CN117203241A - 抗Siglec15抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种抗Siglec15抗体及其用途，所述抗Siglec15抗体以约4E‑09M或以下的KD值与人Siglec15蛋白特异性结合。本申请还提供了包含所述抗Siglec15抗体的免疫缀合物、制备所述Siglec15抗体的方法以及所述抗Siglec15抗体的用途。
Description
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种抗Siglec15抗体及其用途。
Siglec15是I型跨膜蛋白，包括两个Ig样结构域、一个包含赖氨酸残基的跨膜结构域、一个短的细胞质尾巴。该蛋白最初被鉴定为具有典型唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素结构的Siglec基因家族成员，其功能与破骨细胞的分化和骨重塑相关。在大多数正常人类组织和各种免疫细胞亚群中，Siglec15的mRNA表达水平极低，但在巨噬细胞中表达较高。
2019年，陈列平等发现siglec15是一种巨噬细胞相关的T细胞抑制分子，其表达通常局限于髓系细胞，但在人类肿瘤组织中广泛表达。IFN-γ可以抑制Siglec15表达水平，而Siglec15体外抑制T细胞活性。Siglec15敲除小鼠各项生理指标正常，显示了Siglec15靶点的安全性。Siglec15通过抑制IL-10抑制抗原特异性T细胞反应，同时，Siglec15敲除小鼠中CD8+T细胞、NK细胞以及细胞因子分泌增加，肿瘤发生率降低，生存率升高。以上结果提示Siglec15可能是一个非常有潜力的肿瘤治疗靶点。
目前，已知的抗Siglec-15抗体还存在亲和力弱，体内抗肿瘤效果不强等缺陷。因此，有必要开发对Siglec15蛋白亲和力高、特异性强，具有更好抗肿瘤效果的新型抗Siglec15抗原结合蛋白。
发明内容
本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：1)在Biacore检测中，以约4E-09M或以下的KD值与人Siglec15蛋白特异性结合；2)在流式检测中，以约0.1μg/ml或以下的EC50值与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15特异性结合；3)解除Siglec15对血液中PBMC的增殖抑制；4)在ELISA检测中，以约0.2μg/ml或以下的EC50值与人Siglec15特异性结合；5)在ELISA检测中，以约0.1μg/ml或以下的EC50值与猴Siglec15特异性结合；以及6)在ELISA检测中，以约0.1μg/ml或以下的EC50值与鼠Siglec15特异性结合。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含重链可变区VH，所述VH包含所述HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述H-FR1包含SEQ ID NO：1-3中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述H-FR2包含SEQ ID NO：5-8中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述H-FR3包含SEQ ID NO：10-12中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述H-FR4包含SEQ ID NO：14和15中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO：1-3中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO：5-8中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO：10-12中任一项所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO：14和15中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)H-FR1：SEQ ID NO:1，H-FR2：SEQ ID NO:5，H-FR3：SEQ ID NO:10和H-FR4：SEQ ID NO:14；
b)H-FR1：SEQ ID NO:2，H-FR2：SEQ ID NO:6，H-FR3：SEQ ID NO:11和H-FR4：SEQ ID NO:15；
c)H-FR1：SEQ ID NO:2，H-FR2：SEQ ID NO:7，H-FR3：SEQ ID NO:12和H-FR4：SEQ ID NO:15；
d)H-FR1：SEQ ID NO:3，H-FR2：SEQ ID NO:8，H-FR3：SEQ ID NO:12和H-FR4：SEQ ID NO:15。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述VH包含SEQ ID NO：29-32中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含轻链可变区VL，所述VL包含所述LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述L-FR1包含SEQ ID NO：16-18中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述L-FR2包含SEQ ID NO：20和21中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述L-FR3包含SEQ ID NO：23-25中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述L-FR4包含SEQ ID NO：27和28中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列；所述L-FR2包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列；所述L-FR3包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列；以及所述L-FR4包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO：16-18中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR2包含SEQ ID NO：20和21中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR3包含SEQ ID NO：23-25中任一项所示的氨基酸序列；以及所述L-FR4包含SEQ ID NO：27和28中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)L-FR1：SEQ ID NO:16，L-FR2：SEQ ID NO:20，L-FR3：SEQ ID NO:23和L-FR4：SEQ ID NO:27；
b)L-FR1：SEQ ID NO:17，L-FR2：SEQ ID NO:21，L-FR3：SEQ ID NO:24和L-FR4：SEQ ID NO:28；
c)L-FR1：SEQ ID NO:18，L-FR2：SEQ ID NO:21，L-FR3：SEQ ID NO:25和L-FR4： SEQ ID NO:28；
d)L-FR1：SEQ ID NO:18，L-FR2：SEQ ID NO:20，L-FR3：SEQ ID NO:25和L-FR4：SEQ ID NO:28。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述VL包含SEQ ID NO：33-36中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述VH和VL包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)VH：SEQ ID NO:29和VL：SEQ ID NO:33；
b)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:34；
c)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:35；
d)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:36；
e)VH：SEQ ID NO:31和VL：SEQ ID NO:34；
f)VH：SEQ ID NO:31和VL：SEQ ID NO:35；
g)VH：SEQ ID NO:31和VL：SEQ ID NO:36；
h)VH：SEQ ID NO:32和VL：SEQ ID NO:34；
i)VH：SEQ ID NO:32和VL：SEQ ID NO:35；
j)VH：SEQ ID NO:32和VL：SEQ ID NO:36。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含重链恒定区，且所述重链恒定区包括源自IgG的恒定区或源自IgY的恒定区。
在某些实施方式中，所述分离的抗体结合蛋白中所述重链恒定区包括源自人IgG的恒定区。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述重链恒定区包含SEQ ID NO：39-42中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含轻链恒定区，且所述轻链恒定区包括源自Igκ的恒定区或源自Igλ的恒定区。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述轻链恒定区包括源自人Igκ的恒定区。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：43 中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
另一方面，本申请提供了一种多肽，其包含所述分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，其包含所述分离的抗原结合蛋白或所述多肽。
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其编码所述分离的抗原结合蛋白，或者所述多肽。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含所述分离的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含所述分离的抗原结合蛋白，所述多肽，所述免疫缀合物，所述分离的核酸分子和/或所述载体。
另一方面，本申请提供了一种制备所述分离的抗原结合蛋白或所述多肽的方法，所述方法包括再使得所述分离的抗原结合蛋白或所述多肽表达的条件下，培养所述细胞。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含所述分离的抗原结合蛋白，所述多肽，所述免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述载体，所述细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
另一方面，本申请提供了一种药物组合，其包含所述分离的抗原结合蛋白和免疫检查点抑制剂。
在某些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包括抑制PD-1/PD-L1相互作用的物质。
在某些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂选自下组：PD-1/PD-L1阻断剂、PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
在某些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包含轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-1抗体包括帕博利珠单抗。
在某些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-L1抗体。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO: 54所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体包括阿替利珠单抗。
在某些实施方式中，所述药物组合可以是药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种用于检测或测定Siglec15的方法，所述方法包括使用所述分离的抗原结合蛋白或所述多肽。
另一方面，本申请提供了一种Siglec15的检测试剂盒，其包含所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽。
另一方面，本申请提供了一种所述分离的抗原结合蛋白或所述多肽在制备试剂盒中的用途。
另一方面，本申请提供了一种调节免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述分离的抗原结合蛋白，所述多肽，所述免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述载体，所述细胞和/或所述药物组合物，和/或药学上可接受的治疗剂。
另一方面，本申请提供了一种调节免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述药物组合，和/或药学上可接受的治疗剂。
另一方面，本申请提供了所述分离的抗原结合蛋白，所述多肽，所述免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述载体，所述细胞和/或所述药物组合物，其用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
另一方面，本申请提供了所述药物组合，其用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括骨代谢异常。
在某些实施方式中，所述骨代谢异常包括骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、人工关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全。
在某些实施方式中，所述骨代谢异常包括骨质疏松症。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括与Siglec15的表达相关的肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括结肠癌。
另一方面，本申请提供了一种所述分离的抗原结合蛋白，所述多肽，所述免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述载体，所述细胞和/或所述药物组合物在制备预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途。
另一方面，本申请提供了所述药物组合在制备预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括骨代谢异常。
在某些实施方式中，所述骨代谢异常包括骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、人工关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全。
在某些实施方式中，所述骨代谢异常包括骨质疏松症。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括与Siglec15的表达相关的肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括结肠癌。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述分离的抗原结合蛋白，所述多肽，所述免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述的细胞。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述药物组合。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括骨代谢异常。
在某些实施方式中，所述骨代谢异常包括骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、 人工关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全。
在某些实施方式中，所述骨代谢异常包括骨质疏松症。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括与Siglec15的表达相关的肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括结肠癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请所述ELISA测定的husiglec-15-hFc抗原活性。
图2A显示的是本申请所述ELISA测定的cyno-siglec-15-his抗原活性。
图2B显示的是本申请所述ELISA测定的husiglec-15-his抗原活性。
图3显示的是多只免疫小鼠的血清效价。
图4显示的是示例性的Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15的结合曲线。
图5A显示的是本申请所述示例性的Siglec15抗原结合蛋白对CD8+T细胞增殖的影响。
图5B显示的是本申请所述示例性的Siglec15抗原结合蛋白对CD4+T细胞增殖的影响。
图5C显示的是本申请所述示例性的Siglec15抗原结合蛋白对IFN-γ表达的影响。
图6A显示的是本申请所述示例性的人源化Siglec15结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15的结合曲线。
图6B显示的是本申请所述示例性的人源化Siglec15结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15的结合曲线。
图7A显示的是本申请所述示例性的人源化Siglec15抗原结合蛋白对CD8+T细胞增殖的影响。
图7B显示的是本申请所述示例性的人源化Siglec15抗原结合蛋白对CD4+T细胞增殖的影响。
图7C显示的是本申请所述示例性的人源化Siglec15抗原结合蛋白对IFN-γ表达的影响。
图8A显示的是本申请所述示例性的人源化Siglec15抗原结合蛋白与人Siglec15抗原的结合曲线。
图8B显示的是本申请所述示例性的人源化Siglec15抗原结合蛋白与猴Siglec15抗原的结合曲线。
图8C显示的是本申请所述示例性的人源化Siglec15抗原结合蛋白与鼠Siglec15抗原的结合曲线。
图9A显示的是本申请所述示例性的抗Siglec15抗体Ab0在野生型C57BL/6N小鼠体内的抗肿瘤药效检测结果。
图9B显示的是施用示例性的抗Siglec15抗体Ab0后，野生型C57BL/6N小鼠的体重变化。
图10A显示的是本申请所述示例性的抗Siglec15抗体Ab1、Ab6和Ab7在野生型C57BL/6N小鼠体内的抗肿瘤药效检测结果。
图10B显示的是施用示例性的抗Siglec15抗体Ab1、Ab6和Ab7后，野生型C57BL/6N小鼠的体重变化。
图11A显示的是本申请所述示例性的抗Siglec15抗体Ab0、Ab1、Ab6和Ab7在人Siglec15转基因小鼠体内的抗肿瘤药效检测结果。
图11B显示的是施用示例性的抗Siglec15抗体Ab0、Ab1、Ab6和Ab7后，人Siglec15转基因小鼠的体重变化。
图12显示的是人源化Siglec15抗原结合蛋白抑制破骨细胞的形成。
图13A显示的是本申请所述示例性的Siglec15抗原结合蛋白Ab1、Ab7和PD-1抗体联用在人PD-1/PD-L1转基因小鼠体内的抗肿瘤药效。
图13B显示的是本申请所述示例性的Siglec15抗原结合蛋白Ab1、Ab7和PD-1抗体联用后，人PD-1/PD-L1转基因小鼠的体重变化。
图14A显示的是本申请所述示例性的Siglec15抗原结合蛋白Ab1、Ab7和PD-L1抗体联用在人PD-1/PD-L1转基因小鼠体内的抗肿瘤药效。
