CN116670169A - 与pd-l1结合的多特异性结合化合物 - Google Patents

与pd-l1结合的多特异性结合化合物 Download PDF

Info

Publication number
CN116670169A
CN116670169A CN202180066258.XA CN202180066258A CN116670169A CN 116670169 A CN116670169 A CN 116670169A CN 202180066258 A CN202180066258 A CN 202180066258A CN 116670169 A CN116670169 A CN 116670169A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
bispecific antibody
heavy chain
variable region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180066258.XA
Other languages
English (en)
Inventor
顾哂达
陈士浩
L·施维默
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Quelsfer Biotherapy Co ltd
Original Assignee
Quelsfer Biotherapy Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Quelsfer Biotherapy Co ltd filed Critical Quelsfer Biotherapy Co ltd
Publication of CN116670169A publication Critical patent/CN116670169A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

公开了与PD‑L1结合的多特异性结合化合物，以及制备此类结合化合物的方法、包含此类结合化合物的组合物，包括药物组合物，以及它们用于治疗以PD‑L1表达为特征的病症的用途。

Description

与PD-L1结合的多特异性结合化合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月16日提交的美国临时专利申请序列号63/093,109的提交日的优先权权益，所述美国临时专利申请的公开内容以引用方式整体并入本文中。
序列表
本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2021年12月30日，命名为QLS-0002-WO_SL.txt，并且大小为228,930字节。
技术领域
本发明涉及与PD-L1结合的多特异性结合化合物。本发明进一步涉及制备此类结合化合物的方法、包含此类结合化合物的组合物(包括药物组合物)，以及它们用于治疗以PD-L1表达为特征的病症的用途。
背景技术
癌症是全世界死亡的主要原因。在晚期转移性癌症中，传统治疗方案，诸如放疗和化疗，在延长生存期方面效果有限。靶向疗法，诸如小分子抑制剂和抑制性单克隆抗体，已经在管理疾病进展方面取得了显著改善，但仍然局限于具有特定突变的癌症亚群或过表达可靶向受体的那些癌症亚群。此外，对这些疗法的抗性很常见，因为肿瘤细胞可以进一步突变或切换到替代信号传导通路，从而绕过药物的抑制效应。免疫疗法通过利用身体自身的免疫系统在抗癌方面具有新前景。例如，靶向PD-1和CTLA-4的检查点抑制剂已在推进该领域中的研发方面处于领先地位。多特异性抗体的开发已允许新的治疗方式。
PD-L1多特异性抗体旨在靶向PD-L1和一种或多种共刺激受体，诸如4-1BB。这种抗体以几种方式起作用。第一，它们与免疫抑制性的表达PD-L1的肿瘤细胞结合。第二，它们通过阻断PD-L1与其受体PD-1的相互作用来发挥典型检查点抑制剂的作用。第三，它们交联T细胞上的共刺激靶标，诸如4-1BB，这继而仅在表达PD-L1的肿瘤细胞存在下刺激T细胞增殖。此外，抗体的恒定区可包含消除Fcγ受体介导的功能(诸如抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的突变。因此，针对PD-L1的多特异性抗体具有仅限于肿瘤组织的强免疫响应，从而使正常组织免受往往在单独共刺激抗体时观察到的不希望毒性的影响。
发明内容
本发明的各方面包括与PD-L1和4-1BB结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：两个与PD-L1结合的结合单位，每个结合单位包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的CDR1序列；包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10的CDR1序列；包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的CDR3序列；以及两个与4-1BB结合的结合单位，每个结合单位包含单链Fv(scFv)，所述scFv包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16的CDR1序列；包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:17的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:18的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:22的CDR1序列；包含SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:23的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24的CDR3序列。
在一些实施方案中，所述两个与PD-L1结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的CDR1序列；包含SEQ ID NO:2的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:3的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:7的CDR1序列；包含SEQ ID NO:8的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:9的CDR3序列。在一些实施方案中，所述两个与PD-L1结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQID NO:4的CDR1序列；包含SEQ ID NO:5的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:6的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:10的CDR1序列；包含SEQ ID NO:11的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:12的CDR3序列。
在一些实施方案中，所述两个与4-1BB结合的结合单位各自包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:13的CDR1序列；包含SEQ ID NO:14的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:15的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:19的CDR1序列；包含SEQ ID NO:20的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:21的CDR3序列。
在一些实施方案中，所述两个与4-1BB结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:16的CDR1序列；包含SEQ ID NO:17的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:18的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:22的CDR1序列；包含SEQ ID NO:23的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:24的CDR3序列。
在一些实施方案中，每个结合单位中的所述CDR1序列、所述CDR2序列和所述CDR3序列存在于人VH框架或人VL框架中。在一些实施方案中，所述两个与PD-L1结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述两个与PD-L1结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，所述两个与PD-L1结合的结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:27具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述两个与PD-L1结合的结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，所述两个与PD-L1结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述两个与PD-L1结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:26。在一些实施方案中，所述两个与PD-L1结合的结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:28具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述两个与PD-L1结合的结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28。
在一些实施方案中，所述两个与4-1BB结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:29具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述两个与4-1BB结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，所述两个与4-1BB结合的结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:31具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述两个与4-1BB结合的结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，所述两个与4-1BB结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:30具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述两个与4-1BB结合的结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:30。在一些实施方案中，所述两个与4-1BB结合的结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO:32具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述两个与4-1BB结合的结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32。
在一些实施方案中，所述抗体进一步包含重链恒定区序列，所述重链恒定区序列包含CH1结构域、铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，所述重链恒定区序列包括野生型人IgG1恒定区序列(SEQ ID NO:92)。在一些实施方案中，所述重链恒定区序列包含L234A突变、L235A突变、G237A突变或其任何组合。在一些实施方案中，所述重链恒定区序列包含SEQ ID NO:93。
在一些实施方案中，所述抗体进一步包含轻链恒定区序列。在一些实施方案中，所述轻链恒定区序列包括人κ轻链恒定区序列(SEQ ID NO:91)。在一些实施方案中，所述轻链恒定区序列包括人λ轻链恒定区序列。
在一些实施方案中，在所述与4-1BB结合的结合单位中的每个结合单位中，所述重链可变区和所述轻链可变区通过接头序列连接。在一些实施方案中，所述接头序列包括G4S接头序列(SEQ ID NO:36)。在一些实施方案中，所述G4S接头序列(SEQ ID NO:36)包含SEQID NO:36、SEQ ID NO:37、或SEQ ID NO:38。
在一些实施方案中，所述第二结合单位中的每个第二结合单位通过接头序列连接至所述重链恒定区序列的C末端。在一些实施方案中，所述接头序列包括G4S接头序列(SEQID NO:36)。在一些实施方案中，所述G4S接头序列(SEQ ID NO:36)包含SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、或SEQ ID NO:38。
本发明的各方面包括一种与PD-L1和4-1BB结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:43的序列；(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:41的序列；(c)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:43的序列；以及(d)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:41的序列。
本发明的各方面包括一种与PD-L1和4-1BB结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:44的序列；(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:42的序列；(c)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:44的序列；以及(d)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:42的序列。
本发明的各方面包括与PD-L1和CD47结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：与PD-L1结合的第一结合单位，所述第一结合单位包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的CDR1序列；包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10的CDR1序列；包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的CDR3序列；以及与CD47结合的第二结合单位，所述第二结合单位包含单链Fv(scFv)，所述scFv包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:53的CDR1序列；包含SEQ ID NO:51或SEQ IDNO:54的的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:55的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:59的CDR1序列；包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:60的的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:61的CDR3序列。
在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的CDR1序列；包含SEQ ID NO:2的CDR2序列；以及包含SEQID NO:3的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:7的CDR1序列；包含SEQ ID NO:8的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:9的CDR3序列。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ IDNO:4的CDR1序列；包含SEQ ID NO:5的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:6的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:10的CDR1序列；包含SEQ ID NO:11的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:12的CDR3序列。
在一些实施方案中，所述与CD47结合的第二结合单位包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:50的CDR1序列；包含SEQ ID NO:51的CDR2序列；以及包含SEQID NO:52的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:56的CDR1序列；包含SEQ ID NO:57的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:58的CDR3序列。在一些实施方案中，所述与CD47结合的第二结合单位包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ IDNO:53的CDR1序列；包含SEQ ID NO:54的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:55的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:59的CDR1序列；包含SEQ ID NO:60的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:61的CDR3序列。
在一些实施方案中，每个结合单位中的所述CDR1序列、所述CDR2序列和所述CDR3序列存在于人VH框架或人VL框架中。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:27具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO:28具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28。
在一些实施方案中，所述与CD47结合的第二结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:62具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与CD47结合的第二结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:62。在一些实施方案中，所述与CD47结合的第二结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQID NO:64具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与CD47结合的第二结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:64。在一些实施方案中，所述与CD47结合的第二结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:63具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与CD47结合的第二结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:63。在一些实施方案中，所述与CD47结合的第二结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:65具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与CD47结合的第二结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:65。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体进一步包含重链恒定区序列，所述重链恒定区序列包含CH1结构域、铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，所述重链恒定区序列包括野生型人IgG1恒定区序列(SEQ ID NO:92)。在一些实施方案中，所述重链恒定区序列包含L234A突变、L235A突变、G237A突变或其任何组合。在一些实施方案中，所述重链恒定区序列包含SEQ ID NO:93。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体进一步包含轻链恒定区序列。在一些实施方案中，所述轻链恒定区序列包括人κ轻链恒定区序列(SEQ ID NO:91)。在一些实施方案中，所述轻链恒定区序列包括人λ轻链恒定区序列。
在一些实施方案中，在所述与CD47结合的第二结合单位中，所述重链可变区和所述轻链可变区通过接头序列连接。在一些实施方案中，所述接头序列包括G4S接头序列(SEQID NO:36)。在一些实施方案中，所述G4S接头序列(SEQ ID NO:36)包含SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、或SEQ ID NO:38。
在一些实施方案中，所述第二结合单位中的每个第二结合单位通过接头序列连接至所述重链恒定区序列的C末端。在一些实施方案中，所述接头序列包括G4S接头序列(SEQID NO:36)。在一些实施方案中，所述G4S接头序列(SEQ ID NO:36)包含SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、或SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，所述双特异性抗体进一步包含重链恒定区，所述重链恒定区包含一个或多个促进两种不同重链多肽的异二聚化的杵臼结构突变。
