JP2023530766A - 二重特異性抗体及びその用途 - Google Patents

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Abstract

【要約】本発明が二重特異性抗体及びその用途を開示している。前記二重特異性抗体は、Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメイン及び４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインを含む。本発明の二重特異性抗体が１つ或いは２つ或いは３つの、４－１ＢＢと結合する部位を有し、且つ真新しい全ヒトＢ７－Ｈ４抗体を有し；前記二重特異性抗体はＢ７－Ｈ４を標的とすることで特異的に腫瘍細胞と結合することによって、４－１ＢＢ活性化による毒性を小さくし；また、本発明の前記二重特異性抗体がヒトＦｃフラグメントを有し、ＦｃとＦｃＲｎの結合役割を保留し、長い半減期を有する。【選択図】無し

Description

本願は、出願日が２０２０／６／３０である中国特許出願２０２０１０６１８１４９．１の優先権を主張する。本願は、前記の中国特許出願の全文を引用している。
本発明は、生物製薬分野に関し、特に二重特異性抗体、特にＢ７－Ｈ４と４－１ＢＢを標的とする二重特異性抗体及びその用途に関する。
Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１、Ｂ７ｈ．５、Ｂ７Ｓ１、Ｂ７ｘ）は、Ｂ７／ＣＤ２８スーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である。Ｂ７－Ｈ４タンパク質は、活性化されたＴ細胞とＢ細胞、単球と樹状細胞に発現され、Ｔ細胞の免疫応答を負に制御する可能性がある。
Ｂ７－Ｈ４ ｍＲＮＡが広く発現されているが、Ｂ７－Ｈ４タンパク質は、ほとんどの正常な組織で発現されていない。しかし、Ｂ７－Ｈ４は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌の腫瘍細胞表面に過剰発現されている。乳癌は、世界で２番目に大きい悪性腫瘍であり、罹病率が徐々に上昇している。女性癌患者のうち乳癌患者は約４分の１を占めている。米国の乳癌患者の２０１９年の新規症例は３２万人、総人数は約３８０万人、中国の乳癌患者の年間新規症例は約３０万人で、２０２１年の患者数は２５０万人に達すると予想されている。卵巣癌、子宮内膜癌は、女性生殖系によく見られる悪性腫瘍である。中国では毎年約５万人の女性が卵巣癌と診断され、約２万人が卵巣癌で死亡し、卵巣癌の死亡率は婦人科悪性腫瘍のトップを占めている。子宮内膜癌は毎年２０万近くの新発例で、死亡を招いた婦人科悪性腫瘍の中で３番目にランクされている。
Ｂ７－Ｈ４は、非小細胞肺癌及び腎臓癌にも過剰発現されている。肺癌は、最も一般的な癌の一つであり、その中で、非小細胞肺癌が肺癌の８０％近くを占めている。世界でも中国でも肺癌の罹病率と致死率がトップを占めている。２０１８年の世界の肺癌新規症例は約２００万人、死者は１７６万人、中国では毎年約７８万人の新規症例が発生し、約６３万人が死亡している。腎臓癌の罹病率は低く、中国腎臓癌の年間罹病患者は約７万人である。
Ｂ７－Ｈ４は、これらの腫瘍の新たな標的として近年注目されている。Ｂ７－Ｈ４抗体は、複数種のメカニズムを通じて腫瘍細胞に作用することができるが、Ｂ７－Ｈ４抗体の開発方向は主にモノクローナル抗体とＡＤＣに集中しており、現在は二重特異性抗体療法はない。
４－１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＤ１３７）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である。４－１ＢＢは、免疫活性のための多機能モジュレーターであり、複数種の細胞上で発現される共刺激分子である。活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞及び単球、樹状細胞、マクロファージ、腫瘍関連血管内皮細胞などに誘導発現される。そのリガンドは、４－１ＢＢＬであり、主に単核マクロファージ、ＤＣ細胞、Ｂ細胞などのプロフェッショナルＡＰＣ細胞、活性化されたＴ細胞、およびいくつかの腫瘍細胞に発現される。抗４－１ＢＢ作動性抗体は腫瘍を抑制することができるが、４－１ＢＢ抗体の開発方向は、主にモノクローナル抗体と、ＰＤ－Ｌ１と４－１ＢＢを同時に標的とする抗体に集中している。現在、臨床開発段階にあるＢ７－Ｈ４と４－１ＢＢを標的とする二重特異性抗体はない。
Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）社のｕｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳ－６６３５１３）は、抗４－１ＢＢ抗体の全ヒト由来ＩｇＧ４抗体であり、最初に臨床試験に入った抗４－１ＢＢ抗体である。Ｕｒｅｌｕｍａｂの最初の臨床結果が２００８年に発表され、一部の患者で鼓舞的な治療効果が観察されたが、データは、Ｕｒｅｌｕｍａｂが肝毒性を持ち、標的と用量と関係があることを示した。深刻なことに、臨床試験で２人の患者が肝毒性で死亡し、単剤としてのＵｒｅｌｕｍａｂの臨床試験が中止された。一方、ＰＤ－Ｌ１と４－１ＢＢを標的とする二重特異性抗体は、現在も臨床第１期段階のみにあり、腫瘍細胞上でのＰＤ－Ｌ１の発現とＢ７－Ｈ４の発現との重複が少ない。そのため、より安全で効果的で、人のＢ７－Ｈ４と４－１ＢＢを同時に標的とし、且つカニクイザルのＢ７－Ｈ４と４－１ＢＢを結合できる二重特異性抗体を開発する必要がある。
本発明が解決しようとする課題は、先行技術における安全且つ有効でヒトのＢ７－Ｈ４と４－１ＢＢを同時に標的とし、且つカニクイザルのＢ７－Ｈ４と４－１ＢＢを結合することができる二重特異性抗体の欠乏を克服するために、二重特異性抗体、特にＢ７－Ｈ４と４－１ＢＢを標的とする二重特異性抗体及びその応用を提供することである。
上記課題を解決するために、本発明は、以下の技術構成を提供する。
本発明の第一の形態は、Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメイン及び４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体を提供する。
好ましく、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、配列としての配列番号１６に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号４６に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号８４に示すＨＣＤＲ３；配列としての配列番号２３に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号５９に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号９８に示すＨＣＤＲ３；又は、配列としての配列番号１６に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号６０に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号８４に示すＨＣＤＲ３を含み；好ましく、配列としての配列番号１４２に示すＶＨ、配列番号１５９に示すＶＨ又は配列番号１６０に示すＶＨを含み；より好ましく、配列としての配列番号１７４に示す重鎖、配列番号１９１に示す重鎖又は配列番号１９２に示す重鎖を含み；
さらに好ましく、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインがさらにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１１２又は１１３に示し、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１１８に示し、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１３１～１３３のいずれかに示し；
より一層好ましく、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、さらに配列としての配列番号１１２に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３１に示すＬＣＤＲ３；配列としての配列番号１１３に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３２に示すＬＣＤＲ３；又は、配列としての配列番号１１２に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３３に示すＬＣＤＲ３を含み；好ましく、さらに配列としての配列番号１６６～１６９のいずれかに示すＶＬを含み；より好ましく、さらに配列としての配列番号１９８～２０１のいずれかに示す軽鎖を含み。
上記のような二重特異性抗体では、
前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、好ましく配列としての配列番号１６に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号４６に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号８４に示すＨＣＤＲ３、配列としての配列番号１１２に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３１に示すＬＣＤＲ３；配列としての配列番号２３に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号５９に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号９８に示すＨＣＤＲ３、配列としての配列番号１１３に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３２に示すＬＣＤＲ３；又は、配列としての配列番号１６に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号６０に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号８４に示すＨＣＤＲ３、配列としての配列番号１１２に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３３に示すＬＣＤＲ３を含む。
さらに好ましく、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、配列としての配列番号１４２に示すＶＨ及び配列としての配列番号１６６に示すＶＬ；配列としての配列番号１５９に示すＶＨ及び配列としての配列番号１６７に示すＶＬ；配列としての配列番号１６０に示すＶＨ及び配列としての配列番号１６８に示すＶＬ；又は、配列としての配列番号１５９に示すＶＨ及び配列としての配列番号１６９に示すＶＬを含む。
より一層好ましく、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、配列としての配列番号１７４に示す重鎖及び配列としての配列番号１９８に示す軽鎖；配列としての配列番号１９１に示す重鎖及び配列としての配列番号１９９に示す軽鎖；配列としての配列番号１９２に示す重鎖及び配列としての配列番号２００に示す軽鎖；又は、配列としての配列番号１９１に示す重鎖及び配列としての配列番号２０１に示す軽鎖を含む。
前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインについて、その形態は好ましく単一のＶＨ、タンデムのＶＨ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ又はＩｇＧの形態である。そのなかで、前記タンデムのＶＨは、好ましく２個以上のＶＨのタンデム、例えば２個、３個又は４個のＶＨのタンデムである。ＩｇＧ形態であれば、それが含む定常領域は、好ましく突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１、又は突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１に由来する。
上記のような４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインについては、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３は、好ましく、以下の通りである：
前記ＨＣＤＲ１の配列が配列番号１９或いはその変異体１、又は配列番号１４に示し、前記ＨＣＤＲ２の配列が配列番号４９或いはその変異体２、配列番号５１又は配列番号４３に示し、前記ＨＣＤＲ３の配列が配列番号８６或いはその変異体、配列番号９６、配列番号８９又は配列番号８１に示し；そのなかで：
前記変異体１の突然変異がＴ３Ｉ、Ｓ６Ｎ／Ｒ並びにＹ７Ｆのなかの１つ或いは複数を含み；好ましく、前記変異体１の配列は、配列表における配列番号１７～１８並びに配列番号２０～２２のいずれかに示し；
前記変異体２の突然変異がＳ１Ｎ／Ｄ、Ｇ２Ｓ／Ａ、Ｓ３Ｄ／Ｇ、Ｇ５Ｄ／Ｆ／Ｓ／Ｖ並びにＳ６Ｔ／Ｎ／Ｄのなかの１つ或いは複数を含み；前記変異体２の配列は、好ましく配列表における配列番号４７～４８、配列番号５０、配列番号５２～５８並びに配列番号６１のなかのいずれかに示し；
前記変異体３の突然変異がＧ２Ｒ／Ｄ／Ａ／Ｋ、Ｓ３Ａ／Ｔ、Ｓ４Ｇ／Ｎ／Ａ／Ｔ／Ｈ、Ｅ５Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｇ、Ｔ６Ａ、Ｄ７Ｇ／Ｓ、Ｈ９Ｙ／Ｓ、Ｙ１０Ｈ、Ｙ１１Ｆ、Ｎ１２Ｇ／Ｄ並びにＶ１３Ｉ／Ｍ／Ｔのなかの１つ或いは複数を含み；前記変異体３のアミノ酸配列は、好ましく配列表における配列番号８５、配列番号８７～８８並びに配列番号９０～９５のなかのいずれかに示す。
ある実施形態においては、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインは、配列としてそれぞれ配列番号１７、４７及び８５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、４８及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び８７に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１９、５０及び８８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号２０、５１及び８９に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、５２及び９０に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び９０に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号２１、５３及び９１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号２１、５４及び９２に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１９、５５及び９３に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１９、４９及び９４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号２２、５６及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、５７及び９５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１９、５８及び９６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、６１及び９５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、配列としてそれぞれ配列番号１４、４３及び８１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
好ましく、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインは、１つ又は複数の配列が配列番号１４３～１５７、１３９、２８４又は１６１に示す重鎖可変領域を含む。
さらに好ましく、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としての配列番号１７５～１８９、１９３、２８５又は１７１に示す重鎖を含む。
より一層好ましく、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインは、さらに配列としてそれぞれ配列番号１０９、１１８及び１２８に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；好ましく、配列としての配列番号１６３に示す軽鎖可変領域を含み；さらに好ましく、配列としての配列番号１９５に示す軽鎖を含む。
本発明においては、上記のような４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが本分野のなかの常規形態であってもよく、例えば：単一のＶＨ又はタンデムのＶＨの形態、ＨＣＡｂの形態又はＳｃＦｖの形態であり；前記タンデムのＶＨは、好ましく２個以上のＶＨのタンデム、例えば２個、３個又は４個のＶＨのタンデムである。
本発明のある具体的な実施形態においては、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１０９、１１８及び１２８に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１４、４３及び８１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１３、１１８及び１３２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号２３、５９及び９８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１０９、１１８及び１２８に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１４、４３及び８１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１７、４７及び８５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４８及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び８７に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１９、５０及び８８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号２０、５１及び８９に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、５２及び９０に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号２１、５３及び９１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号２１、５４及び９２に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１９、５５及び９３に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１９、４９及び９４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号２２、５６及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、５７及び９５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３３に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、６０及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１７、４７及び８５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３３に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、６０及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４８及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３３に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、６０及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３３に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、６０及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１９、４９及び９４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３３に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、６０及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、６１及び９５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１３、１１８及び１３２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号２３、５９及び９８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４８及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１３、１１８及び１３２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号２３、５９及び９８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１９、５８及び９６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１３、１１８及び１３２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号２３、５９及び９８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、５７及び９５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１３、１１８及び１３２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号２３、５９及び９８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び９０に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。
本発明に記載の二重特異性抗体について、本発明の具体的な実施形態において：
前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原ドメインがＩｇＧの形態であり、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが単一のＶＨの形態であり；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原ドメインがＩｇＧの形態であり、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインがＳｃＦｖの形態であり；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原ドメインがＩｇＧの形態であり、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが２個又は３個のＶＨのタンデムの形態であり；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原ドメインがＦａｂの形態であり、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインがＨＣＡｂの形態又はＨＣＡｂの形態及びＶＨの形態（ＨＣＡｂ－ＶＨ形態）であり；
