CN112646031B - 抗4-1bb纳米抗体及其用途 - Google Patents

抗4-1bb纳米抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112646031B
CN112646031B CN202010328300.8A CN202010328300A CN112646031B CN 112646031 B CN112646031 B CN 112646031B CN 202010328300 A CN202010328300 A CN 202010328300A CN 112646031 B CN112646031 B CN 112646031B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanobody
antibody
ser
gly
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010328300.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112646031A (zh
Inventor
万亚坤
朱敏
盖军伟
李光辉
沈晓宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjing Biotechnology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Tianjing Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjing Biotechnology Shanghai Co ltd filed Critical Tianjing Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority to CN202010328300.8A priority Critical patent/CN112646031B/zh
Publication of CN112646031A publication Critical patent/CN112646031A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112646031B publication Critical patent/CN112646031B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Abstract

本发明提供了抗PD‑L1/4‑1BB双特异性抗体及其用途。具体地，本发明提供了一种双特异性抗体，包括(a)PD‑L1纳米抗体和(b)4‑1BB纳米抗体。本发明提供了编码上述双特异性抗体的编码序列、相应的表达载体和能够表达该双特异性抗体的宿主细胞，以及本发明双特异性抗体的生产方法。本发明双特异性抗体能够有效靶向PD‑L1及4‑1BB，有良好的生物学活性和应用前景。

Description

抗4-1BB纳米抗体及其用途
本申请是申请日为2019年10月10日、申请号为201910958176.0、发明名称为“抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体及其用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体及其用途。
背景技术
程序性死亡因子1(Programmedcelldeathprotein1,PD-1)是CD28超家族成员。作为T细胞抑制受体，在肿瘤细胞中可限制T细胞效应子的功能，在肿瘤免疫逃逸中具有重要作用。阻断PD-1与PD-L1的相互作用可有效恢复T细胞对肿瘤的杀伤功能。PD-1/PD-L1免疫疗法已是当前备受全世界瞩目、引领癌症治疗的变革，为患者带来新希望的新一类抗癌免疫疗法，旨在充分利用人体自身的免疫系统抗击癌症，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路使癌细胞死亡，具有治疗多种类型肿瘤的潜力，实质性改善患者总生存期。然而，针对PD-1/PD-L1的疗法并不完全尽如人意：一部分患者经历快速和持久的肿瘤消退，但大多数患者获得很小或没有明显的效果。为了增加对免疫疗法对患者的响应率，研究人员试图开发新的免疫调节靶点和治疗策略。其中一种很有希望的策略即是对免疫刺激受体激动作用以诱导免疫细胞活化。这种“共刺激”策略为临床开发中的多种药剂提供了机制基础，包括靶向OX40，CD27，CD40，GITR和4-1BB的抗体。
4-1BB也称CD137，是一种表面糖蛋白和肿瘤坏死因子受体(TNFRSF9)超家族的成员，主要表达于活化的T细胞，是T细胞协同刺激分子，其配体为4-1BBL，二者结合可刺激T细胞(和B细胞)活化和增殖，作为治疗靶点具有独特的吸引力。第一个进入临床试验的抗4-1BB治疗药物Urelumab(BMS-663513)是一种全人的IgG4类型的单克隆抗体。该抗体不会阻断4-1BB与其配体的相互作用。该药物在临床已有令人鼓舞的疗效，但PhaseI和PhaseII阶段的数据显示肝脏毒性似乎与靶标和剂量有关，因此阻碍了其临床开发。另一个进入临床研究的药物Utomilumab(PF-05082566)是人源化IgG2单克隆抗体，其在激活4-1BB的同时可以阻断与内源性4-1BBL的结合。该抗体相较于Urelumab的激动活性更弱，且有更好的安全性。
针对以上情况，通过使用双特异性抗体使产生的激活局限于表达靶抗原的组织，从而可减轻系统毒性；同时肿瘤介导的4-1BB crosslinking作用可以有效地发挥激动作用。目前市场上还没有有效的PD-L1/4-1BB双特异性抗体药物产品，将PD-L1纳米抗体联合靶向4-1BB的纳米抗体可能发挥更好的抗肿瘤效应，该项技术有待进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体及其用途。
本发明第一方面，提供了一种双特异性抗体，所述的双特异性抗体包括：抗PD-L1纳米抗体和抗4-1BB纳米抗体，
其中，所述的抗PD-L1纳米抗体的互补决定区CDR包括：
SEQ ID NO.:5所示的CDR1、SEQ ID NO.:6所示的CDR2，SEQ ID NO.:7所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体包括2-4个抗PD-L1纳米抗体，较佳地，包括2个抗PD-L1纳米抗体，更佳地，所述两个抗PD-L1纳米抗体形成抗PD-L1纳米抗体二聚体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体包括2-4个抗4-1BB纳米抗体，较佳地，包括2个抗4-1BB纳米抗体，更佳地，所述两个抗4-1BB纳米抗体形成抗4-1BB纳米抗体二聚体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体还包含Fc段，较佳地，所述的Fc段包含CH2结构域和CH3结构域。
在另一优选例中，所述的Fc段为IgG4型Fc段。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体从N端到C端具有式I所示的结构：
P-L1-P-L2-Fc-L3-B-L4-B 式I
其中，
“-”为肽键；
L1、L2、L3、和L4各自独立地为肽键或接头元件；
P为抗PD-L1纳米抗体，
B为抗4-1BB纳米抗体，和
Fc为抗体的Fc段。
在另一优选例中，所述的抗PD-L1纳米抗体包含框架区FR和互补决定区CDR。
在另一优选例中，所述的抗PD-L1纳米抗体的框架区FR包括：
SEQ ID NO.:1所示的FR1、SEQ ID NO.:2所示的FR2、SEQ ID NO.:3所示的FR3、和SEQ ID NO.:4所示的FR4。
在另一优选例中，所述的抗PD-L1纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。
在另一优选例中，所述的PD-L1为人PD-L1。
在另一优选例中，所述的抗PD-L1纳米抗体可以阻断PD-1和PD-L1的相互作用。
在另一优选例中，所述的抗4-1BB纳米抗体包含框架区FR和互补决定区CDR。
在另一优选例中，所述的抗4-1BB纳米抗体的互补决定区CDR包括：
SEQ ID NO.:14所示的CDR1、SEQ ID NO.:15所示的CDR2、和SEQ ID NO.:16所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的抗4-1BB纳米抗体的框架区FR包括：
SEQ ID NO.:10所示的FR1、SEQ ID NO.:11所示的FR2、SEQ ID NO.:12所示的FR3、和SEQ ID NO.:13所示的FR4。
在另一优选例中，所述的抗4-1BB纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:17所示。
在另一优选例中，所述的4-1BB为人4-1BB。
在另一优选例中，所述的抗4-1BB纳米抗体可以阻断4-1BB和4-1BBL的相互作用。
在另一优选例中，所述的L1、L3、和L4为接头元件。
在另一优选例中，所述的接头元件的序列为(4GS)n，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n＝4。
在另一优选例中，所述的接头元件如SEQ ID NO.:19所示。
在另一优选例中，所述的L2为肽键。
在另一优选例中，所述的Fc段如SEQ ID NO.:20的第273-501位所示。
在另一优选例中，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:20所示。
在另一优选例中，所述双功能抗体与PD-L1的结合亲和力的KD值小于10E-08M，优选地，小于6E-08M。
在另一优选例中，所述双功能抗体与4-1BB的结合亲和力的KD值小于5E-08M，优选地，小于3E-08M。
在另一优选例中，所述双功能抗体抑制PD-1和PD-L1结合的IC50小于2ug/ml，优选地，小于1.5ug/ml，更佳地，小于1.2ug/ml。
在另一优选例中，所述双功能抗体抑制4-1BB和4-1BBL结合的IC50小于20ug/ml，优选地，小于15ug/ml，更佳地，小于12ug/ml。
本发明第二方面，提供了一种双特异性融合蛋白，所述的双特异性融合蛋白是由两个本发明第一方面所述的双特异性抗体形成的二聚体。
在另一优选例中，所述双特异性融合蛋白包含4个抗PD-L1纳米抗体和4个4-1BB纳米抗体。
在另一优选例中，所述双特异性融合蛋白通过Fc段形成二聚体。
在另一优选例中，所述的二聚体包括同源二聚体和异源二聚体。
在另一优选例中，所述双特异性融合蛋白从N端到C端具有式II所示的结构：
Figure BDA0002464022200000041
其中，
“-”为肽键，
Figure BDA0002464022200000042
为二硫键；
L1、L2、L3、和L4各自独立地为肽键或接头元件；
P为抗PD-L1纳米抗体，
B为抗4-1BB纳米抗体，和
Fc为抗体的Fc段。
本发明第三方面，提供了一种抗4-1BB纳米抗体，所述抗4-1BB纳米抗体的互补决定区CDR包括：
SEQ ID NO.:14所示的CDR1、SEQ ID NO.:15所示的CDR2、和SEQ ID NO.:16所示的CDR3。