本发明的各方面包括一种与PD-L1和CD47结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:66的序列；(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:67的序列；以及(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:68的序列。
本发明的各方面包括一种与PD-L1和CD47结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:69的序列；(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:70的序列；以及(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:71的序列。
本发明的各方面包括这样的抗体，所述抗体与PD-L1结合并包含一个或多个IL15多肽，所述一个或多个IL15多肽融合至所述双特异性抗体的重链多肽亚基的C末端，所述抗体包含：与PD-L1结合的第一结合单位，所述第一结合单位包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的CDR1序列；包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10的CDR1序列；包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的CDR3序列；以及IL15多肽，所述IL15多肽包含与SEQ ID NO:86至SEQ ID NO:90中的任一者具有至少95％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的CDR1序列；包含SEQ ID NO:2的CDR2序列；以及包含SEQID NO:3的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:7的CDR1序列；包含SEQ ID NO:8的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:9的CDR3序列。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含：重链可变区，所述重链可变区包含：包含SEQ IDNO:4的CDR1序列；包含SEQ ID NO:5的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:6的CDR3序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:10的CDR1序列；包含SEQ ID NO:11的CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:12的CDR3序列。
在一些实施方案中，IL15多肽包含SEQ ID NO:86至SEQ ID NO:90中任一者的序列。在一些实施方案中，所述IL15多肽通过接头序列连接至所述抗体的所述重链多肽亚基。在一些实施方案中，所述接头序列包含SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQID NO:49、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128中任一者的序列。
在一些实施方案中，所述CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列存在于人VH框架或人VL框架中。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQID NO:27具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:28具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28。
在一些实施方案中，所述抗体进一步包含重链恒定区序列，所述重链恒定区序列包含CH1结构域、铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，所述重链恒定区序列包括野生型人IgG1恒定区序列(SEQ ID NO:92)。在一些实施方案中，所述重链恒定区序列包含L234A突变、L235A突变、G237A突变或其任何组合。在一些实施方案中，所述重链恒定区序列包含SEQ ID NO:93。
在一些实施方案中，所述抗体进一步包含轻链恒定区序列。在一些实施方案中，所述轻链恒定区序列包括人κ轻链恒定区序列(SEQ ID NO:91)。在一些实施方案中，所述轻链恒定区序列包括人λ轻链恒定区序列。
在一些实施方案中，所述抗体进一步包含重链恒定区，所述重链恒定区包含一个或多个促进两种不同重链多肽的异二聚化的杵臼结构突变。
本发明的各方面包括一种双特异性抗体，所述双特异性抗体与PD-L1结合并包含IL15多肽，所述IL15多肽融合至每个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:104的序列；(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:105的序列；(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:105的序列；以及(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:104的序列。
本发明的各方面包括一种双特异性抗体，所述双特异性抗体与PD-L1结合并包含IL15多肽，所述IL15多肽融合至每个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:106的序列；(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:107的序列；(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:107的序列；以及(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:106的序列。
本发明的各方面包括一种双特异性抗体，所述双特异性抗体与PD-L1结合并包含IL15多肽，所述IL15多肽融合至每个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:108的序列；(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:109的序列；(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:110的序列；以及(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:108的序列。
本发明的各方面包括一种双特异性抗体，所述双特异性抗体与PD-L1结合并包含IL15多肽，所述IL15多肽融合至一个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:111的序列；(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:112的序列；(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:113的序列；以及(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:111的序列。
本发明的各方面包括一种双特异性抗体，所述双特异性抗体与PD-L1结合并包含IL15多肽，所述IL15多肽融合至一个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:114的序列；(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:115的序列；(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:116的序列；以及(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:114的序列。
本发明的各方面包括一种双特异性抗体，所述双特异性抗体与PD-L1结合并包含IL15多肽，所述IL15多肽融合至每个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:117的序列；(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:118的序列；(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:119的序列；以及(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:117的序列。
本发明的各方面包括包含如本文所述的抗体的药物组合物。
本发明的各方面包括用于治疗以PD-L1表达为特征的病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者施用如本文所述的抗体或如本文所述的药物组合物。
本发明的各方面包括如本文所述的抗体在用于治疗以PD-L1表达为特征的病症的药物的制备中的用途。
本发明的各方面包括如本文所述的抗体，所述抗体用于治疗以PD-L1表达为特征的病症。在一些实施方案中，所述病症是癌症。
本发明的各方面包括一种编码如本文所述的抗体的多核苷酸、一种包含如本文所述的多核苷酸的载体和一种包含如本文所述的根据权利要求所述的载体的细胞。
本发明的各方面包括一种产生如本文所述的抗体的方法，所述方法包括使如本文所述的细胞在允许表达所述抗体的条件下生长，以及从所述细胞中分离所述抗体。
本发明的各方面包括一种治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的个体施用有效剂量的如本文所述的抗体或如本文所述的药物组合物。
这些和另外的方面将在包括实施例的本公开的剩余部分中进一步解释。
附图说明
图1，小图A，是示出所示抗体构建体与表达人PD-L1的HEK293细胞的结合的图表。
图1，小图B，是示出所示抗体构建体与表达人4-1BB的HEK293细胞的结合的图表。
图1，小图C，是示出所示抗体构建体针对人PD-L1和人4-1BB的EC50值的表格。
图2，小图A和小图B，分别是示出抗体构建体与HIS标记的PD-L1和4-1BB的结合动力学的图表。
图2，小图C，是示出与PD-L1和4-1BB结合的KD值的表格。
图3，小图A，是示出所示抗体构建体与表达食蟹猴PD-L1的HEK293细胞的结合的图表。
图3，小图B，是示出所示抗体构建体与表达食蟹猴4-1BB的HEK293细胞的结合的图表。
图3，小图C，是示出所示抗体构建体针对食蟹猴PD-L1和食蟹猴4-1BB的EC50值的表格。
图4，小图A是示出所示抗体构建体在表达PD-L1的HEK293细胞中的PD-1阻断活性的图表。
图4，小图B，是示出所示抗体构建体在表达4-1BB的HEK293细胞中的4-1BBL阻断活性的图表。
图4，小图C，是示出所示抗体构建体针对PD-1和4-1BBL的IC50值的表格。
图5，小图A，是示出所示抗体构建体的双功能ELISA结合随浓度变化的图表。
图5，小图B，是示出所示抗体构建体的NF-kB报道分子活性随抗体浓度变化的图表。
图6，小图A和小图B，是分别示出来自用抗CD3抗体(OKT3)刺激然后与PD-L1+A431细胞连同指示浓度的所示抗体构建体共培养的人PBMC的IL2释放和IFNγ释放的图表。
图6，小图C，是示出来自用抗CD3抗体(OKT3)刺激然后在有和没有PD-L1+A431细胞连同指示浓度的所示抗体构建体的情况下培养的人PBMC的IL2释放的图表。
图7，小图A，是示出在SEB刺激测定中使用指定浓度的所示抗体构建体的IL2释放的图表。
图7，小图B是示出在抗CD3抗体(OKT3)和PD-L1+A431细胞以及指定浓度的所示抗体构建体存在下CD8+T细胞增殖的图表。
图8，小图A，是示出对于使用指定剂量的所示抗体构建体进行治疗的MC38小鼠肿瘤模型，肿瘤体积随初始剂量后天数的变化的图表。
图8，小图B，是示出在研究结束时采集的每个剂量组的肿瘤浸润免疫细胞(CD8+T细胞)的图表。
图9，小图A，是示出对于使用指定剂量的所示抗体构建体进行治疗的A431人类肿瘤模型，肿瘤体积随初始剂量后天数的变化的图表。
图9，小图B，是示出在研究结束时采集的每个剂量组的肿瘤浸润免疫细胞(CD8+T细胞)的图表。
图10是示出在取自加速温度应力测试的QL301的HPLC-SEC曲线中单体、聚集体和片段的计算百分比的表格。
图11，小图A，是示出针对在人血清中温育7天后并且作为储备对照的QL301，双功能ELISA结合随抗体浓度的变化的图表。
图11，小图B，是示出使用指定浓度的经人血清孵育和作为储备对照的QL301抗体时，在SEB刺激测定中从PBMC的IL2释放随抗体浓度的变化的图表。
图12，小图A，是PD-L1-CD47双特异性抗体的示意图。
图12，小图B是示出与PD-L1和CD47的ELISA结合随抗体浓度的变化的图表。
图13，小图A至小图E，是示出指定抗体构建体与指定细胞的结合随抗体浓度的变化的一系列图表。
图14是示出所示CD47-PD-L1双特异性抗体构建体对经刺激的A431细胞的PD-1阻断活性随抗体浓度的变化的图表。
图15是示出所示CD47-PD-L1双特异性抗体构建体对huPD-L1+HEK293细胞的PD-1阻断活性随抗体浓度的变化的图表。
图16，小图A，是示出所示CD47-PD-L1双特异性抗体构建体对A431细胞的SIRPα阻断随抗体浓度的变化的图表。
图16，小图B，是示出所示CD47-PD-L1双特异性抗体构建体对huCD47+CHO细胞的SIRPα阻断随抗体浓度的变化的图表。
图17，小图A，是示出在使用指定浓度的所示CD47-PD-L1抗体构建体时Raji细胞的抗体介导的吞噬作用的图表。
图17，小图B，是示出在使用指定浓度的所示CD47-PD-L1抗体构建体时MM.1S细胞的抗体介导的吞噬作用的图表。
图18，小图A和小图B，是示出对于两个不同的RBC供体，在指定抗体浓度下，所示CD47-PD-L1双特异性抗体与红细胞的结合的图表。
图19是示出由指定浓度的所示抗体构建体诱导的红细胞血凝的图像。
图20，小图A至小图F，是示出在ICR-SCID小鼠中的A431、hPBMC共移植肿瘤模型中，肿瘤体积随天数变化的一系列图表。剂量组G1至G5代表不同的抗体构建体或对照(PBS)。
图21，小图A至小图F，是示出来自图20中所述的肿瘤模型的功效终点的图表。
图22，小图A至小图F，是示出在NOD-SCID小鼠中的A431、hPBMC共移植肿瘤模型中，肿瘤体积随天数变化的一系列图表。剂量组G1至G5代表不同的抗体构建体或对照(PBS)。
图23，小图A至小图F，是在其C末端处包含IL15融合体的各种双特异性抗体构建体的示意图。
图24，小图A至小图C，是示出在指定抗体浓度下所示PD-L1-IL15双特异性抗体构建体与指定细胞的结合的一系列图表。
图25，小图A至小图C，是示出在指定浓度下NK92细胞或M07e细胞响应于所示PD-L1-IL15双特异性抗体构建体的增殖的代表性示例的一系列图表。
图26，小图A和小图B，是示出使用指定浓度的所示PD-L1-IL15双特异性抗体或单克隆抗PD-L1或同种型对照IL15抗体在MO7e细胞上诱导pSTAT5的图表。
图27，小图A至小图C，是示出指定细胞类型响应于指定浓度的PD-L1-IL15双特异性抗体暴露的增殖的一系列图表。
图28，小图A至小图D，是示出指定细胞类型响应于指定浓度的PD-L1-IL15双特异性抗体暴露的增殖的一系列图表。
图29，小图A至小图D，是示出指定细胞类型响应于指定浓度的PD-L1-IL15双特异性抗体暴露的增殖的一系列图表。
图29，小图E，是示出用于染色的抗体(列出的BioLegend目录号)的表格。
图30，小图A至小图E，是示出针对所示细胞类型、以及所示的PD-L1-IL15双特异性抗体构建体和给药方案，细胞计数随时间的变化的一系列图表。
图31，小图A至小图F，是示出针对所示细胞类型、以及所示的PD-L1-IL15双特异性抗体构建体和给药方案，细胞计数随时间的变化的一系列图表。
图32，小图A至小图D，是示出C57BL/6和NSG小鼠中所示PD-L1-IL15双特异性抗体构建体的药代动力学性质的一系列图表。
图33，小图A至小图F，是示出指定的剂量的所示PD-L1-IL15抗体构建体对表达PD-L1的MC38鼠结肠癌细胞的肿瘤生长抑制的一系列图表。
图33，小图G，是示出肿瘤体积随肿瘤再攻击后天数的变化的图表。
图34，小图A至小图G，是示出指定剂量的所示PD-L1-IL15双特异性抗体构建体对与人PBMC肿瘤模型共移植的A431异种移植物的肿瘤生长抑制的一系列图表。
图35，小图A至小图G，是示出取自从与用图34中所指示的剂量的所示PD-L1-IL15双特异性抗体构建体处理的人PBMC肿瘤模型共移植的A431异种移植物分离的肿瘤的细胞的表型分析的一系列图表。
图36，小图A至小图G，是示出取自从与用图34中所指示的剂量的所示PD-L1-IL15双特异性抗体处理的人PBMC肿瘤模型共移植的A431异种移植物分离的肿瘤的细胞的表型分析的一系列图表。
图37，小图A至小图E，是示出在C57BL/6小鼠中，指定的剂量的所示PD-L1-IL15抗体构建体对表达PD-L1的MC38鼠结肠癌细胞的肿瘤生长抑制的一系列图表。
图38，小图A至小图F，是示出取自从与用图37中所指示的剂量的所示PD-L1-IL15双特异性抗体构建体处理的MC38鼠结肠癌肿瘤模型分离的肿瘤的细胞的表型分析的一系列图表。
图39，小图A至小图G，是示出指定剂量的所示PD-L1-IL15双特异性抗体对CD17-SCID小鼠中与人PBMC共移植的NCI-H1650细胞的肿瘤生长抑制的一系列图表。
图40，小图A，是双特异性PD-L1x4-1BB抗体QL301的模型，所述抗体具有两个相同的与PD-L1结合的结合区和两个相同的与4-1BB结合的scFv。
图40，小图B，是已经由QL301双特异性抗体交联的肿瘤细胞和T细胞的图示。
图41，小图A和小图B，是示出两种不同供体的由双特异性PD-L1xCD47抗体介导的RBC吞噬％的图表。
图42是示出所示PD-L1-IL15抗体构建体的结合活性的图表。
图43是示出NK92细胞响应于所示PD-L1-IL15抗体构建体的增殖的图表。
图44，小图A和小图B，是示出根据本发明的一些实施方案使用PD-L1-4-1BB双特异性抗体构建体在恒河猴中进行重复剂量毒理学研究时观察到的AST水平和ALT水平的图表。
图45是示出根据本发明的一些实施方案使用PD-L1-CD47双特异性抗体构建体，在NOG小鼠肿瘤模型中的A375肿瘤生长抑制的图表。
图46是示出根据本发明的实施方案使用PD-L1-CD47双特异性抗体构建体，在NOG小鼠肿瘤模型中的Raji肿瘤生长抑制的图表。
图47是示出根据本发明的实施方案使用PD-L1-CD47双特异性抗体构建体在食蟹猴中进行重复剂量毒理学研究时观察到的红细胞计数的图表。
图48是示出根据本发明的实施方案使用PD-L1-IL15-T2A构建体的小鼠交叉反应替代物，在C57BL/6小鼠中进行的MC38肿瘤模型中观察到的cDC1刺激的图表。
具体实施方式
除非另外指示，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术是在本领域的技术范围内。此类技术在文献中得到充分解释，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第二版(Sambrook等人,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编,1984)；“Animal CellCulture”(R.I.Freshney编,1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人编,1987，并定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis等人编,1994)；“A Practical Guide toMolecular Cloning”(Perbal Bernard V.,1988)；“Phage Display:A LaboratoryManual”(Barbas等人,2001)；Harlow,Lane和Harlow,Using Antibodies:A LaboratoryManual:Portable Protocol No.I,Cold Spring Harbor Laboratory(1998)；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory；(1988)。
提供值的范围时，应理解除非上下文另外明确指出，否则介于该范围上下限之间的每个居中值，到下限单位的十分之一，及规定范围内的任何其它规定值或居中值，涵盖在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本发明内，以规定范围内任何明确排除的限值为条件。当规定范围包括一个或两个限值时，排除了那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本发明中。
除非另外指示，否则本文中的抗体残基均是根据Kabat编号系统(例如Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))进行编号。
在以下描述中，阐述了许多具体细节以提供对本发明的更全面理解。然而，对于本领域技术人员将显而易见的是，可以在没有这些特定细节中的一个或多个特定细节的情况下实践本发明。在其他情况下，没有描述本领域技术人员所熟知的众所周知的特征和过程，以避免混淆本发明。
本公开通篇所引用的所有参考文献(包括专利申请和公布)均以全文引用的方式并入本文中。
I.定义
“包含”是指在组合物/方法/试剂盒中需要所列举的要素，但是可以包括其他要素以形成在权利要求书的范围内的组合物/方法/试剂盒等。
“基本上由……组成”意指将所描述的组合物或方法的范围限制为不实质上影响本发明的基本和新颖特征的规定材料或步骤。
“由……组成”意指从所述组合物、方法或试剂盒中排除权利要求书中未规定的任何要素、步骤或成分。
本文中的抗体残基是根据Kabat编号系统和EU编号系统进行编号。当提及可变结构域中的残基(重链的大约残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，一般使用“EU编号系统”或“EU指数”(例如Kabat等人,同上中报道的EU指数)。“如Kabat中的EU指数”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文中另外规定，否则对抗体可变结构域中的残基编号的提及意指通过Kabat编号系统进行的残基编号。除非本文中另外规定，否则对抗体恒定结构域中的残基编号的提及意指通过EU编号系统进行的残基编号。
抗体也被称为免疫球蛋白，惯常至少包含一条重链和一条轻链，其中所述重链和轻链的氨基末端结构域在序列上是可变的，因此通常被称为可变区结构域或可变重(VH)或可变轻(VL)结构域。所述两个结构域惯常缔合以形成特异性结合区，但是如此处将讨论的，特异性结合也可用仅重链可变序列获得，并且在本领域中已知并且使用多种非天然的抗体构型。
“功能性”或“生物活性”抗体或结合化合物是能够在结构、调节、生化或生物物理事件中发挥一种或多种活性的抗体或结合化合物。例如，功能性抗体或其他结合化合物可以具有特异性结合抗原的能力，并且所述结合可继而引起或改变细胞或分子事件，诸如信号转导或酶促活性。功能性抗体或其他结合化合物也可以阻断受体的配体活化或用作激动剂或拮抗剂。抗体或其他结合化合物发挥一种或多种活性的能力取决于若干因素，包括多肽链的正确折叠和装配。
本文中术语“抗体”以最广泛含义使用并且特定地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、单体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、三链抗体、单链Fv(scFv)、纳米抗体等，并且还包括抗体片段，只要它们展现出期望的生物活性即可(Miller等人(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠科、人、人源化、嵌合的，或来源于其他物种。
术语抗体可提及全长重链、全长轻链、完整免疫球蛋白分子；或这些多肽中的任何多肽的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合感兴趣的靶标的抗原的抗原结合位点的多肽或其部分，此类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫疾病相关联的自身免疫抗体的细胞。本文所公开的免疫球蛋白可为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子，包括具有提供降低或增强的效应子细胞活性的改变的Fc部分的经工程化的亚类。免疫球蛋白可源自任何物种。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体的群体中获得的抗体，即构成该群体的各个抗体除了可能少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体为高度特异的，针对单一抗原位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过由Kohler等人(1975)Nature 256:495首次描述的杂交瘤方法制备，或者也可以经由重组蛋白质生产方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备。
与抗体结合使用的术语“可变”是指事实上抗体可变结构域的某些部分在抗体之间在序列上有很大差异并且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的整个可变结构域中并非均匀分布。在轻链可变结构域和重链可变结构域两者中，所述可变性集中在三个称为高变区的区段中。可变结构域的更加高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，所述四个FR大多采用通过三个高变区连接的β折叠构型，所述连接形成了环连接，并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语"高变区"当在本文中使用时是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自重链可变结构域中的“高变环”残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)的那些残基；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基为除了入本文所定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
示例性CDR名称在本文中示出，然而本领域技术人员应理解，通常使用多种CDR定义，包括Kabat定义(参见“Zhao等人A germline knowledge based computationalapproach for determining antibody complementarity determining regions.”MolImmunol.2010；47:694–700)，所述定义是基于序列变异性并且是最常用的。Chothia定义是基于结构环区的位置(Chothia等人“Conformations of immunoglobulin hypervariableregions.”Nature.1989；342:877–883)。替代的感兴趣的CDR定义包括但不限于由以下公开的那些：Honegger,“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variabledomains:an automatic modeling and analysis tool.”J Mol Biol.2001；309:657-670；Ofran等人“Automated identification of complementarity determining regions(CDRs)reveals peculiar characteristics of CDRs and B cell epitopes.”JImmunol.2008；181:6230-6235；Almagro“Identification of differences in thespecificity-determining residues of antibodies that recognize antigens ofdifferent size:implications for the rational design of antibody repertoires.”J Mol Recognit.2004；17:132–143；以及Padlan等人“Identification of specificity-determining residues in antibodies.”Faseb J.1995；9:133–139.，这些文献中的每一者以引用方式特定地并入本文中。
如本文所用的术语“多特异性结合化合物”意指包含两个或更多个抗原结合位点的结合化合物。根据本发明的实施方案的多特异性结合化合物可以是抗体样分子，所述抗体样分子包含、基本上由或由两个、三个或四个多肽亚基组成，所述多肽亚基中的任何多肽亚基可包含一个或多个具有对靶抗原(例如，PD-L1)的结合亲和力的可变区结构域。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含一起形成结合单位的一对可变区结构域(例如，重链可变区结构域和轻链可变区结构域)。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含一对单链Fv(scFv)形式的可变区结构域，其中第一可变区结构域和第二可变区结构域通过接头连接，并一起形成结合单位。主题多特异性结合化合物可以具有结合单位的任何合适的组合或构型，包括但不限于本文所述的特定构型。
本文所述的多特异性结合化合物可属于任何免疫球蛋白亚类，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE亚类。在一个特定实施方案中，所述多特异性结合化合物为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的，特别是IgG1亚型的。改变效应子功能的CH结构域的修饰在本文中进一步描述。
如本文所用的“完整抗体链”是包含全长可变区和全长恒定区(Fc)的抗体链。针对分泌的IgG，完整“常规”抗体包含完整轻链和完整重链，以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域、CH1、铰链、CH2和CH3。其他同种型(诸如IgM或IgA)可具有不同的CH结构域。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，其是指可归因于抗体的Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变异Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的示例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；以及细胞表面受体的下调。恒定区变体包括那些改变效应子概况、与Fc受体的结合等的变体。
取决于其重链的Fc(恒定结构域)的氨基酸序列，抗体和各种抗原结合蛋白可被提供为不同类别。有五种主要类别的重链Fc区：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与不同抗体类别对应的Fc恒定结构域可分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。Ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(Roux等人(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund等人(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US 2005/0048572；US 2004/0229310)。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列分配为两种类型(被称为κ和λ)中的一种类型。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。效应子功能的非限制性示例包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；ADCP；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调，等等。此类效应子功能通常需要Fc区与受体(例如，FcγRI；FcγRIIA；FcγRIIB1；FcγRIIB2；FcγRIIIA；FcγRIIIB受体、以及低亲和力FcRn受体)相互作用；并且可以使用本领域已知的各种测定来评定。“死的”或“沉默的”Fc是已经突变以保留与例如延长血清半衰期有关的活性，但不会激活高亲和力Fc受体的Fc，或具有降低的对Fc受体的亲和力的Fc。
“天然序列Fc区”包含与自然中存在的Fc区的氨基酸序列同一的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括例如天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及它们的天然存在的变体。
“变体Fc区”包含由于至少一种氨基酸修饰(优选一个或多个氨基酸取代)而区别于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中存在约一个至约十个氨基酸取代，优选地约一个至约五个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并且最优选地与其具有至少约90％同源性，更优选地与其具有至少约95％同源性。
人IgG1氨基酸序列由UniProtKB号P01857提供，所述氨基酸序列以引用方式整体并入本文。人IgG2氨基酸序列由UniProtKB号P01859提供，所述氨基酸序列以引用方式整体并入本文。人IgG3氨基酸序列由UniProtKB号P01860提供，所述氨基酸序列以引用方式整体并入本文。人IgG4氨基酸序列由UniProtKB号P01861提供，所述氨基酸序列以引用方式整体并入本文。
变体Fc序列可在CH2区中包含三个氨基酸取代，以减少EU索引位置234、235和237处的FcγRI结合(参见Duncan等人，(1988)Nature 332:563；Hezareh等人，(2001)J.Virology 75:12161；美国专利号5,624,821，这些文献的公开内容以引用方式整体并入本文)。在一些实施方案中，变体Fc序列可包含以下氨基酸取代：L234A；L235A；和G237A。当这三个氨基酸取代存在于IgG1 Fc序列中时，它们可被称为G1AAA。
在EU索引位置330和331处的补体C1q结合位点中的两个氨基酸取代降低补体固定(参见Tao等人，J.Exp.Med.178:661(1993)以及Canfield和Morrison,J.Exp.Med.173:1483(1991))。在位置233-236处的人IgG1或IgG2残基以及在位置327、330和331处的IgG4残基中的取代极大地降低了ADCC和CDC(参见例如Armour KL.等人,1999Eur J Immunol.29(8):2613-24；和Shields RL.等人,2001.J Biol Chem.276(9):6591-604)。
其他Fc变体也是可能的，包括但不限于其中缺失能够形成二硫键的区，或其中在天然Fc的N末端处消除某些氨基酸残基，或向其中添加甲硫氨酸残基的Fc变体。因此，在一些实施方案中，结合化合物的一个或多个Fc部分可在铰链区中包含一个或多个突变以消除二硫键键合。在又一个实施方案中，可完全去除Fc的铰链区。在又一个实施方案中，结合化合物可包含Fc变体。
此外，可通过取代(突变)、缺失或添加氨基酸残基以实现补体结合或Fc受体结合来构建Fc变体，以去除或大体上降低效应子功能。例如但不限于，缺失可发生于补体结合位点，诸如C1q结合位点中。用于制备免疫球蛋白Fc片段的此类序列衍生物的技术公开于国际专利公布号WO 97/34631和WO 96/32478中。此外，Fc结构域可以通过磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙酰化、酰胺化等进行修饰。
术语“含Fc区的抗体”是指包含Fc区的抗体。可例如在抗体纯化期间或通过编码所述抗体的核酸的重组工程化来去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，根据本发明的具有Fc区的抗体可包括具有或不具有K447的抗体。
本发明的各方面包括具有多特异性构型的抗体，所述多特异性构型包括但不限于双特异性、三特异性等。多种方法和蛋白质构型是已知的并且用于双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等中。
已经通过重组地融合两种或更多种抗体的可变结构域开发了多种用于生产多价人工抗体的方法。在一些实施方案中，多肽上的第一结合结构域和第二抗原结合结构域通过多肽接头连接。此类多肽接头的一个非限制性示例是GS接头，所述GS接头具有四个甘氨酸残基之后一个丝氨酸残基的氨基酸序列，并且其中所述序列重复n次，其中n是范围为1至约10，诸如2、3、4、5、6、7、8或9的整数(SEQ ID NO:133)。此类接头的非限制性示例包括GGGGS(SEQ ID NO:36)(n＝1)和GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)(n＝2)。也可使用其他合适的接头，并且所述接头描述于例如Chen等人，Adv Drug Deliv Rev.2013年10月15日；65(10):1357-69中，该文献的公开内容以引用方式整体并入本文中。附加的接头序列在本文别处描述，并且可以以任何合适的构型并入主题抗体中。
如本文所述的抗体和多特异性结合化合物可呈二聚体形式，在所述二聚体中两条重链以二硫键键合，或以其他方式彼此共价或非共价附接，并且可任选地在所述CH结构域中的两个或更多个CH结构域之间包含不对称界面以促进多肽链之间的适当配对(通常称为“杵臼结构(knobs-into-holes)”界面)。用于重链异二聚化的杵臼结构抗体工程技术例如在Ridgway等人，Protein Eng.1996年7月；9(7):17-21和美国专利号8,216,805中讨论，该文献的公开内容以引用方式整体并入本文。包含不对称界面的Fc区在本文中可以用缩写“KiH”指代，意指杵臼结构。例如，本发明的各方面包括一种变体Fc区序列，诸如G1AAA序列，所述序列包含不对称界面，并且在本文中被称为“G1AAA KiH”。
术语“PD-L1”和“程序性死亡配体1”是指任何人类和非人类动物物种的PD-L1蛋白，并且特定地包括人类PD-L1以及非人类哺乳动物的PD-L1。
如本文所用的术语“人PD-L1”包括人PD-L1(UniProt Q9NZQ7)的任何变体、同种型和物种同源物，而无论其来源或制备方式如何。因此，“人PD-L1”包括细胞天然表达的人PD-L1和在用人PD-L1基因转染的细胞上表达的PD-L1。
术语“抗PD-L1抗体”、“PD-L1抗体”、“抗PD-L1结合化合物”和“PD-L1结合化合物”在本文中可互换使用，以指代如本文所定义的抗体或结合化合物，所述抗体或结合化合物免疫特异性地与PD-L1，包括如本文所定义的人PD-L1结合。
术语“4-1BB”是指任何人和非人动物物种的4-1BB蛋白，并且特定地包括人4-1BB以及非人哺乳动物的4-1BB。
如本文所用的术语“人4-1BB”包括人4-1BB(UniProt Q07011)的任何变体、同种型和物种同源物，而无论其来源或制备方式如何。因此，“人4-1BB”包括细胞天然表达的人4-1BB和在用人4-1BB基因转染的细胞上表达的4-1BB。
术语“抗4-1BB抗体”、“4-1BB抗体”、“抗4-1BB结合化合物”和“4-1BB结合化合物”在本文中可互换使用，以指代如本文所定义的抗体或结合化合物，所述抗体或结合化合物免疫特异性地与4-1BB，包括如本文所定义的人4-1BB结合。
术语“CD47”和“白细胞表面抗原CD47”是指任何人类和非人类动物物种的CD47蛋白，并且特定地包括人类CD47以及非人类哺乳动物的CD47。
如本文所用的术语“人CD47”包括人CD47(UniProt Q08722)的任何变体、同种型和物种同源物，而无论其来源或制备方式如何。因此，“人CD47”包括细胞天然表达的人CD47和在用人CD47基因转染的细胞上表达的CD47。
术语“抗CD47抗体”、“CD47抗体”、“抗CD47结合化合物”和“CD47结合化合物”在本文中可互换使用，以指代如本文所定义的抗体或结合化合物，所述抗体或结合化合物免疫特异性地与CD47，包括如本文所定义的人CD47结合。
术语“IL15”和“白介素-15”是指任何人类和非人类动物物种的IL15蛋白，并且特定地包括人类IL15以及非人类哺乳动物的IL15。
如本文所用的术语“人IL15”包括人IL15(UniProt P40933)的任何变体、同种型和物种同源物，而无论其来源或制备方式如何。因此，“人IL15”包括细胞天然表达的人IL15和在用人IL15基因转染的细胞上表达的IL15。
如本文所用以描述多特异性抗体或多特异性结合化合物，术语“IL15”是指这样的抗体或结合化合物，所述抗体或结合化合物包含已融合IL15蛋白序列的多肽亚基(例如，抗体重链或抗体轻链)，从而促进融合的IL15蛋白与IL15受体之间的相互作用，如图23，小图A至小图F中示意性所示。
关于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，并在不将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与所述参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比，可以以本领域技术范围内的各种方式来实现比对，例如，使用诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件的公开可得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文中的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。
“分离的”抗体或结合化合物是已经鉴定并且从其自然环境的组分分开和/或回收的抗体。其自然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化(1)到如通过Lowry法所测定的按抗体重量计大于95％，并且最优选地按重量计大于99％，(2)到足以通过使用转杯式测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)以通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝(Coomassie blue)或优选地银染色，达到均一。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体自然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
本发明的结合化合物包括多特异性结合化合物。多特异性结合化合物具有多于一种结合特异性。术语“多特异性”特定地包括“双特异性”和“三特异性”，以及更高阶的独立特异性结合亲和力，诸如更高阶的多表位特异性，以及四价抗体和抗体片段。术语“多特异性抗体”和“多特异性结合化合物”在本文中以最广泛含义使用并且涵盖具多过一种结合特异性的所有抗体和抗体样分子。本发明的多特异性抗PD-L1结合化合物特定地包括免疫特异性地与PD-L1蛋白(诸如人PD-L1蛋白)上的表位和不同蛋白(诸如例如，4-1BB蛋白或CD47蛋白)上的表位结合的结合化合物。
“表位”是抗原分子的表面上与单一抗体分子结合的位点。通常，抗原具有几个或许多不同的表位并与许多不同的抗体反应。所述术语特定地包括线性表位和构象表位。
抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中的连续氨基酸序列形成。构象表位由在蛋白质序列中不连续，但在蛋白质折叠成其三维结构时集合在一起的氨基酸形成。
如本文所用，术语“价”是指抗体分子或结合化合物中结合位点的规定数目。
“单价”结合化合物具有一个结合位点。因此，单价结合化合物也是单特异性的。
“多价”结合化合物具有两个或更多个结合位点。因此，术语“二价”、“三价”和“四价”分别是指存在两个结合位点、三个结合位点和四个结合位点。因此，根据本发明的双特异性结合化合物至少是二价的并且可以是三价、四价或在其他情况下多价的。根据本发明的实施方案的二价结合化合物可以具有针对同一表位(即，二价、单互补位)或针对两个不同表位(即，二价、双互补位)的两个结合位点。
多种方法和蛋白质构型是已知的并且用于制备双特异性单克隆抗体(BsMAB)和结合化合物、三特异性抗体和结合化合物等。
术语“人抗体”在本文中用于包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文中的人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变。术语“人抗体”特定地包括具有人重链可变区序列的抗体和结合化合物。
如本文所用的术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，所述抗体具有源自非人免疫球蛋白(诸如大鼠或小鼠抗体)的可变序列，以及通常选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区。用于产生嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如，Morrison,1985,Science229(4719):1202-7；Oi等人，1986,BioTechniques 4:214-221；Gillies等人，1985,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397，这些文献以引用方式整体并入本文。术语“嵌合抗体”特定地包括这样的抗体和结合化合物，所述抗体和结合化合物具有源自非人免疫球蛋白的可变区序列和人免疫球蛋白恒定区序列。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的抗体或结合化合物。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个，以及典型地两个可变结构域，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的框架(FR)区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白共有序列的至少一部分。抗体人源化方法是本领域中已知的。参见例如，Riechmann等人，1988,Nature 332:323-7；美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和Queen等人的美国专利号6,180,370；EP239400；PCT公布WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan,1991,Mol.Immunol.,28:489-498；Studnicka等人，1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska等人，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973；和美国专利号5,565,332，所有这些文献都以引用方式整体并入本文。
如本文所用，术语“效应细胞”是指参与免疫响应的效应阶段(与免疫应的认知和激活阶段相反)的免疫细胞。一些效应细胞表达特定的Fc受体并进行特定的免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞(诸如自然杀伤细胞)能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。例如，表达FcR的单核细胞和巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀死并将抗原呈递给免疫系统的其他组分，或与呈递抗原的细胞结合。在一些实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原或靶细胞。
“人效应细胞”是表达受体(诸如T细胞受体或FcR)并执行效应子功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的示例包括天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中NK细胞是优选的。效应细胞可以从其天然来源，例如如本文所述从血液或PBMC分离。
术语“免疫细胞”在本文中以最广泛含义使用，包括但不限于骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(诸如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞，诸如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
抗体“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变异Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的示例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调，等等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，在所述细胞介导的反应中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并且随后导致靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为了评定感兴趣的分子的ADCC活性，可以执行体外ADCC测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的体外ADCC测定。对于此类测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。替代地或另外，可以在体内，例如在动物模型(诸如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的动物模型)中评定感兴趣的分子的ADCC活性。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在下裂解靶标的能力。补体活化途径由补体系统的第一组分(C1q)结合到与同源抗原复合的分子(例如抗体)所引发。为了评估补体活化，可以执行CDC测定，例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述。
如本文可互换使用的“定向T细胞介导的细胞毒性”和“重定向T细胞介导的细胞毒性”是指细胞介导的反应，在所述细胞介导的反应中交联分子(例如，双特异性抗体)交联T细胞上的表面抗原(例如，CD3)和靶细胞上的抗原(例如，癌细胞上的表面抗原)。T细胞和靶细胞的交联促进T细胞经由T细胞的细胞毒活性杀伤靶细胞。重定向T细胞介导的细胞毒性在例如Velasquez等人，Blood 2018 131:30-38中有所描述。
“结合亲和力”是指在分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由平衡解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域中已知的常见方法测量。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并且倾向于快速解离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并且倾向于保持结合。
如本文所用，“KD”或“KD值”是指在动力学模式下使用Octet Red96仪器(FortebioInc.,Menlo Park,CA)通过生物层干涉术测定的解离常数。例如，将抗小鼠Fc传感器用小鼠-Fc融合抗原装载，然后浸渍于含抗体的孔中以测量浓度依赖性缔合速率(kon)。在最后步骤中测量抗体解离速率(koff)，其中将所述传感器浸渍于仅含缓冲液的孔中。KD是koff/kon的比率。(有关进一步细节，参见Concepcion,J,等人，Comb Chem High ThroughputScreen,12(8),791-800,2009)。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等在本文中一般用于意指获得期望的药理和/或生理效应。该效应在完全或部分预防疾病或其症状的方面可以是预防性的和/或在部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利影响方面可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖对哺乳动物疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可易于患病但尚未诊断为患病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。其中治疗使患者的不合需要的临床症状稳定或减少的对正在进行的疾病的治疗尤其受到关注。希望在受影响组织的功能完全丧失之前执行此类治疗。主题疗法可以在疾病的症状阶段期间施用，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。
“治疗有效量”意指向受试者赋予治疗益处所必需的活性剂的量。例如，“治疗有效量”是诱导、改善或以其他方式引起病理性症状、疾病进展或与疾病相关的生理状况的改进或改进对病症的抵抗力的量。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常为不受调控的细胞生长的生理病症。“肿瘤”包括一种或多种癌细胞。癌症的示例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的示例包括鳞状细胞癌(如，上皮鳞状细胞癌)、皮肤癌、黑素瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌的胃部癌症(gastric cancer)或胃癌(stomachcancer)、胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌)、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌(例如，高级别浆液性卵巢癌)、肝癌(例如，肝细胞癌(HCC))、膀胱癌(例如，膀胱尿路上皮癌)、睾丸(生殖细胞肿瘤)癌、肝癌、乳腺癌、脑癌(例如，星形细胞瘤)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾部癌症或肾癌(例如，肾细胞癌、肾胚细胞瘤或肾母细胞瘤)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、以及头颈癌。癌症的其他示例包括但不限于视网膜母细胞瘤、卵泡膜瘤、肾母细胞瘤、肝细胞瘤、血液恶性肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤和急性血液恶性肿瘤、子宫内膜癌或子宫癌、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食道癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、皮肤癌、神经鞘瘤、少突神经胶质瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉瘤和泌尿道癌。
术语“转移性癌症”意指这样的癌症状态，其中起源组织的癌细胞通过血管或淋巴管从原始部位转移到身体中其他地方的一个或多个部位，以在除起源组织外的一个或多个器官中形成一个或多个继发性肿瘤。一个突出的示例是转移性乳腺癌。
术语“以PD-L1表达为特征”泛指任何疾病或病症，在所述疾病或病症中PD-L1表达与所述疾病或病症所特有的一个或多个病理过程相关或涉及所述一个或多个病理过程。具体地，但非限制性地，以PD-L1表达为特征的疾病或病症包括例如其中肿瘤细胞表达PD-L1和/或肿瘤相关间质表现出PD-L1表达，和/或PD-L1在免疫细胞上表达的癌症。此类病症包括但不限于：浸润性乳腺癌、结肠腺癌、淋巴瘤、淋巴肿瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、直肠腺癌、膀胱尿路上皮癌、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌、胆管癌、多形性成胶质细胞瘤、肝细胞癌、间皮瘤、默克尔细胞癌、肾细胞癌、肉瘤(例如，未分化肉瘤)、皮肤黑素瘤、胃腺癌、睾丸生殖细胞肿瘤、子宫癌肉瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、卵巢癌、胃癌和结直肠癌。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”是指与某种程度的异常细胞增殖相关联的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是癌症。
如本文所用的“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论是恶性还是良性的)以及所有癌前和癌性细胞和组织。
如本文所用的术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指治疗性治疗和/或预防性(prophylactic或preventative)措施，其中目的是预防或减缓(减少)靶向生理疾患或病症。需要治疗的受试者包括已经患有特定疾患或病症的受试者，以及易于患有所述病症的受试者或要预防所述病症的受试者。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用地指正在针对治疗进行评定和/或正在经受治疗的哺乳动物。在实施方案中，哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”涵盖但不限于患有癌症的个体、患有自身免疫疾病的个体、患有病原体感染等。受试者可以是人，但也包括其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
术语“药物制剂”是指这样的制备物，所述制备物所处的形式使得允许活性成分的生物活性有效，并且其不含对所述制剂将施用于的受试者有不可接受的毒性的附加组分。此类制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(媒剂、添加剂)是可合理地施用于受试哺乳动物以提供所用活性成分的有效剂量的那些。
“无菌”制剂是无菌的或不含或基本上不含所有活的微生物和其孢子。“冷冻”制剂是在低于0℃的温度下的制剂。
“稳定”制剂是其中蛋白质在存储时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。优选地，制剂在储存时基本上保持其物理和化学稳定性，以及其生物活性。储存期通常基于制剂的预期保质期来选择。用于测量蛋白质稳定性的多种分析技术在本领域中可获得并且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301.Vincent Lee编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones.A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90)(1993)中。可在所选择的温度下测量稳定性持续所选择的时间段。稳定性可以多种不同方式定性和/或定量地评估，包括评估聚集体形成(例如使用尺寸排阻色谱法、通过测量浊度和/或通过目视检查)；通过使用阳离子交换色谱法、图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评定电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原抗体和完整抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物活性或抗原结合功能；等。不稳定性可能涉及以下中的任一者或多者：聚集、脱酰胺(例如，Asn脱酰胺)、氧化(例如，Met氧化)、异构化(例如，Asp异构化)、剪取/水解/片段化(例如，铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、未配对的半胱氨酸、N末端延伸、C末端加工、糖基化差异等。
II.详述
PD-L1×4-1BB双特异性抗体
本发明的各方面包括多特异性结合化合物，例如与PD-L1和4-1BB结合的双特异性抗体。多特异性结合化合物可包含多种构型，并且每个结合单位可包含一组CDR序列。PD-L1重链CDR序列包括SEQ ID NO:1-6。PD-L1轻链CDR序列包括SEQ ID NO:7-12。抗4-1BB重链CDR序列包括SEQ ID NO:13-18，并且抗4-1BB轻链CDR序列包括SEQ ID NO:19-24。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含在SEQ ID NO:1-24中的任一者中具有两个或更少的氨基酸取代的CDR序列。
根据本发明的实施方案的多特异性结合化合物可包含如本文所提供的重链可变区序列和轻链可变区序列的任何合适的组合。抗PD-L1重链可变区序列包括SEQ ID NO:25和26。抗PD-L1轻链可变区序列包括SEQ ID NO:27-28。抗4-1BB重链可变区序列包括SEQ IDNO:29、30、45和46。抗4-1BB轻链可变区序列包括SEQ ID NO:31、32、47和48。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含可变区序列，所述可变区序列与SEQ ID NO:25-32和SEQ IDNO:45-48中的任一者的可变区序列具有至少约80％同一性，诸如约85％、约90％、约95％、约99％或约99.9％同一性。
根据本发明的实施方案的多特异性结合化合物可包含一个或多个如本文所列的抗4-1BB scFv序列。抗4-1BB scFv序列包括SEQ ID NO:129至SEQ ID NO:132。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含scFv序列，所述scFv序列与SEQ ID NO:129至SEQ ID NO:132中的任一者的scFv序列具有至少约80％同一性，诸如约85％、约90％、约95％、约99％或约99.9％同一性。在一些实施方案中，scFv序列通过接头序列连接至多肽亚基(例如，重链或轻链多肽亚基)。接头序列的非限制性示例包括SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:128。
本文所述的多特异性结合化合物提供有助于用作临床治疗剂的许多益处。多特异性结合化合物包括具有多种结合单位构型的成员，从而允许选择显示出治疗益处的特定分子。
合适的结合化合物可以选自本文提供用于开发和治疗或其他用途的那些，所述用途包括但不限于用作双特异性结合化合物，例如，如图40，小图A所示。
在一个优选的实施方案中，双特异性结合化合物与PD-L1和4-1BB结合，并且包含：第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:43的序列；第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:41的序列；第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:41的序列，以及第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:43的序列。这种双特异性抗体被称为QL301(带有信号序列)。
在一个优选的实施方案中，双特异性结合化合物与PD-L1和4-1BB结合，并且包含：第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:44的序列；第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:42的序列；第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:42的序列；以及第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:44的序列。这种双特异性抗体被称为QL301(没有信号序列)。
可使用本领域中已知的方法(诸如Biacore测量)来执行对候选蛋白质的亲和力的测定。如本文所述的多特异性结合化合物可对PD-L1或4-1BB具有亲和力，所述亲和力的Kd为约10-6至大致约10-11，包括但不限于：约10-6至大致约10-10；约10-6至大致约10-9；约10-6至大致约10-8；约10-8至大致约10-11；约10-8至大致约10-10；约10-8至大致约10-9；约10-9至大致约10-11；约10-9至大致约10-10；或这些范围内的任何值。亲和力选择可以通过用于调节PD-L1或4-1BB生物活性的生物学评定来确认，所述生物学评定包括体外测定、临床前模型和临床试验，以及潜在毒性的评定。
各种形式的多特异性结合化合物在本发明的范围内，包括但不限于如本文所述的四链多肽。本文的多特异性结合化合物特定地包括对PD-L1和4-1BB具有结合亲和力的双特异性结合化合物(例如，抗PD-L1×抗4-1BB结合化合物)。此类双特异性结合化合物诱导有效的T细胞介导的肿瘤细胞杀伤，如图40，小图B所描绘。
PD-L1×CD47双特异性抗体
本发明的各方面包括多特异性结合化合物，例如与PD-L1和CD47结合的双特异性抗体。多特异性结合化合物可包含多种构型，并且每个结合单位可包含一组CDR序列。PD-L1重链CDR序列包括SEQ ID NO:1-6。PD-L1轻链CDR序列包括SEQ ID NO:7-12。抗CD47重链CDR序列包括SEQ ID NO:50-55，并且抗CD47轻链CDR序列包括SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含在SEQ ID NO:1-12或SEQ ID NO:50-61中的任一者中具有两个或更少的氨基酸取代的CDR序列。
根据本发明的实施方案的多特异性结合化合物可包含如本文所提供的重链可变区序列和轻链可变区序列的任何合适的组合。抗PD-L1重链可变区序列包括SEQ ID NO:25和26。抗PD-L1轻链可变区序列包括SEQ ID NO:27-28。抗CD47重链可变区序列包括SEQ IDNO:62至SEQ ID NO:63。抗CD47轻链可变区序列包括SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:65。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含可变区序列，所述可变区序列与SEQ ID NO:25至SEQID NO:28和SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:65中的任一者的可变区序列具有至少约80％同一性，诸如约85％、约90％、约95％、约99％或约99.9％同一性。
根据本发明的实施方案的多特异性结合化合物可包含一个或多个如本文所列的抗CD47 scFv序列。抗CD47 scFv序列包括SEQ IDNO: 72至SEQ ID NO: 75。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含scFv序列，所述scFv序列与SEQ ID NO: 72至SEQ ID NO: 75中的任一者的scFv序列具有至少约80％同一性，诸如约85％、约90％、约95％、约99％或约99.9％同一性。在一些实施方案中，scFv序列通过接头序列连接至多肽亚基(例如，重链或轻链多肽亚基)。接头序列的非限制性示例包括SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO: 49和SEQ ID NO: 120至SEQ ID NO: 128。
本文所述的多特异性结合化合物提供有助于用作临床治疗剂的许多益处。多特异性结合化合物包括具有多种结合单位构型的成员，从而允许选择显示出治疗益处的特定分子。
合适的结合化合物可以选自本文提供用于开发和治疗或其他用途的那些，所述用途包括但不限于用作双特异性结合化合物，例如，如图12，小图A所示。
本发明的各方面包括多特异性结合化合物，所述多特异性结合化合物在其重链亚基之间包含杵臼结构(KiH)界面以促进所述多特异性化合物的所需组分(例如包含抗PD-L1结合结构域的第一重链多肽亚基和包含抗CD47结合结构域的第二重链多肽亚基(例如，抗CD47scFv))的异二聚化。
在一个优选的实施方案中，双特异性结合化合物与PD-L1和CD47结合，并且包含：第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQID NO: 66的序列；第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:67的序列；第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO: 68的序列。 这种分子被称为huD39.5.2.3-huG4a_臼_RF_ huE15.1_scFvds-huG4a_铰链Fc_杵_KiHss。
在一个优选的实施方案中，双特异性结合化合物与PD-L1和CD47结合，并且包含：第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQID NO: 69的序列；第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:70的序列；第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO: 71的序列。 这种分子被称为huD39.5.2.3-huG4a_臼_RF_ huE24.6_scFvds-huG4a_铰链Fc_杵_KiHss。
可使用本领域中已知的方法(诸如Biacore测量)来执行对候选蛋白质的亲和力的测定。如本文所述的多特异性结合化合物可对PD-L1或CD47具有亲和力，所述亲和力的Kd为约10-6至大致约10-11，包括但不限于：约10-6至大致约10-10；约10-6至大致约10-9；约10-6至大致约10-8；约10-8至大致约10-11；约10-8至大致约10-10；约10-8至大致约10-9；约10-9至大致约10-11；约10-9至大致约10-10；或这些范围内的任何值。亲和力选择可以通过用于调节PD-L1或CD47生物活性的生物学评定来确认，所述生物学评定包括体外测定、临床前模型和临床试验，以及潜在毒性的评定。
各种形式的多特异性结合化合物在本发明的范围内，包括但不限于如本文所述的三链或四链多肽。本文的多特异性结合化合物特定地包括对PD-L1和CD47具有结合亲和力的双特异性结合化合物(例如，抗PD-L1×抗CD47结合化合物)。此类双特异性结合化合物诱导有效的T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。
PD-L1×IL15结合化合物
本发明的各方面包括多特异性结合化合物，例如双特异性抗体，其与PD-L1结合并包含促进与IL15受体相互作用的IL15区域。多特异性结合化合物可包含多种构型，并且每个PD-L1结合单位可包含一组CDR序列。PD-L1重链CDR序列包括SEQ ID NO: 1-6。PD-L1轻链CDR序列包括SEQ ID NO: 7-12。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含在SEQ IDNO: 1至SEQ ID NO: 12中的任一者中具有两个或更少的氨基酸取代的CDR序列。
根据本发明的实施方案的多特异性结合化合物可包含如本文所提供的重链可变区序列和轻链可变区序列的任何合适的组合。抗PD-L1重链可变区序列包括SEQ ID NO:25和26。抗PD-L1轻链可变区序列包括SEQ ID NO:27-28。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含可变区序列，所述可变区序列与SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:28中的任一者的可变区序列具有至少约80％同一性，诸如约85％、约90％、约95％、约99％或约99.9％同一性。
根据本发明的实施方案的多特异性结合化合物可包含一个或多个如本文所列的IL15序列。IL15序列包括SEQ ID NO:86至SEQ ID NO:90。在一些实施方案中，多特异性结合化合物包含IL15序列，所述IL15序列与SEQ ID NO:86至SEQ ID NO:90中的任一者的IL15序列具有至少约80％同一性，诸如约85％、约90％、约95％、约99％或约99.9％同一性。在一些实施方案中，IL15序列通过接头序列连接至多肽亚基(例如，重链或轻链多肽亚基)。接头序列的非限制性示例包括SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:49和SEQID NO:120至SEQ ID NO:128。
本文所述的多特异性结合化合物提供有助于用作临床治疗剂的许多益处。多特异性结合化合物包括具有多种结合单位构型的成员，从而允许选择显示出治疗益处的特定分子。
合适的结合化合物可以选自本文提供用于开发和治疗或其他用途的那些，所述用途包括但不限于用作双特异性结合化合物，例如，如图23，小图A至小图F所示。
本发明的各方面包括多特异性结合化合物，所述多特异性结合化合物在其重链亚基之间包含杵臼结构(KiH)界面以促进所述多特异性化合物的所需组分(例如包含抗PD-L1结合结构域和第一IL15蛋白的第一重链多肽亚基和包含抗PD-L1结合结构域和第二IL15蛋白的第二重链多肽亚基)的异二聚化。
在一个优选的实施方案中，双特异性结合化合物与PD-L1结合并且包含两个IL15蛋白，每个重链多肽亚基上一个IL15蛋白，并且包含第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:104的序列；第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:105的序列；第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:105的序列；以及第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:104的序列。这种分子被称为D39.5.2.3-G1AAA-IL15RaSu-IL15-T2A，并且示意性地描绘于图23，小图A中。
在一个优选的实施方案中，双特异性结合化合物与PD-L1结合并且包含两个IL15蛋白，每个重链多肽亚基上一个IL15蛋白，并且包含第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:106的序列；第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:107的序列；第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:107的序列；以及第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:106的序列。这种分子被称为D39.5.2.3-G1AAA-IL15-IL15 RaSu-T2B，并且示意性地描绘于图23，小图D中。
在一个优选的实施方案中，双特异性结合化合物与PD-L1结合并且包含两个IL15蛋白，每个重链多肽亚基上一个IL15蛋白，并且包含第一和第二轻链多肽，所述第一和第二轻链多肽包含SEQ ID NO:108的序列；第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:109的序列；以及第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:110的序列。这种分子是四链分子，并且包含在重链多肽之间的KiH界面以促进异二聚化。这种分子被称为D39.5.2.3-G1AAA.KiH-IL15+IL15RaSu-T3，并且示意性地描绘于图23，小图F中。
在一个优选的实施方案中，双特异性结合化合物与PD-L1结合并且包含一个IL15蛋白，该IL15蛋白在一个重链多肽亚基上，并且包含第一和第二轻链多肽，所述第一和第二轻链多肽包含SEQ ID NO:111的序列；第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:112的序列；以及第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:113的序列。这种分子是四链分子，并且包含在重链多肽之间的KiH界面以促进异二聚化。这种分子被称为D39.5.2.3-G1AAA-IL15RaSu-IL15-T2A-单，并且示意性地描绘于图23，小图B中。
在一个优选的实施方案中，双特异性结合化合物与PD-L1结合并且包含一个IL15蛋白，该IL15蛋白在一个重链多肽亚基上，并且包含第一和第二轻链多肽，所述第一和第二轻链多肽包含SEQ ID NO:114的序列；第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:115的序列；以及第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:116的序列。这种分子是四链分子，并且包含在重链多肽之间的KiH界面以促进异二聚化。这种分子被称为D39.5.2.3-G1AAA-IL15-IL15RaSu-T2B-单，并且示意性地描绘于图23，小图E中。
在一个优选的实施方案中，双特异性结合化合物与PD-L1结合并且包含两个IL15蛋白，每个重链多肽亚基上一个IL15蛋白，并且包含第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:117的序列；第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:118的序列；以及第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:119的序列；以及第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:117的序列。这种分子是四链分子，并且包含在重链多肽之间的KiH界面以促进异二聚化。这种分子被称为D39.5.2.3-G1AAA-IL15RaSu-IL15-T2A-经掩蔽的，并且示意性地描绘于图23，小图C中。
可使用本领域中已知的方法(诸如Biacore测量)来执行对候选蛋白质的亲和力的测定。如本文所述的多特异性结合化合物可对PD-L1具有亲和力，所述亲和力的Kd为约10-6至大致约10-11，包括但不限于：约10-6至大致约10-10；约10-6至大致约10-9；约10-6至大致约10-8；约10-8至大致约10-11；约10-8至大致约10-10；约10-8至大致约10-9；约10-9至大致约10-11；约10-9至大致约10-10；或这些范围内的任何值。亲和力选择可以通过用于调节PD-L1或IL15生物活性的生物学评定来确认，所述生物学评定包括体外测定、临床前模型和临床试验，以及潜在毒性的评定。
各种形式的多特异性结合化合物在本发明的范围内，包括但不限于如本文所述的三链或四链多肽。本文的多特异性结合化合物特定地包括对PD-L1具有结合亲和力并且包含一种或多种促进与IL15受体相互作用的IL15蛋白的双特异性结合化合物(例如，抗PD-L1×IL15结合化合物)。此类双特异性结合化合物诱导有效的T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。
下表提供了用于装配本文所述的结合化合物的各种序列。
PD-L1重链CDR序列：
PD-L1轻链CDR序列：
4-1BB重链CDR序列：
4-1BB轻链CDR序列：
CD47重链CDR序列：
CD47轻链CDR序列：
PD-L1重链可变区序列：
PD-L1轻链可变区序列：
4-1BB重链可变区序列：
4-1BB轻链可变区序列：
4-1BB scFv序列：
CD47重链可变区序列：
CD47轻链可变区序列：
CD47 scFv序列：
Misc.附加序列：
QL301全长多肽序列：
CD47实施方式序列：
CD47实施方式序列：
huIgG4序列：
附加接头：
IL-15序列：
恒定区序列：
IL-15全长序列：
结合化合物的制备
本发明的多特异性结合化合物可以通过本领域已知的方法制备。例如，还可以通过重组DNA技术、通过在合适的真核或原核宿主(包括例如哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)、大肠杆菌(E.coli)或酵母)中表达编码核酸来产生结合化合物及其抗原结合片段。
药物组合物、用途和治疗方法
本发明的另一方面提供药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本发明的多特异性结合化合物与合适的药学上可接受的载体的掺混物。如本文所用的药学上可接受的载体是例如但不限于佐剂、固体载体、水、缓冲液或本领域中用于保持治疗组分的其他载体，或它们的组合。
在一个实施方案中，药物组合物包含与PD-L1和4-1BB结合的多特异性结合化合物。在一个实施方案中，药物组合物包含与PD-L1和CD47结合的多特异性结合化合物。在一个实施方案中，药物组合物包含与PD-L1结合并且包含一种或多种IL15蛋白的多特异性结合化合物。
通过使具有期望程度的纯度的蛋白质与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编辑(1980))混合，诸如呈冻干制剂或水溶液的形式来制备根据本发明使用的结合化合物的药物组合物以供存储。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠离子；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
用于肠胃外施用的药物组合物优选是无菌的和大体上等渗的，并且在优良制造规范(GMP)条件下制造。药物组合物可以单位剂型(即，用于单次施用的剂量)提供。所述制剂取决于所选择的施用途径。本文中的结合化合物可通过静脉内注射或输注或皮下施用。对于注射施用，本文中的结合化合物可在水溶液中，优选在生理学上可相容的缓冲液中配制以降低注射部位处的不适。所述溶液可包含如上所述的载体、赋形剂或稳定剂。或者，结合化合物可呈在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)复原的冻干形式。
抗体制剂公开于例如美国专利号9,034,324中。类似的制剂可用于本发明的结合化合物。皮下抗体制剂描述于例如US20160355591和US20160166689中。
使用方法
本文所述的多特异性结合化合物和药物组合物可用于治疗以PD-L1表达为特征的疾病和疾患，包括但不限于上述疾患和疾病。
在一个方面中，本文的多特异性结合化合物和药物组合物可用于治疗以PD-L1表达为特征的癌症。如本文所用，“以PD-L1表达为特征”的癌症包括但不限于其中一个或多个肿瘤细胞表达PD-L1，和/或其中肿瘤相关间质表现出PD-L1表达，和/或其中免疫细胞表现出PD-L1表达的癌症。此类病症包括但不限于：浸润性乳腺癌、结肠腺癌、淋巴瘤、淋巴肿瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、直肠腺癌、膀胱尿路上皮癌、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌、胆管癌、多形性成胶质细胞瘤、肝细胞癌、间皮瘤、默克尔细胞癌、肾细胞癌、肉瘤(例如，未分化肉瘤)、皮肤黑素瘤、胃腺癌、睾丸生殖细胞肿瘤、子宫癌肉瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、卵巢癌、胃癌和结直肠癌。
用于治疗疾病的本发明组合物的有效剂量取决于多种不同因素而变化，包括施用手段、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、所施用的其他药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但也可以治疗非人哺乳动物，例如伴侣动物(诸如狗、猫、马等)、实验室哺乳动物(诸如兔、小鼠、大鼠等)等。可用滴定法测量治疗剂量以优化安全性和功效。
剂量水平可由普通熟练临床医生容易地确定，并且可根据需要，例如根据修改受试者对疗法的反应的需要进行修改。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量取决于所治疗的宿主和特定施用模式而变化。剂量单位形式一般含有约1mg至约500mg之间的活性成分。
在一些实施方案中，所述剂的治疗剂量可以介于约0.0001至100mg/kg并且更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。本发明的治疗实体通常在多种情况下施用。单个剂量之间的时间间隔可以是每周、每月或每年。时间间隔也可以是无规律的，如通过测量治疗实体在患者中的血液水平所指示。或者，本发明的治疗实体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率可取决于抗体在患者中的半衰期而变化。
典型地，制备呈可注射剂(液体溶液或悬浮液)形式的组合物；也可制备可用于在注射之前溶解或悬浮于液体媒剂中的固体形式。本文中的药物组合物可直接地或在固体(例如冻干)组合物的重构之后用于静脉内或皮下施用。也可以将所述制备物乳化或密封在脂质体或微粒，诸如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中以实现增强的佐剂效应，如上所论述。Langer,Science 249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997。本发明的药剂可以以储库注射液或植入制备物的形式施用，所述储库注射液或植入制备物可以以允许活性成分的持续释放或脉冲释放的方式配制。所述药物组合物一般是配制成无菌、大体上等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有优良制造规范(GMP)法规。
可通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)来测定本文所述的抗体和抗体结构的毒性。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制对于在人类中使用无毒的剂量范围。本文所述的抗体的剂量优选在循环浓度范围内，所述范围包括毒性很小或没有毒性的有效剂量。所述剂量可视所用剂型和所用施用途径而在这一范围内变化。确切的制剂、施用途径和剂量可由个别医生根据患者的疾患来选择。
用于施用的组合物通常将包含溶解于药学上可接受的载体，优选地水性载体中的抗体或其他药剂(例如，另一种消融剂)。可使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且一般不含不合需要的物质。可以通过常规、众所周知的灭菌技术对这些组合物进行灭菌。所述组合物可含有接近生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的活性剂的浓度可广泛地变化，并且将根据所选择的特定施用模式和患者的需求(例如Remington's Pharmaceutical Science(第15版,1980)以及Goodman和Gillman,ThePharmacological Basis of Therapeutics(Hardman等人编辑,1996))，主要基于流体体积、粘度、体重等进行选择。
包含本发明的活性剂及其制剂以及使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。所述试剂盒可进一步包含至少一种附加试剂，例如化学治疗药物等。试剂盒通常包括指示试剂盒的内容物的预期用途的标签。如本文所用的术语“标签”包括在试剂盒上或随试剂盒供应或以其他方式伴随试剂盒的任何书面或记录材料。
现已充分描述了本发明，本领域技术人员应显而易知，可在不脱离本发明的精神或范围的情况下作出各种变化和修改。
实施例
实施例1：QL301与表达PD-L1或4-1BB的HEK293细胞结合
将表达PD-L1或4-1BB的HEK293细胞以1×105的密度涂铺在96孔V形底板中。将连续稀释的抗体加入细胞中并在冰上孵育30分钟。在用FACS缓冲液洗涤2次后，加入经AF647标记的抗人Fc二抗并在冰上孵育20分钟。在用FACS缓冲液洗涤2次后，将细胞重悬于含有7AAD存活力染料的FACS缓冲液中，并在流式细胞仪上进行分析。结果在图1，小图A-C中示出。
实施例2：结合动力学
在Octet RED96系统上测量结合动力学。将抗体加载到来自ForteBio的抗人Fc捕获(AHC)传感器上，之后结合经his标记的重组PD-L1或4-1BB蛋白。结果在图2，小图A-C中示出。
实施例3：QL301与表达食蟹猴PD-L1或食蟹猴4-1BB的HEK293细胞结合
将表达食蟹猴PD-L1或4-1BB的HEK293细胞以1×105的密度涂铺在96孔V形底板中。将连续稀释的抗体加入细胞中并在冰上孵育30分钟。在用FACS缓冲液洗涤2次后，加入经AF647标记的抗人Fc二抗并在冰上孵育20分钟。在用FACS缓冲液洗涤2次后，将细胞重悬于含有7AAD存活力染料的FACS缓冲液中，并在流式细胞仪上进行分析。结果在图3，小图A-C中示出。
实施例4：QL301竞争测定
将表达PD-L1或4-1BB的HEK293细胞以1×105的密度涂铺在96孔V形底板中。将连续稀释的抗体加入细胞中并在冰上孵育15分钟。将经His标记的重组PD-L1或4-1BB蛋白加入到相应的板中，并在冰上再孵育15分钟。在用FACS缓冲液洗涤2次后，加入经APC标记的抗His标签二抗并在冰上孵育20分钟。在用FACS缓冲液洗涤2次后，将细胞重悬于含有7AAD存活力染料的FACS缓冲液中，并在流式细胞仪上进行分析。结果在图4，小图A-C中示出。
实施例5：QL301双功能ELISA和NF-kB报告子测定
重组的经His标记的4-1BB蛋白在室温下振荡包被到96孔板上过夜。在用含0.05％Tween-20的PBS洗涤板后，将板用2％BSA封闭60分钟，并加入抗体并在室温下振荡孵育60分钟。在洗涤后，将生物素化的重组PD-L1蛋白加入板中并在室温下孵育60分钟。洗涤板并加入HRP(辣根过氧化物酶)缀合的链霉亲和素，并在室温下孵育30分钟。在洗涤后，加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物并孵育5分钟至10分钟以显色，在此之后加入0.16M硫酸以停止反应。在读板仪上读取吸光度。对于报告子测定，将表达4-1BB且还含有受NF-kB转录控制的海肾荧光素酶报告子元件的HEK293细胞以5×104个细胞/孔接种在96孔板中。每孔加入相同细胞数的亲本HEK293细胞或表达PD-L1的HEK293细胞。然后加入连续稀释的抗体，并于37℃和5％CO2下孵育24小时。然后收集上清液，转移至白壁96孔板中，并加入QuantiLuc试剂(Invivogen)。立刻在读板仪上读取发光。结果在图5，小图A-B中示出。