图14B显示的是本申请所述示例性的Siglec15抗原结合蛋白Ab1、Ab7和PD-L1抗体联用后，人PD-1/PD-L1转基因小鼠的体重变化。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，在本申请中，术语“抗原结合蛋白”可包括“抗体”或“抗原结合片段”。例如，所述抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且可包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”可包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于鼠源抗体、人抗体(全人源抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’，VHH和(Fab)2片段)。术语“抗体”还可包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原(例如，人Siglec15)相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。所述CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的系统，不仅提供了可应用于抗原结合片段的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196： 901-917(1987)以及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性，但是Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。另外，其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。在本申请中，所述CDR可通过使用的是Kabat编号系统定义。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。抗体的抗原结合功能也可通过以下来实现：包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的重链，或者，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的轻链。(1)Fab片段，通常为由VL、VH、CL和CH结构域组成的一价片段；(2)F(ab’)2片段，包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(4)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)和(7)可任选地通过接头连接的两个或以上分离的CDR的组合。例如，还可包括由VL和VH配对形成的一价单链分子Fv(scFv)(参见Bird等(1988)Science 242：423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。例如，还可包括缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体VHH(例如，可参见康晓圳等，生物工程学报,2018,34(12):1974-1984)。所述“抗原结合部分”还可包括免疫球蛋白融合蛋白，所述融合蛋白包含选自以下的结合结构域：(1)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(2)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；和(3)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指一群基本同源的抗体，即包含该群的各个抗体除了可能的以微量存在的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个抗原性位点。例如，所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备或者通过使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生。单克隆抗体也可以得自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,Mol.Biol.，222:581-597(1991)所述的技术进行。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指这样的抗体，其中每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受与其组合的恒定区的来源的影响。同时，由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合在注射时抗体引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指一种嵌合抗体，其含有较少的来自非人免疫球蛋白的序列，从而降低异种抗体引入到人类中时的免疫原性，同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。例如，可以使用CDR移植(Jones et al.,Nature 321:522(1986))及其变体；包括“重塑”(reshaping)，(Verhoeyen,et al.,1988Science 239:1534-1536；Riechmann,et al.,1988Nature 332:323-337；Tempest,et al.,Bio/Technol 1991 9:266-271)，“高度加成”(hyperchimerization)，(Queen,et al.,1989Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033；Co,et al.,1991Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873；Co,et al.,1992J Immunol 148:1149-1154)和“贴面”(veneering)，(Mark,et al.,“Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18antibodies.”In:Metcalf B W,Dalton B J,eds.Cellular adhesion:molecular definition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312)、表面重建(美国专利US5639641)等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
在本申请中，术语“鼠源抗体”通常是指可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本申请的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如可以包括通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。
在本申请中，术语“Siglec15蛋白”，“Siglec-15”或“Siglec15抗原”可以互换使用，并且包括Siglec15的任何功能活性片段、变体和同源物，其由细胞天然表达或在用Siglec15基因转染的细胞上表达。在本申请中，Siglec15可以为人Siglec15，其在UniProt/Swiss-Prot中的登录号为Q6ZMC9。例如，Siglec15可以为人Siglec15的功能活性片段。例如，所述“功能活性片段”可以包括保留至少一种天然存在的蛋白质的内源功能(例如，与本申请所述的抗原结合蛋白结合)的片段。例如，所述“功能活性片段”可以包括与本申请的抗原结 合蛋白结合的结构域。
除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸之外，本申请还可包括其功能活性片段、衍生物、类似物、同源物及其片段。
术语“功能活性片段”指与天然存在序列具有基本上同一的氨基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的功能活性片段是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得编码功能活性片段的序列，只要保持原来的功能活性即可。
在本申请中，术语“衍生物”通常是指本申请的多肽或多核苷酸而言包括自/对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一种内源功能。
在本申请中，术语“类似物”通常对多肽或多核苷酸而言，包括多肽或多核苷酸的任何模拟物，即拥有该模拟物模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。
通常，可以进行氨基酸取代，例如至少1个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个以上)氨基酸取代，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物。
在本申请中，术语“同源物”通常是指与天然存在序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
用于本申请的蛋白质或多肽也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，所述氨基酸残基产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水 性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指局部组织细胞增生所形成的赘生物。例如，所述肿瘤可包括实体瘤。例如，所述肿瘤可包括与Siglec15的表达相关的肿瘤。术语“与Siglec15的表达相关的肿瘤”通常是指存在Siglec15表达的肿瘤。所述与Siglec15的蛋白表达相关的肿瘤可以是Siglec15阳性的肿瘤。在Siglec15阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的Siglec15的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。
在本申请中，术语“实体瘤”通常是指可通过临床检测(例如，X线射片，CT扫描，B超或触诊)到的有形肿块。例如，所述实体瘤可以包括结肠癌。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指所述其他治疗剂与所述分离的抗原结合蛋白缀合(例如，通过连接分子共价相连)而形成的缀合物，该缀合物可以通过所述分离的抗原结合蛋白与靶细胞上的抗原的特异性结合，将所述其他治疗剂递送至靶细胞(例如，肿瘤细胞)。此外，所述抗原也可以由所述靶细胞分泌，并位于所述靶细胞外的间隙。
在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指一种核酸分子，该种核酸分子能够转运与其连接的另一核酸。所述载体可将插入的核酸分子转移到细胞中和/或细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体可以是当引入合适的细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。在本申请中，所述载体可包含慢病毒载体。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的多肽或本申请所述的抗原结合蛋白的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述 的多肽或抗原结合蛋白即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方式中，所述细胞可以是免疫细胞。例如，所述免疫细胞可以选自下组：T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在本申请中，术语“治疗”通常是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/或病状相关联的症状消退。
在本申请中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白质”可互换地使用，通常是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。这些修饰可以包含：二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵(如与标记组分结合)。术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
在本申请中，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。
在本申请中，术语“K
D”(同样地，“K
D”或“K
D”)通常指“亲和常数”或“平衡解离常数”，并指在滴定测量中在平衡时、或者通过将解离速率常数(kd)除以结合速率常数(ka)所获得的值。使用结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(K
D) 表示结合蛋白(例如本申请所述的分离的抗原结合蛋白)对抗原(例如，Siglec15蛋白)的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度以及在生理缓冲液中在平衡时检查样品的能力。例如，可以通过Biacore(生物分子相互作用分析)测定(例如，可以从BIAcoreInternationalAB，aGEHealthcarecompany，Uppsala，瑞典获得的仪器)所述K
D值，也可以使用其他实验途径和仪器例如Octet检测。另外，也可以使用可以从SapidyneInstruments(Boise，Idaho)获得的KinExA(动态排阻测定(KineticExclusionAssay))测定所述K
D值，或者使用表面等离子共振仪(SPR)测定所述K
D值。例如，也可以通过胺偶联试剂盒测定所述K
D值。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。在某些情形中，“包含”也涵盖仅包括指定的组分的情况。例如，包含也表示为也表示“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
发明详述
本申请所述分离的抗原结合蛋白
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其在Biacore测定中，可以以约4E-09M或以下的K
D值(例如，所述K
D不高于约4E-09M、不高于约3.5E-09M、不高于约3E-09M、不高于约2.5E-09M、不高于约2E-09M、不高于约1.5E-09M、不高于约1E-09M、不高于约9E-10M、不高于约5E-10M、不高于约1E-10M、不高于约5E-11M、不高于约1E-11M或不高于5E-12M或以下)与人Siglec15蛋白特异性结合。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白在流式检测中，可以以约0.1μg/ml或以下的EC
50值(例如，所述EC50值不高于约0.1μg/ml、不高于约99ng/ml、不高于约95ng/ml、不高于约90ng/ml、不高于约85ng/ml、不高于约80ng/ml、不高于约75ng/ml、不高于约70ng/ml、不高于约65ng/ml、不高于约60ng/ml、不高于约55ng/ml或不高于约50ng/ml或以下)与表达于CHOK1细胞上的人Siglec15特异性结合。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白在ELISA检测中，可以以约0.2μg/ml或以下的 EC
50值(例如，所述EC
50值不高于约0.2μg/ml、不高于约0.1μg/ml、不高于约99ng/ml、不高于约95ng/ml、不高于约90ng/ml、不高于约85ng/ml、不高于约80ng/ml、不高于约75ng/ml、不高于约70ng/ml、不高于约65ng/ml、不高于约60ng/ml、不高于约55ng/ml或不高于约50ng/ml或以下)与人Siglec15特异性结合。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白在ELISA检测中，可以以约0.1μg/ml或以下的EC
50值(例如，所述EC
50值不高于约0.1μg/ml、不高于约99ng/ml、不高于约95ng/ml、不高于约90ng/ml、不高于约85ng/ml、不高于约80ng/ml、不高于约75ng/ml、不高于约70ng/ml、不高于约65ng/ml、不高于约60ng/ml、不高于约55ng/ml或不高于约50ng/ml或以下)与猴Siglec15特异性结合。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白在ELISA检测中，可以以约0.1μg/ml或以下的EC
50值(例如，所述EC
50值不高于约0.1μg/ml、不高于约99ng/ml、不高于约95ng/ml、不高于约90ng/ml、不高于约85ng/ml、不高于约80ng/ml、不高于约75ng/ml、不高于约70ng/ml、不高于约65ng/ml、不高于约60ng/ml、不高于约55ng/ml或不高于约50ng/ml或以下)与鼠Siglec15特异性结合。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可解除Siglec15对血液中PBMC的增殖抑制。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以促进CD8和CD4 T细胞的增殖。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以促进IFN-γ的表达。
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其可以包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH可以包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列。
例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:29-32中任一项所示的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的HCDR可以通过任何形式划分，只要VH与SEQ ID NO:29-32中任一项所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的HCDR都可落入本申请的保护范围内。
抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30 个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，本申请所述分离的抗原结合蛋白通过Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区VH，所述VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3中的至少一个、两个或三个。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR3序列可根据Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR2序列可根据Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1序列可根据Kabat编码系统定义。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab0到Ab9或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的VH可包含框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的H-FR1与SEQ ID NO：64所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X
2，X
9，X
16，X
17和X
20。
Q X
2QLVQSG X
9ELKKPG X
16X
17VK X
20SCKASGYTFT(SEQ ID NO：64)，其中，X
2可以是I或V，X
9可以是P或S，X
16可以是A或E，X
17可以是T或S，X
20可以是I或V。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO：1-3中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR2可包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的H-FR2与SEQ ID NO：65所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X
3，X
8和X
11。
WV X
3QAPG X
8GL X
11WMG(SEQ ID NO：65)，其中，X
3可以是K或R，X
8可以是K或Q，X
11可以是E或K。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR2可包含SEQ ID NO：5-8中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR3可包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的H-FR3与SEQ ID NO：66所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X
3，X
7，X
10，X
12，X
18，X
19，X
22，X
27和X
29。
RF X
3FSL X
7TS X
10S X
12AYLQI X
18X
19LK X
22EDTA X
27Y X
29CAR(SEQ ID NO：66)，其中，X
3可以是A或V，X
7可以是D或E，X
10可以是A或V，X
12可以是M或T，X
18可以是N或S，X
19可以是N或S，X
22可以是A或N，X
27可以是T或V和X
29可以是F或Y。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR3可包含SEQ ID NO：10-12中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR4可包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的H-FR4与SEQ ID NO：67所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X
6和X
7。
WGQGT X
6X
7TVSS(SEQ ID NO：67)，其中，X
6可以是L或T，X
7可以是L或V。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR4可包含SEQ ID NO：14和15中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO：1-3中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO：5-8中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO：10-12中任一项所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：14和15中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab0或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO：11所 示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab1、Ab2、Ab3或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab4、Ab5、Ab6或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab7、Ab8、Ab9或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白包含VH，所述VH与SEQ ID NO：72所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X
2，X
9，X
16，X
17，X
20，X
38，X
43，X
46，X
69，X
73，X
76，X
78，X
84，X
85，X
88，X
93，X
95，X
115和X
116。
Q X
2QLVQSG X
9ELKKPG X
16X
17VK X
20SCKASGYTFTTYEMSWV X
38QAPG X
43GL X
46WMGWINTYSGVPTYADDFKGRF X
69FSL X
73TS X
76S X
78AYLQI X
84X
85LK X
88EDTA X
93Y X
95CAREGVYDYPYFDSWGQGT X
115X
116TVSS(SEQ ID NO：72)，其中，X
2可以是I或V，X
9可以是P或S，X
16可以是A或E，X
17可以是T或S，X
20可以是I或V，X
38可以是K或R，X
43可以是K或Q，X
46可以是E或K，X
69可以是A或V，X
73可以是D或E，X
76可以是A或V，X
78可以是M或T，X
84可以是N或S，X
85可以是N或S，X
88可以是A或N，X
93可以是T或V和X
95可以是F或Y，X
115可以是L或T，X
116可以是L或V。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO：29-32中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链恒定区，所述重链恒定区可包括源自IgG的恒定区或源自IgY的恒定区。
在本申请中，所述重链恒定区可包括源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
例如，所述抗原结合蛋白的重链恒定区可包含SEQ ID NO：39-42中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可以包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述 VL可以包含SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可以包含SEQ ID NO:33-36中任一项所示的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的LCDR可以通过任何形式划分，只要VL与SEQ ID NO:33-36中任一项所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的LCDR都可落入本申请的保护范围内。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包括轻链可变区VL，所述VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3中的至少一个，至少两个或至少三个。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的LCDR3可根据Kabat编号系统定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的LCDR2可根据Kabat编号系统定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的LCDR1可根据Kabat编号系统定义。
例如，本申请所述抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab0到Ab9或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的VL可包含框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的L-FR1与SEQ ID NO：68所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X
5，X
15，X
18和X
19。
DIQM X
5QSPSSLSAS X
15GD X
18X
19TITC(SEQ ID NO：68)，其中，X
5可以是N或T，X
15可以是L或V，X
18可以是R或T和X
19可以是I或V。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：16-18中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR2可包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的L-FR2与SEQ ID NO：69所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X
8和X
9。
WYQQKPG X
8X
9PKLLIY(SEQ ID NO：69)，其中，X
8可以是K或N，X
9可以是A或I。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR2可包含SEQ ID NO：20和21中任一项所示的 氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR3可包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的L-FR3与SEQ ID NO：70所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X
12，X
14和X
27。
GVPSRFSGSGS X
12T X
14FTLTISSLQPED X
27ATYYC(SEQ ID NO：70)，其中，X
12可以是G或R，X
14可以是D或G和X
27可以是F或I。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR3可包含SEQ ID NO：23-25中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR4可包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的L-FR4与SEQ ID NO：71所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X
7。
FGGGTK X
7EIK(SEQ ID NO：71)，其中，X
7可以是L或V。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR4可包含SEQ ID NO：27和28中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：16-18中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO：20和21中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO：23-25中任一项所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO：27-28中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab0或与其具有相同L-FR1-4的抗体。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab1、Ab4、Ab7或与其具有相同H-FR1-4的抗体。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列； 所述L-FR2可包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab2、Ab5、Ab8或与其具有相同L-FR1-4的抗体。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab3、Ab6、Ab9或与其具有相同H-FR1-4的抗体。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL，所述VL可包含SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的VL与SEQ ID NO：73所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X
5，X
15，X
18，X
19，X
42，X
43，X
68，X
70，X
83，X
104。
DIQMX
5QSPSSLSASX
15GDX
18X
19TITCHASQNINVWLSWYQQKPGX
42X
43PKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSX
68TX
70FTLTISSLQPEDX
83ATYYCQQGQSSPLTFGGGTKX
104EIK
(SEQ ID NO：73)，其中，X
5可以是N或T，X
15可以是L或V，X
18可以是R或T，X
19可以是I或V，X
42可以是K或N，X
43可以是A或I，X
68可以是G或R，X
70可以是D或G，X
83可以是F或I，X
104可以是L或V。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO：33-36中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含轻链恒定区，所述轻链恒定区可包括源自Igκ的恒定区或源自Igλ的恒定区。
例如，所述轻链恒定区可包括源自Igκ的恒定区。
例如，所述抗原结合蛋白的轻链恒定区包含SEQ ID NO：43中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab0-Ab9或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与 其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区。所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab0或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab0或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab1或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab1或与其具有相同轻链可变 区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab2或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab2或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗原结合片段Ab3或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab3或与其具有相 同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab4或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab4或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区。所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab5或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体 Ab5或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab6或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab6或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab7或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab7或与其具有相同轻链可变 区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab8或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab8或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab9或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体Ab9或与其具有相同轻链可变 区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可与参比抗体竞争结合所述人Siglec15蛋白，所述参比抗体可包含重链可变区VH，所述VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3中的至少一个、两个或三个。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR3的序列可根据Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR2的序列可根据Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR1的序列可根据Kabat编码系统定义。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab0到Ab9或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区，所述重链可变区可包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列。
Q X
2QLVQSG X
9ELKKPG X
16X
17VK X
20SCKASGYTFTTYEMSWV X
38QAPG X
43GL X
46WMGWINTYSGVPTYADDFKGRF X
69FSL X
73TS X
76S X
78AYLQI X
84X
85LK X
88EDTA X
93Y X
95CAREGVYDYPYFDSWGQGT X
115X
116TVSS(SEQ ID NO：72)，其中，X
2可以是I或V，X
9可以是P或S，X
16可以是A或E，X
17可以是T或S，X
20可以是I或V，X
38可以是K或R，X
43可以是K或Q，X
46可以是E或K，X
69可以是A或V，X
73可以是D或E，X
76可以是A或V，X
78可以是M或T，X
84可以是N或S，X
85可以是N或S，X
88可以是A或N，X
93可以是T或V和X
95可以是F或Y，X
115可以是L或T，X
116可以是L或V。
在本申请中，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO：29-32中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链恒定区，所述重链恒定区可包括源自IgG的恒定区或源自IgY的恒定区。
例如，所述参比抗体的重链恒定区可包含SEQ ID NO：39-42中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述参比抗体可包括轻链可变区VL，所述VL可包含LCDR1、LCDR2和 LCDR3。
在本申请中，所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的LCDR3的序列可根据Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述参比抗体的LCDR2可包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的LCDR2的序列可根据Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述参比抗体的LCDR1可包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的LCDR1的序列可根据Kabat编码系统定义。
例如，本申请所述参比抗体的LCDR1可包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab0到Ab9或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含轻链可变区，所述轻链可变区可包含SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列。
DIQMX
5QSPSSLSASX
15GDX
18X
19TITCHASQNINVWLSWYQQKPGX
42X
43PKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSX
68TX
70FTLTISSLQPEDX
83ATYYCQQGQSSPLTFGGGTKX
104EIK(SEQ ID NO：73)，其中，X
5可以是N或T，X
15可以是L或V，X
18可以是R或T，X
19可以是I或V，X
42可以是K或N，X
43可以是A或I，X
68可以是G或R，X
70可以是D或G，X
83可以是F或I，X
104可以是L或V。
在本申请中，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO：33-36中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述参比抗体可包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包括源自Igκ的恒定区或源自Igλ的恒定区。
例如，所述参比抗体的轻链恒定区包含SEQ ID NO：43中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述参比抗体可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab0-Ab9或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区。例如，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab0或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab0或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab0或与其具有相同重链可变区及轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区。例如，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab1或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab1或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab1或与其具有相同重链可变区及轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区。例如，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab2或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab2或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab2或与其具有相同重链可变区及轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区。例如，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab3或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab3或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab3或与其具有相同重链可变区及轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区。例如，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab4或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab4或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab4或与其具有相同重链可变区及轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区。例如，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab5或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab5或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab5或与其具有相同重链可变区及轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区。例如，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab6或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab6或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab6或与其具有相同重链可变区及轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区。例如，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab7与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab7或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab7或与其具有相同重链可变区及轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区。例如，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab8或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab8或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab8或与其具有相同重链可变区及轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区。例如，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab9或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab9或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述参比抗体可包括抗体Ab9或与其具有相同重链可变区及轻链可变区的抗原结合蛋白。
多肽和免疫缀合物
另一方面，本申请提供了一种或多种多肽，其可包含本申请的分离的抗原结合蛋白。例如，所述多肽可包括融合蛋白。例如，所述多肽可包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
另一方面，本申请提供了一种或多种免疫缀合物，所述免疫缀合物可包含本申请的分离的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，所述免疫缀合物还可包含药学上可接受的治疗剂、标记物和/或检测剂。
核酸、载体和细胞
另一方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述分离的抗原结合蛋白。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗原结合蛋白，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、重链可变区中的一种或多种)。
例如，当核酸分子分别编码所述抗原结合蛋白的一部分时，核酸分子编码的产物合在一起可以形成有功能的(例如，可结合Siglec15)的本申请的分离的抗原结合蛋白。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。例如，所述分离的核酸可以是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述分离的抗原结合蛋白的核酸，这些方法包括但不限于，采用逆转录PCR和PCR获得本申请所述分离的抗原结合蛋白的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动 子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体可为表达载体。例如，所述载体可为病毒载体。可以将病毒载体直接给予至患者(体内)或可以通过间接的形式，例如，在体外使用病毒处理细胞，然后将处理过的细胞给予至患者(离体)。病毒载体技术在本领域中是公知的，并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。在某些情形中，可以用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的方法将基因转移整合进宿主基因组中，使插入的基因长期表达。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录病毒载体。慢病毒载体可包含长末端重复序列5’LTR和截短的3’LTR、RRE、rev应答元件(cPPT)、中央终止序列(CTS)和/或翻译后调控元件(WPRE)。本申请所述的载体可以被引入细胞。
另一方面，本申请提供了一种细胞。所述细胞可包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。例如，每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。例如，每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如原核细胞(例如，细菌细胞)、CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞、293F细胞或HEK293A细胞，或者其他真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。例如，所述细胞可以包括酵母细胞。例如，所述细胞可以包括大肠杆菌细胞。例如，所述细胞可以包括哺乳动物细胞。例如，所述细胞可以包括免疫细胞。
所述细胞可以包括免疫细胞。在某些情形中，所述细胞可以包括免疫细胞。例如，所述细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
药物组合物和药物组合
另一方面，本申请提供了一种药物组合物。所述药物组合物可包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、所述分离的核酸分子、所述的载体、所述的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。在本申请中，所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂。除非与本申请所述的细胞不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑用于本申请的药物组合物中。在本申请中，所述药学上可接受的赋形剂可以包括在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。例如，所述赋形剂可以包括片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂。例如，所述赋形剂可以包括中药丸剂中的酒、醋、药汁等。例如，所述赋形剂可以包括半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分。例如，所述赋形剂可以包括液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。
另一方面，本申请提供了一种药物组合，其包含所述分离的抗原结合蛋白和免疫检查点抑制剂。
在本申请中，所述免疫检查点抑制剂可包括抑制PD-1/PD-L1相互作用的物质。例如，所述免疫检查点抑制剂可选自下组：PD-1/PD-L1阻断剂、PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
例如，所述PD-1/PD-L1阻断剂可选自下组：BMS202(PD-1/PD-L1抑制剂2)、BMS-1(PD-1/PD-L1抑制剂1)、PD-1/PD-L1抑制剂3、BMS-1166和BMS-1001。
例如，所述PD-1抑制剂可包括抗PD-1抗体。例如，所述PD-L1抑制剂可包括抗PD-L1抗体。
例如，所述抗PD-1抗体可选自下组：Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)和Tislelizumab(替雷利珠单抗)。例如，所述抗PD-L1抗体可选自下组：Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Atezolizumab(阿替利珠单抗)和avelumab(阿维单抗)。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含选自下组的抗体的HCDR3：Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)和Tislelizumab(替雷利珠单抗)。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含选自下组的抗体的HCDR2：Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠单抗)、Toripalimab(特瑞 普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)和Tislelizumab(替雷利珠单抗)。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含选自下组的抗体的HCDR1：Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)和Tislelizumab(替雷利珠单抗)。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含选自下组的抗体的LCDR3：Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)和Tislelizumab(替雷利珠单抗)。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含选自下组的抗体的LCDR2：Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)和Tislelizumab(替雷利珠单抗)。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含选自下组的抗体的LCDR1：Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)和Tislelizumab(替雷利珠单抗)。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含选自下组的抗体的VH：Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)和Tislelizumab(替雷利珠单抗)。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含选自下组的抗体的VL：Nivolumab(纳武单抗)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)和Tislelizumab(替雷利珠单抗)。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含选自下组的抗体的HCDR3：Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Atezolizumab(阿替利珠单抗)和avelumab(阿维单抗)。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含选自下组的抗体的HCDR2：Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Atezolizumab(阿替利珠单抗)和avelumab(阿维单抗)。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含选自下组的抗体的HCDR1：Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Atezolizumab(阿替利珠单抗)和avelumab(阿维单抗)。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含选自下组的抗体的LCDR3：Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Atezolizumab(阿替利珠单抗)和avelumab(阿维单抗)。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含选自下组的抗体的LCDR2：Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Atezolizumab(阿替利珠单抗)和avelumab(阿维单抗)。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含选自下组的抗体的LCDR1：Durvalumab(德瓦 鲁单抗)、Atezolizumab(阿替利珠单抗)和avelumab(阿维单抗)。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含选自下组的抗体的VH：Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Atezolizumab(阿替利珠单抗)和avelumab(阿维单抗)。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含选自下组的抗体的VL：Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Atezolizumab(阿替利珠单抗)和avelumab(阿维单抗)。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含HCDR3，所述HCDR3可包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-1抗体包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-1抗体包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-1抗体包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-1抗体可包括帕博利珠单抗或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)的抗体。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含重链可变区VH，所述VH可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含LCDR3，所述LCDR3可包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含LCDR2，所述LCDR2可包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含LCDR1，所述LCDR1可包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含轻链可变区VL，所述VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR3可包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1可包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-1抗体可包括帕博利珠单抗或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗体。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含轻链可变区VL，所述VL可包含SEQ ID NO：51 所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-1抗体可包含重链和轻链，所述重链可包含HCDR1-3以及H-FR1-4，且所述轻链可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-1抗体可包括帕博利珠单抗或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合蛋白。
例如，所述抗PD-1抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-1抗体可包括帕博利珠单抗或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗PD-1抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-1抗体可包括帕博利珠单抗或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗PD-1抗体的重链可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-1抗体可包括帕博利珠单抗或与其具有相同重链的抗原结合蛋白。例如，所述抗PD-1抗体的轻链可包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-1抗体可包括帕博利珠单抗或与其具有相同轻链的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含HCDR3，所述HCDR3可包含SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-L1抗体可包括阿替利珠单抗或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)的抗体。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含重链可变区VH，所述VH可包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含LCDR3，所述LCDR3可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含LCDR2，所述LCDR2可包含SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含LCDR1，所述LCDR1可包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含轻链可变区VL，所述VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR3可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1可包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-L1抗体可包括阿替利珠单抗或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗体。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含轻链可变区VL，所述VL可包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗PD-L1抗体可包含重链和轻链，所述重链可包含HCDR1-3以及H-FR1-4，且所述轻链可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-L1抗体可包括阿替利珠单抗或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合蛋白。
例如，所述抗PD-L1抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-L1抗体可包括阿替利珠单抗或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗PD-L1抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-L1抗体可包括阿替利珠单抗或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗PD-L1抗体的重链可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-L1抗体可包括阿替利珠单抗或与其具有相同重链的抗原结合蛋白。例如，所述抗PD-L1抗体的轻链可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。例如，所述抗PD-L1抗体可包括阿替利珠单抗或与其具有相同轻链的抗原结合蛋白。
试剂盒、用途和方法
另一方面，本申请提供了一种用于检测或测定Siglec15的方法，所述方法可包括使用所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽。
在本申请中，所述方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
例如，所述方法可包括用于非诊断目的的检测Siglec15的存在和/或含量的方法，其可包括下述步骤：
1)使样品与本申请的抗原结合蛋白接触；以及
2)检测样品结合的所述抗原结合蛋白的存在和/或含量来确定获自受试者的样品中Siglec15的存在和/或表达水平。
另一方面，本申请提供了一种Siglec15的试剂盒，其可包括使用所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽。
在本申请中，所述试剂盒还可包含使用说明，所述使用说明记载用于检测Siglec15的存在和/或含量的方法。例如，所述方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面，本申请提供了一种所述的分离的抗原结合蛋白或所述的多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒可用于检测Siglec15的存在和/或含量的方法。例如，所述方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面，本申请提供了一种调节免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述的载体，所述的细胞和/或所述的药物组合物，和/或药学上可接受的治疗剂。
在本申请中，所述调节免疫应答的方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面，本申请提供了一种调节免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的药物组合，和/或药学上可接受的治疗剂。
在本申请中，所述调节免疫应答的方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面，本申请提供了分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、所述分离的核酸分子、所述的载体、所述的药物组合物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
另一方面，在本申请中，所述的试剂盒和/或所述的药物组合用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
例如，所述疾病或病症可以包括骨代谢异常。例如，所述骨代谢异常可包括骨质疏松症、 伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、人工关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全。例如，所述骨代谢异常可包括骨质疏松症。例如，本申请的抗原结合蛋白可以单独施用或者与骨相关疾病的至少一种其它治疗剂组合施用。例如，本申请的抗原结合蛋白可以与治疗有效量的骨代谢异常的治疗剂组合施用。可与本申请的抗原结合蛋白组合施用的治疗剂包括但不限于：二膦酸盐(例如，阿仑膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、伊卡膦酸盐、帕玛二磷酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐),活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM(选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2(四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH(甲状旁腺激素)、非甾体类抗炎药(例如，塞来考昔和罗非昔布)、可溶性TNF受体(例如，依那西普)、抗-TNF-α抗体或所述抗体的功能片段(例如，英夫利昔单抗)、抗-PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白)抗体或所述抗体的功能片段、IL-1受体拮抗剂(例如，阿那白滞素)、抗-IL-6受体抗体或所述抗体的功能片段(例如，托珠单抗)、抗-RANKL抗体或所述抗体的功能片段(例如，denosumab)和OCIF(破骨细胞生成抑制因子)。根据骨代谢异常的状态或希望的治疗和/或预防程度，可以施用两种、三种或更多种药物类型。
例如，所述疾病或病症可包括肿瘤。例如，所述肿瘤可包括实体瘤。例如，所述肿瘤可包括与Siglec15的表达相关的肿瘤。术语“与Siglec15的表达相关的肿瘤”通常是指Siglec15表达改变导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。例如，所述“与Siglec15的表达相关的肿瘤”可以是Siglec15表达量上调导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。所述与Siglec15的蛋白表达相关的肿瘤可以是Siglec15阳性的肿瘤。在Siglec15阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的Siglec15的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。
例如，所述肿瘤可以包括结肠癌。
另一方面，本申请提供了一种所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、所述的分离的核酸分子、所述的载体，所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
另一方面，本申请提供了一种药物组合在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
例如，所述疾病或病症可以包括骨代谢异常。例如，所述骨代谢异常可包括骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、 骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、人工关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全。例如，所述骨代谢异常可包括骨质疏松症。例如，本申请的抗原结合蛋白可以单独施用或者与骨相关疾病的至少一种其它治疗剂组合施用。例如，本申请的抗原结合蛋白可以与治疗有效量的骨代谢异常的治疗剂组合施用。可与本申请的抗原结合蛋白组合施用的治疗剂包括但不限于：二膦酸盐(例如，阿仑膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、伊卡膦酸盐、帕玛二磷酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐),活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM(选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2(四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH(甲状旁腺激素)、非甾体类抗炎药(例如，塞来考昔和罗非昔布)、可溶性TNF受体(例如，依那西普)、抗-TNF-α抗体或所述抗体的功能片段(例如，英夫利昔单抗)、抗-PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白)抗体或所述抗体的功能片段、IL-1受体拮抗剂(例如，阿那白滞素)、抗-IL-6受体抗体或所述抗体的功能片段(例如，托珠单抗)、抗-RANKL抗体或所述抗体的功能片段(例如，denosumab)和OCIF(破骨细胞生成抑制因子)。根据骨代谢异常的状态或希望的治疗和/或预防程度，可以施用两种、三种或更多种药物类型。
例如，所述疾病或病症可包括肿瘤。例如，所述肿瘤可包括实体瘤。例如，所述肿瘤可包括与Siglec15的表达相关的肿瘤。术语“与Siglec15的表达相关的肿瘤”通常是指Siglec15表达改变导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。例如，所述“与Siglec15的表达相关的肿瘤”可以是Siglec15表达量上调导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。所述与Siglec15的蛋白表达相关的肿瘤可以是Siglec15阳性的肿瘤。在Siglec15阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的Siglec15的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。
例如，所述肿瘤可以包括结肠癌。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用所述的分离的抗原结合蛋白、所述的分离的核酸分子、所述的载体，所述的细胞、所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用所述的药物组合。
例如，所述疾病或病症可以包括骨代谢异常。例如，所述骨代谢异常可包括骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、人工关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉 特病、肾性骨营养不良和成骨不全。例如，所述骨代谢异常可包括骨质疏松症。例如，本申请的抗原结合蛋白可以单独施用或者与骨相关疾病的至少一种其它治疗剂组合施用。例如，本申请的抗原结合蛋白可以与治疗有效量的骨代谢异常的治疗剂组合施用。可与本申请的抗原结合蛋白组合施用的治疗剂包括但不限于：二膦酸盐(例如，阿仑膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、伊卡膦酸盐、帕玛二磷酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐),活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM(选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2(四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH(甲状旁腺激素)、非甾体类抗炎药(例如，塞来考昔和罗非昔布)、可溶性TNF受体(例如，依那西普)、抗-TNF-α抗体或所述抗体的功能片段(例如，英夫利昔单抗)、抗-PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白)抗体或所述抗体的功能片段、IL-1受体拮抗剂(例如，阿那白滞素)、抗-IL-6受体抗体或所述抗体的功能片段(例如，托珠单抗)、抗-RANKL抗体或所述抗体的功能片段(例如，denosumab)和OCIF(破骨细胞生成抑制因子)。根据骨代谢异常的状态或希望的治疗和/或预防程度，可以施用两种、三种或更多种药物类型。
例如，所述疾病或病症可包括肿瘤。例如，所述肿瘤可包括实体瘤。例如，所述肿瘤可包括与Siglec15的表达相关的肿瘤。术语“与Siglec15的表达相关的肿瘤”通常是指Siglec15表达改变导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。例如，所述“与Siglec15的表达相关的肿瘤”可以是Siglec15表达量上调导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。所述与Siglec15的蛋白表达相关的肿瘤可以是Siglec15阳性的肿瘤。在Siglec15阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的Siglec15的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。
例如，所述肿瘤可以包括结肠癌。
本申请所述药物组合物、药物组合及方法可与其他类型的癌症疗法结合使用，诸如化学疗法、手术、放射、基因疗法等。本申请中所描述的药物组合物及方法可用于其他依赖于免疫反应的疾病病状，诸如炎症、免疫疾病及感染性疾病。
在本申请中，所述受试者可以包括人或非人动物。例如，所述非人动物可以选自下组：猴、鸡、鹅、猫、狗、小鼠和大鼠。此外，非人动物也可以包括任何除人以外的动物物种，例如家畜动物，或啮齿类动物，或灵长类动物，或家养动物，或家禽动物。所述人可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族，或各种种族的杂合体。又例如，所述人可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。
可以根据在实验动物中的有效量推测在人类中的有效量。例如，Freireich等人描述了动 物和人的剂量的相互关系(基于每平方米身体表面的毫克数)(Freireich et al.，Cancer Chemother.Rep.50，219(1966))。身体表面积可以从患者的身高和体重近似确定。参见例如Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardsley，N.Y.，537(1970)。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1免疫抗原活性验证
1.1抗原包被：用DPBS溶液配制浓度梯度稀释的husiglec-15-hFc抗原(人Siglec-15Fc，SinoBiological，货号：13976-H02H)溶液，96孔板4℃包被过夜。
1.2清洗：取过夜包被96孔板，PBST溶液清洗三遍。
1.3封闭：采用DPBS(含3％BSA)对抗原进行封闭，置于室温，封闭1小时。
1.4配体结合：采用DPBS(含1％BSA)溶液定量稀释Siglec-15抗体(小鼠-人嵌合抗体(5G12,人IgG1)，Acrobiosystem)，37℃包被1小时。
1.5二抗结合：弃去反应液，PBST溶液清洗三遍，加入二抗(HRP-山羊抗人IgG,F(ab')2二抗，来源:Jackson，货号:109-035-006)，每孔加入100μl，置于37℃反应1小时。
1.6 ELISA检测：弃去反应液，PBST溶液清洗三遍；先后加入TMB溶液及H
2SO
4终止液，轻微震荡显黄色后，450nm下检测OD值。
如图1所示，ELISA测定的husiglec-15-hFc抗原活性实验结果，结果显示husiglec-15-hFc抗原具有较好的抗原活性，可用作后期杂交瘤实验中小鼠免疫原。
实施例2筛选抗原活性验证
2.1抗原包被：用DPBS溶液配制浓度梯度稀释的husiglec-15-his抗原(人Siglec-15his，Acrobiosystem，货号：SG5-H52H3)溶液，cyno-siglec-15-hFc(食蟹猴Siglec-15his，Acrobiosystem，货号：SG5-C52H6)取96孔板，每孔加入100μl，4℃包被过夜。
后续实验与实施案例1步骤2-6相同。
如图2A所示，ELISA测定的cyno-siglec-15-his抗原活性结果显示其具有很好的抗原活性，可用于后期杂交瘤细胞上清的筛选抗原，如图2B所示，ELISA测定的husiglec-15-his抗原活性结果显示其具有很好的抗原活性，可用于免疫小鼠血清中抗体滴度检测实验。
实施例3抗人Siglec-15单克隆抗体的制备和筛选
抗人Siglec-15单克隆抗体通过免疫小鼠产生，实验用SJL白小鼠，雌性，6周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司)。饲养环境:SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养l周后将己适应环境的小鼠用重组蛋白husiglec-15-Fc(人siglec-15Fc，SinoBiological，货号：13976-H02H)(50ug)与RIBI佐剂免疫。进行4-5次免疫，期间监测血清抗体水平，选择血清中抗体滴度高的小鼠进行加强免疫，3日后处死小鼠，取脾细胞，与骨髓瘤细胞融合。采用优化的电融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(ATCC，货号：BDXB-0001)进行融合得到杂交瘤细胞。
如表1所示，试验动物及免疫信息。
表1试验动物及免疫信息
| 小鼠类型 | SJL鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司) |
| 免疫抗原 | husiglec-15-Fc抗原 |
| 免疫方法 | 初次免疫50ug/只，后续25μg/只，腹腔注射(ip) |
| 免疫次数 | 5 |
| 最后加强免疫 | 50μg husiglec-15-Fc蛋白，腹腔注射(ip)，在融合前三天进行 |
3.1小鼠血清效价检测
3.1.1抗原包被：采用DPBS溶液配制1μg/ml的husiglec-15-his抗原(人Siglec-15his，Acrobiosystem，货号：SG5-H52H3)溶液，96孔板4℃包被过夜。
3.1.2清洗：取过夜包被96孔板，PBST溶液清洗三遍。
3.1.3封闭：采用DPBS(含3％BSA)对抗原进行封闭，置于室温，封闭1小时。
3.1.4抗体结合：采用DPBS(含1％BSA)溶液稀释血清溶液，阴性对照为未免疫小鼠的血清。阳性对照孔为Siglec-15抗体(小鼠-人嵌合抗体(5G12,Human IgG1)，Acrobiosystem)。置于室温，反应1小时。
3.1.5二抗结合：弃去反应液，PBST溶液清洗三遍；加入二抗(山羊抗鼠IgG F(ab')2二抗,偶联HRP，来源:invitrogen，货号:31436)，阳性对照孔加入二抗(HRP-山羊抗人IgG,F(ab')2二抗，来源:Jackson，货号:109-035-006)置于室温反应1小时。
3.1.6 ELISA检测：弃去反应液，PBST溶液清洗三遍；先后加入TMB溶液及H
2SO
4终止液，轻微震荡显黄色后，450nm下检测OD值。
如图3所示，多只免疫小鼠的血清效价。实验结果显示5只免疫小鼠中，2#，3#，4#小 鼠小鼠效价值较高，均达到437.4k，达到可以进行融合的效价，可安排后续冲免及融合实验。