又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原ドメインがＦａｂの形態であり、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインがＶＨの形態であり、前記ＶＨの形態が好ましく単一のＶＨ、２個又は３個のＶＨのタンデムの形態である。
より具体的には、
前記二重特異性抗体は、以下の形態である：
（１）ＩｇＧのＣ端にＳｃＦｖが接続され、前記ＳｃＦｖのＶＨが前記Ｃ端に接続され；好ましく、当該形態の二重特異性抗体のポリペプチド鎖１が式：ＶＬＢ７－Ｈ４－ＣＬに示し、ポリペプチド鎖２が式：ＶＨＢ７－Ｈ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ＶＨ４－１ＢＢ－リンカー－ＶＬ４－１ＢＢに示し；
（２）ＩｇＧのＣ端にＶＨ又はタンデムのＶＨが接続され；好ましく、当該形態の二重特異性抗体のポリペプチド鎖１が式：ＶＬＢ７－Ｈ４－ＣＬに示し、ポリペプチド鎖２が式：ＶＨＢ７－Ｈ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－（ＶＨ４－１ＢＢ）ｎ－に示し；
（３）ＨＣＡｂのＮ端にＦａｂが接続され；好ましく、当該形態の二重特異性抗体のポリペプチド鎖１が式：ＶＨＢ７－Ｈ４－ＣＨ１に示し、ポリペプチド鎖２が式：ＶＬＢ７－Ｈ４－ＣＬ－リンカー－ＶＨ４－１ＢＢ－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３に示し；
（４）ＨＣＡｂのＮ端にＦａｂが接続され、前記ＦａｂのＣ端にＶＨが接続され；好ましく、当該形態の二重特異性抗体のポリペプチド鎖１が式：ＶＨＢ７－Ｈ４－ＣＨ１に示し、ポリペプチド鎖２が式：ＶＬＢ７－Ｈ４－ＣＬ－リンカー－ＶＨ４－１ＢＢ－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ４－１ＢＢに示し；
又は、（５）Ｆｃの２個のＣＨ２のＮ端にそれぞれＦａｂ、並びにＶＨ又はタンデムのＶＨが接続され；好ましく、当該形態の二重特異性抗体が３つのポリペプチド鎖を含み：
ポリペプチド鎖１が式：ＶＬＢ７－Ｈ４－ＣＬに示し；
ポリペプチド鎖２が式：ＶＨＢ７－Ｈ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示し；
ポリペプチド鎖３が式：ＶＨ４－１ＢＢ－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３又は（ＶＨ４－１ＢＢ）ｎ－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３に示し；
そのなかで、異なるドメインを接続する前記リンカーの配列が同じ又は異なる。
そのなかで：前記ＩｇＧ又はＨＣＡｂのＦｃは、突然変異を含み、好ましく下記の突然変異の一つを含み：
１）ＩｇＧ１の場合、ＥＵ番号によるＬ２３４ＡとＬ２３５Ａ、選択的にＰ３２９Ｇ、ＹＴＥまたはＤＨＳをさらに含み；その中で、ＹＴＥはＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを指し、ＤＨＳとは、３０９位のＬがＤに突然変異し、３１１位のＱがＨに突然変異し、４３４位のＮがＳに突然変異し；
２）ＩｇＧ１の場合、ＥＵ番号による第２３３～２３５位の欠失；
３）ＩｇＧ１の場合、ＥＵ番号によるＬ２３４ＡとＧ２３７Ａ；
４）ＩｇＧ４の場合、ＥＵ番号によるＳ２２８ＰとＦＡＬＡ；ＦＡＬＡとは、２３４位のＦがＡに突然変異し、２３５位のＬがＡに突然変異し；
５）ＩｇＧ１の場合、ＥＵ番号によるＮ２９７Ａ。
上記のようなヒンジ及び上記のリンカーは、当技術分野の従来のものであってもよく、好ましく、上記のリンカーは、配列番号２４１～２６１、２８２及び２８８～２８９からなる群から選択され；そのなかで：
形態（１）のリンカーが好ましく配列番号２４５に示す配列を含み；
形態（２）のリンカーが好ましく配列番号２４３、２４５～２４７並びに配列番号２８８～２８９のいずれかに示す配列を含み；
形態（３）のリンカーが好ましく配列番号２５０に示す配列を含み；
形態（４）のリンカーが好ましく配列番号２８２に示す配列を含み；
形態（５）のリンカーが好ましく配列番号２４５に示す配列を含む。
本発明のある好ましい実施例においては、前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列が配列番号１９８に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列が配列番号２０２～２１５のいずれかに示し；
又は、前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列が配列番号２０１に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列が配列番号２１７、２３０、２３８、２４０、２２６、２６２又は２３９に示し；
又は、前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列が配列番号２００に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列が配列番号２１８～２２５、２３５～２３７、２６３～２６８、２７４～２８１、２８６並びに２８７のいずれかに示し；
又は、前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列が配列番号２０１に示し、前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列が配列番号２２７に示し、且つ前記ポリペプチド鎖３のアミノ酸配列が配列番号２２８、２２９、２３１又は２３２に示し；
又は、前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列が配列番号２３３に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列が配列番号２３４、２６９～２７３のなかのいずれかに示す。
本発明の第二の形態は、前記第一の形態に記載の二重特異性抗体をコードする、単離の核酸を提供する。
本発明の第三の形態は、第二の形態に記載の単離の核酸を含む、発現ベクターを提供する。
本発明の第四の形態は、第三の形態に記載の発現ベクターを含み；好ましく、原核細胞或いは真核細胞である、宿主細胞を提供する。
本発明の第五の形態は、第四の形態に記載の宿主細胞を培養すること、及び培養物から前記二重特異性抗体を得ることを含む、二重特異性抗体の作製方法を提供する。
本発明の第六の形態は、本発明第一の形態に記載の二重特異性抗体を含む、医薬組成物を提供する。
本発明の第七の形態は、第一の形態に記載の二重特異性抗体、第六の形態に記載の医薬組成物の、４－１ＢＢ及び／又はＢ７－Ｈ４関連の疾患を予防及び／又は治療するための薬物の作製における用途を提供する。
そのなかで、前記疾患は好ましく癌であり、前記癌が好まく乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌、メラノーマ、肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、膀胱癌、肉腫又は結腸直腸癌である。好ましく、前記癌が乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌又は胆管癌である。さらに好ましく、前記癌が乳癌である。
本発明の第八の形態は、第一の形態に記載の二重特異性抗体を含む、キメラ抗原受容体を提供する。
本発明の第九の形態は、細胞毒性剤、並びに第一の形態に記載の二重特異性抗体を含み；好ましく、前記細胞毒性剤がＭＭＡＦ或いはＭＭＡＥである、抗体薬物複合体を提供する。
本発明の第十の形態は、第一の形態に記載の二重特異性抗体、第八の形態に記載のキメラ抗原受容体、第九の形態に記載の抗体薬物複合体及び／又は第六の形態に記載の医薬組成物を含み；
好ましく、（ｉ）抗体或いはその抗原結合フラグメント或いは抗体薬物複合体或いは医薬組成物を投与するデバイス；及び／又は（ｉｉ）使用説明をさらに含む、試薬キットを提供する。
本発明の第十一の形態は、キットＡ及びキットＢを含む薬物キットであって、
前記キットＡが第一の形態に記載の二重特異性抗体、第八の形態に記載のキメラ抗原受容体、第九の形態に記載の抗体薬物複合体及び／又は第六の形態に記載の医薬組成物を含み；
前記キットＢが他の抗腫瘍抗体又は前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物、及び／又は、ホルモン製剤、標的小分子製剤、プロテアソーム阻害剤、イメージング剤、診断剤、化学療法剤、腫瘍溶解性薬物、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、抑制性分子の阻害剤並びにワクチンからなる群のなかの一種或いは複数種を含む、薬物キットを提供する。
本発明の第十二の形態は、４－１ＢＢ及び／又はＢ７－Ｈ４が媒介する疾患或いは障害を診断、治療及び／又は予防する方法であって、
必要な患者に治療有効量の第一の形態に記載の二重特異性抗体、第八の形態に記載のキメラ抗原受容体、第九の形態に記載の抗体薬物複合体或いは第六の形態に記載の医薬組成物を投与すること、又は第十一の形態に記載の薬物キットを用いて必要な患者を治療することを含む、方法に関する。
そのなかで、前記疾患或いは障害は、好ましく腫瘍であり、好ましく乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌、メラノーマ、肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、膀胱癌、肉腫又は結腸直腸癌であり；好ましく、前記癌が乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌又は胆管癌であり；さらに好ましく、前記癌が乳癌である。
本発明の第十一の形態は、４－１ＢＢ或いはＢ７Ｈ４を免疫検出又は測定する方法であって、第一の形態に記載の二重特異性抗体、第八の形態に記載のキメラ抗原受容体、第九の形態に記載の抗体薬物複合体或いは第六の形態に記載の医薬組成物を用いることを含み；好ましく、前記検出が診断及び／又は治療の目的のものではない、方法に関する。
本発明の第十四の形態は、必要な患者に第一の形態に記載の二重特異性抗体、第八の形態に記載のキメラ抗原受容体、第九の形態に記載の抗体薬物複合体或いは第六の形態に記載の医薬組成物、及び第二治療剤をそれぞれ投与することを含み；
前記第二治療剤が好ましく他の抗腫瘍抗体又は前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物、及び／又は、ホルモン製剤、標的小分子製剤、プロテアソーム阻害剤、イメージング剤、診断剤、化学療法剤、腫瘍溶解性薬物、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、抑制性分子の阻害剤並びにワクチンからなる群のなかの一種或いは複数種を含む、併用療法に関する。
なお、本発明における「変異体１」、「変異体２」及び「変異体３」における数字については、特別な意味はなく、同じ用語を区別するためだけである。
本発明のＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、特定のＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体であり、４－１ＢＢに結合する１つまたは２つまたは３つの部位を有し；二重特異性抗体の２つのタンパク質機能領域は、いずれかも良好なカニザルとの結合活性がある。
本発明の積極的な進歩効果は下記の通りである：
１、本発明の４－１ＢＢ抗体は、全く新しく「重鎖」のみを含む全ヒト抗体であり、ヒト４－１ＢＢ及びカニクイザル４－１ＢＢと結合する活性を有する。この４－１ＢＢ重鎖抗体の大きさが従来のＩｇＧ抗体の半分しかなく、軽鎖を含まないという特徴により、この抗体は、二重特異性抗体に用いることができ、軽鎖ミスマッチと異種二量化の問題を解決した。
２、本発明のＢ７－Ｈ４抗体は全く新しい全ヒト抗体であり、ヒトＢ７－Ｈ４及びカニクイザルＢ７－Ｈ４と結合する活性を有する。
３、本発明の二重特異性抗体は、４－１ＢＢと結合する１つまたは２つまたは３つの部位を有し、４－１ＢＢ末端の活性を最適化した。
４、本発明は、Ｂ７－Ｈ４を標的とすることで腫瘍細胞を特異的に結合し、４－１ＢＢ活性化による毒性を低下させる。
５、本発明は、ヒトＦｃフラグメントを有する二重特異性抗体の構造であり、ＦｃとＦｃＲｎの結合作用を保留し、それにより長い半減期を有する。
図１において、（Ａ）は、Ｂ７－Ｈ４単クローン抗体のＢ７－Ｈ４を高発現するＳＫ－ＢＲ－３細胞系におけるインビトロ結合のＦＡＣＳ検出を示し；（Ｂ）は、Ｂ７－Ｈ４単クローン抗体のカニクイザルＢ７－Ｈ４を高発現するＣＨＯ－Ｋ１－カニクイザルＢ７－Ｈ４細胞系におけるインビトロ結合のＦＡＣＳ検出を示し；（Ｃ）は、Ｂ７－Ｈ４単クローン抗体の鼠Ｂ７－Ｈ４を高発現するＣＨＯ－Ｋ１－マウスＢ７－Ｈ４細胞系におけるインビトロ結合のＦＡＣＳ検出を示す。 図２－（Ａ）－（Ｉ）は、４－１ＢＢ単クローン抗体のヒト４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１－ヒト４－１ＢＢ細胞系におけるインビトロ結合のＦＡＣＳ検出を示す。 同上。 同上。 図３－（Ａ）－（Ｈ）は、４－１ＢＢ単クローン抗体のカニクイザル４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１－カニクイザル４－１ＢＢ細胞系におけるインビトロ結合のＦＡＣＳ検出を示す。 同上。 同上。 図４－（Ａ）－（Ｅ）は、４－１ＢＢ単クローン抗体の４－１ＢＢパスを活性化しＴ細胞を誘導し活性化する機能ことを示す。 同上。 図５－（Ａ）－（Ｉ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性分子の構造模式図である。 同上。 同上。 同上。 同上。 図６－（Ａ）－（Ｌ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株におけるインビトロ結合のＦＡＣＳ検出を示す。 同上。 同上。 同上。 図７－（Ａ）－（Ｃ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のカニクイザル４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株におけるインビトロ結合のＦＡＣＳ検出を示す。 図８－（Ａ）－（Ｋ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＢ７－Ｈ４を高発現するＳＫ－ＢＲ－３細胞系におけるインビトロ結合のＦＡＣＳ検出を示す。 同上。 同上。 同上。 図９－（Ａ）－（Ｅ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＢ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３が存在するときにのＴ細胞活性化実験並びにサイトカインＩＦＮ－γの放出を示す。 同上。 図１０－（Ａ）－（Ｎ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＢ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３が存在するときにのＴ細胞活性化実験並びにサイトカインＩＬ－２の放出を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１１－（Ａ）－（Ｂ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＴ細胞に対する活性化がＦｃγＲの存在に依存しないことを示す。 図１２－（Ａ）－（Ｂ）は、腫瘍細胞表面のＢ７－Ｈ４発現量のＦＡＣＳ検出を示す。 図１３－（Ａ）－（Ｈ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体のＴ細胞に対する活性化が特異的にＢ７－Ｈ４の発現に依存することを示す。 同上。 同上。 図１４－（Ａ）－（Ｈ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体のＰＲ００３３３４、ＰＲ００３３３５及びＰＲ００４２８２の血清安定性を示す。 同上。 同上。 図１５－（Ａ）－（Ｃ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体のＰＲ００４２８２とヒト、サル及びマウスの４－１ＢＢとのインビトロ結合を示す。 図１６－（Ａ）－（Ｃ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体のＰＲ００４２８２とヒト、サル及びマウスのＢ７Ｈ４とのインビトロ結合を示す。 図１７は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体のＰＲ００４２８２とＳＫ－ＢＲ－３及びＣＨＯ－Ｋ１／４－１ＢＢとのインビトロ同時結合を示す。 図１８－（Ａ）－（Ｂ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体のＰＲ００４２８２とインビトロ活性化のヒト、サルのＰａｎ Ｔ細胞とのインビトロ結合を示す。 図１９－（Ａ）－（Ｂ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体のＰＲ００４２８２とＢ７ファミリーメンバー或いはＴＮＦＲファミリーの他のメンバーとの交差反応結果を示す。 図２０－（Ａ）－（Ｃ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体のＰＲ００４２８２のＡＤＣＣ効果の結果を示す。 図２１－（Ａ）－（Ｃ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＲ００４２８２の非特異的サイトカインの放出の検出結果を示す。 図２２－（Ａ）－（Ｆ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＲ００３３３４、ＰＲ００３３３５及びＰＲ００４２８２の野生型マウスにおける薬物動態データを示す。 同上。 図２３は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＲ００４２８２の正常サル体内の薬物動態データ（単回投与量）を示す。 図２４－（Ａ）－（Ｂ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＲ００３３３４のＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７／ＣＴ２６－Ｂ７－Ｈ４マウスモデルのなかの抗腫瘍薬効を示す。 図２５－（Ａ）－（Ｂ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＲ００３３３８のＭＤＡ－ＭＢ－４６８異種移植マウスモデルのなかの抗腫瘍薬効を示す。 図２６－（Ａ）－（Ｂ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＲ００４２８２のＯＶＣＡＲ３異種移植マウスモデルのなかの抗腫瘍薬効を示す。 図２７－（Ａ）－（Ｉ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＲ００４２８２のＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７／ＣＴ２６－Ｂ７－Ｈ４マウスモデルのなかの抗腫瘍薬効及び記憶的免疫効果の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 図２８－（Ａ）－（Ｂ）は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＲ００４２８２の抗腫瘍薬効の特異的な結果を示す。
以下、実施例の形態により本発明をさらに説明するが、それにより本発明を前記実施例の範囲に限定するものではない。以下の実施例に具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法と条件に従って、または商品説明書に従って選択する。
本願において、「抗体」という用語は、通常、抗原を結合する部分を含むタンパク質を指し、抗原を結合する部分に任意に抗体と抗原の結合を促進できる立体構造のスキャフォールドまたは骨格部分を採用することができる。典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、またはこれらの両方を含むことができる。例えば、本願における「重鎖抗体」は、ＶＬ領域を含まず、ＶＨ領域のみを含む。ＶＨまたはＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保守的な領域に点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに区分され得る。各ＶＨまたはＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ領域から構成することができ、アミノ基末端からカルボキシル基末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列することができる。重鎖と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の例としては、所望の抗原結合活性を示す限り、全長抗体、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂ）、免疫複合体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体類似体、または融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
本願において、「可変」という用語は、一般に、抗体の可変ドメインの配列のいくつかの部分的変化が強く、それらが様々な特定の抗体の特定の抗原に対する特異的な結合を形成するということを指す。しかし、変異性は、抗体の可変領域全体に均一に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の可変領域の３つのセグメントに集中し、ＣＤＲまたは超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれ、ＦＲが可変領域におけるより高度に保守的な部分である。天然重鎖と軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、大部分はβ－シート構造を採用し、３つのＣＤＲｓによって接続され、ループ接続を形成し、ある場合ではβ－シート構造の一部を形成する。各鎖中のＣＤＲｓは、ＦＲ領域を介して互いに近接し、別の鎖由来のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成し、定常領域は抗体と抗原の結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存細胞毒性などの異なる効果機能を示す。
本願において、「全ヒト由来抗体」という用語は、一般に、ヒトの抗体をコードする遺伝子を遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子欠損動物に全て移し、動物に発現させる抗体を指す。抗体のすべての部分（抗体の可変領域と定常領域を含む）は、ヒト由来の遺伝子によってコードされる。全ヒト由来抗体は、異種抗体による人体への免疫副反応を大幅に減少させることができる。当分野で全ヒト由来抗体を得る方法としては、ファージディスプレイ技術、トランスジェニックマウス技術などがある。
本願において、「核酸」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸を別の核酸配列と機能関係に置く場合、核酸は「効果的に結合されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコーディングシーケンスの転写に影響を与える場合、プロモーターまたはエンハンサーは、コーディングシーケンスに効果的に接続される。
本願において、「特異的に結合する」という用語は、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープと結合することを意味し、且つ当該結合には抗原結合ドメインとエピトープとの間のある程度の相補性が必要である。この定義によれば、抗体がランダムに関連性のないエピトープと結合することより、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合しやすい場合は、当該抗原に「特異的に結合する」と呼ばれる。
