CN117820490A - Vegf和ang-2双特异性抗体及其应用 - Google Patents

Vegf和ang-2双特异性抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种VEGF和ANG‑2双特异性抗体及其应用，该双抗包括：第一结合区，所述第一结合区包含单链抗体，所述单链抗体具有ANG‑2结合活性；第二结合区，所述第二结合区包括VEGF受体片段。根据本发明实施例的双特异性抗体与VEGF和ANG‑2具有较好的结合活性，能够有效阻断VEGF和ANG‑2与其各自受体的结合，从而有效治疗或预防血管生成引起的相关疾病。

Description

VEGF和ANG-2双特异性抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种VEGF和ANG-2双特异性抗体及其应用，更具体地，本发明涉及一种双抗、抗体或抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞、组合物、药物、试剂盒、制备试剂盒的用途、制药用途。
背景技术
血管生成参与多种疾病的发病机理，包括实体瘤，眼内新生血管综合征(intraocular neovascular syndromes)，如增殖性视网膜病变(proliferativeretinopathies)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degenetarion，AMD)，炎性疾病，如类风湿关节炎(rheumatoid arthritis)和牛皮癣等。
血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，在血管发生、维持及生成中发挥重要生理功能，具有诱导内皮细胞存活、增殖、迁移、血管增生和增加血管通透性等重要作用。因此，对VEGF信号通路的抑制，可以治疗肿瘤、眼科等血管生成引起的相关的疾病。
在VEGF抑制剂方面开展的工作包括：有抑制作用的抗VEGF单克隆抗体，例如贝伐珠单抗(WO 98/45331)、兰尼单抗(WO98/45331)；和可溶性的VEGF受体(VEGFR)抑制剂，例如阿柏西普。
血管生成素-2(Angiopoietin 2，ANG-2)是一个分子量约为70kDa的分泌型糖蛋白，在血管生成、炎症和血管发育中起复杂作用，在高度血管生成组织的血管内皮细胞、平滑肌细胞、肺上皮细胞、分化的肌管和神经祖细胞中表达。ANG-2与其受体TEK酪氨酸激酶(TEK Tyrosine Kinase，TIE2)结合后，促进内皮细胞的生存、增殖和迁移，并促进出芽式血管生成，它诱导血管壁周细胞的损失，增加血管通透性。因此，对ANG-2信号通路进行抑制，可以治疗肿瘤、眼科等血管生成引起的相关的疾病。
在ANG-2抑制剂方面开展的工作包括：有抑制作用的抗ANG-2单克隆抗体，和可溶性的ANG-2受体抑制剂，例如可溶性TIE2。与单一抑制剂相比，VEGF、ANG-2双抑制剂能够获得协同促进效果，在双抑制剂方面开展的工作包括：具有抑制作用的抗VEGF与具有抑制作用的抗ANG-2双特异性抗体，例如Faricimab(商品名Vabysmo)，是特异性结合人VEGFA的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的非对称Crossmab结构双特异性二价抗体。
进一步地，开发出对VEGF和ANG-2具有更高结合活性的抗体对血管生成相关疾病的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一：
本申请中发明人设计了一种VEGF和ANG-2对称型四价双特异性抗体，经实验验证，意外地发现所述对称型四价双特异性抗体相较于市场上现有的VEGF和ANG-2双特异性抗体具有与VEGF和ANG-2更高的结合活性，可以有效阻断VEGF、ANG-2与其各自受体的结合，具有抑制血管生成和减少血管炎症的作用，且其制备以及功能稳定性也得到提高，能够有效治疗或预防血管生成导致的相关疾病。
因此，在本发明的的第一方面，本发明提出了一种双抗。根据本发明的实施例，所述双抗包括第一结合区，所述第一结合区包含单链抗体，所述单链抗体具有ANG-2结合活性；第二结合区，所述第二结合区包括VEGF受体片段。根据本发明实施例的所述双抗与VEGF和ANG-2均具有较高的结合活性，可以有效阻断VEGF与VEGF受体、ANG-2与其受体，如TIE2的结合，且所述双抗的稳定性较高，在制备和使用过程中均能够稳定发挥作用，能够有效治疗或预防血管生成导致的相关疾病。
根据本发明的实施例，上述双抗还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述双抗为对称双抗。根据本发明的一些具体实施例的对称结构VEGF和ANG-2双抗相较于非对称结构的Faricimab具有更好的结合活性，当然，本领域技术人员可以理解，所述双抗可以是包括具有ANG-2结合活性的单链抗体和VEGF受体片段的不对称抗体。
根据本发明的实施例，所述单链抗体包括抗体重链可变区和抗体轻链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体重链可变区的C端与所述抗体轻链可变区的N端相连，或者所述抗体轻链可变区的C端与所述抗体重链可变区的N端相连。
根据本发明的实施例，所述单链抗体进一步包括第一连接肽。
根据本发明的实施例，所述第一连接肽具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。本领域技术人员可以理解，本领域常规连接肽均可使用，如常规的柔性氨基酸片段或刚性氨基酸片段。
根据本发明的实施例，所述第一连接肽具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述第一连接肽的N端与所述抗体重链可变区的C端相连，所述第一连接肽的C端与所述抗体轻链可变区的N端相连；或者所述第一连接肽的N端与所述抗体轻链可变区的C端相连，所述第一连接肽的C端与所述抗体重链可变区的N端相连。
根据本发明的实施例，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:3、5和7中任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗体重链可变区具有SEQ ID NO:4、6和8中任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗体轻链可变区具有G104位或G105位氨基酸突变。本申请中，发明人以SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，对第105位的G进行突变，或者以SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，对第104位的G进行突变，经实验检测后，意外地发现具有G104位或G105氨基酸突变的抗体轻链可变区的双抗仍然具有较现有的VEGF和ANG-2双抗更高的VEGF和ANG-2结合活性，且其稳定性得到显著提高，在制备和使用过程中均能够稳定存在并发挥作用，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，所述重链可变区具有G44位氨基酸突变。本申请中，发明人以SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，对第44位的G进行突变，或者以SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，对第44位的G进行突变，经实验检测后，意外地发现具有G44氨基酸突变的抗体重链可变区的双抗仍然具有较现有的VEGF和ANG-2双抗更高的VEGF和ANG-2结合活性，且其稳定性得到显著提高，在制备和使用过程中均能够稳定存在并发挥作用，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，所述抗体轻链可变区具有G104C或G105C突变。本申请中，发明人以SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第105位的G突变为C，或者以SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第104位的G突变为C，发明人意外地发现具有G104C或G105C氨基酸突变的抗体轻链可变区的双抗仍然具有较现有的VEGF和ANG-2双抗更高的VEGF和ANG-2结合活性，且抗体间其稳定性得到显著提高，稳定性提高的原因可能是G突变为C后抗体分子内易形成二硫键，由此在一定程度上提高其稳定性，有利于提高所述双抗制备过程中的纯度，降低制备难度，且在使用过程中，所述双抗能够稳定发挥作用，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，所述抗体重链可变区具有G44C突变。本申请中，发明人以SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第44位的G突变为C，或者以SEQID NO:8所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第44位的G突变为C，发明人意外地发现具有G44C突变的抗体重链可变区的双抗仍然具有较现有的VEGF和ANG-2双抗更高的VEGF和ANG-2结合活性，且其稳定性得到显著提高，有利于提高所述双抗制备过程中的纯度，降低制备难度，且在使用过程中，所述双抗能够稳定发挥作用，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:9和11中任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗体重链可变区具有SEQ ID NO:10和12中任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VEGF受体片段包括选自VEGFR1片段、VEGFR2片段和VEGFR3片段中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述VEGF受体片段包括免疫球蛋白样区域1、免疫球蛋白样区域2和免疫球蛋白样区域3中的至少之一。
需要说明的是，VEGF受体由细胞外的VEGF结合区、受体的跨膜区(TM)和细胞内的信号传导结构域三部分组成，其中，VEGF结合区由7个免疫球蛋白样结构构成，具体分为免疫球蛋白样区域1～免疫球蛋白样区域7(或称D1～D7)，本领域技术人员可以理解，任何能够与VEGF结合的受体片段均在本申请的保护范围之内。
根据本发明的实施例，所述VEGF受体片段包括所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2和/或所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3。根据本发明的一些具体实施例，当所述VEGF受体片段包括所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2和/或所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3时，获得的双抗具有更强的VEGF结合活性。
根据本发明的实施例，所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2的N末端与所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的C末端相连。