本发明第四方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、或本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的双特异性抗体，且所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.:20所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码抗PD-L1纳米抗体，且所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.:9所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体，且所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.:18所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的多核苷酸包括DNA或RNA。
本发明第五方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第四方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。
本发明第六方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第五方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸；
或者，所述的宿主细胞表达本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、或本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在本发明的第七方面，提供了一种产生双特异性抗体或纳米抗体的方法，包括步骤：
(a)在合适的条件下，培养本发明第六方面所述的宿主细胞，从而获得含所述双特异性抗体或纳米抗体的培养物；和
(b)对步骤(a)中得到的培养物进行纯化和/或分离，所述的获得所述的双特异性抗体或纳米抗体。
在另一优选例中，所述纯化可以通过蛋白A亲和柱纯化分离获得目标抗体。
在另一优选例中，所述经过纯化分离后的目标抗体纯度大于95％，大于96％、大于97％、大于98％、大于99％，优选为100％。
在本发明的第八方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、和/或本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133 Yb-169、Yb-177、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：
耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白和/或本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体。
在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白和/或本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体。
在本发明的第九方面，提供了本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、或本发明第一方面所述的双特异性抗体的用途，用于制备(a)用于检测PD-L1和/或4-1BB分子的试剂；(b)用于制备治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为诊断用同位素。
在另一优选例中，所述的试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。
在另一优选例中，所述检测PD-L1和/或4-1BB分子的试剂为(体内)检测PD-L1和/或4-1BB分子的造影剂。
在另一优选例中，所述的检测为体内检测或体外检测。
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
在另一优选例中，所述的药物用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用，同时阻断4-1BB和4-1BBL的相互作用。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，含有：(i)本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体、或本发明第七方面所述的免疫偶联物；以及(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为药物、毒素、和/或治疗用同位素。
在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有治疗肿瘤的其他药物，如细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的治疗肿瘤的其他药物包括紫杉醇、多柔比星、环磷酰胺、阿西替尼、乐伐替尼、或派姆单抗。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用，同时阻断4-1BB和4-1BBL的相互作用。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于阻断PD-1/PD-L1信号通路。
另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
本发明的第十一方面，提供了本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、或本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体的一种或多种选自下组的用途：(i)用于检测人PD-L1分子和/或4-1BB分子；(ii)用于流式检测；(iii)用于细胞免疫荧光检测；(iv)用于治疗肿瘤；(v)用于肿瘤诊断；(vi)用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用；和(vii)用于阻断4-1BB和4-1BBL的相互作用。
在另一优选例中，所述的肿瘤为表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤。
在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。
在本发明的第十二方面，还提供了一种抗体，所述抗体具有：所述的抗PD-L1纳米抗体、本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为抗PD-L1蛋白和/或4-1BB蛋白的抗体。
在本发明的第十三方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：(i)本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签、HA标签和Fc标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于PD-L1蛋白和/或4-1BB蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了如本发明第一方面所述的双特异性抗体、如本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、如本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体、或如本发明第八方面所述的免疫偶联物的用途，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中PD-L1蛋白和/或4-1BB蛋白；其中，所述药剂用于治疗或预防表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤或是表达4-1BBL的肿瘤。
在本发明的第十五方面，提供了一种检测样品中PD-L1蛋白和/或4-1BB蛋白的方法，所述方法包括步骤：(1)将样品与如本发明第一方面所述的双特异性抗体、如本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、或如本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体接触；(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在PD-L1蛋白。
在本发明的第十六方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用如本发明第一方面所述的双特异性抗体、如本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、如本发明第三方面所述的抗4-1BB纳米抗体或本发明第八方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。
在本发明的第十七方面，提供了一种PD-L1蛋白和/或4-1BB蛋白检测试剂，所述的检测试剂包含本发明第八方面所述的免疫偶联物和检测学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为诊断用同位素。
在另一优选例中，所述的检测学上可接受的载体为无毒的、惰性的水性载体介质。
在另一优选例中，所述的检测试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。
在另一优选例中，所述的检测试剂用于体内检测。
在另一优选例中，所述的检测试剂的剂型为液态或粉状(如水剂，针剂，冻干粉，片剂，含服剂，吸雾剂)。
本发明的第十八方面，提供了一种检测PD-L1蛋白和/或4-1BB蛋白的试剂盒，所述试剂盒含有本发明第八方面所述的免疫偶联物或本发明的第十七方面所述的检测试剂，以及说明书。
在另一优选例中，所述的说明书记载，所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的PD-L1和/或4-1BB表达。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤的检测。
在本发明的十九方面，提供了一种本发明第八方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备体内检测PD-L1蛋白和/或4-1BB蛋白的造影剂。
在另一优选例中，所述检测用于癌症的诊断或预后。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了4-1BB纳米抗体与上市抗体的抗原识别表位差异的结果。结果表明，Urelumab结合4-1BB的位点为N42，而Utomilumab与4-1BB的结合位点为M101和I132。以上三个位点均不是本发明4-1BB纳米抗体与4-1BB结合的位点，因此可以认为本发明纳米抗体识别的抗原表位与两种对照抗体不同。
图2显示了4-1BB纳米抗体对小鼠结肠癌MC38的抑制作用。其中，对照抗体Utomilumab的肿瘤抑制率TGI为68.3％，候选的4-1BB纳米抗体的肿瘤抑制率TGI为75.8％。