如表2所示，多只免疫小鼠的血清效价值。
表2免疫小鼠的血清效价
| 1# | 2# | 3# | 4# | 5# |
| 5.4K | 437.4K | 437.4K | 437.4K | 1.8K |
3.2杂交瘤融合
3.2.1将脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞以5:1～2:1比例混合，离心，共沉淀。去除上清后，用适量融合缓冲液重悬细胞，调整混合细胞密度至1×10
7个细胞/ml进行电融合。融合结束，细胞在电极匣中静置5分钟后,将细胞加入到20％FBS的1×HAT选择培养液中，转入96孔细胞培养板，置37℃、5％CO
2培养箱中培养。7～8天更换新鲜培养基1次。
3.2.2培养第10天(或更久，根据细胞生长状态)后取上清，通过FACS和ELISA方法测定杂交瘤上清中抗体表达量，筛选出表达特异性抗Siglec-15抗体的杂交瘤细胞。经初筛得到的阳性克隆转移到24孔板培养，然后经过再次筛选鉴定上清，选择阳性克隆进行1-2轮亚克隆，再次筛选稳定表达特异性抗Siglec-15抗体的杂交瘤单克隆细胞，据此挑选出表达量最高的杂交瘤细胞系，冻存细胞样本及Trizol样本。
3.3抗原结合蛋白测序
本申请利用分子生物学技术，获得Siglec-15阳性杂交瘤细胞中的抗原结合蛋白序列，并进行嵌合和人源化改造。
3.4抗人Siglec-15抗体的人源化设计
为了降低鼠源抗体的免疫原性，任选地可以将已筛选出的有生物学活性的抗体进行人源化。鼠源单克隆抗体的人源化根据本领域许多文献公示的方法进行。简言之，可以使用人抗体恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种系抗体序列，进行CDR移植。然后可以以鼠源抗体的三维结构为基础，通过VL和VH的氨基酸残基进行回复突变，将鼠源抗体的恒定区替换为人恒定区，得到最终的人源化结合蛋白。
如表3、表4和表5所示，本申请抗原结合蛋白的CDR、重链可变区VH、轻链可变区VL、FR，轻链恒定区CL和重链恒定区CH的氨基酸序列。
表3本申请抗原结合蛋白的CDR、重链可变区VH、轻链可变区VL的序列信息
表4本申请抗原结合蛋白的FR的序列信息
表5本申请抗原结合蛋白的轻链恒定区CL和重链恒定区CH的序列信息
| 轻链恒定区 | SEQ ID NO:43 |
| 重链恒定区IgG1 | SEQ ID NO:39 |
| 重链恒定区IgG2 | SEQ ID NO:40 |
| 重链恒定区IgG3 | SEQ ID NO:41 |
| 重链恒定区IgG4 | SEQ ID NO:42 |
3.5抗体蛋白的表达和纯化
根据本申请的抗原结合蛋白序列构建质粒，瞬转表达Expi293细胞(Thermo Fisher，货号：A14527CN)，使用大量抽提试剂盒提取抗体表达质粒。溶液1：用1ml培养液稀释15μg质粒，混匀。溶液2：用1ml培养液稀释60μl转染试剂，混匀。将溶液2加入溶液1中，混匀，37℃孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入细胞液中，边摇边加，放至摇床培养，表达一周，收集上清，8000转/分钟离心5分钟。
Protein A亲和层析柱纯化抗体蛋白：
(1)平衡层析柱：1×PBS，流速1ml/分钟，20ml
(2)上样：流速1ml/分钟
(3)洗杂：1×PBS，流速1ml/分钟，20ml
(4)洗脱：柠檬酸缓冲液(PH3.4)，1ml/分钟，分管收集，每管约500μl。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。
(5)透析：将高浓度蛋白吸至透析袋放1×PBS的烧杯中透析。使用高效液相色谱仪LC-20AT及凝胶色谱柱的纯度检测合格，内毒素检测合格。
实施例4嵌合Siglec15抗原结合蛋白与表达于细胞上的人Siglec15的结合
基于流式细胞术测定法测定Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15的结合能力。通过比较不同Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15的结合曲线来测定其结合能力。
4.1将CHOK1/hSiglec15细胞(康源博创)铺于96孔板中。
4.2用含2％FBS的PBS分别配制阳性对照抗体(SPH-Sg-PC-1，泰州市百英生物科技有限公司，货号B218501，重链可变区序列如SEQ ID NO：37所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：38所示)、阴性对照抗体(人IgG1，novoprotein，货号NC002)和本申请抗原结合蛋白最大浓度为15μg/ml，5倍稀释，8个点，稀释好的样品加入96孔板中，4摄氏度孵育1小时。
4.3用含2％FBS的PBS洗板3次。
4.4将PE标记的-人IgG(Biolegend,货号410708)分别用2％FBS的PBS按产品说明书比例稀释，稀释好的样品加入96孔板中，4摄氏度孵育0.5小时。
4.5用含2％FBS的PBS洗板2次。
4.6用2％FBS的PBS重新悬浮细胞，使用流式细胞仪测定PE通道的中位荧光度值(MFI)。
在以上试验表明，本申请的嵌合Siglec15抗原结合蛋白具有与CHOK1细胞上过表达的人Siglec15的结合活性，并且优于阳抗。
如图4所示，基于流式细胞术测定嵌合Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15的结合曲线。
如表6所示，基于流式细胞术测定嵌合Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15结合的EC
50值和最高MFI值。
表6嵌合Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面Siglec15结合的EC
50值和最高MFI值
| 编号 | EC 50(μg/ml) | 最高MFI值 |
| 阳性对照抗体 | 0.2956 | 39462.26 |
| 阴性对照抗体 | ～ | 243.61 |
| Ab0 | 0.07046 | 41452.98 |
实施例5嵌合Siglec15抗原结合蛋白的生物学活性
Siglec15是表达在免疫系统细胞表面的Siglecs家族中的一员。在肿瘤微环境中，它可以抑制T细胞的活化和增殖，进而抑制T细胞的抗肿瘤活性。Siglec15抗原结合蛋白与Siglec15结合后，可以阻断其对T细胞的抑制作用，增强T细胞的活化和增殖，进而引起IFN-γ表达分泌量的增加。
在Siglec15存在下，将Siglec15抗原结合蛋白与人血液中提取的PBMC共孵育一定时间，最终通过检测共孵育的PBMC中CD4和CD8T细胞的增殖以及培养基上清中IFN-γ的表达量判断Siglec15抗原结合蛋白能否阻断Siglec15对受试者血液中PBMC的增殖抑制能力。
5.1 CD4和CD8T细胞增殖检测
5.1.1将100μl的OKT3(novoprotein，货号GMP-A018)加入96孔细胞板(Corning，3599)中，4℃孵育过夜。包被结束后用PBS洗三次，待用。
5.1.2用PBS稀释待测抗体(Siglec15结合蛋白)终浓度为15μg/ml，，同时稀释Siglec15抗原终浓度为5μg/ml，稀释好的样品加入96孔板中。将细胞板放于37℃孵育30min。
5.1.3冻存的人外周单个核细胞(PBMC)，在37℃水浴锅中化冻后，重悬于PBS中，400g，5min离心弃去上清。将细胞重悬于PBS中调整细胞密度，加入0.5μM CFSE(Invitrogen,货号65-0850-85)，并在室温下孵育8分钟，然后加入等体积的血清，室温下孵 育8分钟，400g，5min离心弃去上清。
5.1.4用PBS洗细胞，洗三次。用带血清1640培养基重悬PBMC后，加入到孵育后的抗体孔中，37℃孵育64h。孵育结束后，收集细胞上清液备用。
5.1.5用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)将细胞反应板中的PBMC转移到96孔U型板中(Corning，货号3799)，400g，5min离心弃去上清。按照说明书用FACS缓冲液稀释APC抗人CD8(BioLegend，344722)和PE-Cy7抗人CD4(BioLegend，357410)抗体，稀释好的样品加入96孔圆底板中，室温孵育30min。400g，5min离心弃去上清。
5.1.6用FACS缓冲液重复洗细胞3次。PBS重悬细胞后流式细胞仪检测，用Kaluza分析数据。数据显示的是基于CFSE含量降低的CD4和CD8T细胞与未刺激的CD4和CD8T细胞的比例。
5.2用人IFN-g Elisa Kit(RnD,货号DY285B)检测培养基上清中IFN-γ的表达量
5.2.1用PBS将捕获抗体稀释至2μg/ml，按100μl/孔的体积包被96孔板，4℃包被过夜。
5.2.2包被结束后用PBST(0.05％
20in PBS,pH 7.2-7.4)洗三次，洗板后将96孔板倒扣在洁净的实验室用纸巾上，轻拍若干次，去除孔中残余液体。
5.2.3用含1％BSA的PBST进行封闭，300μl/孔，室温封闭2h。封闭结束后，用PBST洗三次。
5.2.4用含1％BSA的PBST稀释样品及标准品到使用浓度，按100μl/孔将样品及标准品加入96孔板中，完成后盖上板盖，密封接口处缝隙，室温孵育2h。孵育结束后，用PBST洗三次。
5.2.5用含1％BSA的PBST将检测抗体稀释至200ng/ml，按100μl/孔将稀释好的检测抗体加入96孔板中，盖上板盖，密封接口处缝隙，室温孵育2h。孵育结束后，用PBST洗三次。
5.2.6用含1％BSA的PBST按1:40的比例稀释链霉亲和素-HRP至工作浓度，然后将其加入96孔板中，100μl/孔，37℃孵育20min(稀释及孵育时要注意避光)。孵育结束后，用PBST洗三次。
5.2.7将TMB混合液按100μl/孔加入96孔板，37℃孵育15～20min(此步骤需避光操作)。
5.2.8反应结束后，加入50μl终止液反应，轻拍96孔板使其充分混匀。终止反应后，立即用酶标仪读取96孔板在450nm处的吸光度值。通过标准品计算样品中INF-γ的水平。
以上试验表明，本申请嵌合Siglec15抗原结合蛋白能够阻断Siglec15对受试者血液中 PBMC的增殖抑制能力。
如图5A，5B，5C所示，嵌合Siglec15抗原结合蛋白能够促进CD8和CD4 T细胞的增殖以及促进培养基上清中IFN-γ的表达量性，并且活性优于阳性抗体。
如表7所示，嵌合Siglec15抗原结合蛋白能够阻断Siglec15对受试者血液中PBMC的增殖抑制能力。
表7嵌合Siglec15结合阻断Siglec15对受试者血液中PBMC的增殖抑制能力
实施例6人源化Siglec15抗原结合蛋白与表达于细胞上的人Siglec15的结合
基于流式细胞术测定法测定Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15的结合能力。通过比较本申请不同人源化Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15的结合曲线来测定其结合能力。
6.1将CHOK1/hSiglec15细胞(康源博创)铺于96孔板中。
6.2用含2％FBS的PBS分别配制阳性对照抗体(SPH-Sg-PC-1，泰州市百英生物科技有限公司，货号B218501)、阴性对照抗体(人IgG1，novoprotein，货号NC002)和本申请抗原结合蛋白抗体最大浓度为15μg/ml，5倍稀释，8个点，稀释好的样品加入96孔板中，4摄氏度孵育1小时。
6.3用含2％FBS的PBS洗板3次。
6.4将PE标记的-人IgG(Biolegend,货号410708)分别用2％FBS的PBS按产品说明书比例稀释，稀释好的样品加入96孔板中，4摄氏度孵育0.5小时。
6.5用含2％FBS的PBS洗板2次。
6.6用2％FBS的PBS重新悬浮细胞，使用流式细胞仪测定PE通道的中位荧光度值(MFI)。
在以上试验表明，本申请的人源化Siglec15抗原结合蛋白具有与CHOK1细胞上过表达的人Siglec15的结合活性，并且优于阳抗。
如图6A和图6B所示，基于流式细胞术测定人源化Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15的结合曲线。
如表8所示，基于流式细胞术测定人源化Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15结合的EC
50值和最高MFI值。
表8人源化Siglec15抗原结合蛋白与表达于CHOK1细胞表面人Siglec15结合的EC
50值和最高MFI值
| 编号 | EC 50(μg/ml) | 最高MFI值 |
| 阳性对照抗体 | 0.0599 | 27625.13 |
| 阴性对照抗体 | ～ | 288.74 |
| Ab0 | 0.0334 | 24080.77 |
| Ab1 | 0.0804 | 25061.89 |
| Ab2 | 0.0380 | 23658.72 |
| Ab3 | 0.0467 | 23381.68 |
| Ab4 | 0.0723 | 26642.79 |
| Ab5 | 0.0560 | 26104.63 |
| Ab6 | 0.0345 | 24640.97 |
| Ab7 | 0.0718 | 25183.29 |
| Ab8 | 0.0460 | 24927.39 |
| Ab9 | 0.0609 | 23493.68 |
实施例7人源化Siglec15抗原结合蛋白的生物学活性
7.1 CD4和CD8T细胞增殖检测
7.1.1将100μl的OKT3(novoprotein，货号GMP-A018)加入96孔细胞板(Corning，3599)中，4℃孵育过夜。包被结束后用PBS洗三次，待用。
7.1.2用PBS稀释待测抗体终浓度为15μg/ml，，同时稀释Siglec15抗原终浓度为5μg/ml，稀释好的样品加入96孔板中。将细胞板放于37℃孵育30min。
7.1.3冻存的人外周单个核细胞(PBMC)，在37℃水浴锅中化冻后，重悬于PBS中，400g，5min离心弃去上清。将细胞重悬于PBS中调整细胞密度，加入0.5μM CFSE(Invitrogen,货号65-0850-85)，并在室温下孵育8分钟，然后加入等体积的血清，室温下孵育8分钟，400g，5min离心弃去上清。
7.1.4用PBS洗细胞，洗三次。用带血清1640培养基重悬PBMC后，加入到孵育后的 抗体孔中，37℃孵育64h。孵育结束后，收集细胞上清液备用。
7.1.5用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)将细胞反应板中的PBMC转移到96孔U型板中(Corning，货号3799)，400g，5min离心弃去上清。按照说明书用FACS缓冲液稀释APC抗人CD8(BioLegend，344722)和PE-Cy7抗人CD4(BioLegend，357410)抗体，稀释好的样品加入96孔圆底板中，室温孵育30min。400g，5min离心弃去上清。
7.1.6用FACS缓冲液重复洗细胞3次。PBS重悬细胞后流式细胞仪检测，用Kaluza分析数据。数据显示的是基于CFSE含量降低的CD4和CD8T细胞与未刺激的CD4和CD8T细胞的比例。
7.2用人IFN-g Elisa Kit(RnD，货号DY285B)检测培养基上清中IFN-γ的表达量
7.2.1用PBS将捕获抗体稀释至2μg/ml，按100μl/孔的体积包被96孔板，4℃包被过夜。
7.2.2包被结束后用PBST(0.05％
20in PBS,pH 7.2-7.4)洗三次，洗板后将96孔板倒扣在洁净的实验室用纸巾上，轻拍若干次，去除孔中残余液体。
7.2.3用含1％BSA的PBST进行封闭，300μl/孔，室温封闭2h。封闭结束后，用PBST洗三次。
7.2.4用含1％BSA的PBST稀释样品及标准品到使用浓度，按100μl/孔将样品及标准品加入96孔板中，完成后盖上板盖，密封接口处缝隙，室温孵育2h。孵育结束后，用PBST洗三次。
7.2.5用含1％BSA的PBST将检测抗体稀释至200ng/ml，按100μl/孔将稀释好的检测抗体加入96孔板中，盖上板盖，密封接口处缝隙，室温孵育2h。孵育结束后，用PBST洗三次。
7.2.6用含1％BSA的PBST按1:40的比例稀释链霉亲和素-HRP至工作浓度，然后将其加入96孔板中，100μl/孔，37℃孵育20min(稀释及孵育时要注意避光)。孵育结束后，用PBST洗三次。
7.2.7将TMB混合液按100μl/孔加入96孔板，37℃孵育15～20min(此步骤需避光操作)。
7.2.8反应结束后，加入50μl终止液反应，轻拍96孔板使其充分混匀。终止反应后，立即用酶标仪读取96孔板在450nm处的吸光度值。通过标准品计算样品中INF-γ的水平。
以上试验表明，本申请人源化Siglec15抗原结合蛋白能够阻断Siglec15对受试者血液中PBMC的增殖抑制能力。
如图7A，7B，7C所示，人源化Siglec15抗原结合蛋白能够促进CD8和CD4 T细胞的 增殖以及促进培养基上清中IFN-γ的表达量性，并且活性优于阳性抗体。
如表9所示，Siglec15抗原结合蛋白能够阻断Siglec15对受试者血液中PBMC的增殖抑制能力。
表9 Siglec15抗原结合蛋白阻断Siglec15对受试者血液中PBMC的增殖抑制能力
实施例8 Siglec15抗原结合蛋白的结合亲和力
用Biacore检测不同Siglec15抗原结合蛋白与抗原(Siglec15蛋白，人，重组(ECD,His Tag)，来源:Acro，货号:SG5-C5253)蛋白的结合亲和性。
试剂配制。运行试剂：含10mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2磺酸(HEPES)，150mM氯化钠(NaCl)，3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.005％吐温-20(Tween-20)，pH调节至7.4；人IgG(Fc)捕获试剂盒(货号：BR-1008-39，GE)，其中包括：鼠抗人IgG(Fc)抗体(0.5mg/mL)，固定试剂(10mM醋酸钠，pH5.0)，再生试剂(3M氯化镁)；氨基偶联试剂盒(货号：BR100050，GE)，其中包括：115mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，750mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10.5mL 1M乙醇胺(pH 8.5)。将每管EDC和NHS分别加入10mL的去离子水，分装保存到-18℃至更低温度，保质期两个月。(参考GE氨基偶联指导手册《22-0510-62AG》)。
芯片制备。将鼠抗人IgG(Fc)抗体用固定试剂(10mM醋酸钠，pH 5.0)稀释到25μg/mL，芯片每个通道约使用约100μL鼠抗人IgG(Fc)抗体，固定八个通道约使用1900μL 固定试剂加入100μL鼠抗人IgG(Fc)抗体。首先，CM5芯片的表面用400mM EDC和100mM NHS以10μL/min的流速进行420s的活化。其次，将25μg/mL的鼠抗人IgG(Fc)抗体以10μL/min的流速注入到实验通道(FC2)约420s，固定量约为9000至14000RU。最后，芯片用1M乙醇胺以10μL/min进行420s封闭。参比通道(FC1)与试验通道(FC2)进行相同的操作。(参考GE人IgG(Fc)捕获试剂盒指导手册《22-0648-88AD》)。
捕获配体。将11个Siglec15抗原结合蛋白用运行试剂稀释至5μg/mL，并以10μL/min的流速注入到实验通道(FC2)，捕获40s，参比通道(FC1)不需要进行配体的捕获。
分析物单浓度分析。将Siglec15抗原用运行试剂稀释至400nM。捕获Siglec15抗原结合蛋白后，将稀释后的Siglec15抗原依次以30μL/min的流速，结合90s，解离210s，注入到实验通道与参比通道，同时每个抗体设定1个0浓度。每一个Siglec15抗原结合蛋白分析后，芯片需要用3M氯化镁以20μL/min的流速再生30s，洗掉配体以及未解离的分析物。
分析物单浓度分析。将抗原用运行试剂稀释至200nM。捕获抗体后，将稀释后的抗原依次以30μl/分钟的流速，结合90秒，解离210秒，注入到实验通道与参比通道，同时每个抗原结合蛋白设定1个0浓度。每一个抗原结合蛋白分析后，芯片需要用3M氯化镁以20μl/分钟的流速再生30秒，洗掉配体以及未解离的分析物。
所有的操作步骤均在运行试剂中进行，SPR的分析试剂均需过滤脱气使用。使用Biacore8K分析软件计算每个抗体的K
D值。参比通道(FC1)用于背景的扣减。
以上试验表明，本申请人源化Siglec15抗原结合蛋白具有与抗原的结合亲和力。
如表10所示，用Biacore检测不同人源化Siglec15抗原结合蛋白与抗原蛋白的结合亲和性。
表10 Siglec15抗原结合蛋白与抗原蛋白的结合亲和力
| 编号 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | K D(M) |
| 阳性对照抗体 | 2.89E+05 | 5.96E-04 | 2.06E-09 |
| Ab0 | 1.14E+05 | 4.41E-04 | 3.86E-09 |
| Ab1 | 1.27E+05 | 4.49E-04 | 3.54E-09 |
| Ab2 | 1.14E+05 | 3.81E-04 | 3.34E-09 |
| Ab3 | 1.04E+05 | 4.13E-04 | 3.95E-09 |
| Ab4 | 1.39E+05 | 4.54E-04 | 3.27E-09 |
| Ab5 | 1.14E+05 | 4.15E-04 | 3.66E-09 |
| Ab6 | 1.17E+05 | 4.12E-04 | 3.52E-09 |
| Ab7 | 1.31E+05 | 4.33E-04 | 3.31E-09 |
| Ab8 | 1.48E+05 | 3.93E-04 | 2.65E-09 |
| Ab9 | 1.21E+05 | 4.80E-04 | 3.97E-09 |
实施例9 Siglec15抗原结合蛋白的种属交叉反应试验
本试验检测Siglec15抗原结合蛋白分别与人Siglec15-his(Acro,货号5G5-H52H3)，食蟹猴Siglec15-hFc(Acro,货号SG5-C5253)，小鼠Siglec15-his(Acro,货号SG5-M52H7)蛋白的结合。
9.1用PBS分别配制人Siglec15-his，食蟹猴Siglec15-hFc和小鼠Siglec15-his 1ug/ml，加入96孔板中(Corning，货号9018)，4度过夜。
9.2次日弃掉包被液，用0.05％Tween20的PBS洗板3次。
9.3用含3％BSA的PBS 37度孵育2小时，用0.05％Tween20的DPBS洗板3次。
9.4用含1％BSA的PBS分别配制待测抗体最大浓度为15ug/ml，5倍稀释，8个浓度点。加入96孔板中，室温孵育1小时。用0.05％Tween20的PBS洗板3次。
9.5将二抗HRP-山羊抗人IgG F(ab')2(Jackson，货号109-006-008)用含1％BSA的PBS按产品说明书稀释，稀释好的样品加入96孔板中,室温孵育0.5小时。用0.05％Tween20的PBS洗板3次。
9.6每孔加入100ul TMB底物显色液，室温孵育15分钟。
9.7每孔加入100ul 2N H
2SO
4终止液，用酶标仪在450nm波长处读取数值并记录。
以上试验表明，本申请人源化Siglec15抗原结合蛋白具有与人、猴和鼠Siglec15抗原的结合能力。
如图8A，8B，8C所示，人源化Siglec15抗原结合蛋白具有与人、猴和鼠Siglec15抗原的结合曲线。
如表11所示，人源化Siglec15抗原结合蛋白与人、猴和鼠Siglec15抗原的结合能力。
表11人源化Siglec15抗原结合蛋白与人、猴和鼠Siglec15抗原的结合能力
实施例10 Siglec15抗原结合蛋白对野生型C57BL/6N动物模型的抗肿瘤药效试验
本试验采用MC38/hSiglec15细胞接种C57BL/6N小鼠测定本发明的Siglec15抗原结合蛋白的抗肿瘤作用。
C57BL/6N小鼠：雌性C57BL/6N小鼠(6周)购自浙江维通利华实验动物技术有限公司。小鼠在到达后适应性饲养7天，随后开始研究。
细胞：鼠源MC38细胞购自和元生物技术(上海)股份有限公司，按照说明书进行常规传代培养；SPH对MC38细胞进行了基因改造，使其过量表达人源Siglec15，该细胞被命名为MC38/hSiglec15细胞，用于后续体内实验。离心收集细胞，在无血清培养基中重悬细胞并调整细胞密度，在第0天将细胞悬液皮下接种至野生型C57BL/6N小鼠右腋窝皮下来建立MC38/hSiglec15荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种第6天，检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在100mm
3～190mm
3范围内的小鼠按瘤体积平均分组(每组6只小鼠)，分别在接种后第6、9、12、15、18、21天给药，阴性对照抗体(人IgG)、阳性对照抗体(SPH-Sg-PC-1，来源：泰州市百英生物科技有限公司，货号B218501)、本申请抗原结合蛋白，给药期间监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2次/周，连续监测3周。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第24～26天计算肿瘤体积抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；其中Ti：给药组肿瘤体积均数，T0：给药组D0天的肿瘤体积均数，Vi：同型对照组肿瘤体积均数，V0：同型对照组D0天的肿瘤体积均数。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的长径(a)和宽径(b)，肿瘤体积按如下公式计算：TV＝1/2×a×b
2。采用电子天平测定体重。
如表12所示，给药剂量和方式。
表12给药试验设计
| 编号 | 给药剂量 | 给药次数 | 给药方式 |
| 阴性对照抗体 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
| 阳性对照抗体 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
| Ab0 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
| Ab1 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
| Ab6 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
| Ab7 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
*每隔3天给药，共6次。
如图9A所示，第一次试验中抗原结合蛋白Ab0在野生型C57BL/6N小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
如图9B所示，第一次试验中抗原结合蛋白Ab0施用后，野生型C57BL/6N小鼠的体重变化。
如图10A所示，第二次试验中抗原结合蛋白Ab1、Ab6和Ab7在野生型C57BL/6N小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
如图10B所示，第二次试验中抗原结合蛋白Ab1、Ab6和Ab7施用后，野生型C57BL/6N小鼠的体重变化。
如表13和表14所示，第一次试验中在接种后第26天，本申请的抗原结合蛋白Ab0在10mg/kg剂量下显著性抑制肿瘤的生长，肿瘤体积抑制率为83％；第二次试验中在接种后第24天，本申请的抗原结合蛋白Ab1、Ab6和Ab7在10mg/kg剂量下显著性抑制肿瘤的生长，肿瘤体积抑制率分别为99％、60％和54％。
上述试验表明，本申请的抗原结合蛋白Ab0、Ab1、Ab6和Ab7显著性抑制肿瘤的生长，并且对野生型C57BL/6N小鼠动物体重均没有明显影响。
表13第一次试验中第26天本申请的抗原结合蛋白Ab0体内抑制肿瘤生长能力
注：*：与阴性对照抗体肿瘤体积相比，P<0.05；**：与阴性对照抗体肿瘤体积相比，P<0.01。
表14第二次试验中第24天本申请的抗原结合蛋白Ab1、Ab6和Ab7体内抑制肿瘤生长能力
注：*：与阴性对照抗体肿瘤体积相比，P<0.05；**：与阴性对照抗体肿瘤体积相比，P<0.01。
实施例11 Siglec15抗原结合蛋白对人Siglec15转基因小鼠的抗肿瘤药效试验
本试验采用MC38/hSiglec15细胞接种人Siglec15转基因小鼠测定本发明的Siglec15抗原结合蛋白的抗肿瘤作用。
人Siglec15转基因小鼠：雌性C57BL/6背景的人Siglec15转基因小鼠(6周)购自上海南方模式生物科技股份有限公司。小鼠在到达后适应性饲养7天，随后开始研究。
细胞：鼠源MC38细胞购自和元生物技术(上海)股份有限公司，按照说明书进行常规传代培养；对MC38细胞进行基因改造，使其过量表达人源Siglec15，该细胞被命名为MC38/人Siglec15细胞，用于后续体内实验。离心收集细胞，在无血清培养基中重悬细胞并调整细胞密度，在第0天将细胞悬液皮下接种至人Siglec15转基因小鼠右腋窝皮下来建立MC38/人Siglec15荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种第6天，检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在90mm
3～130mm
3范围内的小鼠按瘤体积平均分组(每组5～6只小鼠)，分别在接种后第6、9、12、15、18、21天给药，阴性对照抗体(人IgG)、阳性对照抗体(SPH-Sg-PC-1，来源：泰州市百英生物科技有限公司，货号B218501)本申请抗原结合蛋白，给药期间监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2次/周，连续监测3周。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第24天计算肿瘤体积抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；其中Ti：给药组肿瘤体积均数，T0：给药组D0天的肿瘤体积均数，Vi：同型对照组肿瘤体积均数，V0：同型对照组D0天的肿瘤体积均数。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的长径(a)和宽径(b)，肿瘤体积按如下公式计算：TV＝1/2×a×b
2。采用电子天平测定体重。
如表15所示，给药剂量和方式。
表15给药试验设计
| 编号 | 给药剂量 | 给药次数 | 给药方式 |
| 阴性对照抗体 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
| 阳性对照抗体 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
| Ab0 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
| Ab1 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
| Ab6 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
| Ab7 | 10mg/kg | Q3DX6* | 腹腔注射 |
*每隔3天给药，共6次。
如图11A所示，结合蛋白Ab0、Ab1、Ab6和Ab7在人Siglec15转基因小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
如图11B所示，结合蛋白Ab0、Ab1、Ab6和Ab7施用后，人Siglec15转基因小鼠的体重变化。
如表16所示，在接种后第24天，本申请的抗原结合蛋白Ab0、Ab1、Ab6和Ab7在10mg/kg剂量下显著性抑制肿瘤生长，肿瘤体积抑制率分别为54％、63％、51％和65％。
上述试验表明，本申请的抗原结合蛋白Ab0、Ab1、Ab6和Ab7显著性抑制肿瘤的生长，并且对人Siglec15转基因小鼠体重均没有明显影响。
表16第24天本申请的抗原结合蛋白Ab0、Ab1、Ab6和Ab7体内抑制肿瘤生长能力
注：**：与阴性对照抗体肿瘤体积相比，P<0.01。
实施例12人源化Siglec15抗原结合蛋白的生物学活性
用TRAP Staining kit(来源：Cosmo Bio Co.,LTD，货号：AK04F)检测不同Siglec15抗原结合蛋白抑制破骨细胞形成的活性。
(1)将冻存的人外周单个核细胞(PBMC)在37°水浴锅迅速解冻，用Pan Monocyte Isolation Kit(来源：Miltenyi，货号：130-096-537)分选单核细胞。
(2)离心计数，配制含25ng/mlM-SC(来源：peprotech，货号：AF-300-25)与30ng/mlRANKL(来源：peprotech，货号：AF-310-01)的带血清1640全培养基，调整细胞密度，铺于96孔板。
(3)每孔加入100ul全培养基配制的抗体，终浓度为5ug/ml。设置No-RANKL的培养基和全培养基(含M-CSF+RANKL)作为对照组。
(4)隔两天吸掉原来培养基，加入新鲜培养基和抗体,继续在培养箱培养。
(5)第8天收集上清，用50ulTRAP Staining Kit buffer与10ul上清共同孵育2h,在540nm波长处检测破骨分泌的抗酒石酸酸性磷酸酶的水平。
以上试验表明，本申请人源化Siglec15抗原结合蛋白能够抑制破骨的形成。
如图12所示，人源化Siglec15抗原结合蛋白能够抑制破骨细胞的形成，并且活性与阳性抗体相当。
如表17所示，人源化Siglec15抗原结合蛋白能够抑制破骨细胞的形成。
表17人源化Siglec15抗原结合蛋白抑制破骨细胞的形成
实施例13 Siglec15抗原结合蛋白与PD-1抗体联用对人PD-1/PD-L1转基因小鼠的抗肿瘤药效试验
本试验采用MC38/hSiglec15细胞接种人PD-1/PD-L1转基因小鼠测定本发明的Siglec15抗原结合蛋白与PD-1抗体联用的抗肿瘤作用。
人PD-1/PD-L1转基因小鼠：雌性C57BL/6背景的人PD-1/PD-L1转基因小鼠(6周)购自上百奥塞图江苏基因生物技术有限公司。小鼠在到达后适应性饲养7天，随后开始研究。
细胞：鼠源MC38细胞购自和元生物技术(上海)股份有限公司，按照说明书进行常规传代培养；对MC38细胞进行基因改造，使其过量表达人源Siglec15，该细胞被命名为MC38/人Siglec15细胞，用于后续体内实验。离心收集细胞，在无血清培养基中重悬细胞并调整细胞密度，在第0天将细胞悬液皮下接种至人PD-1/PD-L1转基因小鼠右腋窝皮下来建立 MC38/人Siglec15荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种第7天，检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在120mm
3～230mm
3范围内的小鼠按瘤体积平均分组(每组6只小鼠)，肿瘤细胞接种第7天单次给药，PD-1抗体(帕博利珠单抗Pembrolizumab，来源：泰州市百英生物科技有限公司，货号：B2014-CHO)；分别在接种后第7、10、14、17、21、24天给药，阴性对照抗体(人IgG)、阳性对照抗体(SPH-Sg-PC-1，来源：杭州皓阳生物技术有限公司，货号HSP067-41)、本申请抗原结合蛋白；给药期间监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2次/周，连续监测3周。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第28天计算肿瘤体积抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；其中Ti：给药组肿瘤体积均数，T0：给药组D0天的肿瘤体积均数，Vi：同型对照组肿瘤体积均数，V0：同型对照组D0天的肿瘤体积均数。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的长径(a)和宽径(b)，肿瘤体积按如下公式计算：TV＝1/2×a×b
2。采用电子天平测定体重。
如表18所示，给药剂量和方式。
表18给药试验设计
| 编号 | 给药剂量 | 给药次数 | 给药方式 |
| 阴性对照抗体 | 5mg/kg | BIWX6* | 腹腔注射 |
| PD-1抗体 | 1mg/kg | 单次 | 腹腔注射 |
| 阳性对照抗体 | 5mg/kg | BIWX6* | 腹腔注射 |
| Ab1 | 5mg/kg | BIWX6* | 腹腔注射 |
| Ab7 | 5mg/kg | BIWX6* | 腹腔注射 |
| PD-1抗体+阳性对照抗体 | 1mg/kg+5mg/kg | 单次+BIWX6* | 腹腔注射 |
| PD-1抗体+Ab1 | 1mg/kg+5mg/kg | 单次+BIWX6* | 腹腔注射 |
| PD-1抗体+Ab7 | 1mg/kg+5mg/kg | 单次+BIWX6* | 腹腔注射 |
*每周2次给药，共6次。
如图13A所示，抗原结合蛋白Ab1、Ab7与PD-1抗体联用在人PD-1/PD-L1转基因小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
如图13B所示，抗原结合蛋白Ab1、Ab7与PD-1抗体联用后，人PD-1/PD-L1转基因小鼠的体重变化。
如表19所示，在接种后第28天，本申请的抗原结合蛋白Ab1和Ab7在5mg/kg剂量下 肿瘤体积抑制率分别为5％和14％，PD-1抗体在1mg/kg剂量下肿瘤体积抑制率为39％；Ab1和PD-1抗体联用剂量下肿瘤体积抑制率为50％；Ab7和PD-1抗体联用剂量下肿瘤体积抑制率为61％；本申请的抗原结合蛋白Ab1和Ab7分别和PD-1抗体联用均显著性抑制肿瘤的生长。
上述试验表明，本申请的抗原结合蛋白Ab1和Ab7分别和PD-1抗体联用均显著性抑制肿瘤的生长，并且对人PD-1/PD-L1转基因小鼠体重均没有明显影响。
表19第28天本申请的抗原结合蛋白Ab1、Ab7和PD-1抗体联用的体内抑制肿瘤生长能力
*：与阴性对照抗体肿瘤体积相比，P<0.05。
实施例14 Siglec15抗原结合蛋白与PD-L1抗体联用对人PD-1/PD-L1转基因小鼠的抗肿瘤药效试验
本试验采用MC38/hSiglec15细胞接种人PD-1/PD-L1转基因小鼠测定本发明的Siglec15抗原结合蛋白与PD-L1抗体联用的抗肿瘤作用。
人PD-1/PD-L1转基因小鼠：雌性C57BL/6背景的人PD-1/PD-L1转基因小鼠(6周)购自上百奥塞图江苏基因生物技术有限公司。小鼠在到达后适应性饲养7天，随后开始研究。
细胞：鼠源MC38细胞购自和元生物技术(上海)股份有限公司，按照说明书进行常规传代培养；对MC38细胞进行基因改造，使其过量表达人源Siglec15，该细胞被命名为MC38/人Siglec15细胞，用于后续体内实验。离心收集细胞，在无血清培养基中重悬细胞并调整细胞密度，在第0天将细胞悬液皮下接种至人PD-1/PD-L1转基因小鼠右腋窝皮下来建立MC38/人Siglec15荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种第8天，检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在100mm
3～200mm
3范围内的小鼠按瘤体积平均分组(每组6只小鼠)，分别在接种后第8、12、15、19、22、26天给药，阴性对照抗体(人IgG)、PD-L1抗体(阿特珠单抗Atezolizumab，来源：杭州皓阳生物技术有限公司，货号：HSP099-20)、阳性对照抗体(SPH-Sg-PC-1，来源：杭州皓阳生物技术有限公司，货号HSP067-41)、本申请抗原结合蛋白；给药期间监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2次/周，连续监测3周。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第29天计算肿瘤体积抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；其中Ti：给药组肿瘤体积均数，T0：给药组D0天的肿瘤体积均数，Vi：同型对照组肿瘤体积均数，V0：同型对照组D0天的肿瘤体积均数。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的长径(a)和宽径(b)，肿瘤体积按如下公式计算：TV＝1/2×a×b
2。采用电子天平测定体重。
如表20所示，给药剂量和方式。
表20给药试验设计
| 编号 | 给药剂量 | 给药次数 | 给药方式 |
| 阴性对照抗体 | 5mg/kg | BIWX6* | 腹腔注射 |
| PD-L1抗体 | 3mg/kg | BIWX6* | 腹腔注射 |
| 阳性对照抗体 | 5mg/kg | BIWX6* | 腹腔注射 |
| Ab1 | 5mg/kg | BIWX6* | 腹腔注射 |
| Ab7 | 5mg/kg | BIWX6* | 腹腔注射 |
| PD-L1抗体+阳性对照抗体 | 3mg/kg+5mg/kg | BIWX6+BIWX6* | 腹腔注射 |
| PD-L1抗体+Ab1 | 3mg/kg+5mg/kg | BIWX6+BIWX6* | 腹腔注射 |
| PD-L1抗体+Ab7 | 3mg/kg+5mg/kg | BIWX6+BIWX6* | 腹腔注射 |
*每周2次给药，共6次。
如图14A所示，抗原结合蛋白Ab1、Ab7与PD-L1抗体联用在人PD-1/PD-L1转基因小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
如图14B所示，抗原结合蛋白Ab1、Ab7与PD-L1抗体联用后，人PD-1/PD-L1转基因小鼠的体重变化。
如表21所示，在接种后第29天，本申请的抗原结合蛋白Ab1和Ab7在5mg/kg剂量下肿瘤体积抑制率分别为17％和-10％，PD-L1抗体在3mg/kg剂量下肿瘤体积抑制率为19％；Ab1和PD-L1抗体联用剂量下肿瘤体积抑制率为64％；Ab7和PD-L1抗体联用剂量下肿瘤 体积抑制率为58％；本申请的抗原结合蛋白Ab1和Ab7分别和PD-L1抗体联用均显著性抑制肿瘤的生长。
上述试验表明，本申请的抗原结合蛋白Ab5和Ab10分别和PD-L1抗体联用均显著性抑制肿瘤的生长，并且对人PD-1/PD-L1转基因小鼠体重均没有明显影响。
表21第29天本申请的抗原结合蛋白Ab1、Ab7和PD-L1抗体联用的体内抑制肿瘤生长能力
**：与阴性对照抗体肿瘤体积相比，P<0.01。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
Claims (112)
- 分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：a)在Biacore检测中，以约4E-09M或以下的K D值与人Siglec15蛋白特异性结合；b)在流式检测中，以约0.1μg/ml或以下的EC 50值与表达于CHOK1细胞表面的人Siglec15特异性结合；c)解除Siglec15对血液中PBMC的增殖抑制；d)在ELISA检测中，以约0.2μg/ml或以下的EC 50值与人Siglec15特异性结合；e)在ELISA检测中，以约0.1μg/ml或以下的EC 50值与猴Siglec15特异性结合；f)在ELISA检测中，以约0.1μg/ml或以下的EC 50值与鼠Siglec15特异性结合。
- 根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含所述HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求6所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1包含SEQ ID NO:1-3中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求8所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR2包含SEQ ID NO:5-8中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求10所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3包含SEQ ID NO:10-12中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR4包含SEQ ID NO:14和15中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-13中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:1-3中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:5-8中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:10-12中任一项所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:14和15中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求14-15中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含选自下述任意一组的氨基酸序列：a)H-FR1：SEQ ID NO:1，H-FR2：SEQ ID NO:5，H-FR3：SEQ ID NO:10和H-FR4：SEQ ID NO:14；b)H-FR1：SEQ ID NO:2，H-FR2：SEQ ID NO:6，H-FR3：SEQ ID NO:11和H-FR4：SEQ ID NO:15；c)H-FR1：SEQ ID NO:2，H-FR2：SEQ ID NO:7，H-FR3：SEQ ID NO:12和H-FR4：SEQ ID NO:15；d)H-FR1：SEQ ID NO:3，H-FR2：SEQ ID NO:8，H-FR3：SEQ ID NO:12和H-FR4：SEQ ID NO:15。
- 根据权利要求1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求17所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含SEQ ID NO:29-32中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR3，所述LCDR3 包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-20中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-21中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区VL，所述VL包含所述LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-22中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求23所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1包含SEQ ID NO:16-18中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求25所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR2包含SEQ ID NO:20和21中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-26中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求27所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR3包含SEQ ID NO:23-25中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求29所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR4包含SEQ ID NO:27和28中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列；所述L-FR2包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列；所述L-FR3包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列；以及所述L-FR4包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-31中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO:16-18中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR2包含SEQ ID NO:20和21中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR3包含SEQ ID NO:23-25中任一项所示的氨基酸序列；以及所述L-FR4包含SEQ ID NO:27和28中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求31-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4包含选自下述任意一组的氨基酸序列：a)L-FR1：SEQ ID NO:16，L-FR2：SEQ ID NO:20，L-FR3：SEQ ID NO:23和L-FR4：SEQ ID NO:27；b)L-FR1：SEQ ID NO:17，L-FR2：SEQ ID NO:21，L-FR3：SEQ ID NO:24和L-FR4：SEQ ID NO:28；c)L-FR1：SEQ ID NO:18，L-FR2：SEQ ID NO:21，L-FR3：SEQ ID NO:25和L-FR4：SEQ ID NO:28；d)L-FR1：SEQ ID NO:18，L-FR2：SEQ ID NO:20，L-FR3：SEQ ID NO:25和L-FR4：SEQ ID NO:28。
- 根据权利要求1-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求34所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NO:33-36中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-35中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，所述VH和VL包含选自下述任意一组的氨基酸序列：a)VH：SEQ ID NO:29和VL：SEQ ID NO:33；b)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:34；c)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:35；d)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:36；e)VH：SEQ ID NO:31和VL：SEQ ID NO:34；f)VH：SEQ ID NO:31和VL：SEQ ID NO:35；g)VH：SEQ ID NO:31和VL：SEQ ID NO:36；h)VH：SEQ ID NO:32和VL：SEQ ID NO:34；i)VH：SEQ ID NO:32和VL：SEQ ID NO:35；j)VH：SEQ ID NO:32和VL：SEQ ID NO:36。
- 根据权利要求1-36中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链恒定区，且所述重链恒定区包括源自IgG的恒定区或源自IgY的恒定区。
- 根据权利要求37所述的分离的抗体结合蛋白，其中所述重链恒定区包括源自人IgG的恒定区。
- 根据权利要求37-38中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:39-42中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-39中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链恒定区，且所述轻链恒定区包括源自Igκ的恒定区或源自Igλ的恒定区。
- 根据权利要求40所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链恒定区包括源自人Igκ的恒定区。
- 根据权利要求40-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:43中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
- 根据权利要求43所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
- 根据权利要求43-44中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
- 多肽，其包含权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
- 免疫缀合物，其包含权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求46所述的多肽。
- 分离的核酸分子，其编码权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，或者权利要求46所述的多肽。
- 载体，其包含权利要求48所述的分离的核酸分子。
- 细胞，其包含权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求46所述的多肽，权利要求47所述的免疫缀合物，权利要求48所述的分离的核酸分子和/或权利要求49所述的载体。
- 制备权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求46所述的多肽的方法，所述方法包括再使得权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求 46所述的多肽表达的条件下，培养权利要求50所述的细胞。
- 药物组合物，其包含权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求46所述的多肽，权利要求47所述的免疫缀合物，权利要求48所述的分离的核酸分子，权利要求49所述的载体，权利要求50所述的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
- 药物组合，其包含权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白和免疫检查点抑制剂。
- 根据权利要求53所述的药物组合，其中所述免疫检查点抑制剂包括抑制PD-1/PD-L1相互作用的物质。
- 根据权利要求53-54中任一项所述的药物组合，其中所述免疫检查点抑制剂选自下组：PD-1/PD-L1阻断剂、PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
- 根据权利要求53-55中任一项所述的药物组合，其中所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体。
- 根据权利要求56所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求56-57中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求56-58中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求56-59中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求56-60中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求56-61中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求56-62中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求56-63中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求56-64中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包含轻链可变区 VL，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求56-65中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包含轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求56-66中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-1抗体包括帕博利珠单抗。
- 根据权利要求53-55中任一项所述的药物组合，其中所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-L1抗体。
- 根据权利要求68所述的药物组合，其中所述抗PD-L1抗体包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求68-69中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-L1抗体包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求68-70中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-L1抗体包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求68-71中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-L1抗体包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求68-72中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-L1抗体包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求68-73中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-L1抗体包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
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- 根据权利要求68-75中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-L1抗体包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求68-76中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-L1抗体包含轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求68-77中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-L1抗体包含轻链可变区 VL，所述VL包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求68-78中任一项所述的药物组合，其中所述抗PD-L1抗体包括阿替利珠单抗。
- 根据权利要求53-79中任一项所述的药物组合，其可以是药物组合物。
- 一种用于检测或测定Siglec15的方法，所述方法包括使用权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求46所述的多肽。
- 一种Siglec15的检测试剂盒，其包含权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求46所述的多肽。
- 权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求46所述的多肽在制备试剂盒中的用途。
- 一种调节免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求46所述的多肽，权利要求47所述的免疫缀合物，权利要求48所述的分离的核酸分子，权利要求49所述的载体，权利要求50所述的细胞和/或权利要求52中任一项所述的药物组合物，和/或药学上可接受的治疗剂。
- 一种调节免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求53-80中任一项所述的药物组合，和/或药学上可接受的治疗剂。
- 权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求46所述的多肽，权利要求47所述的免疫缀合物，权利要求48所述的分离的核酸分子，权利要求49所述的载体，权利要求50所述的细胞和/或权利要求52所述的药物组合物，其用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
- 权利要求53-80中任一项所述的药物组合，其用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
- 根据权利要求86-87中任一项所述的用途，其中所述疾病或病症包括骨代谢异常。
- 根据权利要求88所述的用途，其中所述骨代谢异常包括骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、人工关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全。
- 根据权利要求88-89中任一项所述的用途，其中所述骨代谢异常包括骨质疏松症。
- 根据权利要求86-90中任一项所述的用途，其中所述疾病或病症包括肿瘤。
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- 根据权利要求91-92中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤。
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- 权利要求53-80中任一项所述的药物组合在制备预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途。
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- 根据权利要求100-102中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括结肠癌。
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- 根据权利要求106所述的方法，其中所述骨代谢异常包括骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、人工关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全。
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