CN116490206A - 靶向4-1bb的单域抗体、其融合蛋白、药物组合物及用途 - Google Patents

靶向4-1bb的单域抗体、其融合蛋白、药物组合物及用途 Download PDF

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Abstract

涉及一种靶向4‑1BB的单域抗体、其融合蛋白、药物组合物及用途。具体地，涉及的单域抗体包含一个重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1‑CDR3的氨基酸序列分别如表B中的任一项所示。单域抗体可以结合人的4‑1BB，同时交叉结合食蟹猴的4‑1BB；借助外部交联的情况下激活T细胞，兼备优异的抗肿瘤活性和安全性。

Description

靶向4-1BB的单域抗体、其融合蛋白、药物组合物及用途 技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种靶向4-1BB的单域抗体、其融合蛋白、药物组合物及用途。
背景技术
肿瘤坏死因子受体超家族(4-1BB)又名CD137，或TNFRF9，是TNF受体家族的成员之一。4-1BB是一个阅读框含有255个氨基酸(NCBI：NP_001552)的I型跨膜蛋白，由含有17个氨基酸的N端信号肽，169个氨基酸的胞外区，27个氨基酸的跨膜区和42个氨基酸的C端胞内区组成。4-1BB分子主要表达在活化的T细胞、NK细胞、调节性T细胞、树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性细胞中，肿瘤血管的内皮细胞也有报道表达4-1BB。
在T细胞的活化过程中，4-1BB分子能为其提供共刺激信号。当T细胞受体接触到抗原后，会增加4-1BB的表达量，4-1BB与配体结合后会引起NFκB信号通路的激活，从而导致T细胞的活化增殖，并且4-1BB还能抑制活化细胞凋亡。动物模型和体外实验证实，抗4-1BB单抗具有抗肿瘤活性。它能够选择性地引起CD8+T细胞的增殖、上调促炎性细胞因子IFNγ的表达，并且能够增强抗原特异性效应型T细胞的杀伤作用，从而促进肿瘤的清除。抗4-1BB单抗也能引起NK细胞的扩增，并能通过其增加CD8+T细胞的细胞毒活性。抗4-1BB抗体还能够引起肿瘤细胞的血管的内皮细胞上调粘附分子的表达，促进活化的T淋巴细胞浸润肿瘤组织。除此之外，在动物模型中，抗4-1BB激活性抗体还能减轻自身免疫性疾病，如自身免疫性脑脊髓炎，狼疮样综合征和胶原诱导型关节炎。
因此，在肿瘤治疗和一些自身免疫性疾病的治疗中，4-1BB是一个重要潜在的靶点，具体的，在临床前结直肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等动物模型种，靶向4-1BB的激动剂分子作为单药或者与anti-PD-1、anti-PD-L1、anti-CTLA-4、anti-HER-2等抗体的联用显示出显著的抗肿瘤活性(Etxeberria I,et al.ESMO Open 2020；4:e000733.)。目前有两种4-1BB抗体正在进行临床实验：Urelumab(BMS-663513，Bristol-Myers Squibb开发)和Utomilumab(PF-05082566，Pfizer开发)。研究表明，Urelumab是一种强效的激活剂，具有较好的激活活性，但是也具有肝毒性和疲劳等 不良反应；而Utomilumab在安全性具有优势，但相对于Urelumab，它对受体激动活性较低。
因此，本领域迫切需要开发出一种更高效地靶向4-1BB的抗体及其相关药物。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，开发了一种抗人4-1BB的纳米抗体。具体地，本发明人利用人源的4-1BB抗原蛋白免疫羊驼(Llama)，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。其中，本发明人在所述免疫纳米抗体基因文库中筛选获得可以同时结合人和食蟹猴4-1BB，同时需要借助外部交联发挥激活作用的两株抗4-1BB纳米抗体。再将两株纳米抗体序列进行优化，将基因工程化的突变体表达纯化，从抗体亲和力、与食蟹猴4-1BB交叉结合，激活T细胞的活性等方面进行进一步的筛选，从而获得了一类能在体外高效表达的、且特异性高的纳米抗体株。实验结果表明，本发明的抗4-1BB纳米抗体和融合蛋白具有分子量小，和食蟹猴交叉，不阻断4-1BB配体与4-1BB的天然结合，T细胞激活作用强，安全性好的优点。由此提供了下述发明。
本发明的一个方面涉及一种抗4-1BB单域抗体，其包含一个重链可变区，所述重链可变区包含CDR1-CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NOs:41-80，CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NOs:81-120，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NOs:121-160。
本发明的一个方面涉及一种抗4-1BB单域抗体，其包含一个重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-CDR3的氨基酸序列分别如下面的1-40项中的任一项所示：
本发明中，抗4-1BB单域抗体的CDR均由IMGT编号系统定义，请参见Ehrenmann F,Kaas Q,Lefranc M P.IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF[J].Nucleic acids research,2009；38(suppl_1):D301-D307。
本发明中，所述4-1BB，如果没有特别说明，是指人4-1BB。在本发明的一些实施方式中，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:168所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗4-1BB单域抗体，其4个框架区中的任意的一个、两个、三个或全部4个进行人源化改造；
优选地，对第二个框架区进行人源化改造；可选地，还对第一个、第三个或第四个框架区进行改造；
优选地，所述抗4-1BB单域抗体与人的同源性大于或等于75％、大于或等于76％、大于或等于77％、大于或等于78％、大于或等于79％、或者大于或等于80％；
优选地，所述抗4-1BB单域抗体的框架区1的氨基酸序列如SEQ ID NO:170所示，框架区2的氨基酸序列如SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172所示，框架区3的氨基酸序列如SEQ ID NO:173所示，并且框架区4的氨基酸序列如SEQ ID NO:174所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗4-1BB单域抗体，其与4-1BB抗原的K D为小于E-07、小于5E-08、小于4E-08、小于3E-08、或者小于2E-08；优选地，所述K D通过ForteBio测得。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗4-1BB单域抗体，其与4-1BB抗原的结合位点不同于Urelumbab和Utomilumab。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗4-1BB单域抗体，其特异结合人4-1BB，同时交叉结合食蟹猴4-1BB。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗4-1BB单域抗体，其不阻断天然状态(例如在哺乳动物体内特别是在人体内)下4-1BB配体与4-1BB的结合。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗4-1BB单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:1-40中的任一序列所示。
本发明的另一方面涉及一种融合蛋白，其包含本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体，以及人IgG的Fc段或人IgG的恒定区。
在本发明的一些实施方式中，所述的融合蛋白，其由本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体，以及人IgG的Fc段或人IgG的恒定区组成。
在本发明的一些实施方式中，所述的融合蛋白，其由本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体、连接片段(linker)、以及人IgG的Fc段或人IgG的恒定区组成。
在本发明的一些实施方式中，所述的融合蛋白，其中，按照EU编号系统，所述人IgG的Fc段或人IgG的重链恒定区包含L234A突变和L235A突变；可选地，所述IgG的Fc段还包含G237A突变。
在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白为抗4-1BB的重链抗体。重链抗体是指没有轻链的抗体。是目前对VHH-Fc类抗体的一个通用的名称。
在本发明的一些实施方式中，所述的融合蛋白，其中，
所述人IgG的Fc段为人IgG1的Fc段；
所述人IgG的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区。
在本发明的一些实施方式中，所述的融合蛋白，其中，
所述人IgG的Fc段为包含L234A突变和L235A突变的人IgG1的Fc段；可选地，所述人IgG1的Fc段还包含G237A突变；
