CN117736330B

CN117736330B - 肿瘤坏死因子超家族受体9的特异性抗原结合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN117736330B
Application number: CN202410096590.6A
Authority: CN
Inventors: 刘雅容; 李海豹
Original assignee: Shanghai Grit Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Grit Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2024-01-24
Filing date: 2024-01-24
Publication date: 2024-05-17
Anticipated expiration: 2044-01-24
Also published as: CN117736330A

Abstract

本发明公开了肿瘤坏死因子超家族受体9的特异性抗原结合蛋白及其应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了一种与目前的4‑1BB单克隆抗体差异化显著、且具有更好临床应用前景的4‑1BB抗体，该抗体具有良好的亲和力和特异性，在免疫细胞激活上的优势更为显著。实验结果表明，采用本发明的GT4B10抗体激活肿瘤细胞时，肿瘤特异性T细胞的数量显著高于现有抗体，可用于结合4‑1BB蛋白、激活4‑1BB信号通路、刺激免疫细胞分泌IFN‑γ等细胞因子，进而能够促进肿瘤浸润淋巴细胞的增殖以及提高CD8阳性T细胞比例，最终抑制肿瘤生长。

Description

肿瘤坏死因子超家族受体9的特异性抗原结合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤坏死因子超家族受体9的特异性抗原结合蛋白及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

4-1BB（CD137）又名肿瘤坏死因子超家族受体9，属于肿瘤坏死因子（TNFR）超家族成员，是一种激活诱导型的共刺激受体分子，由信号肽、胞外区、疏水区及胞内区构成，以单体或二聚体形式表达于活化的T细胞表面。4-1BB主要表达于CD4⁺T、CD8⁺T表面，也可表达于NK细胞、NKT细胞、肥大细胞、中性粒细胞和Foxp3⁺T细胞。其配体4-1BBL是一种II型跨膜蛋白，主要表达于树突状细胞、B细胞及巨噬细胞等抗原提呈细胞，也可以表达于肥大细胞、NK细胞、平滑肌细胞等。4-1BB和其配体4-1BBL的结合能提供共刺激信号激活T细胞，加强细胞因子和免疫功能。4-1BB也被证明可以促进记忆T细胞反应，用于提高T细胞疗法的治疗持久性。动物模型全身性注射抗4-1BB抗体也被证明可导致肿瘤生长的延迟。

4-1BB信号途径的抗肿瘤作用主要是通过增强肿瘤特异性CD8⁺T细胞的功能实现的。一方面，4-1BB信号途径可促进肿瘤特异性CD8⁺T细胞的生成和增殖，通过增强存活基因的表达抑制细胞的凋亡。另一方面，4-l BB信号途径还可增强肿瘤特异性CD8⁺T细胞向肿瘤内的浸润，增强细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肿瘤细胞的杀伤效率。肿瘤内浸润的CD8⁺T细胞上4-1BB的表达水平是衡量浸润T细胞免疫功能的重要标志之一。4-1BB信号途径可直接增强CD8⁺T细胞的功能来提高其抗肿瘤效果，也可以通过增强NK细胞、DC以及CD4⁺T细胞的免疫功能间接提高CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。

然而，现有的4-1BB抗体的激活活性较低。因此，急需研发更加安全有效的靶向4-1BB的新型疗法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种结合4-1BB的抗原结合蛋白，其表现出一种或多种期望的功能特性，如：1)能够结合4-1BB蛋白和/或激活4-1BB信号通路；2)能够刺激免疫细胞分泌IFN-γ等细胞因子；3)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖；4)能够促进肿瘤浸润淋巴细胞的增殖和/或提高CD8阳性T细胞比例。以上特性展现了其在预防和治疗肿瘤中的潜力。

本发明的第一个目的是提供一种肿瘤坏死因子超家族受体9的特异性抗原结合蛋白，所述特异性抗原结合蛋白含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示的互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3。

进一步地，本发明包括那些具有CDR的抗体重链可变区和轻链可变区的分子，只要其CDR与上述CDR序列具有85%以上（较佳地90%以上，最佳地95%以上，如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）的同源性。

进一步地，所述特异性抗原结合蛋白的重链可变区包括框架区HFR1、HFR2、HFR3、HFR4，相邻两个框架区之间设置互补决定区，即HCDR1、HCDR2、HCDR3被框架区HFR1、HFR2、HFR3、HFR4所隔开。因此抗体的重链可变区上依次设置有HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3、HFR4。

进一步地，所述框架区HFR1、HFR2、HFR3、HFR4分别包括SEQ ID NO.8-11所示的序列或与其同源性不低于90%的序列。

进一步地，所述特异性抗原结合蛋白的轻链可变区包括框架区LFR1、LFR2、LFR3、LFR4，相邻两个框架区之间设置互补决定区，即LCDR1、LCDR2、LCDR3被框架区LFR1、LFR2、LFR3、LFR4所隔开。因此抗体的轻链可变区上依次设置有LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR2、LFR3、LCDR3、LFR4。

进一步地，所述框架区LFR1、LFR2、LFR3、LFR4分别包括SEQ ID NO.13-16所示的序列或与其同源性不低于90%的序列。

进一步地，所述特异性抗原结合蛋白序列包含SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.12所示的序列。

进一步地，所述特异性抗原结合蛋白还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

进一步地，所述特异性抗原结合蛋白可为抗体或其抗原结合片段。

进一步地，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)₂，scFv，di-scFv和/或dAb。

本发明的第二个目的是提供编码上述特异性抗原结合蛋白的核酸分子。

本发明的第三个目的是提供含有上述核酸分子的表达载体。

进一步地，所述的表达载体可选自DNA、RNA、病毒载体（如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒或其组合）、质粒、转座子、其他基因转移系统、脂质体纳米颗粒（LNP，其中包裹的编码上述抗体的DNA或mRNA），或其组合。

本发明的第四个目的是提供含有上述特异性抗原结合蛋白的宿主细胞。

进一步地，所述宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，如植物细胞、动物细胞、微生物等。

本发明的第五个目的是提供含有上述特异性抗原结合蛋白的单价抗体、二价抗体或多价抗体。

本发明的第六个目的是提供含有上述特异性抗原结合蛋白的重组蛋白或免疫偶联物。

进一步地，所述重组蛋白含有特异性抗原结合蛋白，以及协助表达和/或纯化的标签序列。

进一步地，所述免疫偶联物含有特异性抗原结合蛋白，以及以下一种或几种偶联部分：可检测标记物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。

本发明的第七个目的是提供一种药物组合物，包含所述特异性抗原结合蛋白、核酸分子、表达载体、宿主细胞、单价抗体、二价抗体、多价抗体、重组蛋白或免疫偶联物。

进一步地，药物组合物中还包含药学上可接受的载体。

进一步地，所述药物组合物为免疫治疗药物，更优选地，为抗肿瘤药物。

进一步地，所述药物组合物可预防或治疗的疾病包括但不限于：胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、以及头颈癌。

本发明的第八个目的是提供上述特异性抗原结合蛋白、核酸分子、表达载体、宿主细胞、单价抗体、二价抗体、多价抗体、重组蛋白或免疫偶联物在制备用于肿瘤坏死因子超家族受体9检测的产品或在制备用于激活4-1BB信号通路或激活免疫细胞的产品中的应用。所述产品的形式包括但不限于药剂、试剂、检测板、试剂盒等。

进一步地，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测等。

进一步地，本发明提供了一种激活4-1BB信号通路的方法，其包括施用有效量的本发明所述的抗原结合蛋白、本发明所述的核酸分子、本发明所述的细胞、和/或本发明所述的药物组合物等，所述方法为非治疗且非诊断目的的体外和/或离体方法。

本发明的有益效果：

本发明利用噬菌体展示技术经过大量的筛选，成功获得一种抗人4-1BB的抗体，该抗体对4-1BB抗原具有较高的亲和力，具有独特的可变区序列，并且可通过真核表达、纯化批量制备，可用于制备检测人4-1BB的试剂或试剂盒。在功能上该抗体可以刺激 T细胞活化、增殖，尤其是CD8阳性T细胞的扩增，相关实验结果表明，相对于相同筛选批次的同靶点的4-1BB抗体，本发明的GT4B10抗体具有更强的激活效果。在肿瘤等免疫关联疾病的治疗研究中具有潜在应用。

附图说明

图1为小鼠血清效价检测结果。

图2为4-1BB抗体轻、重链可变区基因的扩增片段大小结果。

图3为4-1BB抗体scFv基因扩增到的scFv片段大小结果。

图4为4-1BB抗体的免疫文库涂板结果。

图5为本发明GT4B10的4-1BB抗体纯化后SDS-PAGE检测结果。

图6为4-1BB抗体GT4B10的亲和力结果。

图7为4-1BB抗体GT1C4的亲和力结果。

图8为本发明GT4B10的4-1BB抗体刺激PBMC后IFN-γ分泌检测结果。

图9为本发明GT4B10的4-1BB抗体在TIL细胞培养中对CD8阳性T细胞的增殖作用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

术语定义

在本发明中，术语“特异性结合”通常是指抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。根据该定义，当抗体相比于其将结合随机的，不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该抗原。术语“人4-1BB”是指具有来自人的氨基酸序列，诸如Genbank登录号为NP_001552.2的人4-1BB的氨基酸序列的4-1BB蛋白质。

在本发明中，术语“分离的”或“纯化的”通常是指至少部分从在其天然状态中通常与其结合的其他分子中分离的分子（例如抗体、核酸等）。“分离的或纯化的多肽”或“分离的或纯化的核酸”基本上没有其他生物分子，如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、细胞碎片和生长培养基。