本願において、「Ｆａｂ」という用語は、一般に、抗体の重鎖可変領域ＶＨ、軽鎖可変領域ＶＬ、重鎖定常領域ドメインＣＨ１及び軽鎖定常領域ＣＬを含む通常の抗体（例えばＩｇＧ）中の抗原と結合する部分を指す。通常の抗体では、ＶＨのＣ端はＣＨ１のＮ端に結合して重鎖Ｆｄフラグメントを形成し、ＶＬのＣ端はＣＬのＮ端に結合して軽鎖を形成し、ＣＨ１のＣ端はさらに重鎖のヒンジ領域とその他の定常領域ドメインに結合して重鎖を形成する。ある実施形態では、「Ｆａｂ」はまたＦａｂの変異体構造を指す。例えば、ある実施形態では、ＶＨのＣ端とＣＬのＮ端が結合して１つのポリペプチド鎖を形成し、ＶＬのＣ端とＣＨ１のＮ端が結合して別のポリペプチド鎖を形成し、Ｆａｂ（ｃｒｏｓｓ ＶＨ／ＶＬ）の構造を形成する；ある実施形態では、ＦａｂのＣＨ１はヒンジ領域に結合されず、ＣＬのＣ端は重鎖のヒンジ領域に結合され、Ｆａｂ（ｃｒｏｓｓ Ｆｄ／ＬＣ）の構造を形成する。
本願において、「ＶＨ」という用語は、通常、抗体の重鎖可変領域ＶＨドメインを指し、すなわち、ヒトまたは他の動物の通常の抗体（Ｈ２Ｌ２構造）の重鎖可変領域ＶＨであってもよく、ラクダ科などの動物の重鎖抗体（ＨＣＡｂ構造）の重鎖可変領域ＶＨＨであってもよく、Ｈａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂトランスジェニックマウスを用いて産生された全ヒト由来重鎖抗体（ＨＣＡｂ構造）の重鎖可変領域ＶＨであってもよい。
本分野では、配列可変性に基づくＫａｂａｔ定義規則（Ｋａｂａｔら、免疫学的なタンパク質配列、第５版、米国国立衛生研究院、ベセスダ、メリーランド州（１９９１）を参照）、および構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ定義規則（Ａ１－Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－４８１９９７を参照）などの様々な方法で、抗体のＣＤＲを定義することができる。本願はまた、Ｋａｂａｔ定義及びＣｈｏｔｈｉａ定義を含むＣｏｍｂｉｎｅｄ定義規則を用いて可変ドメイン配列及び全長抗体配列中のアミノ酸残基を決定することができる（表１）。本発明では、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に基づいて配列を決定する。
ここで、Ｌａａ－Ｌｂｂは、抗体軽鎖のＮ末端から、第ａａ位（Ｃｈｏｔｈｉａコード規則）から第ｂｂ位（Ｃｈｏｔｈｉａコード規則）までのアミノ酸配列を指すことができ、Ｈａａ－Ｈｂｂは、抗体重鎖のＮ末端から、第ａａ位（Ｃｈｏｔｈｉａコード規則）から第ｂｂ位（Ｃｈｏｔｈｉａコード規則）までのアミノ酸配列を指すことができる。例えば、Ｌ２４－Ｌ３４は、抗体軽鎖のＮ末端からＣｈｏｔｈｉａコード規則に基づく第２４位から第３４位までのアミノ酸配列を指すことができ、Ｈ２６－Ｈ３２は、抗体重鎖Ｎ末端からＣｈｏｔｈｉａコード規則に基づく第２６位から第３２位までのアミノ酸配列を指すことができる。本発明は、Ｃｈｏｔｈｉａコード規則を用いて抗体のＣＤＲを定義する。
抗体Ｆｃドメインに媒介されるエフェクター機能、例えばＡＤＣＣとＣＤＣにも、非常に重要な生物学的機能があり、異なるＩｇＧサブタイプには異なるＡＤＣＣまたはＣＤＣ機能があり、例えばＩｇＧ１とＩｇＧ３には強いＡＤＣＣとＣＤＣ作用があり、ＩｇＧ２とＩｇＧ４は相対的に弱い。また、アミノ酸突然変異や修飾によるＦｃとＦｃ受容体の結合能の変化によっても、Ｆｃの本来のエフェクター機能を調節することができる。例えば、ＩｇＧ１における「ＬＡＬＡ」二重突然変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）との親和性を顕著に低下し、さらにＡＤＣＣ作用を低下することができる。また、Ｐ３２９Ｇ突然変異は、複数種のＦｃγ受容体との結合を顕著に低下することができる（Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ Ｔ、Ｈｅｒｔｅｒ Ｓ、Ｋｏｌｌｅｒ ＣＦ、Ｇｒａｕ－Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｓ、Ｓｔｅｉｎｈａｒｔ Ｖ、Ｓｐｉｃｋ Ｃ、Ｋｕｂｂｉｅｓ Ｍ、Ｋｌｅｉｎ Ｃ、Ｕｍａｎａ Ｐ、Ｍｏｓｓｎｅｒ Ｅ．Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＩｇＧ４ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｂｏｌｉｓｈｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥｎｇＤｅｓ Ｓｅｌ．２０１６ Ｏｃｔ、２９（１０）：４５７－４６６．ｄｏｉ：１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎｅ／ｇｚｗ ０４０．Ｅｕｂ ２０１６ Ａｕｇ ２９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２７５７８８８９を参照）。本願では、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体とＦｃγ受容体の結合を減らすために、これらの抗体のＦｃには「ＬＡＬＡ」二重突然変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）または「ＬＡＬＡＰＧ」三重突然変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）が導入された。
実施例１．抗体の配列分析、発現精製、及び理化学的特性評価分析
１．１ 抗体の配列分析及び最適化
抗体の重鎖可変ドメイン配列は、染色体上の重鎖遺伝子群の生殖系列遺伝子Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子フラグメントの遺伝子再配列及び体細胞の高頻度突然変異などの事象に由来し；軽鎖可変ドメイン配列は、軽鎖遺伝子群の生殖系列遺伝子Ｖ、Ｊ遺伝子フラグメントの遺伝子再配列及び体細胞の高頻度突然変異などの事象に由来する。遺伝子再配列と体細胞の高頻度突然変異は、抗体の多様性を増加させる主要な要素である。同じ生殖系列Ｖ遺伝子フラグメントに由来する抗体も異なる配列を産生する可能性があるが、全体的に類似性が高い。例えばＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉ）またはＮＣＢＩ／ＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）などの計算方法によって、抗体の可変ドメイン配列から遺伝子再配列が発生した場合に可能な生殖系列遺伝子フラグメントを推定することができる。
タンパク質またはポリペプチドアミノ酸鎖は、細胞中で翻訳合成された後、翻訳後修飾（ＰＴＭ）と呼ばれる化学修飾を導入することがある。抗体にとって、いくつかのＰＴＭの部位が非常に保守的であり、例えば、ヒトのＩｇＧ１抗体の定常ドメインの第２９７位（ＥＵ番号）の保守的アミノ酸アスパラギンＡｓｎは、通常グリコシル化修飾を起こして糖鎖を形成し、この糖鎖構造は、抗体構造及び関連の効果機能にとって極めて重要である。しかし、抗体の可変ドメイン、特にＣＤＲなどの抗原結合ドメインにＰＴＭが存在する場合、これらのＰＴＭの存在は、抗原結合に大きな影響を与える可能性があり、抗体の物理化学的性質にも変化をもたらす可能性がある。例えば、グリコシル化、脱アミド、異性化、酸化などは、いずれかも抗体分子の不安定性または異質性を増加させ、それによって抗体開発の難度とリスクを増加させる可能性がある。したがって、いくつかの潜在的なＰＴＭを回避することは、治療抗体の開発にとって非常に重要である。経験の蓄積に伴い、いくつかのＰＴＭがアミノ酸配列の組成、特に隣接するアミノ酸組成の「パターン」と高度に関連していることが発見され、これによりタンパク質の一級アミノ酸配列から潜在的なＰＴＭを予測することができる。例えば、Ｎ－ｘ－Ｓ／Ｔ（第１位はアスパラギン、第２位はプロリン以外の任意のアミノ酸、第３位はセリンまたはトレオニン）の配列パターンは、Ｎ－結合グリコシル化部位を予測する。ＰＴＭを引き起こすアミノ酸配列パターンは、生殖系列遺伝子配列に由来する可能性があり、例えばヒト生殖系列遺伝子フラグメントＩＧＨＶ３－３３は、ＦＲ３領域に天然にグリコシル化パターンＮＳＴが存在し；体細胞の高頻度突然変異に由来する可能性もある。例えば、ＮＧＳまたはＮＬＴはグリコシル化部位であり、ＮＳは脱アミド部位であり、ＤＧはアスパラギンの異性化を引き起こす可能性がある。
アミノ酸突然変異によってＰＴＭのアミノ酸配列パターンを破壊し、さらに特定のＰＴＭの形成を低減または除去することができる。抗体配列とＰＴＭ配列パターンによって、異なる変異設計方法がある。１つの方法は、ＮＳモードにおけるＮまたはＳなどの「ホットスポット」アミノ酸を類似の物理化学的性質を持つアミノ酸（ＮをＱに突然変異させるなど）に置換することである。ＰＴＭ配列パターンが体細胞の高頻度変異に由来し、生殖系列遺伝子配列に存在しない場合、別の方法は、当該配列パターンを対応する生殖系列遺伝子配列に置換することである。実際の操作では、同じＰＴＭシーケンスパターンに対して複数の突然変異設計方法を採用することができる。
１．２ 抗体の発現及び精製
本実施例は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３またはチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯおよびその誘導体）、瞬時トランスフェクション発現およびアフィニティー捕獲分離などの技術を用いて抗体を製造する一般的な方法を紹介した。本方法は、Ｆｃ領域を含む標的抗体に適用する。標的抗体は、１つまたは複数のタンパク質ポリペプチド鎖から構成することができ、１つまたは複数の発現プラスミドに由来することができる。
抗体ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコドン最適化法によりヌクレオチド配列に変換し；コードされたヌクレオチド配列を合成し、宿主細胞に適合する発現ベクター上にクローニングする。抗体ポリペプチド鎖をコードするプラスミドを哺乳動物宿主細胞に特定の割合で同時にトランスフェクションし、従来の組換えタンパク質発現と精製技術を利用して、正確な折り畳みとポリペプチド鎖組立を有する組換え抗体を得ることができる。具体的には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ，＃Ｒ７９００７）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） Ｆ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｔｈｅｒｍｏ，＃Ａ１３８３５０４）で拡大培養した。瞬時トランスフェクション開始前に、細胞濃度を６～８×１０５細胞／ｍｌに調整し、３７°Ｃ、８％ＣＯ２シェーカー中で２４時間培養し、細胞濃度は１．２×１０６細胞／ｍｌである。培養した細胞を３０ｍｌ用意する。抗体ポリペプチド鎖をコードするプラスミドを一定の割合で混合し、合計３０μｇのプラスミド（プラスミドと細胞の割合は１μｇ：１ｍｌ）を１．５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ減血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ，＃３１９８５０８８）に溶解し、０．２２μｍ濾過膜で濾過除菌した。さらに１．５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭを取り１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃２３９６６－２）１２０μｌに溶解し、５分間静置した。ＰＥＩをゆっくりとプラスミドに加え、室温で１０分間インキュベートし、培養瓶を揺らしながらプラスミドＰＥＩ混合溶液をゆっくり滴下し、３７°Ｃ、８％ＣＯ２シェーカーで５日間培養した。５日後に細胞生存率を観測した。培養物を集め、回転数３３００ｇで１０分間遠心分離した後、上清を取り；その後、上清を高速遠心分離して不純物を除去した。ＰＢＳ ｐＨ７．４緩衝液でＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃７１－５０２０－９１）を含む重力カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，＃７３１１５５０）を平衡化させ、２－５倍のカラム体積で洗浄する。上清サンプルをカラムに通し；カラム体積５～１０倍のＰＢＳ緩衝液でカラムを洗浄し、ｐＨ３．５の０．１Ｍグリシンで目的のタンパク質を溶出し、その後ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌで中性に調整し、最後に限外ろ過管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＵＦＣ ９０１０２４）でＰＢＳ緩衝液または他の成分を含む緩衝液に濃縮交換し、精製された組換え抗体溶液を得た。最後にＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標） Ｏｎｅ）で濃度を測定し、分割し、予備に保存する。
１．３ ＳＥＣ－ＨＰＬＣによるタンパク質純度及び多量体の分析
本実施例は、分析型分子サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、タンパク質サンプルの純度及び量体形態を分析した。分析型クロマトグラフィーカラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＃０８５４１，５μｍ，７．８ ｍｍ×３０ ｃｍ）を高圧液体クロマトグラフィーＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）に接続し、ＰＢＳ緩衝液を用いて室温で少なくとも１時間平衡させる。適量のタンパク質サンプル（少なくとも１０μｇ）を０．２２μｍ濾過膜で濾過してシステムに注入し、ＨＰＬＣプログラムを設定する：ＰＢＳ緩衝液でサンプルを１．０ｍｌ／分の流速でクロマトグラフィーカラムを流し、最長時間は２５分である。ＨＰＬＣは分析報告書を生成し、サンプル内の異なる分子サイズの成分の滞留時間を報告する。
１．４ ＤＳＦによるタンパク質分子の熱安定性の測定
示差走査蛍光法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＦ）は、タンパク質の熱安定性を測定するための一般的な高スループット法である。リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置を用いて、折り畳み解除されたタンパク質分子と結合した染料の蛍光強度の変化を監視することにより、タンパク質の変性の過程を反映し、タンパク質分子の熱安定性を反映する。本実施例は、ＤＳＦ法を用いてタンパク質分子の熱変性温度（Ｔｍ）を測定した。１０ μｇタンパク質を９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ，＃ＡＢ－０７００／Ｗ）に添加し、続いて２μｌ １００×希釈染料ＳＹＰＲＯＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２００８１３８）を添加し、続いて最終体積がウェルあたり４０μｌになるように緩衝液を添加した。ＰＣＲプレートを密封し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ ９６ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）に置き、２５°Ｃで５分間インキュベートした後、０．２°Ｃ／０．２分の勾配で２５°Ｃから９５°Ｃに徐々に昇温し、試験終了時に温度を２５°Ｃに下げた。ＦＲＥＴスキャンモードを使用し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアを使用してデータ分析を行い、サンプルのＴｍを算出した。
実施例２．抗Ｂ７－Ｈ４全ヒト由来抗体の獲得
Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウス（Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＢＶ）は、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを担持するトランスジェニックマウスであり、産生された抗体が完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。
可溶性組換えヒトＢ７－Ｈ４－ＥＣＤ－ｍＦｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，＃１０７３８－Ｈ０５Ｈ）を用いてＨａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスを複数ラウンドの免疫し、またはヒトＢ７－Ｈ４を過剰発現したＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いてｍＣＤ４０Ｌをトランスフェクションした後、免疫アジュバントと混合して免疫原試薬を形成した後、Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスを複数ラウンドの免疫した。
マウス血清中のＢ７－Ｈ４特異的抗体価が一定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出した。ハイブリドーマ融合技術、Ｂ細胞クローニング技術及びファージライブラリ技術によりスクリーニングを行い、スクリーニングにより得られたモノクローナル抗体をさらに鑑定し、ヒトＢ７－Ｈ４への結合能、カニクイザルＢ７－Ｈ４への結合能などのパラメータに基づいて、２つのクローン８０Ｃ８－２Ｅ９と１０２５＿Ｂ－１Ｈ１１が選択された。抗体分子の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を、従来の配列決定手段て得る。その後、候補抗体分子の配列分析と最適化を行い、数個の変異体配列を得た。抗体のＶＬおよびＶＨ配列を対応するヒトのκ軽鎖定常領域及びＩｇＧ１重鎖定常領域配列と融合発現し、組換え全ヒト由来抗体分子を得た。
本例における抗Ｂ７－Ｈ４の組換え全ヒト由来ＩｇＧ抗体を表２に示す。
また、特許照会によると、（特許ＷＯ２０１６０４０７２４Ａ１から）、１Ｄ１１．ｖ１．９ｖａｒＣ２とも呼ばれ、コントロール抗体１を設計し、後続の実験でコントロールとして：
２．１ 抗ヒトＢ７－Ｈ４ Ｈ２Ｌ２単クローン抗体の細胞レベルでの結合能のＦＡＣＳ検出
本実施例は、抗ヒトＢ７－Ｈ４のＨ２Ｌ２単クローン抗体のヒト／カニクイザル／マウスＢ７－Ｈ４とのインビトロ結合活性を研究するためのものである。カニクイザルＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ Ｂ７－Ｈ４、ＨＡＲＢＯＵＲ ＢＩＯＭＥＤ製）、マウスＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｍ Ｂ７－Ｈ４、ＨＡＲＢＯＵＲ ＢＩＯＭＥＤ製）、及びヒトＢ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－３０）を使用し、細胞レベルでの抗体結合実験を行った。簡単に言えば、ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ Ｂ７－Ｈ４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１／ｍ Ｂ７－Ｈ４細胞またはＳＫ－ＢＲ－３細胞を消化し、２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで再懸濁した。細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種した後、終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を１００μＬ／ウェルで加えた。細胞を４°Ｃに置き、光を避けて２時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルの予冷した２％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ，＃１０９－５４５－０６，１：５００希釈）、４°Ｃで、光を避けて１時間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの予冷した２％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μＬ／ウェルの予冷した２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで細胞を再懸濁し、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ ３０００フローサイトメーターを用いて蛍光発光シグナル値を読み取った。
図１－（Ａ）に示すように、Ｂ７－Ｈ４を高発現するＳＫ－ＢＲ－３細胞系におけるＢ７－Ｈ４抗体のインビトロ結合；ＰＲ００１４７６及びＰＲ００２４０８とＳＫ－ＢＲ－３細胞系との結合活性は、コントロール抗体１より優れている。
図１－（Ｂ）に示すように、カニクイザルＢ７－Ｈ４を高発現するＣＨＯ－Ｋ１－カニクイザルＢ７－Ｈ４細胞系におけるＢ７－Ｈ４抗体のインビトロ結合；ＰＲ００１４７６及びＰＲ００２４０８とＣＨＯ－Ｋ１－カニクイザルＢ７－Ｈ４細胞系の結合活性は、コントロール抗体１より優れている。
図１－（Ｃ）に示すように、マウスＢ７－Ｈ４を高発現するＣＨＯ－Ｋ１－マウスＢ７－Ｈ４細胞系におけるＢ７－Ｈ４抗体のインビトロ結合；ＰＲ００２４１０とＣＨＯ－Ｋ１－マウスＢ７－Ｈ４細胞系の結合活性は、コントロール抗体１と有意差がなかった
実施例３．４－１ＢＢ全ヒト由来抗体の獲得
３．１ 抗４－１ＢＢ全ヒト由来ＨＣＡｂ抗体の獲得
Ｈａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂマウス（Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＢＶ、ＷＯ２０１０／１０９１６５Ａ２）は、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、従来のＩｇＧ抗体の半分の大きさしかない重鎖のみの抗体を産生することができる。産生された抗体は、ヒトの抗体重鎖可変ドメインとマウスＦｃ定常ドメインのみを有する。
Ｈａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂマウスは、可溶性組換えヒト４－１ＢＢ－Ｆｃ融合タンパク質（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ）またはヒト４－１ＢＢを過剰発現したＮＩＨ－３Ｔ３細胞（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ）を用いて複数ラウンドの免疫された。マウス血清中の４－１ＢＢ特異的抗体価が一定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出してＢ細胞を分離し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒを用いてＣＤ１３８陽性の形質細胞とヒト４－１ＢＢ抗原陽性のＢ細胞群を選別した。通常の分子生物学的手段を用いて形質細胞からヒトＶＨ遺伝子を増幅し、増幅されたヒトＶＨ遺伝子フラグメントを、ヒトＩｇＧ１抗体重鎖Ｆｃ領域配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドｐＣＡＧベクターに構築した。プラスミドトランスフェクション哺乳動物宿主細胞（例えばヒト胎児腎細胞ＨＥＫ ２９３）を発現させ、全ヒト由来ＨＣＡｂ抗体上清を得た。ＦＡＣＳを用いてＨＣＡｂ抗体上清とヒト４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ４－１ＢＢの結合を試験し、陽性ＨＣＡｂ抗体を同定した。これらのＨＣＡｂ抗体をさらに同定し、ヒト４－１ＢＢに対する結合能、カニクイザル４－１ＢＢ結合能、Ｔ細胞活性化能などのパラメータに基づいて、好ましくはいくつかの候補ＨＣＡｂ抗体分子を選択した。その後、候補ＨＣＡｂ抗体分子の配列分析と最適化を行い、数個の変異体配列を得た。ＨＣＡｂ抗体のＶＨ配列とヒトのＩｇＧ１重鎖Ｆｃ配列を融合発現し、全ヒト由来組換えＨＣＡｂ抗体分子を得た。ここで、ＰＲ００４４６９はＰＲ００１８３８のＰＴＭの変異体であり、ＰＲ００７３８１はＰＲ００４４６９の生殖系列化変異体であり、具体的な変異部位を表５に示した。
