TWI833244B - 一種雙抗組合及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示了一種雙抗組合及其應用，所述雙抗組合包括雙特異性抗體I和雙特異性抗體II，所述雙特異性抗體I包括標靶CD3的結構域和標靶腫瘤相關抗原的結構域，所述雙特異性抗體II包括標靶4-1BB的結構域和標靶腫瘤相關抗原的結構域。還揭示了含其的藥物組成物、套組、套裝藥盒和給藥裝置，以及使用其治療癌症的方法。雙抗聯用不僅減少了T細胞的耗竭，還可以明顯促進後期的腫瘤毒殺。此外，雙抗聯用，尤其在標靶相同的腫瘤相關抗原的不同表位或標靶不同的腫瘤相關抗原時，還具有很強的協同毒殺作用。使用本發明的雙抗組合及含其的藥物組成物提供了一種潛在的臨床上有效治療固態腫瘤的方案。
Description
本申請主張申請日為2021/6/18的中國專利申請202110678326X、申請日為2022/6/6的中國專利申請2022106340425的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明屬於生物製藥領域，具體涉及一種雙抗組合、含其的藥物組成物及其應用。
腫瘤細胞能透過向下調控細胞表面的主要組織相容性複合物I(MHCI)降低腫瘤抗原的呈現，逃避身體的抗腫瘤免疫反應。CD3雙特異性抗體透過同時結合T細胞上的CD3分子以及腫瘤細胞上的腫瘤相關抗原，媒介免疫突觸的形成，殺滅腫瘤細胞。理論上，CD3雙特異性抗體透過直接活化T細胞上的CD3分子，可以不依賴組織相容性複合物對抗原的呈現，同時，也不依賴於抗原特異性T細胞的活化，而是活化多株T細胞，因此，具有很強的媒介T細胞殺死腫瘤細胞的作用。2014年，Amgen稱為BiTE的Blinatumomab上市用於治療復發性/難治性B細胞急性淋巴癌
(B-ALL)，取得了很好的療效。Blinatumomab雙特異性抗體一端結合腫瘤細胞上的CD19，一端結合T細胞上的CD3，可以媒介很強的T細胞毒殺腫瘤作用，病人初始反應率超過50%(Bejnjamin and Stein2016,Ther Adv Hematol,7(3)：142-146)。
目前在研究中的臨床試驗中CD3雙特異性抗體佔據雙特異性抗體將近一半，其中約2/3針對血瘤，1/3針對固態腫瘤(Bispecific antibodies：a mechanistic review of the pipeline.Nature Review Drug Discovery,2019 Aug；18(8)：585-608)。儘管在體外實驗或動物實驗中，針對固態腫瘤的CD3雙特異性抗體展現出很強的抗腫瘤活性，但目前在臨床上其療效並不盡如人意。固態腫瘤往往含有很多基質細胞和胞外基質，形成的物理屏障阻斷了淋巴細胞的浸潤，在固態腫瘤裡T細胞相比腫瘤細胞數目占很小的比例；同時腫瘤內部免疫抑制性微環境，包括Treg、MDSC、TAM，免疫檢查點的表現；以及單獨CD3雙特異性抗體在缺乏T細胞第二信號的情況下容易導致T細胞的凋亡。這些因素都可能導致CD3雙特異性抗體在固態腫瘤裡臨床療效不佳。有文獻報導，CD3雙特異性抗體聯用第二信號比如4-1BB，或者在CAR-T細胞的CAR胞內段整合4-1BB可以明顯促進T細胞的活化，減少T細胞的耗竭，進而提高療效(Transl.Med.2019；11,eaav5989)。
B7-H4(VTCN1,B7h.5,B7S1,B7x,B7H4)是一種隸屬於B7/CD28超家族的跨膜蛋白。B7-H4蛋白在大多數正常組織中無表現，或僅在身體的部分導管上皮細胞上如乳房導管和小葉、輸卵管上皮、子宮內膜腺等組織有低位準表現。但是，B7-H4過度表現於乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌的腫瘤細胞表面，特別是三陰性乳腺癌。乳腺癌是全球範圍第二大的惡性腫瘤，且發病率逐漸上升。女性癌症患者中乳腺癌患者約占四分之一。卵巢癌、子宮內膜癌為女性生殖系統常見的惡性腫瘤。卵巢癌的死亡率占婦科惡性腫瘤之首，子宮內膜癌在導致死亡的婦科惡性腫瘤中排三位，急需研發更加安全有效的治療手段。鑒於B7-H4在這一大類腫瘤上的高度表現以及在正常組織的低度表現，標靶B7-H4開發雙特異性抗體是一種很有前途的治療手段。
因此，開發出一種能同時提供T細胞第一信號和第二信號，並能標靶腫瘤的抗體產品意義重大。
為解決現有技術中缺乏一種有效的雙特異性抗體組合(即雙抗組合)，並用其進行治療癌症的缺陷，本發明提供了一種雙抗組合、含其的藥物組成物及其應用。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之一為：提供一種雙抗組合，其包含作為第一治療劑的雙特異性抗體I，和作為
第二治療劑的雙特異性抗體II，其中所述雙特異性抗體I包括標靶CD3的結構域和標靶腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA)的結構域，所述雙特異性抗體II包括標靶4-1BB的結構域和標靶腫瘤相關抗原的結構域。
較佳地，所述雙特異性抗體I中，所述腫瘤相關抗原的結構域為標靶B7-H4的結構域；和/或，所述雙特異性抗體II中，標靶腫瘤相關抗原的結構域為標靶B7-H4的結構域或標靶Her2的結構域。
更佳地，所述雙特異性抗體I和雙特異性抗體II中的標靶B7-H4的結構域分別標靶B7-H4的不同表位。
在一些優選的實施例中，所述雙特異性抗體I為Fab-Fc-scFv或Fab-Fc-(VH)n非對稱結構，所述雙特異性抗體II為IgG-VH對稱結構；其中n為大於等於1的自然數。
較佳地，所述雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域為scFv或VH_A-VH_B，所述VH_A和VH_B相同或不同；標靶CD3的結構域為Fab，所述Fab與所述scFv透過樞紐區或連接胜肽連接在Fc上；或者所述Fab與所述VH_A-VH_B透過樞紐區或連接胜肽連接在Fc上；所述Fc優選為IgG1的Fc，所述連接胜肽的胺基酸序列如SEQ ID NO：93-96、124所示，更優選所述Fc包括1-3個胺基酸的增加、缺失或突變，例如L234A、L235A突變，“knob”突變T366W
和“Hole”突變T366S、L368A和Y407V，和/或，“knob”突變S354C和“Hole”突變Y349C；和/或，所述雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域或標靶Her2的結構域為IgG，所述IgG的Fc優選包括1-3個胺基酸的增加、缺失或突變，例如L234A、L235A突變；標靶4-1BB的結構域為VH或scFv；所述標靶B7-H4的結構域或標靶Her2的結構域與所述標靶4-1BB的結構域透過連接胜肽連接，所述連接胜肽的胺基酸序列優選如SEQ ID NO：93-96所示。
在另一些優選的實施例中，所述雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、21、33所示，所述輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：43、49、57所示；或者，所述標靶B7-H4的結構域包括VH_A-VH_B，所述VH_A和VH_B的HCDR1~3的胺基酸序列均分別如SEQ ID NO：100、104、102所示或所述VH_A的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：100、104、102所示、所述VH_B的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：97、103、99所示；標靶CD3的結構域包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，
所述輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示；和/或，所述雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、20、32所示，所述輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：42、49、56所示；或，所述重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、21、33所示，所述輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：43、49、57所示；標靶Her2的結構域包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、17、29所示，所述輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：40、47、54所示；標靶4-1BB的結構域為VH，其HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、18、30所示，或如SEQ ID NO：7、22、30所示。
較佳地，所述雙特異性抗體II選自以下組：a)所述雙特異性抗體II包括標靶B7-H4的結構域和標靶4-1BB的結構域；其中，標靶B7-H4的結構域中，重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、20、32所示，輕鏈可變區的LCDR1~3
的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：42、49、56所示；標靶4-1BB的結構域中，HCDR1~3的胺基酸序列如SEQ ID NO：7、22、30所示；或，標靶B7-H4的結構域中，重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、21、33所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：43、49、57所示；標靶4-1BB的結構域中，HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、18、30所示；b)所述雙特異性抗體II包括標靶Her2的結構域和標靶4-1BB的結構域；其中，標靶Her2的結構域中，重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、17、29所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：40、47、54所示；標靶4-1BB的結構域中，HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、18、30所示。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、21、33所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：43、49、57所示；標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別