实施例6：细胞因子释放
用抗CD3(OKT3)刺激人PBMC，并与QL301、PD-L1或4-1BB单克隆抗体或它们的组合以及PD-L1+A431细胞一起孵育。QL301诱导IL2和IFNγ释放，而单独的抗PD-L1或4-1BB或这两者的组合则不诱导。在不存在A431细胞的情况下，IL2诱导显著较少。结果在图6，小图A-C中示出。每个点代表个别供体，并且值是相对于对照抗体的倍数。
实施例7：SEB刺激测定中的细胞因子释放
在QL301存在下在SEB刺激测定中也观察到了IL2释放，但在PD-L1或4-1BB单克隆抗体或这两者的组合存在下没有观察到。QL301在抗CD3(OKT3)和PD-L1+A431细胞存在下诱导CD8+T细胞增殖，但这在使用PD-L1或4-1BB单克隆抗体或这两者的组合时未观察到。结果在图7，小图A-B中示出。
实施例8：MC38肿瘤模型
将表达人PD-L1的MC38小鼠癌细胞植入人PD-L1和4-1BB双敲入C57BL/6小鼠的胁腹中。在平均肿瘤体积已达到约100mm3后，每周两次腹膜内施用QL301、PD-L1单克隆抗体或盐水。10mg/kg的QL301比8mg/kg等摩尔剂量的PD-L1单克隆抗体显著更有效(p<0.0001，n＝6)。在研究结束时对肿瘤浸润免疫细胞的分析显示，与盐水或PD-L1单克隆相比，接受QL301的动物肿瘤中有更多的CD8+T细胞(p<0.01)。
结果在图8，小图A-B中示出。
实施例9：A431肿瘤模型
在第二模型中，将A431人癌细胞与人PBMC共同植入CB17-SCID小鼠的胁腹中。与来自MC38-hPD-L1模型的结果一致，QL301比PD-L1单克隆抗体具有更好的肿瘤生长抑制效应，肿瘤中CD8+T细胞的百分比更高(n＝8)。结果在图9，小图A-B中示出。
实施例10：加速温度应力测试
在42℃下28天过程中的加速温度应力测试中，QL301的HPLC-SEC图(五个时间点的叠加色谱图)变化很小。单体、聚集体和片段的计算百分比保持在初始生产组成的1％以内。
结果在图10中示出。
实施例11：QL301在人血清中的孵育
将QL301在人血清中孵育7天，并在SEB刺激测定中测试结合和刺激IL2从PBMC中释放的能力。在4℃的储备对照与经血清孵育的分子之间没有观察到显著变化。结果在图11，小图A-B中示出。
实施例12：与PD-L1和CD47的ELISA结合
评价了与PD-L1和CD47的ELISA结合。Immulon HBX板在4℃下用2μg/mL的hPDL1-FC(R&D Systems)包被过夜。然后将板用PBST洗涤3次，并在室温下用4％NFDM/PBS封闭1小时。去除封闭，并加入在4％NFDM/PBS中的抗体稀释液，并在室温下孵育1小时。然后将板用PBST洗涤3次。将1μg/mL的huCD47-C33S_his加入到每个孔中并在室温下孵育1小时，然后用PBST洗涤3次。将抗His-HRP(AbCam，1:20,000)加入到每个孔中，并在室温下孵育45分钟。在用PBST洗涤6次后，用TBM、然后用2N硫酸使测定显色。结果在图12，小图B中示出。图12，小图A，是PD-L1×CD47双特异性抗体的示意图。
实施例13：PD-L1×CD47双特异性抗体与HEK293细胞的结合
收获细胞并用FACS缓冲液洗涤一次。将1×105个细胞/孔分配到96孔V形底板中。加入测试抗体的连续稀释液并在冰上孵育20分钟。将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤2次。接着，将细胞重悬于50μL的以1:500稀释的二抗AF647 F(ab')2山羊抗hu IgG，Fc特异性(Jackson ImmunoResearch，目录号109-606-098)中并在冰上孵育15分钟。最后，将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤2次，并重悬于100μL的含7-AAD的FACS缓冲液中。结果在图13，小图A-E中示出。
实施例14：PD-1 Fc-生物素阻断
收集细胞并用FACS缓冲液洗涤一次。将1.2×105个细胞/孔分配到96孔V形底板中。向细胞中加入0.5μg/mL的PD-1-生物素(终浓度)并在冰上孵育5分钟。接着，加入测试抗体的连续稀释液并在冰上孵育20分钟。将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤2次。接着，将细胞以10μL/106个细胞重悬于50μL的二抗链霉亲和素-APC(R&D，目录号F0050)中，并在冰上孵育15分钟。最后，将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤2次，并重悬于120μL的含7-AAD的FACS缓冲液中。结果在图14和图15中示出。
实施例15：SIRPα Fc-生物素阻断
收获细胞并用FACS缓冲液洗涤一次。将1.2×105个细胞/孔分配到96孔V形底板中。向细胞中加入1.25μg/mL的SIRPα-生物素(终浓度)并在冰上孵育5分钟。接着，加入测试抗体的连续稀释液并在冰上孵育20分钟。将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤2次。接着，将细胞以10μL/106个细胞重悬于50μL的二抗链霉亲和素-APC(R&D，目录号F0050)中，并在冰上孵育15分钟。最后，将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤2次，并重悬于120μL的含7-AAD的FACS缓冲液中。结果在图16，小图A-B中示出。
实施例16：PD-L1/CD47介导的Raji细胞和MM.1S细胞的吞噬作用
从新鲜分离的人外周血单核细胞(PBMC)中产生重组人M-CSF(Miltenyi Biotec，目录号130-096-492)和重组人IL-10(Miltenyi Biotec，目录号130-098-448)源性的巨噬细胞。在第0天去除非贴壁细胞后，将Rh M-CSF(20ng/ml)加入到组织培养瓶中的贴壁细胞中，在第3天和第7天补充新鲜培养基并在第7天加入Rh IL-10(10ng/ml)，并在含有10％热灭活FBS的RPMI-1640中进一步孵育另外2天。然后将经CFSE标记的靶细胞(1×105个细胞/孔)和效应细胞(2.5×104个细胞/孔)在5％CO2孵育箱中于37℃下与测试抗体的连续稀释液一起在96孔超低附着u型底板(Costar，目录号7007)中孵育2小时。接着，将细胞转移至96孔V形底PP板中，离心沉淀并用含有20％热灭活FBS的DPBS洗涤一次。然后将细胞用含有20％HI FBS的DPBS重悬。将APC缀合的抗人CD36抗体(ThermoFisher Scientific，目录号MA1-10210)加入到含有测试抗体的孔中，并在冰上孵育30分钟。将细胞用200μL的含20％HI FBS的DPBS洗涤2次。最后，将细胞用含7-AAD的缓冲液重悬。将样品使用BD LSR Fortessa通过流式细胞术进行分析，并使用FlowJo门控进一步进行活CFSE/APC双阳性分析，表明了CD47-PDL1抗体诱导的巨噬细胞对靶细胞的吞噬作用。结果在图17，小图A-B中示出。
实施例17：PD-L1/CD47与红细胞的结合
将在通过密度梯度离心分离单核细胞后从血沉棕黄层获得的人红细胞(RBC)小心地转移到50mL锥形管中。将RBC用DPBS洗涤3次，并在离心后小心去除上清液。然后加入DPBS以制成10％的红细胞溶液。将1×106个细胞/孔分配到96孔V形底板中。加入测试抗体的连续稀释液并于4℃孵育30分钟。然后将RBC用200μL的含有2％FBS和0.05％叠氮化钠的DPBS(FACS缓冲液)洗涤2次。接着，将RBC重悬于100μL的以1:500稀释的二抗AF647 F(ab’)2山羊抗hu IgG，Fc特异性(Jackson ImmunoResearch，目录号109-606-098)中并于4℃孵育15分钟。最后，将RBC用200μL的FACS缓冲液洗涤2次，并用200μL的FACS缓冲液重悬以进行流式细胞术分析。结果在图18，小图A-B中示出。
实施例18：CD47抗体诱导的红细胞血凝
将从Stanford Blood Center获得的新鲜全血用DPBS以1:1的比率稀释。然后将2μL经稀释的血液分配到96孔U形底板中。加入50μL连续稀释的测试抗体，并在室温下孵育2小时。拍摄结果的图片文件。结果在图19中示出。
实施例19：ICR-SCID小鼠中的A431/hPBMC共移植肿瘤模型
将A431细胞和人PBMC的混合物用基质胶皮下植入ICR-SCID小鼠，使得每只小鼠接受5×106个A431细胞和1.5×107个人PBMC。当肿瘤达到平均140mm3时，在第0天、第4天、第7天、第11天和第15天(n＝8)向小鼠腹膜内给予10mg/kg的测试抗体或等体积的PBS。每周两次监测肿瘤生长和小鼠重量。在第18天，收集肿瘤并分析淋巴细胞和单核细胞含量。结果在图20，小图A-F和图21，小图A-F中示出。
实施例20：NOD-SCID小鼠中的A431肿瘤模型
向NOD-SCID小鼠皮下植入5×106个A431细胞/小鼠。当肿瘤达到平均110mm3时，在第0天、第4天、第8天、第11天、第14天和第18天(n＝6)向小鼠腹膜内给予20mg/kg的测试抗体或等体积的PBS。每周两次监测肿瘤生长和小鼠重量。结果在图22，小图A-F中示出。
实施例21：PDL1-IL15抗体与表达人或食蟹猴PD-L1或人IL2Rβ和人IL2Rγ的细胞 结合
收获细胞并用FACS缓冲液洗涤两次。将2×105个细胞/孔分配到96孔V形底板中。加入测试抗体的连续稀释液并在冰上孵育20分钟。将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤2次。接着，将细胞重悬于50μL的以1:500稀释的二抗AF647 F(ab')2山羊抗hu IgG，Fc特异性(Jackson ImmunoResearch，目录号109-606-098)中并在冰上孵育25分钟。最后，将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤2次，并重悬于100μL的含7-AAD的FACS缓冲液中。结果在图24，小图A-C中示出。
实施例22：NK92或M07e细胞响应于PD-L1-IL15抗体的增殖
将NK92细胞在补充有12.5％马血清、12.5％胎牛血清、0.2mM肌醇、0.02mM叶酸、0.1mM 2-巯基乙醇和100-200U/ml IL-2(PeproTech)的MEM-α培养基(Gibo,12561056)中培养。将M07e细胞在补充有20％胎牛血清和10ng/ml GM-CSF的IMDM(Gibco，12440046)中培养。对于这些增殖测定，收获细胞并用不含IL2或GM-CSF的适当培养基洗涤两次。将细胞以20,000个细胞/孔分配到白色96孔板中，并于37℃在5％CO2中饥饿4小时。然后加入测试抗体的连续稀释，并将板再孵育3天。根据制造商的说明书，使用CellTiter-Glo试剂(Promega)测量增殖。使用FlexStation3记录发光。结果在图25，小图A-C中示出。
实施例23：用PD-L1-IL15抗体在M07e细胞上诱导pSTAT5
收获M07e细胞并用补充有不含GM-CSF的20％FBS的IMDM培养基洗涤两次。将细胞于37℃在5％CO2中进行GM-CSF饥饿24小时，然后以1.5×105个细胞/孔分配到96孔V形底板中。加入测试抗体的连续稀释液，并于37℃在5％CO2中孵育20分钟。对于作为阳性对照的用GM-CSF刺激的孔，在10分钟后加入GM-CSF，总共刺激10分钟。在孵育完成时，通过将4％多聚甲醛直接加入到培养基中达1.5％多聚甲醛的终浓度使细胞固定，并在室温下孵育10分钟。然后通过加入100μL冰冷的甲醇使细胞透化，并用剧烈的移液混合。在4℃孵育10分钟后，将细胞用染色缓冲液(含1％BSA的PBS)洗涤两次，然后用含有人Fc封闭剂的50μL染色缓冲液重悬。接着，加入抗pSTAT5抗体(AF647小鼠抗STAT5 pY694，BD目录号612599)或同种型对照(小鼠IgG1同种型对照，BD，目录号557714)，并在室温下孵育15分钟至30分钟。然后将细胞用染色缓冲液洗涤两次，并重悬于120uL的染色缓冲液中以在LSF Fortessa上进行分析。结果在图26，小图A-B中示出。
实施例24：PD-L1-IL15抗体增加CD4+和CD8+T细胞、NKT细胞和NK细胞的增殖
根据Miltenyi Biotech密度离心方案分离PBMC。根据制造商的方案，用RBC裂解缓冲液(eBiosciences)裂解红细胞。在分离后，将PBMC用PBS加2％FBS洗涤一次，并以2×107个细胞/mL重悬。将CellTrace Violet制备成6μM，并加入到PBMC中以实现3μM的终浓度。在室温下在黑暗中孵育10分钟后，加入等体积的FBS以停止反应。然后将PBMC用PBS加2％FBS洗涤两次，并以2×106个细胞/mL重悬于含10％热灭活FBS的RPMI中。然后将PBMC以2×105个细胞/孔分配到96孔板中。然后加入测试抗体的连续稀释液，并将板于37℃在5％CO2中孵育五天。然后通过使用针对以下人类蛋白质的具有对应荧光团的抗体进行染色来分析PBMC的增殖：CD3-BB515、CD4-APC-H7、CD8-APC、CD56-BV786和CD25BUV395。结果在图27，小图A-C；图28，小图A-D；和图29，小图A-E中示出。
实施例25：PD-L1-IL15抗体对鼠淋巴细胞计数的药效动力学
向C57BL/6小鼠腹膜内给予测试抗体或等体积的PBS(n＝3)。在第1天、第4天、第6天、第8天和第11天收集全血。将小鼠Fc封闭CD16/CD32克隆2.4G2(BD目录号553142)以1.2-1.5μL/50μL血液加入到50μL的抗凝小鼠全血中，并于4℃孵育5分钟。将针对小鼠淋巴细胞标志物的荧光染料缀合抗体混合并加入到血样中，然后将所述血样于4℃在黑暗中孵育15-20分钟。在孵育后，用BD裂解缓冲液(BD，目录号555899)通过向每个样品中加入800μL并剧烈涡旋来裂解红细胞。在室温下在黑暗中孵育15分钟后，将样品以350xg离心5分钟并弃去上清液。将细胞用2mL的BD染色缓冲液(BD目录号554657)洗涤一次，并用350μL的含7-AAD和50μL计数珠粒(Biolegend目录号424902)/样品的BD染色缓冲液重悬。结果在图30，小图A-E中示出。
实施例26：PD-L1-IL15抗体对鼠淋巴细胞计数的药效动力学
向C57BL/6小鼠腹膜内给予测试抗体(0.5mg/kg)或等体积的PBS(n＝3)。在4小时和第1天、第2天、第3天、第6天和第8天收集全血。将小鼠Fc封闭CD16/CD32克隆2.4G2(BD目录号553142)以1.2-1.5μL/50μL血液加入到50μL的抗凝小鼠全血中，并于4℃孵育5分钟。将针对小鼠淋巴细胞标志物的荧光染料缀合抗体混合并加入到血样中，然后将所述血样于4℃在黑暗中孵育15-20分钟。在孵育后，用BD裂解缓冲液(BD，目录号555899)通过向每个样品中加入800μL并剧烈涡旋来裂解红细胞。在室温下在黑暗中孵育15分钟后，将样品以350xg离心5分钟并弃去上清液。将细胞用2mL的BD染色缓冲液(BD目录号554657)洗涤一次，并用350μL的含7-AAD和50μL计数珠粒(Biolegend目录号424902)/样品的BD染色缓冲液重悬。结果在图31，小图A-F中示出。
实施例27：C57Bl/6和NSG小鼠中D39.5-G1AAA-IL15T2A型、T2B型、T3型和T2A-单型 的药代动力学测定
小图A-C：研究27：C57BL/6小鼠(n＝6，每个时间点n＝3)在第0天静脉内给予一次。在4小时和第1天、第2天、第3天、第6天和第8天收集全血和血浆。研究28：用基质胶向NSG小鼠植入U118细胞(5×106个细胞/小鼠)。当肿瘤已达到250mm3时，将每只荷瘤小鼠与一只非荷瘤NSG小鼠分组。PBS组有两只非荷瘤小鼠。在第0天，向小鼠静脉内注射人PBMC(5×106个细胞/小鼠)。在第1天，小鼠接受测试抗体或等体积的PBS。在第2天、第4天、第7天和第11天收集全血和血浆。小图D：C57Bl/6小鼠(n＝6，每个时间点n＝3)在第0天腹膜内给予一次。在4小时和第1天、第2天、第3天、第7天和第9天收集全血和血浆。结果在图32，小图A-D中示出。
实施例28：PDL1-G1AAA-IL15-T2A对表达人PD-L1的MC38鼠结肠癌细胞的肿瘤生长 抑制
将MC38-hPDL1细胞用基质胶以5×106个细胞/小鼠皮下植入C57BL/6小鼠中。当肿瘤达到平均165mm3时，将小鼠随机化(n＝10)，并在第0天、第7天和第14天腹膜内给予测试分子或等体积的PBS。每周两次监测肿瘤生长和重量。结果在图33，小图A-F中示出。将在PDL1-G1AAA-IL15-T2A治疗后的无肿瘤小鼠用MC38-hPD-L1或B16F10癌细胞再次攻击。数据示出在在图33，小图G中。没有MC38-hPD-L1生长，表明持久的保护性免疫记忆。
实施例29：与人PBMC共移植的A431异种移植物的肿瘤生长抑制
将A431细胞(5×106个细胞/小鼠)与人PBMC(15×106个细胞/小鼠)和基质胶(1:1)混合，然后皮下植入CB17-SCID小鼠中。当肿瘤达到平均100mm3时，将小鼠随机化(n＝8)，并在第0天、第6天和第13天腹膜内给予测试分子或等体积的PBS。每周两次监测肿瘤生长和重量。将小鼠安乐死并在第27天收获肿瘤。将肿瘤均质化并进行针对人T细胞和NK细胞标志物CD45、CD3、CD8、CD4和CD56进行染色。将样品使用BD LSR Fortessa通过流式细胞术进行分析，并使用FlowJo进一步进行分析。结果在图34，小图A-G中示出。来自肿瘤表型分析的数据在图35，小图A-G和图36，小图A-G中示出。组1、2、3和4中的人T细胞、NK细胞和NKT细胞显著增加。
实施例30：C57BL/6小鼠中PDL1-G1AAA-IL15-T2A对表达人PD-L1的MC38鼠结肠癌 细胞的肿瘤生长抑制
将MC38细胞用基质胶以0.6×106个细胞/小鼠皮下植入C57BL/6小鼠中。当肿瘤达到平均145mm3时，将小鼠随机化(n＝5，对于PBS为n＝8)，并在第0天、第7天和第14天腹膜内给予测试分子或等体积的PBS。每周两次监测肿瘤生长和重量。将肿瘤均质化并针对小鼠T细胞和NK细胞标志物CD45、CD90.2、CD8、CD4和NK1.1进行染色。将样品使用BD LSRFortessa通过流式细胞术进行分析，并使用FlowJo进一步进行分析。结果在图37，小图A-E中示出。来自肿瘤表型分析的数据在图38，小图A-F中示出。
实施例31：在CB17-SCID小鼠中与人PBMC共移植的NCI-H1650细胞的肿瘤生长抑制
将NCI-H1650细胞(10×106个细胞/小鼠)与人PBMC(10×106个细胞/小鼠)和基质胶(1:1)混合，然后皮下植入CB17-SCID小鼠中。当肿瘤达到平均95mm3时，将小鼠随机化(n＝8)，并在第0天、第7天和第14天腹膜内给予测试分子或等体积的PBS。每周两次监测肿瘤生长和重量。结果在图39，小图A-G中示出。
实施例32：由CD47-PDL1双特异性抗体诱导的红细胞(RBC)的吞噬少于由单克隆抗 CD47抗体诱导的吞噬
如实施例16和图17中所述产生重组人M-CSF和重组人IL-10源性巨噬细胞。将小心分离的RBC用1μM的CellTrace CFSE(ThermoFisher Scientific，目录号C34554)标记。将经CFSE标记的RBC(1×105个细胞/孔)和巨噬细胞(2.5×104个细胞/孔)在5％CO2中于37℃与测试抗体的连续稀释液一起在96孔超低附着u型底板(Costar，目录号REF7007)中孵育2小时。然后将细胞转移至96孔V形底PP板中，离心沉淀并用含有20％热灭活FBS的DPBS洗涤一次。将细胞用含20％HI FBS的DPBS重悬，并将APC缀合的抗人CD36抗体(ThermoFisherScientific，目录号MA1-10210)加入到含有测试抗体的孔中并在冰上孵育20分钟。将细胞用200μL的含20％HI FBS的DPBS洗涤2次。最后，将细胞用含7-AAD的缓冲液重悬。将样品使用BD LSR Fortessa通过流式细胞术进行分析，并使用FlowJo门控进一步进行活CFSE/APC双阳性分析，表明了抗CD47抗体诱导的巨噬细胞对RBC的吞噬作用。结果在图41，小图A-B中示出。
实施例33：在用MMP14和uPA切割之前和之后，2A型经掩蔽抗体与CHOK1-IL2Rb/g细 胞的结合。
将16μg的每种抗体于37℃用0.4μg的弗林蛋白酶活化的MMP14和0.4μg的补充有氯化锌的uPA消化过夜。在消化后，收获CHOK1-IL2Rb/g细胞并用FACS缓冲液洗涤两次。将1×105个细胞/孔分配到96孔V形底板中。加入测试抗体(切割和未切割的)的连续稀释液并在冰上孵育30分钟。将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤2次。接着，将细胞重悬于50μL的以1:500稀释的二抗AF647 F(ab')2山羊抗hu IgG，Fc特异性(Jackson ImmunoResearch，目录号109-606-098)中并在冰上孵育20分钟。最后，将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤2次，并重悬于120μL的含7-AAD的FACS缓冲液中。结果在图42中示出，并且表明仅使用D1的IL15Rb的抗体不降低结合；然而，用IL15Rb掩蔽使结合减少了>10倍。
实施例34：在用MMP14和uPA切割之前和之后，NK92细胞响应于2A型经掩蔽抗体的 增殖
将NK92细胞在补充有12.5％马血清、12.5％胎牛血清、0.2mM肌醇、0.02mM叶酸、0.1mM 2-巯基乙醇和100-200U/ml IL-2(PeproTech)的MEM-α培养基(Gibo,12561056)中培养。将16μg的每种抗体于37℃用0.4μg的弗林蛋白酶活化的MMP14和0.4μg的uPA(补充有氯化锌)消化过夜。在消化后，收获NK92细胞并用不含IL2的培养基洗涤两次。将细胞以20,000个细胞/孔分配到白色96孔板中，并于37℃在5％CO2中饥饿4小时。然后加入测试抗体的连续稀释液，并将板再孵育3天。根据制造商的说明书，使用CellTiter-Glo试剂(Promega)测量增殖。使用FlexStation3记录发光。结果在图43中示出，并表明用IL15Rb掩蔽将增殖减少5倍至15倍。
实施例35：在PD-L1×4-1BB双特异性抗体的4周重复剂量毒理学研究中恒河猴体 内的AST水平和ALT水平
在恒河猴中进行PD-L1×4-1BB双特异性抗体的4周重复剂量毒理学研究，并测量天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平。结果在图44，小图A和B中示出。在重复施用后AST或ALT水平没有慢性升高，表明3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的PD-L1×4-1BB对肝脏的毒性效应最小。
实施例36：PD-L1×CD47(QL401)双特异性抗体在NOG小鼠中的A375肿瘤生长抑制
在接种A375细胞之前，将人PBMC植入NOG小鼠体内。来自这种肿瘤模型的结果在图45中示出。10mg/kg的PD-L1×CD47(QL401)的抗肿瘤效应与莫洛利单抗(magrolimab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)或它们的组合相当或更有效。