３．２ 抗４－１ＢＢ全ヒト由来Ｈ２Ｌ２抗体の獲得
Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウス（Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＢＶ）は、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを担持するトランスジェニックマウスであり、産生された抗体が完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスに可溶性組換えヒト４－１ＢＢ－Ｆｃ融合タンパク質を用いて複数ラウンドの免疫を行った。マウス血清中の４－１ＢＢ特異的抗体価が一定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞系と融合してハイブリドーマ細胞を得た、ハイブリドーマ細胞を複数ラウンドのスクリーニングおよびクローニングした後、抗－４－１ＢＢモノクローナル抗体分子を発現するハイブリドーマ細胞株を単離した。抗体分子可変ドメインをコードするヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を、従来のハイブリドーマ配列決定手段を用いて得た。その後、候補抗体分子の配列分析と最適化を行い、数個の変異体配列を得た。抗体のＶＬおよびＶＨ配列を対応するヒトのκ軽鎖定常領域とＩｇＧ１重鎖定常領域配列に融合発現し、組換え全ヒト由来抗体分子を得た。
また、特許照会によると、コントロール抗体を設計し、後続の実験ではコントロールとして：
３．３ 抗ヒト４－１ＢＢ単クローン抗体の細胞レベルでの結合能のＦＡＣＳ検出
本実施例は、抗ヒト４－１ＢＢのＨＣＡｂ及びＨ２Ｌ２単クローン抗体のヒトとカニクイザル４－１ＢＢへのインビトロ結合活性を研究するためのものである。ヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ ４－１ＢＢ、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）、カニクイザル４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏ ４－１ＢＢ、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）を使用して細胞レベルでの抗体結合実験を行った。簡単に言えば、細胞ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ ４－１ＢＢとＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏ ４－１ＢＢ細胞を消化し、ＤＭＥＭ完全培地で再懸濁し、細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃：３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種した後、終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を１００μＬ／ウェルで加えた。細胞を４°Ｃに置き、光を避けて１時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルの予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ，＃：１０９－５４５－０６，１：５００希釈）、４°Ｃで、光を避けて３０分間インキュベートした。細胞を１００μＬ／ウェルの予冷したＰＢＳで２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μＬ／ウェルの予冷したＰＢＳで細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを用いて蛍光発光シグナル値を読み取った。
図２－（Ａ）－（Ｉ）：４－１ＢＢ抗体のヒト４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１－ヒト４－１ＢＢ細胞系におけるインビトロ結合；
図３－（Ａ）－（Ｈ）：４－１ＢＢ抗体のカニクイザル４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１－カニクイザル４－１ＢＢ細胞系におけるインビトロ結合。
図２－（Ａ）－（Ｉ）に示すように、本発明の抗４－１ＢＢ抗体は、いずれもヒト４－１ＢＢに結合することができ、検出された抗体結合能が抗体濃度と正の相関関係で増加する。これらの抗体は、参照抗体（ＵｒｅｌｕｍａｂおよびＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ）と比較して、より低い濃度でヒト４－１ＢＢにより敏感に結合することができ、参照抗体ＵｔｏｍｉｌｕｍａｂおよびＵｒｅｌｕｍａｂのＥＣ５０に相当する。
図３－（Ａ）－（Ｈ）に示すように、本発明の抗４－１ＢＢの抗体は、いずれもサル４－１ＢＢに結合することができ、検出された抗体結合能が抗体濃度と正の相関関係で増加する。これらの抗体は、参照抗体Ｔａｂ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）と比較して、より低い濃度でサル４－１ＢＢにより敏感に結合することができ、参照抗体ＵｔｏｍｉｌｕｍａｂのＥＣ５０と同等またはより優れている。一方、参照抗体Ｕｒｅｌｕｍａｂは、サル４－１ＢＢと交差結合する活性を有しない。
３．４ 抗原結合タンパク質はインビトロで４－１ＢＢパスを活性化することができる
１０μｇ／ｍｌのマイトマイシン（ＲＵＩＴＡＩＢＩＯ、＃１０１０７４０９００１）でヒトＣＤ３２ｂを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、＃Ｍ００６００）を３７°Ｃで３０分間処理した。その後、１０％ＦＢＳ含有Ｆ－１２Ｋ培養液で４回洗浄した。処理した細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり１．５×１０４個入れ、３７°Ｃの保温箱で一晩培養した。翌日、ＭＡＣＳキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９６－５３５）を用いてヒトＰＢＭＣからヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離した。まず細胞数を決定し、その後、細胞数に応じて対応する量のＭＡＣＳ緩衝液とＰａｎ－Ｔ細胞ビオチン抗体を加えてよく混合し、４°Ｃで５分間静置した。次に、対応する量のマイクロ磁気ビーズを加え、４°Ｃ１０分間静置した。ＬＳカラムを通過したのはＣＤ３陽性Ｔ細胞であった。前日の９６ウェルプレートの培養液を洗い流し、精製Ｔ細胞をウェルあたり１×１０５個添加した。次に、対応する濃度の４－１ＢＢ抗体またはコントロール抗体を加え、ＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃１６－００３７－８５）を加え、最終濃度が０．３μｇ／ｍｌになるようにした。３７°Ｃの保温箱で７２時間培養した。７２時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃８８－７３１６－８８）を用いてＩＦＮ－γの含有量を検出した。９６平底プレートにコーティング抗体を加え、４°Ｃで一晩。翌日、ＥＬＩＳＡ 緩衝液を加え、室温で１時間。回収した上清を加え、室温で２時間培養した。プレートを２回洗浄し、検出抗体を加え、室温で１時間。プレートを２回洗浄し、ＨＲＰ－ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした。次にＴＭＢ基質を添加し、続いてＥＬＩＳＡ停止液（ＢＢＩ、＃Ｅ６６１００６－０２００）を添加した。マイクロプレートリーダー （ＰｅｒｋｉｎＥｌｅｍｅｒ、＃Ｅｎｓｐｉｒｅ）で４５０ｎｍと５７０ｎｍの吸光値（ＯＤ４５０～ＯＤ５７０）を読み取り、ＩＦＮ－γの濃度を算出した。
その結果を図４－（Ａ）－（Ｅ）に示す：４－１ＢＢ抗体は、４－１ＢＢパスを活性化し、Ｔ細胞の活性化を誘導する機能を有する。ＰＲ００１７５８、ＰＲ００１７６０、ＰＲ００１７６４、ＰＲ００１７７１、ＰＲ００１７７４、ＰＲ００１７８０、ＰＲ００１７８１、ＰＲ００１８３０、ＰＲ００１８３３、ＰＲ００１８３６、ＰＲ００１８３８、ＰＲ００１８４０、ＰＲ０００４４８活性化作用は、いずれもｕｔｏｍｉｌｕｍａｂより強く、ＩＦＮ－γの信号がｕｔｏｍｉｌｕｍａｂよりも高いことが示した。
実施例４．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の作製
実施例２から選択された抗Ｂ７－Ｈ４抗体と、実施例３から選択された抗４－１ＢＢ抗体とを組み合わせて二重特異性抗体を製造するために使用し、一方の端部が腫瘍細胞表面に特異的に発現されたＢ７－Ｈ４を識別し、他方の端部がＴ細胞上の４－１ＢＢ分子を結合することができる２つの標的を同時に結合することができる。Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体分子が腫瘍細胞表面に結合した後、腫瘍細胞近傍のＴ細胞を募集して活性化し、腫瘍細胞を殺すことができる。
本実施例で作製したＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、複数の分子構造を含む：
図７－（Ａ）－（Ｉ）は、本発明の二重特異性分子の構造模式図である。
４．１ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ 四価対称構造の二重特異性抗体を構築する
抗Ｂ７－Ｈ４のＨ２Ｌ２抗体と抗４－１ＢＢのＨ２Ｌ２抗体を用いてＩｇＧ－ｓｃＦｖ四価対称構造の二重特異性抗体を構築した。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ ４価対称構造（図５－（Ａ）に示すように）の結合タンパク質は２つのポリペプチド鎖を含む：短鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシ末端までＶＬ＿Ａ－ＣＬを含むポリペプチド鎖１；長鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシル基末端までＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ１－ＶＨ＿ＢＬ２－ＶＬ＿Ｂを含むポリペプチド鎖２。ｈは、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域または誘導配列である。ポリペプチド鎖２の接続ペプチドＬ１及び接続ペプチドＬ２は、表８に列挙された配列であってもよい。
４．２ ＩｇＧ－ＶＨ 四価対称構造の二重特異性抗体を構築する
抗Ｂ７－Ｈ４のＨ２Ｌ２抗体と抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体を用いてＩｇＧ－ＶＨ 四価対称構造の二重特異性抗体を構築した。ＩｇＧ－ＶＨ 四価対称構造（図５－（Ｂ）に示すように）の結合タンパク質は２つのポリペプチド鎖を含む：短鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシ末端までＶＬ＿Ａ－ＣＬを含むポリペプチド鎖１；長鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシル基末端までＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ－ＶＨ＿Ｂを含むポリペプチド鎖２。ｈは、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域または誘導配列である。一実施形態では、ポリペプチド鎖２のＣＨ３はＶＨ＿Ｂと直接融合結合している、すなわちＬの長さは０である。別の実施形態では、ポリペプチド鎖２のＣＨ３は、接続ペプチドＬを介してＶＨ＿Ｂに連結され；Ｌは、表８に列挙された配列であってもよい。
４．３ ＩｇＧ－ＶＨ－ＶＨ 六価対称構造の二重特異性抗体を構築する
抗Ｂ７－Ｈ４のＨ２Ｌ２抗体と抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体を用いてＩｇＧ－ＶＨ－ＶＨ 六価対称構造の二重特異性抗体を構築した。ＩｇＧ－ＶＨ－ＶＨ六価対称構造（図５－（Ｃ）に示すように）の結合タンパク質は２つのポリペプチド鎖を含む：短鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシ末端までＶＬ＿Ａ－ＣＬを含むポリペプチド鎖１；長鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシル基末端までＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ１－ＶＨ＿Ｂ－Ｌ２－ＶＨ＿Ｂを含むポリペプチド鎖２。ｈは、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域または誘導配列である。一実施形態では、ポリペプチド鎖２のＣＨ３はＶＨ＿Ｂと直接融合結合している、すなわちＬの長さは０である。別の実施形態では、ポリペプチド鎖２の接続ペプチドＬ１及びＬ２は、表８に列挙された配列であってもよい。
４．４ Ｆａｂ－ＨＣＡｂ構造の二重特異性抗体分子を構築する
抗Ｂ７－Ｈ４のＨ２Ｌ２抗体と抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体を用いてＦａｂ－ＨＣＡｂ対称構造の二重特異性抗体を構築し、２種類の異なる構造のＦａｂ（ＣＬ）－ＶＨ－Ｆｃ（図５－（Ｄ）に示すように）、Ｆａｂ（ＣＨ）－ＶＨ－Ｆｃ（図５－（Ｅ）に示すように）を含む。Ｆａｂ（ＣＬ）－ＶＨ－Ｆｃの結合タンパク質は２つのポリペプチド鎖を含む：短鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシ末端までＶＨ＿Ａ－ＣＨ１を含むポリペプチド鎖１；長鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシル基末端までＶＬ＿Ａ－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ＿Ｂ－Ｌ２－ＣＨ２－ＣＨ３を含むポリペプチド鎖２。ポリペプチド鎖２の接続ペプチドＬ１及びＬ２は、表８に列挙された配列であってもよい。Ｆａｂ（ＣＨ）－ＶＨ－Ｆｃの結合タンパク質は２つのポリペプチド鎖を含む：短鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシ末端までＶＬ＿Ａ－ＣＬを含むポリペプチド鎖１；長鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシル基末端までＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ＿Ｂ－Ｌ２－ＣＨ２－ＣＨ３を含むポリペプチド鎖２。ポリペプチド鎖２の接続ペプチドＬ１及びＬ２は、表８に列挙された配列であってもよい。
４．５ Ｆａｂ－Ｆｃ－ＶＨ（Ｎ） 非対称構造を構築する
抗Ｂ７－Ｈ４のＨ２Ｌ２抗体と抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体を用いてＦａｂ－Ｆｃ－ＶＨ（Ｎ）非対称構造の二重特異性抗体を構築した。Ｆａｂ－Ｆｃ－ＶＨ（Ｎ）非対称構造（図５－（Ｆ）（Ｇ）（Ｈ）に示すように）の結合タンパク質は３つのポリペプチド鎖を含む：短鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシ末端までＶＬ＿Ａ－ＣＬを含むポリペプチド鎖１；長鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシル基末端までＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３を含むポリペプチド鎖２；アミノ基末端からカルボキシ末端までＶＨ＿Ｂ－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３を含むポリペプチド鎖３、又は、アミノ基末端からカルボキシ末端までＶＨ＿Ｂ－Ｌ－ＶＨ＿Ｂ－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３を含むポリペプチド鎖３、又は、アミノ基末端からカルボキシ末端までＶＨ＿Ｂ－Ｌ１－ＶＨ＿Ｂ－Ｌ２－ＶＨ＿Ｂ－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３を含むポリペプチド鎖３。ｈは、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域または誘導配列である。ポリペプチド鎖３の接続ペプチドＬ１及びＬ２は、表８に列挙された配列であってもよい。
ＷＯ２００９０８０２５１及びＷＯ２００９０８０２５２に記載されているように、ミスマッチを有する重鎖（例えば、抗４－１ＢＢ抗体の２本の重鎖又は抗Ｂ７－Ｈ４の２本の重鎖のミスマッチ）の副生成物の形成を最小化するために、「ｋｎｏｂ－ｈｏｌｅ」変異および操作されたジスルフィド結合を有する、突然変異のヘテロダイマーＦｃ領域が使用された。
４．６ Ｆａｂ－ＶＨ－Ｆｃ－ＶＨ対称構造を構築する
抗Ｂ７－Ｈ４のＨ２Ｌ２抗体と抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体を用いてＦａｂ－ＶＨ－Ｆｃ－ＶＨ対称構造の二重特異性抗体を構築した。Ｆａｂ－ＶＨ－Ｆｃ－ＶＨ対称構造（図５－（Ｉ）に示すように）の結合タンパク質は２つのポリペプチド鎖を含む：短鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシ末端までＶＬ＿Ａ－ＣＬを含むポリペプチド鎖１；長鎖とも呼ばれ、アミノ基末端からカルボキシル基末端までＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ＿Ｂ－ＣＨ１－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨＢを含むポリペプチド鎖２。ｈは、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域または誘導配列である。ポリペプチド鎖３の接続ペプチドＬ１及びＬ２は、表８に列挙された配列であってもよい。表１１－（Ｂ）のなかのＰＲ００７３７９に係るＰＲ００２４０８（Ｈ：ｇｍ）は、ＰＲ００２４０８のＣＤＲと同様であり、可変領域ＶＨのＦＲ２は２つの突然変異を有し、該当２つの突然変異がＴ６９Ｉ、Ｅ１０１Ｇである。
本発明で得られた二重抗体分子のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を以下の配列表に示す。
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗原ドメインのＣＤＲ配列番号を下記の表に示し、表１０においては、１＃番号はＢ７－Ｈ４を結合する抗原ドメインであり、２＃番号は４－１ＢＢを結合する抗原ドメインである。
表１１－（Ａ）－（Ｆ）は、本発明の二重特異性抗体分子構造の情報である。
表１２－（Ａ）－（Ｆ）は、本発明の二重特異性抗体のタンパク質発現及び物理化学的性質である。
実施例５．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のヒト及びカニクイザル４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株におけるインビトロ結合のＦＡＣＳ検出
本実施例は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の４－１ＢＢアームのヒトおよびカニクイザル４－１ＢＢへのインビトロ結合活性を研究するためのものである。ヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，＃Ｍ００５３８）とカニクイザル４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ ４－１ＢＢ，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，＃Ｍ００５６９）を用いて細胞レベルでの抗体結合実験を行った。簡単に言えば、細胞ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢとＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ ４－１ＢＢ細胞を消化し、Ｆ１２Ｋ完全培地で再懸濁し、ＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＳで細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍｌに調整した。９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種した後、終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を１００μＬ／ウェルで加えた。細胞を４°Ｃに置き、光を避けて１時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルの予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃：１０９－５４５－０６，１：５００希釈）または（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７，Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃：１０９－６０５－０９８，１：１０００希釈）、４°Ｃで、光を避けて３０分間インキュベートした。細胞を１００μＬ／ウェルの予冷したＰＢＳで２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μＬ／ウェルの予冷したＰＢＳを用いて細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩまたはＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅシリーズフローサイトメーターを用いて蛍光発光シグナル値を読み取った。。
図６－（Ａ）－（Ｌ）：Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株におけるインビトロ結合；
図７－（Ａ）－（Ｃ）：Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のカニクイザル４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株におけるインビトロ結合；
図６－（Ａ）－（Ｌ）に示すように、本実例におけるＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、いずれもヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞に特異的に結合している。ＰＲ００２７８９、ＰＲ００２９７２、ＰＲ００３３３４、ＰＲ００３３３５、ＰＲ００３３３６、ＰＲ００３３３７、ＰＲ００３３３８、ＰＲ００４１６０、ＰＲ００４１６１、ＰＲ００４１５８、ＰＲ００４１６２、ＰＲ００４３５７、ＰＲ００４３５９、ＰＲ００４２７９、ＰＲ００４２８０、ＰＲ００４２８１、ＰＲ００４２８２、ＰＲ００５８２９などのヒト４－１ＢＢへの結合は、ポジティブコントロールＵｒｅｌｕｍａｂより強い。具体的には、抗体ＰＲ００３３３５の結合曲線のＳｐａｎ値は約Ｕｒｅｌｕｍａｂの１．５倍であり、ＭＦＩ最大値はＵｒｅｌｕｍａｂより高い。
図７－（Ａ）－（Ｃ）に示すように、本実例におけるＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、いずれもサル４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞に特異的に結合している。一方、参照抗体Ｕｒｅｌｕｍａｂは、サル４－１ＢＢと交差結合する活性を有しない。
実施例６．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＢ７－Ｈ４を高発現するＳＫ－ＢＲ－３細胞系におけるインビトロ結合のＦＡＣＳ検出
