JP2022538375A - Ｐｄ－１と結合する抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３，１４，１５，１６，１７，１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲから選ばれる１つ又は複数を含む、ＰＤ－１と結合する抗体を開示する。これらの抗体は、ＰＤ－１に対して親和力が高くて解離速度が低いとともに、インビトロでＰＤ－１を中和する活性を有する。本発明の抗体は、完全長抗体又はその抗原結合部分であってもよく、ＰＤ－１の検出などの用途に適用することができる。

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明は、バイオテクノロジー分野に属し、ＰＤ－１と結合する抗体に関する。
〔背景技術〕
プログラム死受容体－１（ＰＤ－１）は、活性化したＴ細胞、Ｂ細胞と骨髄細胞において発現する免疫阻害受容体であり、ＣＤ２８免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。ＰＤ－１は、５５ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質であり、リガンドと結合するＩｇ可変型構造ドメインと、シグナル伝達分子と結合するための細胞質尾部とを含む。ＰＤ－１細胞質尾部は、２つのチロシンベースのシグナル伝達モジュールであるＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン阻害性モチーフ）とＩＴＳＭ（免疫受容体チロシンスイッチモチーフ）を含む。

ＰＤ－１の２種類のリガンドであるＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２が構成的発現であり、又は、非造血組織及び各種の腫瘍を含む種々の細胞型において誘導されることができることが検定されている。ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞と樹状細胞において発現されるが、末梢細胞（例えば、微小血管内皮細胞）と非リンパ器官（例えば、心臓、肺など）においても発現される。それに対して、ＰＤ－Ｌ２は、マクロファージと樹状細胞にのみ存在する。

文献において、がんにおけるＰＤ－１の作用が確定されている。ＰＤ－１とそのリガンドの相互作用は、抗原受容体シグナル伝達に負の調節を行い、Ｔ細胞応答を低減することが示されている。ＰＤ－１によりＴ細胞応答を弱く調節するメカニズムは、ＣＴＬＡ－４と似ているが、相違点もあり、この２つの分子は何れも、重なった一連のシグナル伝達タンパク質を調節するからである。ＰＤ－Ｌ１は、種々のヒト腫瘍において豊かである（大部分のＰＤ－１陰性腫瘍細胞系では、ＩＦＮγにより誘導可能である）。今までの多くの研究によると、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用により、腫瘍に侵入するリンパ球が低減され、Ｔ細胞受容体を介した増殖が低減され、がん細胞の免疫が回避されることが示されている。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断すると、Ｔ細胞の増殖と細胞因子の生成を増加し、腫瘍特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫性を向上させることができることが示されているため、免疫系による腫瘍細胞の除去に寄与する。

免疫組織により生物組織を化学的に評価する検査は、既に、多くのヒト原発性腫瘍においてＰＤ－１（腫瘍浸潤リンパ球で）及び／又はＰＤ－Ｌ１（腫瘍細胞で）を発見した。このような組織は、肺がん、肝がん、卵巣がん、子宮頚がん、皮膚がん、結腸がん、神経膠腫、膀胱がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、胃がん、口腔扁平上皮がん、尿道上皮がんと膵がん、及び頭頸部腫瘍の病変組織を含む。様々な腫瘍種類の腫瘍細胞におけるＰＤ－１リガンドの発現は、がん患者の予後不良に関連する。

要するに、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路は、がんを治療する抗体療法の開発において十分に実証された標的である。従って、ＰＤ－１の試薬、このような試薬を使用する方法を認識しなければならない。
〔発明の概要〕
本発明は、ＰＤ－１と結合する抗体又はそのフラグメントを提供する。

上記技術的問題を解決するために、本発明の一態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３，１４，１５，１６，１７及び１８に示されるアミノ酸配列、又は、それと比べて１つ、２つ又は３つの保存的置換をしたアミノ酸置換を有するＣＤＲから選ばれる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを含む抗体又は抗体フラグメントを提供する。

ある実施形態において、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＰＤ－１と結合する。

ある実施形態において、前記抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）と結合する。

ある実施形態において、前記抗体又は抗体フラグメントは、ｈＰＤ－Ｌ１（ヒトＰＤ－Ｌ１）とｈＰＤ－１の結合を遮断し、及び／又は、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１を介した下流シグナル経路を破壊する。

ある実施形態において、上記の抗体又は抗体フラグメントでは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の７３－１１４位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のヌクレオチド配列をコード化する。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１６０－１７７位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のヌクレオチド配列をコード化する。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の２７１－３０３位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のヌクレオチド配列をコード化する。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の９１－１０８位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のヌクレオチド配列をコード化する。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１４８－１９２位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のヌクレオチド配列をコード化する。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２９２－３２７位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のヌクレオチド配列をコード化する。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６，１７及び１８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲから選ばれる１つ、２つ又は３つを含み、及び／又は、
前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３，１４及び１５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲから選ばれる１つ、２つ又は３つを含む。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３，１４及び１５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６，１７及び１８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲと、を含む。

ある実施形態において、前記抗体又は抗体フラグメントは、単離した抗体又は抗体フラグメントである。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性をもつアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性をもつアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含有する軽鎖可変領域を含む。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を含有する軽鎖可変領域と、を含む。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のヌクレオチド配列をコード化し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチド配列をコード化する。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記抗体又は抗体フラグメントは、ヒトγ４重鎖定常領域又はその変異体、及び／又はヒトκ軽鎖定常領域又はその変異体をさらに含む。

上記技術的問題を解決するために、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性をもつアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：７２に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性をもつアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体又は抗体フラグメントをさらに提供する。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示される重鎖、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示される軽鎖を含む。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示される重鎖と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示される軽鎖と、を含む。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１のヌクレオチド配列をコード化し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のヌクレオチド配列をコード化する。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記抗体又は抗体フラグメントは、ヒト抗体又はヒト抗体フラグメントである。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦｖ抗体である。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体又は多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。

ある実施形態において、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントでは、前記変異体は、多くとも２０個、多くとも１０個、多くとも５個、又は多くとも３個の保存的置換をしたアミノ酸置換を含む。

上記技術的問題を解決するために、本発明の他の態様では、１つ、２つ又は、３つの保存的置換をしたアミノ酸置換を含むとともに、前記抗体又は抗体フラグメントと同様の機能をもつ、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメントの変異体をさらに提供する。

上記技術的問題を解決するために、本発明の他の態様では、下記のようなＢ１）又はＢ２）である生体材料をさらに提供する：
Ｂ１）上記の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント又は変異体をコード化する核酸分子、
（前記核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡや組換えＤＮＡのようなＤＮＡであってもよいし、ｍＲＮＡやｈｎＲＮＡなどのＲＮＡであってもよい）
Ｂ２）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む発現カセット、組換え担体、組換え細胞又は組換え微生物。

この生体材料は、上述した抗体又は抗体フラグメント又は変異体に関連し、例えば、上述した抗体又は抗体フラグメント又は変異体の生成に適用できる。

ある実施形態において、本発明は、下記の１）又は２）又は３）に示されるものを含む分子を提供する：
１）下記のような核酸フラグメント：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の９１－１０８位に示される核酸フラグメント、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１４８－１９２位に示される核酸フラグメント、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２９２－３２７位に示される核酸フラグメント、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の７３－１１４位に示される核酸フラグメント、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１６０－１７７位に示される核酸フラグメント、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の２７１－３０３位に示される核酸フラグメント、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される核酸フラグメント、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される核酸フラグメント、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に示される核酸フラグメント、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４に示される核酸フラグメント、
２）１）に限定される核酸フラグメントと交雑し、上記の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント又は変異体をコード化する核酸フラグメント、
３）１）又は２）に限定される核酸フラグメントと９０％以上の同一性をもち、上記の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント又は変異体をコード化する核酸フラグメント。

上記の核酸分子は、上記の生体材料の一部に適用できる。

ここで用いられる「同一性」という用語は、肉眼又はコンピュータソフトウェア（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．（２００７）によりＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにおいて記載されているソフトウェアプログラム）により評価することができる。比較対象配列におけるサイトが同じ塩基又はアミノ酸に占められている場合、分子は当該サイトで同一である。２つ又は多数の配列間の同一性は、百分率（％）で示すことができ、それは関連する配列間の同一性の評価に適用できる。ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が別の配列と特定の百分率（例えば、９０％、９５％、９８％又は９９％）の「配列同一性」を有することは、配列を比較する時に、比較される２つの配列において当該百分率の塩基又はアミノ酸が同じであることを意味する。

ある実施形態において、抗ＰＤ－１抗体又は抗体フラグメントによる治療は、放射線治療と組み合わせることができる。放射線治療は、がん細胞の死亡を誘導し、免疫細胞を提示して活性化するための腫瘍抗原の有効性を向上させる。

他の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体又は抗体フラグメントによる治療は、治療対象のがん細胞を除去するために、手術と組み合わせることができる。

他の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体又は抗体フラグメントは、ＰＤ－１遮断と相乗効果が発生可能な治療法と組み合わせることができ、前記治療法は、ホルモンを取り除く又は血管新生を阻害するための標的薬物、腫瘍細胞において活性を有するタンパク質を標的とする標的薬物を含み、それらは何れも、腫瘍細胞の死亡を増加し、免疫刺激性腫瘍抗原の有効性を向上させる。抗ＰＤ－１抗体又は抗体フラグメントと併用する場合に、Ｔ細胞活性化作用の向上により、がんへの免疫による制御を長続きすることができる。

ある実施形態において、抗ＰＤ－１抗体又は抗体フラグメントは、がん又は感染性疾患を治療するための別の治療用抗体と併用することができる。非制限的な形態として、抗ＰＤ－１と、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを標的とする、又は、ＥＧＦ受容体を標的とする抗体との組み合わせが提供される。他の非制限的な形態において、抗ＰＤ－１抗体又は抗体フラグメントは、ＶＥＧＦ又はその受容体を標的とする治療と組み合わせる。他の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体又は抗体フラグメントは、抗ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わせる。さらなる他の非制限的な形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ＲＳＶを標的とする抗体と組み合わせる。

本発明の他の態様では、上記の何れか１つに記載の抗体又は抗体フラグメント又は変異体を調製する方法をさらに提供し、前記方法は、
ａ．上記の何れか１つの抗体又は抗体フラグメント又はその変異体をコード化する核酸分子を発現させることができる条件下で、培地において前記核酸分子を含む組換え細胞を培養することにより、前記抗体又は抗体フラグメント又は変異体を調製することを含む。

ある実施形態において、前記方法は、
ｂ．前記組換え細胞又は培地から前記抗体又は抗体フラグメント又は変異体を回収することをさらに含む。

本発明の他の態様では、下記のような製品の何れか１つの調製における、上記の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント又は変異体の応用をさらに提供する：
（１）ＰＤ－１を検出する製品、
（２）免疫応答を刺激する又は向上させる製品、
（３）がんを治療する製品。

ある実施形態において、ＰＤ－１を検出する製品は、ｈＰＤ－１を検出する製品であり、例えば、特定の細胞、組織又は血清におけるｈＰＤ－１の発現をインビトロで検出する製品や、ｈＰＤ－１をインビボで検出する製品である。

ある実施形態において、免疫応答を刺激する又は向上させる製品では、免疫細胞は、抗原及び前記抗体又は抗体フラグメント又は変異体と接触することにより、抗原への免疫応答を刺激する又は向上させる。

ある実施形態において、前記免疫応答は、Ｔ細胞を介した免疫応答である。

ある実施形態において、がんを治療する製品では、前記がんは、黒色腫（例えば、悪性転移性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモンで制御し難い前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝がん、卵巣がん、子宮頚がん、甲状腺がん、海綿芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫及び他の悪性腫瘍である。

本発明の他の態様において、治療活性成分となる上記の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント又は変異体、及び薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤若しくは担体、又はそれらの混合物を含む医薬組成物をさらに提供する。

本発明の他の態様において、上述したがんのようながんを治療する方法をさらに提供し、当該方法は、それを必要とする個体に有効量の本発明に記載される抗体又は抗体フラグメント又は変異体又は医薬組成物を投与することを含み、前記個体は、（例えば）齧歯目動物、イヌ科の動物、豚、霊長類又は人であってもよい。

ある実施形態において、本発明により提供される抗体又は抗体フラグメントは、ｈＰＤ－１と結合し、以下を含む良い特性が多く示されている。

１、本発明により提供される抗体又は抗体フラグメントは、ｈＰＤ－１と高親和的に結合し、免疫応答を調節することができる。具体的に、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、約２０ｐＭ又はそれ以下のＫＤでｈＰＤ－１と結合することができる。

２、本発明により提供される抗体又は抗体フラグメントは、約１．９８×１０^６ １／
Ｍｓ又はそれ以上のｋ_結合でｈＰＤ－１と結合することができる。

３、本発明により提供される抗体又は抗体フラグメントは、約４．１１×１０^－５ １／ｓ又はそれ以下のｋ_解離でｈＰＤ－１と結合することができる。バイオレイヤー光干渉計測法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ法）により解離定数を計測してもよいし、表面プラズモン共鳴技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）により解離定数を計測してもよい。

４、本発明により提供される抗体又は抗体フラグメントは、約１ｎＭ又はそれ以下のＩＣ_５０でｈＰＤ－Ｌ１とｈＰＤ－１の結合を遮断することもできる。当該分野における任意の既知の方法、例えば、ＦＡＣＳ法により、リガンド結合の遮断状況を計測してＩＣ_５０を算出することができる。

５、本発明により提供される抗体又は抗体フラグメントは、ｈＰＤ－１とｈＰＤ－Ｌ１の結合を遮断することで、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１を介した下流シグナル経路を破壊することができる。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕タンパク質ＥＬＩＳＡにおける抗ｈＰＤ－１抗体と精製されたｈＰＤ－１との用量依存的結合のグラフである。

〔図２〕バイオレイヤー光干渉計測法（Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）により測定されたＣＬ１抗体のｋ結合とｋ解離を示すグラフである。そのうち、各曲線は、様々な濃度のＣＬ１抗体とｈＰＤ－１との結合の動的過程を表す。

〔図３〕フローサイトメトリー法による、ＣＬ１抗体のｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１結合への遮断の検出である。

〔図４〕ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙによる、抗ｈＰＤ－１抗体の機能活性の検出である。
〔発明を実施するための形態〕
後述する実施例に用いられる実験方法は、特に説明しない限り、何れも従来の方法である。

後述する実施例に用いられる材料、試薬などは、特に説明しない限り、何れも商業的供給源から入手することができる。

以下、具体的な実施例と合わせて、本発明をさらに説明する。下記の実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、単に本発明を説明するものであると理解すべきである。
［略語と定義］
別段の説明がなければ、下記の用語は、後述するような意味をもつべきである。他の用語や略語は、当該分野において広く知られている意味をもつ。

「抗体」とは、必要な生物学的活性（例えば、リガンドとその受容体の結合を阻害すること、又は、リガンドの阻害による受容体シグナル伝達）を示す抗体の任意の形態を指す。従って、「抗体」は、その最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体と多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全ヒト・ヒト化・霊長類化・キメラ抗体、一本鎖抗体などを明らかに含むが、これらに限定されない。

「抗体フラグメント」とは、抗体の一部、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどである。その構造に関係なく、抗体フラグメントは、完全な抗体により認識される同一の抗原と結合する。「抗体フラグメント」という用語は、アプタマー、鏡像異性体及び２価抗体を含む。「抗体フラグメント」という用語は、特定の抗原と結合して複合物を形成して抗体作用を果たす任意の合成された又は遺伝子工学によってなされたタンパク質をさらに含む。

「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖と１本の重鎖のＣＨ１及び可変領域から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

「Ｆｃ領域」は、抗体のＣＨ２とＣＨ３構造ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含有する。２つの重鎖フラグメントは、２つ又は多数のジスルフィド結合によりＣＨ３構造ドメインの疎水作用で一緒にされている。

「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域が無い。

「単鎖Ｆｖ抗体」（又は、「ｓｃＦｖ抗体」）とは、抗体のＶＨとＶＬ構造ドメインを含む抗体フラグメントであり、これらの構造ドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶＨとＶＬ構造ドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、このリンカーにより、ｓｃＦｖは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる。ｓｃＦｖについての概説は、アメリカ特許第６４２３５３８号を参照できる。

当業者であれば、抗体重鎖の種類は、ｇａｍｍａ、ｍｕ、ａｌｐｈａ、ｄｅｌｔａ又はｅｐｓｉｌｏｎ（γ、μ、α、δ、ε）を含み、さらに幾つかのサブクラス（例えば、γ１－γ４）も含むことが理解される。当該鎖の性質によって、抗体の「種類」は、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥと決定される。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などの免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）は、既に十分に特徴づけられ、付与された機能特異性も知られている。何れの免疫グロブリンの種類も、本発明の請求範囲に保護されている。ある実施形態において、免疫グロブリン分子の種類はＩｇＧである。ＩｇＧは一般的に、分子量約２３，０００ダルトンの２本の同じ軽鎖ポリペプチド、及び分子量約５３，０００－７０，０００の２本の同じ重鎖ポリペプチドを含む。この４本の鎖は、ジスルフィド結合により「Ｙ」配置で接続され、そのうち軽鎖は「Ｙ」の口部から始め、可変領域を通じ続けて重鎖を取り囲む。ＩｇＧ４形態の抗体は、ＩｇＧのサブクラスであり、その重鎖はγ４サブタイプである。ある実施形態において、本発明に係る抗体は、ＩｇＧ４である。

「超可変領域」とは、抗原結合を担う抗体アミノ酸残基である。超可変領域は、配列アラインメントで定義された「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「骨格」残基又は「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変構造ドメイン残基である。

本発明に係る抗体は、鳥類と哺乳類を含む任意の動物から由来してもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、ラクダ、ラマ、ウマ又はニワトリ由来の抗体である。他の実施形態において、可変領域は、軟骨魚綱（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）由来（例えば、サメ由来）であってもよい。「ヒト抗体」は、そのアミノ酸配列が、ヒトによる抗体のアミノ酸配列に対応する抗体、及び／又は、本明細書に示されるヒト抗体を調製するための何れかの技術により調製された抗体である。この定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明らかに除外している。

「単離した抗体」は、自然環境成分の全て又は一部から分離した抗体である。その自然環境の汚染成分は、酵素、ホルモン及び他のタンパク質溶質又は非タンパク質溶質を含む、前記抗体の診断的又は治療的応用を干渉する物質である。ある実施形態において、前記抗体を以下の程度に精製する：（１）Ｌｏｗｒｙ法により測定されて、重量の９５％を超える、例えば、重量の９９％を超える抗体、（２）回転カップ型シークエネーターによりＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られることに十分な程度、又は（３）還元又は非還元条件でクマシーブルー又は銀染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥにより同質と確定されること。単離した抗体は、抗体自然環境における少なくとも１種の成分が無くなるため、組換え細胞内の原サイトの抗体を含む。単離した抗体は、一般的に、少なくとも１つの精製工程で調製される。ある実施形態において、単離した抗体の純度は、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、又は、これらの数値のうちの何れか２つの値の間の範囲（終点を含む）又はそのうちの任意の値である。

「核酸」又は「ポリヌクレオチド」とは、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）（又は、ＲＮＡにおけるウラシル（ｕ））という単一のヌクレオチドから構成されるポリマー分子であり、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその修飾である。核酸分子は、天然の核酸分子、又は合成された核酸分子、又は１種若しくは複数の天然の核酸分子と１種若しくは複数の合成された核酸分子との組み合わせであってもよい。核酸の実施例は、遺伝子又は遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマ、ＥＳＴやＳＡＧＥラベル）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐したポリヌクレオチド、プラスミド、担体、任意配列の単離したＤＮＡ、任意配列の単離したＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマを含むが、これらに限定されない。

「単離した核酸分子」は、同定されているとともに、少なくとも１種の汚染性核酸分子から分離した核酸分子である。単離した核酸分子は、その天然に存在する形態や環境とは異なる。従って、単離した核酸分子は、その天然細胞に存在する核酸分子とは違う。しかし、単離した核酸分子は、通常の通り抗体を発現する細胞に含まれる核酸分子を含み、例えば、前記核酸分子の所在する染色体のサイトは、天然細胞の染色体のサイトとは異なる。

「モノクローナル抗体」とは、基本的に同種の抗体グループから得られた抗体であり、前記グループを構成する各抗体が一致している。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位を標的にすることができる。なお、一般的に複数の異なる決定基（エピトープ）に対する複数の異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製品とは逆であり、各種のモノクローナル抗体のそれぞれは、抗原における単一の決定基のみを標的にする。

「免疫細胞」は、造血に繋がり、免疫応答において機能する細胞を含む。免疫細胞は、Ｂリンパ球とＴリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、好酸性細胞、マスト細胞、好塩基球及び顆粒球を含む。

本明細書に用いられる配列の「変異体」とは、１つ又は複数のアミノ酸残基において、示される配列とは異なっているが、得られる分子の生物学的活性が保持されている配列である。

「アミノ酸」とは、α-アミノ酸のような、アミノ基とカルボキシル基を同時に含む有機化合物であり、そのまま又は前駆体の形式で核酸によりコード化することができる。単一のアミノ酸は、３つのヌクレオチド（いわゆるコドン又は塩基トリプレット）から構成される核酸によりコード化される。同じアミノ酸が異なるコドンによりコード化できることは、「遺伝暗号の縮退」と呼ばれている。アミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸を含む。天然アミノ酸は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む。

「保存的置換をした変異体」又は「保存的置換をしたアミノ酸置換」とは、当業者に知られているアミノ酸置換であり、このような置換を行ったとしても、通常、得られる分子の生物学的活性は変化しない。一般的に、当業者は、ポリペプチド非必要領域における単一のアミノ酸置換が基本的に生物学的活性を変化させないと認めている。保存的置換は、化学的性質が似ている側鎖を含むアミノ酸で置換してもよく、例えば、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、２）脂肪族ヒドロキシ基側鎖：セリンとトレオニン、３）アミドを含む側鎖：アスパラギンとグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、５）アルカリ性側鎖：リシン、アルギニン及びヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸とグルタミン酸である。

本明細書に用いられる「約」という用語とは、数値が当業者により測定される具体値の許容可能な誤差範囲内にあることであり、前記数値部分は、いかに計測又は測定するか（即ち、計測システムの限度）によって決定される。或いは、「約」は、多くとも±２０％の範囲、例えば、±１０％、±５％又は±１％の範囲を意味してもよい。別段の説明がなければ、具体値が本願と特許請求の範囲に現れる場合に、「約」の意味は、当該具体値の許容可能な誤差範囲内にあるとすべきである。

リガンド／受容体、抗体／抗原又は他の結合対に言及する場合に、「特異的」結合とは、タンパク質及び／又は他の生物試薬の不均一集団において、ＰＤ－１のような前記タンパク質があるか否かを確定する結合反応である。従って、所定の条件で、特定のリガンド／抗原は、特定の受容体／抗体と結合しており、顕著な量で試料にある他のタンパク質と結合することはしない。特異的結合は、平衡解離定数（ＫＤ）で記載することができ、ＫＤが小さいほど、結合がより緊密であることを意味する。２つの分子が特異的結合であるか否かを確定する方法は、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー光干渉計測法などを含み、当該分野で周知されるものであるＰＤ－１と「特異的結合」する抗体は、ＰＤ－１との平衡解離定数ＫＤが約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、又は約１ｎＭ以下の抗体を含む。

本明細書に用いられる「生体材料」という用語は、核酸分子、発現カセット、組換え担体、組換え細胞又は組換え微生物を含むが、これらに限定されない。

「投与」と「治療」で動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官又は生体液に言及する場合は、外因性薬物、治療剤、診断薬又は組成物を動物、ヒト、被治療者、細胞、組織、器官又は生体液と接触することを指す。「投与」と「治療」は、例えば、治療方法、薬物動態方法、診断方法、研究方法及び実験方法を指してもよい。細胞治療は、試薬を細胞と接触することと、試薬を流動液体と接触することとを含み、ここで、前記流動液体は細胞と接触する。「投与」と「治療」は、例えば、試薬、診断薬、結合組成物により、又は、他の細胞により、細胞をインビトロとエクスビボで治療することをさらに意味する。

本明細書に用いられる「阻害」又は「治療」（ｔｒｅａｔ又はｔｒｅａｔｍｅｎｔ）という用語は、疾患に関連する症状の進行を緩和すること、及び／又は、間もなく発生される又は予想される前記疾患の症状の重症度を軽減することを含む。前記用語は、既存の症状を軽減すること、別の症状を防止すること、これらの症状の潜在的原因を軽減又は防止することをさらに含む。従って、前記用語は、有益な結果を、疾患にかかっているヒトなどの脊椎動物対象に既に付与したことを示す。

本明細書に用いられる「治療有効量」又は「有効量」という用語とは、抗ＰＤ－１抗体又はそのフラグメントを、細胞、組織又は被治療者へ単独で投与する又は他の治療剤と併用投与する時に、治療対象疾患又は病症を効果的に防止又は軽減する量である。治療有効量は、さらに、症状の軽減に十分な前記抗体又はそのフラグメントの量を指し、前記症状を軽減することは、例えば、関連する医学的状態を治療、治癒、防止又は軽減すること、又は、前記病症への治療率、治癒率、防止率又は軽減率を向上させることである。具体的な被治療者への有効量は、例えば、治療対象疾患、患者の全体的な体調、投薬の方法経路と用量、及び副作用の重症度といった種々の要因によって変更することができる。有効量は、明らかな副作用又は毒性作用を回避するための最大用量又は投薬計画であってもよい。個体へ単独で投与される活性成分を投与する場合には、治療有効量は、当該単独の成分を指す。組み合わせて投与する場合には、併用投与、連続投与又は同時投与に関係なく、治療有効量とは、治療効果を生じさせる活性成分の併用量である。治療有効量は、症状を少なくとも１０％、一般的に少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％軽減する。ある実施形態において、抗ＰＤ－１抗体又はそのフラグメントの有効量は、０．０１ｍｇ～１ｇとする。ある実施形態において、抗ＰＤ－１抗体又はそのフラグメントの有効量は、１０ｍｇ～７５０ｍｇとする。本明細書に記載される抗体は、静脈や皮下注射のような通常の方法経路で投与することができる。

モノクローナル抗体
当該分野の知識とスキルによってＰＤ－１に対するモノクローナル抗体を調製することができ、抗体又は抗体フラグメントは、ｓｃＦｖ酵母ディスプレイライブラリーから分離することができる。

従来の方法によれば、モノクローナル抗体をコード化するＤＮＡを容易に分離してその配列を決定することができる。前記ＤＮＡは分離されると、発現担体中に置かれ、そして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が達成されるように、当該担体を宿主細胞にトランスフェクトすることができ、前記宿主細胞は、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞や、別途に免疫グロブリンが生成されない骨髄腫細胞がある。抗体の組換え調製については、以下、さらに詳しく説明する。

キメラ抗体
抗体ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖と軽鎖定常構造ドメインのコード配列で相同性マウス配列を置換することにより、又は、免疫グロブリンをコード化する配列と、非免疫グロブリン物質（例えば、タンパク質構造ドメイン）をコード化する配列の全体又は一部とを共有結合することにより、修飾されることもできる。一般的に、前記非免疫グロブリン物質で抗体の定常構造ドメイン、又は、置換される抗体の１つの抗原結合部位の可変構造ドメインを置換することにより、２価キメラ抗体が生成されるが、前記２価キメラ抗体は、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、別の抗原に対して特異性を有するもう１つの抗原結合部位とを含む。

抗体の精製
組換え技術が用いられる場合、抗体は細胞内、ペリプラズム空間に生成され、又は培地に直接分泌されることができる。抗体は細胞内、ペリプラズム空間に生成されると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡとフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間で細胞をスラリー凍結融解し、遠心分離により細胞破片を除去する。抗体は培地に分泌される場合、まず、市販のタンパク質濃縮フィルタ（例えば、ＡｍｉｃｏｎやＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニット）により前記発現系からの上清液を濃縮することができる。前記工程の何れにおいても、タンパク質の加水分解を阻害するために、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ）を使用することができ、外部からの汚染物の増殖を防ぐために、抗生物質を使用することができる。

例えば、水酸化リン灰石、ゲル電気泳動、透析と親和性クロマトグラフィーにより細胞から抗体組成物を調製することができ、精製技術として、好ましくは親和性クロマトグラフィーである。タンパク質Ａが親和性リガンドとして適用されるかは、抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種類とアイソタイプによって決まる。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づく抗体（Ｌｉｎｄｍａｒｋなど、１９８３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３）の精製に適用できる。親和性リガンドの依存する基質は、一般的にアガロースであるが、他の基質を利用してもよい。コントロールド・ポア・ガラスやポリ（スチレンージビニルベンゼン）のような機械的に安定な基質は、アガロースと比べると、取得可能な流速がより早く、処理時間がより短い。抗体はＣＨ３構造ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂により精製することができる。回収対象抗体によって、例えば、イオン交換カラムでの分離、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）クロマトグラフィー、クロマトグラフィーフォーカシング及びＳＤＳ－ＰＡＧＥのような他のタンパク質精製技術を利用してもよい。

本発明の抗体及び抗体フラグメントの治療的応用
ＰＤ－１と特異的に結合する本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、免疫応答の刺激又は向上に適用できる。本発明の抗体及び抗体フラグメントは、特に、Ｔ細胞を介した免疫応答を向上させることにより治療可能な疾患にかかった被治療者の治療に適用できる。ある実施形態において、被治療者は、免疫応答の向上を必要とするヒト患者を含む。

ある実施形態において、本発明は、Ｔ細胞を介した免疫応答を向上させることにより疾患を治療する方法をさらに提供する。前記方法は、必要がある患者に、本発明に記載される有効治療量の抗体又は抗原結合フラグメントを投与することを含む。ある実施形態において、上記のＴ細胞を介した免疫応答を向上させることにより治療される疾患は、がんである。

がん
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、がんの治療（即ち、腫瘍細胞の増殖又は生存への阻害）に適用できる。ある実施形態において、本発明の抗体によりその増殖が阻害可能ながんは、一般的に、免疫療法に敏感ながんを含むが、今まで免疫療法とは関わっていないがんも含む。ある実施形態において、がんを治療するための非制限的な形態は、黒色腫（例えば、悪性転移性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモンで制御し難い前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝がん、卵巣がん、子宮頚がん、甲状腺がん、海綿芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫及びその他の悪性腫瘍を含む。さらに、本発明は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントによりその増殖が阻害可能な難治性又は再発性のがんを含む。

本発明の抗体及び抗体フラグメントの非治療的応用
非治療的応用の抗ＰＤ－１抗体の商品は既に存在しており、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡにより販売されているＭａｂ１０８６抗ｈＰＤ－１モノクローナル抗体であり、それはフローサイトメトリー、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢｌｏｔとＥＬＩＳＡに適用できる。本発明の抗体は、Ｍａｂ１０８６により提供される任意の非治療的目的に適用できる。

本発明の抗体は、診断測定に適用でき、例えば、特定の細胞、組織又は血清におけるＰＤ－１の発現を検出することに適用できる。診断的応用のために、一般的に、検出可能な部分で抗体を（直接又は間接的に）マークする。一般的に、ビオチン、蛍光色素、放射性ヌクレオチド、酵素、ヨウ素及び生物合成マーカーに分けられている多くのマーカーは利用可能である。

本発明の抗体は、さらに、インビボの診断測定に適用できる。免疫シンチグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ）又はポジトロン放出断層撮影により抗原、又は抗体を発現する細胞の位置を特定することができるように、一般的に、放射性核種（例如^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^３２Ｐ、^３５Ｓ^１８Ｆ）で抗体をマークする。

医薬組成物
本発明は、医薬組成物をさらに提供する。このような組成物は、有効量の抗体又は抗体フラグメント、及び薬学的に許容可能な担体を含む。

ある実施形態において、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、政府の規制機関により承認された、又は他の広く認められている薬局方に挙げられた動物用（特にヒト用）の物質を指す。さらに、「薬学的に許容可能な担体」は、一般的に、任意種類の無毒な固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、封入材料や製剤添加物である。

「担体」という用語は、活性成分とともに使用される治療用の希釈剤、補助剤、賦形剤又は担体を指す。このような薬物担体は、滅菌液体であってもよく、例えば、水、及び石油、動植物又は合成由来の油を含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ごま油などである。ある実施形態において、医薬組成物が静脈内に投与される場合に、担体は水であってもよい。生理食塩水溶液とグルコース水溶液とグリセリン溶液は、液体担体として用いられてもよく、特に注射用溶液に用いられる。好適な薬物担体の例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎのＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおいて記載されており、ここで引用により本発明に組み込まれる。このような組成物は、臨床有効量の抗体又は抗体フラグメントを、適当な担体と合わせることによって、患者に適する投与形式を提供する。当該製剤は、投与モードに適用すべきである。製剤は、アンプル、使い捨て注射器、又は、ガラスやプラスチックで作製される多用量のバイアルにパッケージされてもよい。

ある実施形態において、従来の工程により、組成物を、ヒトへの静脈内注射に適する医薬組成物に調製する。静脈内投与用の組成物は、一般的に、滅菌などの透水性緩衝液における溶液である。医薬組成物は、さらに可溶化剤と、リドカインのような局所麻酔薬を含んでもよく、これにより、注射部位の痛みが緩和される。一般的に、有効成分は、単位用量の形式で単独で供給され、又は混合して供給され、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末又は無水濃縮物の形式で活性剤量を指示可能な密封容器（例えば、アンプル又は小袋）に入れられる。輸液で組成物を投与する場合は、滅菌医療用水又は生理食塩水を含有する点滴ボトルで組成物を分割包装してもよい。注射で組成物を投与する場合は、投与する前に有効成分が混合できるように、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルを使用してもよい。

本発明の抗体又は抗体フラグメントは、その塩の形態を含む。薬学的に許容可能な塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などのアニオンと形成される塩から誘導されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのカチオンと形成される塩から誘導されるものを含む。
［試薬又は材料］
ｈＰＤ－１は、北京義翹神州科技有限公司の製品であり、カタログ番号が１０３７７－Ｈ０３Ｈ－Ｂである。

ｈＩｇＧは、ジェンスクリプトバイオテック（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）有限公司の製品であり、カタログ番号がＡ０１００６である。

ｈＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔ細胞は、Ｐｒｏｍｅｇａ社の製品であり、カタログ番号が
Ｊ１２５２である。

マークされていないｈＰＤ－１は、北京義翹神州科技有限公司の製品であり、カタログ番号が１００８４－ＨＮＡＨである。

ＰＥでマークされたヤギ抗ヒトＦｃは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社の製品であり、カタログ番号が１２－４９９８－８２である。

ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、Ｐｒｏｍｅｇａ社の製品であり、カタログ番号がＪ１２５２である。

Ｆ－１２は、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社の製品であり、カタログ番号が１１７６５０６２である。

Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍは、Ｐｒｏｍｅｇａ社の製品であり、カタログ番号がＧ７９４０である。
実施例１：抗ｈＰＤ－１抗体の調製及びその配列決定
まず、ヒトリンパ球ｍＲＮＡによってヒトＶＬとＶＨ ｃＤＮＡを調製し、そして、これによってｓｃＦｖ酵母ディスプレイライブラリーを調製し、このライブラリーをスクリーニングすることにより、本明細書に係るＣＬ１とＣＬ１関連抗体を分離した。当該分野では、このようなライブラリーを調製とスクリーニングする方法論が既に知られている。例えば、Ｗｉｔｔｒｕｐなどのアメリカ特許６４２３５３８号のような文献において、抗体ディスプレイライブラリーの調製とスクリーニングに特に適用される方法と試薬を見つけることができる。

遺伝子配列決定法により、酵母で発現されるｓｃＦｖ可変領域をコード化するＤＮＡ配列を決定した。Ｓｅｑｍａｎにより、それぞれのクローニングに用いられるそれぞれの配列決定反応結果を解析した。配列は、配列表に開示されているとともに、表１に挙げられている。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の７３－１１４位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のヌクレオチド配列をコード化する。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１６０－１７７位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のヌクレオチド配列をコード化する。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の２７１－３０３位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のヌクレオチド配列をコード化する。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の９１－１０８位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のヌクレオチド配列をコード化する。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１４８－１９２位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のヌクレオチド配列をコード化する。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２９２－３２７位に示されるようにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のヌクレオチド配列をコード化する。

実施例２：ＣＬ１抗体及び関連抗体の作製と発現
ＰＣＲクローニングしたＣＬ１抗体のＶＬとＶＨ領域ＤＮＡを、それぞれヒトκ軽鎖定常領域とＩｇＧ４定常領域（γ４重鎖定常領域）に接続することにより、軽鎖と重鎖
ＤＮＡ配列を作製した。各鎖に適当なリーダー配列が増加されるように設計されたＰＣＲプライマで、配列の５’と３’端を修飾し、そして、既存の組換え抗体の発現担体にクローニングし、配列解析により、担体の正確な作製を明らかにした。４０μｇの発現プラスミドを、７００μＬの総細胞数１０^７のＣＨＯと均一に混合し、０．４ｃｍのエレクトロポレーションカップに入れて、エレクトロポレーターに置き、エレクトロポレーションパラメータ（電圧３００Ｖ、電気パルス時間１７ｍｓ、方形波）を設定してエレクトロポレーションを完了させた。エレクトロポレーションを完了させた後、８ｍＬの増殖培地においてこれらの細胞を３日間培養した。ＥＬＩＳＡにより、上清液をトランスフェクトした抗体濃度を計測し、発現が高くて細胞増殖の状況が良い工学的細胞株を最終的に決定した。

細胞は、振とうフラスコでＣＤ－ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ）において１２日間増殖した。タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを行い、洗浄し、１Ｍの酢酸で溶離して３Ｍ Ｔｒｉｓで中和することにより、細胞上清液における抗体を精製した。最後に、緩衝液を、１Ｍ ＴｒｉｓでｐＨ５．５に調整した１００ｍＭの酢酸に変更し、ＣＬ１抗体を得た。

ＣＬ５、ＣＬ９、ＣＬ２、ＣＬ７、ＣＬ６及びＣＬ２０の作製と発現は、同様に、上記と類似する方法を採用した。

精製して得られたＣＬ１、ＣＬ５、ＣＬ９、ＣＬ２、ＣＬ７、ＣＬ６及びＣＬ２０抗体のアミノ酸配列は、所期通りである。

実施例３：抗ｈＰＤ－１抗体のｈＰＤ－１との親和力の解析
酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）は、抗体とｈＰＤ－１の結合を測定することに用いられた。４℃で一晩インキュベートすることで、ｈＰＤ－１を９６ウェルプレートに固定した。被覆した後、ＰＢＳＴでプレートを５回洗った。ＰＢＳＴにより抗体ＣＬ１、ＣＬ５、ＣＬ９、ＣＬ２、ＣＬ７、ＣＬ６、ＣＬ２０及びｈＩｇＧの異なる濃度の希釈液を調製し、それを固定されたｈＰＤ－１とともに室温で１時間インキュベートした。結合した後、
ＰＢＳＴでプレートを５回洗い、室温で、１／１００００まで希釈したペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でマークしたヤギ抗マウスＩｇＧを含むＰＢＳＴにより１時間インキュベートし、再び洗浄し、ＴＭＢで発色させた。

ＥＬＩＳＡの結果は、図１の通りである。半最大有効濃度（ＥＣ_５０）で結合親和力を表し、結果を表２に示す。

実験結果から明らかなように、抗ｈＰＤ－１抗体ＣＬ１、ＣＬ５、ＣＬ９、ＣＬ２、ＣＬ７、
ＣＬ６及びＣＬ２０は、何れもｈＰＤ－１と結合しており、そのうち、ＣＬ１のｈＰＤ－１と結合したＥＣ_５０は約０．２０８ｎＭであり、親和力が最も強く、ＣＬ５、ＣＬ９、ＣＬ２、
ＣＬ７、ＣＬ６及びＣＬ２０より明らかに優れている。

実施例４：抗体ＣＬ１のｈＰＤ－１と結合する動力学的解析
抗体の結合特性をさらに特徴づけるために、Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，メンローパーク，カリフォルニア州）においてバイオレイヤー光干渉計測法により抗体ＣＬ１の概況を解析することで、結合動力学を明らかにして平衡結合定数を算出した。この測定は、ビオチンでｈＰＤ－１融合タンパク質をストレプトアビジンバイオセンサとカップリングすることによって実施された。

ｈＰＤ－１をストレプトアビジンバイオセンサの基質に固定するために、ｈＰＤ－１をビオチン化しなければならない。まず、１．０ｍｇのビオチンを１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解することで、１０ｍｇ／ｍｌのビオチン溶液を調製し、そして、１ミリリットルのｈＰＤ－１（１．８ｍｇ／ｍｌ）ごとに１０μｌのビオチン溶液を加え、反応物を軽く撹拌し、暗所において室温で２時間保温し、ｈＰＤ－１－ビオチンを得た。
２５ｍｌの冷たいＰＢＳにより、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５Ｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号１７－０８５１－０１）を入れたＰＤ－１０カラムを平衡し、そして、カラムごとに２ｍｌのｈＰＤ－１－ビオチンをロードした。１０×１ｍｌの冷たいＰＢＳを用いてこのカラムから溶離した。溶離液を収集し、ＯＤ２８０で数値を読み、精製されたｈＰＤ－１－ビオチンを得て、使用されるまでそれを－８０℃で貯蔵した。

ストレプトアビジンバイオセンサを、予備湿潤されるように、ＰＢＳを含有したウェルに１０分間浸入し、そしてＰＢＳでバイオセンサを２分間平衡し、バイオセンサを２０μｇ／ｍＬのｈＰＤ－１－ビオチンのＰＢＳ溶液に５分間浸入することにより、ｈＰＤ－１－ビオチンとカップリングし、ＰＢＳでバイオセンサを２分間平衡した。バイオセンサを、様々な濃度の抗体（０．１２５－２ｎＭ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ純度＞９９％の抗体）を含有するウェルに置いて抗ＰＤ－１抗体との結合状況を観察し、３０分間監視計測した。バイオセンサをＰＢＳに転移した後、解離を計測し、９０分間監視計測した。全ての試験濃度を含む１：１の結合球形フィットモデル（ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔ ｍｏｄｅｌ）により、観察された結合と解離速度（ｋ_結合とｋ_解離）をフィッティングし、平衡結合定数ＫＤを算出した。

動力学的研究の結果は、表２及び図２に示されている。

実験結果から明らかなように、ＣＬ１抗体のｈＰＤ－１と結合したＫＤは、約０．０２０７ｎＭであり、親和力がこれほど強いのは、結合速度が普通の抗体より遥かに高く、解離速度が遅いからである。

実施例５：抗体ＣＬ１のｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１結合への遮断の研究
フローサイトメトリーにより、リガンド結合への遮断を研究する。ｈＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を９６ウェルプレートに敷き、様々な濃度の抗体（ＣＬ１又はｈＩｇＧ（陰性対照として））及び濃度１μｇ／ｍＬのマークされていないｈＰＤ－Ｌ１を加えた。混合物を氷上に３０分間置き、ＦＡＣＳ緩衝液（０．３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄し、ＰＥでマークしたヤギ抗ヒトＦｃを氷上においてさらに３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で再び細胞を３回洗浄し、フローサイトメーターにより解析した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアの非線形回帰法によりデータを解析してＩＣ_５０値を算出した。結果は、表２及び図３を参照する。

実験結果から明らかなように、抗ＰＤ－１抗体ＣＬ１は、用量依存性によりｈＰＤ－Ｌ１とＪｕｒｋａｔ細胞のｈＰＤ－１との結合を完全に阻害することができ、ＩＣ_５０値は約０．７７ｎＭである。

実施例６：ＣＬ１関連抗体の動力学的解析
実施例４に記載されるように、バイオレイヤー光干渉計測法により、ＣＬ１抗体に関連する一連の抗体を解析した。関連抗体のＶＬとＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列表を参照する。各関連抗体の平衡結合定数ＫＤは、表３に示されている。

表３中の結果から明らかなように、同じＶＨとＶＬである場合に、ｓｃＦｖ形式の抗体のｈＰＤ－１との親和力はＩｇＧ４形式の抗体の親和力よりも低い。同じ抗体形式である場合に、即ち、何れもＩｇＧ４又はｓｃＦｖである場合に、抗体ＣＬ１のＶＨアミノ酸配列をそのままにするが、抗体ＣＬ１のＶＬを置換（抗体ＣＬ５のＶＬ、抗体ＣＬ９のＶＬ、抗体ＣＬ２のＶＬ又は抗体ＣＬ７のＶＬに置換）した後、親和力は何れも低減され、しかもＣＬ９のＶＬに置換した後、親和力が最も多く低減された。抗体ＣＬ１のＶＬは、ＣＬ１とｈＰＤ－１の結合において重要な役割を果たしており、アミノ酸配列が変更されると、配座が変更され、ｈＰＤ－１との結合が影響される可能性があることが明らかになる。

実施例７：抗ｈＰＤ－１抗体の機能活性の解析
抗ｈＰＤ－１抗体の機能活性を検出するために、当該抗体のｈＰＤ－１活性への阻害能力のインビトロ検出が行われた。

抗ｈＰＤ－１抗体は、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１の相互作用を遮断し、Ｊｕｒｋａｔ細胞の
ＴＣＲ下流免疫シグナル経路を活性化する。

レポーター遺伝子は、その発現産物が非常に検出され易い遺伝子であり、そのコード配列と遺伝子発現調節配列とを融合してキメラ遺伝子を形成し、調節配列の制御下において発現することにより、その発現産物の検出によって上流シグナルが間接的に検出される。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙシステムは、抗ｈＰＤ－１モノクローナル抗体の生物学的活性検出に適用される。その主な原理としては、ＣＨＯ－Ｋ１細胞株の細胞膜において安定的に発現したＰＤ－Ｌ１とＴ細胞受容体活性化タンパク質（ＴＣＲ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、模擬抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）が作製されており、Ｊｕｒｋａｔは、細胞膜にＰＤ－１発現があり、ＮＦＡＴをプロモータとするＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子担体がトランスフェクトされているヒトＴリンパ球系である。２種の細胞がともにインキュベートされる場合、ＣＨＯ－Ｋ１細胞のＴＣＲ ａｃｔｉｖａｔｏｒはＪｕｒｋａｔ細胞表面ＴＣＲと結合し、下流シグナル経路を誘導し、レポーター遺伝子の発現を最終的に活性化するが、同時にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用はこのような活性化作用を遮断することになり、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を加えた後、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用は遮断され、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子の発現は回復され、蛍光シグナルが発生され、シグナル値と加えられた抗ＰＤ－１モノクローナル抗体量とは、正の相関関係になる。