优选地，人IgG1的Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的融合蛋白，其中，
所述人IgG的Fc段或人IgG的恒定区与所述抗4-1BB单域抗体的C末端直接连接或通过连接片段连接。
在本发明的一些实施方式中，所述的融合蛋白，其中，
所述人IgG1的Fc段或人IgG1的恒定区与所述抗4-1BB单域抗体的C末端直接连接或通过连接片段连接。
本发明的再一方面涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体或者本发明中任一项所述的融合蛋白。
本发明还涉及一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。
本发明还涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或者本发明的载体。
本发明的再一方面涉及一种制备本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体或者本发明中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述抗4-1BB单域抗体或融合蛋白的步骤。
本发明的再一方面涉及一种偶联物，其包括抗体部分以及偶联部分，其中，所述抗体部分为本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体或者本发明中任一项所述的融合蛋白，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体或者本发明中任一项所述的融合蛋白，或者包含本发明的偶联物；
优选地，所述试剂盒还包含第二抗体，其能够特异性结合所述单域抗体或融合蛋白；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体或者本发明中任一项所述的融合蛋白在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测4-1BB在样品中的存在或其水平。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体或者本发明中任一项所述的融合蛋白或者包含本发明的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的辅料。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体或者本发明中任一项所述的融合蛋白或者本发明的偶联物在制备预防和/或治疗恶性肿瘤或自身免疫性疾病的药物中的用途；
优选地，所述恶性肿瘤选自直肠癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌、卵巢癌、食道癌和头颈癌；
优选地，所述自身免疫性疾病选自自身免疫性脑脊髓炎、狼疮样综合征和胶原诱导型关节炎。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防恶性肿瘤自身免疫性疾病的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体或者本发明中 任一项所述的融合蛋白或者本发明的偶联物的步骤；
优选地，所述恶性肿瘤选自直肠癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌、卵巢癌、食道癌和头颈癌；
优选地，所述自身免疫性疾病选自自身免疫性脑脊髓炎、狼疮样综合征和胶原诱导型关节炎。
在本发明的一些实施方式中，所述的方法，其中，给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的单域抗体或融合蛋白的步骤为在手术治疗之前或之后，和/或在放射治疗之前或之后。
在本发明的一些实施方式中，所述的方法，其中，
本发明的单域抗体或融合蛋白的单次给药剂量为每千克体重0.1-100mg，优选4.8-24mg或1-10mg；或者，本发明的单域抗体或融合蛋白的单次给药剂量为每位受试者10-1000mg，优选50-500mg、100-400mg、150-300mg、150-250mg或200mg；
优选地，每3天、4天、5天、6天、10天、1周、2周或3周给药一次；
优选地，给药方式为静脉滴注或静脉注射。
根据本发明中任一项所述的抗4-1BB单域抗体或者本发明中任一项所述的融合蛋白或者本发明的偶联物，其用于治疗和/或预防恶性肿瘤或自身免疫性疾病；
优选地，所述恶性肿瘤选自直肠癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌、卵巢癌、食道癌和头颈癌；
优选地，所述自身免疫性疾病选自自身免疫性脑脊髓炎、狼疮样综合征和胶原诱导型关节炎。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经 典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Bethesda M.d.,Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,(1987and 1991))，或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987；196:901-917；Chothia等人Nature1989；342:878-883，或者IMGT编号系统定义，见Ehrenmann F,Kaas Q,Lefranc M P.IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF[J].Nucleic acids research,2009；38(suppl_1):D301-D307的定义。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得( G,Milstein C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].nature,1975；256(5517):495)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature 1986；321:522 525；Reichmann et al.,Nature,1988；332:323329；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.1992；2:593-596；和Clark,Immunol.Today 2000；21:397 402。在一些情况下，抗体的 抗原结合片段是双抗体(Diabodies)，其中V H和V L结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993；90:6444-6448和Poljak R.J.et al.,Structure 1994；2:1121-1123)。
如本文中所述的融合蛋白是一种通过DNA重组得到的两个基因共表达的蛋白产物。现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法(如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章)。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，GS细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受 试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19 th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途的有效量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
本发明还涉及如下1至11项中的任意一项：
1.一种抗4-1BB纳米抗体，其特征在于，所述抗4-1BB纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NOs:1-40中任一所示的氨基酸序列；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代1-8个(较佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基，并能够保留4-1BB纳米抗体的4-1BB结合亲和力的衍生序列。
2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端具有如式I所示的结构：
Z1-L-Z2 (式I)
式中，
Z1为一个或多个(较佳地1-2个，更佳地1个)如第1项所述的抗4-1BB纳米抗体的VHH链；
Z2为免疫球蛋白的Fc段；
L为任选的接头序列。
3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如第1项所述的抗4-1BB纳米抗体或如第2项所述的融合蛋白。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如第3项所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如第4项所述的表达载体，或其基因组中整合有如第3项所述的多核苷酸。
