CN110144010B9

CN110144010B9 - 阻断型pd-l1驼源单域抗体及其用途

Info

Publication number: CN110144010B9
Application number: CN201810151835.5A
Authority: CN
Inventors: 万亚坤; 朱敏; 沈晓宁
Original assignee: Shanghai Novamab Biopharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Shanghai Novamab Biopharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2038-02-14
Also published as: CN110144010B; EP3786184A9; US11912770B2; EP3786184A4; US20210261667A1; EP3786184A1; WO2019158113A1; CN110144010A

Abstract

本发明涉及一种驼源单域抗体，该抗体特异识别程序性死亡受体-配体1(PD-L1)，能够有效阻断PD-L1与其受体PD-1的相互作用，其阻断效果优于上市的阿特珠单抗。具体来说，本发明公布了一种PD-L1驼源单域抗体及其衍生蛋白的编码序列、制备方法和用途。

Description

阻断型PD-L1驼源单域抗体及其用途

技术领域

本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种抗PD-L1的驼源单域抗体及其应用。

背景技术

肿瘤免疫逃逸是肿瘤细胞通过自身或微环境的改变来逃避集体的免疫识别和攻击。肿瘤免疫治疗因其损伤小且能有效控制肿瘤生长和转移等优势，成为临床肿瘤治疗的迫切需要。程序性死亡因子1/程序性死亡因子1配体1(PD-1/PD-L1)作为一对负性免疫共刺激分子参与了肿瘤免疫逃逸。PD-1/PD-L1是CD28/B7协同刺激分子超家族的新成员，可以介导负性协同刺激信号，能有效抑制T、B细胞功能和增殖，同时减少细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌，该抑制途径参与的免疫调节在肿瘤免疫、移植免疫、病毒感染、自身免疫等疾病的研究中都具有重要意义。

程序性死亡因子1配体1(programmeddeath1ligand1，PD-L1)又称CD274，是B7家族成员。PD-L1属于I型跨膜蛋白，分子量约为30-35KD。其受体PD-1是免疫球蛋白B7-CD28家族成员之一，由胞外段、疏水性跨膜区、胞内段组成，其胞内段含有免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotif，ITIM)、免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptortyrosine-basedswitchmotif，ITSM)。其中，ITSM的激活与效应性T细胞应答活性密切相关。PD-1可表达于活化的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞和树突状细胞上。另外，PD-1也表达于调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)，并能促进Treg细胞的增殖，抑制免疫应答。人PD-L1分子可组成性表达于胎盘、心、肝、肺、肾、骨骼肌和部分造血细胞等非淋巴组织，在胸腺、淋巴结和脾脏等淋巴组织中也有适度表达。此外，PD-L1在肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等癌组织细胞上也具有表达，且癌组织经过诱导亦可上调其表达。在健康的机体中，PD-1/PD-L1信号通路的激活可最大程度减少免疫反应对周围组织的损伤，避免发生自身免疫疾病。然而，PD-1/PD-L1信号通路激活改变肿瘤局部微环境使得T细胞免疫效应降低，从而介导肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤生长。PD-L1在肿瘤上的表达与食管癌、胰腺癌和其它类型的癌症的生存率下降相关，突出了该通路可以作为新的有前途的肿瘤免疫治疗靶点，并以得到诸多实验证实。

单域抗体作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。单域抗体的分子量仅有12-15KD，是常规单克隆抗体的十分之一，尺寸只有2-4nM，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。单域抗体具有优良的生物学特性，不仅拥有完整的抗原结合位点，还能够克服天然抗体分子量大的弊端，具有很好的组织穿透性，特异性高，水溶性好。因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎避免了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，在免疫诊断和治疗中显示出广阔的应用前景。本研究领域仍亟需能与PD-L1结合，且可以阻断PD-L1/PD-1结合的抗体，尤其是抗PD-L1单域抗体。