在本发明中，术语“抗原结合蛋白”被以其广义使用并且意指包含与抗原或靶标结合的一部分并且任选地包含允许抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构型的构架或框架部分的蛋白质。抗原结合蛋白的实例包括人抗体、人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；Fab片段；F(ab’)₂片段；IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；或IgG4抗体以及其片段。抗原结合蛋白可以包括，例如具有移植的CDR或CDR衍生物的嵌合抗原受体、替代蛋白构架或人工构架。此类构架包括，但不限于：抗体来源的构架，其包含被引入以便例如使抗原结合蛋白的三维结构稳定的突变；以及完全合成的构架，其包含例如生物相容性聚合物。

在本发明中，术语“抗体”其以最广泛意义使用，且具体涵盖，但不限于，单克隆抗体（包括包含两条轻链和两条重链的全长单克隆抗体）、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、人源化抗体、完全人类抗体、嵌合抗体、重链抗体和骆驼化单结构域抗体（如，重链可变结构域抗体）。抗体通常具有免疫球蛋白的结构，可以包含通过二硫键互相连接的至少两条重链（HC）和两条轻链（LC）的蛋白，或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区（VH）和重链恒定区。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链，δ链，γ链，α链，ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。

在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。在某些天然存在的抗体中，各轻链包含轻链可变区（VL）和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为超变性的区域，称为互补决定区（CDR），其与称为框架区（FR）的较保守的区域交替。各VH和VL包含三个CDR和四个框架区（FR），从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区（HFR1，HFR2，HFR3，HFR4，LFR1，LFR2，LFR3，LFR4），大部分采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞（例如，效应细胞）和经典补体系统的第一组分（Clq）结合。

在本发明中，术语“可变”通常是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDRs)或高变区（HVR）。可变域中更高度保守的部分被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDRs一起形成抗体的抗原结合位点，恒定区不直接参与抗体与抗原的结合。在本领域中，可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则、Chothia定义规则或IMGT定义规则。

在本发明中，术语“Fab”指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区，同上)。Fab片段由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(V_H)的第一恒定区(C_H1)组成。

在本发明中，术语“Fab′片段”是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，该片段比Fab片段稍大。例如，Fab′片段包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可包括重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。

在本发明中，术语“F(ab')2”指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。

在本发明中，术语“Fv片段”是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。

在本发明中，术语“scFv”通常是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本发明中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。

在本发明中，术语“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,TrendsBiotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及参考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公布的专利申请。

在本发明中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即集群中的个别抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂（通常具有针对不同决定簇的不同抗体）不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。

在本发明中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体（“亲本抗体”），且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本（例如小鼠来源）抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。

在本发明中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体（例如小鼠抗体）的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白（受体抗体）中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种（供体抗体）（诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物）的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。

在本发明中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本发明所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本发明所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本发明所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本发明所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞（例如大肠杆菌），也可以是真核细胞（例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞）。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是免疫细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是肿瘤浸润淋巴细胞、TCR细胞、CAR-NK细胞、CAR-NKT细胞或CAR-T细胞。在本发明中，术语“重组细胞”通常是指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。

在本发明中，术语“治疗有效量”是指当施用于人或动物时引起足以在所述人或动物中产生治疗效果的应答的抗体的量。有效量易于由本领域普通技术人员按照常规方法确定。

在本发明中，术语“药学上可接受的佐剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子可包括缓冲剂，抗氧化剂，低分子量（少于约10个残基）多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，单糖，二糖和其它碳水化合物，螯合剂，糖醇，成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂。

在本发明中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。在本发明中，所述变体可以为，在所述蛋白质和/或所述多肽（例如，特异性结合4-1BB蛋白的抗体或其片段）的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变（例如取代、缺失或添加）之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60%，70%，80%，90%，或100%的生物学活性（例如抗原结合能力）。例如，所述取代可以为保守取代。

在本发明中，所述同源物可以为，与所述蛋白质和/或所述多肽（例如，特异性结合4-1BB蛋白的抗体或其片段）的氨基酸序列具有至少约85%（例如，具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的）序列同源性的蛋白质或多肽。

在本发明中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基（例如，A、T、C、G、I）或相同氨基酸残基（例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met）的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数（即，窗大小），并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊（Proc．Natl．Acad．Sci．），85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一种基本的局部对比（alignment）搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。

在本发明中，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。在本发明中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。在本发明中，术语“约”和“大约”应当通常意指鉴于测量的性质或精度，所测量的量的可接受误差程度。示例性误差程度在所给出的值或值范围的20百分数(％)范围内，一般在其10％范围内和更一般在其5％范围内。

抗原结合蛋白

一方面，本发明提供一种抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区VH中的HCDR1-3。

本发明所述的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。本发明所述的抗体可以为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。本发明所述抗体的抗原结合片段可以为Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)₂，scFv，di-scFv和/或dAb。