6.一种产生抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在适合产生抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白的条件下，培养如第5项所述的宿主细胞，从而获得含所述抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白的培养物；和
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白。
7.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：
(a)如第1项所述的抗4-1BB纳米抗体，或如第2项所述的融合蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
8.如第1项所述的抗4-1BB纳米抗体或如第2项所述的融合蛋白的用途，用于制备(a)用于检测4-1BB分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(i)如第1项所述的抗4-1BB纳米抗体、如第2项所述的融合蛋白，或如第7项所述的免疫偶联物；和
(ii)药学上可接受的载体。
10.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如第1项所述的抗4-1BB纳米抗体，或如第2项所述的融合蛋白的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
11.一种蛋白复合物，其特征在于，所述的复合物由4-1BB蛋白和抗4-1BB抗体或其抗原结合片段通过氢键和/或疏水相互作用而形成；
其中，所述的氢键作用位点包括4个以上(较佳地5个以上，更佳地6个以上，最佳地为7个)位于4-1BB蛋白中选自下组的位点：第118位Asp、第123位Leu、第130位Arg、第132位Val、第134位Cys、第135位Gly，和第137位Ser；
并且，所述的疏水性相互作用界面的构成位点包括2个以上(较佳地3个以上，更佳地4个以上)位于4-1BB蛋白中选自下组的位点：第123位Leu、第124位Val、第133位Val，和第136位Pro；
其中，所述的4-1BB蛋白的氨基酸编号是基于SEQ ID NO:168的编号。
本发明还涉及如下的第一方面至第十五方面中的任一方面：
在本发明的第一方面，提供了一种抗4-1BB纳米抗体，所述抗4-1BB纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:1-40中任一所示的氨基酸序列；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代1-8个(较佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基，并能够保留4-1BB纳米抗体的4-1BB结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述抗4-1BB纳米抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、35、37、38、39或40中任一所示。
在本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端具有如式I所示的结构：
Z1-L-Z2 (式I)
式中，
Z1为一个或多个(较佳地1-2个，更佳地1个)如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体的VHH链；
Z2为免疫球蛋白的Fc段；
L为任选的接头序列。
在另一优选例中，所述的融合蛋白为二聚体，所述的二聚体由Z2中的Fc段之间的二硫键所形成。
在另一优选例中，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；优选为IgG1、IgG2或IgG4。
在另一优选例中，所述免疫球蛋白是IgG1，或其突变型。
在另一优选例中，所述L具有选自下组的氨基酸序列：GGGGS、(GGGGS) 2、(GGGGS) 3、(GGGGS) 4、(GGGGS) 5，或其组合。
在另一优选例中，所述Z2的氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示。
在另一优选例中，所述Z2的氨基酸序列与如SEQ ID NO:167所示的氨基酸序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个，最佳地为1-3个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加。
在另一优选例中，所述的基本相同是氨基酸序列与相应氨基酸序列的序列同一性至少为70％、至少为75％、至少为80％、至少为85％、至少为86％、至少为87％、 至少为88％、至少为89％、至少为90％、至少为91％、至少为92％、至少为93％、至少为94％、至少为95％、至少为96％、至少为97％、至少为98％，或者至少为99％。
在另一优选例中，所述融合蛋白的式I中，Z1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-40中任一所示，并且L为无，并且Z2的氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代1-8个(较佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基，并能够保留4-1BB结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述融合蛋白的式I中，Z1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、35、37、38、39或40中任一所示，并且L为无，并且Z2的氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代1-8个(较佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基，并能够保留4-1BB结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列中，从N端到C端依次为：如SEQ ID NO:1-40中任一所示的序列和如SEQ ID NO:167所示的序列。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列中，从N端到C端依次为：如SEQ ID NO:3、35、37、38、39或40中任一所示的序列，和如SEQ ID NO:167所示的序列。
在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体或如本发明第二方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸包括DNA或RNA。
在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种产生抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白的方法，包括步骤：
(a)在适合产生抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白的培养物；和
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白。
在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体，或如本发明第二方面所述的融合蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体，或如本发明第二方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体，或如本发明第二方面所述的融合蛋白。
在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体或如本发明第二方面所述的融合蛋白的用途，用于制备(a)用于检测4-1BB分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，包括：
(i)如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体、如本发明第二方面所述的融合蛋白，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物；和
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、黑色素瘤、头颈癌、鼻咽癌、甲状腺肿瘤、舌癌或其组合。
在本发明的第十方面，提供了如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体或如本发明第二方面所述的融合蛋白的一种或多种的用途：
(i)用于检测人4-1BB分子；
(ii)用于流式检测；
(iii)用于细胞免疫荧光检测；
(iv)用于治疗肿瘤；和
(v)用于肿瘤诊断。
在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。
在本发明的第十一方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体，或如本发明第二方面所述的融合蛋白的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括：6His标签、HA标签、Flag标签、Fc标签，或其组合。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于4-1BB蛋白。
在本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体、如本发明第二方面所述的融合蛋白，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中4-1BB蛋白；
其中，所述药剂用于治疗或预防各种血液肿瘤与实体肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括：胃癌、淋巴瘤、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、肾上腺肿瘤、黑色素瘤、头颈癌、鼻咽癌、甲状腺肿瘤、舌癌或其组合。
在本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中4-1BB蛋白的方法，包括步骤：
(1)将样品与如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体或如本发明第二方面所述的融合蛋白接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在4-1BB蛋白。
在另一优选例中，所述检测包括定性检测和定量检测。
在本发明的第十四方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体、如本发明第二方面所述的融合蛋白或如本发明第七方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物。
在另一优选例中，所述哺乳动物为人。
在本发明的第十五方面，提供了一种蛋白复合物，所述的复合物由4-1BB蛋白和抗4-1BB抗体或其抗原结合片段通过相互作用而形成。
在另一优选例中，所述的相互作用包括氢键作用和疏水性作用。
在另一优选例中，所述抗4-1BB抗体是抗4-1BB纳米抗体。
在另一优选例中，所述抗4-1BB抗体是如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体。
在另一优选例中，所述的复合物由4-1BB蛋白和抗4-1BB抗体或其抗原结合片段通过氢键和/或疏水相互作用而形成；
其中，所述的氢键作用位点包括4个以上(较佳地5个以上，更佳地6个以上，最佳地7个)位于4-1BB蛋白中选自下组的位点：第118位Asp、第123位Leu、第130位Arg、第132位Val、第134位Cys、第135位Gly，和第137位Ser；
并且，所述的疏水性相互作用界面的构成位点包括2个以上(较佳地3个以上，更佳地4个以上)位于4-1BB蛋白中选自下组的位点：第123位Leu、第124位Val、第133位Val，和第136位Pro；
其中，所述的4-1BB蛋白的氨基酸编号是基于SEQ ID NO:168的编号。
在另一优选例中，所述的疏水性相互作用界面还包括4个以上(较佳地5个以上，更佳地6个以上，最佳地7个以上或8个以上)位于抗4-1BB抗体或其抗原结合片段中选自下组的位点：第32位Val、第33位Ala、第37位Tyr、第47位Leu、第52位Ile、第97位Tyr、第102位Tyr，和第115位Trp；
其中，所述的抗4-1BB抗体或其抗原结合片段的氨基酸编号是基于SEQ ID NO:169或39的编号。
在另一优选例中，所述复合物中的4-1BB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:168 所示。
在另一优选例中，所述复合物中的抗4-1BB纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:169或39所示。
在另一优选例中，所述的氢键作用位于4-1BB蛋白的第118位Asp、第123位Leu、第130位Arg、第132位Val、第134位Cys、第135位Gly，和/或第137位Ser；
其中，所述的氨基酸编号是基于SEQ ID NO:168的编号。
在另一优选例中，所述的疏水性作用的作用界面位于4-1BB蛋白的第123位Leu、第124位Val、第133位Val和/或第136位Pro，与抗4-1BB纳米抗体的VHH链的第32位Val、第33位Ala、第37位Tyr、第47位Leu、第52位Ile、第97位Tyr、第102位Tyr和/或第115位Trp；
其中，所述的4-1BB蛋白的氨基酸编号是基于SEQ ID NO:168的编号，并且所述的抗4-1BB纳米抗体的VHH链的氨基酸编号是基于SEQ ID NO:169或39的编号。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
如本文所用，术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，术语“给予”、“施用”可互换使用，是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
本发明纳米抗体
如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的抗4-1BB纳米抗体”、“本发明4-1BB纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于4-1BB(包括人4-1BB)的纳米抗体。特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-40中任一所示的纳米抗体，更加优选地是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、35、37、38、39或40中任一所示的纳米抗体。
如本文所用，术语“单域抗体(VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具 有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗4-1BB蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“V H”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determining region,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合4-1BB蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。纳米抗体也有4个框架区(framwork)，其中第1、3、4个框架区(框架区1、框架区3和框架区4)和人抗体同源性较高，在人源化过程中改造的必要性较小；优选改造第2个框架区即框架区2(framework 2)。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有4-1BB蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还 包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC、0.1％SDS、60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺、0.1％小牛血清/0.1％Ficoll、42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl 2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl 2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、 MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；9.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明融合蛋白
如本文所述，“本发明融合蛋白”是指既具有本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体，又具有免疫球蛋白的Fc段的融合蛋白。
在本发明中，提供了一种融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白从N端到C端具有如式I所示的结构：
Z1-L-Z2 (式I)
式中，
Z1为一个或多个如本发明第一方面所述的抗4-1BB纳米抗体的VHH链；
Z2为免疫球蛋白的Fc段；
L为任选的接头序列。
优选地，所述的免疫球蛋白可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等。(优选IgG1、IgG2或IgG4)，也可以是IgG1的不同突变型。
在一个实施方式中，所述的融合蛋白为二聚体，所述的二聚体由Z2中的Fc段之间的二硫键所形成。
在一个实施方式中，所述L具有选自下组的氨基酸序列：GGGGS、(GGGGS) 2、(GGGGS) 3、(GGGGS) 4、(GGGGS) 5，或其组合。
在优选的实施方式中，所述Z2的氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示。
在另一个实施方式中，所述Z2的氨基酸序列与如SEQ ID NO:167所示的氨基酸序列相同或基本相同。
优选地，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个，最佳地为1-3个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加。
