul greu, după grefarea CDRurilor şi introducerea a două mutaţii inverse de şoarece, procentul de identitate cu linia germinală umană a scăzut la puţin sub 81%. Acest lucru ar putea fi explicat prin faptul că CDR2 IMGT este semnificativ mai scurtă decât definiţia Kabat utilizată aici, ceea ce a cauzat inserarea unui număr mai mare de reziduuri de şoarece la începutul cadrului 3.

Exemplul 3 - Legarea selectivă a BAN0805 la protofibrilele de α-sinucleină umană

Selectivitatea de legare a BAN0805 la protofibrilele de α-sinucleină umană a fost măsurată atât prin ELISA de inhibare, cât şi prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (SPR).

Valorile IC50 pentru protofibrila de α-sinucleină au fost foarte similare pentru mAb47 şi BAN0805 (2,7 nM şi, respectiv, 2,2 nM), arătând că caracteristicile de legare la protofibrilă nu s-au modificat după umanizare. În schimb, legarea la monomerul de α-sinucleină s-a modificat, rezultând o putere de legare redusă a

BAN0805 la monomerul de α-sinucleină. Acest lucru a dus la o selectivitate mai bună pentru protofibrila de α-sinucleină faţă de monomerul pentru BAN0805 (de 910 ori) comparativ cu mAb47 (de 340 de ori). Vezi FIG. 2.

Cu toate acestea, din cauza limitărilor de detecţie, nu a fost posibilă scăderea suplimentară a concentraţiei de anticorpi pentru a face posibilă detectarea unor valori IC50 chiar mai mici şi, prin urmare, se apropie de valoarea IC50 "reală". Prin urmare, valorile IC50 prezentate au fost obţinute conform procedurii actuale pentru testul ELISA de inhibare, care a fost utilizat pentru toate loturile de mAb47 şi BAN0805, cu menţiunea că valorile IC50 pentru protofibrilă sunt probabil supraestimate (adică, puterea de legare este probabil subestimată). O legare mai precisă şi, prin urmare, o selectivitate mai mare au fost obţinute folosind SPR, care este descrisă mai jos.

Selectivitatea de legare a mAb47 şi BAN0805 a fost confirmată prin SPR utilizând un instrument Biacore 8K (GE Healthcare). Din cauza problemelor de fezabilitate cauzate de complexitatea antigenului ţintă în combinaţie cu dependenţa pronunţată de aviditate a anticorpilor, au fost utilizate diferite configuraţii de testare pentru a evalua legarea protofibrilei şi, respectiv, a monomerului de α-sinucleină. Pentru măsurătorile legării la monomer, cipul a fost acoperit cu un anticorp antişoarece sau anti-uman pentru mAb47 şi, respectiv, BAN0805. 0,25-1,5 µg/ml mAb47 sau BAN0805 a fost apoi capturat pe suprafaţă, urmat de o injecţie cinetică cu un singur ciclu de diluţie de 5 ori a monomerului α-sinucleină. Pentru a măsura legarea la protofibrilă (PF), cipul a fost acoperit cu 0,5 µg/ml PF şi o diluţie de 2 ori de mAb47 sau BAN0805 a fost injectată utilizând o cinetică cu un singur ciclu. Senzorgramele reprezentative pentru mAb47 şi BAN0805 sunt prezentate în FIG. 3.

Valorile KD pentru protofibrila α-sinucleină au fost similare pentru mAb47 şi BAN0805, arătând că modificarea mAb47 nu a afectat legarea puternică la protofibrila de α-sinucleină (Tabelul 1), confirmând rezultatele testului ELISA de inhibare. Cu toate acestea, valorile KD au fost în intervalul pM, confirmând limitările menţionate anterior cu ELISA de inhibare. Important este că SPR a confirmat că afinitatea BAN0805 pentru monomerul de α-sinucleină a fost redusă în comparaţie cu mAb47. Valorile KD măsurate cu SPR au dus la o selectivitate de 110.000 de ori, respectiv 18.000 de ori pentru PF faţă de monomer pentru BAN0805 şi mAb47. Valorile KD medii pentru mAb47 şi BAN0805 pentru monomerul şi protofibrila de αsinucleină sunt prezentate în Tabelul 1.

Tabelul 1. Valori KD pentru mAb47 şi BAN0805 pentru legarea la protofibrila (PF) şi monomerul (M) de α-sinucleină prin Biacore SPR.