实施例37：PD-L1×CD47(QL401)双特异性抗体在NOG小鼠中的Raji肿瘤生长抑制
在接种Raji细胞之前，将人PBMC植入NOG小鼠体内。来自这种肿瘤模型的结果在图46中示出。10mg/kg的PD-L1×CD47(QL401)的抗肿瘤效应与莫洛利单抗(magrolimab)相当。
实施例38：在PD-L1×CD47双特异性抗体的4周重复剂量毒理学研究中恒河猴中的 红细胞计数
在食蟹猴中使用PD-L1×CD47双特异性抗体进行了4周的重复剂量毒理学研究。来自这种模型的结果在图47中示出。在重复施用10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg剂量的PD-L1×CD47后，红细胞计数没有显著减少到低于正常范围。
实施例39：PDL1-G1AAA-IL15-T2A的小鼠交叉反应替代物对cDC1的刺激
将MC38肿瘤细胞植入C57BL/6小鼠中并生长至约100mm3。用盐水、非靶向IL-15融合蛋白和PD-PDL1-G1AAA-IL15-T2A的小鼠交叉反应替代物处理小鼠。收集肿瘤引流淋巴结并通过FACS分析抗原呈递细胞。结果在图48中示出。PD-L1×IL-15替代分子诱导了更高百分比的常规树突状细胞1(cDC1)，表明通过刺激抗原呈递细胞产生抗肿瘤效应的次级机制。
尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅为通过举例方式提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员现将进行多种变型、变化和取代。应理解，本文所述的发明的实施方案的多种替代方案可以用于实施本发明。这意味着以下权利要求书限定本发明的范围并且这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构因此被涵盖。这意味着以下权利要求书限定本发明的范围并且由此涵盖在这些权利要求和其相等物的范围内的方法和结构。

Claims (114)

1.一种与PD-L1和4-1BB结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
与PD-L1结合的两个结合单位，每个结合单位包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:1或4的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:2或5的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:3或6的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:7或10的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:8或11的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:9或12的CDR3序列；和
与4-1BB结合的两个结合单位，每个结合单位包含单链Fv(scFv)，所述scFv包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:13或16的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:14或17的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:15或18的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:19或22的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:20或23的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:21或24的CDR3序列。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的两个结合单位各自包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:1的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:2的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:3的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:7的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:8的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:9的CDR3序列。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的两个结合单位各自包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:4的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:5的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:6的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:10的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:11的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:12的CDR3序列。
4.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述与4-1BB结合的两个结合单位各自包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:13的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:14的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:15的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:19的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:20的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:21的CDR3序列。
5.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述与4-1BB结合的两个结合单位各自包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:16的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:17的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:18的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:22的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:23的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:24的CDR3序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的双特异性抗体，其中每个结合单位中的所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人VH或人VL框架中。
7.如权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的两个结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的序列。
8.如权利要求7所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的两个结合单位各自包含含SEQ ID NO:25的重链可变区。
9.如权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的两个结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:27具有至少95％序列同一性的序列。
10.如权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的两个结合单位各自包含含SEQ ID NO:27的轻链可变区。
11.如权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的两个结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性的序列。
12.如权利要求11所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的两个结合单位各自包含含SEQ ID NO:26的重链可变区。
13.如权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的两个结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:28具有至少95％序列同一性的序列。
14.如权利要求13所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的两个结合单位各自包含含SEQ ID NO:28的轻链可变区。
15.如权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述与4-1BB结合的两个结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:29具有至少95％序列同一性的序列。
16.如权利要求15所述的双特异性抗体，其中所述与4-1BB结合的两个结合单位各自包含含SEQ ID NO:29的重链可变区。
17.如权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述与4-1BB结合的两个结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:31具有至少95％序列同一性的序列。
18.如权利要求17所述的双特异性抗体，其中所述与4-1BB结合的两个结合单位各自包含含SEQ ID NO:31的轻链可变区。
19.如权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述与4-1BB结合的两个结合单位各自包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:30具有至少95％序列同一性的序列。
20.如权利要求19所述的双特异性抗体，其中所述与4-1BB结合的两个结合单位各自包含含SEQ ID NO:30的重链可变区。
21.如权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述与4-1BB结合的两个结合单位各自包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:32具有至少95％序列同一性的序列。
22.如权利要求21所述的双特异性抗体，其中所述与4-1BB结合的两个结合单位各自包含含SEQ ID NO:32的轻链可变区。
23.如权利要求1-22中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体进一步包含重链恒定区序列，所述重链恒定区序列包含CH1结构域、铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。
24.如权利要求23所述的双特异性抗体，其中所述重链恒定区序列包括野生型人IgG1恒定区序列(SEQ ID NO:92)。
25.如权利要求24所述的双特异性抗体，其中所述重链恒定区序列包含L234A突变、L235A突变、G237A突变或其任何组合。
26.如权利要求25所述的双特异性抗体，其中所述重链恒定区序列包含SEQ ID NO:93。
27.如权利要求1-26中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体进一步包含轻链恒定区序列。
28.如权利要求27所述的双特异性抗体，其中所述轻链恒定区序列包括人κ轻链恒定区序列(SEQ ID NO:91)。
29.如权利要求27所述的双特异性抗体，其中所述轻链恒定区序列包括人λ轻链恒定区序列。
30.如权利要求1-29中任一项所述的双特异性抗体，其中在所述与4-1BB结合的结合单位中的每个中，所述重链可变区和所述轻链可变区通过接头序列连接。
31.如权利要求30所述的双特异性抗体，其中所述接头序列包括G4S接头序列(SEQ IDNO:36)。
32.如权利要求31所述的双特异性抗体，其中所述G4S接头序列(SEQ ID NO:36)包含SEQID NO:36、SEQ ID NO:37、或SEQ ID NO:38。
33.如权利要求23-32中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二结合单位中的每个通过接头序列连接至所述重链恒定区序列的C末端。
34.如权利要求33所述的双特异性抗体，其中所述接头序列包括G4S接头序列(SEQ IDNO:36)。
35.如权利要求34所述的双特异性抗体，其中所述G4S接头序列(SEQ ID NO:36)包含SEQID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38。
36.一种与PD-L1和4-1BB结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:43的序列；
(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:41的序列；
(c)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:43的序列；和
(d)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:41的序列。
37.一种与PD-L1和4-1BB结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:44的序列；
(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:42的序列；
(c)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:44的序列；和
(d)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:42的序列。
38.一种与PD-L1和CD47结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
与PD-L1结合的第一结合单位，所述第一结合单位包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:1或4的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:2或5的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:3或6的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:7或10的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:8或11的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:9或12的CDR3序列；和
与CD47结合的第二结合单位，所述第二结合单位包含单链Fv(scFv)，所述scFv包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:50或53的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:51或54的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:52或55的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:56或59的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:57或60的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:58或61的CDR3序列。
39.如权利要求38所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:1的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:2的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:3的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:7的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:8的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:9的CDR3序列。
40.如权利要求38所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:4的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:5的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:6的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:10的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:11的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:12的CDR3序列。
41.如权利要求38所述的双特异性抗体，其中所述与CD47结合的第二结合单位包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:50的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:51的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:52的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:56的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:57的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:58的CDR3序列。
42.如权利要求38所述的双特异性抗体，其中所述与CD47结合的第二结合单位包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:53的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:54的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:55的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:59的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:60的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:61的CDR3序列。
43.如权利要求38-42中任一项所述的双特异性抗体，其中每个结合单位中的所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人VH或人VL框架中。
44.如权利要求39所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的序列。
45.如权利要求44所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含含SEQ ID NO:25的重链可变区。
46.如权利要求39所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:27具有至少95％序列同一性的序列。
47.如权利要求46所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含含SEQ ID NO:27的轻链可变区。
48.如权利要求39所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性的序列。
49.如权利要求48所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含含SEQ ID NO:26的重链可变区。
50.如权利要求39所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:28具有至少95％序列同一性的序列。
51.如权利要求50所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含含SEQ ID NO:28的轻链可变区。
52.如权利要求39所述的双特异性抗体，其中所述与CD47结合的第二结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:62具有至少95％序列同一性的序列。
53.如权利要求52所述的双特异性抗体，其中所述与CD47结合的第二结合单位包含含SEQ ID NO:62的重链可变区。
54.如权利要求39所述的双特异性抗体，其中所述与CD47结合的第二结合单位包含含与SEQ ID NO:64具有至少95％序列同一性的序列的轻链可变区。
55.如权利要求54所述的双特异性抗体，其中所述与CD47结合的第二结合单位包含含SEQ ID NO:64的轻链可变区。