根据本发明的实施例，所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2的C末端与所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的N末端相连。
根据本发明的实施例，所述第二结合区进一步包括抗体Fc片段。
根据本发明的实施例，所述Fc片段的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体和灵长目源抗体或鼠源抗体、人源抗体和灵长目源抗体突变体中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述Fc片段的至少一部分来自于人源抗体或其突变体。
根据本发明的实施例，所述Fc片段的至少一部分来自于人源抗体IgG或其突变体。
根据本发明的实施例，所述Fc片段的至少一部分来自于人源抗体IgG1或其突变体。
根据本发明的实施例，所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2的C末端与所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的N末端相连，所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的C末端与所述Fc片段的N末端相连；或者所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2的N末端与所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的C末端相连，所述VEGFR1中的免疫球蛋白样区域2的C末端与所述Fc片段的N末端相连。
根据本发明的实施例，所述第二结合区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗体进一步包括第二连接肽。
根据本发明的实施例，所述Fc片段的C端与所述第二连接肽的N端相连，所述第二连接肽的C端与所述单链抗体的N端相连。
根据本发明的实施例，所述第二连接肽具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。本领域技术人员可以理解，本领域常规连接肽均可使用，如常规的柔性氨基酸片段或刚性氨基酸片段。
根据本发明的实施例，所述第二连接肽具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述双抗包括：1)SEQ ID NO:13、14、15、16和17任一项所示的氨基酸序列；或2)与SEQ ID NO:13、14、15、16和17任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区具有第104位或第105位氨基酸突变。本申请中，发明人以SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，对第105位的G进行突变，或者以SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，对第104位的G进行突变，经实验检测后，发明人意外地发现具有G104位或G105氨基酸突变的轻链可变区的抗体或抗原结合片段仍然具有较高的ANG-2结合活性，且其稳定性得到显著提高，有利于提高所述抗体或抗原结合片段制备过程中的纯度，降低制备难度，且在使用过程中，所述抗体或抗原结合片段能够稳定发挥作用，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述轻链可变区具有G104C或G105C突变。本申请中，发明人以SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第105位的G突变为C，或者以SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第104位的G突变为C，意外地发现具有G104C或G105C氨基酸突变的轻链可变区的抗体或抗原结合片段仍然具有较高的ANG-2结合活性，且G突变为C后抗体分子内易形成二硫键，抗体间其稳定性得到显著提高，有利于提高所述抗体或抗原结合片段制备过程中的纯度，降低制备难度，且在使用过程中，所述抗体或抗原结合片段能够稳定发挥作用，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:9和11中任一项所示的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有第44位氨基酸突变。本申请中，发明人以SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，对第44位的G进行突变，或者以SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，对第44位的G进行突变，发明人意外地发现具有G44位氨基酸突变的重链可变区的抗体或抗原结合片段仍然具有较高的ANG-2结合活性，且其稳定性得到显著提高，有利于提高所述抗体或抗原结合片段制备过程中的纯度，降低制备难度，且在使用过程中，所述抗体或抗原结合片段能够稳定发挥作用，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述重链可变区具有G44C突变。本申请中，发明人以SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第44位的G突变为C，或者以SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第44位的G突变为C，意外地发现具有G44C突变的重链可变区的抗体或抗原结合片段仍然具有较高的VEGF和ANG-2结合活性，且其稳定性得到显著提高，有利于提高所述抗体或抗原结合片段制备过程中的纯度，降低制备难度，且在使用过程中，所述抗体或抗原结合片段能够稳定发挥作用，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，所述重链可变区具有SEQ ID NO:10和12中任一项所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区具有第104位或第105位氨基酸突变，所述重链可变区具有第44位氨基酸突变。本申请中，发明人以SEQID NO:5所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，对第105位的G进行突变，获得突变后的轻链可变区，以SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第44位的G突变为C，获得突变后的重链可变区；或者以SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，对第104位的G进行突变，获得突变后的轻链可变区，以SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第44位的G突变为C，获得突变后的重链可变区，经实验检测，发明人意外地发现具有上述突变的的轻链可变区和重链可变区的抗体或抗原结合片段具有较高的ANG-2结合活性，且其稳定性得到显著提高，有利于提高所述抗体或抗原结合片段制备过程中的纯度，降低制备难度，且在使用过程中，所述抗体或抗原结合片段能够稳定发挥作用，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述轻链可变区具有G104C或G105C突变。根据本发明的一些具体实施例，发明人以SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第105位的G突变为C，或者以SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第104位的G突变为C，意外地发现具有G104C或G105C氨基酸突变的轻链可变区的抗体或抗原结合片段仍然具有较高的ANG-2结合活性，且G突变为C后抗体分子内易形成二硫键，抗体间其稳定性得到显著提高，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，所述重链可变区具有G44C突变。本申请中，发明人以SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第44位的G突变为C，或者以SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列进行氨基酸位点的定位，将第44位的G突变为C，意外地发现具有G44C突变的重链可变区的抗体或抗原结合片段仍然具有较高的ANG-2结合活性，且其稳定性得到显著提高，治疗或预防血管生成相关疾病的效果优。
根据本发明的实施例，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:9和11中任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述重链可变区具有SEQ ID NO:10和12中任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体。根据本发明的一些具体实施例的单链抗体具有较高的ANG-2结合活性，且所述单链抗体的稳定性得到提高。
根据本发明的实施例，所述单链抗体进一步包括第三连接肽。
根据本发明的实施例，所述第三连接肽具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。本领域技术人员可以理解，本领域常规连接肽均可使用，如常规的柔性氨基酸片段或刚性氨基酸片段。
根据本发明的实施例，所述第三连接肽具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述第三连接肽的N端与所述重链可变区的C端相连，所述第三连接肽的C端与所述轻链可变区的N端相连；或者所述第三连接肽的N端与所述轻链可变区的C端相连，所述第三连接肽的C端与所述重链可变区的N端相连。
根据本发明的实施例，所述单链抗体具有SEQ ID NO:18或19所示的氨基酸序列。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述的双抗或前面所述的抗体或抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸分子获得的所述的双抗能够有效与VEGF和ANG-2进行结合，阻断VEGF和ANG-2与其各自受体进行结合，根据本发明实施例的核酸分子获得的所述抗体或抗原结合片段与ANG-2具有较高的结合活性，能够有效阻断ANG-2与其受体的结合，且所述双抗、抗体或抗原结合片段均具有较高的稳定性，有利于降低制备难度，并稳定发挥抑制作用，能够有效治疗或预防血管生成相关疾病。
根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
根据本发明的实施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:20、21、22、23和24任一项所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:25、26、27或28所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:29和30任一项所示的核苷酸序列。
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带前面所述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将所述核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可，即所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接。当然，这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的双抗或所述抗体或抗原结合片段的表达，进而实现所述双抗或所述抗体或抗原结合片段的体外大量获得。
根据本发明的实施例，上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体、原核表达载体或病毒载体。
根据本发明的实施例，所述原核表达载体包括大肠杆菌表达载体。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，携带前面所述的核酸分子，表达载体，或者表达前面所述的双抗或抗体或抗原结合片段。根据本发明实施例的重组细胞可用于在适合条件下体外表达和大量获得前面所述的双抗或抗体或抗原结合片段。
根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的表达载体导入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。示例性的，所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等；所述真核细胞包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述双抗或抗体或抗原结合片段表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合所述双抗或抗体或抗原结合片段表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述双抗或抗体或抗原结合片段表达的条件。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，包括：前面所述的双抗，抗体或抗原结合片段，核酸分子，表达载体或重组细胞。如前所述，所述双抗，抗体或抗原结合片段，以及所述核酸分子、表达载体或重组细胞表达后获得的蛋白不仅能够有效结合人VEGF和/或ANG-2，且其稳定性均得到提高，有利于提高所述双抗或抗体或抗原结合片段制备过程中的纯度，降低制备难度，且在使用过程中，所述双抗或抗体或抗原结合片段能够稳定发挥作用，因此，根据本发明实施例的组合物中所包含的双抗或抗体或抗原结合片段或经表达后获得的的双抗或抗体或抗原结合片段能够结合人VEGF和/或ANG-2，阻断VEGF和/或ANG-2与其各自受体进行结合，有效治疗或预防血管生成引起的相关疾病。
本发明的组合物也可以相互组合、或与一种或多种其它的治疗化合物组合给药，例如，与化疗剂组合给药。因此，所述组合物还可以含有化疗剂。本发明的双抗或抗体或其抗原结合片段还可以与第二治疗剂组合，所述第二治疗剂的示例性试剂包括但不限于抑制VEGF和/或ANG-2活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)，和/或干扰VEGF和/或ANG-2上游或下游信号转导的试剂。
本领域技术人员可以理解，所述组合物包含食品组合物、药物组合物等。所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，包括前面所述的双抗，抗体或抗原结合片段，核酸分子，表达载体、重组细胞或组合物。如前所述，所述双抗，抗体或抗原结合片段以及所述核酸分子、表达载体、或重组细胞表达后能够获得所述双抗或抗体或抗原结合片段，不仅能够有效结合人VEGF和/或ANG-2，且其稳定性均得到提高，因此，包含上述物质的药物同样能够有效结合人VEGF和/或ANG-2，阻断VEGF和/或ANG-2与其各自受体进行结合，且由于所述双抗和所述抗体或抗原结合片段具有较高的稳定性，所述药物的制备难度降低，能够稳定发挥作用，有效治疗或预防血管生成引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物进一步包括药学上可接受的载体，包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、或其他液体赋形剂、分散剂、矫味剂或悬浮剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、助流剂或润滑剂，等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
例如，本发明的双抗或者抗体或抗原结合片段可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物中。这些药物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物为注射溶液或输注溶液形式。所述双抗或者抗体或抗原结合片段可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。
本发明所述的双抗或者抗体或抗原结合片段的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，依据治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含前面所述的双抗，核酸分子，表达载体或重组细胞。根据本发明实施例提供的所述双抗能够与VEGF和/或ANG-2进行有效结合，此外，在合适条件下，所述核酸分子、表达载体或重组细胞均能够表达所述双抗，进一步地，包含上述物质的试剂盒能够与VEGF和/或ANG-2进行有效结合，可用于有效检测VEGF和/或ANG-2。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的VEGF和/或ANG-2，以获得符合要求的生物样本以进行后续研究；也可以用于对个体状态进行判断，如获得所述个体的VEGF和/或ANG-2水平后，判断其VEGF和/或ANG-2水平是否过高于或低于正常水平，示例性地，所述生物样本可以为细胞、组织、尿液、粪便等。
所述试剂盒还可以包括常规用于检测VEGF和/或ANG-2的试剂，如包被液等。
在本发明的第十一方面，本发明提出了前面所述的双抗，核酸分子，表达载体或重组细胞在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测ANG-2和/或VEGF。如前所述，根据本发明实施例提供的所述双抗能够与VEGF和/或ANG-2进行有效结合，此外，在合适条件下，所述核酸分子、表达载体或重组细胞均能够表达所述双抗，进一步地，包含上述物质的试剂盒能够与VEGF和/或ANG-2进行有效结合，可用于有效检测VEGF和/或ANG-2。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的VEGF和/或ANG-2，也可以用于对个体状态进行判断，如获得所述个体的VEGF和/或ANG-2水平后，判断其VEGF和/或ANG-2水平是否过高于或低于正常水平，所述生物样本可以为细胞、组织、尿液、粪便等。
在本发明的第十二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含前面所述的抗体或抗原结合片段，核酸分子，表达载体或重组细胞。根据本发明实施例提供的所述抗体或抗原结合片段能够与ANG-2进行有效结合，此外，在合适条件下，所述核酸分子、表达载体或重组细胞均能够表达所述抗体或抗原结合片段，进一步地，包含上述物质的试剂盒可用于有效检测ANG-2。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的ANG-2，以获得符合要求的生物样本以进行后续研究；也可以用于对个体状态进行判断，如获得所述个体的ANG-2水平后，判断其ANG-2水平是否过高于或低于正常水平。
所述试剂盒还可以包括常规用于检测ANG-2的试剂，如包被液等。
在本发明的第十三方面，本发明提出了前面所述的抗体或抗原结合片段，核酸分子，表达载体或重组细胞在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测ANG-2。如前所述，根据本发明实施例提供的所述抗体或抗原结合片段能够与ANG-2进行有效结合，此外，在合适条件下，所述核酸分子、表达载体或重组细胞均能够表达所述抗体或抗原结合片段，进一步地，包含上述物质的试剂盒能够与ANG-2进行有效结合，可用于有效检测ANG-2。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的ANG-2，也可以用于对个体状态进行判断，如获得所述个体的ANG-2水平后，判断其ANG-2水平是否过高于或低于正常水平，所述生物样本可以为细胞、组织、尿液、粪便等。
在本发明的第十四方面，本发明提出了前面所述的双抗，抗体或抗原结合片段，核酸分子，表达载体、重组细胞或组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防血管生成引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述血管生成引起的相关疾病包括肿瘤、炎性疾病和眼内新生血管综合征中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括成血管瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述炎性疾病包括类风湿关节炎和牛皮癣中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述眼内新生血管综合征包括增殖性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中的至少之一。
在本发明的第十五方面，本发明提出了一种治疗或预防血管生成引起的相关疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括向受试者施用以下中的至少之一：1)前面所述的双抗；2)前面所述的抗体或抗原结合片段；3)前面所述的核酸分子；4)前面所述的表达载体；5)前面所述的重组细胞；6)前面所述的组合物；和7)前面所述的药物。如前所述，所述双抗与VEGF和/或ANG-2具有较高的结合活性，所述抗体或抗原结合片段能够与ANG-2进行结合，且所述双抗或者所述抗体或抗原结合片段的稳定性较高，能够有效治疗或预防血管生成导致的相关疾病，因此，根据本发明实施例的方法能够有效治疗或预防血管生成引起的相关的疾病。
根据本发明的实施例，上述治疗或预防血管生成引起的相关疾病的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述血管生成引起的相关疾病包括肿瘤、炎性疾病和眼内新生血管综合征的至少之一。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括成血管瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述炎性疾病包括类风湿关节炎和牛皮癣中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述眼内新生血管综合征包括增殖性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中的至少之一。