Anticorp KD PF de α-sinucleină (pM) KD monomer de αsinucleină (nM) Selectivitate PF vs. monomer de α- sinucleină (multiplu) BAN0805 18,5±7,3 (n=27) 2190±540 (n=59) 110 000 mAb47 16,8±8,0 (n=18) 307±35 (n=23) 18 000 Datele sunt prezentate ca medie ± deviaţie standard (n = numărul de experimente) KD: Constantă de disociere

Reactivitatea încrucişată a proteinelor omoloage, cum ar fi β- sau γsinucleina, şi a altor proteine predispuse la agregare, cum ar fi Aβ, a fost testată atât utilizând ELISA directă (unde acoperirea densă imită formele agregate ale proteinei acoperite), cât şi ELISA de inhibare. Aici, reactivitatea încrucişată a mAb47 şi BAN0805 a fost analizată comparativ prin ELISA de inhibare. ELISA de inhibare a fost efectuată cu monomer de β-sinucleină, monomer de γ-sinucleină şi Aβprotofibrilă ca antigene. Rezultatul indică faptul că nu a existat nicio legare detectabilă a BAN0805 la monomerul de β- sau γ-sinucleină sau Aβ-protofibrilă. Un test reprezentativ de reactivitate încrucişată a BAN0805 la β- sau γ-sinucleină în ELISA de inhibare este prezentat în FIG. 4. Datele sunt prezentate în Tabelul 2.

Tabelul 2. Reactivitatea încrucişată a mAb47 şi BAN0805 la monomerul de βsinucleină, monomerul de γ-sinucleină şi Aβ-protofibrilă.

Anticorp Monomer de sinucleină (> 14 µM) β- Monomer de sinucleină (> 14 µM) γ- Aβ-protofibrilă (> 5 µM) BAN0805 f.l. f.l. f.l. mAb47 f.l. f.l. f.l. f.l. = fără legare

Rezultatele testelor ELISA de inhibare şi datele obţinute prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă (SPR) Biacore au arătat că afinitatea BAN0805 pentru monomerul de α-sinucleină a fost redusă în comparaţie cu mAb47, indicând o selectivitate mai bună a BAN0805 în comparaţie cu mAb47. În plus, nu s-a observat nicio legare la monomerul de β- şi γ-sinucleină sau la Aβ-protofibrile la concentraţiile testate (până la intervalul µM) pentru BAN0805.

Astfel, prezenta dezvăluire se referă la un anticorp cu afinitate ridicată pentru protofibrilele de α-sinucleină şi afinitate scăzută pentru monomerii de α-sinucleină şi având următoarele caracteristici în comparaţie cu mAb47 murin:

(1) BAN0805 are o legare mult mai puternică la protofibrilele de α-sinucleină încomparaţie cu monomerul; (2) atât datele ELISA de inhibare, cât şi cele obţinute prin SPR Biacore au arătat călegarea monomerului de α-sinucleină a fost mai puternică pentru mAb47 în comparaţie cu BAN0805, rezultând o selectivitate mai bună pentru BAN0805 decât pentru mAb47 atunci când se compară raporturile de legare între protofibrila şi monomerul de α-sinucleină (adică, BAN0805 are o tendinţă mai mică de a se lega de ţinta monomerică nedorită de α-sinucleină în comparaţie cu mAb47); şi (3) nu s-a observat nicio legare la monomerul de β- şi γ-sinucleină sau la Aβprotofibrile la concentraţiile testate (până la intervalul µM) pentru BAN0805.

Exemplul 4 - Producerea BAN0805

Pentru a produce BAN0805, secvenţele de ADN optimizate care codifică VH (SECV ID NR: 13) şi VL (SECV ID NR: 14) a BAN0805, inclusiv peptidele semnal, au fost sintetizate şi clonate în vectorii GS pXC-IgG4Pro(deltaK) şi, respectiv, pXCKappa (Lonza). SGV-urile HC şi LC rezultate au fost apoi utilizate pentru a genera un vector genetic dublu (DGV) care conţine atât genele HC, cât şi LC. Secvenţele de ADN optimizate care codifică lanţul greu (HC) şi lanţul uşor (LC) al BAN0805 sunt prezentate în SECV ID NR: 11 şi, respectiv, 12. Secvenţele de ADN optimizate care codifică regiunea variabilă a lanţului greu (VH) şi regiunea variabilă a lanţului uşor (VL) a BAN0805 sunt prezentate în SECV ID NR: 13 şi, respectiv, 14. SECV ID NR: 11-14 includ toate o secvenţă de nucleotide care codifică o peptidă semnal (vezi Tabelul 3B). Secvenţele de nucleotide corespunzătoare secvenţelor de aminoacizi pentru HC, LC, VH şi VL BAN0805, excluzând peptida semnal, sunt prezentate în SECV ID NR: 17, 18, 19 şi, respectiv, 20. Secvenţele CDR ale BAN0805 sunt listate în Tabelul 3A. Secvenţele de aminoacizi ale CDR a lanţului greu (VH-CDR) 1-3 conform nomenclaturii Chothia sunt prezentate în SECV ID NR: 5, 6 şi, respectiv, 7. Secvenţele de aminoacizi ale CDR a lanţului greu (VH-CDR) 1-3 conform nomenclaturii Kabat sunt prezentate în SECV ID NR: 15, 16 şi, respectiv, 7. Secvenţa de aminoacizi a CDR a lanţului greu (VH-CDR-3) conform nomenclaturilor Chothia şi Kabat este aceeaşi şi este prezentată în SECV ID NR: 7. Secvenţele de aminoacizi ale CDR a lanţului uşor (VL-CDR) 1-3 conform nomenclaturilor Chothia şi Kabat sunt aceleaşi şi sunt prezentate în SECV ID NR: 8, 9 şi, respectiv, 10. DGV rezultat, denumit pBAN0805/DGV, a fost apoi transfectat tranzitoriu în celule GS-KO CHOK1SV şi cultivat în condiţii care au dus la secreţia anticorpului asamblat. Anticorpul secretat a fost apoi purificat prin cromatografie de afinitate cu proteina A.

Tabelul 3. LISTĂ DE SECVENŢE

A. BAN0805 VH: VL: Lanţ greu A. BAN0805 Lanţ uşor CDR-uri VH-CDR-1 (Chothia): GFSLTSYGVH (SECV ID NR: 5) VH-CDR-1 (Kabat): SYGVH (SECV ID NR: 15) VH-CDR-2 (Chothia): VIWRGGSTDYSAAF (SECV ID NR: 6) VH-CDR-2 (Kabat): VIWRGGSTDYSAAFMS (SECV ID NR: 16) VH-CDR-3 (Kabat/Chothia): LLRSVGGFAD (SECV ID NR: 7) VL-CDR-1 (Kabat/Chothia): RSSQTIVHNNGNTYLE (SECV ID NR: 8) VL-CDR-2 (Kabat/Chothia): KVSNRFS (SECV ID NR: 9) VL-CDR-3 (Kabat/Chothia): FQGSHVPFT (SECV ID NR: 10)

Tabelul 3A prezintă secvenţele subliniate ca secvenţe CDR conform nomenclaturii Chothia şi secvenţele îngroşate ca secvenţe CDR conform nomenclaturii Kabat. CDR1, CDR2 şi CDR3 sunt prezentate în ordinea standard de apariţie de la stânga (capătul N-terminal) la dreapta (capătul C-terminal).

B. Secvenţe de nucleotide care codifică lanţurile grele şi uşoare BAN0805

Gena HC BAN0805 cu secvenţă semnal (SECV ID NR: 11)

Gena LC BAN0805 cu secvenţă semnal (SECV ID NR: 12) Gena VH BAN0805 cu secvenţă semnal (SECV ID NR: 13)

Gena VL BAN0805 cu secvenţă semnal (SECV ID NR: 14) Gena HC BAN0805 (SECV ID NR: 17) Gena LC BAN0805 (SECV ID NR: 18) Gena VH BAN0805 (SECV ID NR: 19) Gena VL BAN0805 (SECV ID NR: 20)

Secvenţele care codifică o peptidă semnal sunt subliniate. Codonii start sunt îngroşaţi, iar codonii stop sunt în italic.

Claims (12)

1. Anticorp anti-alfa sinucleină care cuprinde un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 1 şi un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 2.

2. Anticorp conform revendicării 1, în care anticorpul este de izotipul IgG.

3. Anticorp conform revendicării 1, în care anticorpul este de izotipul IgG4.

4. Anticorp anti-alfa sinucleină care cuprinde un lanţ greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 3 şi un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi cu SECV ID NR: 4.

5. Anticorp conform revendicării 4, în care anticorpul cuprinde două lanţuri grele şi două lanţuri uşoare.

6. Unul sau mai mulţi acizi nucleici care codifică anticorpul conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 5.

7. Unul sau mai mulţi acizi nucleici conform revendicării 6, în care

(a) respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR:11 şi 12,

(b) respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 13 şi 14,

(c) respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 17 şi 18, sau

(d) respectivul unul sau mai mulţi acizi nucleici cuprind secvenţele cu SECV ID NR: 19 şi 20.

8. Unul sau mai mulţi vectori care cuprind acidul (acizii) nucleic(i) conform oricăreia dintre revendicările de la 6 până la 7.

9. Celulă gazdă care cuprinde acidul (acizii) nucleic(i) conform oricăreia dintre revendicările de la 6 până la 7.

10. Celulă gazdă care cuprinde unul sau mai mulţi vectori conform revendicării 8.

11. Celulă gazdă care exprimă anticorpul conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 5.

12. Compoziţie care cuprinde anticorpul conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 5 şi un purtător acceptabil farmaceutic.