本发明所述的抗原结合蛋白可以与参比抗体竞争结合4-1BB。所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区。例如，所述参比抗体的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含 SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述 LCDR2包含SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列（WAS, 色氨酸-丙氨酸-丝氨酸）；所述LCDR3包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；且所述参比抗体的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含 SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述HCDR3 包含SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。

本发明所述抗原结合蛋白可包含重链互补决定区HCDR1，HCDR2和HCDR3。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

本发明所述抗原结合蛋白还可包含重链框架区HFR1，HFR2，HFR3和HFR4。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的HFR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的HFR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的HFR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的HFR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连。

在本发明中，所述抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区（VH），且所述VH可包含SEQID NO.7所示的氨基酸序列。

本发明所述的抗原结合蛋白可包含重链恒定区。在本发明中，所述重链恒定区可包含人IgG的恒定区。在某些情形中，所述重链恒定区可包括人IgG4恒定区和/或人IgG1的重链恒定区。

本发明中所述抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。例如，本发明中所述抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区VL中的LCDR1-3。

在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。

本发明所述抗原结合蛋白可包含轻链互补决定区LCDR1，LCDR2和LCDR3。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的LCDR1包含SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的LCDR2包含SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列(WAS)。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的LCDR3包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5（WAS）和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5(WAS)和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5(WAS)和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的VH可包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5(WAS)和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的VH可包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白可包含重链恒定区。

本发明所述抗原结合蛋白可包含轻链框架区LFR1，LFR2，LFR3和LFR4。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的LFR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的LFR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的LFR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间。

在本发明中，所述抗原结合蛋白的LFR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连。

在本发明中，所述的抗原结合蛋白可包含VL，且所述VL可包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述抗原结合蛋白可包含VH和VL，所述VH可包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。

可通过本领域已知的各种测定鉴别、筛选或表征本发明所述的4-1BB抗原结合蛋白的物理/化学特性和/或生物活性。

在一个方面，例如可通过已知方法诸如酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫印迹（例如，蛋白质印迹）、流式细胞术（例如，FACS）、免疫组织化学、免疫荧光等来测试本发明抗原结合蛋白或融合蛋白的抗原结合活性。本发明所述的抗原结合蛋白（例如，4-1BB抗体）能够特异性结合4-1BB抗原。“特异性结合”4-1BB抗原的抗原结合蛋白（例如，4-1BB抗体）通常可以结合4-1BB，但不结合缺乏4-1BB序列的其它蛋白。本发明所述的抗原结合蛋白（例如，4-1BB抗体）能够特异性结合4-1BB抗原或其标记形式（例如，荧光标记的4-1BB抗原），但不会结合缺乏4-1BB表位的其它蛋白。抗原结合蛋白（例如，抗体）是否结合4-1BB抗原可使用本领域中已知的任何测定法确定。本领域中已知测定结合亲和力的分析的实例包括生物膜干涉技术（BLI）。例如使用人4-1BB抗原蛋白，所述4-1BB抗原结合蛋白与4-1BB的KD可以在约1E-07至约1E-10之间，可以在约1E-08至约1E-10之间，可以在约1E-08至约1E-9之间或可以在约1E-09至约1E-10之间。

本发明所述的抗原结合蛋白可以结合人4-1BB蛋白。在某些情形中，本发明所述的抗原结合蛋白还可以与猴，例如食蟹猴的4-1BB交叉反应。例如，通过流式分析技术和酶联免疫反应所检测的。在本发明中，“交叉反应”是指抗体与来自其它物种的同源蛋白反应的能力。

在某些情形中，本发明所述抗原结合蛋白与4-1BB的结合活性可使用酶联免疫法测定进行检测。例如，在ELISA中，使用人4-1BB抗原蛋白，所述4-1BB抗原结合蛋白与4-1BB的EC50值可以在约0.0001nM至约100nM之间，例如，可以在约0.001nM至约10nM之间，可以在约0.001nM至约5nM之间，可以在约0.001nM至约1nM之间或可以在约0.01nM至约1nM之间。

本发明所述抗原结合蛋白能够刺激免疫细胞中表达CD107a阳性细胞的比例。本发明所述抗原结合蛋白能够刺激免疫细胞中IFN-γ、TNF-α和/或IL2的分泌。例如，本发明所述抗原结合蛋白的刺激能力，可以是在本领域已知激活剂（例如CD3抗体、CD28抗体、或包含CD3抗体和CD28抗体的纳米材料TransAct）激活的基础上，增加对免疫细胞激活的效果。所述免疫细胞可包括淋巴细胞，例如B细胞、T细胞，天然杀伤细胞，髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。例如，所述免疫细胞可以包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。例如，所述免疫细胞可以包含人工修饰的免疫细胞。例如，所述免疫细胞可以包含TCR-T细胞。可用本领域任何技术人员已知的方法测定免疫细胞中细胞因子的分泌，例如，通过酶联免疫法（ELISA）定量测定免疫细胞（例如T细胞）增殖情况或由免疫细胞产生的细胞因子（例如由T细胞产生的IFN-γ）。例如，可以通过混合淋巴细胞反应（MLR）实验检测4-1BB抗体对于T淋巴细胞的刺激结果。