56.如权利要求39所述的双特异性抗体，其中所述与CD47结合的第二结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:63具有至少95％序列同一性的序列。
57.如权利要求56所述的双特异性抗体，其中所述与CD47结合的第二结合单位包含含SEQ ID NO:63的重链可变区。
58.如权利要求39所述的双特异性抗体，其中所述与CD47结合的第二结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:65具有至少95％序列同一性的序列。
59.如权利要求58所述的双特异性抗体，其中所述与CD47结合的第二结合单位包含含SEQ ID NO:65的轻链可变区。
60.如权利要求38-59中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体进一步包含重链恒定区序列，所述重链恒定区序列包含CH1结构域、铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。
61.如权利要求60所述的双特异性抗体，其中所述重链恒定区序列包括野生型人IgG1恒定区序列(SEQ ID NO:92)。
62.如权利要求61所述的双特异性抗体，其中所述重链恒定区序列包含L234A突变、L235A突变、G237A突变或其任何组合。
63.如权利要求62所述的双特异性抗体，其中所述重链恒定区序列包含SEQ ID NO:93。
64.如权利要求38-63中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体进一步包含轻链恒定区序列。
65.如权利要求64所述的双特异性抗体，其中所述轻链恒定区序列包括人κ轻链恒定区序列(SEQ ID NO:91)。
66.如权利要求64所述的双特异性抗体，其中所述轻链恒定区序列包括人λ轻链恒定区序列。
67.如权利要求38-66中任一项所述的双特异性抗体，其中在所述与CD47结合的第二结合单位中，所述重链可变区和所述轻链可变区通过接头序列连接。
68.如权利要求67所述的双特异性抗体，其中所述接头序列包括G4S接头序列(SEQ IDNO:36)。
69.如权利要求68所述的双特异性抗体，其中所述G4S接头序列(SEQ ID NO:36)包含SEQID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38。
70.如权利要求60-69中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二结合单位中的每个通过接头序列连接至所述重链恒定区序列的C末端。
71.如权利要求70所述的双特异性抗体，其中所述接头序列包括G4S接头序列(SEQ IDNO:36)。
72.如权利要求71所述的双特异性抗体，其中所述G4S接头序列(SEQ ID NO:36)包含SEQID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38。
73.如权利要求38-72中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体进一步包含重链恒定区，所述重链恒定区包含一个或多个促进两种不同重链多肽的异二聚化的杵臼结构突变。
74.一种与PD-L1和CD47结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:66的序列；
(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:67的序列；和
(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:68的序列。
75.一种与PD-L1和CD47结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:69的序列；
(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:70的序列；和
(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:71的序列。
76.一种与PD-L1结合并包含一个或多个IL15多肽的双特异性抗体，所述一个或多个IL15多肽融合至所述双特异性抗体的重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：
与PD-L1结合的第一结合单位，所述第一结合单位包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:1或4的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:2或5的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:3或6的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:7或10的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:8或11的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:9或12的CDR3序列；和
IL15多肽，所述IL15多肽包含与SEQ ID NO:86-90中的任一者具有至少95％同一性的序列。
77.如权利要求76所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:1的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:2的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:3的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:7的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:8的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:9的CDR3序列。
78.如权利要求76所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
包含SEQ ID NO:4的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:5的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:6的CDR3序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
包含SEQ ID NO:10的CDR1序列；
包含SEQ ID NO:11的CDR2序列；和
包含SEQ ID NO:12的CDR3序列。
79.如权利要求76所述的双特异性抗体，其中所述IL15多肽包含SEQ ID NO:86-90中任一者的序列。
80.如权利要求76-79中任一项所述的双特异性抗体，其中所述IL15多肽通过接头序列连接至所述抗体的重链多肽亚基。
81.如权利要求80所述的双特异性抗体，其中所述接头序列包含SEQ ID NO:36、37、38、49、120、121、122、123、124、125、126、127或128中任一者的序列。
82.如权利要求76-81中任一项所述的双特异性抗体，其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人VH或人VL框架中。
83.如权利要求77所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的序列。
84.如权利要求83所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含含SEQ ID NO:25的重链可变区。
85.如权利要求77所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:27具有至少95％序列同一性的序列。
86.如权利要求85所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含含SEQ ID NO:27的轻链可变区。
87.如权利要求77所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性的序列。
88.如权利要求87所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含含SEQ ID NO:26的重链可变区。
89.如权利要求77所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:28具有至少95％序列同一性的序列。
90.如权利要求89所述的双特异性抗体，其中所述与PD-L1结合的第一结合单位包含含SEQ ID NO:28的轻链可变区。
91.如权利要求76-90中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体进一步包含重链恒定区序列，所述重链恒定区序列包含CH1结构域、铰链区序列、CH2结构域和CH3结构域。
92.如权利要求91所述的双特异性抗体，其中所述重链恒定区序列包括野生型人IgG1恒定区序列(SEQ ID NO:92)。
93.如权利要求92所述的双特异性抗体，其中所述重链恒定区序列包含L234A突变、L235A突变、G237A突变或其任何组合。
94.如权利要求93所述的双特异性抗体，其中所述重链恒定区序列包含SEQ ID NO:93。
95.如权利要求76-94中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体进一步包含轻链恒定区序列。
96.如权利要求95所述的双特异性抗体，其中所述轻链恒定区序列包括人κ轻链恒定区序列(SEQ ID NO:91)。
97.如权利要求95所述的双特异性抗体，其中所述轻链恒定区序列包括人λ轻链恒定区序列。
98.如权利要求76-97中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体进一步包含重链恒定区，所述重链恒定区包含一个或多个促进两种不同重链多肽的异二聚化的杵臼结构突变。
99.一种与PD-L1结合并包含IL15多肽的双特异性抗体，所述IL15多肽融合至每个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：
(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:104的序列；
(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:105的序列；
(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:105的序列；和
(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:104的序列。
100.一种与PD-L1结合并包含IL15多肽的双特异性抗体，所述IL15多肽融合至每个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：
(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:106的序列；
(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:107的序列；
(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:107的序列；和
(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:106的序列。
101.一种与PD-L1结合并包含IL15多肽的双特异性抗体，所述IL15多肽融合至每个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：
(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:108的序列；
(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:109的序列；
(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:110的序列；和
(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:108的序列。
102.一种与PD-L1结合并包含IL15多肽的双特异性抗体，所述IL15多肽融合至一个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：
(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:111的序列；
(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:112的序列；
(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:113的序列；和
(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:111的序列。
103.一种与PD-L1结合并包含IL15多肽的双特异性抗体，所述IL15多肽融合至一个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：
(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:114的序列；
(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:115的序列；
(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:116的序列；和
(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:114的序列。
104.一种与PD-L1结合并包含IL15多肽的双特异性抗体，所述IL15多肽融合至每个重链多肽亚基的C末端，所述双特异性抗体包含：
(a)第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含SEQ ID NO:117的序列；
(b)第一重链多肽，所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:118的序列；
(c)第二重链多肽，所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:119的序列；和
(d)第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含SEQ ID NO:117的序列。
105.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至104中任一项所述的抗体。
106.一种用于治疗以PD-L1表达为特征的病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者施用如权利要求1至104中任一项所述的抗体或如权利要求105所述的药物组合物。
107.如权利要求1至104中任一项所述的抗体在用于治疗以PD-L1表达为特征的病症的药物的制备中的用途。
108.如权利要求1至104中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗以PD-L1表达为特征的病症。
109.如权利要求106至108中任一项所述的方法、用途或抗体，其中所述病症是癌症。
110.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1至104中任一项所述的抗体。
111.一种载体，所述载体包含如权利要求110所述的多核苷酸。
112.一种细胞，所述细胞包含如权利要求111所述的载体。
113.一种产生如权利要求1至104中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括使根据权利要求112所述的细胞在允许表达所述抗体的条件下生长，以及从所述细胞中分离所述抗体。
114.一种治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求1至104中任一项所述的抗体或如权利要求105所述的药物组合物。
CN202180066258.XA 2020-10-16 2021-10-15 与pd-l1结合的多特异性结合化合物 Pending CN116670169A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063093109P 2020-10-16 2020-10-16
US63/093,109 2020-10-16
PCT/US2021/055225 WO2022082005A1 (en) 2020-10-16 2021-10-15 Multispecific binding compounds that bind to pd-l1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116670169A true CN116670169A (zh) 2023-08-29

Family

ID=78599233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180066258.XA Pending CN116670169A (zh) 2020-10-16 2021-10-15 与pd-l1结合的多特异性结合化合物

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240084014A1 (zh)
EP (1) EP4229094A1 (zh)
JP (1) JP2023545447A (zh)
CN (1) CN116670169A (zh)
CA (1) CA3191224A1 (zh)
WO (1) WO2022082005A1 (zh)

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO2004042017A2 (en) 2002-10-31 2004-05-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for increasing antibody production
US7575893B2 (en) 2003-01-23 2009-08-18 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
US20160355591A1 (en) 2011-05-02 2016-12-08 Immunomedics, Inc. Subcutaneous anti-hla-dr monoclonal antibody for treatment of hematologic malignancies
PL2406284T3 (pl) 2009-03-10 2017-09-29 Biogen Ma Inc. Przeciwciała anty-bcma
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
EP3870600A1 (en) * 2018-10-24 2021-09-01 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
US20220064314A1 (en) * 2019-01-02 2022-03-03 Qlsf Biotherapeutics Inc. Cd137 agonist antibodies and uses thereof
WO2020215012A1 (en) * 2019-04-18 2020-10-22 Qlsf Biotherapeutics Inc. Antibodies that target human cd47
WO2020215020A1 (en) * 2019-04-18 2020-10-22 Qlsf Biotherapeutics Inc. Humanized anti-pd-l1 antibodies
CN112646031B (zh) * 2019-10-10 2021-12-07 天境生物科技(上海)有限公司 抗4-1bb纳米抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022082005A1 (en) 2022-04-21
CA3191224A1 (en) 2022-04-21
US20240084014A1 (en) 2024-03-14
EP4229094A1 (en) 2023-08-23
JP2023545447A (ja) 2023-10-30
WO2022082005A9 (en) 2022-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110431151B (zh) 仅有重链的抗bcma抗体
CN110945026B (zh) 仅有重链的抗bcma抗体
CN113710707B (zh) 结合于psma的重链抗体
AU2022259766B2 (en) Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
CN117866097A (zh) 仅有重链的抗bcma抗体
TWI838621B (zh) 具有經修飾重鏈恆定區之多特異性重鏈抗體
US20230374130A1 (en) Bispecific anti lrrc15 and cd3epsilon antibodies
EP4292611A1 (en) Anti-cd112r antibody and use thereof
CN112955467A (zh) 与cd38结合的重链抗体
TW202304994A (zh) 促效性抗ｉｌ－２ｒ抗體及使用方法
CN111133007A (zh) 与胞外酶结合的重链抗体
WO2022183074A2 (en) Anti-psma antibodies and car-t structures
KR20230110303A (ko) 폴레이트 수용체 알파에 결합하는 중쇄 항체
CN115768465A (zh) 抗cd36抗体及其治疗癌症的用途
CN116670169A (zh) 与pd-l1结合的多特异性结合化合物
CN117136198A (zh) 激动性抗il-2r抗体及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination