TW202104262A - 結合pd-1的抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了結合PD-1的抗體，其包含一個或多個選自具有以下所示的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO: 13、14、15、16、17、18。這些抗體對PD-1具有高親和力和低解離速率，並具有在體外中和PD-1的活性。本發明的抗體可以是全長抗體或是其抗原結合部分，其可以用於檢測PD-1等用途。

Description

結合PD-1的抗體
本發明屬於生物技術領域，涉及結合PD-1的抗體。
程式性死亡受體-1(PD-1)是在活化的T細胞、B細胞和髓樣細胞上表達的免疫抑制性受體，是CD28免疫球蛋白超家族成員。PD-1為55kDa的I型跨膜糖蛋白，其含有與配體結合的Ig可變型結構域和負責結合信號轉導分子的胞質尾區。PD-1胞質尾區含有兩個基於酪氨酸的信號轉導模體ITIM(免疫受體酪氨酸抑制基序)和ITSM(免疫受體酪氨酸轉換基序)。
現已鑒定了PD-1的兩種配體，PD-L1和PD-L2，為組成型表達，或在多種細胞類型中可被誘導，這些細胞類型包括非造血組織以及各種腫瘤。PD-L1在B細胞、T細胞、髓樣細胞和樹突狀細胞上表達，但也在外周細胞(例如微血管內皮細胞)和非淋巴器官(如心臟、肺等)中表達。與此相反，PD-L2僅在巨噬細胞和樹突狀細胞中存在。
在文獻中已確定了PD-1在癌症中的作用。顯示PD-1與其配體相互作用會負調節抗原受體信號轉導，減弱T細胞應答。PD-1減弱調節T細胞應答的機制與CTLA-4有相似也有不同之處，因為這兩種分子都調控重迭的一系列信號轉導蛋白。PD-L1在多種人腫瘤中都很豐富(並在大多數PD-L1陰性腫瘤細胞系中可由IFNγ誘導)。迄今有大量的研究顯示PD-1和PD-L1之間的相互作用導致滲入腫瘤的淋巴細胞減少、T細胞受體介導的增殖減少和癌細胞的免疫逃避。阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用顯示可增加T細胞增殖和細胞因數產生，提高腫瘤特異性CD8+T細胞的免疫性，因此，有助於免疫系統清除腫瘤細胞。
通過免疫組織化學評估活組織檢查業已在人的很多原發性腫瘤中發現 PD-1(在腫瘤浸潤淋巴細胞上)和/或PD-L1(在腫瘤細胞上)。這樣的組織包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、結腸癌、神經膠質瘤、膀胱癌、乳腺癌、腎癌、食道癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌、尿道上皮細胞癌和胰腺癌以及頭頸腫瘤的病變組織。PD-1配體在多種腫瘤類型的腫瘤細胞上的表達與癌症患者預後不良相關聯。
總之，PD-1/PD-L1途徑是開發癌症治療的抗體療法的被充分證實的靶標。因此，需要識別PD-1的試劑和使用此類試劑的方法。
本發明提供一種結合PD-1的抗體或其片段。
為了解決以上技術問題，在本發明的一個方面，提供一種抗體或抗體片段，其包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自包含具有以下所示的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO: 13、14、15、16、17和18；或與其相比具有一個、兩個或三個保守替換的氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些實施方案中，所述抗體或抗體片段結合PD-1。
在一些實施方案中，所述抗體或抗體片段結合人PD-1(hPD-1)。
在一些實施方案中，所述抗體或抗體片段阻斷hPD-L1（人PD-L1）與hPD-1的結合和/或破壞hPD-1/hPD-L1介導的下游信號通路。
在一些實施方案中，上述抗體或抗體片段中，編碼SEQ ID NO: 13的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2的第73-114位所示。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，編碼SEQ ID NO: 14的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2的第160-177位所示。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，編碼SEQ ID NO: 15的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2的第271-303位所示。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，編碼SEQ ID NO: 16的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1的第91-108位所示。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，編碼SEQ ID NO: 17的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1的第148-192位所示。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，編碼SEQ ID NO: 18的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1的第292-327位所示。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述抗體或抗體片段包含一個、兩個或三個選自具有以下所示的氨基酸序列的重鏈CDR：SEQ ID NO: 16、17和18；和/或，
所述抗體或抗體片段包含一個、兩個或三個選自具有以下所示的氨基酸序列的輕鏈CDR：SEQ ID NO: 13、14和15。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述抗體或抗體片段包含具有以下所示的氨基酸序列的輕鏈CDR：SEQ ID NO: 13、14和15以及具有以下所示的氨基酸序列的重鏈CDR：SEQ ID NO: 16、17和18。
在一些實施方案中，所述抗體或抗體片段為分離的抗體或抗體片段。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述抗體或抗體片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區；所述重鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列具有至少90%，或至少95 %，至少98 %或者至少99 %同一性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列相比具有一個或多個保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或，所述輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列，與SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列具有至少90 %，或至少95 %，至少98 %或者至少99 %同一性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列相比具有一個或多個保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述抗體或抗體片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列，輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，編碼SEQ ID NO: 7的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼SEQ ID NO: 8的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述抗體或抗體片段進一步包含人γ4重鏈恆定區或其變體和/或人κ輕鏈恆定區或其變體。
為了解決以上技術問題，本發明還提供一種抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含如SEQ ID NO: 71所示的氨基酸序列，與SEQ ID NO: 71所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 71所示的氨基酸序列相比具有一個或多個保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 72所示的氨基酸序列，與SEQ ID NO: 72所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 72所示的氨基酸序列相比具有一個或多個保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述抗體或抗體片段包含SEQ ID NO: 71所示的重鏈和/或SEQ ID NO: 72所示的輕鏈。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述抗體或抗體片段包含SEQ ID NO: 71所示的重鏈和SEQ ID NO: 72所示的輕鏈。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，編碼SEQ ID NO: 71的核苷酸序列如SEQ ID NO: 73所示，編碼SEQ ID NO: 72的核酸序列如SEQ ID NO:74所示。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述抗體或抗體片段為人抗體或人抗體片段。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述抗體片段為Fab、Fv或scFv抗體。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述抗體或抗體片段為單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。