图3A显示了PD-L1/4-1BB双特异性抗体(即八价双抗)的结构示意图。
图3B显示了六价双抗A的结构示意图。
图3C显示了六价双抗B的结构示意图。
图3D显示了四价双抗的结构示意图。
图4显示了PD-L1/4-1BB双特异性抗体的SDS-PAGE检测结果。结果表明，经一步亲和纯化的该双抗纯度约在85％以上。
图5显示不同结构的PD-L1/4-1BB双特异性抗体对293T/4-1BB细胞的结合活性。结果表明，八价双抗(EC50＝6.43nM)4-1BB部分的细胞水平结合活性优于六价双抗A(EC50＝20.1nM)，六价双抗B(EC50＝19.2nM)及四价双抗(EC50＝30.1nM)的结合活性；八价双抗细胞水平的结合活性显著优于六价以及四价双抗的结合活性。
图6显示不同结构的PD-L1/4-1BB双特异性抗体对293T/4-1BB细胞和4-1BBL结合的阻断活性。结果表明，八价双抗(IC50＝59.5nM)4-1BB部分的细胞水平的阻断活性优于六价双抗A(IC50＝99.7nM)，六价双抗B(IC50＝105nM)及四价双抗(IC50＝126nM)的阻断活性；八价双抗细胞水平的阻断活性显著优于六价以及四价双抗的阻断活性。
图7A显示了包被4-1BB抗原和IgG1蛋白时的检测结果，结果表明抗PD-L1/4-1BB双特异性纳米抗体可以同时结合4-1BB和PD-L1。
图7B显示了包被PD-L1抗原和IgG1时的检测结果，结果表明抗PD-L1/4-1BB双特异性纳米抗体可以同时结合PD-L1和4-1BB。
图8显示了Fortebio检测抗PD-L1/4-1BB双特异性纳米抗体对PD-L1的亲和力，亲和力为5.87E-08M。
图9显示了Fortebio检测抗PD-L1/4-1BB双特异性纳米抗体对4-1BB的亲和力，亲和力为2.24E-08M。
图10显示了抗PD-L1/4-1BB双特异性纳米抗体与PD-L1纳米抗体及Tecentriq细胞水平PD-L1/PD-1阻断活性分析。其中，抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体的IC50为1.194ug/ml，PD-L1纳米抗体的IC50为0.6437ug/ml，Tecentriq的IC50为1.136ug/ml。
图11显示了抗PD-L1/4-1BB双特异性纳米抗体与4-1BB纳米抗体及Utomilumab细胞水平4-1BB/4-1BBL阻断活性分析。其中，抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体的IC50为11.70ug/ml，4-1BB纳米抗体的IC50为4.640ug/ml，Utomilumab的IC50为3.069ug/ml。
图12显示了利用PD-1/PD-L1 Reporter Assay系统检测抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体生物学活性的结果。其中，抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体的EC50为0.3021ug/ml，PD-L1纳米抗体的EC50为0.3232ug/ml，Tecentriq的EC50为0.6198ug/ml。
图13A与图13B分别显示了在Donor 1和Donor 2中抗PD-L1/4-1BB双特异性纳米抗体，PD-L1纳米抗体和4-1BB纳米抗体对PBMC细胞的体外激活实验。其中，双特异性抗体能有效激活T细胞，且激活作用显著强于单独的PD-L1纳米抗体和4-1BB纳米抗体。
图14A、14B、14C和14D显示了抗PD-L1/4-1BB双特异性纳米抗体介导的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用具有PD-L1依赖性。其中，14A和14B所示候选双抗对不同个体来源的T细胞能够显著杀伤PD-L1过表达的A375细胞，且杀伤作用显著优于单独的4-1BB纳米抗体和单独的PD-L1纳米抗体。14C和14D结果表明，候选双抗刺激T细胞/过表达PD-L1的A375细胞组合产生的IFNr量显著高于单独的4-1BB纳米抗体和单独的PD-L1纳米抗体。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，意外地获得了一种抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体，其包含抗PD-L1纳米抗体和抗4-1BB纳米抗体。实验表明，本发明的双特异性抗体对PD-L1和4-1BB分子均具有较好的结合活性，同时能够阻断PD-1与PD-L1的相互作用以及4-1BB与4-1BBL的相互作用，具有良好的抗肿瘤活性。在此基础上完成了本发明。
本发明的双特异性抗体可以通过Fc片段形成二聚体，即包含4个抗PD-L1纳米抗体和4个抗4-1BB纳米抗体8价融合蛋白。申请人发现，相比包含2个抗PD-L1纳米抗体和2个抗4-1BB纳米抗体的4价融合蛋白，或包含2个抗PD-L1纳米抗体和4个抗4-1BB纳米抗体、或4个抗PD-L1纳米抗体和2个抗4-1BB纳米抗体的6价融合蛋白，本发明的8价融合蛋白具有显著更优的的结合活性。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
如本文所用，术语“本发明的双特异性抗体”、“本发明的双抗”、“抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体”具有相同的含义，均指特异性识别和结合于PD-L1和4-1BB的双特异性抗体。本发明还提供了PD-L1纳米抗体和4-1BB纳米抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。存在两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链种类(或同型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每种链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，重链可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区都决定对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定区(CH)赋予重要的生物性质如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性取决于抗体结合位点和抗原决定区间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高度可变或框架区(FR)的残基影响整体结构域结构且进而影响结合位点。互补决定区或CDR指共同限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点天然Fv区的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR，分另称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。常规抗体抗原结合位点因此包括六个CDR，包含来自每个重链和轻链v区的CDR集合。
如本文所用，术语“纳米抗体VHH”、“纳米抗体nanobody”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“框架区”(FR)指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，术语″人框架区″是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
如本文所用，术语“亲和力”理论上通过完整抗体和抗原间的平衡缔合来定义。本发明双抗的亲和力可以通过KD值(解离常数)(或其它测定方式)进行评估或测定，例如生物膜层干涉技术(Bio-layer interferometry BLI)，使用FortebioRed96仪器测量确定。
如本文所用，术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的PD-L1/4-1BB双特异性抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合PD-L1和/或4-1BB蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有PD-L1和/或4-1BB蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
双特异性抗体
本发明提供了一种抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体，其包括：抗PD-L1纳米抗体和抗4-1BB纳米抗体。
在优选的实施方式中，该双特异性抗体包含两个抗PD-L1纳米抗体和两个抗4-1BB纳米抗体，并且，该双特异性抗体可以形成二聚体，即包含4个抗PD-L1纳米抗体和4个抗4-1BB纳米抗体的双特异性融合蛋白，如图3A所示。
事实上，基于本发明中的抗4-1BB纳米抗体和抗PD-L1纳米抗体，申请人在双特异性抗体的构建过程中，构建了多种结构的双特异性抗体，包括1个抗PD-L1纳米抗体和1个抗4-1BB纳米抗体，或者包括1个抗PD-L1纳米抗体和2个抗4-1BB纳米抗体，或者包括2个抗PD-L1纳米抗体和1个抗4-1BB纳米抗体，这样结构的双特异性抗体也能形成二聚体融合蛋白，结构如图3B、3C和3D所示。实验结果显示，如图3B、3C和3D所示结构的融合蛋白相比，图3A所示的融合蛋白具有显著更优的的结合活性。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合PD-L1和/或4-1BB蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
标记的纳米抗体
在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗PD-1的纳米抗体、抗4-1BB纳米抗体和PD-L1/4-1BB双特异性抗体可以用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。
本发明的PD-L1/4-1BB双特异性抗体具有很好的特异性，很高的效价。
检测方法
本发明还涉及检测PD-L1和/或4-1BB蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中PD-L1和/或4-1BB蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测PD-L1和/或4-1BB水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别PD-L1和/或4-1BB蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与PD-L1和/或4-1BB相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对PD-L1和/或4-1BB的临床诊断和靶向治疗，如肿瘤治疗。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的4-1BB纳米抗体与上市产品Urelumab和Utomilumab具有不同的抗原识别表位；