发明内容

本发明第一方面，提供了一种抗PD-L1单域抗体VHH链的互补决定区CDR，所述VHH链的互补决定区CDR包含：

SEQ ID NO.:5所示的CDR1、SEQ ID NO.:6所示的CDR2，SEQ ID NO.:7所示的CDR3。

本发明第二方面，提供了一种抗PD-L1单域抗体的VHH链，所述VHH链包括框架区FR和本发明第一方面所述的互补决定区CDR。

在另一优选例中，所述的框架区FR选自下组的一种或多种：

(a)SEQ ID NO.:1所示的FR1，SEQ ID NO.:2所示的FR2，SEQ ID NO.:3所示的FR3，SEQ ID NO.:4所示的FR4组成；

(b)SEQ ID NO.:10所示的FR1，SEQ ID NO.:11所示的FR2，SEQ ID NO.:12所示的FR3，SEQ ID NO.:13所示的FR4组成。

本发明第三方面，提供了一种抗PD-L1单域抗体，它是针对PD-L1表位的单域抗体，并且具有本发明第二方面所述的VHH链。

在另一优选例中，所述单域抗体包括单体和/或二聚体。

在另一优选例中，所述单域抗体如SEQ ID NO.:8和/或SEQ ID NO.:14所示

本发明第四方面，提供了一种PD-L1单域抗体-Fc融合蛋白，所述融合蛋白P从N’-C’端具有如下元件：

A-Fc；

其中，A元件为SEQ ID NO.:14所示的序列；

“-”代表肽键。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

在另一优选例中，所述IgG来源于人。

本发明第五方面，提供了一种抗PD-L1单域抗体四价体，所述四价体具有如下结构

A-L-P～P-L-A；其中，

P元件为本发明第三方面所述的融合蛋白，

A元件为SEQ ID NO.:14所示的序列；

L代表连接子；

“-”代表肽键；

“～”代表二硫键。

在另一优选例中，所述连接子选自以下序列：GGGGSGGGS、GS、(GGGGS)n，其中n＝1或2或3或4。

在另一优选例中，所述PD-L1单域抗体四价体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:17所示。

本发明第六方面，提供了一种多核苷酸或其组合，所述多核苷酸编码选自一种或多种蛋白质：本发明第一方面所述的抗PD-L1单域抗体VHH链的CDR区、本发明第二方面所述的抗PD-L1单域抗体的VHH链、本发明第三方面所述的抗PD-L1单域抗体、或本发明第五方面所述的四价体。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组的一种或多种：SEQ ID NO.:9、15、18所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，SEQ ID NO.:18所示的序列编码SEQ ID NO.:17所示的抗体氨基酸序列。

本发明第七方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第六方面所述的多核苷酸或其组合。

本发明第八方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第七方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第六方面所述的多核苷酸或其组合。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母细胞、噬菌体。

在另一优选例中，所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞可以为如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，如草地粘虫等昆虫细胞，如烟草等植物细胞，如BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本发明所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞或COS细胞。

本发明第九方面，提供了一种产生抗PD-L1单域抗体的方法，包括步骤：

(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养本发明第八方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗PD-L1单域抗体的培养物；

(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗PD-L1单域抗体；和任选的

(c)分离和/或纯化步骤(b)所获得的PD-L1单域抗体。

本发明第十方面，提供了本发明第三方面所述抗PD-L1单域抗体经化学标记或生物标记制得的结合物。

在另一优选例中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。

本发明第十一方面，提供了本发明第三方面所述抗PD-L1单域抗体或本发明第十方面任一项所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明第十二方面，提供了本发明第三方面任一项所述抗PD-L1单域抗体、本发明第十方面任一项所述的结合物和/或本发明第十一方面所述的偶联物在制备检测PD-L1表达的产品中的应用。

本发明第十三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有选自下组的一种或多种：本发明第三方面所述抗PD-L1单域抗体、本发明第十方面任一项所述的结合物，或本发明第十一方面所述的偶联物。

本发明第十四方面，提供了本发明第三方面所述抗PD-L1单域抗体、本发明第四方面所述融合蛋白、本发明第五方面所述抗PD-L1单域抗体四价体、或其抗原结合片段在制备阻断PD-L1与PD-1结合的制剂中的应用。

本发明第十五方面，提供了一种药物组合物，包括选自下组的一种或多种：本发明第三方面抗PD-L1单域抗体、本发明第四方面所述融合蛋白、本发明第五方面所述抗PD-L1单域抗体四价体、或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。