本実施例は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＢ７－Ｈ４アームのヒトＢ７－Ｈ４への結合活性を研究するためのものである。Ｂ７－Ｈ４を高発現するＳＫ－ＢＲ－３細胞株を用いてヒトＢ７－Ｈ４との細胞レベルでの結合実験を行った。簡単に言えば、ＳＫ－ＢＲ－３細胞懸濁液を集め、細胞密度をそれぞれ２×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃：３８９４）に５０μＬ細胞／ウェルで接種し、次いで終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を５０μＬ／ウェルで添加した。細胞を４°Ｃに置き、光を避けて２時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルの予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃：１０９－６０５－０９８，１：１０００希釈）、４°Ｃで、光を避けて１時間インキュベートした。細胞を１００μＬ／ウェルの予冷したＰＢＳで２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μＬ／ウェルの予冷したＦＡＣＳで細胞を再懸濁し、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ ３０００を用いて蛍光発光シグナル値を読み取った。
図８－（Ａ）－（Ｋ）：Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＢ７－Ｈ４を高発現するＳＫ－ＢＲ－３細胞系におけるインビトロ結合；
図８－（Ａ）－（Ｋ）に示すように、本実例では、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、いずれもＳＫ－ＢＲ－３細胞系上のヒトＢ７－Ｈ４に特異的に結合し、結合曲線ＥＣ５０の多くは０．１－１０ ｎＭである。
実施例７．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＢ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３が存在するときにのＴ細胞活性化実験並びにサイトカインの放出
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体がインビトロで標的Ｔ細胞の活性化を媒介する能力を研究するために、ヒトｐａｎ Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、Ｂ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３を、架橋を媒介する細胞としてインビトロ活性化実験及びサイトカインの放出の検出を行った。具体的には、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５９９）をＯＫＴ３でコーティングし、ｐａｎ Ｔの密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整し、ＳＫ－ＢＲ－３の密度を２×１０５細胞／ｍＬに調整し、２種類の細胞懸濁液をそれぞれ５０μＬ細胞／ウェルで９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５９９）に接種し、その後、終濃度の３倍の異なる勾配で希釈した測定対象抗体を５０μＬ／ウェルで添加し、その中で、抗体の最高終濃度は１００ｎＭまたは３０ｎＭまたは２０ｎＭまたは６ｎＭであり、各抗体は合計６または３または２つの濃度であり、最終の有効標的比（エフェクター細胞と標的細胞の比、即ち、エフェクター細胞：標的細胞）は１０：１であり、２つの繰り返しを設定した。同時に、プレート内に同型ＩｇＧコントロール群を設置した。９６ウェルプレートを３７°Ｃの二酸化炭素培養箱に２日間または３日間インキュベートした。インキュベーション完了後、上清を取り、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５９９）に加え、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離した。２日間インキュベートされた上清を用いてサイトカインＩＬ－２の放出を検出し、または３日間インキュベートされた上清を用いてＩＦＮ－ｇａｍｍａの放出を検出する。ＥＬＩＳＡ検出方法は、ＩＬ－２（ＩＬ－２ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ，＃８８－７０２５－８８）キットとＩＦＮ ｇａｍｍａ（ＩＦＮ ｇａｍｍａ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ，＃８８－７３１６－８８）操作説明を参照する
図９－（Ａ）－（Ｅ）：Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、Ｂ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３が存在するときに４－１ＢＢパスを活性化し、Ｔ細胞に誘導し活性化してＩＦＮ－γを放出させる。
図１０－（Ａ）－（Ｎ）：Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＢ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３が存在するときに４－１ＢＢパスを活性化し、Ｔ細胞に誘導し活性化してＩＬ－２を放出させる。
図９－（Ａ）－（Ｅ）及び図１０－（Ａ）－（Ｎ）に示すように、Ｂ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３が存在するときに、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体が媒介できるＴ細胞活性化。そして、ＰＲ００２７９０、ＰＲ００２７９１、ＰＲ００２８０２、ＰＲ００２８０４、ＰＲ００２８０６、ＰＲ００３３３４、ＰＲ００３３３５、ＰＲ００３３３６、ＰＲ００３３３７、ＰＲ００３３３８、ＰＲ００３４８７、ＰＲ００３４８８、ＰＲ００３４８９、ＰＲ００４１５８、ＰＲ００４１６０、ＰＲ００４１６１、ＰＲ００４１６２、ＰＲ００４１８１、ＰＲ００４１８２、ＰＲ００４２７９、ＰＲ００４２８０、ＰＲ００４２８１、ＰＲ００４２８２、ＰＲ００４３５７、ＰＲ００４３５８、ＰＲ００４３５９による４－１ＢＢパスの活性化は、Ｕｒｅｌｕｍａｂよりも優れているか、Ｕｒｅｌｕｍａｂに相当する。具体的には、サイトカインＩＦＮ－γまたはＩＬ－２の産生はＵｒｅｌｕｍａｂより高い。
異なるリンカー長も、二重抗体によるＴ細胞の活性化に影響を与え、例えば、ＰＲ００４２８１およびＰＲ００４２８２がＰＲ００３３３８およびＵｒｅｌｕｍａｂより優れたパフォーマンスを示す（図１０－Ｋ）。
異なる抗原エピトープを有するＢ７Ｈ４アームは、二重抗体によるＴ細胞の活性化に影響を与え、例えば、ＰＲ００４２８１およびＰＲ００４２８２がＰＲ００４９９５およびＵｒｅｌｕｍａｂより優れたパフォーマンスを示す（図１０－Ｌ）。
異なるＦｃ突然変異部位を有することは、二重抗体によるＴ細胞の活性化に影響を与え、例えば、ＰＲ００５１８５、ＰＲ００５１８６及びＰＲ００４２８２がＵｒｅｌｕｍａｂよりも優れている（図１０－Ｍ）。
実施例８．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＴ細胞に対する活性化は、ＦｃγＲ細胞に依存しない
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の活性がＦｃγＲの発現に依存するかどうかを研究するために、ヒトｐａｎ Ｔ細胞をエフェクター細胞として、ＦｃγＲＩＩｂを高発現する細胞系ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂまたはＦｃγＭＲＩを高発現する細胞系ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ６４を、架橋を媒介する細胞として、インビトロ活性化実験及びサイトカインの放出の検出を行った。具体的には、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５９９）をＯＫＴ３でコーティングし、ｐａｎ Ｔの密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整し、ＦｃγＲ細胞の密度を２×１０５細胞／ｍＬに調整し、２種類の細胞懸濁液をそれぞれ５０μＬ細胞／ウェルで９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５９９）に接種し、その後、終濃度の２倍の異なる勾配で希釈した測定対象抗体を１００μＬ／ウェルで添加し、最終の有効標的比は１０：１で、２つの繰り返しを設定した。同時に、プレート内に同型ＩｇＧコントロール群を設置した。９６ウェルプレートを３７°Ｃの二酸化炭素培養箱に２日間インキュベートした。インキュベーション完了後、上清１００μｌを採取し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に加え、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を採取し、サイトカインＩＬ－２の放出を検出した。ＥＬＩＳＡ検出方法は、ＩＬ－２（ＩＬ－２ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ，＃８８－７０２５－８８）キットの操作説明を参照する。
図１１－（Ａ）－（Ｂ）：Ｔ細胞の活性化に対するＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体の特異性は、ＦｃγＲの表現に依存しない。（Ａ）ＦｃγＲＩＩｂを高発現する細胞系ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ細胞が存在するときに、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２によって媒介されたＴ細胞活性化は、同型ＩｇＧコントロールと同等であった。（Ｂ）ＦｃγＭＲＩを高発現する細胞系ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ６４細胞が存在するときに、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２によって媒介されたＴ細胞活性化は、同型ＩｇＧコントロールと同等であった。
実施例９．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＴ細胞に対する活性化は、Ｂ７－Ｈ４の発現に依存する
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異的抗体活性がＢ７－Ｈ４発現に依存するかどうかを研究するために、ヒトｐａｎ Ｔ細胞をエフェクター細胞として、Ｂ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３とＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞、及びＢ７－Ｈ４を発現しないＣＯＶ６４４とＪＩＭＴ－１及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、架橋を媒介する細胞として、インビトロ活性化実験及びサイトカインの放出の検出を行った。具体的には、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５９９）をＯＫＴ３でコーティングし、ｐａｎ Ｔの密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整し、腫瘍細胞の密度を２×１０５細胞／ｍＬに調整し、２種類の細胞懸濁液をそれぞれ５０μＬ細胞／ウェルで９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５９９）に接種し、その後、終濃度の３倍の測定対象抗体を５０μＬ／ウェルで添加し、最終の有効標的比は１０：１で、２つの繰り返しを設定した。同時に、プレート内に同型ＩｇＧコントロール群を設置した。９６ウェルプレートを３７°Ｃの二酸化炭素培養箱に２日間インキュベートした。インキュベーション完了後、上清１００μｌを採取し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に添加し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を採取し、サイトカインＩＬ－２の放出を検出するためのＥＬＩＳＡ検出方法は、ＩＬ－２（ＩＬ－２ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ，＃８８－７０２５－８８）キットの操作説明を参照する。
図１２：ＦＡＣＳは腫瘍細胞表面のＢ７－Ｈ４発現量を検出する。図１２－（Ａ）では、Ｂ７－Ｈ４ポジティブコントロール抗体１を用いて腫瘍細胞表面のＢ７－Ｈ４発現量を検出した。図１２－（Ｂ）では、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体を用いて腫瘍細胞表面のＢ７－Ｈ４発現量を検出した。図示するように、ＳＫ－ＢＲ－３とＭＤＡ－ＭＢ－４６８はＢ７－Ｈ４を高発現する腫瘍細胞であり、ＪＩＭＴ－１とＣＯＶ６４４及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１はＢ７－Ｈ４を発現しない腫瘍細胞である。
図１３－（Ａ）－（Ｈ）：Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＴ細胞に対する活性化が特異的にＢ７－Ｈ４の発現に依存することを示す。（Ａ）、（Ｂ）では、Ｂ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３またはＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞が存在するときに、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００３３３４によって媒介されたＴ細胞活性化は、ポジティブコントロールより優れている。（Ｃ）、（Ｄ）では、Ｂ７－Ｈ４を発現しない細胞系ＣＯＶ６４４またはＪＩＭＴ－１細胞が存在するときに、ＰＲ００３３３４によって媒介されたＴ細胞活性化の程度は、同型ＩｇＧコントロールと同等である。（Ｅ）、（Ｆ）では、Ｂ７－Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３細胞が存在するときに、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２によって媒介されたＴ細胞活性化は、ポジティブコントロールＵｒｅｌｕｍａｂより優れている。（Ｇ）、（Ｈ）では、Ｂ７－Ｈ４を発現しない細胞系ＪＩＭＴ－１またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が存在するときに、ＰＲ００４２８２によって媒介されたＴ細胞活性化の程度は、同型ＩｇＧコントロールと同等である。
実施例１０．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の血清安定性の研究
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の高濃度ヒト血清中の安定性を研究するために、ＰＲ０００３３３４とＰＲ０００３３５を９０％ヒト血清で勾配希釈し、初期濃度は１００ ｎＭで、１：３勾配で８つの濃度点に希釈した。６つのサンプルに分け、それぞれ３７度で０日、１日、２日、４日、７日、１４日インキュベートした後、液体窒素で急速凍結した後－７０度に放置して保存した。Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体を高濃度血清に３７度で異なる時間放置した後、Ｂ７－Ｈ４を高発現するＳＫ－ＢＲ－３細胞系及びＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ ４－１ＢＢ細胞とのインビトロ結合ことをＦＡＣＳで検出し、実施例３．３及び実施例６を参照する。
ＰＲ０００４２８２を９５％ヒト血清で勾配希釈し、５本のチューブに分け、それぞれ３７度で０日、１日、２日、４日、７日、１４日インキュベートした後、液体窒素で急速凍結した後－８０度で保存した。高濃度ヒト血清に３７度で異なる時間を置いた後のＰＲ００４２８２は、ＦＡＣＳ法を用いてＢ７Ｈ４＋細胞及び４－１ＢＢ＋細胞とのインビトロ結合を検出し、その過程は以下の通りである：
ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ、ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢ、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＢ７Ｈ４及びＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏＢ７Ｈ４細胞を消化し、ＤＭＥＭで完全培地を再懸濁し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種した後、終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象ヒト血清処理後ＰＲ００４２８２抗体（処理時間が異なる抗体の各用量は４．５％ヒト血清を含む）を１００μＬ／ウェルで添加した。細胞を４°Ｃに置き、光を避けて２時間インキュベートした。さらに１００μＬ／ウェルの予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳを添加し細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ，＃１０９－５４５－０６，１：１０００希釈）、４°Ｃで、光を避けて１時間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を２００μＬ／ウェルで再懸濁し、ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅシリーズフローサイトメーターを用いて蛍光発光シグナル値を読み取った。
図１４－（Ａ－Ｄ）：Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体ＰＲ００３３３４及びＰＲ００３３３５の血清安定性を示す。異なるヒト血清インキュベーション時間において、ＰＲ００３３３４及びＰＲ００３３３５は、９０％血清において、Ｂ７－Ｈ４を高発現するＳＫ－ＢＲ－３細胞及びＣＨＯ－Ｋ１－ヒト４－１ＢＢ細胞との結合に変化がなく、ＰＲ００３３３４とＰＲ００３３３５が良好な血清安定性を持っていることを示した。
図１４－（Ｅ－Ｈ）：Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重抗体ＰＲ００４２８２の血清安定性を示す。異なる血清インキュベーション時間において、ＰＲ００４２８２は、９５％血清において、Ｂ７Ｈ４または４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合に変化がなく、ＰＲ００４２８２が良好な血清安定性を持っていることを示した。
実施例１１．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２の４－１ＢＢ＋細胞レベルでの結合能のＦＡＣＳ検出
本実施例は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２のヒト／カニクイザル／マウス４－１ＢＢに対するインビトロ結合活性を研究するためのものである。ヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ，Ｇｅｎｓｒｉｐｔ，＃Ｍ００５３８）、カニクイザル４－１ＢＢのＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢ，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，＃Ｍ００５６９）、マウス４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｍ４－１ＢＢ，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，＃Ｍ００５６８）を用いて細胞レベルでの抗体結合実験を行った。簡単に言えば、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ ４－１ＢＢ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１／ｍ ４－１ＢＢ細胞を消化し、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁した。細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種した後、終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を１００μＬ／ウェルで加えた。細胞を４°Ｃに置き、光を避けて２時間インキュベートした。その後、予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳのＦＡＣＳ緩衝液を１００μＬ／ウェルで加えて細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７，Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－６０５－０９８，１：１０００希釈）、４°Ｃで、光を避けて１時間インキュベートした。細胞を１００μＬ／ウェルの予冷したＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μＬ／ウェルの予冷したＦＡＣＳ緩衝液を用いて細胞を再懸濁し、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ ３０００フローサイトメーターを用いて蛍光発光シグナル値を読み取った。
図１５－（Ａ）に示すように：Ｂ７－Ｈ４／４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２のヒト４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞系におけるインビトロ結合の状況；ＰＲ００４２８２とＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ細胞系の結合活性はコントロール抗体Ｕｒｅｌｕｍａｂより優れている。
図１５－（Ｂ）に示すように：ＰＲ００４２８２のカニクイザル４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞系におけるインビトロ結合の状況；ＰＲ００４２８２はサル４－１ＢＢと結合することができ、Ｕｒｅｌｕｍａｂはサルとの交差反応を持たない。
図１５－（Ｃ）に示すように：ＰＲ００４２８２のマウス４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞系におけるインビトロ結合の状況；ＰＲ００４２８２はマウス４－１ＢＢ結合能を有しない。
実施例１２．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２のＢ７Ｈ４＋細胞レベルでの結合能のＦＡＣＳ検出
本実施例は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２のヒト／カニクイザル／マウスＢ７－Ｈ４へのインビトロ結合活性を研究するためのものである。ヒトＢ７Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＢ７－Ｈ４、ＨＡＲＢＯＵＲ ＢＩＯＭＥＤ製）カニクイザルＢ７－Ｈ４のＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏＢ７－Ｈ４、ＨＡＲＢＯＵＲ ＢＩＯＭＥＤ製）、マウスＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｍＢ７－Ｈ４、ＨＡＲＢＯＵＲ ＢＩＯＭＥＤ製）を用いて細胞レベルでの抗体結合実験を行った。簡単に言えば、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＢ７Ｈ４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ Ｂ７－Ｈ４細胞及びＣＨＯ－Ｋ１／ｍＢ７－Ｈ４細胞を消化し、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁した。細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種した後、終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を１００μＬ／ウェルで加えた。細胞を４°Ｃに置き、光を避けて２時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルの予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７，Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－６０５－０９８，１：１０００希釈）を加え、４°Ｃで、光を避けて１時間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μＬ／ウェルの予冷した２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ細胞を再懸濁し、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ ３０００フローサイトメーターを用いて蛍光発光シグナル値を読み取った。
図１６－（Ａ）に示すように：Ｂ７－Ｈ４／４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２のヒトＢ７－Ｈ４を高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞系におけるインビトロ結合；ＰＲ００４２８２とＣＨＯ－Ｋ１／ｈＢ７Ｈ４細胞系の結合活性は、Ｂ７Ｈ４単クローン抗体抗体ＰＲ００２４０８より高い。
図１６－（Ｂ）に示すように：Ｂ７－Ｈ４抗体のカニクイザルＢ７－Ｈ４を高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞系におけるインビトロ結合；ＰＲ００４２８２及びＰＲ００２４０８は、ＣＨＯ－Ｋ１－カニクイザルＢ７－Ｈ４細胞系との結合活性が匹敵する。
図１６－（Ｃ）に示すように：Ｂ７－Ｈ４抗体のマウスＢ７－Ｈ４を高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞系におけるインビトロ結合；ＰＲ００４２８２は、マウスＢ７Ｈ４に対して弱い結合能を有する。
実施例１３．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２がＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ及びＳＫ－ＢＲ－３に同時に結合する能力のＦＡＣＳ検出
本実施例は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２がＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ及びＳＫ－ＢＲ－３に同時に結合する能力を研究するためのものである。簡単に言えば、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ細胞とＳＫ－ＢＲ－３細胞を消化し、ＰＢＳを用いて細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整し、ＳＫ－ＢＲ－３に対して０．５μＭ Ｆａｒ－ｒｅｄ（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃Ｃ３４５７２）、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ細胞に対して０．５μＭ ＣＦＳＥ（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃Ｃ３４５４４）を用いて室温で５分間染色した。遠心染色した細胞を、＞２０ｍｌの１％ＦＢＳ含有培地で１回洗浄した。洗浄後の細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、細胞密度を２×１０６／ｍｌに調整した。９６ウェルＶ型プレート内（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１ウェル当たり５０μｌ ＳＫ－ＢＲ－３細胞（１ウェル当たりの細胞数１×１０５）と２５μｌ ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ（１ウェル当たりの細胞数１×１０５）及び２５ｕｌ ４倍勾配ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した測定対象抗体を添加し、完全に混合した。４°Ｃで１時間インキュベートした。ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ ３０００フローサイトメーターを用いて、ＦＩＴＣ＋ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ細胞とＡｌｅｘａ ６４７＋ＳＫ－ＢＲ－３二重陽性パーセントを識別した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて分析し、二重染色細胞のパーセンテージは、二重抗体による媒介の共結合率＝（Ｑ２／（Ｑ１＋Ｑ２）を決定するために用いた。
図１７は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ及びＳＫ－ＢＲ－３と同時に結合する能力を有するのはＰＲ００４２８２のみであることを示している。単クローン抗体はいずれもこの能力がない。
実施例１４．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２の初代細胞レベルでの結合能のＦＡＣＳ検出
本実施例は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２のインビトロ結合活性化後のヒト／カニクイザル初代Ｔ細胞の活性を研究するためのものである。非ヒト霊長目ＣＤ３単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，＃１３０－０９２－０１２）を用いて凍結保存されたサルＰＢＭＣ（ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙ，＃ＳＣ １７０２０５１）からサルＣＤ３＋Ｔ細胞を単離し、培地ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ，＃１３６０－０７０）＋１％非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ，＃１１１４０－０５０）を用いて２＾１０６／ｍｌに再懸濁し、それぞれ１ｍｌを６ウェルプレート内に取り、２０ ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ１５８５－１ｍｇ）と５ ｎＭ Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ，＃４０７９５２－５ｍｇ）を含む培地１ｍｌを加えて、３７°Ｃ ＣＯ２培養箱で１６ｈ。ヒトＣＤ３単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，＃１３０－０９６－５３５）を用いて凍結保存されたヒトＰＢＭＣ（Ｓａｉｌｙ，ＸＦＢ－ＨＰ１００Ｂ）からヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を単離し、他の操作はサルＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化と同じであった。
活性化後のサルＴ細胞密度を２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬに調整し、１００μＬＣＤ３＋Ｔ細胞／ウェルで９６ウェルＶ型プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に接種し、その後、１００μＬ／ウェルの終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体ＰＲ００４２８２／ｈＩｇＧ１／Ｕｒｅｌｕｍａｂ／ｈＩｇＧ４を加え、細胞を４°Ｃに置き、光を避けて２時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルの予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳを加え、細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７，Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－６０５－０９８，１：１０００希釈）、４°Ｃで、光を避けて１時間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００μＬ／ウェルで細胞を再懸濁し、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ ３０００フローサイトメーターを用いて蛍光発光シグナル値を読み取った。
Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（商標） 染料（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，＃７７１８４）と活性化後のヒトＴ細胞を室温で暗所で１５～３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を洗浄し、細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬＣＤ３＋Ｔ細胞／ウェルで接種した後、終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体ＰＲ００４２８２／ｈＩｇＧ１を１００μＬ／ウェルで加え、細胞を４°Ｃに置き、光を避けて２時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルの予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８，Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－５４５－０９８，１：１０００希釈）、４°Ｃで、光を避けて１時間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、予冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００μＬ／ウェルで細胞を再懸濁し、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ ３０００フローサイトメーターを用いて蛍光発光シグナル値を読み取った。
図１８－（Ａ－Ｂ）に示すように、Ｂ７－Ｈ４／４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２は、活性化されたヒトまたはサルＣＤ３＋Ｔ細胞に結合することができる
実施例１５．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２とＢ７ファミリー或いはＴＮＦＲファミリーの他のメンバーとの交差反応性のＥＬＩＳＡ検出
１５．１ Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２とＢ７ファミリーの他のメンバーとの交差反応性のＥＬＩＳＡ検出
Ｂ７ファミリーのタンパク質（表１３）をそれぞれＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃９０１８）に加え、１ウェルあたり１００μｌ、４°Ｃで一晩インキュベートした。液体を捨てた後、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０を含む）で３回洗浄し、２％ＢＳＡブロッキング溶液２５０μｌを加え、３７°Ｃで１時間インキュベートした。ブロッキング溶液を廃棄し、ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、測定対象抗原結合タンパク質を１００ ｎＭ、１０ ｎＭ及び１ ｎＭの３つの濃度に希釈し、各ウェルに１００μｌずつ加え、３７°Ｃで１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した後、５０００倍希釈したヤギ抗ヒトＨＲＰ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ａ１８８０５）を加え、３７°Ｃの条件で、光を避けて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液を３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（Ｂｉｏｐａｎｄａ，＃ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で約３０分間光を避けて放置した。５０μｌ／ウェルの停止液（ＢＢＩ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃Ｅ ６６１００６－０２００）を各ウェルに加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｅｍｅｒ，＃Ｅｎｓｐｉｒｅ）で４５０ｎｍ吸光度（ＯＤ４５０）値を測定した。
図１９－（Ａ）は、本発明の抗体ＰＲ００４２８２がＢ７ファミリーの他のメンバータンパク質と交差反応しないことを示す。
１５．２ Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２とＴＮＦＲファミリーの他のメンバーとの交差反応性のＥＬＩＳＡ検出
ＴＮＦＲファミリーのタンパク質（表１４）をそれぞれＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃９０１８）に加え、１ウェルあたり１００μｌ、４°Ｃで一晩インキュベートした。液体を捨てた後、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０を含む）で３回洗浄し、２％ＢＳＡブロッキング溶液２５０μｌを加え、３７°Ｃで１時間インキュベートした。ブロッキング溶液を廃棄し、ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、測定対象抗原結合タンパク質を１００ ｎＭ、１０ ｎＭ及び１ ｎＭの３つの濃度に希釈し、各ウェルに１００μｌずつ加え、３７°Ｃで１時間インキュベートし、同型抗体をコントロールとした。ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した後、５０００倍希釈したヤギ抗ヒトＨＲＰ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ａ１８８０５）を加え、３７°Ｃの条件で、光を避けて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（Ｂｉｏｐａｎｄａ，＃ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で約３０分間光を避けて放置した。５０μｌ／ウェルの停止液（ＢＢＩ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ♯Ｅ ６６１００６－０２００）を各ウェルに加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｅｍｅｒ♯Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）で４５０ ｎｍ吸光度（ＯＤ４５０）値を測定した。
図１９－（Ｂ）は、本発明の抗体ＰＲ００４２８２がＴＮＦＲファミリーの他のメンバータンパク質と交差反応しないことを示す。
実施例１６．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２のＡＤＣＣ効果の検出
１６．１本実施例は、ＡＤＣＣレポーター遺伝子細胞系によるＰＲ００４２８２のＡＤＣＣ効果の検出である
Ｊｕｒｋａｔ ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞（ＨＡＲＢＯＵＲ ＢＩＯＭＥＤ製）を使用して、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢまたはＳＫ－ＢＲ－３のＡＤＣＣ効果に対するＰＲ００４２８２の活性を検出する。ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢまたはＳＫ－ＢＲ－３を３００ ｇで５分間遠心分離し、次いでＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ血清培地を用いて再懸濁した。細胞の密度を６×１０５細胞／ｍｌに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μｌ細胞懸濁液を加え、３７°Ｃで一晩インキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞を４００ ｇで４分間遠心分離した後、ＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ血清培地を用いて再懸濁した。細胞の密度を３×１０６細胞／ｍｌに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μｌ細胞懸濁液を添加した。抗体はＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ培地で希釈し、最高終濃度は１００ ｎＭで、各抗体は合計４つの濃度で、５倍希釈し、２つの繰り返しを設置し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μｌ抗体希釈液を添加した。同時に、プレート内に同型ＩｇＧコントロール群とブランク培地コントロール群を設置した。細胞と抗体を３７°Ｃで５時間インキュベートした。９６ウェルプレートを常温で３０分間静置し、６０μｌ／ウェルの室温Ｏｎｅ－Ｇｌｏ発色液（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ６１１０）を添加した。その後、サンプルを光を避けて常温で１０分間インキュベートした。Ｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅの読み取りは、ＰＥ Ｅｎｓｐｉｒｅを使用して実行された。倍数＝抗体ウェルのＬｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ読み取り値／ブランク培地コントロール群のＬｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ読み取り値、Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアでグラフ化した。ＰＲ００４４６９及びＰＲ００３３６９（親和性成熟変異体のＢ７Ｈ４単クローン抗体、ＡＤＣＣ増強効果を有し、重鎖配列は配列番号２９０に示す、軽鎖配列は配列番号 ２９１に示す）をポジティブコントロールとし、ｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ，＃Ｃ０００１－４）抗体をネガティブコントロールとした。
図２０－（Ａ）－（Ｂ）は、ＰＲ００４２８２がＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢおよびＳＫ－ＢＲ－３細胞に対して明らかなＡＤＣＣ活性を示さないことを示す。一方、ポジティブコントロールＰＲ００４４６９及びＰＲ００３３６９は、ＣＨＯ－Ｋ１／４－１ＢＢ又はＳＫ－ＢＲ－３に対してそれぞれ用量依存的に強いＡＤＣＣ効果をもたらすことができる。
１６．２ 本実施例は、Ｂ７Ｈ４／４－１ＢＢ二重抗体ＰＲ００４２８２がＡＤＣＣ効果によってＮＫ細胞が標的細胞を殺すことを媒介する活性ことを研究するためのものである。
本実験では、ヒトＮＫをエフェクター細胞とし、Ｂ７Ｈ４を高発現する細胞系ＳＫ－ＢＲ－３を標的細胞とした。ＡＣＥＡ社のＲＴＣＡ機器を用いて標的細胞の電気伝導率を検出し、殺傷効率を反映した。９６ウェルプレートのＥ－ｐｌａｔｅは、最初に５０μｌの完全培地で平衡化された。ＳＫ－ＢＲ－３細胞を消化し、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１６４０完全培地に再懸濁し、４×１０５／ｍｌに希釈し、Ｅ－ｐｌａｔｅ ９６プレートに５０μｌ／ウェル、つまり２×１０４／ウェルでプレートし、３７°Ｃで一晩培養した。翌日、ＥａｓｙＳｅｐ（商標） Ｈｕｍａｎ ＣＤ５６ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，＃１７８５５）を使用してＮＫを選別し、１×１０５ＰＢＭＣを含む新鮮な培養液を５０μｌで各ウェルに添加し、その後、５０μｌ ４×の濃度勾配で希釈した抗体を添加し、抗体の最高終濃度は１００ ｎＭで、各抗体は合計４つの濃度、５倍希釈し、２つの繰り返しを設定した。ＰＲ００３３６９をポジティブコントロールとし、ｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃ０００１－４）抗体をネガティブコントロールとした。標的細胞の電気伝導率をリアルタイムで測定し、２４時間時点のデータを用いて標的細胞殺傷効率を計算し、標的細胞殺傷効率＝（１－サンプル／ｉｓｏコントロール）×１００％。
図２０－（Ｃ）の結果は、ＰＲ００４２８２がＰＲ００３３６９と比較して、ＰＲ００４２８２に明らかな殺傷がないことを示している。ＰＲ００４２８２は、ＳＫ－ＢＲ－３標的細胞に対してＡＤＣＣ活性を有さないことを示した。
実施例１７．ＢＬＩ法によるヒト、マウス、カニクイザルＦｃγ受容体タンパク質に対する抗体の親和性の検出
試験にはＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６ｅ分子相互作用アナライザーを用い、実験緩衝液は１×に希釈した動力学緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，＃１８－１１０５）であった。
計器の回転速度を１０００回転／分に設定し、まず１列に置いたＦＡＢ２Ｇセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、＃１８－５１２５）を試験緩衝液中で１０分間平衡させ、その後ＦＡＢ２Ｇセンサーで抗体を捕獲し、高さ１ｎｍのものを捕獲し、ＦＡＢ２Ｇセンサーは緩衝液中で１２０ ｓ平衡した後、２倍勾配で希釈したＦｃγ受容体タンパク質に結合し、結合時間６０ｓ、解離時間３０ｓを設定し、タンパク質濃度は表１５を参照する。最後にＦＡＢ２Ｇセンサーを１０ ｍＭグリシン－塩酸ｐＨ１．５溶液に浸漬して再生し、センサーに結合したタンパク質を溶出した。抗体とＦｃＲｎとの親和性試験は、緩衝液ｐＨ６．０と７．４の２つの条件でそれぞれ行った。ａｖｉタグを有するカニクイザルＣＤ３２ｂ及びＣＤ６４については、ＳＡセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、１８－５０１９）を用いて受容体タンパク質を捕捉し、抗体は分析物である。
Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、バージョン１１．０）を用いてデータ分析を行う場合は、０ｎＭを参照ウェルとし、参照信号（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を差し引いて、「１：１ Ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔｔｉｎｇ」方法を選択してデータフィッティングを行い、タンパク質－抗体結合の動力学パラメータを計算し、ｋｏｎ（１／Ｍｓ）値、ｋｄｉｓ（１／ｓ）値及びＫＤ（Ｍ）値を得た。高速結合高速解離の相互作用については、「ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅ」方法を選択してデータを当てはめ、ＫＤ（Ｍ）値を得た。
表１６－１８から明らかなように、ＰＲ００４２８２のＫＤ値はいずれも対参照抗体Ｕｒｅｌｕｍａｂより高く、ヒトマウスサルＦｃγ受容体タンパク質との結合は弱い。
実施例１８．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の非特異的サイトカインの放出の検出
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体がサイトカインの非特異的放出を引き起こすかどうかを評価するために、ヒトＣＤ１４単離キット（Ｍｅｌｔｅｎｙｉ，＃１３０－０５０－２０１）を用いて単球を単離し、それまたは同一ドナーのＰＢＭＣを１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１６４０完全培地に再懸濁し、２Ｅ６／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェル（Ｃｏｓｔａｒ，＃３５９９）、つまり２Ｅ５／ウェルでプレートし、続いて１００ｕｌ ２× 終濃度の勾配で希釈した抗体を加え、抗体の最高濃度は３００ｎＭ、１０倍希釈し、合計３つの濃度で、２つの繰り返しを設定し、３７°Ｃで一晩培養した。Ｕｒｅｌｕｍａｂをポジティブコントロールとし、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂとｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃ０００１－４）抗体をネガティブコントロールとした。インキュベーション２４ｈ後、上清を回収し、ＴＮＦ－ａ（Ｔｈｅｒｍｏ、８８－７０６６－８８）とＩＬ－６（Ｔｈｅｒｍｏ、８８－７３４６－７７）の放出を検出し、インキュベーション７２ｈ後、上清を回収し、ＩＦＮ－ｇａｍｍａ（Ｔｈｅｒｍｏ、８８－７３１６－７７）の放出を検出した。
図２１－（Ａ）－（Ｃ）：Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２とＰＢＭＣまたは単球との共インキュベーション後のサイトカインの放出状況。ＰＢＭＣであれ単球であれ、Ｕｒｅｌｕｍａｂは強いＴＮＦ－ａとＩＬ－６の放出を示し、ＩＦＮ－ｇａｍｍａはＰＢＭＣとの共インキュベーションの場合にのみ現れた。一方、ＰＲ００４２８２はＵｔｏｍｉｌｕｍａｂと同様に優れた安全性を示し、ＰＢＭＣや単球とのインキュベーションにかかわらず、明らかなサイトカインの放出を示している。
実施例１９．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の正常マウスのなかの薬物動態研究
本実施例は、融合タンパク質の薬物動態特性を試験する。その方法は以下の通りで、体重１８～２２グラムの雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス６匹を選択し、５ｍｇ／ｋｇ ＰＲ００３３３４または５ｍｇ／ｋｇ ＰＲ００３３３５または５ｍｇ／ｋｇ ＰＲ００４２８２の用量で静脈内注射により二重特異性抗体薬物を投与し、１群の３匹は投与前および投与後１５分、２４時間（１日）、４日目、および１０日目に全血を採取し、もう１群の３匹は投与前および投与後５時間、２日目、７日目、および１４日目に全血を採取した。全血を３０分間静置して凝固させ、その後、４°Ｃで２０００ ｒｐｍで５分間遠心分離し、分離した血清サンプルを分析まで－８０°Ｃで凍結保存した。本実施例は２種類のＥＬＩＳＡ方法を用いてマウス血清中の薬物濃度を定量的に測定した。ＥＬＩＳＡ方法１は、つまり全体的な検出方法であり、９６ウェルプレートに被覆されたヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体によりマウス血清中のヒトＦｃ含有融合タンパク質を捕獲し、その後ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ第二抗体を添加して検出する。ＥＬＩＳＡ方法２は、すなわち機能ドメイン検出方法であり、９６ウェルプレートに被覆されたヒト４－１ＢＢタンパク質によりマウス血清中のヒト４－１ＢＢ ＨＣＡｂ含有二重特異性抗体を捕獲し、その後ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ第二抗体を加えて検出する。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアバージョン８．２を使用して、非コンパートメント モデル（ＮＣＡ）を選択して血中濃度データを分析し、その薬物動態を評価した。
図２２－（Ａ）－（Ｆ）及び表１９は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００３３３４及びＰＲ００３３３５及びＰＲ００４２８２の薬物動態データを示している。図２２－（Ａ）の結果は、全体的な検出方法において、ＰＲ００３３３４のマウス体内での半減期が約８日間であることを示している。図２２－（Ｂ）機能ドメイン検出方法は、ＰＲ００３３３４のマウス体内での半減期が約９日間であることを示している。図２２－（Ｃ）の全体的な方法において、ＰＲ００３３３５のマウス体内での半減期は約１４日間であった。図２２－（Ｄ）機能ドメイン検出方法は、ＰＲ００３３３５のマウス体内での半減期が約１２日間であることを示している。図２２－（Ｅ）の全体的な方法において、ＰＲ００４２８２のマウス体内での半減期は約１１日間であった。図２２－（Ｆ）機能ドメイン検出方法は、ＰＲ００４２８２のマウス体内での半減期が約８日間であることを示している。
実施例２０．Ｂ７Ｈ４／４－１ＢＢ二重抗体ＰＲ００４２８２のカニクイザル体内の薬物動態研究
本実施例は、カニクイザル体内におけるＢ７－Ｈ４／４－１ＢＢ二重特異性抗体の薬物動態過程を試験して研究を行った。具体的には、ＰＲ００４２８２を０．９％生理食塩水で希釈し、オスのカニクイザルに１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射し、投与前および投与後０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２、１６８、３３６、５０４、６７２、８４０、１００８時間の血液サンプルを採取した。血液サンプルを室温で３０分間静置した後、遠心分離して血清を得た。確立された特異的ＥＬＩＳＡ方法（全体的な検出法）を用いて血清中のＢ７－Ｈ４／４－１ＢＢ二重特異性抗体の含有量を検出した。
図２３と表２０に示すように、Ｂ７－Ｈ４／４－１ＢＢ二重特異性抗体は、カニクイザル静脈内投与後に典型的なＩｇＧ様薬物動態曲線を示した。ＰＲ００４２８２のオスのサル体内での半減期は約３日間であった。
実施例２１．ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７／ＣＴ２６－Ｂ７－Ｈ４マウスモデルにおけるＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍薬効評価
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のインビボでの抗腫瘍薬効を評価するために、６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７マウスを使用し、その後腫瘍細胞接種当日に各実験マウスに５×１０５ ＣＴ２６／ｈＢ７－Ｈ４細胞を皮下接種した。平均腫瘍体積が８０ ｍｍ３に達した場合、マウスをランダムにグループ化し、グループあたり６匹のマウス。グループ化後、ＰＢＳで希釈した特定濃度の薬物を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で、週２回の合計６回（ＢＩＷ＊３）の投与で投与し、ＰＢＳをブランクコントロール群とした。腫瘍体積およびマウスの体重は、初回投与当日および４、７、１１、１４および１８日目に測定した。腫瘍の大きさの計算公式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）。
図２４は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７／ＣＴ２６－Ｂ７－Ｈ４マウスモデルのなかの抗腫瘍薬効を示した。図２４－（Ａ）に示すように、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００３３３４は、１８ ｍｐｋおよび６ ｍｐｋ濃度でマウスに腫瘍の成長を抑制する薬効があった。図２４－（Ｂ）に示すように、被験した各群のマウスの体重変化はいずれも正常範囲内であった。
実施例２２．ＭＤＡ－ＭＢ－４６８異種移植マウスモデルにおけるＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍薬効評価
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のインビボでの抗腫瘍薬効を評価するために、６～８週齢の雌性ＮＣＧマウスを使用し、その後腫瘍細胞接種当日に各実験マウスに５×１０６ ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を皮下接種した。平均腫瘍体積が１２０ ｍｍ３に達した場合、マウスをランダムにグループ化し、グループあたり６匹のマウス。グループ化後、ヒト５×１０６ ＰＢＭＣ細胞を接種し、翌日、ＰＢＳで希釈した特定濃度の薬物を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で、週２回の合計６回（ＢＩＷ＊３）で投与し、同型コントロールＩｇＧをコントロール群とした。腫瘍体積およびマウスの体重は、初回投与当日および７、１２、１５、１９、２２、２６および２９日目に測定した。腫瘍の大きさの計算公式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）。
図２５は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のＭＤＡ－ＭＢ－４６８異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍薬効を示した。図２５－（Ａ）に示すように、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００３３３８は、１８ ｍｐｋ濃度でマウスに腫瘍の成長を抑制する薬効があり、１５ ｍｐｋ濃度でのＵｒｅｌｕｍａｂの薬効より優れている。図２５－（Ｂ）に示すように、被験した各群のマウスの体重変化はいずれも正常範囲内であった。
実施例２３．ＯＶＣＡＲ３異種移植マウスモデルにおけるＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍薬効評価
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のインビボでの抗腫瘍薬効を評価するために、６～８週齢の雌性ＮＣＧマウスを使用し、その後腫瘍細胞接種当日に各実験マウスに５×１０６ ＯＶＣＡＲ３細胞を皮下接種した。平均腫瘍体積が１２０ ｍｍ３に達した場合、マウスをランダムにグループ化し、グループあたり６匹のマウス。グループ化後、ヒト５×１０６ ＰＢＭＣ細胞を接種し、翌日、ＰＢＳで希釈した特定濃度の薬物を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で、週２回の合計６回（ＢＩＷ＊３）で投与し、同型コントロールＩｇＧをコントロール群とした。腫瘍体積およびマウスの体重は、初回投与当日および７、１２、１５、１９、２２、２６および２９日目に測定した。腫瘍の大きさの計算公式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）。
図２６は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２のＯＶＣＡＲ３異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍薬効を示した。図２６－（Ａ）に示すように、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２は、１８ ｍｐｋ濃度でマウスに腫瘍の成長を抑制する薬効があった。図２６－（Ｂ）に示すように、被験した各群のマウスの体重変化はいずれも正常範囲内であった。
実施例２４．ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７／ＣＴ２６－ｈＢ７－Ｈ４マウスモデルにおけるＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍薬効及び記憶的免疫効果の評価
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のインビボでの抗腫瘍薬効を評価するために、６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７マウスを使用し、その後腫瘍細胞接種当日に各実験マウスに５×１０５ ＣＴ２６－Ｂ７－Ｈ４細胞を皮下接種した。平均腫瘍体積が８０ ｍｍ３に達した場合、マウスをランダムにグループ化し、グループあたり６匹のマウス。グループ化後、ＰＢＳで希釈した特定濃度の薬物を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で、週２回の合計６回（ＢＩＷ＊３）で投与し、ＰＢＳをブランクコントロール群とし、Ｕｒｅｌｕｍａｂをポジティブコントロール群とした。腫瘍体積およびマウスの体重の測定は、初回投与当日、およびその後４５日間にわたって週３回行った。腫瘍の大きさの計算公式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）。投与４５日後に腫瘍除去マウスの反対側に５×１０５ ＣＴ２６／ｈＢ７Ｈ４細胞を皮下接種し、同年齢のマウスを新規接種コントロール群とした。腫瘍体積とマウスの体重を週３回測定し、６６日目にマウスを処刑した。
図２７は、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２のＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７／ＣＴ２６－Ｂ７－Ｈ４マウスモデルにおける抗腫瘍薬効と記憶的免疫効果を示した。図２７－（Ａ）－（Ｄ）に示すように、Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２は、１ ｍｐｋ濃度でマウスに腫瘍の成長を抑制する薬効があり、Ｕｒｅｌｕｍａｂ薬効と同等である。図２７－（Ｅ）に示すように、被験した各群のマウスの体重変化はいずれも正常範囲内であった。図２７－（Ｆ）－（Ｉ）に示すように、腫瘍除去後のマウスに同じ腫瘍を新たに接種した後、未接種未投与の同年齢のマウスと比べて腫瘍が成長しなくなり、ＰＲ００４２８２は、記憶的免疫Ｔ細胞の産生を誘導でき、長期的に効果的な腫瘍の殺傷を持続できることを示している。
実施例２５．Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍薬効特異性の評価
２５．１ ＪＩＭＴ－１異種移植マウスモデルによるＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍薬効特異性の評価
６～８週齢の雌性ＮＣＧマウスを使用し、その後腫瘍細胞接種当日に各実験マウスに５×１０６ ＪＩＭＴ－１細胞を皮下接種した。平均腫瘍体積が１２０ ｍｍ３に達した場合、マウスをランダムにグループ化し、グループあたり６匹のマウス。グループ化後、ヒト５×１０６ ＰＢＭＣ細胞を接種し、翌日、ＰＢＳで希釈した特定濃度の薬物を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で、週２回の合計６回（ＢＩＷ＊３）で投与し、同型コントロールＩｇＧをコントロール群とした。腫瘍体積およびマウスの体重は、初回投与当日および７、１２、１５、１９、２２、２６及び２９日目に測定した。腫瘍の大きさの計算公式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）。
図２８－（Ａ）は、ＰＲ００４２８２のＪＩＭＴ－１異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍薬効を示した。図に示すように、ＰＲ００４２８２は１８ ｍｐｋ濃度でマウスに腫瘍の成長を抑制する薬効がなく、Ｕｒｅｌｕｍａｂは１５ ｍｐｋ濃度で一定の薬効を示し、ＪＩＭＴ－１はＢ７Ｈ４を発現しない細胞であり、ＰＲ００４２８２は、Ｂ７Ｈ４を発現しない腫瘍細胞を殺傷できないことを示している。
２５．２ ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７／ＣＴ２６マウスモデルによるＢ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍薬効特異性の評価
Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体のインビボでの抗腫瘍薬効の特異性を評価するために、６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７マウスを使用し、その後腫瘍細胞接種当日に各実験マウスに５×１０５ ＣＴ２６野生型細胞を皮下接種した。平均腫瘍体積が８０ ｍｍ３に達した場合、マウスをランダムにグループ化し、グループあたり６匹のマウス。グループ化後、ＰＢＳで希釈した特定濃度の薬物を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で、週２回の合計６回（ＢＩＷ＊３）で投与し、ＰＢＳをブランクコントロール群とした。腫瘍体積およびマウスの体重は、初回投与当日、およびその後４、７、１１、１４及び１８日目に測定した。腫瘍の大きさの計算公式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）。
図２８－（Ｂ）：Ｂ７－Ｈ４×４－１ＢＢ二重特異性抗体ＰＲ００４２８２は、ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ１３７／ＣＴ２６マウスモデルにおいてマウスに対して強い腫瘍成長抑制の薬効を示さなかったが、Ｕｒｅｌｕｍａｂは強い薬効を示した。ＣＴ２６はＢ７Ｈ４を発現しない細胞であるため、ＰＲ００４２８２はＢ７Ｈ４を発現しない細胞を殺傷できないことを示している。一方、実施例２４の結果によれば、ＣＴ２６細胞上でヒトＢ７Ｈ４を過剰発現した後、ＣＴ２６－ｈＢ７－Ｈ４腫瘍細胞の成長がＰＲ００４２８２によって抑制される。２つの実験を組み合わせて推論することができ、ＰＲ００４２８２による腫瘍細胞の殺傷はＢ７Ｈ４発現依存性である。
以上、本発明の具体的な実施形態を説明したが、これらは単なる例示であり、本発明の原理と本質から逸脱することなく、これらの実施形態に様々な変更または修飾を行うことができることを当業者は理解すべきである。したがって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。

Claims (25)

  1. Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメイン及び４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体。
  2. 前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１６又は２３に示すアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号４６、５９又は６０に示すアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ３が配列番号９８又は８４に示すアミノ酸配列を含み；
    好ましく、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、配列としての配列番号１６に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号４６に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号８４に示すＨＣＤＲ３；配列としての配列番号２３に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号５９に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号９８に示すＨＣＤＲ３；又は、配列としての配列番号１６に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号６０に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号８４に示すＨＣＤＲ３を含み；好ましく、配列としての配列番号１４２に示すＶＨ、配列番号１５９に示すＶＨ又は配列番号１６０に示すＶＨを含み；より好ましく、配列としての配列番号１７４に示す重鎖、配列番号１９１に示す重鎖又は配列番号１９２に示す重鎖を含み；
    さらに好ましく、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインがさらにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１１２又は１１３に示し、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１１８に示し、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１３１～１３３のいずれかに示し；
    より一層好ましく、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、さらに配列としての配列番号１１２に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３１に示すＬＣＤＲ３；配列としての配列番号１１３に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３２に示すＬＣＤＲ３；又は、配列としての配列番号１１２に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３３に示すＬＣＤＲ３を含み；好ましく、さらに配列としての配列番号１６６～１６９のいずれかに示すＶＬを含み；より好ましく、さらに配列としての配列番号１９８～２０１のいずれかに示す軽鎖を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. 前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、配列としての配列番号１６に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号４６に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号８４に示すＨＣＤＲ３、配列としての配列番号１１２に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３１に示すＬＣＤＲ３；配列としての配列番号２３に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号５９に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号９８に示すＨＣＤＲ３、配列としての配列番号１１３に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３２に示すＬＣＤＲ３；又は、配列としての配列番号１６に示すＨＣＤＲ１、配列としての配列番号６０に示すＨＣＤＲ２並びに配列としての配列番号８４に示すＨＣＤＲ３、配列としての配列番号１１２に示すＬＣＤＲ１、配列としての配列番号１１８に示すＬＣＤＲ２並びに配列としての配列番号１３３に示すＬＣＤＲ３を含み；
    好ましく、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、配列としての配列番号１４２に示すＶＨ及び配列としての配列番号１６６に示すＶＬ；配列としての配列番号１５９に示すＶＨ及び配列としての配列番号１６７に示すＶＬ；配列としての配列番号１６０に示すＶＨ及び配列としての配列番号１６８に示すＶＬ；又は配列としての配列番号１５９に示すＶＨ及び配列としての配列番号１６９に示すＶＬを含み；
    さらに好ましく、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、配列としての配列番号１７４に示す重鎖及び配列としての配列番号１９８に示す軽鎖；配列としての配列番号１９１に示す重鎖及び配列としての配列番号１９９に示す軽鎖；配列としての配列番号１９２に示す重鎖及び配列としての配列番号２００に示す軽鎖；又は、配列としての配列番号１９１に示す重鎖及び配列としての配列番号２０１に示す軽鎖を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体。
  4. 前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインは、単一のＶＨ、タンデムのＶＨ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ又はＩｇＧの形態であり；前記タンデムのＶＨが好ましく２個以上のＶＨのタンデム、例えば２個、３個又は４個のＶＨのタンデムであり；ＩｇＧ形態であれば、それが含む定常領域は、好ましく突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１、又は突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１に由来する、請求項２に記載の二重特異性抗体。
  5. 前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１の配列が配列番号１９或いはその変異体１、又は配列番号１４に示し、前記ＨＣＤＲ２の配列が配列番号４９或いはその変異体２、配列番号５１又は配列番号４３に示し、前記ＨＣＤＲ３の配列が配列番号８６或いはその変異体３、配列番号９６、配列番号８９又は配列番号８１に示し；そのなかで：
    前記変異体１の突然変異は、Ｔ３Ｉ、Ｓ６Ｎ／Ｒ並びにＹ７Ｆのなかの１つ或いは複数を含み；好ましく、前記変異体１の配列は、好ましく配列表における配列番号１７～１８並びに配列番号２０～２２のいずれかに示し；
    前記変異体２の突然変異は、Ｓ１Ｎ／Ｄ、Ｇ２Ｓ／Ａ、Ｓ３Ｄ／Ｇ、Ｇ５Ｄ／Ｆ／Ｓ／Ｖ並びにＳ６Ｔ／Ｎ／Ｄのなかの１つ或いは複数を含み；前記変異体２の配列は、好ましく配列表における配列番号４７～４８、配列番号５０、配列番号５２～５８並びに配列番号６１のなかのいずれかに示し；
    前記変異体３の突然変異は、Ｇ２Ｒ／Ｄ／Ａ／Ｋ、Ｓ３Ａ／Ｔ、Ｓ４Ｇ／Ｎ／Ａ／Ｔ／Ｈ、Ｅ５Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｇ、Ｔ６Ａ、Ｄ７Ｇ／Ｓ、Ｈ９Ｙ／Ｓ、Ｙ１０Ｈ、Ｙ１１Ｆ、Ｎ１２Ｇ／Ｄ並びにＶ１３Ｉ／Ｍ／Ｔのなかの１つ或いは複数を含み；前記変異体３のアミノ酸配列は、好ましく配列表における配列番号８５、配列番号８７～８８並びに配列番号９０～９５のなかのいずれかに示し；
    好ましく、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインは、配列としてそれぞれ配列番号１７、４７及び８５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、４８及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び８７に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１９、５０及び８８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号２０、５１及び８９に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、５２及び９０に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び９０に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号２１、５３及び９１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号２１、５４及び９２に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１９、５５及び９３に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１９、４９及び９４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号２２、５６及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、５７及び９５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１９、５８及び９６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１８、６１及び９５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、配列としてそれぞれ配列番号１４、４３及び８１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    さらに好ましく、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインは、１つ又は複数の配列が配列番号１４３～１５７、１３９、２８４又は１６１に示す重鎖可変領域を含み；
    より一層好ましく、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としての配列番号１７５～１８９、１９３、２８５又は１７１に示す重鎖を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  6. 前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインは、さらに配列としてそれぞれ配列番号１０９、１１８及び１２８に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；好ましく、配列としての配列番号１６３に示す軽鎖可変領域を含み；さらに好ましく、配列としての配列番号１９５に示す軽鎖を含む、請求項５に記載の二重特異性抗体。
  7. 前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインは、単一のＶＨ又はタンデムのＶＨの形態、ＨＣＡｂの形態又はＳｃＦｖの形態であり；前記タンデムのＶＨは、好ましく２個以上のＶＨのタンデム、例えば２個、３個又は４個のＶＨのタンデムである、請求項５に記載の二重特異性抗体。
  8. 前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１０９、１１８及び１２８に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１４、４３及び８１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１３、１１８及び１３２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号２３、５９及び９８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１０９、１１８及び１２８に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１４、４３及び８１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１７、４７及び８５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４８及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び８７に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１９、５０及び８８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号２０、５１及び８９に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、５２及び９０に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号２１、５３及び９１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号２１、５４及び９２に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１９、５５及び９３に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１９、４９及び９４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号２２、５６及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３１に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、４６及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、５７及び９５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３３に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、６０及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１７、４７及び８５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３３に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、６０及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４８及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３３に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、６０及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３３に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、６０及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１９、４９及び９４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１２、１１８及び１３３に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号１６、６０及び８４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、６１及び９５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１３、１１８及び１３２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号２３、５９及び９８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４８及び８６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１３、１１８及び１３２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号２３、５９及び９８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１９、５８及び９６に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１３、１１８及び１３２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号２３、５９及び９８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、５７及び９５に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１１３、１１８及び１３２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、及び配列としてそれぞれ配列番号２３、５９及び９８に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み；且つ前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが配列としてそれぞれ配列番号１８、４９及び９０に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  9. 前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原ドメインがＩｇＧの形態であり、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが単一のＶＨの形態であり；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原ドメインがＩｇＧの形態であり、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインがＳｃＦｖの形態であり；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原ドメインがＩｇＧの形態であり、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインが２個又は３個のＶＨのタンデムの形態であり；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原ドメインがＦａｂの形態であり、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインがＨＣＡｂの形態又はＨＣＡｂの形態及びＶＨの形態（ＨＣＡｂ－ＶＨ形態）であり；
    又は、前記Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗原ドメインがＦａｂの形態であり、前記４－１ＢＢを標的とする抗原結合ドメインがＶＨの形態であり、前記ＶＨの形態は好ましく単一のＶＨ、２個又は３個のＶＨのタンデムの形態であり；
    好ましく、前記二重特異性抗体は、下記の形態であり：
    （１）ＩｇＧのＣ端にＳｃＦｖが接続され、前記ＳｃＦｖのＶＨが前記Ｃ端に接続され；好ましく、当該形態の二重特異性抗体のポリペプチド鎖１が式：ＶＬＢ７－Ｈ４－ＣＬに示し、ポリペプチド鎖２が式：ＶＨＢ７－Ｈ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ＶＨ４－１ＢＢ－リンカー－ＶＬ４－１ＢＢに示し；
    （２）ＩｇＧのＣ端にＶＨ又はタンデムのＶＨが接続され；好ましく、当該形態の二重特異性抗体のポリペプチド鎖１が式：ＶＬＢ７－Ｈ４－ＣＬに示し、ポリペプチド鎖２が式：ＶＨＢ７－Ｈ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－（ＶＨ４－１ＢＢ）ｎに示し；
    （３）ＨＣＡｂのＮ端にＦａｂが接続され；好ましく、当該形態の二重特異性抗体のポリペプチド鎖１が式：ＶＨＢ７－Ｈ４－ＣＨ１に示し、ポリペプチド鎖２が式：ＶＬＢ７－Ｈ４－ＣＬ－リンカー－ＶＨ４－１ＢＢ－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３に示し；
    （４）ＨＣＡｂのＮ端にＦａｂが接続され、前記ＦａｂのＣ端にＶＨが接続され；好ましく、当該形態の二重特異性抗体のポリペプチド鎖１が式：ＶＨＢ７－Ｈ４－ＣＨ１に示し、ポリペプチド鎖２が式：ＶＬＢ７－Ｈ４－ＣＬ－リンカー－ＶＨ４－１ＢＢ－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ４－１ＢＢに示し；又は
    （５）Ｆｃの２個のＣＨ２のＮ端にそれぞれＦａｂ、並びにＶＨ又はタンデムのＶＨが接続され；好ましく、当該形態の二重特異性抗体が３つのポリペプチド鎖を含み：
    ポリペプチド鎖１が式：ＶＬＢ７－Ｈ４－ＣＬに示し、ポリペプチド鎖２が式：ＶＨＢ７－Ｈ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に示し、ポリペプチド鎖３が式：ＶＨ４－１ＢＢ－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３又は（ＶＨ４－１ＢＢ）ｎ－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３に示す、請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  10. 前記リンカーが配列番号２４１～２６１、２８２並びに２８８～２８９からなる群から選択され；そのなかで：
    形態（１）のリンカーが好ましく配列番号２４５に示す配列を含み；
    形態（２）のリンカーが好ましく配列番号２４３、２４５～２４７並びに配列番号２８８～２８９のいずれかに示す配列を含み；
    形態（３）のリンカーが好ましく配列番号２５０に示す配列を含み；
    形態（４）のリンカーが好ましく配列番号２８２に示す配列を含み；
    形態（５）のリンカーが好ましく配列番号２４５に示す配列を含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
  11. 前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列が配列番号１９８に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列が配列番号２０２～２１５のいずれかに示し；
    又は、前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列が配列番号２０１に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列が配列番号２１７、２３０、２３８、２４０、２２６、２６２又は２３９に示し；
    又は、前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列が配列番号２００に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列が配列番号２１８～２２５、２３５～２３７、２６３～２６８、２７４～２８１、２８６並びに２８７のいずれかに示し；
    又は、前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列が配列番号２０１に示し、前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列が配列番号２２７に示し、且つ前記ポリペプチド鎖３のアミノ酸配列が配列番号２２８、２２９、２３１又は２３２に示し；
    又は、前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列が配列番号２３３に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列が配列番号２３４、２６９～２７３のなかのいずれかに示す、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする、単離の核酸。
  13. 請求項１２に記載の単離の核酸を含む、発現ベクター。
  14. 請求項１３に記載の発現ベクターを含み；好ましく、原核細胞或いは真核細胞である、宿主細胞。
  15. 請求項１４に記載の宿主細胞を培養すること、及び培養物から前記二重特異性抗体を得ることを含む、二重特異性抗体の作製方法。
  16. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含む、医薬組成物。
  17. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体又は請求項１６に記載の医薬組成物の、４－１ＢＢ及び／又はＢ７－Ｈ４関連の疾患を予防及び／又は治療するための薬物の作製における用途、
    前記疾患は好ましく癌であり、前記癌は好ましく乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌、メラノーマ、肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、膀胱癌、肉腫又は結腸直腸癌であり；好ましく、前記癌が乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌又は胆管癌であり；より好ましく、前記癌は乳癌である。
  18. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含む、キメラ抗原受容体。
  19. 細胞毒性剤、並びに請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含み；好ましく、前記細胞毒性剤がＭＭＡＦ或いはＭＭＡＥである、抗体薬物複合体。
  20. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、請求項１８に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１６に記載の医薬組成物を含み；
    好ましく、（ｉ）抗体或いはその抗原結合フラグメント或いは抗体薬物複合体或いは医薬組成物を投与するデバイス；及び／又は（ｉｉ）使用説明を含む、試薬キット。
  21. キットＡ及びキットＢを含む薬物キットであって、
    前記キットＡが請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、請求項１８に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１６に記載の医薬組成物を含み；
    前記キットＢが他の抗腫瘍抗体又は前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物、及び／又は、ホルモン製剤、標的小分子製剤、プロテアソーム阻害剤、イメージング剤、診断剤、化学療法剤、腫瘍溶解性薬物、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、抑制性分子の阻害剤並びにワクチンからなる群のなかの一種或いは複数種を含む、薬物キット。
  22. ４－１ＢＢ及び／又はＢ７－Ｈ４が媒介する疾患或いは障害を診断、治療及び／又は予防する方法であって、
    必要な患者に治療有効量の請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、請求項１８に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９に記載の抗体薬物複合体或いは請求項１６に記載の医薬組成物を投与すること、又は請求項２１に記載の薬物キットを用いて必要な患者を治療することを含む、方法。
  23. 前記疾患或いは障害が腫瘍であり、好ましく乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌、メラノーマ、肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、膀胱癌、肉腫又は結腸直腸癌であり；好ましく、前記癌が乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌又は胆管癌であり；さらに好ましく、前記癌が乳癌である、請求項２２に記載の方法。
  24. ４－１ＢＢ或いはＢ７Ｈ４を免疫検出又は測定する方法であって、請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、請求項１８に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９に記載の抗体薬物複合体或いは請求項１６に記載の医薬組成物を用いることを含み；好ましく、前記検出が診断及び／又は治療の目的のものではない、方法。
  25. 必要な患者に請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、請求項１８に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９に記載の抗体薬物複合体或いは請求項１６に記載の医薬組成物、及び第二治療剤をそれぞれ投与することを含み；

    前記第二治療剤が好ましく他の抗腫瘍抗体又は前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物、及び／又は、ホルモン製剤、標的小分子製剤、プロテアソーム阻害剤、イメージング剤、診断剤、化学療法剤、腫瘍溶解性薬物、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、抑制性分子の阻害剤並びにワクチンからなる群のなかの一種或いは複数種を含む、併用療法。
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