(b)本发明的双特异性抗体可以同时阻断PD-1/PD-L1的结合以及4-1BB/4-1BBL的结合；
(c)本发明的双特异性抗体具有显著的抗肿瘤活性。
(d)本发明抗体介导的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用具有PD-L1依赖性，今后可能避免肝毒性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：PD-L1纳米抗体的筛选及人源化
PD-L1抗体文库的构建：
(1)将1mg hPD-L1(ECD)-Fc抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；(2)7次免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；(4)利用限制性内切酶PstI及NotI酶切20μgpMECS噬菌体展示载体及10μgVHH并连接两个片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TG1中，构建PD-L1纳米抗体文库。
PD-L1抗体阳性克隆的富集：
(1)将溶解在100mMNaHCO3、pH8.2中的10μghPD-L1(ECD)-Fc抗原(10μg Fc inNaHCO3作为对照)偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜；(2)第二天加入100μL 0.1％BSA，室温封闭2h；(3)2h后，加入100μL噬菌体(2×1011CFU免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，室温作用1h；(4)用0.05％PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉非特异的噬菌体；(5)用100mM三乙醇胺将与PD-L1特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮得到富集的噬菌体克隆株。
PD-L1抗体单个阳性克隆的筛选：
(1)从上述筛选的含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选200个单个菌落并接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素的TB培养基(1LTB培养基中含有2.3g KH2PO4，12.52g K2HPO4，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1mM的IPTG，28℃培养过夜；(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1h；(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1h；(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，在室温下放置1h；(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值；(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时(Ratio+/-＞3)，判为阳性克隆孔。将阳性克隆株进行测序鉴定并对比分析纳米抗体的CDR区序列。
纳米抗体阻断功能的初步鉴定：
(1)制备hPD-1(ECD)-Biotin蛋白，蛋白生物素化的方法参照生物素试剂说明书；(2)瞬转PD-L1基因于HEK293F细胞，使其细胞表面表达PD-L1蛋白；(3)制备PD-L1纳米抗体TG1菌株粗提裂解液，制备方法同Zhu Min等人，Nanoscale Res Lett.，2014Sep26；9(1)：528；(4)每个样品取1×106个瞬转PD-L1的HEK293F细胞重悬于0.5％BSA-PBS buffer中，加入上述粗提液100μL，同时设置阴性对照(hIgG1)和阳性对照(Tecentriq)，每孔加入5μghPD-1(ECD)-Fc-Biotin，4℃孵育20min；(5)PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测，最终获得1株纳米抗体Nb27(氨基酸序列如SEQ ID NO.:19所示)具有明显的阻断效果。
人源化改造：
(1)首先以SEQ ID NO.:19所示的PD-L1纳米抗体序列为模板在结构数据库中同源结构的搜索，取其中Evalue＝0.0并且序列等同性≥70％的结构；(2)对这这些结构进行结构比对，并依据晶体结构分辨率大小和构建的进化树，进行基于SEQ ID NO.:19所示的PD-L1纳米抗体序列的多模板同源模建，再依据打分函数的高低排序，选取molpdf最低的结构；(3)对模建的最优结构，利用ProtSA服务器计算残基的溶剂可接触性，即残基的折叠态相对于去折叠态的溶剂可接触面积的比值为判据，取大于40％的残基为暴露于溶剂外的残基；(4)对模建的最优结构和DP-47进行序列比对，替换相应的暴露于溶剂的残基。最终确定出一种人源化PD-L1纳米抗体，由SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列编码，各CDR区和FR区的氨基酸序列如表1所示。
实施例2：4-1BB纳米抗体的筛选及人源化
参照实施例1中的方法，进行4-1BB纳米抗体的文库构建、阳性克隆富集和筛选、阻断功能初步鉴定、以及人源化改造，成功获得一种人源化4-1BB纳米抗体，由SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列编码，各CDR区和FR区的氨基酸序列如表1所示。
表1
Figure BDA0002464022200000221
Figure BDA0002464022200000231
实施例3：4-1BB纳米抗体的抗原识别表位分析
(1)将100uL 0.2ug/mL的人4-1BB抗原蛋白及三种突变体蛋白(N42R、M101R、I132R)包被酶标板，37℃孵育2h；(2)用PBST洗涤5遍，拍干后每孔加入300uL的1％BSA，室温封闭2h；(3)PBST洗涤5遍，拍干后分别加入2ug/mL4-1BB纳米抗体及对照抗体(Urelumab和Utomilumab)室温孵育1h；(4)PBST洗涤5遍，拍干后再加入100uL稀释的羊抗人IgG抗体(1:100000稀释)，室温孵育1h；(5)PBST洗涤5遍，拍干后分别加入100uL TMB显色液，室温静置避光10min，在450nm的波长读数。
结果如图1所示，Urelumab结合4-1BB的位点为N42，而Utomilumab与4-1BB的结合位点为M101和I132。该结果与S.Michael Chin,Christopher R.Kimberlin,Zygy Roe-Zurz等人于Nature communications期刊发表的《Structure of the 4-1BB/4-1BBL complexand distinct binding and functional properties of utomilumab and urelumab》文章报导的结果一致。以上三个位点均不是本发明4-1BB纳米抗体与4-1BB结合的位点，因此可以认为本发明纳米抗体识别的抗原表位与两种对照抗体不同。
实施例4：4-1BB纳米抗体的抗肿瘤活性
(1)将小鼠结肠癌MC38细胞培养在37℃、5％CO2的培养箱中，培养基成分为含有10％灭活胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基。(2)将PBS重悬的MC38结肠癌细胞以1×105个/0.1mL浓度，0.1mL/只体积接种于B-h4-1BB人源化小鼠的右侧皮下。(3)当平均肿瘤体积达到大约100-150mm3时，挑选个体肿瘤体积合适的小鼠入组，将动物按肿瘤体积随机分配到各实验组中，每组7只，分组当天开始给药，每3天给药一次，共6次。(4)末次给药后，对实验动物体重及肿瘤生长状态继续观察1周，观察期间，每周测量两次肿瘤体积及动物体重，并记录测量值。
结果如图2所示，两个实验组抗体均有良好的肿瘤抑制效果，且4-1BB纳米抗体更优。对照抗体Utomilumab的肿瘤抑制率TGI为68.3％，候选的4-1BB纳米抗体的肿瘤抑制率TGI为75.8％。
实施例5：抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体设计
将实施例1和实施例2获得的PD-L1纳米抗体及4-1BB纳米抗体进行串联，通过linker(SEQ ID NO.19)连接形成以下结构：
NbPD-L1-4(GGGGS)-NbPD-L1-Fc-4(GGGGS)-Nb4-1BB-4(GGGGS)-Nb4-1BB
其结构示意图如图3A所示。
其氨基酸序列如下所示，其中下划线部分为linker序列，斜体部分为Fc序列：
Figure BDA0002464022200000241
实施例6：抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体表达纯化
将包含实施例5中双抗编码基因的质粒瞬转至HEK293F细胞中，进行抗体的表达和纯化，具体方法如下：
(1)用MN质粒大提试剂盒将质粒大量制备，在超净工作台内过滤除菌备用；(2)培养HEK293F细胞培养至2.0×106个/mL；(3)将质粒与转染试剂PEI以1:3的比例混合均匀至转染培养基F17(Gibco)中静置20min，之后加入到HEK293F细胞中，于37℃，6％CO2摇床培养箱中培养6天；(4)离心获得上清，将上清与proteinA珠子在室温条件下结合1h；(5)使用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗掉杂蛋白和其他杂质，之后再用0.1M pH3.0的Glycine洗脱目标抗体蛋白；(6)将洗脱得到的抗体超滤至1×PBS溶液中，并取样进行SDS-PAGE分析。
结果如图4所示，抗体纯度约在85％以上。将剩余蛋白分装后保存于-80℃冰箱备用。
实施例7：不同结构的PD-L1/4-1BB双特异性抗体4-1BB部分细胞水平结合和阻断活性分析
不同结构的PD-L1/4-1BB双特异性抗体与293F/4-1BB细胞结合的活性，具体方法如下：
(1)每个样品取3×105个293T/4-1BB稳转细胞于PBS buffer中，分别加入稀释的不同结构的抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体(实施例6制得)(抗体浓度为：241nM，120nM，60.2nM，30.nM，15.1nM，7.53nM，3.77nM，1.88nM，0.94nM，0.47nM，0.24nM，0.12nM)，每个样品100uL，4℃孵育20min；(2)PBS洗涤2次细胞，加入Abcam的Goat anti Human Fc-FITC，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测，使用graphpadprism 6软件进行数据处理。
结果如图5所示，八价双抗(EC50＝6.43nM)4-1BB部分的细胞水平结合活性优于六价双抗A(EC50＝20.1nM)，六价双抗B(EC50＝19.2nM)及四价双抗(EC50＝30.1nM)的结合活性。