在一些實施方案中，上述任一所述的抗體或抗體片段中，所述變體包含至多20個、至多10個、至多5個或至多3個保守替換的氨基酸取代。
為了解決以上技術問題，在本發明的另一個方面，還提供上述任一項所述的抗體或抗體片段的變體，其包含一個、兩個或三個保守替換的氨基酸取代，同時保持與所述抗體或抗體片段相同的功能。
為了解決以上技術問題，在本發明的另一個方面，還提供如下B1）或B2）的生物材料： B1）編碼上述任一項所述的抗體或抗體片段或變體的核酸分子； 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA 或重組DNA；所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA或 hnRNA等； B2）含有B1）所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組細胞或重組微生物。
該生物材料與上面所述的抗體或抗體片段或變體相關，比如可以用來產生上面所述的抗體或抗體片段或變體。
在一些實施方案中，本發明提供包含如下1）或2）或3）所示的分子： 1）如下核酸片段： SEQ ID NO: 1中第91-108位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 1中第148-192位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 1中第292-327位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 2中第73-114位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 2中第160-177位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 2中第271-303位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 1所示的核酸片段； SEQ ID NO: 2所示的核酸片段； SEQ ID NO: 73所示的核酸片段；或 SEQ ID NO: 74所示的核酸片段； 2）與1）限定的核酸片段雜交且編碼上述任一項所述的抗體或抗體片段或變體的核酸片段； 3）與1）或2）限定的核酸片段具有90％以上的同一性且編碼上述任一項所述的抗體或抗體片段或變體的核酸片段。
上述核酸分子可用於上述的生物材料的一部分。
這裡使用的術語“同一性”可以用肉眼或電腦軟體（比如Ausubel et al. eds.（2007）在Current Protocols in Molecular Biology中所述的軟體程式）進行評價。當被比較的序列中的位置被相同的鹼基或氨基酸佔據時，則分子在該位置是同一的。兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列與另一序列有具有一定百分比（例如90 %、95 %、98%或者9 9%）的「序列同一性」是指當序列比對時，所比較的兩個序列中該百分比的鹼基或氨基酸相同。
在一些實施方案中，用抗PD-1抗體或抗體片段治療可與放療組合。放療誘導癌細胞死亡，並增加用於呈遞和啟動免疫細胞的腫瘤抗原的有效性。
在另一些實施方案中，用抗PD-1抗體或抗體片段治療可與手術組合以從受治療者中去除癌細胞。
在其它實施方案中，抗PD-1抗體或抗體片段可與能同PD-1阻斷產生協同作用的療法組合，所述療法包括用於激素消除或抑制血管生成的靶向藥物，或靶向在腫瘤細胞中具有活性的蛋白質的靶向藥物，所有這些均導致腫瘤細胞死亡增加和免疫刺激性腫瘤抗原的有效性提高。在與抗PD-1抗體或抗體片段聯合的情況下，T細胞活化作用的提高可導致對癌症的持久免疫控制。
在一些實施方案中，抗PD-1抗體或抗體片段可與用於治療癌症或感染性疾病的另一種治療性抗體聯合。提供的非限制性方案為抗PD-1與靶向Her2/neu或靶向EGF受體的抗體的組合。在另一個非限制性方案中，抗PD-1抗體或抗體片段與靶向VEGF或其受體的治療組合。在另一個實施方案中，抗PD-1抗體或抗體片段與抗CTLA-4抗體組合。在又一個非限制性方案中，抗PD-1抗體與靶向RSV的抗體組合。
在本發明的另一個方面，還提供製備上述任一所述的抗體或抗體片段或變體的方法，所述方法包括：
a.在能使編碼上述任一抗體或抗體片段或其變體的核酸分子表達的條件下於培養基中培養含有所述核酸分子的重組細胞，以製備所述抗體或抗體片段或變體。
在一些實施方案中，所述方法還包括： b.從所述重組細胞或培養基中回收所述抗體或抗體片段或變體。
在本發明的另一個方面，還提供上述任一項所述的抗體或抗體片段或變體在製備如下任一所示的產品中的應用： （1）檢測PD-1的產品； （2）刺激或提高免疫應答的產品； （3）治療癌症的產品。
在一些實施方案中，檢測PD-1的產品為檢測hPD-1的產品，例如體外檢測hPD-1在特定的細胞、組織或血清中的表達的產品，或體內檢測hPD-1的產品。
在一些實施方案中，在刺激或提高免疫應答的產品中，免疫細胞與抗原和所述抗體或抗體片段或變體接觸，以便提高刺激或提高對抗原的免疫應答。
在一些實施方案中，所述免疫應答是T細胞介導的免疫應答。
在一些實施方案中，在治療癌症的產品中，所述癌症為黑素瘤(例如惡性轉移性黑素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素難控制的前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、白血病、淋巴瘤和其它惡性腫瘤。
在本發明的另一個方面，還提供一種藥物組合物，其包含上述任一項所述的抗體或抗體片段或變體作為治療活性成分以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體或它們的混合物。
在本發明的另一個方面，還提供治療癌症比如上述癌症的方法，該方法包括對需要其的個體給予有效劑量的本發明所述的抗體或抗體片段或變體或藥物組合物，所述個體可以是（比如）嚙齒目動物、犬科動物、豬、靈長目動物或人。
在一些實施方案中，本發明提供的抗體或抗體片段與hPD-1結合並表現出較多優良特性，這些特性包括以下方面：
1、本發明提供的抗體或抗體片段與hPD-1高親和力結合，可調控免疫應答。具體地，本發明的抗體或抗體片段可以以約20 pM或更低的KD結合hPD-1。
2、本發明提供的抗體或抗體片段可以以約1.98×106 1/Ms或更快的k結合 結合hPD-1。
3、本發明提供的抗體或抗體片段可以以約4.11×10-5 1/s或更慢的k解離 結合hPD-1。可用生物膜層光學干涉測量法(例如ForteBio Octet法)來測量解離常數，也可以用表面等離子共振技術(例如Biacore)來測量解離常數。
4、本發明提供的抗體或抗體片段還可以以約1nM或更低的IC50 阻斷hPD-L1與hPD-1的結合。可用本領域任何已知的方法測量配體結合的阻斷情況並計算IC50 ，例如FACS法。
5、本發明提供的抗體或抗體片段可以通過阻斷hPD-1與hPD-L1的結合來破壞hPD-1/hPD-L1介導的下游信號通路。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而非用於限定本發明的範圍。
縮寫和定義
除非另作說明，下列術語應當具有下文所述的含義。其他術語或縮寫具有本領域公知的含義。
「抗體」是指表現所需生物學活性(例如抑制配體與其受體的結合或通過抑制配體誘導的受體信號轉導)的抗體的任何形式。因此，「抗體」以其最廣泛的意義來使用，並明確包括但不限於單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體和多特異性抗體(例如雙特異性抗體) 、全人源、人源化、靈長類化、嵌合抗體，單鏈抗體等。
「抗體片段」指抗體的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其結構如何，抗體片段與被完整抗體識別的同一抗原結合。術語「抗體片段」包括適體、鏡像異構體和雙價抗體。術語「抗體片段」還包括通過與特定抗原結合形成複合物起抗體作用的任何合成或基因工程蛋白質。
「Fab片段」由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
「Fc區」含有包含抗體的CH2和CH3結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並通過CH3結構域的疏水作用保持在一起。
「Fv區」包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
「單鏈Fv抗體」(或「scFv抗體」)是指包含抗體的VH和VL結構域的抗體片段，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。一般而言，Fv多肽另外在VH和VL結構域之間包含多肽接頭，該接頭使得scFv能形成用於抗原結合的所需結構。對於scFv綜述，可參見美國專利第6423538號。