後述するように、抗体と前記細胞をともにインキュベートすることにより、抗ｈＰＤ－１抗体を検出・評価した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、Ｆ－１２＋１０％ＦＢＳ培地（２００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ、２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む）で再懸濁し、細胞密度を４．０×１０^５細胞／ｍｌに調整し、ウェルごとに１００μｌで９６ウェル細胞プレートに接種し、９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータに置いて一晩培養した。１２５μｌの抗体（ＣＬ１、ＣＬ５とｈＩｇＧ）を含む９６ウェルマイクロタイタープレートを検出希釈液（１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ培地）によりこのプレートに沿って３つに分けて２．５倍連続希釈した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、検出希釈液で再懸濁し、細胞密度を１．２５ｘ１０^６細胞／ｍｌに調整した。９６ウェルプレートを取り出し、培地を廃棄した後、４０μｌの調製された対照品（ｈＩｇＧ）及び検出対象試料（ＣＬ１、ＣＬ５）を９６ウェルプレートに加えて、４０μｌのＪｕｒｋａｔ細胞を９６ウェルプレートに加えた。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータに６ｈ置いた後、室温で１０ｍｉｎ置いてから、ウェルごとに８０μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ試薬を加え、室温で光を避けて３０ｍｉｎ置いた。多機能マイクロプレートリーダにおける自己蛍光検出機能により、９６ウェルプレートの各ウェルの蛍光値を読み出した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．５．１ソフトウェアにより、４－ｐａｒａｍｅｔｅｒモデルで対照品及び検出対象試料のデータを曲線フィッティングし、標準方法によりＥＣ_５０を決定した。結果は、表２及び図４に示されている。

表２及び図４の結果から明らかなように、抗ｈＰＤ－１抗体の存在下で、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用は遮断され、阻害されたＪｕｒｋａｔ細胞のＴＣＲ下流シグナル経路は改めて活性化され、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子の発現は回復され、蛍光シグナルが発生され、そしてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用への抗ｈＰＤ－１抗体の阻害は用量依存性を有する。さらに、抗体ＣＬ１及びＣＬ５のｈＰＤ－１活性への阻害能力ＥＣ_５０は、それぞれ約０．２６９μｇ／ｍｌ及び０．９３２μｇ／ｍｌであるため、ＣＬ１のｈＰＤ－１活性への阻害能力がより強いことが示され、細胞レベルから、抗体ＣＬ１の機能活性がＣＬ５より優れていることは再び証明され、これは実施例３の結果にも合致している。

実施例８：抗体ＣＬ１及び抗体ＣＬ２０のｈＰＤ－１との結合動力学的解析・比較
Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）において表面プラズモン共鳴技術により抗体ＣＬ１及び抗体ＣＬ２０のｈＰＤ－１との結合動力学を解析・比較した。

Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップを用いて検出を行い、濃度５μｇ／ｍｌの抗体ＣＬ１又は抗体ＣＬ２０が１０μｌ／ｍｉｎの流速で実験流路を通過し、捕捉量が約２００ＲＵになるように１０ｓ捕捉し、そして流速を３０μｌ／ｍｉｎに調整し、順番に異なる濃度のＰＤ－１（０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ）を入れ、結合時間１８０ｓ、解離時間１２００ｓにした。１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルでフィッティングして結合と解離曲線を得て、抗体ＣＬ１及び抗体ＣＬ２０のｈＰＤ－１との結合動力学的パラメータ（ｋ結合：結合速度、ｋ解離：解離速度、ＫＤ：結合解離平衡定数）を得た。動力学的研究の結果は、表４に示されている。抗体ＣＬ１のｈＰＤ－１と結合したＫＤは約０．６０６ｎＭであり、抗体ＣＬ２０のｈＰＤ－１と結合したＫＤは約４．４３４ｎＭであり、抗体ＣＬ１のｈＰＤ－１との親和力は、抗体ＣＬ２０よりも約７倍高くなる。

タンパク質ＥＬＩＳＡにおける抗ｈＰＤ－１抗体と精製されたｈＰＤ－１との用量依存的結合のグラフである。 バイオレイヤー光干渉計測法（Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）により測定されたＣＬ１抗体のｋ結合とｋ解離を示すグラフである。そのうち、各曲線は、様々な濃度のＣＬ１抗体とｈＰＤ－１との結合の動的過程を表す。 フローサイトメトリー法による、ＣＬ１抗体のｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１結合への遮断の検出である。 ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙによる、抗ｈＰＤ－１抗体の機能活性の検出である。

Claims (13)

1. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３，１４，１５，１６，１７及び１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲから選ばれる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを含む、抗体又は抗体フラグメント。
2. 前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６，１７及び１８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲから選ばれる１つ、２つ又は３つを含み、及び／又は、
   前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３，１４及び１５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲから選ばれる１つ、２つ又は３つを含む、
   ことを特徴とする請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント。
3. 前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３，１４及び１５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６，１７及び１８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲと、を含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
4. 前記抗体又は抗体フラグメントは、単離した抗体又は抗体フラグメントである、ことを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
5. 前記抗体又は抗体フラグメントは、
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性をもつアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域、及び／又は、
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性をもつアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含有する軽鎖可変領域、を含む、ことを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
6. 前記抗体又は抗体フラグメントは、ヒトγ４重鎖定常領域又はその変異体、及び／又は、ヒトκ軽鎖定常領域又はその変異体をさらに含む、ことを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
7. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性をもつアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性をもつアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、抗体又は抗体フラグメント。
8. １つ、２つ又は３つの保存的置換をしたアミノ酸置換を含む、請求項１から７の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメントの変異体。
9. Ｂ１）請求項１から７の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント、又は請求項８に記載の変異体をコード化する核酸分子、又は、
   Ｂ２）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む発現カセット、組換え担体、組換え細胞又は組換え微生物、である、請求項１から７の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント、又は請求項８に記載の変異体に関連する生体材料。
10. Ｂ１）に記載の核酸分子は、
    １）下記のようなＤＮＡ分子：
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の９１－１０８位に示される核酸フラグメント、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１４８－１９２位に示される核酸フラグメント、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２９２－３２７位に示される核酸フラグメント、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の７３－１１４位に示される核酸フラグメント、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１６０－１７７位に示される核酸フラグメント、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の２７１－３０３位に示される核酸フラグメント、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される核酸フラグメント、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される核酸フラグメント、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に示される核酸フラグメント、又は
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４に示される核酸フラグメント、
    ２）１）に限定される核酸フラグメントと交雑し、請求項１から６の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント、又は請求項７に記載の変異体をコード化する核酸フラグメント、
    ３）１）又は２）に限定されるＤＮＡ分子と９０％以上の同一性をもち、請求項１から６の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント、又は請求項７に記載の変異体をコード化する核酸フラグメント、
    上記１）又は２）又は３）に示される核酸フラグメントを含む、ことを特徴とする請求項９に記載の生体材料。
11. 請求項１から７の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント、又は請求項８に記載の変異体を調製する方法であって、
    請求項９におけるＢ１）に記載の核酸分子を発現させることができる条件下で、培地において前記核酸分子を含む組換え細胞を培養することにより、前記抗体又は抗体フラグメント又は変異体を調製すること、を含む方法。
12. 請求項１から７の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント、又は請求項８に記載の変異体、及び薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤若しくは担体、又はそれらの混合物を含む医薬組成物。
13. （１）ＰＤ－１を検出する製品、
    （２）免疫応答を刺激する又は向上させる製品、
    （３）がんを治療する製品、
    上記製品の何れか１つの調製における、請求項１から７の何れか１項に記載の抗体又は抗体フラグメント、又は請求項８に記載の変異体の応用。
    
    

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