不同结构的PD-L1/4-1BB双特异性抗体阻断293T/4-1BB细胞和4-1BBL结合的活性，具体方法如下：
(1)每个样品取3×105个293T/4-1BB稳转细胞于PBS buffer中，分别加入稀释的不同结构的抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体(实施例6制得)(抗体浓度为：1651nM，826nM，413nM，206nM，103nM，51.7nM，25.8nM，12.9nM，6.45nM，3.23nM，1.61nM，0.81nM)，每个样品100uL，所有样本中同时加入0.6ug/ml的h4-1BBL(ECD)-Fc-Biotin，4℃孵育20min；(2)PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测，使用graphpad prism 6软件进行数据处理。
结果如图6所示，八价双抗(IC50＝59.5nM)4-1BB部分的细胞水平阻断活性优于六价双抗A(IC50＝99.7nM)，六价双抗B(IC50＝105nM)及四价双抗(IC50＝126nM)的阻断活性。
实施例8：抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体同时结合双靶标的活性鉴定
对实施例6制得的双抗进行活性鉴定，具体方法如下
(1)分别用NaHCO3溶液稀释好的PD-L1-Fc或者4-1BB-Fc100ul包被，4℃过夜；(2)PBST洗5遍；(3)每孔300ul的1％BSA 37℃封闭2h；(4)PBST洗5遍；(5)每孔100ul稀释好的一抗37℃孵育1h；(6)PBST洗5遍；(7)每孔100ul的4-1BB-biotin或者PD-L1-biotin样品37℃孵育1h；(8)PBST洗5遍；(9)加入100ul SA-HRP(1:5000PBS)37℃孵育1h；(10)PBST洗5遍；(11)每孔加100ul TMB显色液，室温，避光反应5-7min；(12)加50ul 2M的H2SO4终止反应，450nm处读取吸光值。
结果如图7A和图7B所示，图7A为包被4-1BB-Fc时的检测结果，图7B为包被PD-L1-Fc时的检测结果，结果表明，本发明的抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体可以同时结合4-1BB和PD-L1。
实施例9：双抗亲和力测定
通过生物膜层干涉技术(Bio-layer interferometry BLI)和Fortebio Red96仪器，测定实施例6制得的双抗针对重组人PD-L1的结合动力学，具体方法如下：
将实施例6制得的双抗用PBST缓冲液稀释至4ug/mL；将PD-L1抗原(由HEK293F表达，制备方法同实施例1，通过TEV酶酶切后去除Fc标签蛋白)用PBST缓冲液1.5倍梯度稀释六个浓度梯度(200nM，133.3nM，88.9nM，59.3nM，39.5nM，26.3nM)，设置仪器运行条件：温度30℃，Shake speed 1000rpm。使用已包被Protein A的探针(Fortebio Part No:18-5010)捕获抗体，捕获时间180s；结合梯度稀释的抗原，结合时间70s；解离时间120s；10mM甘氨酸(PH1.7)再生3次，每次5s。使用FortebioAnalysis9.0版本进行分析，1：1结合模型Global模式进行拟合，计算结合速率(Kon)，解离速率(Kdis)和解离常数KD。
结果如图8所示，双抗对PD-L1的亲和力为5.87E-08M。
类似地，通过生物膜层干涉技术(Bio-layer interferometry BLI)和FortebioRed96仪器，测定实施例6制得的双抗针对重组人4-1BB的结合动力学，具体方法如下：
将实施例6制得的双抗用PBST缓冲液稀释至5ug/mL，将4-1BB抗原(由HEK293F表达，制备方法类似于实施例1中PD-L1抗原的制备方法，通过TEV酶酶切后去除Fc标签蛋白)用PBST缓冲液2倍梯度稀释六个浓度梯度(100nM，50nM，25nM，12.5nM，6.25nM，3.125nM)，设置仪器运行条件：温度30℃，Shake speed 1000rpm。使用已包被Protein A的探针(Fortebio Part No:18-5010)捕获抗体，捕获时间60s；结合梯度稀释的抗原，结合时间70s；解离时间120s；10mM甘氨酸(PH1.7)再生2次，每次5s。使用FortebioAnalysis9.0版本进行分析，1：1结合模型Global模式进行拟合，计算结合速率(Kon)，解离速率(Kdis)和解离常数KD。
结果如图9所示，双抗对4-1BB的亲和力为2.24E-08M。
实施例10：FACS检测本发明双抗阻断PD-1/PD-L1以及4-1BB/4-1BBL结合的活性
检测本发明抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体阻断PD-1/PD-L1结合的活性，具体方法如下：
(1)每个样品取3×105个A375/PD-L1稳转细胞于PBS buffer中，分别加入稀释的抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体(实施例6制得)、PD-L1纳米抗体(实施例1制得)和阳性对照抗体(Tecentriq)(抗体浓度为：20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml，2.5ug/ml，1.25ug/ml，0.625ug/ml，0.3125ug/ml，0.1563u/ml，0.0781ug/ml，0.0391ug/ml，0.0196ug/ml，0.0098ug/ml)，每个样品100uL，所有样本中同时加入50ug/ml的hPD-1(ECD)-Fc-Biotin，4℃孵育20min；(2)PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测，使用graphpad prism 6软件进行数据处理。
结果如图10所示，候选双抗的IC50为1.194ug/ml，与阳性对照抗体(Tecentriq，IC50＝1.136ug/ml)相比，候选双抗具有与其性能相当的PD-L1/PD-1阻断活性；与PD-L1纳米抗体(IC50＝0.6437ug/ml)相比，本发明的双抗保留了较好的PD-L1/PD-1阻断活性。
检测本发明抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体阻断4-1BB/4-1BBL结合的活性，具体方法如下：
(1)每个样品取3×105个293T/4-1BB稳转细胞于PBS buffer中，分别加入稀释的抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体(实施例6制得)、4-1BB纳米抗体(实施例2制得)和阳性对照抗体(Utomilumab)(抗体浓度为：160ug/ml，80ug/ml，40ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml，2.5ug/ml，1.25u/ml，0.625ug/ml，0.3125ug/ml，0.1563ug/ml，0.0781ug/ml)，每个样品100uL，所有样本中同时加入0.6ug/ml的h4-1BBL(ECD)-Fc-Biotin，4℃孵育20min；(2)PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测，使用graphpad prism 6软件进行数据处理。
结果如图11所示，候选双抗的IC50为11.70ug/ml，与4-1BB纳米抗体(IC50＝4.64ug/ml)相比，保留了较好的4-1BB/4-1BBL阻断活性。
实施例11：荧光素酶报告基因系统检测双特异性抗体中PD-L1抗体的活性
通常使用混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction，MLR)可以通过检测IFN-γ的分泌来检测生物活性，但检测周期太长，需要4-5天。且这些方法需要使用原代细胞，由于来源于不同个体及操作的复杂性，检测的变异性很大。基于T细胞增殖、细胞毒性等的检测方法，同样由于需要使用原代细胞以及复杂的操作，并不适合作为通用的生物活性检测方法。PD-L1/PD-L1报告基因检测系统(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)可用于生物样品批次放行、稳定性检测、工艺开发等环节，用于评判PD-L1抗体药物的生物活性。当加入的PD-L1抗体有效阻断效应细胞(GS-J2/PD-L1)表面PD-L1和靶细胞(GS-C2/PD-L1)表面PD-L1的相互作用时，效应细胞内受NFAT元件调控的荧光素酶报告基因Luciferase表达上调。
利用该原理，将(1)每孔4000个GS-C2/PD-L1接种至96孔板中过夜培养；(2)分别对双特异性抗体(实施例6制得)、PD-L1纳米抗体(实施例1制得)和阳性对照抗体(Tecentriq)进行梯度稀释(66.67nM、22.22nM、7.41nM、2.47nM、0.82nM、0.27nM、0.09nM、0.03nM、0.01nM)，将稀释好的抗体分别与1x106个GS-J2/PD-L1细胞混合后加入到靶细胞中，37℃，5％CO2培养6小时；(3)加入Luciferase检测底物，室温反应5分钟后放入酶标仪读值。检测结果按照标准化数据(％)＝(RLU待测样本-RLU空白对照)/(RLUEC100 of Tecentriq–RLU空白对照)*100处理。
结果如图12所示，阳性对照抗体Tecentriq的EC50为0.6198ug/ml，PD-L1纳米抗体的EC50为0.3232ug/ml，双特异性抗体的EC50为0.3021ug/ml。结果表明，本发明的双特异性抗体的生物活性与PD-L1纳米抗体的活性相似，优于对照抗体Tecentriq。
实施例12：本发明双抗对T细胞激活的影响
检测方法如下：
(1)在对应的96孔细胞培养板中分别加入50ul的PBMC细胞，1E5/well；(2)将100ul抗体(终浓度：25nM，5nM，1nM，0.2nM，0.04nM，0.008nM，0nM)和50ul SEB(终浓度：0.1ug/ml)分别加入到对应的孔中；(3)37℃，5％CO2，培养72h；(4)用BDIL-2ELISA试剂盒检测上清中IL-2的含量。
结果如图13A和13B所示，在Donor 1(图13A)和Donor 2(图13B)中，候选双抗均显示出显著的对T细胞的激活作用，且激活作用显著强于单独的PD-L1纳米抗体和4-1BB纳米抗体。
实施例13：本发明双抗介导的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用具有PD-L1依赖性
(1)分离CD3+T细胞：复苏不同donor的PBMC细胞，用CD3试剂盒将PBMC中的CD3+T细胞分离出来。(2)将待测抗体和细胞细胞共孵育：每孔中加入1E5个T细胞和3E4个A375或者A375/PD-L1细胞，再加入50uL抗体混合液或者CD3抗体稀释液，混匀后置于培养箱中孵育72小时。(3)取孵育后的上清用ELISA分别检测乳酸脱氢酶和IFN-r含量，检测方法参见BD LotNO.55142试剂盒说明书以及Promega Lot NO.G1780试剂盒说明书。