优选地，所述的基本相同是氨基酸序列与相应氨基酸序列的序列同一性至少为 70％、至少为75％、至少为80％、至少为85％、至少为86％、至少为87％、至少为88％、至少为89％、至少为90％、至少为91％、至少为92％、至少为93％、至少为94％、至少为95％、至少为96％、至少为97％、至少为98％，或者至少为99％。
在本发明优选的实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列中，从N端到C端依次为：如SEQ ID NO:1-40中任一所示的序列和如SEQ ID NO:167所示的序列；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代1-8个(较佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基，并能够保留4-1BB结合亲和力的衍生序列。
本发明的融合蛋白具有双靶标结合亲和力高、特异性强的优势，从而进一步增强抗肿瘤免疫功能。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合4-1BB蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体 重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
标记的纳米抗体
在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗4-1BB的纳米抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。
本发明的抗4-1BB纳米抗体具有很好的特异性，很高的效价。
检测方法
本发明还涉及检测4-1BB蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中4-1BB蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或融合蛋白或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测4-1BB水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别4-1BB蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与4-1BB相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对4-1BB的临床诊断和靶向治疗。
发明的有益效果
本发明取得了如下技术效果中的任意一项或任意多项：
1)本发明的纳米抗体分子量小。
2)本发明的纳米抗体能够高度特异结合人4-1BB蛋白，同时交叉结合食蟹猴蛋白。
3)本发明纳米抗体需要借助外部交联发挥激活作用，具有优异的活性和安全性。
4)本发明的纳米抗体不阻断天然状态下4-1BB配体与4-1BB的结合。
5)作为抗4-1BB的激动型分子，Urelumab因为激活活性太强导致临床肝毒性。本发明的抗体一个重要优势是与Urelumbab和Utomilumab的结合4-1BB的位点有差异，且激活活性处于Urelumab和Utomilumab之间。
附图说明
图1A：本发明第一批的4-1BB抗体结合稳定表达人4-1BB的CHO细胞的检测结果。
图1B：本发明第二批的4-1BB抗体结合稳定表达人4-1BB的CHO细胞的检测结果。
图2A：本发明第一批的4-1BB抗体结合食蟹猴4-1BB蛋白的检测结果。
图2B：本发明第二批的4-1BB抗体结合食蟹猴4-1BB蛋白的检测结果。
图3A：本发明第一批的4-1BB抗体激活原代T细胞产生IFN-γ的检测结果。
图3B：本发明第二批4-1BB抗体激活原代T细胞产生IFN-γ的检测结果。
图4A：本发明L-Yr-13&14-16分子经基因工程改造的子代分子结合稳定表达人4-1BB的CHO细胞的检测结果。
图4B：本发明A-Na-19分子经基因工程改造的子代分子结合稳定表达人4-1BB的CHO细胞的检测结果。
图5A：本发明L-Yr-13&14-16分子经基因工程改造的子代分子结合稳定表达食蟹猴4-1BB的CHO细胞的检测结果。
图5B：本发明A-Na-19分子经基因工程改造的子代分子结合稳定表达食蟹猴4-1BB的CHO细胞的检测结果。
图6A：本发明L-Yr-13&14-16分子经基因工程改造的子代分子激活原代T细胞产生IFN-γ的检测结果。
图6B：本发明A-Na-19分子经基因工程改造的子代分子激活原代T细胞产生IFN-γ的检测结果。
图7A：本发明L-Yr-13&14-16分子经基因工程改造的子代分子阻断4-1BB配体与4-1BB结合的检测结果。
图7B：本发明L-Yr-13&14-16-1分子与TNFRSF成员结合的检测结果。
图8：本发明4-1BB-VHH复合物的晶体示意图。
图9：本发明4-1BB-VHH复合物晶体结构。其中，绿色为4-1BB蛋白；蓝色为抗4-1BB纳米抗体的VHH链。
图10：本发明4-1BB-VHH复合物晶体结构中的氢键相互作用界面。其中，绿色为4-1BB蛋白；蓝色为抗4-1BB纳米抗体的VHH链。
图11：本发明4-1BB-VHH复合物晶体结构中的疏水性相互作用界面。其中，绿色为4-1BB蛋白；蓝色为抗4-1BB纳米抗体的VHH链。
在本发明中，涉及到的抗4-1BB纳米抗体以及其CDR的序列编号如下面的表B所示。
表B：本发明的纳米抗体所对应的序列编号(SEQ ID NO:)
抗体名称 VHH CDR1 CDR2 CDR3
A-Na-16 1 41 81 121
A-Na-18 2 42 82 122
A-Na-19 3 43 83 123
A-Ye-02 4 44 84 124
A-Ye-03 5 45 85 125
A-Ye-04 6 46 86 126
A-Ye-05 7 47 87 127
A-Ye-10 8 48 88 128
A-Ye-13 9 49 89 129
A-Ye-14 10 50 90 130
A-Ye-15 11 51 91 131
A-Ye-18 12 52 92 132
A-Ye-19 13 53 93 133
A-Ye-21 14 54 94 134
A-Ye-22 15 55 95 135
A-Ye-23 16 56 96 136
A-Ye-25 17 57 97 137
A-Ye-27 18 58 98 138
A-Ye-30 19 59 99 139
A-Ye-33 20 60 100 140
A-Ye-20 21 61 101 141
A-Ye-35 22 62 102 142
L-Yr-13&14-01 23 63 103 143
L-Yr-13&14-02 24 64 104 144
L-Yr-13&14-03 25 65 105 145
L-Yr-13&14-05 26 66 106 146
L-Yr-13&14-06 27 67 107 147
L-Yr-13&14-07 28 68 108 148
L-Yr-13&14-08 29 69 109 149
L-Yr-13&14-09 30 70 110 150
L-Yr-13&14-10 31 71 111 151
L-Yr-13&14-11 32 72 112 152
L-Yr-13&14-12 33 73 113 153
L-Yr-13&14-13 34 74 114 154
L-Yr-13&14-16 35 75 115 155
L-Yr-13&14-17 36 76 116 156
Hu-A-NA-19-1 37 77 117 157
Hu-A-NA-19-2 38 78 118 158
HZ-L-Yr-13&14-16-1 39 79 119 159
HZ-L-Yr-13&14-16-2 40 80 120 160
其中，各纳米抗体的CDR均是由IMGT编号系统定义。
表C：本发明涉及的部分序列
备注：表C中，SEQ ID NO:41-160为CDR序列，其中部分序列可能相同，为了便于表述，采用了不同的编号。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：纳米抗体文库的构建
1.1动物免疫
将1mg人4-1BB抗原(购自AcroBiosystems)与弗氏佐剂等体积混合，免疫2只羊驼(Llama)，每周一次，共免疫4次，剌激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。4次免疫结束后，提取50ml有羊驼外周血，采用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞。采用RNA提取试剂Trizol(购自Invitrogen)提取总RNA。使用cDNA合成试剂盒(购自Invitrogen)反转录获得羊驼总cDNA。
1.2纳米抗体基因的扩增
第一轮PCR，从cDNA中扩增出IgG2、IgG3序列：
表1：第一轮PCR引物
名称 序列(5’到3’) SEQ ID NO:
上游引物 GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG 161
下游引物 GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC 162
将第一轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收750bp处的片段用于第二轮 VHH序列的扩增。第二轮PCR扩增引物如下：
表2：第二轮PCR引物
以第二轮PCR产物为模板，进行第三轮PCR，为VHH基因加上同源臂，第三轮PCR扩增引物如下：
表3：第三轮PCR引物
利用PCR纯化试剂盒(购自QIAGEN)回收目的片段。
1.3文库构建
将线性化的酵母展示载体和第三轮的PCR产物混合后电转化入酿酒酵母( 20828)中，分别构建来自2只羊驼的抗4-1BB纳米抗体文库。
实施例2：4-1BB纳米抗体的筛选
2.1人4-1BB蛋白的生物素化标记
取适量体积的双蒸水溶解人4-1BB蛋白(购自AcroBiosystems)，按照生物素标记试剂盒(购自Thermo)产品说明书，将生物素溶解后与蛋白溶液混合，于4℃孵育2小时。用脱盐柱(购自Thermo)去除多余的生物素，脱盐柱预处理及样品收集操作均参考产品说明书步骤进行。
2.2 MACS(Magnetic-Activated Cell Sorting)富集能与4-1BB特异性结合的酵母
将实施例1中构建的VHH文库接种于SD-CAA扩增培养基(1L SD-CAA扩增培 养基中含6.7g YNB、5g酪蛋白氨基酸、13.62g Na 2HPO 4·12H 2O、7.44g NaH 2PO 4和2％葡萄糖)中，30℃，225rpm培养过夜。取适量的酵母细胞，3000rpm×5min离心去除培养基，用SD-CAA诱导培养基重悬酵母细胞，诱导过夜。测定诱导后的文库浓度，取适量的酵母细胞，离心去除培养基。用50ml洗涤缓冲液(PBS+0.5％BSA+2mM EDTA)重悬酵母细胞，离心去除上清。用10ml洗涤缓冲液重悬酵母细胞。
加入生物素标记的4-1BB蛋白(终浓度100mM)，室温孵育30min，离心收集酵母细胞，并用50ml洗涤缓冲液洗涤酵母3遍。用5ml洗涤缓冲液重悬酵母细胞，并加入200μl SA磁珠(购自美天旎)，颠倒孵育10min。用洗涤缓冲液洗涤酵母和磁珠混合物3遍，将混合物加入LS柱(购自美天旎)中。将LS柱放在磁力架上，用洗涤缓冲液洗涤去除非特异性结合的酵母细胞。将柱子从磁力架上取出，加入洗涤缓冲液洗脱酵母。洗脱下来的酵母离心后转入200ml SD-CAA扩增培养基中进行扩增。
2.3流式细胞分选获得高亲和力酵母细胞
将经过MACS富集的酵母细胞接种于SD-CAA扩增培养基中，30℃，225rpm摇瓶培养过夜。用SD-CAA诱导培养基(1L SD-CAA诱导培养基中含6.7g YNB，5g酪蛋白氨基酸，13.62g Na 2HPO 4·12H 2O，7.44g NaH 2PO 4及2％半乳糖，2％棉子糖和0.1％葡萄糖)重悬酵母细胞，诱导过夜。加入1:200稀释的anti-c-Myc鼠源抗体(购自Thermo)和100nM生物素标记的4-1BB抗原，室温孵育10min。加入PBS清洗酵母3遍，加入1:500稀释的羊抗鼠IgG(H+L)Alexa Fluor Plus 488(购自Invitrogen)和链霉亲和素APC偶联荧光抗体(购自Invitrogen)，4℃避光孵育15min。加入2ml PBS重悬细胞，使用BD FACS AriaII仪器进行分选获得可与4-1BB抗原有较高结合能力的酵母。
2.4 4-1BB纳米抗体候选分子抗体基因的获取
通过MACS和FACS富集得到的能与4-1BB抗原有较高结合能力的酵母菌液，在SD-CAA扩增培养基中30℃，225rpm培养过夜，按照酵母质粒抽提试剂盒(购自天根)操作抽提酵母质粒。质粒通过电转化入Top10感受态细胞(购自天根)，涂布氨苄抗性平板，于37℃培养过夜。挑取单克隆测序获得VHH基因序列。
实施例3：重链抗体融合蛋白的构建及表达纯化
3.1抗体基因构建入pCDNA3.1表达载体
将实施例2获得的VHH基因序列和人IgG1(LALA突变)Fc段相连，利用同源重 组酶(购自Vazyme)和EcoR I/Not I双酶切线性化的pCDNA3.1载体中，流程按照商品说明书。同源重组产物化转入Top10感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃培养过夜，挑取单克隆测序。
3.2细胞转染
采用ExpiCHO TM表达系统试剂盒(购自Thermo)，将质粒转入Expi-CHO细胞中，转染方法按照商品说明书，细胞培养5天后收集上清利用蛋白A磁珠(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)分选法纯化目的蛋白。将磁珠用适当体积的结合缓冲液(PBS+0.1％吐温20，pH 7.4)重悬(1-4倍磁珠体积)后加入至待纯化样品中，室温孵育1小时，期间温柔振荡。样品置于磁力架上(购自苏州海狸生物医学工程有限公司)，弃去上清，磁珠用结合缓冲液清洗3遍。按照磁珠体积的3-5倍体积加入洗脱缓冲液(0.1M sodium citrate,pH 3.2)室温振荡5-10min，置回磁力架上，收集洗脱缓冲液，转移至已加入中和缓冲液(1M Tris，pH 8.54)的收集管中混匀。纯化后得到的4-1BB抗体融合蛋白样品用于下面的实施例4至实施例7。
实施例4：4-1BB抗体融合蛋白亲和力测定
ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，基于溶液的高通量抗体-抗原亲和力和表位分级的测量，MAbs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言之，传感器在分析缓冲液中线下平衡30min，然后线上检测60s建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHQ传感器上。再将传感器放入100nM的4-1BB抗原中作用5min，之后将传感器转移至PBS中解离5min。使用1:1结合模型进行动力学的分析。
实验结果如下面的表4所示。
表4：候选分子亲和力
结果显示，本发明的抗4-1BB分子单价亲和力在1E-08水平，符合激动型分子的开发要求。
实施例5：4-1BB抗体融合蛋白与人4-1BB CHO-S细胞结合
通过转染克隆到MCS(多克隆位点)的编码人4-1BB cDNA的pCHO1.0载体(购自Invitrogen)产生过表达人4-1BB的CHO细胞(CHO-h4-1BB细胞)。将扩大培养的CHO-h4-1BB细胞调整细胞密度至2×10 6细胞/ml，100μl/孔加入96孔流式板，离心备用。将纯化的4-1BB抗体用PBS稀释，400nM开始3倍稀释共12个点，将上述稀释好的样品100μl/孔加入上述带有细胞的96孔流式板中，4℃孵育30min，PBS清洗两次。100μl/孔加入用PBS稀释100倍的羊F(ab’)2抗人IgG-Fc(PE)(购自Abcam)，4℃孵育30min，PBS清洗两次。100μl/孔加入PBS重悬细胞，在CytoFlex(Bechman)流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。
实验结果如图1A、图1B所示。
结果显示，本发明的所有纯化样品均具有与CHO-h4-1BB细胞结合的活性，且部分纯化样品的活性与对照抗体Urelumab(US20090068192)相似。
实施例6：4-1BB抗体融合蛋白与食蟹猴4-1BB蛋白结合
食蟹猴4-1BB-his蛋白(购自ACRO)按照说明书溶解，用ELISA包被液(购自上海生工)稀释至1μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜，PBST清洗3次，5％BSA(购自上海生工)室温封闭1小时。弃去包被液，100μl/孔加入1％BSA梯度稀释的4-1BB抗体，200nM 3倍稀释共12个点，室温孵育2小时。PBST清洗3次，100μl/孔加入1％BSA稀释的羊抗人IgG-Fc-HRP(购自abcam)，室温孵育1小时。PBST清洗3次，100μl/孔加入ELISA显色液(购自索莱宝)室温反应3分钟，50μl/孔加入ELISA终止液(购自索莱宝)，读取450nm处吸光度数值。
实验结果如图2A、图2B所示，本发明的部分纯化样品(例如L-Yr-13&14-16和A-Na-19)和对照抗体Utomilumab与食蟹猴4-1BB蛋白有较好的结合活性，对照抗体Urelumab(US20090068192)与食蟹猴4-1BB蛋白结合活性较弱。
实施例7：4-1BB抗体融合蛋白激活原代T细胞的测定
OKT-3抗体(购自Biolegend)用无菌PBS(购自Hyclone)稀释至1μg/ml，50μl/孔包被96孔细胞培养平底板(购自Thermo)，同时50μl/孔加入PBS梯度稀释的抗4-1BB抗体，37℃孵育两小时。复苏冻存的人PBMC(购自上海赛笠)，用人T细胞分离纯化试剂盒(购自Stemcell)分离出T细胞，用X-VIVO15培养基(购自LONZA)重悬T细胞，调整细胞密度为0.5×10 6细胞/ml，备用。待抗体包被完成，弃去包被液，PBS清洗两次，弃去PBS，200μl/孔加入上述T细胞悬液。37℃，5％CO 2培养5天，收集上清检测IFN-γ含量。
实验结果如图3A、图3B所示，本发明的部分纯化样品可以激活人原代T细胞分泌IFN-γ，且部分样品(例如A-Na-16、A-Na-18、A-Na-19)的活性和对照抗体Urelumab(US20090068192)相当，部分样品(例如L-Yr-13&14-16、L-Yr-13&14-17)的活性处于Urelumab和Utomiumab之间。
实施例8：4-1BB抗体的人源化改造和表达
为了减少单克隆抗体在人体内产生免疫原性，将L-Yr-13&14-16和A-Na-19抗体进行人源化。人源化方法采用VHH人源化通用框架移植法，同时根据文献(Vincke,C.,等人，人源化骆驼单域抗体和鉴定通用人源化纳米抗体支架的一般策略.J Biol Chem 284(5):3273-3284)报道的方法对抗体框架2(framework 2)的部分氨基酸进行突变完成。分别得到序列SEQ ID NOs:39-40，以及SEQ ID NOs:37-38。
本研究利用IMGT(http://www.imgt.org)对L-Yr-13&14-16和A-Na-19抗体人源化序列进行了人源化水平评估，结果如表5所示。
表5：L-Yr-13&14-16和A-Na-19人源化序列和人的同源性(比较VHH的序列)
编号 种系 同源性 SEQ ID NO:
L-Yr-13&14-16 IGHV3-30*01 76.3％ 35
HZ-L-Yr-13&14-16-1 IGHV3-30*01 80.4％ 39
HZ-L-Yr-13&14-16-2 IGHV3-30*01 84.5％ 40
A-Na-19 IGHV3-30*01 69.4％ 3
Hu-A-NA-19-1 IGHV3-15*06 76.5％ 37
Hu-A-NA-19-2 IGHV3-15*06 78.6％ 38
蛋白构建及表达纯化方法同实施例3。对纯化的基因工程改造的抗体进行人4-1BB CHO-S细胞结合检测，检测方法同实施例4。结果如图4A、图4B所示，基因工程改造后的抗体保持与人4-1BB CHO-S细胞结合活性。
对纯化的基因工程改造的抗体进行食蟹猴4-1BB CHO-S细胞结合检测。结果如图5A、图5B所示。结果显示，基因工程改造后的HZ-L-Yr-13&14-16抗体保持与食蟹猴4-1BB CHO-S细胞结合活性，而基因工程改造后的A-Na-19抗体HZ-A-Na-19-1、HZ-A-Na-19-2与食蟹猴4-1BB CHO-S细胞结合活性下降明显。
对纯化的基因工程改造的抗体进行原代T细胞激活测定，检测方法同实施例7。结果如图6A、图6B所示。结果显示，基因工程改造后的HZ-L-Yr-13&14-16-1、HZ-A-Na-19-1保持原代T细胞激活活性。
实施例9：4-1BB配体阻断试验
将扩大培养的CHO-h4-1BB细胞调整细胞密度至2×10 6细胞/ml，100μl/孔加入96孔流式板，离心备用。将纯化的4-1BB抗体用PBS稀释至400nM，将上述稀释好的样品50μl/孔加入上述带有细胞的96孔流式板中，4℃孵育30min。50μl/孔加入PBS稀释至1μg/ml的Biotin-4-1BB ligand蛋白(购自ACRO)，4℃孵育30min。PBS清洗两次，100μl/孔加入用PBS稀释200倍的SAPE(购自Thermo)，4℃孵育30min，PBS清洗两次。100μl/孔加入PBS重悬细胞，在CytoFlex(Bechman)流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。
结果如图7A所示。结果显示，基因工程改造的4-1BB抗体HZ-L-Yr-13&14-16-1无配体阻断活性，对照抗体Utomilumab(US20120237498)有配体阻断活性，而Urelumab有部分阻断活性。
实施例10：抗体和TNFRSF成员结合检测
人4-1BB-his、GITR-his、OX40-his、CD40-his蛋白(购自ACRO)按照说明书溶解，用ELISA包被液(购自上海生工)稀释至1μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜，PBST清洗3次，200μl/孔加入5％BSA(购自上海生工)室温封闭1小时。弃去包被液，100μl/孔加入1％BSA稀释的4-1BB抗体，200nM 3个复孔，室温孵育2小时。PBST清洗3次，100μl/孔加入1％BSA稀释的羊抗人IgG-Fc-HRP(购自abcam)，室温孵育1小时。PBST清洗3次，100μl/孔加入ELISA显色液(购自索莱宝)室温反应3分钟，50μl/孔加入ELISA终止液(购自索莱宝)，读取450nm处吸光度数值。
结果如图7B所示。结果显示，HZ-L-Yr-13&14-16-1抗体仅和4-1BB蛋白结合，和其它肿瘤坏死因子受体超家族成员不结合。说明本发明抗体的特异性好，不会再体内激活其它肿瘤坏死因子受体超家族成员，避免了潜在的副作用。
实施例11：4-1BB与VHH段复合物晶体结构鉴定
为进一步探究本发明的4-1BB纳米抗体与其抗原蛋白的结合模式，在本实施例中，选取L-Yr-13&14-16-1，进行了抗原复合物的结晶实验。
其中，为促进晶体的形成，经优化，最终结晶复合物中的抗4-1BB抗体的氨基酸序列是在L-Yr-13&14-16-1的VHH链序列(即SEQ ID NO:39)的C端增加了Leu和Gly所形成的序列(SEQ ID NO:169)。需要特别说明的是，该C端所添加的Leu和Gly残基仅为促进结晶所进行的常规技术操作，而并不会影响纳米抗体L-Yr-13&14-16-1与人源4-1BB蛋白的结合模式。
本实验采用X光衍射法鉴定4-1BB与VHH段复合物晶体结构。人源4-1BB蛋白(SEQ ID NO:168)与抗4-1BB VHH蛋白(SEQ ID NO:169)均由HEK293体系表达。4-1BB与VHH以摩尔比1:1比例混合制备用于结晶的复合物样品。复合物(8.5mg/mL)与结晶试剂以1:1比例混合并在18℃下进行晶体培养。四天后在JBK试剂盒培养条件中观察到晶体，晶体形貌如图8所示。
挑选单晶在上海光源进行X光衍射实验并收获分辨率为 的衍射数据。数据处理使用XDS软件。利用分子置换法分别以4-1BB(PDB ID:6mgp)和VHH(PDB ID:4xt1)结构为模型进行晶相鉴定。利用Refmac5进行晶体结构精修。利用COOT进行模型检测、手动重建和结构校验。该复合物晶体归属于P41212空间群，其晶胞参数分别为： α＝90.00°，β＝90.00°，γ＝90.00°。具体晶体数据统计见表6。
表6 4-1BB-VHH复合物晶体数据统计
结构解析后所得4-1BB-VHH复合物晶体结构如图9所示。表位分析可知，4-1BB与VHH间主要氢键作用集中于4-1BB上的Asp118、Leu123、Arg130、Val132、Cys134、Gly135和Ser137等氨基酸(图10)。此外，4-1BB上Leu123、Val124、Val133和Pro136与VHH上Val32、Ala33、Tyr37、Leu47、Ile52、Tyr97、Tyr102和Trp115构成了疏水性作用界面(图11)。
Urelumab与4-1BB结合位点位于4-1BB的N端，4-1BB主要参与结合的氨基酸包括Pro27、Asn40、Asn42和Gln43等；Utomilumab主要结合在4-1BB的CRD3(Cysteine rich domain)和CRD4，4-1BB主要参与结合的氨基酸包括Arg66、Gly96、Ser100、Cys102、Lys114、Arg130和Arg134(Chin SM,Kimberlin CR,Roe-Zurz Z,et al.Structure of the 4-1BB/4-1BBL complex and distinct binding and functional properties of utomilumab and urelumab.Nat Commun 2018；9:4679.)。另外，从理论上，Utomilumab结合表位与4-1BB配体在空间上存在竞争关系，故会对4-1BB与其配体的结合具有一定阻断作用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (34)

  1. 抗4-1BB单域抗体，包含一个重链可变区，所述重链可变区包含CDR1-CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NOs:41-80，CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NOs:81-120，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NOs:121-160；
    优选地，所述CDR1-CDR3的氨基酸序列分别如下面的1-40项中的任一项所示：
  2. 根据权利要求1所述的抗4-1BB单域抗体，其4个框架区中的任意的一个、两个、三个或全部4个进行人源化改造；
    优选地，对第二个框架区进行人源化改造；可选地，还对第一个、第三个或第四个框架区进行改造；
    优选地，所述抗4-1BB单域抗体与人的同源性大于或等于75％、大于或等于76％、大于或等于77％、大于或等于78％、大于或等于79％、或者大于或等于80％；
    优选地，所述抗4-1BB单域抗体的框架区1的氨基酸序列如SEQ ID NO:170所示，框架区2的氨基酸序列如SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172所示，框架区3的氨基酸序列如SEQ ID NO:173所示，并且框架区4的氨基酸序列如SEQ ID NO:174所示。
  3. 根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体，其与4-1BB抗原的K D为小于E-07、小于5E-08、小于4E-08、小于3E-08、或者小于2E-08；优选地，所述K D通过ForteBio测得。
  4. 根据权利要求1至3中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体，其与4-1BB抗原的结合位点不同于Urelumbab和Utomilumab。
  5. 根据权利要求1至4中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体，其特异结合人4-1BB，同时交叉结合食蟹猴4-1BB。
  6. 根据权利要求1至5中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体，其不阻断天然状态下4-1BB配体与4-1BB的结合。
  7. 根据权利要求1至6中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:1-40中的任一序列所示。
  8. 一种融合蛋白，其包含权利要求1至7中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体，以及人IgG的Fc段或人IgG的恒定区。
  9. 根据权利要求8所述的融合蛋白，其中，按照EU编号系统，所述人IgG的Fc段或人IgG的重链恒定区包含L234A突变和L235A突变；可选地，所述IgG的Fc段还包含G237A突变。
  10. 根据权利要求8至9中任一权利要求所述的融合蛋白，其中，
    所述人IgG的Fc段为人IgG1的Fc段；
    所述人IgG的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区。
  11. 根据权利要求8至10中任一权利要求所述的融合蛋白，其中，
    所述人IgG的Fc段为包含L234A突变和L235A突变的人IgG1的Fc段；可选地， 所述人IgG1的Fc段还包含G237A突变；
    优选地，人IgG1的Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示。
  12. 根据权利要求8至11中任一权利要求所述的融合蛋白，其中，
    所述人IgG的Fc段或人IgG的恒定区与所述抗4-1BB单域抗体的C末端直接连接或通过连接片段连接。
  13. 分离的核酸分子，其编码权利要求1至7中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体或者权利要求8至12中任一权利要求所述的融合蛋白。
  14. 一种载体，其包含权利要求13所述的分离的核酸分子。
  15. 一种宿主细胞，其包含权利要求13所述的分离的核酸分子，或者权利要求14所述的载体。
  16. 制备权利要求1至7中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体或者权利要求8至12中任一权利要求所述的融合蛋白的方法，其包括在合适的条件下培养权利要求15的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述抗4-1BB单域抗体或融合蛋白的步骤。
  17. 偶联物，其包括抗体部分以及偶联部分，其中，所述抗体部分为权利要求1至7中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体或者权利要求8至12中任一权利要求所述的融合蛋白，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
  18. 试剂盒，其包含权利要求1至7中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体或者权利要求8至12中任一权利要求所述的融合蛋白，或者包含权利要求17所述的偶联物；
    优选地，所述试剂盒还包含第二抗体，其能够特异性结合所述单域抗体或融合蛋白；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
  19. 权利要求1至7中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体或者权利要求8至12中任一权利要求所述的融合蛋白在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测4-1BB在样品中的存在或其水平。
  20. 一种药物组合物，其包含权利要求1至7中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体或者权利要求8至12中任一权利要求所述的融合蛋白或者包含权利要求17所述的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的辅料。
  21. 权利要求1至7中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体或者权利要求8至12中任一权利要求所述的融合蛋白或者权利要求17所述的偶联物在制备预防和/或治疗恶性肿瘤或自身免疫性疾病的药物中的用途；
    优选地，所述恶性肿瘤选自直肠癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌、卵巢癌、食道癌和头颈癌；
    优选地，所述自身免疫性疾病选自自身免疫性脑脊髓炎、狼疮样综合征和胶原诱导型关节炎。
  22. 一种治疗和/或预防恶性肿瘤或自身免疫性疾病的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的权利要求1至7中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体或者权利要求8至12中任一权利要求所述的融合蛋白或者权利要求17所述的偶联物的步骤；
    优选地，所述恶性肿瘤选自直肠癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌、卵巢癌、食道癌和头颈癌；
    优选地，所述自身免疫性疾病选自自身免疫性脑脊髓炎、狼疮样综合征和胶原诱导型关节炎。
  23. 根据权利要求1至7中任一权利要求所述的抗4-1BB单域抗体或者权利要求8至12中任一权利要求所述的融合蛋白或者权利要求17所述的偶联物，其用于治疗和/或预防恶性肿瘤或自身免疫性疾病；
    优选地，所述恶性肿瘤选自直肠癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌、卵巢癌、食道癌和头颈癌；
    优选地，所述自身免疫性疾病选自自身免疫性脑脊髓炎、狼疮样综合征和胶原诱导型关节炎。
  24. 一种抗4-1BB纳米抗体，其特征在于，所述抗4-1BB纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NOs:1-40中任一所示的氨基酸序列；
    其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代1-8个(较佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基，并能够保留4-1BB纳米抗体的4-1BB结合亲和力的衍生序列。
  25. 一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端具有如式I所示的结构：
    Z1-L-Z2 (式I)
    式中，
    Z1为一个或多个(较佳地1-2个，更佳地1个)如权利要求24所述的抗4-1BB纳米抗体的VHH链；
    Z2为免疫球蛋白的Fc段；
    L为任选的接头序列。
  26. 一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求24所述的抗4-1BB纳米抗体或如权利要求25所述的融合蛋白。
  27. 一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求26所述的多核苷酸。
  28. 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求27所述的表达载体，或其基因组中整合有如权利要求26所述的多核苷酸。
  29. 一种产生抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
    (a)在适合产生抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白的条件下，培养如权利要求28所述的宿主细胞，从而获得含所述抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白的培养物；和
    (b)从所述培养物中分离或回收所述的抗4-1BB纳米抗体或融合蛋白。
  30. 一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：
    (a)如权利要求24所述的抗4-1BB纳米抗体，或如权利要求25所述的融合蛋白；和
    (b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
  31. 如权利要求24所述的抗4-1BB纳米抗体或如权利要求25所述的融合蛋白的用途，用于制备(a)用于检测4-1BB分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。
  32. 一种药物组合物，其特征在于，包括：
    (i)如权利要求24所述的抗4-1BB纳米抗体、如权利要求25所述的融合蛋白，或如权利要求30所述的免疫偶联物；和
    (ii)药学上可接受的载体。
  33. 一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
    (i)如权利要求24所述的抗4-1BB纳米抗体，或如权利要求25所述的融合蛋白的序列；以及
    (ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
  34. 一种蛋白复合物，其特征在于，所述的复合物由4-1BB蛋白和抗4-1BB抗体或其抗原结合片段通过氢键和/或疏水相互作用而形成；
    其中，所述的氢键作用位点包括4个以上(较佳地5个以上，更佳地6个以上，最佳地为7个)位于4-1BB蛋白中选自下组的位点：第118位Asp、第123位Leu、第130位Arg、第132位Val、第134位Cys、第135位Gly，和第137位Ser；
    并且，所述的疏水性相互作用界面的构成位点包括2个以上(较佳地3个以上，更佳地4个以上)位于4-1BB蛋白中选自下组的位点：第123位Leu、第124位Val、第133位Val，和第136位Pro；
    其中，所述的4-1BB蛋白的氨基酸编号是基于SEQ ID NO:168的编号。
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