本发明第十六方面，提供了一种体外非诊断性和/或诊断性检测样品中PD-L1蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)将样品与本发明第三方面所述的PD-L1单域抗体、或是本发明第四方面所述融合蛋白、或本发明第五方面所述PD-L1单域抗体四价体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在PD-L1蛋白。

本发明第十七方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，给所需要的对象施用本发明第十五方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是流式细胞术检测PD-L1单域抗体(大肠杆菌表达)的阻断效果。结果表明：特异性针对PD-L1的单域抗体Nb27(由SEQ ID NO.:8所示的氨基酸系列)能够阻断PD-L1与PD-1的结合。

图2是HEK293F系统表达人源化单域抗体Nb1756融合Fc蛋白(由SEQ ID NO.:16)的SDS-PAGE检测结果。纯化的Nb1756-Fc蛋白纯度达到90％以上，可用于后续检测实验。

图3是流式细胞术鉴定人源化PD-L1单域抗体融合Fc蛋白的阻断效果。结果表明：人源化前的单域抗体Nb27-Fc与人源化后的Nb1756-Fc均具有阻断PD-1与PD-L1相互作用的能力，且人源化Nb1756-Fc的阻断效果更佳。

图4是流式细胞术鉴定人源化PD-L1单域抗体Fc融合蛋白和四价体抗体的IC50。结果表明：本发明构建的人源化PD-L1单域抗体四价体对PD-1/PD-L1的阻断效果优于PD-L1单域抗体Fc融合蛋白以及对照阿特珠单抗。

图5是PD-L1单域抗体Fc融合蛋白及其四价抗体的亲和力检测结果。结果表明：PD-L1单域抗体Fc融合蛋白Nb1756-Fc的亲和力为1.37E-8M，而其四价抗体的亲和力为7.03E-9M。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一类抗PD-L1单域抗体，实验结果表明，本发明获得的一株PD-L1单域抗体能有效阻断PD-L1与PD-1之间的相互作用，且经人源化后的PD-L1单域抗体亦能有效阻断PD-L1与PD-1结合。在此基础上构建的四价抗体的阻断活性明显优于对照抗体阿特珠单抗，由此完成了本发明。

具体地，本发明利用人源的PD-L1胞外段抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫单域抗体基因文库。然后将PD-L1蛋白分子偶联在酶标板上，展示PD-L1蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫单域抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了PD-L1特异性的单域抗体基因。再将此基因转至大肠杆菌中，从而获得了能在大肠杆菌中高效表达的、且特异性高的单域抗体株。

如本文所用，术语“本发明单域抗体”、“本发明的抗PD-L1单域抗体”、“本发明PD-L1单域抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于PD-L1(包括人PD-L1)的单域抗体。特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8或14所示的单域抗体。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“单域抗体”、“VHH”“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIHPubl.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗PD-L1蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementaritydeterminingregion，CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合PD-L1蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有PD-L1蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含单域抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明单域抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；9.疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

融合蛋白及四价体

本发明融合蛋白指的是由本发明VHH链或含有本发明CDR区单域抗体与人IgGFc片段融合形成的单链结构蛋白。具体地，本发明融合蛋白(P)从N端到C端具有以下结构：

A-Fc；

其中，A元件为SEQ ID NO.:14所示的序列；

“-”代表肽键。

一种优选的本发明融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示，或与SEQ ID NO.:16所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列或其活性片段。

在形成融合蛋白后，本发明融合蛋白还可进一步通过连接子(L)与SEQ ID NO.:14(A元件)所示的序列结合从而形成二价体。

可用于本发明融合蛋白的连接子没有特别限制，可以是任何将SEQ ID NO.:14(A元件)所示序列与本发明融合蛋白(P元件)相连且不影响两个元件结构及其折叠的连接序列。优选地，可用于本发明的连接子包括：GGGGSGGGS、GS、(GGGGS)n，其中n＝1或2或3或4。

此外，本发明二价体可以通过Fc片段之间的二硫键进行相连，从而形成具有以下结构的四价体：

A-L-P～P-L-A；其中，

P元件为本发明第三方面所述的融合蛋白，

A元件为SEQ ID NO.:14所示的序列；

L代表连接子；

“-”代表肽键；

“～”代表二硫键。

一种优选的本发明四价体可以如SEQ ID NO.:17所示，或与SEQ ID NO.:17所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列或其活性片段。

本发明融合蛋白与四价抗体对PD-L1的阻断效率更高，结合亲和力更好。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合PD-L1蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单域抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

标记的单域抗体

在本发明的一个优选例中，所述单域抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗PD-L1的单域抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单域抗体。

本发明的抗PD-L1单域抗体具有很好的特异性，很高的效价。

检测方法

本发明还涉及检测PD-L1蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中PD-L1蛋白的水平。

在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。

试剂盒

本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明还提供了用于检测PD-L1水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别PD-L1蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

应用

如上所述，本发明的单域抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与PD-L1相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对PD-L1的临床诊断和靶向治疗。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明单域抗体高特异性针对人的具有正确空间结构的PD-L1蛋白。

(b)本发明单域抗体及其衍生蛋白具有较好的阻断PD-1与PD-L1相互作用的能力。

(c)本发明单域抗体的生产简便快捷。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：PD-L1单域抗体文库的构建及筛选鉴定

文库构建：

(1)将1mg hPD-L1(ECD)-Fc抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的单域抗体；(2)7次免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；(4)利用限制性内切酶PstI及NotI酶切20μgpMECS噬菌体展示载体及10μgVHH并连接两个片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TG1中，构建PD-L1单域抗体文库。

抗体筛选：

(1)将溶解在100mMNaHCO3、pH8.2中的10μghPD-L1(ECD)-Fc抗原(10μg Fc inNaHCO₃作为对照)偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜；(2)第二天加入100μL0.1％BSA，室温封闭2h；(3)2h后，加入100μL噬菌体(2×10¹¹CFU免疫骆驼单域抗体噬菌展示基因库)，室温作用1h；(4)用0.05％PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉非特异的噬菌体；(5)用100mM三乙醇胺将与PD-L1特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮得到富集的噬菌体克隆株。

用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：

(1)从上述筛选的含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选200个单个菌落并接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素的TB培养基(1LTB培养基中含有2.3g KH₂PO₄，12.52gK₂HPO₄，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1mM的IPTG，28℃培养过夜；(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1h；(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1h；(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，在室温下放置1h；(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值；(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时(Ratio+/-＞3)，判为阳性克隆孔。将阳性克隆株进行测序鉴定并对比分析单域抗体的CDR3区序列。

实施例2：流式细胞术初步鉴定单域抗体的阻断功能

(1)制备hPD-1(ECD)-Biotin蛋白(hPD-1(ECD)的制备方法同实施例1)，蛋白生物素化的方法参照生物素试剂说明书；(2)瞬转PD-L1基因于HEK293F细胞，使其细胞表面表达PD-L1蛋白；(3)制备PD-L1单域抗体TG1菌株粗提裂解液，制备方法同Zhu Min等人，Nanoscale Res Lett.，2014Sep26；9(1)：528；(4)每个样品取1×10⁶个瞬转PD-L1的HEK293F细胞重悬于0.5％BSA-PB Sbuffer中，加入上述粗提液100μL，同时设置阴性对照(hIgG1)和阳性对照(Tecentriq)，每孔加入5μghPD-1(ECD)-Fc-Biotin，4℃孵育20min；(5)PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测，最终获得1株单域抗体Nb27(氨基酸序列为SEQ ID NO.:8所示)具有明显的阻断效果(结果如图1所示)。

实施例3：PD-L1阻断型单域抗体的人源化改造

(1)首先以SEQ ID NO.:8所示的PD-L1单域抗体序列为模板在结构数据库中同源结构的搜索，取其中Evalue＝0.0并且序列等同性≥70％的结构；(2)对这这些结构进行结构比对，并依据晶体结构分辨率大小和构建的进化树，进行基于SEQ ID NO.:8所示的PD-L1单域抗体序列的多模板同源模建，再依据打分函数的高低排序，选取molpdf最低的结构；(3)对模建的最优结构，利用ProtSA服务器计算残基的溶剂可接触性，即残基的折叠态相对于去折叠态的溶剂可接触面积的比值为判据，取大于40％的残基为暴露于溶剂外的残基；(4)对模建的最优结构和DP-47进行序列比对，替换相应的暴露于溶剂的残基。最终确定出一种人源化PD-L1单域抗体，由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列编码。人源化前后抗体序列对应如下表2：

表2

实施例4：人源化PD-L1单域抗体真核表达纯化

(1)将人源化前(SEQ ID NO.:9，实验编号Nb27)和人源化后(SEQ ID NO.:15，实验编号Nb1756)的PD-L1单域抗体片段克隆至pFUSE-IgG1载体，用Omega质粒大提试剂盒提取pFUSE-IgG1-Nb27和pFUSE-IgG1-Nb1756质粒；(2)培养HEK293F细胞至OD为2.0×10⁶个/mL；(3)将质粒与转染试剂PEI按照1:3混合均匀后静置20min，然后加入到HEK293F细胞中，37℃，6％CO₂摇床培养箱中培养5-6天；(4)收集细胞上清，与Protein A珠子在室温下结合1h；(5)用磷酸盐缓冲液pH7.0洗涤珠子后，再用0.1M pH3.0 Glycine洗脱蛋白；(6)将洗脱的蛋白超滤至PBS中，测定产量后取样进行SDS-PAGE检测纯度(如图2所示，该蛋白的纯度达到90％以上)，其余蛋白保存于-80℃用于后续实验。

实施例5：流式细胞术检测人源化PD-L1单域抗体的阻断效果

(1)构建稳定表达PD-L1的A375转基因细胞；(2)每个样品取5×10⁵个PD-L1稳转细胞A375于0.5％BSA-PBSbuffer中，加入梯度稀释的人源化前及人源化后PD-L1单域抗体及Tecentriq阳性对照抗体(抗体稀释梯度为0.25ug/mL、0.125ug/mL、0.083ug/mL)，每个样品加入100uL，同时设置阴性对照(hIgG1)，所有样本中同时加入5μg hPD-1(ECD)-Fc-Biotin，4℃孵育20min；(3)PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测，使用Graphpad prism6软件进行数据处理。结果如图3所示，人源化前的单域抗体Nb27-Fc与人源化后的Nb1756-Fc均具有阻断PD-1与PD-L1相互作用的能力，且人源化Nb1756-Fc的阻断效果更佳。

实施例6：流式细胞术检测PD-L1单域抗体四价体的IC50

(1)每个样品取3×10⁵个A375/PD-L1稳转细胞于0.5％BSA-PBS buffer中，加入梯度稀释的PD-L1人源化单域抗体、四价抗体及对照抗体(抗体稀释梯度为3.33ug/mL、2.5ug/mL、1.67ug/mL、1.25ug/mL、0.83ug/mL、0.625ug/mL、0.42ug/mL、0.31ug/mL、0.21ug/mL、0.16ug/mL、0.01ug/mL、0.08ug/mL)，每个样品加入100uL，同时设置阴性对照(hIgG1)，所有样本中同时加入3μghPD-1(ECD)-Fc-Biotin，4℃孵育20min；(2)PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BDFACS Calibur)检测，使用graphpad prism6软件进行数据处理。结果如图4所示，人源化的PD-L1单域抗体Fc融合蛋白Nb1756-Fc的IC50为0.84ug/mL，对照抗体(Tecentriq)的IC50为0.97ug/mL，而PD-L1四价抗体的IC50为0.65ug/mL。

实施例7：Fortebio检测抗体亲和力

(1)用PBST将人源化的单域抗体Fc融合蛋白和四价抗体从200nM进行稀释，分别为：200nM、133.3nM、88.9nM、59.3nM、39.5nM、26.3nM。将抗原蛋白hPD-L1(ECD)-Fc和Fc分别稀释至40ug/mL。(2)设置仪器运行条件：温度30℃，Shakespeed 1000rpm。使用已包被Protein A的探针(Fortebio Part No:18-5010)捕获抗体，捕获时间180s；结合梯度稀释的抗原，结合时间70s；解离时间120s；10mM甘氨酸(PH1.7)再生3次，每次5s。(3)用ForteBio's Octet System进行上机检测。检测结果如图5所示：人源化单域抗体Nb1756-Fc的亲和力为1.37E-8M，抗PD-L1四价体的亲和力为7.03E-9M。

序列表

<110> 上海洛启生物医药技术有限公司

<120> 阻断型PD-L1驼源单域抗体及其用途

<130> P2018-0336

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser

20 25

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Phe

1 5 10 15

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Gly Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Cys Met Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr

1 5

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Ala Ala Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser Ala

1 5 10 15

Arg Asp Lys Tyr

20

<210> 8

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Leu Ser Pro Ser

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Phe Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser Ala Arg

100 105 110

Asp Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 9

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtacag cctctggata caacttgagt cccagctgca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcattt acagatgctg atggtagcac aagatacgca 180

gactctgtga aggcccggtt caccatctcc cgagacaacg ccgagaacac tctgtatctg 240

caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc agatttcttt 300

tcttactgct cggtcgtctt ccgggcgagt gcccgcgata agtaccgggg ccaggggacc 360

caggtcaccg tctcctca 378

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser

20 25

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Phe

1 5 10 15

<210> 12

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Leu Ser Pro Ser

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ala Phe Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser Ala Arg

100 105 110

Asp Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 15

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60

tcctgcaccg cctccggcta caacctgtcc ccctcctgca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggaggg cgtggccttc accgacgccg acggctccac caggtacgcc 180

gactccgtga aggccaggtt caccatctcc agggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgacttcttc 300

tcctactgct ccgtggtgtt cagggcctcc gccagggaca agtacagggg ccagggcacc 360

ctggtgaccg tgtcctcc 378

<210> 16

<211> 353

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Leu Ser Pro Ser

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ala Phe Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser Ala Arg

100 105 110

Asp Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys

115 120 125

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

145 150 155 160

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

165 170 175

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

180 185 190

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val

195 200 205

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

210 215 220

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

225 230 235 240

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

245 250 255

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

260 265 270

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

275 280 285

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

290 295 300

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

305 310 315 320

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

325 330 335

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

340 345 350

Lys

<210> 17

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Leu Ser Pro Ser

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ala Phe Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser Ala Arg

100 105 110

Asp Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly

145 150 155 160

Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly

165 170 175

Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Phe Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr Arg

180 185 190

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

195 200 205

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val

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Phe Arg Ala Ser Ala Arg Asp Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

260 265 270

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

275 280 285

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

290 295 300

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

325 330 335

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340 345 350

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370 375 380

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450 455 460

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

465 470 475 480

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 18

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60

tcctgcaccg cctccggcta caacctgtcc ccctcctgca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggaggg cgtggccttc accgacgccg acggctccac caggtacgcc 180

gactccgtga aggccaggtt caccatctcc agggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240

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tcctactgct ccgtggtgtt cagggcctcc gccagggaca agtacagggg ccagggcacc 360

ctggtgaccg tgtcctccgg cggcggcggc agcggcggcg gcagccaggt gcagctgcag 420

gagtccggcg gcggcctggt gcagcccggc ggctccctga ggctgtcctg caccgcctcc 480

ggctacaacc tgtccccctc ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caagggcctg 540

gagggcgtgg ccttcaccga cgccgacggc tccaccaggt acgccgactc cgtgaaggcc 600

aggttcacca tctccaggga caactccaag aacaccctgt acctgcagat gaactccctg 660

agggccgagg acaccgccgt gtactactgc gccgccgact tcttctccta ctgctccgtg 720

gtgttcaggg cctccgccag ggacaagtac aggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc 780

tccgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 840

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 900

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 960

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta cgccagcacg 1020

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1080

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1140

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1200

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1260

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1320

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1380

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1440

agcctctccc tgtctccggg taaa 1464

Claims

1.一种抗PD-L1单域抗体VHH链的互补决定区CDR，其特征在于，所述VHH链的互补决定区CDR包含：

SEQ ID NO:5所示的CDR1、SEQ ID NO:6所示的CDR2，SEQ ID NO:7所示的CDR3。

2.一种抗PD-L1单域抗体的VHH链，其特征在于，所述VHH链包括框架区FR和权利要求1所述的互补决定区CDR。

3.如权利要求2所述的VHH链，其特征在于，所述的框架区FR选自下组的一种：

(a)SEQ ID NO:1所示的FR1，SEQ ID NO:2所示的FR2，SEQ ID NO:3所示的FR3，SEQ ID NO:4所示的FR4组成；

(b)SEQ ID NO:10所示的FR1，SEQ ID NO:11所示的FR2，SEQ ID NO:12所示的FR3，SEQ ID NO:13所示的FR4组成。

4.一种抗PD-L1单域抗体，其特征在于，它是针对PD-L1表位的单域抗体，并且具有权利要求2所述的VHH链。

5.如权利要求4所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包括单体或二聚体。

6.如权利要求4所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14所示。

7.一种PD-L1单域抗体-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N’-C’端具有如下元件：

A-Fc；

其中，A元件为SEQ ID NO:14所示的序列；

“-”代表肽键。

8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

9.一种抗PD-L1单域抗体四价体，其特征在于，所述四价体具有如下结构

A-L-P~P-L-A；其中，

P元件为权利要求7所述的融合蛋白，

A元件为SEQ ID NO:14所示的序列；

L代表连接子；

“-”代表肽键；

“~”代表二硫键。

10.如权利要求9所述的抗PD-L1单域抗体四价体，其特征在于，所述连接子选自以下序列：GGGGSGGGS、GS、(GGGGS)n，其中n=1或2或3或4。

11.如权利要求9所述的抗PD-L1单域抗体四价体，其特征在于，所述PD-L1单域抗体四价体的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。

12.一种多核苷酸或其组合，其特征在于，所述多核苷酸编码选自一种或多种蛋白质：如权利要求1所述的抗PD-L1单域抗体VHH链的CDR区、如权利要求2所述的抗PD-L1单域抗体的VHH链、如权利要求4所述的抗PD-L1单域抗体、或如权利要求9所述的四价体。

13.如权利要求12所述的多核苷酸或其组合，其特征在于，所述多核苷酸选自下组的一种或多种：SEQ ID NO:9、15、18所示的核苷酸序列。

14.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求12所述的多核苷酸或其组合。

15.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求14所述的表达载体，或其基因组中整合有如权利要求12所述的多核苷酸或其组合。

16.如权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自下组：哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母细胞、噬菌体。

17.一种产生抗PD-L1单域抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养如权利要求15所述的宿主细胞，从而获得含所述抗PD-L1单域抗体的培养物；

(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗PD-L1单域抗体；

(c)分离和/或纯化步骤(b)所获得的PD-L1单域抗体。

18.如权利要求4所述的抗PD-L1单域抗体经化学标记或生物标记制得的结合物。

19.如权利要求18所述的结合物，其特征在于，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为生物素、亲和素或酶。

20.如权利要求4所述抗PD-L1单域抗体或如权利要求18-19中任一项所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

21.如权利要求20所述的偶联物，其特征在于，所述介质选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI磁共振成像或CT电子计算机X射线断层扫描技术造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶，或化疗剂。

22.如权利要求21所述的偶联物，其特征在于，所述细胞因子为IL-2。

23.如权利要求21所述的偶联物，其特征在于，所述前药激活酶为DT-心肌黄酶DTD或联苯基水解酶-样蛋白质BPHL。

24.如权利要求21所述的偶联物，其特征在于，所述化疗剂为顺铂。

25.如权利要求4-6中任一项所述抗PD-L1单域抗体、如权利要求18-19中任一项所述的结合物和/或如权利要求20-21中任一项所述的偶联物在制备检测PD-L1表达的产品中的应用。

26.一种试剂盒，所述试剂盒含有选自下组的一种或多种：如权利要求4所述抗PD-L1单域抗体、如权利要求18-19中任一项所述的结合物，或如权利要求20所述的偶联物。

27.如权利要求4所述抗PD-L1单域抗体、如权利要求7所述融合蛋白、如权利要求9所述抗PD-L1单域抗体四价体在制备阻断PD-L1与PD-1结合的制剂中的应用。

28.一种药物组合物，其特征在于，包括选自下组的一种或多种：如权利要求4所述的抗PD-L1单域抗体、如权利要求7所述的融合蛋白、如权利要求9所述的抗PD-L1单域抗体四价体，和药学上可接受的载体。

29.如权利要求28所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为注射剂型。

30.如权利要求28所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。