本領域技術人員將會理解，抗體重鏈的類別包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon（γ、μ、α、δ、ε），其中還有一些亞類（例如γ1-γ4）。該鏈的性質決定了抗體的「種類」分別為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亞類（同種型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被充分表徵並且賦予的功能特異性也已知。所有的免疫球蛋白種類都在本發明公開的保護範圍內。在一些實施方案中，免疫球蛋白分子為IgG種類。IgG通常包含分子量約23,000道爾頓的兩條相同的輕鏈多肽和分子量約為53,000-70,000的兩條相同的重鏈多肽。這四條鏈通過二硫鍵以「Y」構型連接，其中輕鏈從「Y」口開始並延續通過可變區包圍重鏈。IgG4形式的抗體為IgG的一種亞類，其重鏈為γ4亞型。在一些實施方案中，本發明公開的抗體為IgG4。
「超變區」是指負責抗原結合的抗體氨基酸殘基。超變區包含以下氨基酸殘基：來自序列比對所界定的「互補決定區」或「CDR」的氨基酸殘基。「構架」殘基或「FR」殘基為除本文定義的超變區殘基之外的可變結構域殘基。
本發明公開的抗體可以來源於任何動物，包括鳥類和哺乳動物。較佳地，抗體是人源、鼠源、驢源、兔源、山羊源、駱駝源、美洲駝源、馬源或雞源抗體。在另一實施方案中，可變區可以是軟骨魚綱（condricthoid）來源（例如來自鯊魚）。「人抗體」為其氨基酸序列對應於由人產生的抗體的氨基酸序列的抗體，和/或業已用任何用於製備本文所示的人抗體的技術製備的抗體。該定義明確排除了包含非人類抗原結合殘基的人源化抗體。
“分離的抗體”為與全部或部分的天然環境組分分離的抗體。其天然環境的污染組分是會干擾所述抗體的診斷性或治療性應用的物質，可包括酶、激素和其它蛋白質溶質或非蛋白質溶質。在一些實施方案中，將所述抗體純化到以下程度：(1)超過95％重量的抗體，如超過99％重量，其由Lowry法測定；(2)足以通過用旋杯式測序儀獲得N-末端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度；或(3)通過在還原或非還原條件下用考馬斯藍或銀染色的SDS-PAGE確定為同質。分離的抗體包括在重組細胞內的原位的抗體，因為抗體自然環境中的至少一種組分將不存在。分離的抗體通常由至少一個純化步驟製備。在一些實施方案中，分離的抗體的純度至少為約50 %、約60 %、約70 %、約80 %、約90 %、約95 %、約99 %，或這些數值中的任何兩個值之間的範圍（包括終點）或其中任何值。
「核酸」或「多核苷酸」是指由單個核苷酸：腺嘌呤（a）、胞嘧啶（c）、鳥嘌呤（g）、胸腺嘧啶（t）（或RNA中的尿嘧啶（u））組成的聚合物分子，例如DNA，RNA或其修飾。核酸分子可以是天然的核酸分子或合成的核酸分子或一種或多種天然的核酸分子與一種或多種合成的核酸分子的組合。核酸的實施例包括但不限於：基因或基因片段（例如探針、引物、EST或SAGE標籤）、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、轉運RNA、核糖體RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重組多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。
「分離的核酸分子」為被鑒定並與至少一種污染性核酸分子分離的核酸分子。分離的核酸分子不同於其天然存在的形式或環境。因此，分離的核酸分子與在其天然細胞中存在的核酸分子有區別。然而，分離的核酸分子包括在如常表達抗體的細胞中所含的核酸分子，例如，所述核酸分子所處的染色體位置不同於天然細胞的染色體位置。
「單克隆抗體」是指從基本上同種抗體群中獲得的抗體，構成所述群的各個抗體是一致的。單克隆抗體具有高度特異性，可針對單個的抗原位點。此外，與通常包括針對多個不同的決定簇(表位)的多種不同抗體的常規(多克隆)抗體製備物相反，每種單克隆抗體僅針對抗原上的單個決定簇。
「免疫細胞」包括具有造血的起源並在免疫應答中起作用的細胞。免疫細胞包括：B淋巴細胞和T淋巴細胞；天然殺傷細胞；單核細胞、巨噬細胞、嗜酸細胞、肥大細胞、嗜鹼細胞和粒細胞。
本文所用序列「變體」是指在一個或多個氨基酸殘基處不同於所示的序列但保留所得到的分子的生物學活性的序列。
「氨基酸」是指既含氨基又含羧基的有機化合物，比如α-氨基酸，其可直接或以前體的形式由核酸編碼。單個氨基酸由三個核苷酸(所謂的密碼子或鹼基三聯體)組成的核酸編碼。相同氨基酸可由不同密碼子編碼稱為“遺傳密碼的簡並性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代碼：ala，一字母代碼：A)、精氨酸(arg，R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、穀氨醯胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、組氨酸(his，H)、異亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、賴氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、絲氨酸(ser，S)、蘇氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和纈氨酸(val，V)。
「保守替換的變體」或“保守替換的氨基酸取代”是指本領域技術人員已知的氨基酸取代，進行這種取代通常不改變所得到的分子的生物學活性。一般而言，本領域技術人員公認在多肽非必需區的單個氨基酸取代基本上不改變生物學活性。保守替換可以是由含有化學性質相似側鏈的氨基酸取代，比如：1）脂族側鏈：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2）脂族羥基側鏈：絲氨酸和蘇氨酸；3）含醯胺的側鏈：天冬醯胺和穀氨醯胺；4）芳族側鏈：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5）鹼性側鏈：賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6）酸性側鏈：天冬氨酸和谷氨酸。
本文所用術語“約”是指數值在由本領域一般技術人員所測定的具體值的可接受誤差範圍內，所述數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。或者，「約」可意味著至多±20 %的範圍，比如±10 %，±5 % 或±1 %範圍。除非另外說明，否則當具體值在本申請和請求項中出現時，“約”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。
當提及配體/受體、抗體/抗原或其它結合對時，「特異性」結合是指在蛋白和/或其它生物試劑的異質群體中確定是否存在所述蛋白例如PD-1的結合反應。因此，在所指定的條件下，特定的配體/抗原與特定的受體/抗體結合，並且並不以顯著量與樣品中存在的其它蛋白結合。特異性結合可以用平衡解離常數（KD）來描述，較小的KD意味著較緊密的結合。確定兩個分子是否特異性結合的方法是本領域內眾所周知的，並包括例如平衡透析、表面等離子共振、生物膜層光學干涉測量法等。「特異性結合」PD-1的抗體包括與PD-1平衡解離常數KD小於或等於約100 nM、小於或等於約10 nM、小於或等於約5 nM、或小於或等於約1 nM的抗體。
本文所用術語「生物材料」包括但不限於核酸分子、表達盒、重組載體、重組細胞或重組微生物。
當用「給予」和「治療」提及動物、人、實驗物件、細胞、組織、器官或生物液時，是指將外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受治療者、細胞、組織、器官或生物液接觸。「給予」和「治療」可指例如治療方法、藥動學方法、診斷方法、研究方法和實驗方法。治療細胞包括讓試劑與細胞接觸以及讓試劑與流液接觸，其中所述流液與細胞接觸。「給予」和「治療」還意味著例如通過試劑、診斷劑、結合組合物或通過其他細胞對細胞進行體外和離體治療。
本文所用「抑制」或「治療 (treat或treatment) 」包括延緩與疾病有關的症狀的發展和/或減輕所述疾病將要或預期發展的這些症狀的嚴重程度。所述術語還包括減緩已有症狀、防止另外的症狀和減緩或防止這些症狀的潛在原因。因此，所述術語表示業已將有益結果賦予患有疾病的脊椎動物對象，比如人。
本文所用術語「治療有效量」或「有效量」是指當將抗PD-1抗體或其片段單獨給予或與另外的治療劑聯合給予細胞、組織或受治療者時，其有效防止或減緩待治療的疾病或病症的量。治療有效劑量進一步指所述抗體或其片段足以導致症狀減緩的量，所述減緩症狀例如為治療、治癒、防止或減緩相關醫學狀態，或提高對所述病徵的治療率、治癒率、防止率或減緩率。對具體受治療者的有效量可視多種因素而變化，例如待治療的疾病、患者的整體健康狀況、給藥的方法途徑和劑量及副作用的嚴重性。有效量可為避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。當施用給個體單獨給予的活性成分時，治療有效量是指該單獨的成分。當施用組合時，治療有效量是指產生治療效果的活性成分的聯合的量，而不論其是聯合給予、連續給予還是同時給予。治療有效量將減輕症狀通常至少10 %；通常至少20 %；較佳至少約30 %；更佳至少40 %和最佳至少50 %。在一些實施方案中，將抗PD-1抗體或者其片段的有效量為0.01 mg-1 g。在一些實施方案中，將抗PD-1抗體或者其片段的有效量為10 mg-750 mg。本文所述抗體可以通常方法途徑給藥，比如靜脈或皮下注射。
單克隆抗體
可根據本領域知識和技能來製備針對PD-1的單克隆抗體，抗體或抗體片段可分離自scFv酵母呈現文庫。
用常規方法便可容易地分離編碼單克隆抗體的DNA並測定其序列。所述DNA一經分離便可將其置於表達載體中，然後將該載體轉染到宿主細胞中以在重組宿主細胞中實現單克隆抗體的合成，所述宿主細胞例如有大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不會另外產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞。抗體的重組製備將在下文更詳細地闡述。
嵌合抗體
還可對抗體DNA進行修飾，例如通過用人重鏈和輕鏈恆定結構域的編碼序列取代同源性鼠序列，或通過使編碼免疫球蛋白的序列與編碼非免疫球蛋白物質(例如蛋白質結構域)的全部或部分序列共價連接。通常用所述非免疫球蛋白物質取代抗體的恆定結構域，或被取代抗體的一個抗原結合位元點的可變結構域，以產生二價嵌合抗體，所述二價嵌合抗體包含對抗原具有特異性的一個抗原結合位點和對不同的抗原具有特異性的另一抗原結合位點。
抗體純化
當使用重組技術時，抗體可產生在細胞內、周質空間或直接分泌到培養基中。若抗體在細胞內或周質空間產生，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA和苯基甲基磺醯氟(PMSF)存在下在約30分鐘內使細胞泥漿凍融，通過離心去除細胞碎片。當抗體分泌到培養基中時，可以首先用市售的蛋白質濃縮篩檢程式(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自所述表達系統的上清液。可在任何前述步驟中使用蛋白酶抑制劑(例如PMSF)以抑制蛋白水解，可使用抗生素以防止外來污染物生長。
可用例如羥基磷灰石、凝膠電泳、透析和親和色譜從細胞製備抗體組合物，並且親和色譜是優選純化技術。蛋白A是否適合作為親和配體，取決於抗體中存在的免疫球蛋白Fc區的種類和同種型。可將蛋白A用於純化基於人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等，1983，J.Immunol.Meth.62：1-13)。親和配體所依附的基質通常為瓊脂糖，也可利用其它基質。機械穩定的基質例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，可比瓊脂糖能獲得的流速更快且處理時間更短。當抗體包含CH3結構域時，用Bakerbond ABXTM樹脂來純化。根據待回收的抗體，還可利用其它蛋白質純化技術，例如離子交換柱上分級分離、乙醇沉澱、反相HPLC、陰離子或陽離子交換樹脂(例如聚天冬氨酸柱)色譜法、色譜聚焦法和SDS-PAGE。
本發明抗體及抗體片段的治療應用
與PD-1特異性結合的本發明抗體或抗原結合片段可用於刺激或提高免疫應答。本發明抗體及抗體片段尤其適用於治療罹患可通過提高 T 細胞介導的免疫應答來治療的疾病的受治療者。在一些實施方案中，受治療者包括需要提高免疫應答的人患者。
在一些實施方案中，本發明還提供一種通過增加T細胞介導的免疫應答來治療疾病的方法。所述方法包括向有需要的患者施用本發明所述的有效治療量的抗體或抗原結合片段。在一些實施方案中，所述通過增加T細胞介導的免疫應答來治療的疾病為癌症。
癌症
本發明抗體或抗原結合片段可用於治療癌症(即抑制腫瘤細胞的生長或存活)。在一些實施方案中，可用本發明抗體抑制其生長的癌症包括通常對免疫療法有反應的癌症，但還包括迄今與免疫療法尚無關聯的癌症。在一些實施方案中，用於治療癌症的非限制性方案包括黑素瘤(例如惡性轉移性黑素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素難控制的前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、白血病、淋巴瘤和其它惡性腫瘤。另外，本發明包括可用本發明抗體或抗原結合片段抑制其生長的難治性或復發性癌。
本發明抗體及抗體片段的非治療性應用
非治療性應用的抗PD-1抗體商品已經存在，比如由R&D Systems of Minneapolis，MN，USA所售的Mab1086抗hPD-1單克隆抗體，可用於流式細胞術、Western Blot和ELISA。本發明抗體可用於Mab1086所提供的任何非治療目的。
本發明抗體可用於診斷測定，例如用於檢測PD-1在特定的細胞、組織或血清中的表達。為了診斷應用，通常用可檢測的部分(直接或間接)標記抗體。可利用眾多標記物，其通常分為以下類別：生物素、螢光染料、放射性核苷酸、酶、碘和生物合成標記物。
本發明抗體還可用於體內診斷測定。通常用放射性核素(例如111 In、99 Tc、4 C、125 I、3 H、32 P、35 S或18 F)標記抗體，以使可用免疫顯像(immunoscintigraphy)或正電子成像術定位抗原或表達抗體的細胞。
藥物組合物
本發明還提供了藥物組合物。這樣的組合物包含有效劑量的抗體或抗體片段以及藥學上可接受的載體。
在一些實施方案中，術語“藥學上可接受的載體”是指由政府的監管機構批准的或其他公認的藥典中列出的用於動物（特別是用於人類）的物質。此外，「藥學上可接受的載體」通常將是任何類型的無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封材料或製劑助劑。
術語「載體」是指與活性成分一起使用的用於治療的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。這此類藥物載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動植物或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。在一些實施方案中，當藥物組合物靜脈內給藥時，載體可以是水。鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液體載體，特別是用於注射溶液。合適的藥物載體的實例在E. W. Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中有描述，在此通過引用併入本發明。此類組合物將含有臨床有效劑量的抗體或抗體片段，連同合適的載體，以提供適合於患者的給藥形式。該製劑應該適用於給藥模式。製劑可以封裝在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑膠製成的多劑量小瓶中。
在一些實施方案中，根據常規步驟將組合物配製成適合靜脈內注射於人體的藥物組合物。用於靜脈內給藥的組合物通常是在無菌等滲水性緩衝液中的溶液。藥物組合物還可包含增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因，從而緩解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以單位劑量形式單獨供給或混在一起供給，如以乾燥的凍幹粉末或無水濃縮物的形式裝在可指示活性劑份量的密封容器（如安瓿瓶或小袋）中。在通過輸注施用組合物的情況下，可以用含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶來分裝組合物。在通過注射施用組合物的情況下，可以使用注射用的無菌水或鹽水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
本發明的抗體或抗體片段包括其鹽的形式。藥學上可接受的鹽包括衍生自如與鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子形成的鹽，以及衍生自如與鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的陽離子形成的鹽。
試劑或材料
hPD-1為北京義翹神州科技有限公司產品，產品目錄號為10377-H03H-B。
hIgG為金斯瑞生物科技有限公司產品，產品目錄號為A01006。
表達hPD-1的Jurkat細胞為Promega公司產品，產品目錄號為J1252。
未標記的hPD-L1為北京義翹神州科技有限公司產品，產品目錄號為10084-HNAH。
PE標記的山羊抗人Fc為Thermofisher公司產品，產品目錄號為12-4998-82。
CHO-K1細胞為Promega公司產品，產品目錄號為J1252。
F-12為Thermofisher公司產品，產品目錄號為11765062。
Bio-Glo Luciferase Assay System為Promega公司產品，產品目錄號為G7940。
實施例1：抗hPD-1抗體的製備及其序列測定
首先根據人淋巴細胞mRNA製備人VL和VH cDNA，再由此製備scFv酵母呈現文庫，通過篩選該文庫分離本文公開的CL1和CL1相關抗體。本領域已知道製備和篩選這種文庫的方法學。可以在以下文獻中找到特別適用於製備和篩選抗體呈現文庫的方法和試劑：例如Wittrup等的美國專利6423538號。
用基因測序方法，測定編碼由酵母表達的scFv可變區的DNA序列。用Seqman分析用於每個克隆的每個測序反應結果。序列在序列表中公開並在表1中列出。
表1 本發明抗hPD-1抗體的DNA或氨基酸序列
SEQ ID NO： 說明 序列
1 CL1重鏈可變區（DNA） caggtgcagctggtgcagtccggcgtggaggtgaagaagcctggcgccagcgtgaaggtgtcctgtaaggccagcggctacaccttcaccaattactatatgtattgggtgcggcaggcccccggccagggactggagtggatgggaggcatcaatcccagcaacggcggcaccaacttcaatgagaagtttaagaaccgggtgaccctgaccaccgatagcagcaccaccaccgcttacatggagctgaagagcctgcagtttgacgataccgctgtgtactattgcgctgcccgggatcaggctggacatgggcttcgagttctggggccagggcaccaccgtgaccgtgtccagc
2 CL1輕鏈可變區（DNA） gagatcgtgctgacccagtcccccgctaccctgagcctgtcccccggagagcgggctaccctgtcttgtcgggcctccaagggcgtgagcaccagcggatactcctatctgcactggtaccagcagaagcccggccaggctcccaggctgctgatctacctggcttcctacctggagagcggcgtgcccgctaggtttagcggcagcggcagcggaaccgatttcaccctgaccatcagctccctggagcccgaggattttgccgtgtactactgccagcacgcttacgacctgcccctgacctttggcggcggcaccaaggtggagatcaag
3 CL5重鏈可變區（DNA） caagttcaattagtccaaagtggtgtcgaagtaaagaagccaggtgcctcagtcaaagtcagttgtaaagcctcaggttatacatttacaaactactacatgtactgggttagacaagccccaggtcaaggtttggaatggatgggtggtatcaatccttcaaacggtggcaccaacttcaacgaaaagttcaagaacagagtaactttgactacagattcttcaaccactacagcatacatggaattgaaatctttacaattcgatgacacagctgtttactactgtgcagcgcgtgattacagattcgacatgggtttcgaatactggggtcaaggtaccactgttactgtctcctct
4 CL5輕鏈可變區（DNA） gaaattgtcttgactcaatctccagctacattgtccttaagtcctggtgaaagagccacattgtcatgcagagcttccaaaggtgtatctacctcaggttactcttacttgcattggtatcaacaaaagccaggtcaagcacctagattgttgatctacttggccagttacttggaatctggtgttccagctagattttccggtagtggttctggtactgacttcacattgaccatatcttcattagaacctgaagatttcgcagtctattactgccaacattcttatgaccttccacttacattcggaggtggtacaaaggtagaaataaaa
5 CL9重鏈可變區（DNA） caagttcaattagtccaaagtggtgtcgaagtaaagaagccaggtgcctcagtcaaagtcagttgtaaagcctcaggttatacatttacaaactactacatgtactgggttagacaagccccaggtcaaggtttggaatggatgggtggtatcaatccttcaaacggtggcaccaacttcaacgaaaagttcaagaacagagtaactttgactacagattcttcaaccactacagcatacatggaattgaaatctttacaattcgatgacacagctgtttactactgtgcagcacgtgattacaaattcgacatgggtttcgaattctggggtcaaggtaccactgttactgtctcctct
6 CL9輕鏈可變區（DNA） gaaattgtcttgactcaatctccagctacattgtccttaagtcctggtgaaagagccacattgtcatgcagagcttccaaaggtgtatctacctcaggttactcttacttgcattggtatcaacaaaagccaggtcaagcacctagattgttgatctacttggccagttacttggaatctggtgttccagctagattttccggtagtggttctggtactgacttcacattgaccatatcttcattagaacctgaagatttcgcagtctattattgccaacattcctatggccttccagttacattcggtggtggtacaaaggtagaaataaaa
7 CL1重鏈可變區（AA） QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCAARDYRLDMGFEFWGQGTTVTVSS
8 CL1輕鏈可變區（AA） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHAYDLPLTFGGGTKVEIK
9 CL5重鏈可變區（AA） QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCAARDYRFDMGFEYWGQGTTVTVSS
10 CL5輕鏈可變區（AA） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSYDLPLTFGGGTKVEIK
11 CL9重鏈可變區（AA） QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCAARDYKFDMGFEFWGQGTTVTVSS
12 CL9輕鏈可變區（AA） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSYGLPVTFGGGTKVEIK
13 CL1輕鏈CDR1（AA） ASKGVSTSGYSYLH
14 CL1輕鏈CDR2（AA） LASYLE  
15 CL1輕鏈CDR3（AA） YCQHAYDLPLT
16 CL1重鏈CDR1（AA） NYYMYW
17 CL1重鏈CDR2（AA） GINPSNGGTNFNEKF
18 CL1重鏈CDR3（AA） ARDYRLDMGFEF  
19 CL5輕鏈CDR1（AA） ASKGVSTSGYSYLH
20 CL5輕鏈CDR2（AA） LASYLE
21 CL5輕鏈CDR3（AA） YCQHSYDLPLT  
22 CL5重鏈CDR1（AA） NYYMYW
23 CL5重鏈CDR2（AA） GINPSNGGTNFNEKF
24 CL5重鏈CDR3（AA） ARDYRFDMGFEY
25 CL9輕鏈CDR1（AA） ASKGVSTSGYSYLH
26 CL9輕鏈CDR2（AA） LASYLE
27 CL9輕鏈CDR3（AA） YCQHSYGLPVT
28 CL9重鏈CDR1（AA） NYYMYW
29 CL9重鏈CDR2（AA） GINPSNGGTNFNEKF
30 CL9重鏈CDR3（AA） ARDYKFDMGFEF
31 CL2重鏈可變區（DNA） caagttcaattagtccaaagtggtgtcgaagtaaagaagccaggtgcctcagtcaaagtcagttgtaaagcctcaggttatacatttacaaactactacatgtactgggttagacaagccccaggtcaaggtttggaatggatgggtggtatcaatccttcaaacggtggcaccaacttcaacgaaaagttcaagaacagagtaactttgactacagattcttcaaccactacagcatacatggaattgaaatctttacaattcgatgacacagctgtttactactgtgcagcccgtgattacaaattcgacatgggtttcgagtactggggtcaaggtaccactgttactgtctcctct
32 CL2輕鏈可變區（DNA） gaaattgtcttgactcaatctccagctacattgtccttaagtcctggtgaaagagccacattgtcatgcagagcttccaaaggtgtatctacctcaggttactcttacttgcattggtatcaacaaaagccaggtcaagcacctagattgttgatctacttggccagttacttggaatctggtgttccagctagattttccggtagtggttctggtactgacttcacattgaccatatcttcattagaacctgaagatttcgcagtctattattgccaacattcctatggtcttccacttacattcggtggtggtacaaaggtagaaataaaa
33 CL7重鏈可變區（DNA） caagttcaattagtccaaagtggtgtcgaagtaaagaagccaggtgcctcagtcaaagtcagttgtaaagcctcaggttatacatttacaaactactacatgtactgggttagacaagccccaggtcaaggtttggaatggatgggtggtatcaatccttcaaacggtggcaccaacttcaacgaaaagttcaagaacagagtaactttgactacagattcttcaaccactacagcatacatggaattgaaatctttacaattcgatgacacagctgtttactactgtgcagcccgtgattaccgattcgacatgggtttcgagttttggggtcaaggtaccactgttactgtctcctct
34 CL7輕鏈可變區（DNA） gaaattgtcttgactcaatctccagctacattgtccttaagtcctggtgaaagagccacattgtcatgcagagcttccaaaggtgtatctacctcaggttactcttacttgcattggtatcaacaaaagccaggtcaagcacctagattgttgatctacttggccagttacttggaatctggtgttccagctagattttccggtagtggttctggtactgacttcacattgaccatatcttcattagaacctgaagatttcgcagtctattattgccaacattcctatagttttccactcacattcggtggtggtacaaaggtagaaataaaa
35 CL6重鏈可變區（DNA） caagttcaattagtccaaagtggtgtcgaagtaaagaagccaggtgcctcagtcaaagtcagttgtaaagcctcaggttatacatttacaaactactacatgtactgggttacacaagccccaggtcaaggtttggaatggatgggtggtatcaatccttcaaacggtggcaccaacttcaacgaaaagttcaagaacagagtaactttgactacagattcttcaaccactacagcatacatggaattgaaatctttacaattcgatgacacagctgtttactactgtgcagcccgtgattacagatttgacatgggtttcgagttctggggtcaaggtaccactgttactgtctcctct
36 CL6輕鏈可變區（DNA） gaaattgtcttgactcaatctccagctacattgtccttaagtcctggtgaaagagccacattgtcatgcagagcttccaaaggtgtatctacctcaggttactcttacttgcattggtatcaacaaaagccaggtcaagcacctagattgttgatctacttggccagttacttggaatctggtgttccagctagatgttccggtagtggttctggtactgacttcacattgaccatatcttcattagaacctgaagatgtcgcagtctattattgccaacattcctatgaccttccacttacattcggtggtggtacaaaggtagagataaaa
37 CL2重鏈可變區（AA） QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCAARDYKFDMGFEYWGQGTTVTVSS
38 CL2輕鏈可變區（AA） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSYGLPLTFGGGTKVEIK
39 CL7重鏈可變區（AA） QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCAARDYRFDMGFEFWGQGTTVTVSS
40 CL7輕鏈可變區（AA） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSYSFPLTFGGGTKVEIK
41 CL6重鏈可變區（AA） QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCAARDYRFDMGFEFWGQGTTVTVSS
42 CL6輕鏈可變區（AA） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSYDLPLTFGGGTKVEIK
43 CL2輕鏈CDR1（AA） ASKGVSTSGYSYLH
44 CL2輕鏈CDR2（AA） LASYLE
45 CL2輕鏈CDR3（AA） YCQHSYGLPLT
46 CL2重鏈CDR1（AA） NYYMYW
47 CL2重鏈CDR2（AA） GINPSNGGTNFNEKF
48 CL2重鏈CDR3（AA） ARDYKFDMGFEY
49 CL7輕鏈CDR1（AA） ASKGVSTSGYSYLH
50 CL7輕鏈CDR2（AA） LASYLE
51 CL7輕鏈CDR3（AA） YCQHSYSFPLT
52 CL7重鏈CDR1（AA） NYYMYW
53 CL7重鏈CDR2（AA） GINPSNGGTNFNEKF
54 CL7重鏈CDR3（AA） ARDYRFDMGFEF
55 CL6輕鏈CDR1（AA） ASKGVSTSGYSYLH
56 CL6輕鏈CDR2（AA） LASYLE
57 CL6輕鏈CDR3（AA） YCQHSYDLPLT
58 CL6重鏈CDR1（AA） NYYMYW
59 CL6重鏈CDR2（AA） GINPSNGGTNFNEKF
60 CL6重鏈CDR3（AA） ARDYRFDMGFEF
61 CL20重鏈可變區（DNA） caggtgcagctggtgcagtcaggggtggaggtcaaaaagcccggtgcctcagtcaaagtgtcttgtaaagcctctggatatacatttactaactactatatgtactgggtgaggcaggcaccaggacagggtctggagtggatgggcggaatcaacccctctaatgggggtaccaacttcaacgaaaagtttaaaaaccgggtgacactgaccacagattccagcactaccacagcctatatggagctgaagtccctgcagttcgacgatacagcagtgtactattgcgccaggcgggactacagattcgatatgggctttgactattggggccagggaactaccgtcaccgtgtctagt
62 CL20輕鏈可變區（DNA） gaaattgtgctgacccagagccccgccactctgtctctgagtccaggagagagggccaccctgtcatgccgagcttccaagggcgtgtccacctccggctacagttatctgcactggtaccagcagaaacccggacaggcacctagactgctgatctacctggccagctatctggaatctggcgtgccagctaggttcagcggctctggaagtgggaccgactttaccctgacaatttccagcctggagcccgaagatttcgcagtctactattgccagcattctcgtgacctgcccctgacattcggcggtggaacaaaagtggaaatcaag
63 CL20重鏈可變區（AA） QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS
64 CL20輕鏈可變區（AA） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK
65 CL20輕鏈CDR1（AA） RASKGVSTSGYSYLH
66 CL20輕鏈CDR2（AA） LASYLES
67 CL20輕鏈CDR3（AA） QHSRDLPLT
68 CL20重鏈CDR1（AA） NYYMY
69 CL20重鏈CDR2（AA） GINPSNGGTNFNEKFKN
70 CL20重鏈CDR3（AA） RDYRFDMGFDY
71 CL1重鏈全長（AA） QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCAARDYRLDMGFEFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
72 CL1輕鏈全長（AA） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHAYDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
73 CL1重鏈全長（DNA） caggtgcagctggtgcagtccggcgtggaggtgaagaagcctggcgccagcgtgaaggtgtcctgtaaggccagcggctacaccttcaccaattactatatgtattgggtgcggcaggcccccggccagggactggagtggatgggaggcatcaatcccagcaacggcggcaccaacttcaatgagaagtttaagaaccgggtgaccctgaccaccgatagcagcaccaccaccgcttacatggagctgaagagcctgcagtttgacgataccgctgtgtactattgcgctgcccgggattacaggctggacatgggcttcgagttctggggccagggcaccaccgtgaccgtgtccagcgctagcaccaagggcccttccgtgttccccctggccccctgtagccggtccacctctgagagcaccgctgctctgggctgtctggtgaaggattactttcccgaaccggtgaccgtgtcatggaactccggggctctgacatccggtgtccacacttttcctgcagtgctgcagtcatccggcctgtacagcctgagctctgtggtcacagtcccaagttcatccctgggaaccaagacatatacttgcaacgtggatcataaacccagcaatactaaggtcgacaaacgagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagcacctgagttcctgggaggaccaagcgtgttcctgtttcctccaaagcctaaagataccctgatgatcagtcggactcccgaggtcacctgcgtggtcgtggacgtgtcccaggaggaccctgaagtccagttcaactggtacgtggacggcgtcgaagtgcacaatgctaagacaaaacctcgagaggaacagtttaactccacataccgtgtcgtgagcgtcctgactgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaggagtataagtgcaaagtgagcaataagggactgccaagctctatcgagaaaactatttctaaggctaaaggacagcctagggaaccacaggtgtacaccctgccccctagtcaggaggaaatgactaagaaccaggtctcactgacctgtctggtgaaagggttctatccttcagatattgcagtggagtgggaatccaatggtcagccagagaacaattacaagacaactccacccgtgctggacagcgatgggtctttctttctgtattctagactgaccgtggacaaaagtcgctggcaggagggtaatgtcttttcttgtagtgtgatgcacgaagccctgcacaaccactacactcagaaaagcctgtcactgtccctgggtaaa
74 CL1輕鏈全長（DNA） gagatcgtgctgacccagtcccccgctaccctgagcctgtcccccggagagcgggctaccctgtcttgtcgggcctccaagggcgtgagcaccagcggatactcctatctgcactggtaccagcagaagcccggccaggctcccaggctgctgatctacctggcttcctacctggagagcggcgtgcccgctaggtttagcggcagcggcagcggaaccgatttcaccctgaccatcagctccctggagcccgaggattttgccgtgtactactgccagcacgcttacgacctgcccctgacctttggcggcggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
注:表中括弧中的DNA是指核苷酸，AA是指氨基酸。 編碼SEQ ID NO:13的核苷酸序列如SEQ ID NO:2的第73-114位所示； 編碼SEQ ID NO:14的核苷酸序列如SEQ ID NO:2的第160-177位所示； 編碼SEQ ID NO:15的核苷酸序列如SEQ ID NO:2的第271-303位所示； 編碼SEQ ID NO:16的核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第91-108位所示； 編碼SEQ ID NO:17的核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第148-192位所示； 編碼SEQ ID NO:18的核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第292-327位所示。
實施例2：構建和表達CL1抗體以及相關抗體
通過將PCR克隆的CL1抗體的VL和VH區DNA分別與人κ輕鏈恆定區和IgG4恆定區（γ4重鏈恆定區）連接構建輕鏈和重鏈DNA序列。用PCR引物修飾序列的5’和3’端，所述引物設計成為各鏈增加合適的前導序列，再克隆到現有重組抗體表達載體上，通過測序分析表明載體構建正確。用40 μg的表達質粒與700 μL的細胞總數為107 的CHO混勻，加入0.4 cm電轉杯，置於電轉儀，設置電轉參數（電壓300 V，電脈衝時間17 ms，方波）完成電穿孔。電轉完成後，在8mL生長培養基中培養這些細胞3天。用ELISA測量轉染上清液的抗體濃度，最終確定高表達且細胞生長狀況良好的工程細胞株。
細胞在搖瓶中於CD-CHO(Gibco)中生長12天。通過蛋白A親和層析，洗滌，用1M乙酸洗脫並用3M Tris中和，來純化細胞上清液中的抗體。最後，將緩衝液換成已用1M Tris調整到pH 5.5的100 mM乙酸，得到CL1抗體。
CL5、CL9、CL2、CL7、CL6和CL20的構建和表達同樣採用與上述類似的方法。
純化得到的CL1、CL5、CL9、CL2、CL7、CL6和CL20抗體的氨基酸序列與預期一致。
實施例3：抗hPD-1抗體與hPD-1的親和力分析
酶聯免疫吸附測定（ELISA）用於測定抗體與hPD-1的結合。通過4 ℃過夜孵育，將hPD-1固定在96孔板上。包被後，用PBST洗板5次。用PBST製備抗體CL1、CL5、CL9、CL2、CL7、CL6、CL20和hIgG的不同濃度的稀釋液，將其與固定的hPD-1在室溫下孵育1小時。結合後，用PBST洗板5次，在室溫下用含稀釋至1/10000的過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG的PBST孵育1小時，再次洗滌，用TMB顯色。
ELISA結果如圖1所示。用半最大效應濃度（EC50 ）表示結合親和力，結果顯示於表2。
實驗結果表明，抗hPD-1抗體CL1、CL5、CL9、CL2、CL7、CL6和CL20均結合hPD-1，其中CL1與hPD-1結合的EC50 為約0.208nM，親和力最強，明顯優於CL5、CL9、CL2、CL7、CL6和CL20。
實施例4：抗體CL1與hPD-1結合的動力學分析
為了進一步表徵抗體的結合特性，在Octet系統(ForteBio，門洛派克，加利福尼亞州)上用生物膜層光學干涉測量法對抗體CL1進行概況分析，以闡明結合動力學並計算平衡結合常數。通過用生物素讓hPD-1融合蛋白與鏈黴親和素生物感測器偶聯來實施該測定。
為便於將hPD-1固定於鏈黴親和素生物感測器基質上，需將hPD-1進行生物素化。首先溶解1.0 mg生物素於100 μl二甲基亞碸以製備10 mg/ml的生物素溶液，然後在每毫升hPD-1(1.8 mg/ml)加入10 μl生物素溶液，溫和攪拌反應物並於黑暗處於室溫保溫2小時，得到hPD-1-生物素。用25 ml冷PBS平衡裝有Sephadex G-25M (Pharmacia，目錄號 17-0851-01)的PD-10柱，並以每根柱2 ml hPD-1-生物素上柱。用10×1 ml冷PBS洗脫該柱。收集洗脫液，於OD280讀數，得到純化的hPD-1-生物素，將其儲存於-80 ℃直至使用。
將鏈黴親和素生物感測器浸沒在含有PBS的孔中10分鐘來使其預濕潤，然後用PBS平衡生物感測器2分鐘，通過將生物感測器浸沒在20 μg/mL hPD-1-生物素的PBS溶液中5分鐘來與hPD-1-生物素偶聯，用PBS平衡生物感測器2分鐘。通過將生物感測器置於含有各種抗體濃度(0.125-2nM，SDS-PAGE純度＞99 %的抗體)的孔中來觀察與抗PD-1抗體的結合情況，並監測測量30分鐘。在將生物感測器轉移到PBS後測量解離，並監測測量90分鐘。用包含所有測試濃度的1：1的結合球形擬合模型(binding global fit model)擬合所觀察到的結合和解離速率(k結合 和k解離 )，計算平衡結合常數KD。
動力學研究結果顯示於表2和圖2中。
實驗結果表明，CL1抗體與hPD-1結合的KD為約0.0207 nM，如此強的親和力是由於結合速率比一般抗體要高很多，且解離速率較慢。
實施例5：抗體CL1對hPD-1/hPD-L1結合的阻斷研究
用流式細胞術研究對配體結合的阻斷。將表達hPD-1的Jurkat細胞鋪在96孔板中，再加入各種濃度的抗體（CL1或hIgG（作為陰性對照））和濃度1μg/mL的未標記的hPD-L1。讓混合物置於冰上30分鐘，用FACS緩衝液(含有0.3 %BSA的PBS)洗滌3次，用PE標記的山羊抗人Fc在冰上再孵育30分鐘。用FACS緩衝液再次洗滌細胞3次，並用流式細胞儀分析。用Prism軟體的非線性回歸法分析資料並計算IC50 值。結果見表2和圖3。
實驗結果證明，抗PD-1抗體CL1能以劑量依賴方式完全抑制hPD-L1與Jurkat細胞的hPD-1的結合，IC50 值為約0.77nM。
表2 抗hPD-1抗體的親和力、動力學、配體結合阻斷和功能活性
  CL1 CL5 CL9 CL2 CL7 CL6 CL20
ELISA親和力分析 EC50 （nM） 0.208 0.399 0.594 0.451 0.346 1.336 0.242
ForteBio動力學分析 k結合 （1/Ms） k解離 （1/s） KD（nM）   1.98×106 4.11×10-5 0.0207 NA NA NA NA NA NA
配體結合阻斷研究 IC50 （nM） 0.77 NA NA NA NA NA NA
功能活性分析 EC50 （μg/ml） 0.269 0.932 NA NA NA NA NA
NA: 未進行相關實驗，無此資料。
實施例6：CL1相關抗體的動力學分析
按照實施例4所述通過生物膜層光學干涉測量法，分析與CL1抗體相關的一系列抗體。相關抗體的VL和VH區的氨基酸序列見序列表。各相關抗體的平衡結合常數KD示於表3中。
表3 CL1相關抗體與hPD-1的結合
VH VL 形式 KD（nM）
CL1 VH （SEQ ID NO:7） CL1 VL（SEQ ID NO:8） IgG4 0.0207
CL1 VH（SEQ ID NO:7） CL1 VL（SEQ ID NO:8） scFv 0.082
CL1 VH（SEQ ID NO:7） CL5 VL（SEQ ID NO:10） IgG4 0.076
CL1 VH（SEQ ID NO:7） CL5 VL（SEQ ID NO:10） scFv 0.143
CL1 VH（SEQ ID NO:7） CL9 VL（SEQ ID NO:12） IgG4 0.229
CL1 VH（SEQ ID NO:7） CL9 VL（SEQ ID NO:12） scFv 0.518
CL1 VH（SEQ ID NO:7） CL2 VL（SEQ ID NO:38） IgG4 0.189
CL1 VH（SEQ ID NO:7） CL2 VL（SEQ ID NO:38） scFv 0.447
CL1 VH（SEQ ID NO:7） CL7 VL（SEQ ID NO:40） IgG4 0.061
CL1 VH（SEQ ID NO:7） CL7 VL（SEQ ID NO:40） scFv 0.149
表3中的結果證明，相同VH和VL的情況下，scFv形式的抗體與hPD-1的親和力比IgG4形式的抗體親和力低。在相同抗體形式時，即都是IgG4或scFv時，將抗體CL1的VH氨基酸序列保持不變，並將抗體CL1的VL替換（替換為抗體CL5的VL、抗體CL9的VL、抗體CL2的VL或抗體CL7的VL）後，親和力都會下降，且替換成CL9的VL後，親和力下降最多。表明抗體CL1的VL在CL1與hPD-1的結合中起到重要作用，氨基酸序列改變後可能導致構象改變，與hPD-1的結合受到影響。
實施例7：抗hPD-1抗體的功能活性分析
為檢測抗hPD-1抗體的功能活性，進行該抗體抑制hPD-1活性的能力的體外檢測。
抗hPD-1抗體阻斷hPD-1/hPD-L1相互作用，啟動Jurkat細胞的TCR下游免疫信號通路。
報告基因是一個其表達產物非常容易被檢測的基因，把它的編碼序列和基因表達調控序列相融合形成嵌合基因，在調控序列控制下進行表達，從而通過檢測它的表達產物來間接檢測上游信號。PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay系統，適用於抗PD-1單克隆抗體的生物學活性檢測。其主要原理是：CHO-K1細胞株的細胞膜上構建了穩定表達的PD-L1和T細胞受體啟動蛋白（TCR activator），模擬抗原提呈細胞（APCs）；Jurkat是一種人T淋巴細胞系，細胞膜上有PD-1表達，且轉染了以NFAT為啟動子的Luciferase報告基因載體。當兩種細胞共孵育時，CHO-K1細胞的TCR activator與Jurkat細胞表面TCR結合，誘導下游信號通路，最終啟動報告基因表達，但同時PD-1/PD-L1的相互作用會阻斷這一啟動作用；在加入抗PD-1單克隆抗體後，PD-1/PD-L1的相互作用被阻斷，Luciferase報告基因恢復表達，產生螢光信號，且信號值與加入的抗PD-1單克隆抗體量呈正相關。
如下所述通過共溫育抗體與所述細胞，檢測評價抗hPD-1抗體。CHO-K1細胞用F-12+10 %FBS培養基（含200μg/ml Hygromycin B，250μg/ml G418）重懸，調整細胞密度為4.0×105 細胞/ml，以每孔100 μl接種到96孔細胞板中，將96孔板置於37 ℃，5 %CO2 培養箱中培養過夜。將含有125 μl抗體（CL1、CL5和hIgG）的96孔微滴定板用檢測稀釋液（含有1％胎牛血清(FBS)的RPMI培養基）沿著該板三份進行2.5倍連續稀釋。Jurkat細胞用檢測稀釋液重懸，調整細胞密度為1.25x106 細胞/ml。取出96孔板，倒棄培養基，然後取40 μl配製好的對照品（hIgG）及待測樣品（CL1、CL5）加入96孔板，並取40 μl Jurkat細胞加到96孔板中。將96孔板置於37 ℃，5 % CO2 培養箱中6 h後，室溫放置10 min後每孔加入80 μl Bio-Glo Luciferase Assay System試劑，室溫避光放置30min。用多功能酶標儀中的自發螢光檢測功能，讀取96孔板每孔的螢光值。運用SoftMax Pro 6.5.1軟體，以4-parameter模型對對照品和待測樣品資料進行曲線擬合，通過標準方法確定EC50 。結果示於表2和圖4。
表2和圖4的結果表明，在抗hPD-1抗體存在下，PD-1/PD-L1的相互作用被阻斷，受到抑制的Jurkat細胞的TCR下游信號通路重新啟動，Luciferase報告基因恢復表達，產生螢光信號，並且抗hPD-1抗體阻斷PD-1/PD-L1相互作用具有劑量依賴性。進一步地，抗體CL1和CL5抑制hPD-1活性的能力EC50 分別為約0.269 μg/ml和0.932 μg/ml，說明CL1對hPD-1活性的抑制能力更強，從細胞水準上再次證明了抗體CL1的功能活性優於CL5，這也和實施例3的結果保持一致。
實施例8： 抗體CL1以及抗體CL20與hPD-1的結合動力學分析比較
在Biacore系統（GE，Boston，MA）上用表面等離子共振技術對抗體CL1以及抗體CL20與hPD-1的結合動力學進行了分析比較。
使用Protein A晶片進行檢測，濃度5 μg/ml的抗體CL1或抗體CL20以10 μl/min的流速通過實驗流路，捕獲10 s使捕獲量約為200 RU；之後流速調為30 µl/min，依次進不同濃度的PD-1（0.625 nM、1.25 nM、2.5 nM、5 nM、10 nM），結合時間180 s，解離時間1200 s。用1:1 Langmuir結合模型擬合得到結合和解離曲線，得出抗體CL1以及抗體CL20與hPD-1的結合動力學參數（k結合：結合速率；k解離：解離速率；KD：結合解離平衡常數）。動力學研究結果顯示於表4中。抗體CL1與hPD-1結合的KD為約0.606 nM，抗體CL20與hPD-1結合的KD為約4.434 nM，抗體CL1與hPD-1的親和力比抗體CL20高約7倍。
表4 抗體CL1以及CL20與hPD-1的結合動力學資料
  CL1 CL20
k結合（1/Ms） k解離（1/s） KD（nM） 8.252×105 4.999×10-4 0.606 1.025×106 4.544×10-3 4.434
無
圖1為蛋白ELISA中抗hPD-1抗體與純化的hPD-1劑量依賴性結合的曲線圖。 圖2 為描述由生物膜層光學干涉測量法(Biolayer Interferometry)測定的CL1抗體的k結合和k解離的曲線圖。其中，各曲線代表不同濃度的CL1抗體與hPD-1結合的動態過程。 圖3 為流式細胞術檢測CL1抗體對hPD-1/hPD-L1結合的阻斷。 圖4 為PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay檢測抗hPD-1抗體的功能活性。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
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Claims (13)

  1. 一種抗體或抗體片段，其包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自具有以下所示的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO: 13、14、15、16、17和18。
  2. 根據請求項1所述之抗體或抗體片段，其特徵在於：該抗體或抗體片段包含一個、兩個或三個選自具有以下所示的氨基酸序列的重鏈CDR：SEQ ID NO: 16、17和18；和/或， 該抗體或抗體片段包含一個、兩個或三個選自具有以下所示的氨基酸序列的輕鏈CDR：SEQ ID NO: 13、14和15。
  3. 根據請求項1或2所述之抗體或抗體片段，其特徵在於：該抗體或抗體片段包含具有以下所示的氨基酸序列的輕鏈CDR：SEQ ID NO: 13、14和15以及具有以下所示的氨基酸序列的重鏈CDR：SEQ ID NO: 16、17和18。
  4. 根據請求項1-3任一項所述之抗體或抗體片段，其特徵在於：該抗體或抗體片段為分離的抗體或抗體片段。
  5. 根據請求項1-4任一項所述之抗體或抗體片段，其特徵在於：該抗體或抗體片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區；其中 該重鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列具有至少90 %同一性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列相比具有一個或多個保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或， 該輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列具有至少90 %同一性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列相比具有一個或多個保守氨基酸取代的氨基酸序列。
  6. 根據請求項1-5任一項所述之抗體或抗體片段，其特徵在於：該抗體或抗體片段進一步包含人γ4重鏈恆定區或其變體，和/或人κ輕鏈恆定區或其變體。
  7. 一種抗體或抗體片段，其包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含如SEQ ID NO: 71所示的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 71所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 71所示的氨基酸序列相比具有一個或複數個保守氨基酸取代的氨基酸序列；該輕鏈包含如SEQ ID NO: 72所示的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 72所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 72所示的氨基酸序列相比具有一個或複數個保守氨基酸取代的氨基酸序列。
  8. 請求項1-7任一項所述之抗體或抗體片段的變體，其包含一個、兩個或三個保守替換的氨基酸取代。
  9. 請求項1-7任一項所述之抗體或抗體片段或請求項8所述之變體相關的生物材料，為如下B1）或B2）： B1）編碼請求項1-7任一項所述之抗體或抗體片段或請求項8所述之變體的核酸分子； B2）含有B1）該核酸分子的表達盒、重組載體、重組細胞或重組微生物。
  10. 根據請求項9所述之生物材料，其特徵在於：B1）所述核酸分子包含如下1）或2）或3）所示之核酸片段： 1）如下DNA分子： SEQ ID NO: 1中第91-108位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 1中第148-192位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 1中第292-327位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 2中第73-114位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 2中第160-177位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 2中第271-303位所示的核酸片段； SEQ ID NO: 1所示的核酸片段； SEQ ID NO: 2所示的核酸片段； SEQ ID NO: 73所示的核酸片段；或 SEQ ID NO: 74所示的核酸片段； 2）與1）限定的核酸片段雜交且編碼請求項1-6任一項所述之抗體或抗體片段或請求項7所述之變體的核酸片段； 3）與1）或2）限定的DNA分子具有90 %以上的同一性且編碼請求項1-6任一項所述之抗體或抗體片段或請求項7所述之變體的核酸片段。
  11. 製備請求項1-7任一項所述之抗體或抗體片段或請求項8所述之變體的方法，所述方法包括： 在能使請求項9中B1）所述之核酸分子表達的條件下於培養基中培養含有所述核酸分子的重組細胞，以製備所述抗體或抗體片段或變體。
  12. 一種藥物組合物，其包含請求項1-7任一項所述之抗體或抗體片段或請求項8所述之變體以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體或它們的混合物。
  13. 請求項1-7任一項所述之抗體或抗體片段或請求項8所述之變體在製備如下任一所示的產品中的應用： （1）檢測PD-1的產品； （2）刺激或提高免疫應答的產品； （3）治療癌症的產品。
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