在本发明的第十六方面，本发明提出了一种诊断血管生成引起的相关疾病的方法。根据本发明的实施例，包括使用下列中的至少之一对待测样品中的ANG-2和/或VEGF进行检测：1)前面所述的双抗；2)前面所述的抗体或抗原结合片段；3)前面所述的核酸分子；4)前面所述的表达载体；和5)前面所述的重组细胞，基于所述ANG-2和/或VEGF的检测结果，确定所述待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量。本申请提出的所述双抗，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的双抗均可以有效与ANG-2和/或VEGF进行结合，所述抗体或抗原结合片段，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与ANG-2进行结合，因此，采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中ANG-2和/或VEGF含量，并可以对ANG-2和/或VEGF引起的相关疾病进行有效诊断。
根据本发明的实施例，上述诊断血管生成引起的相关疾病的方法还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量不低于患病的最低标准是待测样品来源于患有ANG-2和/或VEGF引起的相关疾病的患者的指示。所述最低标准的值可以通过对大量患有所述血管生成引起的相关疾病的个体和大量健康个体的待测样本中的ANG-2和/或VEGF的含量进行差异比较分析、以及验证，而确定下来。
根据本发明的实施例，所述待测样品包括下列中的至少之一：血液、组织、细胞、粪便和尿液。
根据本发明的实施例，所述血管生成引起的相关疾病包括肿瘤、炎性疾病和眼内新生血管综合征中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括成血管瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述炎性疾病包括类风湿关节炎和牛皮癣中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述眼内新生血管综合征包括增殖性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中的至少之一。
在本发明的第十七方面，本发明提出了一种评估血管生成引起的相关疾病分期的方法。根据本发明的实施例，包括使用下列中的至少之一对待测样品中的ANG-2和/或VEGF进行检测：1)前面所述的双抗；2)前面所述的抗体或抗原结合片段；3)前面所述的核酸分子；4)前面所述的表达载体；和5)前面所述的重组细胞，基于所述ANG-2和/或VEGF的检测结果，确定所述待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量。本申请提出的所述双抗，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的双抗均可以有效与ANG-2和/或VEGF进行结合，所述抗体或抗原结合片段，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与ANG-2进行结合，因此，采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中ANG-2和/或VEGF含量，并基于所述ANG-2和/或VEGF含量对ANG-2和/或VEGF引起的血管生成相关疾病所处的时期进行评估。
根据本发明的实施例，上述评估血管生成引起的相关疾病分期的方法还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量不低于肿瘤IV期患病的标准水平是待测样品来源于患有肿瘤IV期的患者的指示，所述待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量位于肿瘤IV期和III期患病的标准水平之间是待测样品来源于患有肿瘤III期的患者的指示；所述待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量处于肿瘤III期和II期患病的标准水平之间是待测样品来源于患有肿瘤II期的患者的指示；所述待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量处于I期和II期患病的标准水平之间是待测样品来源于患有肿瘤I期的患者的指示。本领域技术人员可以理解，所述的肿瘤I期、II期、III期、IV期患病时ANG-2和/或VEGF的水平根据肿瘤种类的不同而变化，判断肿瘤所述时期，只要将所述待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量与对应的该肿瘤阶段ANG-2和/或VEGF的标准水平进行对比即可知晓，或将所述待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量与已知患病时期的个体或群体来源的样品ANG-2和/或VEGF的含量进行对比。所述肿瘤I期、II期、III期、IV期标准水平的值可以通过对大量所述患有血管生成引起的相关疾病的个体和大量健康个体的待测样本中的ANG-2和/或VEGF的含量的差异进行比较分析、以及验证，而确定下来。炎性疾病和眼内新生血管综合症的分期方式或确定标准水平的方式与肿瘤分期或确定标准水平的方式类似，此处不再进行累述，但不同种疾病可以划分的期数或阶段，以及各期或各阶段的标准水平的值相同或不同，本领域技术人员至少可以通过对大量患有所述炎性疾病或眼内新生血管综合症的个体与大量健康个体的待测样本中的ANG-2和/或VEGF的含量的差异进行比较分析、以及验证，而确定所述炎性疾病和眼内新生血管综合症的分期或标准水平的值。
根据本发明的实施例，所述待测样品包括下列中的至少之一：血液、组织、细胞、粪便和尿液。
根据本发明的实施例，所述血管生成引起的相关疾病包括肿瘤、炎性疾病和眼内新生血管综合征的至少之一。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括成血管瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述炎性疾病包括类风湿关节炎和牛皮癣中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述眼内新生血管综合征包括增殖性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中的至少之一。
在本发明的第十八方面，本发明提出了一种评估血管生成引起的相关疾病预后的方法。根据本发明的实施例，包括使用下列中的至少之一对待测样品中的ANG-2和/或VEGF进行检测：1)前面所述的双抗；2)前面所述的抗体或抗原结合片段；3)前面所述的核酸分子；4)前面所述的表达载体；和5)前面所述的重组细胞，基于所述ANG-2和/或VEGF的检测结果，确定所述待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量。如前所述，ANG-2和/或VEGF的含量对血管生成具有重要影响，患有血管生成引起的相关疾病个体进行治疗后，通过监测其组织或排泄物，如外周血、尿液等中的ANG-2和/或VEGF的含量可以有效评估该类疾病的预后，例如，将治疗前后的受试者体内ANG-2和/或VEGF的含量进行比较，或将治疗后的受试者体内ANG-2和/或VEGF的含量与正常个体或患病个体的ANG-2和/或VEGF水平进行比较等方式，本申请提出的所述双抗，或核酸分子、表达载体或重组细胞表达的双抗均可以有效与ANG-2和/或VEGF进行结合，所述抗体或抗原结合片段，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与ANG-2进行结合，因此，采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中ANG-2和/或VEGF的含量，并基于所述ANG-2和/或VEGF的含量对ANG-2和/或VEGF引起的相关疾病的预后进行评估。
根据本发明的实施例，上述评估血管生成引起的相关疾病预后的方法还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述待测样品来源于治疗前或治疗后的患有血管生成引起的相关疾病的患者。
根据本发明的实施例，基于所述治疗前或治疗后的患有血管生成引起的相关疾病的患者的待测样品中的ANG-2和/或VEGF的含量，确定血管生成引起的相关疾病的预后效果。
根据本发明的实施例，治疗后的患有血管生成引起的相关疾病的患者的待测样品中的ANG-2和/或VEGF的含量下降是患者预后良好的指示。
根据本发明的实施例，所述待测样品包括下列中的至少之一：血液、组织、细胞、粪便和尿液。
根据本发明的实施例，所述血管生成引起的相关疾病包括肿瘤、炎性疾病和眼内新生血管综合征的至少之一。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括成血管瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述炎性疾病包括类风湿关节炎和牛皮癣中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述眼内新生血管综合征包括增殖性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中的至少之一。
在本发明的第十九方面，本发明提出了本发明提出了前面所述的双抗，抗体或抗原结合片段，核酸分子，表达载体、重组细胞，组合物或药物在治疗或预防血管生成引起的相关疾病中的用途。如前所述，所述双抗与VEGF和ANG-2均具有较高的结合活性，所述抗体或抗原结合片段能够与ANG-2进行有效结合，且所述双抗或者所述抗体或抗原结合片段的稳定性较高，能够有效治疗或预防血管生成导致的相关疾病。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述血管生成引起的相关疾病包括肿瘤、炎性疾病和眼内新生血管综合征中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括成血管瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述炎性疾病包括类风湿关节炎和牛皮癣中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述眼内新生血管综合征包括增殖性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中的至少之一。
在本发明的第二十方面，本发明提出了本发明提出了前面所述的双抗，抗体或抗原结合片段，核酸分子，表达载体或重组细胞在诊断血管生成引起的相关疾病、评估血管生成引起的相关疾病分期或评估血管生成引起的相关疾病预后中的用途。如前所述，本申请提出的所述双抗，或核酸分子、表达载体或重组细胞表达的双抗均可以有效与ANG-2和/或VEGF进行结合，所述抗体或抗原结合片段，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与ANG-2进行结合，因此，采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中ANG-2和/或VEGF含量，并可以对ANG-2和/或VEGF引起的相关疾病进行有效诊断、疾病分期和疾病预后评估。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述血管生成引起的相关疾病包括肿瘤、炎性疾病和眼内新生血管综合征中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括成血管瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述炎性疾病包括类风湿关节炎和牛皮癣中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述眼内新生血管综合征包括增殖性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中的至少之一。
本发明的有益效果：
1)本发明设计并经实验验证后获得的所述双抗较上市药物Faricimab具有更高的VEGF和ANG-2结合活性，并有效阻断VEGF与VEGFR结合以及阻断ANG-2与TIE2结合，此外，所述双抗的稳定性较高，有利于提高所述双抗制备过程中的纯度，降低制备难度，且在使用过程中，所述双抗能够稳定发挥抗血管生成和减少血管炎症的作用，从而有效治疗或预防血管生成引起的相关疾病。
2)本发明获得的所述抗体或抗原结合片段具有较高的ANG-2结合活性，并有效阻断ANG-2与其受体的结合，如受体TIE2，此外，所述抗体或抗原结合片段的稳定性较高，其制备过程中的纯度较高，有利于降低制备难度，且在使用过程中，所述抗体或抗原结合片段能够稳定发挥抗血管生成和减少血管炎症的作用，从而有效治疗或预防血管生成引起的相关疾病。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是根据本发明实施例的双抗的结构1和结构2的示意图；
图2是根据本发明实施例的双抗对VEGF介导的报告基因表达的阻断活性检测结果图；
图3是根据本发明实施例的双抗对VEGF介导的HUVEC增殖活性影响检测结果图；
图4是根据本发明实施例的双抗与人ANG-2的结合活性检测结果图；
图5是根据本发明实施例的双抗与猴ANG-2的结合活性检测结果图；
图6是根据本发明实施例的双抗与鼠ANG-2结合活性检测结果图；以及
图7是根据本发明实施例的双抗ANG-2阻断活性检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在对本发明描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。
本发明所述的双抗、抗体或抗原结合片段通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本领域技术人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“抗体”通常是指可识别一种或多种抗原表位的抗体，包括但不限于单抗、多抗、多聚体抗体和CDR移植抗体。
在本文中，术语“单抗”是指仅可识别一种特定抗原表位的抗体。其中，常见的单抗为包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子，该重链或轻链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，该重链或轻链的羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)；L链和H链的V区分别称为VL和VH。单抗还可以为小分子抗体，小分子抗体主要包括：Fab抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体。
在本文中，术语“多抗”是指可识别多种抗原表位的抗体，例如可识别两种抗原表位的抗体(简称双抗)、三种抗原表位的抗体或者四种抗原表位的抗体，其为广义理解，具体结构不受限制，可识别多种抗原表位即可。示例性地，如图1所示的双抗。
在本文中，术语“CDR移植抗体”是指将一个物种单抗的CDR移植至另一物种抗体可变区。例如，可将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，以便替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。需要说明的是，本申请中的多抗和单抗均可为CDR移植抗体。
在本文中，术语“Fab抗体”通常是指仅含Fab分子的抗体，其由重链的VH和CH1以及完整的轻链构成，轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中，术语“单域抗体”其最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-Casterman C,AtarhouchT,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:“Naturallyoccurringantibodies devoid of light chains”；Nature 363,446-448(1993))，只包含重链可变区(VH)和常规的CH2与CH3区，其通过重链可变区与抗原特异性结合。
在本文中，术语“Fv抗体”通常是指仅由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过非共价键连接而成的抗体，是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。
在本文中，术语“突变”可以指对任何天然存在的或工程化的分子进行包含一个或多个核苷酸或氨基酸改变的操作。
在本文中，术语“突变体”可以指包含一个或多个核苷酸或氨基酸突变的任何天然存在的或工程化的分子。
在本文中，“对称双抗”是指具有两条或多条相同的肽链1的抗体，所述肽链1的条数不受特别限制，例如，以双抗Fc片段两条肽链中间的中轴线为对称线，其左右两边的结构和序列完全相同的双抗。示例性地，如图1所示的双抗，其中，所述双抗中的结构1具有两条相同的肽链1，所述肽链1包括第一结合区和第二结合区，所述第一结合区包含单链抗体，所述单链抗体具有ANG-2结合活性，所述单链抗体包括抗体重链可变区、第一连接肽和抗体轻链可变区，所述第一连接肽的N端与所述抗体轻链可变区的C端相连，所述第一连接肽的C端与所述抗体重链可变区的N端相连；所述第二结合区包括VEGF受体片段，所述VEGF受体片段包括所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2和/或所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3，所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2的C末端与所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的N末端相连；所述第二结合区进一步包括抗体Fc片段，所述抗体Fc片段包括CH2和CH3区，所述CH2区的C端和所述CH3区的N端相连，所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2的C末端与所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的N末端相连，所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的C末端与所述Fc片段的N末端相连；所述双抗进一步包括第二连接肽，所述Fc片段的C端与所述第二连接肽的N端相连，所述第二连接肽的C端与所述单链抗体的N端相连，所述两条相同的肽链1通过二硫键进行连接。
在本文中，术语“不对称双抗”，通常是指具有两条或多条不完全相同的肽链的抗体，所述不完全相同的肽链的条数不受特别限制，且所述两条或多条不完全相同的肽链之间通过作用力结合形成完整的所述不对称抗体，示例性的，例如包括具有ANG-2结合活性的单链抗体、VEGF受体片段和Fc片段的不对称抗体，所述Fc区可以通过knob into hole结构进行连接。
所述“knob into hole结构”是在抗体重链恒定区的CH3区形成钮(Knob)扣(hole)突变，便于重链咬合，形成异二聚体，例如，通过突变人IgG1重链恒定区CH3结构域中氨基酸(一条链中为T366S、L368A、Y407V、Y349C突变，即“hole”；另一链中为T366W、S354C突变，即“knob”)实现。
在本文中，术语“片段”包括完整的目标蛋白或具有N-末端(N端)或C-末端(C端)截短、和/或内部删除、增加的多肽。例如，VEGF受体片段可为完整的VEGF受体(如VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3)，也可为截短的VEGF受体(例如VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3)多肽；如本申请中所述VEGF受体片段为VEGFR1中的免疫球蛋白样区域2和/或VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3。
在本文中，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸，脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式，及其组合。
在本文中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。
在本文中，术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。
在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中，术语“至少90％同一性”指序列与其对应的各参考序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％，所述序列包括氨基酸序列、核酸序列、DNA与RNA的融合序列或者氨基酸与核酸的融合序列。
在本文中，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。
在本文中，术语“治疗”是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述双抗或者所述抗体或抗原结合片段给予有需要的个体。
在本文中，术语“血管生成引起的相关疾病”通常是指由血管生成(或称血管新生)引起的疾病，包括但不限于癌症、眼科疾病或炎性疾病。示例性地，所述癌症可为实体瘤或血液瘤，包括但不限于血管瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤；所述眼科疾病可为眼内新生血管综合征(例如增殖性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性)；所述炎性疾病包括但不限于类风湿关节炎和牛皮癣。
在本文中，当SEQ ID NO:5、6、7、8作为“氨基酸定位序列”时，不构成对本发明所述(抗体)轻链可变区和(抗体)重链可变区的限制，所述(抗体)轻链可变区和(抗体)重链可变区除SEQ ID NO:5、6、7、8外，亦可以用于其它已然发生突变ANG-2抗体的轻链可变区和/或重链可变区的改进，只需要使得前面描述的突变位点的变异发生在相对于SEQ ID NO:5、6、7、8所示的ANG-2抗体的轻链可变区和/或重链可变区的相应位置上即可，例如，本文中描述的以SEQ ID NO:5作为氨基酸定位序列时的G105C突变，以SEQ ID NO:7作为氨基酸定位序列时的G104C突变，以SEQ ID NO:6作为氨基酸定位序列时的G44C突变，或者以SEQ ID NO:8作为氨基酸定位序列时的G44C突变。本领域技术人员可通过常规得序列分析方法找到相应的位点。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1不同结构双特异性抗体制备和表达量检测
本实施例构建了表达不同结构的四价双特异性抗体GB10-01、GB10-02，所述不同结构的四价双特异性抗体如图1所示，其中，结构1所示的双抗包括2条相同的肽链，这2条相同的肽链通过二硫键进行连接，每条肽链包括第一结合区(VEGF受体片段和Fc区)和第二结合区(ANG-2单链抗体或ANG-2单链可变片段)，具体地，所述结构1的肽链包括N端的VEGF受体片段(由VEGF受体1中的免疫球蛋白样区域2和VEGF受体2中的免疫球蛋白样区域3组成)、Fc片段和C端的ANG-2单链可变片段(Single-chain variable fragment，scFv)，其中，所述ANG-2单链可变片段通过连接肽与所述Fc片段进行连接，此外，所述ANG-2单链可变片段中的轻链可变区的C端与连接肽的N端进行连接，连接肽的C端与所述重链可变区的N端进行连接。结构2所示的双抗也包括两条相同的肽链，这2条相同的肽链之间通过二硫键进行连接，每条肽链包括第一结合区(VEGF受体片段和Fc区)和第二结合区(ANG-2单链抗体或ANG-2单链可变片段)，具体地，所述结构2抗体的每条肽链包括N端的ANG-2单链可变片段、VEGF受体片段(由VEGF受体1中的免疫球蛋白样区域2和VEGF受体2中的免疫球蛋白样区域3组成)和C端的Fc片段，其中，所述ANG-2单链可变片段中的轻链可变区的C端与连接肽的N端进行连接，连接肽的C端与所述重链可变区的N端进行连接。两种结构抗体的氨基酸序列如表1所示。
将表1所示的编码四价双特异性抗体GB10-01和GB10-02的核苷酸序列送至金唯智进行核苷酸密码子优化，合成各自抗体的pcDNA3.1载体，构建成表达质粒Plasmid-X，并转化至大肠杆菌中。将转化后的大肠杆菌分别按1％接种量接种活化并扩培至200mL含有氨苄抗性的LB培养基中，于37℃，200rpm中振荡培养过夜，然后使用质粒大提试剂盒(天根，DP117)进行质粒提取。
将获得的表达两种结构抗体的表达质粒Plasmid-X分别经过0.22μm滤膜过滤后，用PEI转染试剂(Polysciences，08APR22)将质粒转染至100mL 293F细胞(Thermo，A14527CN)中，转染的实验操作采用本领域常规技术进行即可，转染20-24h后添加Feed(Sino Biological，M293-SUPI)，以后隔天加适量Feed，培养6天后收集蛋白。
转染第6天分别收集细胞培养上清液，加入充分重悬的Protein A凝胶溶液，充分混匀后置于4℃孵育1小时，将Protein A和细胞培养上清的混合物转移到重力柱中，待混合物中液体流净，使用10倍柱体积的洗脱液洗涤Protein A凝胶，收集蛋白洗脱液，并加入4mLpH 8.5的Tris-HCl中和液，于室温孵育5min，得到目标产物四价双特异性抗体蛋白GB10-01、GB10-02，使用Nanodrop测定不同结构的蛋白浓度，根据转染体积及纯化后的蛋白产量计算表达量，如表2所示。其中结构1的表达量优于结构2。
表1：不同结构四价双特异性抗体氨基酸序列
表2：不同结构四价双特异性抗体表达量
表达量
结构1：GB10-01 0.172mg/mL
结构2：GB10-02 0.064mg/mL
实施例2结构1四价双特异性抗体表达载体的构建
本实施例构建了表达结构1所示的四价双特异性抗体GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26、GB10-39的表达载体，所述6种四价双特异性抗体的结构如图1中的结构1所示，包括2条相同的肽链，这2条相同的肽链通过二硫键进行连接，每条肽链包括第一结合区(VEGF受体片段和Fc区)和第二结合区(ANG-2单链抗体或ANG-2单链可变片段)，具体地，所述结构1的肽链包括N端的VEGF受体片段(由VEGF受体1中的免疫球蛋白样区域2和VEGF受体2中的免疫球蛋白样区域3组成)、Fc片段和C端的ANG-2单链可变片段，其中，所述ANG-2单链可变片段通过连接肽与所述Fc片段进行连接，所述ANG-2单链可变片段中的轻链可变区的C端与连接肽的N端进行连接，连接肽的C端与所述轻链可变区的N端进行连接，双抗GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26、GB10-39的各组成的氨基酸序列如表3所示，单条肽链的完整氨基酸序列如表4所示，完整的编码上述双特异性抗体单条肽链的核苷酸序列如表5所示。
将表5所示的编码双抗GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26、GB10-39的核苷酸序列送至金唯智合成各自的载体pcDNA3.1，构建成表达质粒Plasmid-X，并转化至大肠杆菌中。将转化后的大肠杆菌按1％接种量分别接种活化并扩培至200mL含有氨苄抗性的LB培养基中，于37℃，200rpm中振荡培养过夜，然后使用质粒大提试剂盒(天根，DP117)进行质粒提取。
表3：四价双特异性抗体的氨基酸序列
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表4：四价双特异性抗体单条肽链以及单链抗体的氨基酸序列
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表5：编码四价双特异性抗体单条肽链、单链抗体轻重链可变区以及单链抗体的核苷酸序列
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实施例3四价双特异性抗体的表达及纯化
本实施例将实施例2获得的多个表达质粒Plasmid-X经过0.22μm滤膜过滤后，用PEI转染试剂(Polysciences，08APR22)将质粒转染至293F细胞(Thermo，A14527CN)中，转染的实验操作采用本领域常规技术进行即可，转染20-24h后添加Feed(Sino Biological，M293-SUPI)，以后隔天加Feed，培养6天后收集蛋白。
转染第6天收集细胞培养上清液，加入充分重悬的Protein A凝胶溶液，充分混匀后置于4℃孵育1小时，将Protein A和细胞培养上清的混合物转移到重力柱中，待混合物中液体流净，使用10倍柱体积的洗脱液洗涤Protein A凝胶，收集蛋白洗脱液，并加入4mL pH8.0的Tris-HCl中和液，于室温孵育5min，得到目标产物四价双特异性抗体蛋白GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26和GB10-39。
实施例4四价双特异性抗体亲和力测定
本实施例将实施例3获得的四价双特异性抗体蛋白GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26和GB10-39，利用Octet进行人VEGFa165.his、人PLGF.his以及人ANG-2.his亲和力测定，并以Faricimab(百英生物，货号B936701，批号20220108Z003)作为对照品。
4.1四价双特异性抗体与人VEGFa165及人PLGF的亲和力测定
将ProA传感器(Sartorius，18-5010)置于1×KB溶液中浸泡10分钟，用1×KB溶液将待测样品GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26、GB10-39以及对照品Faricimab稀释至1ug/mL。将预湿完成的传感器转入1×KB溶液中平衡60秒，再分别置于含有上述蛋白的溶液中，使各个蛋白偶联至ProA传感器上，捕获结束触发点设置为Loading厚度达1.0nm，震摇速度设为1000rpm/min。用1×KB将人VEGFa165.his(ACRO，VE5-H5248)及人PLGF.his(Novoprotein，CW90)稀释至50nmol/L，然后在黑色96孔板中2倍梯度依次稀释8个浓度，最后一孔浓度为0nmol/L。将偶联有蛋白的传感器分别转入1×KB中再平衡120秒，再置于不同浓度的人VEGFa165.his及人PLGF.his溶液中进行结合，震摇速度为1000rpm/min。然后，将结合有不同浓度样品的ProA传感器转入1×KB中进行解离，震摇速度设为1000rpm/min。将解离完成后的传感器分别置于10mmol/L甘氨酸溶液及1×KB中，时间为5秒，震摇速度设为1000rpm/min，循环3次，ProA传感器上的复合物即可被洗脱，再依次进行下一个样品的分析。
亲和力测定结果如表6所示，其中，四价双特异性抗体蛋白GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26对于VEGF的亲和力优于Faricimab，GB10-39劣于Faricimab，并不是任何的VEGF受体片段和任一ANG-2单链抗体构建的双抗都具有优于Faricimab的亲和力。
表6：
4.2四价双特异性抗体与人ANG-2的亲和力测定
将NTA传感器(Sartorius，18-5101)置于1×KB溶液中浸泡10分钟。用1×KB溶液将人ANG-2.his蛋白(Sino，10691-H08H)稀释至1μg/mL。将预湿完成的传感器转入1×KB溶液中平衡60秒，再分别置于上述人ANG-2.his溶液中，使人ANG-2.his偶联至NTA传感器上，捕获结束触发点设置为Loading厚度达1.0nm，震摇速度设为1000rpm/min。用1×KB将待测样品(GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26、GB10-39和Faricimab)稀释至30nmol/L，然后在黑色96孔板中2倍梯度依次稀释8个浓度，最后一孔浓度为0nmol/L。将偶联有人ANG-2.his的传感器分别转入1×KB中再平衡120秒，再置于上述不同浓度的待测样品溶液中进行结合，震摇速度为1000rpm/min。然后，将结合有不同浓度待测样品的NTA传感器转入1×KB溶液中进行解离，震摇速度设为1000rpm/min。将解离完成后的传感器分别置于10mmol/L甘氨酸溶液及1×KB中，时间为5秒，震摇速度设为1000rpm/min，循环3次，NTA传感器上的复合物即可被洗脱，再转入于10mmol/L NiCl2溶液中活化60秒，即可进行下一个样品的分析。亲和力测定结果见表7所示，GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26、GB10-39对于ANG-2的亲和力优于Faricimab，但GB10-39在6个分子中对于ANG-2的亲和力最弱。
表7：
实施例5四价双特异性抗体VEGF阻断活性测定
本实施例对实施例3获得的纯化后的四价双特异性抗体蛋白GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24和GB10-26进行阻断活性检测，并以上述Faricimab为对照品。
5.1VEGF报告基因活性检测
将H-VEGF Reporter 293cell(GM-C09057)细胞悬液加入96孔微孔板(BeyoGold，FCP968)，2.5*104细胞/50μL/孔，二氧化碳培养箱培养过夜。培养结束后，取出微孔板，于每孔加入50μL含有VEGF165(终浓度5ng/mL，购自近岸生物C083)和不同梯度稀释(最高浓度25mM，3倍稀释12个梯度)的待测样品(GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26和Faricimab)混合液培养基，于37℃、5％ CO2培养箱中继续维持培养，培养6小时后，每孔加入荧光素酶报告基因检测试剂100μL(Vazyme DD1203)，孵育15分钟后读取化学发光数值RLU。利用GraphPad Prism 8.0软件分析数据，进行抑制活性的拟合，得到VEGF阻断活性IC50值。
阻断结果如表8及图2所示，其中，四价双特异性抗体GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26对VEGF介导的报告基因表达有明显阻断活性，阻断活性优于Faricimab。
表8：VEGF报告基因活性IC50
样品 IC50(nM)
GB10-01 0.05
GB10-20 0.04
GB10-22 0.02
GB10-24 0.04
GB10-26 0.04
Faricimab 0.16
5.2HUVEC细胞增殖活性检测
将HUVEC细胞(Promocell#C12205)悬液加入96孔微孔板(Corning，3917)中，3000细胞/50μL/孔，于二氧化碳培养箱过夜。取出微孔板，每孔加入50μL含有VEGF165(终浓度5ng/mL，近岸生物C083)和梯度稀释(最高浓度25mM，3倍稀释12个梯度)的待测样品(GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26和Faricimab)混合液培养基，于37℃、5％ CO2培养箱中继续维持培养，3天后，用CellTiter-Luminescent Cell Viability Assay(Promega G7570)检测细胞增殖结果。每孔加入检测试剂50μL，震荡后孵育15分钟，读取化学发光数值RLU。利用GraphPad Prism 8.0软件分析数据，进行抑制活性的拟合，得到HUVEC增殖抑制活性IC50值。结果如表9及图3所示，GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26对VEGF介导的HUVEC增殖有明显阻断活性，且其阻断活性优于Faricimab。/>
表7：HUVEC增殖活性IC50值
样品 IC50(nM)
GB10-01 0.07
GB10-20 0.06
GB10-22 0.05
GB10-24 0.05
GB10-26 0.05
Faricimab 0.13
实施例6四价双特异性抗体ANG-2结合活性测定
本实施例对实施例3获得的纯化后的四价双特异性抗体进行ANG-2结合活性测定，并以上述Faricimab为对照品。
将人ANG-2蛋白(Sino，10691-H08H)、猴ANG-2蛋白(Sino，90026-C08H)、鼠ANG-2(Acro，AN2-M52H3)蛋白稀释制得1μg/mL包被液，分别以100μL/孔加入酶标板中，于2～8℃包被12小时以上。弃去包板残液，加入2％ BSA-PBS，每孔200μL，于37℃封闭2小时后，每孔加入300μL的PBST洗3次。用PBS将待测样品(GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26和Faricimab)稀释至20nM，再进行3倍稀释为8个梯度，按照体积100μL/孔加入酶标板中，然后于37℃孵育1小时，每孔加入300μL的PBST，洗涤3次后加入稀释10000倍的Goat antiHuman Fc-HRP(abcam，ab97225)，体积为100μL/孔。将酶标板37℃孵育1小时后，每孔加入300uL的PBST，洗涤3次，拍干。加入TMB显色液，每孔100μL。室温反应5分钟后加2M H2SO4终止反应，50μL/孔。将中止反应的酶标板放置酶标仪上，450nm波长下读取吸光度OD450值，利用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，进行结合活性的拟合，得到ANG-2结合活性EC50值。
具体结果如表10及图4、图5、图6所示，GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26对人、猴、鼠ANG-2有明显结合活性，结合活性优于Faricimab。
表8：ANG-2结合活性EC50
样品 人ANG2-EC50(nM) 猴ANG2-EC50(nM) 鼠ANG2-EC50(nM)
GB10-01 0.08 0.07 0.29
GB10-20 0.16 0.04 0.12
GB10-22 0.08 0.06 0.31
GB10-24 0.15 0.05 0.12
GB10-26 0.12 0.09 0.49
Faricimab 0.38 0.38 0.70
实施例7四价双特异性抗体ANG-2阻断活性测定
将TIE2蛋白(Acro，TI2-H5255)稀释制得1μg/mL包被液，分别以100μL/孔加入酶标板，2～8℃包被12小时以上。弃去包板残液，加入2％ BSA-PBS，每孔200μL，37℃封闭2小时后，每孔加入300μL的PBST洗3次。配置含100ng/mL ANG-2蛋白(Sino，10691-H08H)的样品稀释液将待测样品(GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26和Faricimab)稀释至20nM，再3倍稀释8个梯度，100μL/孔加入酶标板。37℃孵育1小时，每孔加入300μL的PBST，洗涤3次后加入稀释10000倍的Goat anti His-HRP(abcam，ab1187)，100μL/孔。37℃孵育1小时后，每孔加入300μL的PBST，洗涤3次，拍干。加入TMB显色液，每孔100μL。室温反应5分钟后加2MH2SO4终止反应，50μL/孔。将中止反应的酶标板放置酶标仪上，450nm波长下读取吸光度OD450值，利用GraphPad Prism7.0软件分析数据，进行抑制活性的拟合，得到ANG-2抑制活性IC50值。
结果如表11及图7所示，GB10-01、GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26对ANG-2与其受体TIE2结合有明显阻断活性，阻断活性优于Faricimab。
表11：ANG-2阻断活性IC50值
样品 IC50(nM)
GB10-01 0.21
GB10-20 0.55
GB10-22 0.28
GB10-24 0.69
GB10-26 0.27
Faricimab 7.19
实施例8不同位置二硫键四价双特异性抗体制备
本实施例设计不同位置的半胱氨酸突变，以探索半胱氨酸的突变位置对双抗各效果的影响，发明人将表5及表12所示的编码GB10-24、GB10-26、GB10-44、GB10-46的核苷酸序列送至金唯智进行核苷酸密码子优化，分别合成载体pcDNA3.1，构建成表达质粒Plasmid-X，并转化至大肠杆菌中，其中，获得的双抗GB10-44、GB10-46的结构参考实施例1中关于结构1的描述，其氨基酸序列如表13所示，GB10-24中的ANG-2单链抗体中的轻链可变区相较于GB10-20包含的ANG-2单链抗体中的轻链可变区(SEQ ID NO:5)发生了G105C突变，GB10-44中的ANG-2单链抗体中的轻链可变区相较于GB10-20包含的ANG-2单链抗体中的轻链可变区发生了G106C突变，GB10-24中的ANG-2单链抗体中的重链可变区相较于GB10-20包含的ANG-2单链抗体中的重链可变区(SEQ ID NO:6)发生了G44C突变，GB10-44中的ANG-2单链抗体中的轻链可变区相较于GB10-20包含的ANG-2单链抗体中的重链可变区发生了G42C突变；此外，GB10-26中的ANG-2单链抗体中的轻链可变区相较于GB10-22包含的ANG-2单链抗体中的轻链可变区(SEQ ID NO:7)发生了G104C突变，GB10-46中的ANG-2单链抗体中的轻链可变区相较于GB10-22包含的ANG-2单链抗体中的轻链可变区发生了G105C突变，GB10-26中的ANG-2单链抗体中的重链可变区相较于GB10-22包含的ANG-2单链抗体中的重链可变区(SEQ IDNO:8)发生了G44C突变，GB10-46中的ANG-2单链抗体中的重链可变区相较于GB10-22包含的ANG-2单链抗体中的重链可变区发生了G42C突变。将转化后的大肠杆菌按1％接种量接种活化并扩培至200mL含有氨苄抗性的LB培养基中，于37℃，200rpm中振荡培养过夜，然后使用质粒大提试剂盒(天根，DP117)进行质粒提取。
获得的表达质粒Plasmid-X分别经过0.22μm滤膜过滤后，用PEI转染试剂(Polysciences，08APR22)将质粒转染至100mL 293F细胞(Thermo，A14527CN)中，转染的实验操作采用本领域常规技术进行即可，转染20-24h后添加Feed(Sino Biological，M293-SUPI)，以后隔天加Feed，培养6天后收集蛋白。
转染第6天收集细胞培养上清液，加入充分重悬的Protein A凝胶溶液，充分混匀后置于4℃孵育1小时，将Protein A和细胞培养上清的混合物转移到重力柱中，待混合物中液体流净，使用10倍柱体积的洗脱液洗涤Protein A凝胶，收集蛋白洗脱液，并加入4mL pH8.0的Tris-HCl中和液，于室温孵育5min，得到目标产物四价双特异性抗体蛋白GB10-24、GB10-26、GB10-44、GB10-46，使用nanodrop测定不同结构的蛋白浓度，根据转染体积及纯化后的蛋白产量计算表达量，如表14所示。其中双抗GB10-24、GB10-26的表达量显著优于GB10-44、GB10-46。
表12：编码双抗GB10-44、GB10-46的核苷酸序列
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表13：双抗GB10-44、GB10-46的氨基酸序列
表14：不同位置二硫键四价双特异性抗体表达量
表达量
GB10-24 0.137mg/mL
GB10-26 0.124mg/mL
GB10-44 0.046mg/mL
GB10-46 0.020mg/mL
实施例9四价双特异性抗体SEC纯度测定
本实施例使用高效液相色谱仪(岛津，LC-20AT)及凝胶色谱柱(G3000SWxl 7.8*30，30指柱长，粒径：5um)对实施例3制备获得的四价双特异性抗体进行纯度检测。具体实验操作如下：
将水更换为100mM PB流动相，将高效液相色谱柱的流速缓慢升至1.000mL/min，至基线平稳。取20μL待测样品(GB10-20、GB10-22、GB10-24、GB10-26)至对应编号的进样瓶中，将样品瓶放入仪器相应的位置，进样时间是15min，分析处理数据并保存，将流动相更换成去离子水，冲洗1.5h。结果如表15所示，随着样品浓度的升高，GB10-24、GB10-26在高浓度状态下SEC纯度明显优于GB10-20、GB10-22。
表15：四价双特异性抗体不同浓度下SEC纯度
样品 2mg/mL 10mg/mL 15mg/mL 20mg/mL 30mg/mL
GB10-20 87.1％ 79.2％ 73.6％ 64.9％ 65.3％
GB10-22 97.0％ 89.8％ 89.2％ 89.4％ 77.1％
GB10-24 91.6％ 90.2％ 90.1％ 88.6％ 87.4％
GB10-26 98.6％ 98.5％ 98.1％ 97.9％ 97.2％
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (14)

1.一种双抗，其特征在于，包括：
第一结合区，所述第一结合区包含单链抗体，所述单链抗体具有ANG-2结合活性；
第二结合区，所述第二结合区包括VEGF受体片段；
任选地，所述双抗为对称双抗；
任选地，所述单链抗体包括抗体重链可变区和抗体轻链可变区；
任选地，所述抗体重链可变区的C端与所述抗体轻链可变区的N端相连，或者所述抗体轻链可变区的C端与所述抗体重链可变区的N端相连；
任选地，所述单链抗体进一步包括第一连接肽；
任选地，所述第一连接肽具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
任选地，所述第一连接肽具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
任选地，所述第一连接肽的N端与所述抗体重链可变区的C端相连，所述第一连接肽的C端与所述抗体轻链可变区的N端相连；或者所述第一连接肽的N端与所述抗体轻链可变区的C端相连，所述第一连接肽的C端与所述抗体重链可变区的N端相连；
任选的，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:3、5和7中任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗体重链可变区具有SEQ ID NO:4、6和8中任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗体轻链可变区具有G104位或G105位氨基酸突变；
任选地，所述重链可变区具有G44位氨基酸突变；
任选地，所述抗体轻链可变区具有G104C或G105C突变；
任选地，所述抗体重链可变区具有G44C突变；
任选地，所述G104位氨基酸突变或G104C突变是以SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列定位的；
任选地，所述G105位氨基酸突变或G105C突变中的氨基酸定位是以SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列定位的；
任选地，所述G44位氨基酸突变或G44C突变中的氨基酸定位是以SEQ ID NO:6或8所示的氨基酸序列定位的；
任选地，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:9和11中任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗体重链可变区具有SEQ ID NO:10和12中任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述VEGF受体片段包括选自VEGFR1片段、VEGFR2片段和VEGFR3片段中的至少之一；
任选地，所述VEGF受体片段包括免疫球蛋白样区域1、免疫球蛋白样区域2和免疫球蛋白样区域3中的至少之一；
优选地，所述VEGF受体片段包括所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2和/或所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3；
优选地，所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2的C末端与所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的N末端相连；
任选地，所述第二结合区进一步包括抗体Fc片段；
任选地，所述Fc片段的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一；
任选地，所述Fc片段的至少一部分来自于人源抗体或其突变体；
任选地，所述Fc片段的至少一部分来自于人源抗体IgG或其突变体；
任选地，所述Fc片段的至少一部分来自于人源抗体IgG1或其突变体；
任选地，所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2的C末端与所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的N末端相连，所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的C末端与所述Fc片段的N末端相连；或者
所述VEGFR1片段中的免疫球蛋白样区域2的N末端与所述VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3的C末端相连，所述VEGFR1中的免疫球蛋白样区域2的C末端与所述Fc片段的N末端相连；
更优选地，所述第二结合区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列；
任选地，所述双抗进一步包括第二连接肽；
任选地，所述Fc片段的C端与所述第二连接肽的N端相连，所述第二连接肽的C端与所述单链抗体的N端相连；
任选地，所述第二连接肽具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
任选地，所述第二连接肽具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
任选地，所述双抗包括：
1)SEQ ID NO:13、14、15、16和17任一项所示的氨基酸序列；或
2)与SEQ ID NO:13、14、15、16和17任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性的氨基酸序列。
2.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区具有G104位或G105位氨基酸突变。
3.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有G44位氨基酸突变。
4.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区具有G104位或G105位氨基酸突变，所述重链可变区具有G44位氨基酸突变。
5.根据权利要求2～4任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区具有G104C或G105C突变；
任选地，所述重链可变区具有G44C突变；
任选地，所述G104位氨基酸突变或G104C突变是以SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列定位的；
任选地，所述G105位氨基酸突变或G105C突变中的氨基酸定位是以SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列定位的；
任选地，所述G44位氨基酸突变或G44C突变中的氨基酸定位是以SEQ ID NO:6或8所示的氨基酸序列定位的；
任选地，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:9和11中任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO:10和12中任一项所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求4～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单链抗体；
任选地，所述单链抗体进一步包括第三连接肽；
任选地，所述第三连接肽具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
任选地，所述第三连接肽具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
任选地，所述第三连接肽的N端与所述重链可变区的C端相连，所述第三连接肽的C端与所述轻链可变区的N端相连；或者所述第三连接肽的N端与所述轻链可变区的C端相连，所述第三连接肽的C端与所述重链可变区的N端相连；
任选地，所述单链抗体具有SEQ ID NO:18或19所示的氨基酸序列。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的双抗或权利要求2～6任一项所述的抗体或抗原结合片段。
8.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求7所述的核酸分子。
9.一种重组细胞，其特征在于，携带权利要求7所述的核酸分子，权利要求8所述的表达载体，或者表达权利要求1所述的双抗或权利要求2～6任一项所述的抗体或抗原结合片段。
10.一种组合物，其特征在于，包括：权利要求1所述的双抗，权利要求2～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，权利要求7所述的核酸分子，权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的重组细胞。
11.一种药物，其特征在于，包括：权利要求1所述的双抗，权利要求2～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，权利要求7所述的核酸分子，权利要求8所述的表达载体，权利要求9所述的重组细胞，或权利要求10所述的组合物。
12.一种试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1所述的双抗，权利要求2～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，权利要求7所述的核酸分子，权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的重组细胞。
13.权利要求1所述的双抗，权利要求2～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，权利要求7所述的核酸分子，权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测ANG-2和/或VEGF。
14.权利要求1所述的双抗，权利要求2～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，权利要求7所述的核酸分子，权利要求8所述的表达载体，权利要求9所述的重组细胞或权利要求10所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防血管生成引起的相关疾病；
任选地，所述血管生成引起的相关疾病包括肿瘤、炎性疾病和眼内新生血管综合征的至少之一；
任选地，所述肿瘤包括成血管瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的至少之一；
任选地，所述炎性疾病包括类风湿关节炎和牛皮癣中的至少之一；
任选地，所述眼内新生血管综合征包括增殖性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中的至少之一。
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