结果如图14A和14B所示，候选双抗介导的T细胞对PD-L1过表达的A375杀伤作用显著优于单独的4-1BB纳米抗体和单独的PD-L1纳米抗体，然而候选双抗介导的T细胞对天然的A375细胞杀伤与单独的4-1BB纳米抗体和单独的PD-L1纳米抗体相比无明显差异；图14C和14D结果表明，候选双抗刺激T细胞/过表达PD-L1的A375细胞组合产生的IFNr量显著高于单独的4-1BB纳米抗体和单独的PD-L1纳米抗体，候选双抗刺激T细胞/天然A375细胞组合产生的IFNr量与单独的4-1BB纳米抗体和单独的PD-L1纳米抗体无显著差别。
上述实施例表明，本发明的抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体可以在HEK293F细胞中表达，能够进一步通过亲和层析纯化，并且仅经过一步纯化后的纯度可达到85％。所得到的双特异性抗体可以结合4-1BB阳性的BxPC3细胞,同时阻断细胞表面4-1BB和4-1BBL相互作用，此外，该双抗还能同时阻断细胞表面PD-L1与PD-1的相互作用。该抗体有较好的亲和力，同时具有良好的PD-L1抗体的生物学活性和4-1BB生物学活性，候选双抗能够显著激活T细胞，从而达到肿瘤杀伤的效果。由此，本发明申请的抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体将具有良好的应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海洛启生物医药技术有限公司
<120>抗4-1BB纳米抗体及其用途
<130> P2019-0957
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Phe
1 5 10 15
<210> 3
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Cys Met Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Ala Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser Ala
1 5 10 15
Arg Asp Lys Tyr
20
<210> 8
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Leu Ser Pro Ser
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Phe Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser Ala Arg
100 105 110
Asp Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcaccg ccagcggcta caacctgagc cccagctgca tgggctggtt caggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccttc accgacgccg acggcagcac caggtacgcc 180
gacagcgtga aggccaggtt caccatcagc agggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgacttcttc 300
agctactgca gcgtggtgtt cagggccagc gccagggaca agtacagggg ccagggcacc 360
ctggtgaccg tgagcagc 378
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Val
1 5 10 15
<210> 12
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Cys Met Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ile Cys Thr Gly Gly Gly Ser Pro
1 5
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ala Ala Asp Leu Leu Arg Ala Gly Thr Pro Leu Ser Ser Tyr Glu Phe
1 5 10 15
Asn Tyr
<210> 17
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Val Ile Cys Thr Gly Gly Gly Ser Pro Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Leu Leu Arg Ala Gly Thr Pro Leu Ser Ser Tyr Glu Phe
100 105 110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 18
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg ccagcggcta cacctacagc agcaactgca tgggctggtt caggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgtg atctgcaccg gcggcggcag ccccagctac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cgccgacctg 300
ctgagggccg gcacccccct gagcagctac gagttcaact actggggcca gggcaccctg 360
gtgaccgtga gcagc 375
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggggsggggs ggggsggggs 20
<210> 20
<211> 791
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Leu Ser Pro Ser
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Phe Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser Ala Arg
100 105 110
Asp Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
145 150 155 160
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Gly Val Ala Phe Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Ala Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser
245 250 255
Ala Arg Asp Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
275 280 285
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
290 295 300
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
305 310 315 320
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
325 330 335
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
340 345 350
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
355 360 365
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
370 375 380
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
385 390 395 400
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
405 410 415
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
420 425 430
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
435 440 445
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
450 455 460
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
465 470 475 480
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
485 490 495
Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
530 535 540
Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln
545 550 555 560
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Val Ile Cys Thr Gly Gly
565 570 575
Gly Ser Pro Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
580 585 590
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
595 600 605
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Leu Leu Arg Ala
610 615 620
Gly Thr Pro Leu Ser Ser Tyr Glu Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
625 630 635 640
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
645 650 655
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
660 665 670
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
675 680 685
Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg
690 695 700
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Val Ile Cys Thr Gly
705 710 715 720
Gly Gly Ser Pro Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