如SEQ ID NO：41、48、55所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、20、32所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：42、49、56所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列如SEQ ID NO：7、22、30所示。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、21、33所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：43、49、57所示；標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示；雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、17、29所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：40、47、54所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、18、30所示。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的VH_A和VH_B的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：100、104、102所示，標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：
8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、20、32所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：42、49、56所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列如SEQ ID NO：7、22、30所示。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的VH_A和VH_B的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：100、104、102所示，標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示；雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、17、29所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：40、47、54所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、18、30所示。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的VH_A的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：100、104、102所示，VH_B的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：97、103、99所示，標靶CD3的結構域的重鏈可
變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、20、32所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：42、49、56所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列如SEQ ID NO：7、22、30所示。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的VH_A的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：100、104、102所示，VH_B的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：97、103、99所示，標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示；雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、17、29所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：40、47、54所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、18、30所示。
在另一些優選的實施例中，所述雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：66所
示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；或，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：64所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；或，標靶B7-H4的結構域包括如SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列，標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；或，標靶B7-H4的結構域包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列，標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：64所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；和/或，所述雙特異性抗體II選自以下組：a)所述雙特異性抗體II包括標靶B7-H4的結構域和標靶4-1BB的結構域；其中，標靶B7-H4的結構域中，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示；標靶4-1BB的結構域中，VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示；或，
標靶B7-H4的結構域中，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示；標靶4-1BB的結構域中，VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示；b)所述雙特異性抗體II包括標靶Her2的結構域和標靶4-1BB的結構域；標靶Her2的結構域中，重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：62所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示，標靶4-1BB的結構域中，VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特異性抗體
II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：62所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域包括如SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域包括如SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：62所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域包括如SEQ ID NO：123所示的胺基
酸序列；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：62所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示。在另一些優選的實施例中，所述雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：92、115、116所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；或，所述B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：92、115、116所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：81所示；和/或，所述雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，或分
別如SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：83所示；標靶Her2的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：80所示。標靶4-1BB的結構域的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：74或79所示。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：92所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端直接連接。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：92所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端透過如SEQ ID NO：95所示的連接胜肽與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端連接。
在又一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：92所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：80所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：115所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端直接連接。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：115所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ
ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端透過如SEQ ID NO：95所示的連接胜肽與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端連接。
在又一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：115所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：80所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：116所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端直接連接。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：116
所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端透過如SEQ ID NO：95所示的連接胜肽與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端連接。
在又一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：116所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：80所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之二為：提供一種雙抗組合，其包含雙特異性抗體I和雙特異性抗體II，或雙特異性抗體I和Urelumab；所述雙特異性抗體I包括3條多肽鏈：多肽鏈-1、多肽鏈-2和多肽鏈-3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：87，或SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：87，或SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、
SEQ ID NO：115；或SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116所示；和/或，所述雙特異性抗體II包括2條多肽鏈：短鏈和長鏈，所述短鏈和長鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：84所示。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：87所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：89所示的2條多肽鏈。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：87所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：85所示的2條多肽鏈。
在又一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：87所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：84所示的2條多肽鏈。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：89所示的2條多肽鏈。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：85所示的2條多肽鏈。
在又一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：84所示的2條多肽鏈。
在一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：89所示的2條多肽鏈。
在另一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：
114、SEQ ID NO：116所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：85所示的2條多肽鏈。
在又一具體的實施例中，所述的雙抗組合為：雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：84所示的2條多肽鏈。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之三為：提供一種分離的核酸，其特徵在於，所述分離的核酸分別編碼如本發明的技術方案之一或之二所述的雙抗組合中的雙特異性抗體I和雙特異性抗體II。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之四為：提供一種重組表現載體，其特徵在於，其包括如本發明的技術方案之三所述的分離的核酸。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之五為：提供一種轉形株，其特徵在於，其包含如本發明的技術方案之三所述的分離的核酸或如本發明的技術方案之四所述的重組表現載體；優選地，所述轉形株的宿主為原核細胞或真核細胞，所述原核細胞優選大腸桿菌，所述真核細胞優選酵母或哺乳動物細胞。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之六為：提供一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物包括如本發明的技術方案之一或之二所述的雙抗組合。
較佳地，還包括第三治療劑例如免疫檢查點抗體和/或化療藥物；以及任選地藥學上可接受的載劑。
所述的藥學上可接受的載劑可為本領域常規的載劑，所述的載劑可以為任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物佐劑。所述的藥物佐劑為本領域常規的藥物佐劑，優選地包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。更優選地，所述的藥物組成物包括0.01~99.99%的上述雙特異性抗體組合，和0.01~99.99%的藥用載劑，所述百分比為占所述藥物組成物的質量百分比。
本發明所述的藥物組成物的給藥途徑優選地為腸胃外施用、注射給藥或口服給藥。所述注射給藥優選地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射等途徑。所述的藥物組成物為本領域常規的各種劑型，較佳地為固體、半固體或液體的形式，即可以為水溶液、非水溶液或懸浮液，更佳的為片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑或輸注劑等。更優選地為經由血管內、皮下、腹膜內或肌內施用。較佳地，所述藥物組成物還可以作為氣霧劑或粗噴霧劑施用，即經鼻施用；或者，鞘內、髓內或心室內施用。更優選地，所述的藥物組成物還可以透皮、經皮、局部、腸內、陰道內、
舌下或經直腸施用。本發明的藥物組成物可根據需要製成各種劑型，並可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。給藥方式例如可以採用注射或其它治療方式。
本發明所述的藥物組成物的給藥劑量位準可以根據達到所需診斷或治療結果的組成物量而調整。施用方案也可以為單次注射或多次注射，或進行調整。所選擇的劑量位準和方案依賴於包括所述藥物組成物的活性和穩定性(即，半衰期)、製劑、施用途徑、與其他藥物或治療的組合、待檢測和/或治療的疾病或病症、以及待治療的受試者的健康狀況和先前醫療史等各種因素而進行合理地調整。
對於本發明的所述藥物組成物的治療有效劑量可以最初在細胞培養實驗或動物模型例如齧齒類動物、兔、犬、豬和/或靈長類動物中進行估計。動物模型也可以用於測定合適的施用濃度範圍和途徑。隨後可以用於確定在人中施用的有用劑量和途徑。一般地，施用有效量或劑量的確定和調整以及何時和如何進行此類調整的評估為本領域技術人員已知。
對於組合療法，上述抗體、雙特異性抗體和/或另外的治療或診斷劑可以各自作為單一藥劑，在適合於執行預期治療或診
斷的任何時間範圍內進行使用。因此，這些單一藥劑可以基本上同時(即作為單一製劑或在數分鐘或數小時內)或以按順序連續施用。
關於製劑、劑量、施用方案和可測量的治療結果的另外指導，參見Berkow等人(2000)The Merck Manual of Medical Information(Merck醫學資訊手冊)和Merck&Co.Inc.,Whitehouse Station,New Jersey；Ebadi(1998)CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology(臨床藥理學手冊)等著作。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之七為：提供一種套組，其特徵在於，所述的套組包括本發明的技術方案之一或之二所述的雙抗組合、本發明的技術方案之三所述的分離的核酸、本發明的技術方案之四所述的重組表現載體、本發明的技術方案之五所述的轉形株或本發明的技術方案之六所述的藥物組成物，及任選地，說明書。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之八為：提供一種如本發明的技術方案之一或之二所述的雙抗組合、本發明的技術方案之三所述的分離的核酸、本發明的技術方案之四所述的重組表現載體、本發明的技術方案之五所述的轉形株或本發明的技術方案之六所述的藥物組成物在製備治療癌症的藥物中的應用。
較佳地，所述癌症為血瘤或固態腫瘤，所述固態腫瘤優選乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之九為：提供一種套裝藥盒，其包括藥盒I與藥盒II。
其中，所述藥盒I包括如本發明的技術方案之一或本發明的技術方案之二所述的雙抗組合中的雙特異性抗體I，所述藥盒II包括如本發明的技術方案之一或之二所述的雙抗組合中的雙特異性抗體II；或，所述藥盒I包括如本發明的技術方案之一或之二所述的雙抗組合中的雙特異性抗體I和雙特異性抗體II；所述藥盒II包括第三治療劑例如免疫檢查點抗體和/或化療藥物。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之十為：提供一種給藥裝置，其包含：(1)用於對有需要的受試者施用如本發明的技術方案之六所述的藥物組成物的輸注模組，以及(2)任選的藥效監控模組。
所述輸注模組包括輸液裝置和/或注射裝置，例如輸液泵或注射器，其用於持續、間歇或定時地將液體藥物例如抗體或抗體組合，例如雙抗組合，或藥物組成物，或化療藥物輸送至有需要的受試者體內。例如，輸液泵能夠準確控制輸液滴數或輸液流速，保證抗體組合或藥物組成物能夠速度均勻、藥量準確且安全地進入有需要的受試者體內發揮作用。所述藥效監控模組包括數據處理單元、輸注監測單元以及輸注控制單元。所述數據處理單元接收和評
估關於治療的常見資訊例如藥效、藥代動力學，用於評估藥物有效性、安全性和/或依從性；在某些實施方式中，藥效學由描述在輸送大劑量藥物之後的一定時間內血液中藥物“活性”的百分比(或者量)的曲線或者函數來表示。所述輸注監測單元和所述輸注控制單元連接所述輸注模組、分別用於獲取和控制所述輸注模組的輸注量。
所述藥效監控模組任選地還包括與所述數據處理單元連接的護理記錄讀取單元、液體排泄量監測單元、供水量監測單元、示警裝置和顯示裝置中的一種或多種。所述護理記錄讀取單元連接所述護理系統、用於獲取患者的手注液體藥物量；所述供水量監測單元連接所述供水裝置、用於獲取有需要的受試者的供水量；所述液體排泄量監測單元連接所述排泄物接收裝置、用於獲取有需要的受試者的液體排泄量；所述示警裝置用於根據所述數據處理單元的處理結果以生成示警；所述顯示裝置用於顯示有需要的受試者的輸注資訊、液體藥物量、排尿量、供水量和\或排汗量以及所述數據處理單元根據所述輸注資訊、液體藥物量、排尿量、供水量和排汗量的處理結果。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之十一為：提供一種治療癌症的方法，其向有需要的受試者施用如本發明的技術方案之一或之二所述的雙抗組合、本發明的技術方案之六所述的
藥物組成物、本發明的技術方案之九所述的套裝藥盒或本發明的技術方案之十所述的給藥裝置。
較佳地，所述癌症為血瘤或固態腫瘤，所述固態腫瘤優選乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌。
較佳地，所述的雙抗組合中的雙特異性抗體I和雙特異性抗體II同時或先後施用。
在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為對應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如本領域技術人員知曉，或J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文使用的，術語“包括”或“包含”旨在表示組成物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根據上下文的理解，也包括“由......組成”的情況。
本發明所述的術語“抗體”包括免疫球蛋白(Ig)，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈透過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球
蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其對應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其樞紐區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞型，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈透過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源的κ、λ鏈或其變異體。在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源的IgG1、2、3、4或其變異體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個互補決定區(CDR)和4個框架區(FWR)組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。輕鏈的3個CDR指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重鏈的3個CDR指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應了解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。在本發明中，上述所列CDR的胺基酸序列均是按照Chothia
定義規則所示出的。但是，本領域技術人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬裡蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見JMol Biol 273：927-48,1997)。雖然本發明請求保護的抗體是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。
術語“突變”包括胺基酸或核苷酸的取代、添加和/或缺失，“胺基酸的取代”是其中胺基酸殘基以另一種胺基酸殘基置換和以具有相似側鏈的胺基酸殘基置換。本發明中，所述突變可以包括目前如本領域技術人員公知的突變，例如在抗體的生產或者應用過程中，可能會對抗體進行的一些突變，例如對可能存在的，特別是CDR的轉錄後修飾(Potential post-translational modifications，PTMs)的位址進行突變，包括抗體的聚集、脫醯胺基敏感(asparagine deamidation，位址(NG、NS和/或NH等)、天冬胺酸異構(DG、DP)敏感位址、N醣基化(N-{P}S/T)敏感位址及氧化敏感位址等相關突變。本發明中，發生了胺基酸突變的抗體稱為變異體。
本文使用的術語“載體”或“表現載體”是包含分離的核酸並可用於將分離的核酸遞送至細胞內部的組成物。在本領域中已知許多載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相關的多核苷酸、質體和病毒。因此，術語“載體”包括自主複製的質體或病毒。該術語還應被解釋為包括促進核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、脂質體等。病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體等。
術語“轉染”是指將外源核酸引入真核細胞。轉染可以透過本領域已知的各種手段來實現，包括磷酸鈣-DNA共沉澱、DEAE-葡聚糖媒介的轉染、聚凝胺媒介的轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂質轉染、原生質體融合、反轉錄病毒感染和生物彈道技術(biolistics)。
如本文中所使用的，術語EC50是指半最大效應濃度(concentration for 50% of maximal effect)，即能引起50%最大效應的濃度。
如本發明所用，術語“癌”、“癌症”、“腫瘤”意在包括全部類型的癌性生長物或致瘤過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，無論組織病理學類型或侵襲力階段是什麼。例子包括但不限於固態腫瘤、血液學癌、軟組織腫瘤和轉移性病灶。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於：
1)本發明的雙抗組合為TAA×CD3雙抗I與TAA×4-1BB雙抗II的組合，優選為B7-H4×CD3雙抗與TAA×4-1BB雙抗例如B7-H4(或Her-2)×4-1BB的雙抗組合。B7-H4×CD3雙抗與B7-H4×4-1BB雙抗的聯用，例如PR003899與PR004281雙抗聯用，不僅減少了T細胞的耗竭，還可以明顯促進後期的腫瘤毒殺；PR007168與PR004282雙抗聯用，可以進一步增強腫瘤細胞的毒殺效應。
2)本發明中，單用雙特異性抗體TAA×CD3(優選B7-H4×CD3)例如PR003899在低效應細胞：標靶細胞比例時沒有任何毒殺效應，而與TAA×4-1BB優選B7-H4×4-1BB聯用則顯示出很強的毒殺效應。尤其當與相同TAA不同表位的PR003338，或不同TAA的PR002828聯用時有很強的協同效應；雙特異性抗體PR007078與PR004282聯用明顯促進T細胞的分裂增殖，降低T細胞的凋亡。
因此，使用本發明的雙抗組合提供了一種潛在的臨床上有效治療固態腫瘤的方案。
圖1為B7-H4×CD3(Fab-Fc-ScFv)、B7-H4×4-1BB(IgG-HC-VH)、Her2×4-1BB(IgG-HC-VH)雙特異性抗體的結構和設計；圖2為流式細胞檢測B7-H4×CD3雙特異性抗體PR003733、PR003899結合人、猴、鼠的B7-H4；圖3為流式細胞檢測B7-H4×CD3雙特異性抗體PR003733、PR003899結合腫瘤細胞上的B7-H4以及結合T細胞；圖4為B7-H4×CD3雙特異性抗體PR003733、PR003899媒介T細胞毒殺MDA-MB-468腫瘤細胞；圖5為B7-H4×CD3雙特異性抗體PR003733、PR003899媒介T細胞毒殺HCC-1954腫瘤細胞；圖6為B7-H4×CD3雙特異性抗體PR003733、PR003899媒介T細胞毒殺BT-474腫瘤細胞；圖7為B7-H4×4-1BB雙特異性抗體PR004281、PR004282結合人、猴的4-1BB；圖8為B7-H4×4-1BB雙特異性抗體PR004281、PR004282結合人、猴、鼠的B7-H4以及結合腫瘤細胞上的B7-H4；圖9為B7-H4×4-1BB雙特異性抗體PR004281、PR004282體外活化T細胞實驗；
圖10為人乳腺癌組織切片的IHC染色檢測T細胞與腫瘤細胞的比例；圖11為B7-H4×CD3雙抗分子PR003733、PR003899在低T細胞：腫瘤細胞比例的條件下的體外毒殺實驗；圖12為B7-H4×CD3(PR003899)與B7-H4×4-1BB聯用(PR004281)降低T細胞的耗竭；圖13為B7-H4×CD3(PR003899)與B7-H4×4-1BB聯用(PR004281)促進腫瘤毒殺；圖14為B7-H4×CD3(PR003899)與B7-H4×4-1BB聯用(PR004359、PR003338、PR002828)促進腫瘤毒殺；圖15為不同雙抗組合(PR003899與PR004359、PR003899與PR003338、PR003899與PR002828)的體外聯合毒殺實驗；圖16為B7-H4×CD3(Fab-Fc-VH-VH)非對稱結構分子結構示意圖；圖17為流式細胞檢測B7-H4×CD3雙特異性抗體PR007078、PR007168結合人、猴、鼠的B7-H4；圖18為流式細胞檢測B7-H4×CD3雙特異性抗體PR007078、PR007168結合腫瘤細胞上的B7-H4以及結合T細胞；
圖19為B7-H4×CD3雙特異性抗體PR007078、PR007168媒介T細胞毒殺MDA-MB-468腫瘤細胞；圖20為B7-H4×CD3雙特異性抗體PR007078、PR007168媒介T細胞毒殺HCC-1954腫瘤細胞；圖21為B7-H4×CD3(PR007078、PR007168)與B7-H4×4-1BB(PR004282)聯用媒介T細胞毒殺SK-BR-3腫瘤細胞；圖22為B7-H4×CD3(PR007078、PR007168)與B7-H4×4-1BB(PR004282)聯用增加T細胞的增殖；圖23為B7-H4×CD3(PR007078、PR007168)與B7-H4×4-1BB(PR004282)聯用增加T細胞的分裂；圖24為B7-H4×CD3(PR007078、PR007168)與B7-H4×4-1BB(PR004282)聯用降低T細胞的凋亡。
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
雙特異性抗體I(B7-H4×CD3雙抗分子)包括兩個結構域，其中一個結構域可以辨識腫瘤細胞表面特異表現的B7-H4，而另一個結構域可以結合T細胞上的CD3分子。當B7-H4×CD3雙抗分子結合到腫瘤細胞表面後，可以招募並活化腫瘤細胞附近的T細胞，從而殺死腫瘤細胞。
圖1的A為B7-H4×CD3的Fab-Fc-scFv非對稱結構分子結構示意圖，其中標靶B7-H4的結構域為scFv結構，標靶CD3的結構域為Fab結構，該雙抗分子涉及三條多肽鏈：多肽鏈-1、多肽鏈-2和多肽鏈-3。從N端到C端多肽鏈-1的結構為VL_A-CL，多肽鏈-2的結構為VH_A-CH1-h-CH2-CH3，多肽鏈-3的結構為VL_B-L-VH_B-h-CH2-CH3；其中A和B分別代表標靶不同的標的，L為連接胜肽，h為樞紐區。
為了將具有錯誤配對的重鏈(例如抗CD3抗體的兩條重鏈錯誤配對)的副產物形成最小化，使用了突變的異源二聚體Fc區，其攜帶“knob-hole”突變和改造的二硫鍵，如WO2009080251和WO2009080252中所述。B7-H4×CD3雙特異性抗體具有IgG1的Fc，並在Fc的CH2上攜帶L234A、L235A(根據EU索引編號)突變。透過同時共轉染三個不同的哺乳動物表現載體產生雙特異性抗體，分別編碼：1)對應的抗B7-H4抗體的ScFv重鏈，其在Fc區攜帶“Hole”突變以產生異源二聚體抗體，Fc的CH2攜帶L234A、L235A
突變。2)對應的抗CD3抗體的重鏈，其在Fc區攜帶“knob”突變以產生異源二聚體抗體，Fc的CH2攜帶L234A、L235A。3)對應的抗CD3抗體的輕鏈。人IgG1Fc區的“knob”突變由以下組成：T366W，“Hole”突變由以下組成：T366S、L368A、Y407V。此外，可以包括“knob”Fc區的S354C和“Hole”Y349C形成一對二硫鍵以增加穩定性和異源二聚體抗體產量。
圖16為B7-H4×CD3非對稱結構分子結構示意圖，該雙抗分子涉及三條多肽鏈：多肽鏈-1、多肽鏈-2和多肽鏈-3。多肽鏈-1和多肽鏈-2的組成標靶CD3的Fab部分，多肽鏈-3包含兩個標靶B7-H4的VH部分(VH_A-VH_B)。其中，VH_A和VH_B的序列可以相同或者不同，VH_A和VH_B之間透過連接胜肽GS_15聯結。
為了防止由Fcγ受體結合引起的交聯和降低效應物功能，在多肽鏈-2和多肽鏈-3的重鏈恆定區引入“AA”雙突變(L234A和L235A)或者“AAA”三突變體(L234A，L235A和G237A)。而且，為了減少同源重鏈二聚體的產生，在兩條重鏈的恆定區分別引入了不同的胺基酸突變，使其攜帶“knob-hole”突變和改造的二硫鍵。標靶CD3的多肽鏈-2引入突變T366W和S354C；同時，標靶B7-H4的多肽鏈-3引入突變T366S、L368A、Y407V和Y349C。
進一步地，為了提高抗體分子的熱穩定性，B7-H4將抗B7-H4的VH結構域中Kabat編號為49和69位的兩個胺基酸變為Cys，使它們形成二硫鍵；即，各自引入突變S49C和I70C。
雙特異性抗體II為TAA×4-1BB雙抗，本發明中TAA僅以B7-H4和Her2為例，旨在透過將T細胞與TAA陽性腫瘤細胞銜接起來促進4-1BB聚集，為腫瘤抗原特異性T細胞提供有效的共刺激信號，進一步增強T細胞受體(TCR)媒介的活性並導致腫瘤解體。因此TAA×4-1BB媒介的4-1BB的活化偏向於體內T細胞和腫瘤細胞的共定位，降低周邊活化帶來的毒性反應。
圖1的B為TAA×4-1BB的IgG-VH對稱結構分子結構示意圖，IgG-VH四價對稱結構的結構域包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_B；其中A和B分別代表標靶不同的標的，L為連接胜肽，h為樞紐區。TAA×4-1BB對稱結構的雙抗分子透過的N端的IgG特異性辨識腫瘤細胞，透過C端的VH辨識並活化T細胞。並且Fc引入了L234A、L235A突變去除Fc的功能，降低了4-1BB在周邊的非特異活化，實現TAA×4-1BB雙抗對腫瘤細
胞的特異性毒殺。TAA×4-1BB的實例有PR004281、PR004282、PR004359、PR003338和PR002828。
本發明B7-H4×CD3雙特異性抗體I結構資訊如下表3中所示。
本發明TAA×4-1BB(B7-H4×4-1BB、HER2×4-1BB)雙特異性抗體II結構資訊如下表4中所示。
本發明中使用的對照分子及用於雙特異性抗體分子建構的親代單抗的資訊如下表1中所示。對照分子及親代單抗的序列在序列表中編號如下表2所示。
本發明雙特異性抗體分子中可使用的linker(L)序列在序列表中如下表5中所示。
本發明雙特異性抗體分子的多肽鏈的胺基酸序列在序列表中編號如下表6中所示。
本發明所得雙特異性抗體的CDR序列編號如下表7所示。
本發明所得雙特異性抗體的CDR的胺基酸序列及對應的SEQ ID NO如表8所示。
本發明所得雙特異性抗體的FWR序列編號如下表9所示。
消化酶處理過度表現人B7-H4的CHO-K1細胞株CHO-K1/huB7-H4(和鉑醫藥自製)、過度表現食蟹猴B7-H4的CHO-K1細胞株CHO-K1/cynoB7-H4(和鉑醫藥自製)、過度表現
小鼠B7-H4的CHO-K1細胞株CHO-K1/mB7-H4(和鉑醫藥自製)、SK-BR-3以及MDA-MB-468細胞。使用人T細胞分離套組(Miltenyi，#130-096-535)按說明書的方法分離T細胞。用含2%FBS的PBS重新懸浮。將細胞密度分別調整為1×106細胞/mL。以100μL細胞/孔接種於96孔V型底孔盤(Corning,#3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。之後，加入100μL/孔預冷含2% BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100μL/孔螢光二抗(AlexaFluor488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific,Jackson,#109-545-098,1：500稀釋)，4℃，避光培育1小時。用100μL/孔預冷含2% FBS的PBS洗滌細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200μL/孔預冷含2% BSA的PBS重新懸浮細胞，使用ACEANovocyte3000流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。
B7-H4×CD3雙抗分子PR003899、PR003733結合CHO-K1/huB7-H4，CHO-K1/cynoB7-H4，CHO-K1/mB7-H4細胞的結果見圖2，A-D；其中圖2的D總結了圖2中A-C的MFI最大值和EC50。結果顯示，由於兩個分子PR003733和PR003899使用
的是相同的抗B7-H4 ScFv片段，雙抗分子對B7-H4的結合活性基本一致。
B7-H4×CD3雙抗分子PR003899、PR003733結合SK-BR-3以及MDA-MB-468細胞的結果見圖3的A、B。結果顯示，雙抗分子對2種腫瘤細胞上的B7-H4的結合活性基本一致。B7-H4×CD3雙抗分子結合人T細胞的結果見圖3的C。結果顯示，PR003733對T細胞的結合活性要明顯高於PR003899。圖3的D是A、B和C的MFI最大值與EC50的總結。
雙抗分子PR007078和PR007168對過度表現人、猴B7-H4的CHOK1細胞結合活性基本一致(圖17的A、B、D)，但PR007078對鼠B7-H4有較強的結合(圖17的C)。與腫瘤細胞這種B7-H4表現量比較低的細胞的結合，PR007168比PR007078有更強的結合(圖18的A、C)。兩個分子使用的是相同的抗CD3抗體片段，兩者對CD3的結合能力接近(圖18的B)。
本實驗採用人原代T細胞作為效應細胞，表現不同位準B7-H4的細胞株MDA-MB-468，HCC-1954或BT-474作為標靶細胞。使用ACEA公司的RTCA儀器檢測標靶細胞的電導率反應毒殺效率。96孔盤e-plate先用50μl完全培養基平衡。消化酶處理標靶細胞，重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋
至4×105/mL，平盤培養50μl/孔於e-plate 96孔盤中，即2×104/孔、37℃培養過夜。次日使用美天妮T細胞分離試劑盒(Miltenyi，#130-096-535)按說明書的方法分離原代T細胞。每孔加入新鮮50μl含2×105 T細胞的培養液，隨後加入50μl 4×的濃度梯度稀釋的抗體，抗體最高終濃度為10nM，每個抗體共8個濃度，設置兩個重複。即時檢測標靶細胞的電導率，一般情況取24小時時間點的數據計算標靶細胞毒殺效率=(1-樣品/空白對照)×100%。24小時收上清液，ELISA方法檢測IFN-γ的濃度。ELISA檢測方法參照IFN gamma Human Uncoated ELISA Kit(Thermo，#88-7316-77)套組操作說明。B7-H4×CD3雙抗分子PR003733、PR003899毒殺MDA-MB-468、HCC-1954和BT-474腫瘤細胞的結果分別見圖4的A、圖5的A和圖6的A。
結果顯示，PR003733和PR003899都能有效地毒殺腫瘤細胞，而且PR003733的毒殺效率高於PR003899。B7-H4×CD3雙抗分子促進IFN-γ釋放位準分別見圖4的B、圖5的B、圖6的B。
B7-H4×CD3雙抗分子PR007078和PR007168都能有效地毒殺腫瘤細胞，而且PR007168的毒殺效率高於PR007078(見圖19的A、圖20的A)，細胞激素IFN-γ的釋放也高於PR007078(見圖19的B、圖20的B)。
消化酶處理過度表現人B7-H4的CHO-K1細胞株CHO-K1/huB7-H4(和鉑醫藥自製)、過度表現食蟹猴B7-H4的CHO-K1細胞株CHO-K1/cynoB7-H4(和鉑醫藥自製)、過度表現小鼠B7-H4的CHO-K1細胞株CHO-K1/mB7-H4(和鉑醫藥自製)、SK-BR-3以及過度表現人4-1BB的CHO-K1細胞株CHO-K1/h4-1BB(和鉑醫藥自製)、過度表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞株CHO-K1/cyno4-1BB細胞(和鉑醫藥自製)。用含2% FBS的PBS重新懸浮。將細胞密度分別調整為1×106細胞/mL。以100μL細胞/孔接種於96孔V型底孔盤(Corning,#3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。之後，加入100μL/孔預冷含2% BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100μL/孔螢光二抗(AlexaFluor488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific,Jackson,#109-545-098,1：500稀釋)，4℃，避光培育1小時。用100μL/孔預冷含2% FBS的PBS洗滌細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200μL/孔預冷含2% BSA的PBS重新懸浮細胞，使用ACEANovocyte3000流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。
B7-H4×4-1BB雙抗分子PR004281、PR004282結合CHO-K1/hu4-1BB、CHO-K1/cyno4-1BB結果見圖7的A-C，其中C為A、B的MFI最大值和EC50值的總結。結果顯示，PR004281、PR004282對人和猴4-1BB有相似的結合活性，而Urelumab與文獻報導的一致，不結合猴4-1BB。B7-H4×4-1BB雙抗分子結合CHO-K1/huB7-H4、CHO-K1/cynoB7-H4、CHO-K1/mB7-H4以及SK-BR-3細胞的結果見圖8，A-E，其中E為A-D的MFI最大值和EC50值的總結。結果顯示，PR004281、PR004282對人、猴、鼠4-1BB以及腫瘤細胞SK-BR-3有相似的結合活性。
用PBS稀釋1mg/ml的OKT3(eBiosciences，貨號16-0037-85)，每孔取100μl 10μg/ml OKT3塗佈96孔盤(Corning，貨號3599)，4度塗佈過夜。第二天，消化酶處理SK-BR-3、或JIMT-1或CHO-K1/CD32b細胞，並用完全培養基重新懸浮，將細胞密度分別調整為4×105細胞/ml備用。使用MACS套組(MiltenyiBiotec，貨號130-096-535)從人PBMC裡分離人CD3陽性T細胞。將前一天96孔盤塗佈的OKT3洗掉，加入50μl純化的T細胞，每孔1×105個。再取50μl SK-BR-3或JIMT-1或CHO-K1/CD32b細胞放入96孔盤裡，每孔2×104個。然後加入50μl對應濃度的B7-H4×4-1BB的雙特異性抗體雙抗抗體或者是對照單
抗，37℃保溫箱培養。48小時後取80μl上清液，用ELISA套組(Invitrogen，#88-7025-88)來檢測IL-2的含量。按照供應商的說明書進行ELISA檢測。
圖9的A顯示，在SK-BR-3細胞表面B7-H4的交聯下，B7-H4×4-1BB雙抗分子PR004281、PR004282有很強的活化T細胞分泌IL-2的作用。而JIMT-1為B7-H4表現陰性細胞，不能交聯B7-H4×4-1BB雙抗分子，因此PR004281、PR004282在JIMT-1存在條件下沒有活化T細胞的功能(圖9的B)。同時由於雙抗分子為LALA突變，降低了與Fc受體CD32b的結合，因此在CHO-K1/CD32b細胞存在條件下也沒有活化T細胞的功能(圖9的C)。提示B7-H4×4-1BB只能在有B7-H4高度表現腫瘤環境中發揮活化T細胞的功能，降低了周邊的作用，進而降低周邊毒性。對照分子Urelumab發揮功能不依賴於交聯(圖9的A、B)，而在有CD32b交聯的情況下，活性進一步增強(圖9的C)。
病理組織晶片購買自桂林泛譜生物技術有限公司的BRC1021乳腺癌組織晶片。石蠟切片為4μm厚度，帶上陽性對照組織。脫蠟，水洗；抗原修復：PH6(檸檬酸)，125℃加熱5分鐘，悶10分鐘，後在室溫冷卻30分鐘；水洗後用0.3%過氧化氫5分鐘，然後用TBST沖洗3次5分鐘；Dako封阻液直接使用，在室溫內用培
育箱封阻20分鐘；甩去封阻液，上兔抗人CD3一抗，抗體稀釋液為Dako直接使用，在室溫內用培育箱培育60分鐘，Rabbit IgG替代對照；TBST洗三次，每次五分鐘；二抗，Anti-Rabbit(EnVision+System-HRP Labelled Polymer)，在室溫內用培育箱培育30分鐘；TBST洗三次，每次五分鐘；DAB顯色，0.85mL蒸餾水，按照試劑ABC順序加入試劑各50μl，在室溫內用培育箱培育5分鐘；蒸餾水清洗，用蘇木素複染。顯微鏡下觀察、封片、讀片。
結果顯示(圖10的A)，T細胞在腫瘤組織裡面的比例較低，大部分樣本的T細胞比例低於10%，說明在病理條件下，T細胞與腫瘤組織比例要遠低於體外實驗中的比例。圖10的B為其中一個樣本例子。
方法類似於實施例2.2，用MDA-MB-468腫瘤細胞作為標靶細胞。使用ACEA公司的RTCA儀器檢測標靶細胞的電導率反應毒殺效率。96孔盤e-plate先用50μl完全培養基平衡。消化酶處理標靶細胞，重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋至4×105/mL，平盤培養50μl/孔於e-plate 96孔盤中，即2×104/孔、37℃培養過夜。次日使用美天妮T細胞分離套組(Miltenyi，#130-096-535)按說明書的方法分離原代T細胞。每孔
加入新鮮50μl含不同密度的T細胞，T細胞：腫瘤細胞比例從0.03：1-10：1，隨後加入50μl終濃度為2nM的抗體。這個濃度在效應細胞：標靶細胞比例(E：T)為10：1的毒殺實驗中為飽和濃度(圖4A)。即時檢測標靶細胞的電導率，取24、48、72、96小時時間點的數據計算標靶細胞毒殺效率=(1-樣品/空白對照)×100%。
B7-H4×CD3雙抗分子PR003733、PR003899毒殺MDA-MB-468腫瘤細胞的結果見圖11的A-D(24-96小時)。結果顯示，PR003733和PR003899的腫瘤細胞效率隨著效應細胞：標靶細胞比例降低而降低，在比例低於1：3的比例下抗體基本沒有毒殺活性，從24小時到96小時趨勢保持一致。說明在低效應細胞：標靶細胞比例下(比如腫瘤環境)，B7-H4×CD3雙抗分子媒介毒殺腫瘤效率較低。
用MDA-MB-468腫瘤細胞作為標靶細胞，MDA-MB-468細胞表面內源性高度表現B7-H4分子。96孔盤先用50μl完全培養基平衡。消化酶處理標靶細胞，重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋至4×105/mL，平盤培養50μl/孔於e-plate 96孔盤中，即2×104/孔、37℃培養過夜。次日使用美天妮T細胞分離套組(Miltenyi，#130-096-535)按說明書的方法
分離原代T細胞。每孔加入新鮮50μl含6666個T細胞，即效應細胞：標靶細胞比例(E：T)為1：3。隨後加入單獨抗體PR003899或與PR004281合用，終濃度為1nM。即時檢測標靶細胞的電導率。在第48小時收取T細胞，流式細胞儀檢測T細胞上免疫檢查點PD1、Tim3、Lag3的表現，這3個標記物的高度表現往往標記這T細胞的耗竭。大概步驟如下：收懸浮細胞，用PBS洗一次，重新懸浮於100μl FACS緩衝液(含2% FBS的PBS)，加入1μl FITC anti-human CD3，1μl APC anti-humanPD1，1μl Brilliant Violet421 anti-Tim3，1μl Brilliant Violet421 anti-Lag3抗體，4℃培育45分鐘，洗2次後，上機檢測。
結果顯示，在B7-H4×CD3雙抗PR003899與B7-H4×4-1BB雙抗PR004281聯用的情況下，經過48小時的培養，與B7-H4×CD3單用相比，PD1、Tim3、Lag3的表現都有一定的降低，特別是Tim3有明顯下降(圖12的A-C)。
方法類同實施例6，檢測不同時間點標靶細胞的毒殺率。用MDA-MB-468腫瘤細胞作為標靶細胞。96孔盤先用50μl完全培養基平衡。消化酶處理標靶細胞，重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋至4×105/mL，平盤培養50μl/孔
於e-plate 96孔盤中，即2×104/孔、37℃培養過夜。次日使用美天妮T細胞分離套組(Miltenyi，#130-096-535)按說明書的方法分離原代T細胞。每孔加入新鮮50μl含6666個T細胞，即效應細胞：標靶細胞比例(E：T)為1：3。隨後加入單獨抗體PR003899或與PR004281合用，終濃度為1nM。即時檢測標靶細胞的電導率。
B7-H4×CD3雙抗分子PR003899毒殺MDA-MB-468腫瘤細胞的結果見圖13的A-E(1-5天)。結果顯示，PR003899單用在第3天的毒殺效率達到最高點，但在4天後毒殺效率慢慢降低，可能是由於T細胞的耗竭所致。PR003899與PR004281聯用後毒殺效率在前3天跟PR003899單用並沒有明顯區別，但在後期4-5天期間，毒殺效率一直升高，與單用的差異逐漸拉大。可能是由於PR004281聯用降低了T細胞的耗竭與凋亡。
方法類同實施例5。用內源性高度表現B7-H4分子的SKBR3腫瘤細胞作為標靶細胞。96孔盤先用50μl完全培養基平衡。消化酶處理標靶細胞，重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋至4×105/mL，平盤培養50μl/孔於e-plate 96孔盤中，即2×104/孔、37℃培養過夜。次日使用美天妮T細胞分離套組(Miltenyi，#130-096-535)按說明書的方法分離原代T細胞。
每孔加入50μl標記的T細胞，效應細胞：標靶細胞比例(E：T)為1：5。隨後加入單獨抗體PR007078，PR007168或與PR004282聯用。即時檢測標靶細胞的電導率。並於第7天計算標靶細胞毒殺效率。
結果顯示(圖21)，在B7-H4×CD3雙抗PR007078，PR007168與B7-H4×4-1BB雙抗PR004282聯用的情況下，經過7天的培養，PR007078單用在低效應細胞：標靶細胞比例(E：T)時沒有毒殺效應，而與B7-H4×4-1BB雙抗PR004282聯用的情況下則顯示出很強的毒殺效應。PR007168本身有一定的毒殺效應，而PR004282聯用則進一步增強毒殺效應。
在另一次實驗中，T細胞用1μM CSFE標記後與SKBR3標靶細胞共培養，並於第7天收集T細胞用流式細胞儀計數活T細胞的數量，T細胞分裂代數，Annexin V染色檢測T細胞凋亡。
結果顯示PR007078與PR004282聯用，與單藥相比，明顯促進T細胞的絕對數量(圖22)，T細胞的分裂代數明顯增加(圖23)，同時，凋亡的比例明顯降低(圖24)。PR007168單藥本身在這次實驗中有較強的作用，與PR004282聯用對T細胞本身並沒有明顯的作用。
本發明證實PR002408、PR002410結合B7-H4不同表位的採用的方法為：使用ForteBio Octet Red96e平臺。第一步，獲取抗體的100%信號：將第一抗體(PR002408)與B7-H4結合的最終信號記錄為該抗體的100%信號。第二步，捕捉第一抗體後，再將SA感測器浸入第一抗體和第二抗體(PR002410)的混合物中，將感測器浸入抗體混合物後的信號差，記錄為該抗體作為第二抗體的信號。抑制率透過下式計算，抑制率(%)=(A-B)/A*100
A：某抗體的100%信號(從第一步中獲得)，B：該抗體作為第二抗體的信號(從第二步獲得)。
若得到的抑制率大於85(%)，則意味著兩種抗體的表位完全重疊；若抑制率小於85(%)，則意味著兩種抗體結合的表位不完全重疊。結果如表10所示，PR002408與PR002410之間沒有表位競爭，說明結合B7-H4不同的抗原表位。表位競爭實驗的結果見下表10。
為探索不同TAA或相同TAA不同結合表位在媒介TAA×CD3與TAA×4-1BB聯用中的作用，在本實施例中使用了不同的TAA×CD3與TAA×4-1BB組合。TAA×CD3為PR003899，其TAA為抗B7-H4；TAA×4-1BB有PR004359、PR003338、PR002828，Urelumab為陽性對照。PR004359的TAA為抗B7-H4，與PR003899完全相同；PR003338的TAA為抗B7-H4但與PR003899的TAA結合B7-H4不同的抗原表位；PR002828的TAA為抗Her2。示意圖見圖15。
毒殺方法類同實施例7，檢測第8天標靶細胞的毒殺率。用SK-BR-3腫瘤細胞作為標靶細胞，SK-BR-3細胞同時高度表現B7-H4和Her2。96孔盤先用50μl完全培養基平衡。消化酶處理標靶細胞，重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋至4×105/mL，平盤培養50μl/孔於e-plate 96孔盤中，即2×104/孔、37℃培養過夜。次日使用美天妮T細胞分離套組(Miltenyi，#130-096-535)按說明書的方法分離原代T細胞。每孔加入新鮮50μl含2000個T細胞，即效應細胞：標靶細胞比例(E：T)為1：10。隨後加入單獨抗體PR003899或與其它TAA×4-1BB合用，PR003899終濃度為0.5nM，TAA×4-1BB的濃度為2nM或0.2
nM。即時檢測標靶細胞的電導率。並於第8天收集T細胞進行活T細胞的染色和計數。
結果如圖14所示，PR003899單用在低效應細胞：標靶細胞比例，即E：T比例為1：10時沒有任何毒殺效應，而與TAA×4-1BB聯用則顯示出很強的毒殺效應，同時活的T細胞數量明顯上升，SK-BR-3腫瘤細胞的毒殺率見圖14的A，活的T細胞的數量見圖14的B。其中PR004359的B7-H4抗原結合表位與PR003899相同，存在表位競爭關係，所以在高濃度2nM情況下，其協同作用反而降低；而PR003899與相同TAA不同表位的PR003338，或不同TAA的PR002828有很強的協同效應。說明，TAA×CD3與相同TAA不同表位或不同TAA的TAA×4-1BB雙抗聯用具有很強的協同毒殺作用，提示在臨床上具有潛在的聯用價值。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是本領域的技術人員應當理解，這些僅是舉例說明，在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此，本發明的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
<110> 大陸商和鉑醫藥(上海)有限責任公司(Harbour Biomed(Shanghai)Co.,Ltd)
<120> 一種雙抗組合及其應用
<150> CN 202110678326X
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<150> CN 2022106340425
<151> 2022-06-06
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接胜肽GS_6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接胜肽GS_20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接胜肽H1_15-RT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接胜肽L-H1_15-RT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR006008的HCDR2
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR006008/PR007441/PR007078/PR007168的HCDR3
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007440/PR007168的HCDR2
<400> 103
<210> 104
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007441/PR007078/PR007168的HCDR2
<400> 104
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<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR006004的重鏈
<400> 105
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR006004的VH
<400> 106
<210> 107
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR006008的重鏈
<400> 107
<210> 108
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR006008的VH
<400> 108
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<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007440的重鏈
<400> 109
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007440的VH
<400> 110
<210> 111
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007441的重鏈
<400> 111
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007441的VH
<400> 112
<210> 113
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007078/PR007168的多肽鏈-1
<400> 113
<210> 114
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007078/PR007168的多肽鏈-2
<400> 114
<210> 115
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007078的多肽鏈-3
<400> 115
<210> 116
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007168的多肽鏈-3
<400> 116
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007078/PR007168的HFWR2
<400> 117
<210> 118
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007078/PR007168的HFWR3
<400> 118
<210> 119
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007078/PR007168的HFWR4
<400> 119
<210> 120
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007168的HFWR2
<400> 120
<210> 121
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007168的HFWR3
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<210> 122
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007078的VH_A-VH_B
<400> 122
<210> 123
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007168的VH_A-VH_B
<400> 123
<210> 124
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接胜肽GS_15
<400> 124
Claims (19)
- 一種雙抗組合，其包含作為第一治療劑的雙特異性抗體I，和作為第二治療劑的雙特異性抗體II，其特徵在於，所述的雙抗組合選自：i)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、21、33所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：43、49、57所示；標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、20、32所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：42、49、56所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列如SEQ ID NO：7、22、30所示；ii)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、21、33所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：43、49、57所示；標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示； 雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、17、29所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：40、47、54所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、18、30所示；iii)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的VH_A和VH_B的HCDR1~3的胺基酸序列均分別如SEQ ID NO：100、104、102所示，標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、20、32所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：42、49、56所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列如SEQ ID NO：7、22、30所示；iv)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的VH_A和VH_B的HCDR1~3的胺基酸序列均分別如SEQ ID NO：100、104、102所示，標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示； 雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、17、29所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：40、47、54所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、18、30所示；v)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的VH_A的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：100、104、102所示，VH_B的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：97、103、99所示，標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、20、32所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：42、49、56所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列如SEQ ID NO：7、22、30所示；vi)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的VH_A的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：100、104、102所示，VH_B的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：97、103、99所示，標靶CD3的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO： 8、19、31所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、48、55所示；雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、17、29所示，輕鏈可變區的LCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：40、47、54所示；標靶4-1BB的結構域的HCDR1~3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、18、30所示。
- 如請求項1所述的雙抗組合，其中，所述的雙抗組合選自：i)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示；ii)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示； 雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：62所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示；iii)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域包括如SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示；iv)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域包括如SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：62所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示；v)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特 異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示；vi)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；標靶CD3的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；雙特異性抗體II中，標靶Her2的結構域的重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：62所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示；標靶4-1BB的結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示。
- 如請求項1所述的雙抗組合，其中，所述雙抗組合選自：i)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：92所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端直接連接；ii)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：92所示，標靶CD3的結構域的 重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端透過如SEQ ID NO：95所示的連接胜肽與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端連接；iii)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：92所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：80所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示；iv)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：115所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端直接連接； v)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：115所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端透過如SEQ ID NO：95所示的連接胜肽與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端連接；vi)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：115所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：80所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示；vii)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：116所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB 的結構域的N末端與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端直接連接；viii)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：116所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示；且標靶4-1BB的結構域的N末端透過如SEQ ID NO：95所示的連接胜肽與標靶B7-H4的結構域的重鏈的C末端連接；ix)雙特異性抗體I中，標靶B7-H4的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：116所示，標靶CD3的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81所示；雙特異性抗體II中，標靶B7-H4的結構域的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：80所示，標靶4-1BB的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示。
- 一種雙抗組合，其特徵在於，其包含雙特異性抗體I和雙特異性抗體II，或雙特異性抗體I和Urelumab；所述雙抗組合選自：i)雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：87所示的3 條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：89所示的2條多肽鏈；ii)雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：87所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：85所示的2條多肽鏈；iii)雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：87所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：84所示的2條多肽鏈；iv)雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：89所示的2條多肽鏈；v)雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：85所示的2條多肽鏈；vi)雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：84所示的2條多肽鏈；vii)雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116所示 的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：89所示的2條多肽鏈；viii)雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：85所示的2條多肽鏈；ix)雙特異性抗體I包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116所示的3條多肽鏈；雙特異性抗體II包括胺基酸序列分別如SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：84所示的2條多肽鏈。
- 一種分離的核酸，其特徵在於，所述分離的核酸編碼如請求項1-4任一項所述的雙抗組合中的雙特異性抗體I和雙特異性抗體II。
- 一種重組表現載體，其特徵在於，其包括如請求項5所述的分離的核酸。
- 一種轉形株，其特徵在於，其包含如請求項5所述的分離的核酸或如請求項6所述的重組表現載體。
- 如請求項7所述的轉形株，其中，所述轉形株的宿主為原核細胞或真核細胞。
- 如請求項8所述的轉形株，其中，所述原核細胞為大腸桿菌，所述真核細胞為酵母或哺乳動物細胞。
- 一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物包括如請求項1-4任一項所述的雙抗組合。
- 如請求項10所述的藥物組成物，其中，所述藥物組成物還包括第三治療劑免疫檢查點抗體和/或化療藥物。
- 一種套組，其特徵在於，所述的套組包括請求項1-4任一項所述的雙抗組合、請求項5所述的分離的核酸、請求項6所述的重組表現載體、請求項7所述的轉形株或請求項10所述的藥物組成物。
- 如請求項12所述的套組，其中，所述套組還包括說明書。
- 一種如請求項1-4任一項所述的雙抗組合、請求項5所述的分離的核酸、請求項6所述的重組表現載體、請求項7所述的轉形株或請求項10所述的藥物組成物在製備治療癌症的藥物中的用途。
- 如請求項14所述的用途，其中，所述癌症為血瘤或固態腫瘤。
- 如請求項15所述的用途，其中，所述固態腫瘤為乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌。
- 一種套裝藥盒，其特徵在於，所述套裝藥盒包括藥盒I與藥盒II，所述藥盒I包括如請求項1-4任一項所述的雙抗組合中的雙特異性抗體I，所述藥盒II包括如請求項1-4任一項所述的雙抗組合中的雙特異性抗體II；或，所述藥盒I包括如請求項1-4任一項所述的雙抗組合中的雙特異性抗體I和雙特異性抗體II；所述藥盒II包括第三治療劑免疫檢查點抗體和/或化療藥物。
- 一種給藥裝置，其特徵在於，所述的給藥裝置包含：用於對有需要的受試者施用請求項10所述的藥物組成物的輸注模組。
- 如請求項18所述的給藥裝置，其中，所述給藥裝置還包含藥效監控模組。
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