核酸分子和细胞

另一方面，本发明提供了一种或多种核酸分子，其可以编码本发明所述的分离的抗原结合蛋白。本发明所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：（i）在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应（PCR）扩增产生的，（ii）通过克隆重组产生的，（iii）纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者（iv）合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。

另一方面，本发明提供了一种载体，其可以包含本发明所述的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。

另一方面，本发明提供了一种细胞，其可以包含本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本发明所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个（例如，2个或以上）或多种（例如，2种或以上）本发明所述的核酸分子或载体。例如，可将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中。可通过本领域已知的方法将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin 转染等。

药物组合物

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其可包含本发明所述的抗原结合蛋白和/或所述的核酸分子，所述的载体，所述的宿主细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。所述药学上可接受的佐剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并且可包括缓冲剂，抗氧化剂，防腐剂，低分子量（小于约10个残基）多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，碳水化合物，成盐反离子，金属络合物，和/或非离子表面活性剂。本发明中的药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。

本发明所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述抗原结合蛋白。所述预防和/或治疗有效量是能够预防和/或治疗（至少部分治疗）患有或具有发展风险的受试者中的疾病或病症和/或其任何并发症而所需的剂量。

制备方法

另一方面，本发明提供了制备所述的抗原结合蛋白的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述本发明所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。

任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的抗原结合蛋白。例如，可以用连接或天然存在的抗原蛋白或其片段，免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。

任何合适形式的4-1BB都可以作为免疫原（抗原），用于产生特异的抗体，筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以是全长的成熟人4-1BB，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。

人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明中，抗体是IgG抗体，使用IgG1亚型。可以通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体实现必需恒定结构域序列的优化，以产生所需生物学活性。同样，任一类轻链都可以在本发明的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。

本发明的抗原结合蛋白或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该核酸分子引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体）和细胞中。

本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的核酸分子所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。通常，在适合本发明抗原结合蛋白表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗原结合蛋白。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验（如流式细胞分选技术（FACS）或酶联免疫吸附测定（ELISA））来测定。

方法和用途

另一方面，本发明提供了一种所述抗原结合蛋白在制备药物中的用途。所述抗原结合蛋白可以单独施用或与一种或多种另外的疗法组合施用，另外的疗法例如化疗放射治疗、免疫治疗、手术干预或这些的任何组合。所述药物可用于需要增强4-1BB以治疗的疾病或病症，例如，用于治疗癌症，抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。

另一方面，本发明提供的所述抗原结合蛋白，可用于预防或治疗肿瘤。所述预防或治疗疾病或病症可以指抑制或延缓疾病或病症的发展或进展。例如，可以用于抑制肿瘤的发展或进展。例如，可以抑制肿瘤增长或肿瘤细胞增殖。

另一方面，本发明提供了预防、缓解或治疗肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用本发明所述的抗体或其抗原结合片段、所述的分子核酸、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。例如，可以用于抑制肿瘤的发展或进展。例如，可以抑制肿瘤增长或肿瘤细胞增殖。

实施例1 抗人4-1BB抗体的制备过程

1.免疫动物

选择4-6周龄纯种Balb/c小鼠，为增加可溶性蛋白免疫原性，本实验中采用的佐剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma)。免疫原采用可溶性真核表达的带有His标签的人4-1BB蛋白(4-1BB -His，恺佧生物)，表达于HEK293细胞，蛋白纯度经Tris-Bis PAGE和HPLC鉴定>95%。

免疫程序如下：初免，弗氏完全佐剂乳化抗原，每只小鼠50ug，皮下分多点注射免疫，共5只小鼠；第14天，二免，弗氏不完全佐剂乳化抗原，每只小鼠50ug，皮下分多点注射免疫；第28天，三免，弗氏不完全佐剂乳化抗原，每只小鼠50ug，皮下分多点注射免疫；在第42天，四免，弗氏不完全佐剂乳化抗原，每只小鼠50ug，皮下分多点注射免疫；在第49天，进行终免，抗原溶于PBS，每只小鼠10ug，尾静脉注射冲击免疫。

2.血清效价检测

每次免疫前尾静脉取血50uL，离心去除细胞，保留血清。ELISA微孔板中加入4-1BB-His（恺佧生物） 50ng/孔，4℃包被过夜。PBS清洗三遍，加入1% BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。加入梯度稀释的小鼠血清，37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100uL 1:5000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG 37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。

图1为最后一次血清效价结果。

3. 构建免疫文库

3.1 小鼠脾细胞总cDNA获取

在用4-1BB -His抗原冲击免疫后四天处死小鼠，生物安全柜中取出小鼠脾脏。用70微米细胞筛网研磨整个脾脏。用PBS冲洗两遍后，500g离心5分钟，获取脾脏细胞，细胞计数仪计数。使用Trizol RNA提取试剂盒抽提总RNA。以所述RNA为模板，使用SuperScript的IV First-Strand Synthesis System（第一链合成系统）试剂盒合成第一链cDNA。

3.2 抗体基因扩增与轻重链拼接

以所述cDNA为模板，参考文献所述的抗体扩增引物（Schaefer J.V.,等人 (2010)Construction of scFv Fragments from Hybridoma or Spleen Cells by PCR Assembly[通过 PCR 组装从杂交瘤或脾细胞构建scFv片段]，Kontermann R., Dübel S. 编写《Antibody Engineering[抗体工程]》. Springer Protocols Handbooks [施普林格实验手册]），使用重链可变域上游引物和下游引物PCR扩增重链基因序列，使用轻链可变域上游引物和下游引物PCR扩增轻链基因序列。在50uL反应体系中，分别加入25uL Phusionmaster mix（预混液，NEB），上游引物2.0uL（25 pmol），下游引物2.0uL（25 pmol），1.5uLDMSO，0.5uL cDNA和19uL ddH₂O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环30次，72℃最终延伸5分钟。

图2为抗体轻、重链可变区基因的扩增片段大小结果。结果显示，其中抗体轻、重链可变区基因的扩增片段大小约为300-400bp，与理论值相符。

使用胶回收试剂盒回收扩增得到的VH基因和VL基因。将等量的VH基因和VL基因混合后为模板，利用scFv-F上游引物和scFv-R下游引物通过重叠PCR扩增scFv基因。在50uL反应体系中，分别加入25uL Phusion master mix（预混液，NEB），上游引物2.5uL（25 pmol），下游引物2.5uL（25 pmol），1.5uL DMSO，0.5uL cDNA和18uL ddH₂O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性20秒，58℃退火20秒，72℃延伸45秒，循环30次，72℃最终延伸5分钟。使用胶回收试剂盒回收扩增得到的scFv基因片段。

图3为抗体scFv基因扩增到的scFv片段大小结果，其中抗体scFv片段大小约为750bp，与理论值相符。

3.3 构建免疫文库

分别使用SfiI DNA内切酶消化scFv基因片段和pcomb3XTT载体（美国Scripps研究所）。在50uL反应体系中，分别加入SfiI 2uL，10x缓冲液5uL，DNA 3ug，加ddH₂O至50uL。充分混匀后，50℃孵育3小时。

使用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的scFv基因片段和pcomb3XTT载体。使用T4连接酶环化酶切后的scFv基因片段和酶切后的pcomb3XTT载体。在50uL反应体系中，分别加入T4连接酶1uL，10x缓冲液5uL，scFv基因100ng，pComb3XTT载体500ng，加ddH₂O至50uL。充分混匀后，4℃孵育16小时。取少量产物通过琼脂糖凝胶电泳验证连接效率。

将10uL连接产物加入TG1电转化感受态中，然后电转仪进行电击转化。电转后100mL菌液取100uL 10倍梯度稀释再取稀释后10uL流线，计算库容=平板克隆数x电转后体积x稀释倍数/流线体积，剩余的电转化后的细菌加入含100ug/mL氨苄青霉素和2%葡萄糖的2xYT培养基，置于加热培养箱培养。培养结束后在4℃以4000g离心10分钟，在沉淀菌中补充适量甘油储存于-80℃作为抗体菌种库。

图4为稀释后的克隆数量结果。结果所示稀释到10⁴时（标记“4”的列）有3个克隆，计算到库容约为3×10⁸。

4. 鼠源免疫抗体噬菌体文库的筛选与鉴定

4.1生物淘选

以4-1BB-His融合蛋白为目标蛋白对上述鼠源免疫抗体文库进行生物淘选获得与4-1BB结合的抗体。淘选过程如下：（1）接种TG1菌株，向摇菌管中加入3mL LB培养基，接种TG1，37℃/250rpm培养过夜。（2）用4-1BB-His抗原包被1支免疫管，体积1mL，浓度100nM。另一只免疫管加1mL，标记为NC。（3）取免疫管，然后加入4mL Casein（牛酪蛋白），盖上塞子，置于旋转混合仪上，速度设定为18rpm，时间1小时，室温旋转孵育。（4）封闭phage library（噬菌体文库），取2只新的1.5mL EP管，每只加入500uL Casein和500uL 4-1BB phagelibrary，置于旋转混合仪上，速度设定为18rpm，时间1小时，室温旋转孵育。（5）接种TG1，向125mL三角瓶中加入50mL 2YT/G培养基，接种500uL过夜培养的TG1，37℃/250rpm培养至OD600≈0.6, 4℃保存备用。（6）phage与抗原结合，小心吸取经过封闭的phage分别转移至第3步经过清洗的免疫管中，然后在垂直混匀仪上室温孵育1小时。（7）洗脱无关phage：将第6步免疫管液体倒入84消毒液中。加入4ml 无菌PBST，震荡30秒。重复以上清洗步骤共10次。（8）配制Elution buffer（洗脱缓冲液），向EP管中加入1mL水，再加入14uL TEA，混合均匀。（9）洗脱，向免疫管中各加入1mL Elution buffer，置于微孔板振荡器上，60rpm震荡10分钟。此时向4支EP管中加入1mL 1M Tris-HCl（pH6.4），将两支标记为4-1BB output，两支标记为NC output。向每只EP管中加入对应的洗脱液500uL，立即颠倒混匀。（10）侵染TG1，用电动移液器转移17mL TG1到2只50mL离心管中。将3mL洗脱液加入到对应的TG1中，37℃静置孵育30min后涂板，重复淘选三次。

4.2 初筛克隆鉴定

将第三轮生物淘选后获得的抗体文库进行稀释涂布于含有氨苄青霉素的平板上获得单克隆，挑选单克隆在深孔板中过夜培养。次日将深孔板进行反复6次冻融，2000g 离心20min上清，用于后续ELISA反应。

检测结合活性的ELISA反应：利用50ng 4-1BB-His过夜包被，PBS清洗三遍，加入含1% BSA的封闭液，200uL/孔，37℃封闭1小时。PBST清洗三遍后加入100uL破菌上清37℃孵育1小时，PBST清洗三遍后加入100uL 1:5000稀释的HRP偶联的山羊抗鼠IgG（Fab特异性的）（Thermo）。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。挑选OD450大于1的单克隆进行检测。获取抗体轻链可变域和重链可变域序列命名为GT4B10。

4.3 表达GT4B10克隆hIgG1形式抗体

将GT4B10的重链可变区序列克隆至pFUSEss-CHIg-hG1 (重链，InvivoGenCatNo.pfusess-hchg1)中。将GT4B10轻链可变区序列克隆至pFUSE2ss-CLIg-hK (轻链，InvivoGen Cat No.pfuse2ss-hclk)中。以此双质粒1:1比例共转染293F细胞5天后，收集培养上清，用AKTA explorer 100（GE）纯化抗体。GT4B10抗体经非还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约150k道尔顿。

图5为抗体纯化后的纯度分析结果。所示抗体纯化后SDS-PAGE结果分析纯度约96.7%。

GT4B10抗体的序列信息如下，经查询，本发明的抗体具有独特的可变区序列：

重链CDR1(GYAFTNFW) SEQ ID NO.1

重链CDR2(IYPGNGNS) SEQ ID NO.2

重链CDR3(ARHSGNYRGAMDY) SEQ ID NO.3

轻链CDR1(QDVSTA) SEQ ID NO.4

轻链CDR2(WAS) SEQ ID NO.5（色氨酸-丙氨酸-丝氨酸，长度小于4，在序列表中被ST.26新标准跳过）

轻链CDR3(QQHYSTPYT) SEQ ID NO.6

重链可变区：

QVQMKQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNFWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGNGNSYYNDNFKGKVTLTADKSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARHSGNYRGAMDYWGQGTSLTVSS(SEQ ID NO.7)

其中，

框架区HFR1（QVQMKQSGAELVRPGTSVKISCKAS）SEQ ID NO.8

框架区HFR2（LGWVKQRPGHGLEWIGD）SEQ ID NO.9

框架区HFR3（YYNDNFKGKVTLTADKSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYFC）SEQ ID NO.10

框架区HFR4（WGQGTSLTVSS）SEQ ID NO.11

轻链可变区：

MADVVLTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO.12)

其中，

框架区LFR1（MADVVLTQSHKFMSTSVGDRVSITCKAS）SEQ ID NO.13

框架区LFR2（VAWYQQKPGQSPKLLIY）SEQ ID NO.14

框架区LFR3（TRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYC）SEQ ID NO.15

框架区LFR4（FGGGTKLEIKR）SEQ ID NO.16

作为同批次对照抗体GT1C4的序列信息如下：

重链可变区：

DVKLVESGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGSGNAYYNEKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARHSDKYRGAMDYWGQGTSLTVSA(SEQ ID NO.17)

轻链可变区：

MADIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO.18)。

实施例2 抗4-1BB抗体的体外评价

1.huIgG1型4-1BB抗体体外结合试验

生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry，BLI）可对生物分子相互作用进行检测分析，可用于测量抗原与抗体相互作用的结合常数和解离常数，测定抗体亲和力。配置100nM的生物素化的4-1BB-His将其固化在链霉亲和素SA探针上。

本发明的GT4B10抗体不同稀释浓度梯度(300nM-25nM)与抗原蛋白结合和解离曲线，计算GT4B10的4-1BB抗体的亲和力KD值在9.16×10^-10（结合速率常数kon(1/Ms)=1.04E+05，解离速率常数koff(1/s)=9.52E-05，解离常数KD(M)= 9.16E-010）。

对照抗体GT1C4的4-1BB抗体的亲和力KD值在1.94×10^-9（结合速率常数kon(1/Ms)=2.1E+05，解离速率常数koff(1/s)=4.06E-04，解离常数KD(M)= 1.94E-09）。

图6-7分别为本发明4-1BB抗体GT4B10（图6）和GT1C4（图7）的亲和力结果。

2.体外验证GT4B10抗体的激动活性

将人的全血使用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞PBMC。取SepMate-50 管并标记, 吸取 15ml 人外周血淋巴细胞分离液，沿 SepMate-50 管中间隔离装置中间孔缓慢加入，吸取稀释后15mL的全血缓慢加入 SepMate-50 管中，使全血-外周血淋巴细胞分离液形成两层。将 SepMate-50 管 1400g 离心 20分钟，全血将分层由底部到顶部分别为：红细胞层、粒细胞层、分离液层、 PBMC层，包含血小板的血浆层。在生物安全柜中吸弃上层血浆层，将PBMC层倾倒至另一新的离心管中，加入 5ml PBS 重悬细胞，300g离心 8分钟，重悬细胞，取 20μL 细胞悬液，加入 180μL的 DMEM 培养基/RPMI1640 培养基中计数备用，将分好的PBMC用抗CD3抗体(50ng/mL )活化培养三天。将4-1BB抗体用PBS稀释至20ug/mL、10ug/mL、 1ug/mL，50uL/孔四摄氏度过夜包被。对照组加入等量的50uL/孔的huIgG1同型对照（与4-1BB抗体具有相同种属来源、相同亚型、相同剂量免疫球蛋白IgG，与4-1BB靶点不会有反应）。PBMC活化后与不同浓度的4-1BB抗体，培养过夜经ELISA的方法测定IFN-γ分泌量，通过IFN-γ分泌的测定间接反应抗体对PBMC细胞的激活活性。

图8为GT4B10对不同的供者的PBMC刺激效果中IFN-γ分泌量结果。结果显示，GT4B10对不同的供者的PBMC刺激效果中IFN-γ分泌量较同型对照以及较同批次对照GT1C4抗体均有提高，显示出较强的激动活性。

实施例3 4-1BB抗体在肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）细胞培养中对CD8阳性T细胞的增殖作用

从液氮取出冻存的TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）于37℃水浴中复苏， 500g离心5分钟。离心后弃上清，补充培养基至适当体积以便计数。根据计数结果补充培养基调节细胞密度至1E6个/mL，1mL/24孔分别加入CD3抗体30ng/mL，IL-2 3000IU/mL，加入不同浓度本发明的4-1BB抗体GT4B10及同型对照抗体，培养48小时后添加PBMC 饲养细胞，调整饲养细胞细胞密度为1E7/mL，培养两周后细胞计数及流式检测。

图9为加入4-1BB抗体后细胞增殖数目。实验结果显示，加入4-1BB抗体GT4B10后细胞增殖数目高于对照组，流式检测细胞中CD8阳性T细胞比例增加。进一步地，4-1BB抗体浓度10ug/ml组明显优于1ug/ml组。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种肿瘤坏死因子超家族受体9的特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述特异性抗原结合蛋白含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包括分别如SEQ ID NO.1-3所示的互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链可变区包括分别如SEQ ID NO.4-6所示的互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3。

2.根据权利要求1所述的特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述重链可变区含有框架区HFR1、HFR2、HFR3、HFR4，其中，框架区HFR1、HFR2、HFR3、HFR4分别包括SEQ ID NO.8-11所示的序列或与其同源性不低于90%的序列。

3.根据权利要求1所述的特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述轻链可变区含有框架区LFR1、LFR2、LFR3、LFR4，其中，框架区LFR1、LFR2、LFR3、LFR4分别包括SEQ ID NO.13-16所示的序列或与其同源性不低于90%的序列。

4.编码权利要求1-3任一项所述的特异性抗原结合蛋白的核酸分子。

5.含有权利要求4所述的核酸分子的表达载体。

6.含有权利要求1-3任一项所述的特异性抗原结合蛋白的宿主细胞。

7.含有权利要求1-3任一项所述的特异性抗原结合蛋白的单价抗体、二价抗体、多价抗体或重组蛋白。

8.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述特异性抗原结合蛋白、权利要求4所述核酸分子、权利要求5所述表达载体、权利要求6所述宿主细胞或权利要求7所述单价抗体、二价抗体、多价抗体或重组蛋白。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为免疫治疗药物。

10.权利要求1-3任一项所述特异性抗原结合蛋白、权利要求4所述核酸分子、权利要求5所述表达载体、权利要求6所述宿主细胞或权利要求7所述单价抗体、二价抗体、多价抗体或重组蛋白在制备检测肿瘤坏死因子超家族受体9的试剂或在制备促进T细胞增殖的试剂中的应用。