725 730 735
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
740 745 750
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Leu Leu Arg
755 760 765
Ala Gly Thr Pro Leu Ser Ser Tyr Glu Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
770 775 780
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
785 790
<210> 21
<211> 2373
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcaccg cctccggcta caacctgtcc ccctcctgca tgggctggtt caggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccttc accgacgccg acggctccac caggtacgcc 180
gactccgtga aggccaggtt caccatctcc agggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgacttcttc 300
tcctactgct ccgtggtgtt cagggcctcc gccagggaca agtacagggg ccagggcacc 360
ctggtgaccg tgtcctccgg cggcggcggc tccggcggcg gcggctccgg cggcggcggc 420
tccggcggcg gcggctccca ggtgcagctg caggagtccg gcggcggcct ggtgcagccc 480
ggcggctccc tgaggctgtc ctgcaccgcc tccggctaca acctgtcccc ctcctgcatg 540
ggctggttca ggcaggcccc cggcaagggc ctggagggcg tggccttcac cgacgccgac 600
ggctccacca ggtacgccga ctccgtgaag gccaggttca ccatctccag ggacaactcc 660
aagaacaccc tgtacctgca gatgaactcc ctgagggccg aggacaccgc cgtgtactac 720
tgcgccgccg acttcttctc ctactgctcc gtggtgttca gggcctccgc cagggacaag 780
tacaggggcc agggcaccct ggtgaccgtg tcctccgagt ccaagtacgg ccccccctgc 840
cccccctgcc ccgcccccga gttcctgggc ggcccctccg tgttcctgtt cccccccaag 900
cccaaggaca ccctgatgat ctccaggacc cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg 960
tcccaggagg accccgaggt gcagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac 1020
gccaagacca agcccaggga ggagcagttc aactccacct acagggtggt gtccgtgctg 1080
accgtgctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag 1140
ggcctgccct cctccatcga gaagaccatc tccaaggcca agggccagcc cagggagccc 1200
caggtgtaca ccctgccccc ctcccaggag gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc 1260
tgcctggtga agggcttcta cccctccgac atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag 1320
cccgagaaca actacaagac cacccccccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg 1380
tactccaggc tgaccgtgga caagtccagg tggcaggagg gcaacgtgtt ctcctgctcc 1440
gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgtccct gtccctgggc 1500
aagggcggcg gcggctccgg cggcggcggc tccggcggcg gcggctccgg cggcggcggc 1560
tcccaggtgc agctgcagga gtccggcggc ggcctggtgc agcccggcgg ctccctgagg 1620
ctgtcctgcg ccgcctccgg ctacacctac tcctccaact gcatgggctg gttcaggcag 1680
gcccccggca agggcctgga gggcgtggcc gtgatctgca ccggcggcgg ctccccctcc 1740
tacgccgact ccgtgaaggg caggttcacc atctccaggg acaacgccaa gaacaccctg 1800
tacctgcaga tgaactccct gagggccgag gacaccgccg tgtactactg cgccgccgac 1860
ctgctgaggg ccggcacccc cctgtcctcc tacgagttca actactgggg ccagggcacc 1920
ctggtgaccg tgtcctccgg cggcggcggc tccggcggcg gcggctccgg cggcggcggc 1980
tccggcggcg gcggctccca ggtgcagctg caggagtccg gcggcggcct ggtgcagccc 2040
ggcggctccc tgaggctgtc ctgcgccgcc tccggctaca cctactcctc caactgcatg 2100
ggctggttca ggcaggcccc cggcaagggc ctggagggcg tggccgtgat ctgcaccggc 2160
ggcggctccc cctcctacgc cgactccgtg aagggcaggt tcaccatctc cagggacaac 2220
gccaagaaca ccctgtacct gcagatgaac tccctgaggg ccgaggacac cgccgtgtac 2280
tactgcgccg ccgacctgct gagggccggc acccccctgt cctcctacga gttcaactac 2340
tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc tcc 2373

Claims (15)

1.一种抗4-1BB纳米抗体，其特征在于，所述抗4-1BB纳米抗体的互补决定区CDR为：
SEQ ID NO.:14所示的CDR1、SEQ ID NO.:15所示的CDR2和SEQ ID NO.:16所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体，其特征在于，所述的抗4-1BB纳米抗体还包含框架区FR，且所述的框架区FR为：
SEQ ID NO.:10所示的FR1、SEQ ID NO.:11所示的FR2、SEQ ID NO.:12所示的FR3和SEQID NO.:13所示的FR4。
3.如权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体，其特征在于，所述的抗4-1BB纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:17所示。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸；
或者，所述的宿主细胞表达权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体。
7.一种制备纳米抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在合适的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而获得含所述纳米抗体的培养物；和
(b)对步骤(a)中得到的培养物进行纯化和/或分离，所述的获得所述的纳米抗体。
8.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、或其组合。
9.如权利要求8所述的免疫偶联物，其特征在于，所述的可检测标记物包括放射性核素、金纳米颗粒/纳米棒。
10.如权利要求8所述的免疫偶联物，其特征在于，所述的偶联部分选自下组：毒素、细胞因子、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
11.权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体的用途，其特征在于，用于制备(a)用于检测4-1BB分子的试剂、试剂盒；(b)用于治疗肿瘤的药物。
12.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：(i)权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体、或权利要求8所述的免疫偶联物；以及(ii)药学上可接受的载体。
13.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：(i)权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
14.一种检测样品中4-1BB蛋白的非诊断非治疗性方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)将样品与如权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在4-1BB蛋白。
15.一种4-1BB蛋白检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包含：(i)权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体；以及(ii)检测学上可接受的载体。
CN202010328300.8A 2019-10-10 2019-10-10 抗4-1bb纳米抗体及其用途 Active CN112646031B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010328300.8A CN112646031B (zh) 2019-10-10 2019-10-10 抗4-1bb纳米抗体及其用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910958176.0A CN110627906B (zh) 2019-10-10 2019-10-10 抗pd-l1/4-1bb双特异性抗体及其用途
CN202010328300.8A CN112646031B (zh) 2019-10-10 2019-10-10 抗4-1bb纳米抗体及其用途

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910958176.0A Division CN110627906B (zh) 2019-10-10 2019-10-10 抗pd-l1/4-1bb双特异性抗体及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112646031A CN112646031A (zh) 2021-04-13
CN112646031B true CN112646031B (zh) 2021-12-07

Family

ID=68976314

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910958176.0A Active CN110627906B (zh) 2019-10-10 2019-10-10 抗pd-l1/4-1bb双特异性抗体及其用途
CN202010328300.8A Active CN112646031B (zh) 2019-10-10 2019-10-10 抗4-1bb纳米抗体及其用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910958176.0A Active CN110627906B (zh) 2019-10-10 2019-10-10 抗pd-l1/4-1bb双特异性抗体及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN110627906B (zh)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110627906B (zh) * 2019-10-10 2020-07-28 上海洛启生物医药技术有限公司 抗pd-l1/4-1bb双特异性抗体及其用途
CN112574309B (zh) * 2019-12-05 2023-06-16 启愈生物技术(上海)有限公司 一种抗pd-l1纳米抗体及其用途
CN113461825A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗pd-l2纳米抗体及其应用
US20230303698A1 (en) * 2020-06-30 2023-09-28 Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd Multispecific binding protein of immune cell engager, preparation therefor and application thereof
AU2021301927A1 (en) * 2020-06-30 2023-02-09 Nona Biosciences Co., Ltd. 4-1BB binding protein and application thereof
CN114106190A (zh) * 2020-08-31 2022-03-01 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗vegf/pd-l1双特异性抗体及其用途
CN114195894A (zh) * 2020-09-17 2022-03-18 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种靶向4-1bb的抗体及其应用
CN114195900B (zh) * 2020-09-17 2024-02-23 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗4-1bb/pd-l1双特异性抗体及其用途
CN116670169A (zh) * 2020-10-16 2023-08-29 魁尔斯弗生物治疗股份有限公司 与pd-l1结合的多特异性结合化合物
CN114437228B (zh) * 2020-10-30 2024-02-06 中国科学院生物物理研究所 一种il-2与抗体亚单位构成的双功能融合蛋白
WO2023000675A1 (zh) * 2021-07-23 2023-01-26 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 靶向pd-l1和4-1bb的双特异性抗体
CN114605541B (zh) * 2021-08-26 2023-08-29 北京大学深圳研究生院 一种抗4-1bb纳米抗体、编码基因及应用
IL311144A (en) * 2021-08-31 2024-04-01 Lanova Medicines Ltd Anti-1-4BB Nanobodies
WO2023093744A1 (zh) * 2021-11-25 2023-06-01 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种双特异性抗原结合蛋白
WO2023098785A1 (zh) * 2021-12-01 2023-06-08 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗4-1bb抗体及其用途
CN114736303A (zh) * 2022-03-17 2022-07-12 英诺湖医药(杭州)有限公司 抗pd-l1和4-1bb的双功能抗体及其医药用途
WO2024008032A1 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Formulations for anti-pd-l1/anti-4-1bb bispecific antibodies
WO2024051752A1 (en) * 2022-09-06 2024-03-14 I-Mab Biopharma Co., Ltd. Multispecific constructs and uses thereof
WO2024077547A1 (zh) * 2022-10-13 2024-04-18 达石药业(广东)有限公司 一种b7h3/pdl1双特异性抗体及其药物组合物及应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170226216A1 (en) * 2014-07-24 2017-08-10 Bluebird Bio, Inc. Bcma chimeric antigen receptors
US11274153B2 (en) * 2016-08-04 2022-03-15 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-PD-L1 nanobody and use thereof
CN107814845B (zh) * 2016-09-14 2021-02-09 浙江特瑞思药业股份有限公司 新的抗pd-1纳米抗体及其应用
CN109096396B (zh) * 2017-06-20 2022-01-04 华兰生物工程股份有限公司 一种抗pd-l1人源化纳米抗体及其应用
CN110144010B9 (zh) * 2018-02-14 2021-01-05 上海洛启生物医药技术有限公司 阻断型pd-l1驼源单域抗体及其用途
CN110627906B (zh) * 2019-10-10 2020-07-28 上海洛启生物医药技术有限公司 抗pd-l1/4-1bb双特异性抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN110627906B (zh) 2020-07-28
CN112646031A (zh) 2021-04-13
CN110627906A (zh) 2019-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112646031B (zh) 抗4-1bb纳米抗体及其用途
CN109096401B (zh) 抗Her2纳米抗体及其编码序列和用途
CN112745392B (zh) 抗pd-l1/cd47双特异性抗体及其用途
CN111718415B (zh) 一种抗tigit纳米抗体及其应用
CN112442122B (zh) 阻断型pd-1纳米抗体及其编码序列和用途
US20230167200A1 (en) Platform for constructing multispecific antibody
CN113307870B (zh) 抗il5纳米抗体及其应用
EP4215549A1 (en) Anti-4-1bb-anti-pd-l1 bispecific antibody, and pharmaceutical composition and use thereof
CN116261595A (zh) 抗vegf-抗pd-l1双特异性抗体、其药物组合物及用途
IL303474A (en) Anti-TSLP nanoparticles and their use
CN111825766B (zh) 抗il-4r单域抗体及其应用
US20230002503A1 (en) Nano-antibody targeting caix antigen and application thereof
EP4130041A1 (en) Anti-pd-l1 and pd-l2 antibody and derivatives and use thereof
CN114539415B (zh) 一种抗PD-L1/VEGF/TGF-β多特异性抗体及其用途
CN116554322A (zh) 一种靶向IL-18Rβ的抗体及其应用
CN114349864A (zh) 抗前列腺酸性磷酸酶抗体及其用途
CN116120450A (zh) 靶向人cd38分子的驼科纳米抗体制备和应用
CN117279950A (zh) 一种靶向il-18bp的抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20211025

Address after: 201203 Room 802, 8th floor, West Tower, building 1, No. 88, Shangke Road, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai

Applicant after: Tianjing Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd.

Address before: 201321 Room 201, building 10, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai

Applicant before: SHANGHAI NOVAMAB BIOPHARMACEUTICALS Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant