CN101821288A - 共价双抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双抗体分子和其在治疗包括免疫病症、传染病、中毒和癌症的多种疾病和病症中的用途。本发明的双抗体分子包含两条多肽链，其缔合形成可识别相同或不同抗原上的相同或不同表位的至少两个表位结合位点。另外，抗原可来自相同或不同分子。双抗体分子的单独多肽链可经由非肽键的共价键共价结合，诸如但不限于位于各多肽链中的半胱氨酸残基的二硫键。在具体实施方案，本发明的双抗体分子进一步包含Fc区，这允许抗体样的功能性被加工到分子中。

Description

共价双抗体及其用途
本申请要求美国专利申请序列号61/019,051(2008年1月4日提交)和60/945,523(2007年6月21日提交)的权益，这两项申请通过引用全文并入本申请。
1.发明领域
本发明涉及双抗体分子和其在治疗多种疾病和病症中的用途，所述疾病和病症包括免疫病症和癌症。本发明的双抗体分子包含至少两条多肽链，其缔合形成可识别相同或不同表位的至少两个表位结合位点。另外，表位可来自相同或不同分子，或位于相同或不同细胞上。双抗体分子的单独多肽链可经由非肽键的共价键共价结合，诸如但不限于位于各多肽链中的半胱氨酸残基的二硫键。在具体实施方案，本发明的双抗体分子进一步包含Fc区，这允许抗体样的功能性被加工到分子中。
2.发明背景
共价双抗体的设计是基于单1链Fv构建体(scFv)(Holliger等人(1993)“‘Diabodies’：Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments(‘双抗体’：小的二价和双特异性抗体片段)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；通过引用全文并入本文)。在完整的未修饰IgG中，VL和VH结构域位于不同多肽链即分别是轻链和重链上。抗体轻链与抗体重链的相互作用，尤其是VL与VH结构域的相互作用形成抗体的表位结合位点之一。相反，scFv构建体包括单条多肽链中包含的抗体的VL和VH结构域，其中各结构域间隔长度足以允许自组装两个结构域为功能性表位结合位点的柔性接头。当由于接头长度不足(少于约12氨基酸残基)而不能自组装时，两个scFv构建体彼此相互作用来形成二价的分子，一条链的VL与另一条链的VH联合(综述于Marvin等人(2005)“RecombinantApproaches To IgG-Like Bispecific Antibodies(IgG-样双特异性抗体的重组方法)”Acta Pharmacol.Sin.26：649-658)。而且，已显示向构建体c-末端加入半胱氨酸残基允许形成多肽链的二硫键，稳定所得的二聚体而不干扰二价分子的结合特征(参见例如，Olafsen等人(2004)“CovalentDisulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation AndRadiolabeling For Tumor Targeting Applications(共价二硫键连接的抗CEA双抗体允许用于肿瘤靶向应用的位点特异性轭合和放射性标记)”Prot.Engr.Des.Sel.17：21-27)。进一步地，当选择具有不同特异性的VL和VH结构域时，可构建不仅二价而且双特异性的分子。
二价双抗体具有广泛的应用，包括治疗和免疫诊断。双效价允许在各种应用中设计和构造双抗体的极大灵活性、对多聚抗原提供增强的亲和力、交联不同抗原、并取决于两种靶抗原的存在而定向靶向特定细胞类型。由于效价增加、低解离速率和从循环快速清除(对于在或低于～50kDa的小尺寸的双抗体)，本领域已知的双抗体分子还已显示在肿瘤成像领域中的特别应用(Fitzgerald等人(1997)“Improved Tumour Targeting By DisulphideStabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris(通过在巴斯德毕赤酵母中表达的二硫化物稳定的双抗体改进肿瘤靶向)”Protein Eng.10：1221)。特别重要的是交联不同细胞，例如交联细胞毒性T细胞于肿瘤细胞(Staerz等人(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells(杂合抗体可靶向被T细胞攻击的位点)”Nature 314：628-631，和Holliger等人(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated ByA Bispecific Diabody(双特异性双抗体介导细胞毒性T细胞特异性杀伤淋巴瘤细胞)”Protein Eng.9：299-305)。双抗体表位结合结构域还可能针对任何免疫效应细胞的表面决定簇，诸如T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞或其他单核细胞上表达的CD3、CDl6、CD32或CD64。许多研究中，还发现结合于效应细胞决定簇如Fcγ受体(FcγR)的双抗体活化效应细胞(Holliger等人(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-CellsMediated By A Bispecific Diabody(双特异性双抗体介导细胞毒性T细胞特异性杀伤淋巴瘤细胞)”Protein Eng.9：299-305；Holliger等人(1999)“Carcinoembryonic Antigen(CEA)-Specific T-cell Activation In ColonCarcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 xAnti-CEA Bispecific Fusion Proteins(结肠癌中抗CD3 x抗CEA双特异性双抗体和B7x抗CEA双特异性融合蛋白诱导癌胚抗原(CEA)-特异性T-细胞活化)”Cancer Res.59：2909-2916)。通常，效应细胞活化被结合抗原的抗体对效应细胞经由Fc-FcγR相互作用的结合而触发；因此，在这方面，本发明的双抗体分子可以展现Ig-样功能性，而不论它们是否包含Fc结构域(如，在本领域已知的或本文示例的任何效应物功能测定(如，ADCC测定)中所检测的)。通过交联肿瘤与效应细胞，双抗体不仅将效应细胞带到肿瘤细胞附近，而且导致有效的肿瘤杀伤(参见例如，Cao等人(2003)“BispecificAntibody Conjugates In Therapeutics(治疗学中的双特异性抗体轭合物)”Adv.Drug.Deliv.Rev.55：171-197，在此通过引用全文并入本文)。
2.1效应细胞受体和它们在免疫系统中的作用
在传统免疫功能中，抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用引起广泛的系列反应，范围从效应物功能，例如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱粒和吞噬作用到免疫调节信号，例如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌。所有这些相互作用都是通过抗体或免疫复合物的Fc结构域与造血细胞上特化的细胞表面受体的结合来启动的。由抗体和免疫复合物触发的细胞反应的多样性是由Fc受体的结构异质性引起的。Fc受体共有结构上相关的抗原结合结构域，其可能介导了细胞内信号传导。
蛋白质的免疫球蛋白基因超家族的成员Fcγ受体，是可以结合免疫球蛋白分子的Fcγ部分的表面糖蛋白。家族的每个成员通过Fcγ受体的α链上的识别结构域来识别一种或多种同种型的免疫球蛋白。Fcγ受体是由它们对免疫球蛋白亚型的特异性定义的。IgG的Fcγ受体被称为FcγR，IgE的称为FcεR，IgA的称为FcαR。不同的辅助细胞带有不同同种型抗体的Fcγ受体，抗体的同种型确定了哪个辅助细胞将参与给定的反应(由RavetchJ.V.等人(1991)“Fc Receptors(Fc受体)”Annu.Rev.Immunol.9：457-92；Gerber J.S.等人(2001)“Stimulatory And Inhibitory Signals Originating FromThe Macrophage Fcgamma Receptors(来源于巨噬细胞Fcγ受体的刺激性和抑制性信号)”Microbes and Infection，3：131-139；Billadeau D.D.等人(2002)，“ITAMs Versus ITIMs： Striking A Balance During Cell Regulation(ITAM相比于ITIM：细胞调节期间破坏平衡)”The Journal of Clinical Investigation，2(109)：161-1681；Ravetch J.V.等人(2000)“Immune Inhibitory Receptors(免疫抑制性受体)”Science，290：84-89；Ravetch J.V.等人(2001)“IgG FcReceptors(IgG Fc受体)”Annu.Rev.Immunol.19：275-90；Ravetch J.V.(1994)“Fc Receptors：Rubor Redux(Fc受体：Rubor Redux)”Cell，78(4)：553-60综述)。在表1中概述不同的Fcγ受体、表达它们的细胞和它们的同种型特异性(改编自Immunobiology：The Immune System in Health and Disease(免疫生物学：健康和疾病中的免疫系统)，第4版.1999，Elsevier ScienceLtd/Garland Publishing，New York)。
Fcγ受体
这个家族的每个成员都是整合的膜糖蛋白，具有与免疫球蛋白相关结构域的C2组有关的细胞外结构域、单个跨膜结构域和长度可变的胞质内结构域。存在三种已知的FcγR，称为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。这三种受体由不同的基因编码；然而，在三个家族成员之间的广泛同源性表明它们可能由于基因重复而起源于共同的祖先。
FcγRII(CD32)
FcγRII蛋白是40kDa整合的膜糖蛋白，由于与单体Ig的低亲和性(106M-1)，其仅结合复合的IgG。这个受体是最广泛表达的FcγR，存在于所有造血细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性白细胞、肥大细胞和血小板。FcγRII在其免疫球蛋白结合链中仅具有两个免疫球蛋白样区域，因而相比FcγRI与IgG的亲和性低得多。存在三种人类FcγRII基因(FcγRII-A、FcγRII-B、FcγRII-C)，所有的都结合聚集物或免疫复合物中的IgG。
FcγRII-A和FcγRII-B的细胞质结构域间的明显不同产生了对受体连接的两种功能上异型的反应(heterogenous response)。基本的差异是A同种型启动引起细胞活化的细胞内信号传导，例如吞噬作用和呼吸爆发，而B同种型启动抑制性信号，例如抑制B细胞活化。
FcγRIII(CD16)
由于这一类中的异质性，在小鼠和人类中FcγRIII的尺寸从40到80kDa变化。两种人类基因编码两种转录物，FcγRIIIA是整合的膜糖蛋白，FcγRIIIB是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-连接的形式。一种小鼠基因编码与跨膜人类FcγRIIIA同源的FcγRIII。FcγRIII与其他两种FcγR的每种共有结构特征。与FcγRII相似，FcγRIII以低亲和性结合IgG，并含有相应的两个细胞外Ig-样结构域。FcγRIIIA在巨噬细胞、肥大细胞中表达，并是NK细胞中仅有的FcγR。目前已知GPI-连接的FcγRIIIB仅在人类嗜中性白细胞中表达。
通过FcγR的信号传导
活化和抑制性信号都在连接之后通过FcγR转导。这些截然不同的功能是由不同的受体同种型之间的结构差异引起的。在受体的细胞质信号传导结构域内、称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的两个不同的结构域，是所述不同的反应的原因。不同的细胞质酶对这些结构的补充决定了FcγR介导细胞反应的结果。含有ITAM的FcγR复合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，而含有ITIM的复合物仅包括FcγRIIB。
人类嗜中性白细胞表达FcγRIIA基因。FcγRIIA经由免疫复合物或特异性抗体交联的群集用来聚集ITAM和受体相关的激酶，所述激酶促进ITAM的磷酸化。ITAM的磷酸化充当了Syk激酶的停泊位点，所述Syk激酶的活化引起下游底物(例如，PI3K)的活化。细胞活化引起促炎性介质的释放。
FcγRIIB基因在B淋巴细胞上表达；它的细胞外结构域与FcγRIIA 96％相同，并以不可区别的方式结合IgG复合物。在FcγRIIB的细胞质结构域中ITIM的存在决定了FcγR的这种抑制性亚类。近来，确定了这种抑制作用的分子基础。当与活化FcγR捆绑时，FcγRIIB中的ITIM变为磷酸化的，并吸引肌醇多磷酸5’-磷酸酶(SHIP)的SH2结构域，所述肌醇多磷酸5’-磷酸酶(SHIP)水解磷酸肌醇信使，从而防止细胞内Ca++的流入，所述磷酸肌醇信使是作为含ITAM的FcγR介导的酪氨酸激酶活化的结果而释放的。因而，FcγRIIB的交联阻抑了对FcγR连接的活化反应，并抑制细胞应答。因而中止了B细胞活化、B细胞增殖和抗体分泌。
Figure GPA00001026478600061
3.发明概述
本发明涉及共价双抗体和/或共价双抗体分子和其在治疗多种疾病和病症包括癌症、自身免疫病症、变应性病症和细菌、真菌或病毒引起的传染病中的用途。优选地，本发明的双抗体可结合于两个不同细胞上的两个不同表位，其中第一表位与第二表位在不同细胞类型上表达，以使双抗体可将两种细胞带到一起。
在一个实施方案，本发明涉及一种共价双特异性双抗体，所述共价双特异性双抗体包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和任选地(iii)包含至少一个半胱氨酸残基的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，和任选地(iii)包含至少一个半胱氨酸残基的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是所述共价连接不是肽键；其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
在另一个实施方案，本发明涉及一种共价双特异性双抗体，所述双抗体包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和(iii)包含Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第三结构域与所述第四结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是所述共价连接不是肽键；其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
在某些方面，本发明涉及一种双抗体分子，所述分子包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和(iii)包含Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，和(iii)包含至少一个半胱氨酸残基的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是所述共价连接不是肽键；其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
在某些实施方案，本发明涉及一种共价双特异性双抗体，所述双抗体是双抗体分子的二聚体，每个双抗体分子包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和(iii)包含Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；且所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，和(iii)包含至少一个半胱氨酸残基的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中各双抗体分子的所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是所述共价连接不是肽键；其中各双抗体分子的所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中各双抗体分子的所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
在其他的实施方案，本发明涉及一种共价四特异性双抗体，所述双抗体是双抗体分子的二聚体，第一双抗体分子包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和(iii)包含Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；且所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，和(iii)包含至少一个半胱氨酸残基的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是所述共价连接不是肽键；其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)；且第二双抗体分子包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包括(i)包含对第三表位特异性的第三免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL3)的结合区的第一结构域，(ii)包含对第四表位特异性的第四免疫球蛋白的重链可变结构域(VH4)的结合区的第二结构域，和(iii)包含Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；且所述第二多肽链包括(i)包含第四免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL4)的结合区的第四结构域，(ii)包含第三免疫球蛋白的重链可变结构域(VH3)的结合区的第五结构域，和(iii)包含至少一个半胱氨酸残基的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是所述共价连接不是肽键；其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合第三表位的第一结合位点(VL3)(VH3)；其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合第四表位的第二结合位点(VL4)(VH4)。
在本发明某些方面，第一表位、第二表位以及当适用时第三表位和第四表位可以相同。在其他方面，第一表位、第二表位以及当适用时第三表位和第四表位可以各自彼此不同。在本发明包含第三表位结合结构域的某些方面，第一表位和第三表位可以相同。在本发明包含第四表位结合结构域的某些方面，第一表位和第四表位可以相同。在本发明包含第三表位结合结构域的某些方面，第二表位和第三表位可以相同。在本发明包含第四表位结合结构域的某些方面，第二表位和第四表位可以相同。在本发明优选方面，第一表位和第二表位不同。在本发明包含第三表位结合结构域和第四表位结合结构域的其他方面，第三表位和第四表位可以不同。应理解的是，上述的任意组合包含在本发明中。
在本发明具体方面，双抗体或双抗体分子的第一结构域和第五结构域可来源于相同免疫球蛋白。在另一方面，双抗体或双抗体分子的第二结构域和第四结构域可来源于相同免疫球蛋白。在另一方面，双抗体或双抗体分子的第一结构域和第五结构域可来源于不同免疫球蛋白。在另一方面，双抗体或双抗体分子的第二结构域和第四结构域可来源于不同免疫球蛋白。应理解的是，上述的任意组合包含在本发明中。
在本发明某些方面，双抗体或双抗体分子的第一(多肽链和第二多肽链之间的共价连接可经由第一多肽链上的至少一个半胱氨酸残基与第二多肽链上的至少一个半胱氨酸残基之间的二硫键。第一或第二多肽链上负责形成二硫键的半胱氨酸残基可见于多肽链上任何地方，包括第一、第二、第三、第四、第五和第六结构域中。在特定实施方案，第一多肽链上的半胱氨酸残基见于第一结构域中，第二多肽链上的半胱氨酸残基见于第五结构域中。第一、第二、第四和第五结构域对应于负责结合的可变区。在优选实施方案，负责在第一和第二多肽链之间形成二硫键的半胱氨酸残基分别位于第三和第六结构域中。在该实施方案的特定方面，第一多肽链的第三结构域包含人类κ轻链的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQ ID NO：23)，其可被氨基酸序列(SEQ ID NO：17)编码。在该实施方案的另一方面，第二多肽链的第六结构域包含人类κ轻链的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQ IDNO：23)，其可被氨基酸序列(SEQ ID NO：17)编码。在该实施方案的另一方面，第一多肽链的第三结构域包含来源于人类IgG铰链结构域的氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：79)，其可被核苷酸序列(SEQ ID NO：80)编码。在该实施方案的另一方面，第二多肽链的第六结构域包含来源于人类IgG铰链结构域的氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：79)，其可被核苷酸序列(SEQ ID NO：80)编码。在该实施方案的某些方面，第一多肽链的第三结构域包含人类κ轻链的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQ ID NO：23)；第二多肽链的第六结构域包含氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：79)。在该实施方案的其他方面，第二多肽链的第六结构域包含人类κ轻链的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQ ID NO：23)；第一多肽链的第三结构域包含氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：79)。在该实施方案的其他方面，第一多肽链的第三结构域包含人类κ轻链的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQ ID NO：23)；第二多肽链的第六结构域包含铰链结构域。在该实施方案的其他方面，第二多肽链的第六结构域包含人类κ轻链的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQID NO：23)；第一多肽链的第三结构域包含铰链结构域。在该实施方案的其他方面，第一多肽链的第三结构域包含人类κ轻链的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQ ID NO：23)；第一多肽链的第六结构域包含Fc结构域或其部分。在该实施方案的其他方面，第二多肽链的第六结构域包含人类κ轻链的C-末端6氨基酸FNRGEC(SEQ ID NO：23)；第一多肽链的第三结构域包含Fc结构域或其部分。
在其他实施方案，在第一或第二多肽上负责形成二硫键的半胱氨酸残基可位于第一多肽链上第一、第二或第三结构域之外和第二多肽链上第四、第五和第六结构域之外。特别是，第一多肽链上的半胱氨酸残基可位于第一结构域的N-末端或可位于第一结构域的C-末端。第一多肽链上的半胱氨酸残基可位于第二结构域的N-末端或可位于第二结构域的C-末端。第一多肽链上的半胱氨酸残基可位于第三结构域的N-末端或可位于第三结构域的C-末端。进一步地，第二多肽链上的半胱氨酸残基可位于第四结构域的N-末端或可位于第四结构域的C-末端。第二多肽链上的半胱氨酸残基可位于第五结构域的N-末端或可位于第五结构域的C-末端。相应地，第二多肽链上的半胱氨酸残基可位于第六结构域的N-末端或可位于第六结构域的C-末端。在特定方面，二硫键可在第一多肽链上至少两个半胱氨酸残基与第二多肽链上至少两个半胱氨酸残基之间。在特定方面，其中第三结构域和第六结构域不包含Fc结构域或其部分，半胱氨酸残基可位于第一多肽链的C-末端和第二多肽链的C-末端。应理解的是，上述的任意组合包含在本发明中。
在上述本发明的具体实施方案，本发明的共价双抗体包括双抗体分子的二聚体，其中各双抗体分子包括第一和第二多肽链。在该实施方案的某些方面，双抗体分子可共价连接以形成二聚体，条件是该共价连接不是肽键。在该实施方案的优选方面，该共价连接是二聚体的各双抗体分子的第一多肽链上至少一个半胱氨酸残基之间的二硫键。在本发明的更优选方面，该共价连接是形成二聚体的各双抗体分子的第一多肽链上至少一个半胱氨酸残基之间的二硫键，其中所述至少一个半胱氨酸残基位于各第一多肽链的第三结构域中。
在本发明某些方面，第一多肽链上的第一结构域可位于第二结构域的N-末端或可位于第二结构域的C-末端。第一多肽链上的第一结构域可位于第三结构域的N-末端或可位于第三结构域的C-末端。第一多肽链上的第二结构域可位于第一结构域的N-末端或可位于第一结构域的C-末端。进一步地，第一多肽链上的第二结构域可位于第三结构域的N-末端或可位于第三结构域的C-末端。相应地，第一多肽链上的第三结构域可位于第一结构域的N-末端或可位于第一结构域的C-末端。第一多肽链上的第三结构域可位于第二结构域的N-末端或可位于第二结构域的C-末端。对于第二多肽链，第四结构域可位于第五结构域的N-末端或可位于第五结构域的C-末端。第四结构域可位于第六结构域的N-末端或可位于第六结构域的C-末端。第二多肽链上的第五结构域可位于第四结构域的N-末端或可位于第四结构域的C-末端。第二多肽链上的第五结构域可位于第六结构域的N-末端或可位于第六结构域的C-末端。相应地，第二多肽链上的第六结构域可位于第四结构域的N-末端或可位于第四结构域的C-末端。第二多肽链上的第六结构域可位于第五结构域的N-末端或可位于第五结构域的C-末端。应理解的是，上述的任意组合包含在本发明中。
在某些实施方案，第一结构域和第二结构域可位于第一多肽链上第三结构域的C-末端；或第一结构域和第二结构域可位于第一多肽链上第三结构域的N-末端。对于第二多肽链，第四结构域和第五结构域可位于第六结构域的C-末端；或第四结构域和第五结构域可位于第六结构域的N-末端。在该实施方案的某些方面，本发明涉及一种共价双特异性双抗体，所述双抗体是双抗体分子的二聚体，每个双抗体分子包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和(iii)包含Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点且其中所述第三结构域位于第一结构域和第二结构域两者的N-末端；且所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，和(iii)包含至少一个半胱氨酸残基的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中各双抗体分子的所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是所述共价连接不是肽键；其中各双抗体分子的所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中各双抗体分子的所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
在另一实施方案，本发明涉及一种共价四特异性双抗体，所述双抗体是双抗体分子的二聚体，第一双抗体分子包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和(iii)包含Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点且其中所述第三结构域位于第一结构域和第二结构域两者的N-末端；且所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，和(iii)包含至少一个半胱氨酸残基的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是所述共价连接不是肽键；其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)；且第二双抗体分子包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包括(i)包含对第三表位特异性的第三免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL3)的结合区的第一结构域，(ii)包含对第四表位特异性的第四免疫球蛋白的重链可变结构域(VH4)的结合区的第二结构域，和(iii)包含Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点且其中所述第三结构域位于第一结构域和第二结构域两者的N-末端；且所述第二多肽链包括(i)包含第四免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL4)的结合区的第四结构域，(ii)包含第三免疫球蛋白的重链可变结构域(VH3)的结合区的第五结构域，和(iii)包含至少一个半胱氨酸残基的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是所述共价连接不是肽键；其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合第三表位的第一结合位点(VL3)(VH3)；其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合第四表位的第二结合位点(VL4)(VH4)。
如上讨论的，单独多肽链上的结构域是共价连接的。在具体方面，第一和第二结构域之间、第一和第三结构域之间、第二和第三结构域之间、第四和第五结构域之间、第四和第六结构域之间、和/或第五和第六结构域之间的共价连接可为肽键。特别是，第一和第二结构域、第四和第五结构域可分别被第三结构域和第六结构域间隔或被另外的氨基酸残基间隔，只要第一和第二、第四和第五结构域不缔合形成结合位点。氨基酸残基的数目可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9氨基酸残基。在一个优选方面，结构域之间氨基酸残基的数目是8。
在本发明某些方面，第一和第二多肽链的结构域包括Fc结构域，即任选地第三和第六结构域分别可进一步包含铰链结构域以使该结构域包含铰链-Fc区。在替代实施方案，第一多肽链或第二多肽链可包含铰链结构域而不还包含Fc结构域。用于本发明的重链、轻链、铰链区、Fc结构域和/或铰链-Fc结构域可来源于任何免疫球蛋白类型，包括IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在优选方面，该免疫球蛋白类型是IgG或其任何亚型，即IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在其他方面，轻链和重链所来源于的免疫球蛋白是人源化或嵌合的。
进一步地，双抗体或双抗体分子对其结合的第一表位和第二表位以及当适用时第三表位和第四表位可以是来自相同抗原的不同表位或可以是来自不同抗原的不同表位。抗原可以是可对其产生抗体的任何分子。例如，蛋白、核酸、细菌毒素、细胞表面标记、自身免疫标记、病毒蛋白、药物等。在具体方面，双抗体的至少一个表位结合位点是对特定细胞上的抗原特异性的，诸如B-细胞、T-细胞、吞噬细胞、天然杀伤(NK)细胞或树突细胞。
在本实施方案的某些方面，双抗体或双抗体分子的至少一个表位结合位点是对Fc受体特异性的，该Fc受体可为活化性Fc受体或抑制性Fc受体。在具体方面，该Fc受体是Fcγ受体，该Fcγ受体是FcγRI、FcγRII或FcγRIII受体。在更优选方面，该FcγRIII受体是FcγRIIIA(CD16A)受体或FcγRIIIB(CD16B)受体，更优选地，该FcγRIII受体是FcγRIIIA(CD16A)受体。在另一优选方面，该FcγRII受体是FcγRIIA(CD32A)受体或FcγRIIB(CD32B)受体，更优选地是FcγRIIB(CD32B)受体。在特别优选方面，双抗体的一个结合位点是对CD32B特异性的，另一结合位点是对CD16A特异性的。在本发明特定实施方案，双抗体或双抗体分子的至少一个表位结合位点是对活化性Fc受体特异性的，至少一个其他位点是对抑制性Fc受体特异性的。在该实施方案的某些方面，该活化性Fc受体是CD32A，该抑制性Fc受体是CD32B。在该实施方案的其他方面，该活化性Fc受体是BCR，该抑制性Fc受体是CD32B。在该实施方案的其他方面，该活化性Fc受体是IgERI，该抑制性Fc受体是CD32B。
在一个表位结合位点是对CD16A特异性的情形，VL和VH结构域可与小鼠抗体3G8的VL和VH结构域相同或相似，小鼠抗体3G8的序列已被克隆并列在本文。在一个表位结合位点是对CD32A特异性的其他情形，VL和VH结构域可与小鼠抗体IV.3的VL和VH结构域相同或相似。在一个表位结合位点是对CD32B特异性的其他情形，VL和VH结构域可与小鼠抗体2B6的VL和VH结构域相同或相似，小鼠抗体2B6的序列已被克隆并列在本文。应理解的是，3G8、2B6和IV.3抗体的任何VL或VH结构域可以任何组合使用。本发明还涉及双特异性双抗体或双抗体分子，其中第一表位是对CD32B特异性的，第二表位是对CD16A特异性的。
在其他方面，表位结合位点可为对致病抗原特异性的。如在此使用的，致病抗原是具体病原性疾病包括癌症、感染和自身免疫疾病中牵涉的抗原。因此，致病抗原可为肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原或自身免疫抗原。示例性致病抗原包括但不限于脂多糖、选自人类免疫缺陷病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncitial Virus)、西尼罗病毒(如E16和/或E53抗原)和肝炎病毒的病毒抗原组成的组的病毒抗原、核酸(DNA和RNA)和胶原。优选地，该致病抗原是中和抗原。在优选方面，当一个表位结合位点对CD16A或CD32A是特异性时，另一表位结合位点是对自身免疫抗原以外的致病抗原特异性的。在另一优选方面，当一个表位结合位点是对CD32B特异性的时，另一表位结合位点是对任何致病抗原特异性的。在特定实施方案，本发明的双抗体分子结合于相同细胞上的两个不同抗原，例如，一个抗原结合位点是对活化性Fc受体特异性的，而另一个是对抑制性Fc受体特异性的。在其他实施方案，双抗体分子结合于两个不同的病毒中和表位，例如但不限于，西尼罗病毒的E16和E53。
在本发明另一实施方案，本发明的双抗体可用于治疗多种疾病和病症。因此，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，包括向需要其的患者施用有效量的本发明共价双抗体或双抗体分子，其中至少一个结合位点是对致病抗原特异性的，所述致病抗原诸如癌症细胞表面上或细菌或病毒粒子表面上表达的抗原，且至少一个其他结合位点是对Fc受体如CD16A特异性的。
在另一实施方案，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，包括向需要其的患者施用有效量的本发明双抗体或双抗体分子，其中至少一个结合位点是对CD32B特异性的，至少一个其他结合位点是对CD16A特异性的。
在另一实施方案，本发明涉及诱导对致病抗原免疫耐受的方法，包括向需要其的患者施用有效量的本发明共价双抗体或共价双抗体分子，其中至少一个结合位点是对CD32B特异性的，至少一个其他结合位点是对所述致病抗原特异性的。在该实施方案的方面，该致病抗原可为期望对其免疫耐受的变应原或另一分子，诸如移植组织上表达的蛋白。
在另一实施方案，本发明涉及解毒方法，包括向需要其的患者施用有效量的本发明共价双抗体或双抗体分子，其中至少一个结合位点是对细胞表面标记特异性的，至少一个其他结合位点是对毒素特异性的。在具体方面，施用的本发明双抗体是其中一个结合位点是对细胞表面标记诸如Fc特异性的，另一结合位点是对细菌毒素或对药物特异性的双抗体。一方面，该细胞表面标记未见于红细胞上。
3.1定义
除非另外指明，否则本文所用的所有领域术语、表示法和其他科学术语或命名法意为具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。在一些情形，为了清楚和/或便于参考，具有通常理解的含义的术语在本文定义，本文并入这些定义不必被解释为代表具有超出本领域通常理解的显著差别。除非另外指明，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、和免疫学的常规技术，这些在本领域技术中。这些技术充分描述于文献，诸如，Current Protocolsin Immunology(免疫学最新实验方案)(J.E.Coligan等人编辑，1999，包括到2001年的增刊)；Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)(F.M.Ausubel等人编辑，1987，包括到2001年的增刊)；MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第三版(Sambrook和Russel，2001 )；PCR：The Polymerase Chain Reaction(PCR：聚合酶链式反应)，(Mullis等人编辑，1994)；The Immunoassay Handbook(免疫测定手册)(D.Wild编辑，Stockton Press NY，1994)；Bioconjugate Techniques(生物轭合技术)(Greg T.Hermanson编辑，Academic Press，1996)；Methods ofImmunological Analysis(免疫学分析方法)(R.Masseyeff、W.H.Albert和N.A.Staines编辑，Weinheim：VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)，Harlow和Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual(使用抗体的实验室手册)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1999；和Beaucage等人编辑，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(核酸化学最新实验方案)John Wiley & Sons，Inc.，New York，2000)。
如在此使用的，术语“抗体”和“多个抗体”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)、内抗体(intrabodies)和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明的抗体的抗Id和抗-抗Id抗体)和任何上述抗体的表位结合片段。特别是，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如在此使用的，术语“免疫特异性地结合”、“免疫特异性地识别”、“特性地结合”、“特异性地识别”和类似术语是指特异性地结合于抗原(如，表位或免疫复合物)而不特异性地结合于另一分子的分子。特异性地结合于抗原的分子可以较低亲和性结合于其他肽或多肽，如以免疫测定、BIAcore或本领域已知的其他测定确定的。优选地，特异性地结合抗原的分子不与其他蛋白交叉反应。可鉴定特异性地结合抗原的分子，例如通过免疫测定、BIAcore或本领域技术人员已知的其他技术。
如在此使用的，“免疫复合物”是指当至少一个靶分子和至少一个含有异源Fcγ区的多肽彼此结合，形成更大分子量的复合物时形成的结构。免疫复合物的实例是抗原-抗体复合物，其可以是可溶的或是颗粒(如，细胞表面上的抗原/抗体复合物)。
如在此使用的，术语“重链”、“轻链”、“可变区”、“框架区”、“恒定结构域”和类似术语具有免疫学领域中的通常含义，是指天然存在的免疫球蛋白中的结构域和合成(如，重组)结合蛋白(如，人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体等)的相应结构域。天然存在的免疫球蛋白(如，IgG)的基本结构单元是四聚体，具有两条轻链和两条重链，通常表达为约150,000Da的糖蛋白。各链的氨基末端(“N”)部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多氨基酸的可变区。各链的羧基-末端(“C”)部分界定恒定区，轻链具有单个恒定结构域，重链通常具有三个恒定结构域和铰链区。因此，IgG分子轻链的结构是n-VL-CL-C，IgG重链的结构是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c(其中H是铰链区)。IgG分子的可变区由互补决定区(CDR)组成，互补决定区包含接触抗原和非-CDR区段(称为框架区段)的残基，通常保持结构并决定CDR环的位置(尽管某些框架残基可能还接触抗原)。因此，VL和VH结构域具有结构n-FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4-C。
当提到结合蛋白或抗体(如本文宽泛定义的)时，将氨基酸分配到各结构域是根据Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学上重要蛋白的序列)(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991)的定义。免疫球蛋白成熟重链和轻链可变区的氨基酸由链中氨基酸的位置指定。Kabat描述了抗体的许多氨基酸序列，鉴定了各亚组的氨基酸共有序列，并对各氨基酸指定了残基号。Kabat的编号方案可延伸到不包括在其纲要中的抗体，通过参考保守氨基酸比对该抗体与Kabat的共有序列之一。指定残基号的这种方法已经变成在本领域中的标准方法，容易地鉴定包括嵌合或人源化变体的不同抗体中相应位置的氨基酸。例如，人类抗体轻链位置50的氨基酸占据与小鼠抗体轻链位置50的氨基酸相应的位置。
如在此使用的，术语“重链”用于定义IgG抗体的重链。在完整的天然IgG中，重链包含免疫球蛋白结构域VH、CH1、铰链、CH2和CH3。本说明书中，IgG重链中残基的编号是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学上重要蛋白的序列)，第5版.Public Health Service，NH1，MD (1991)中所述的EU索引，该文献通过引用明确并入本文。“Kabat的EU索引”是指人类IgG1 EU抗体的编号。包含人类IgG1铰链、CH2和CH3结构域的氨基酸序列的实例显示在下述的图1A和1B。图1A和1B还列出了IgG2、IgG3和IgG4重链的铰链、CH2和CH3结构域的氨基酸序列。将IgG2、IgG3和IgG4同种型的氨基酸序列与IgG1序列比对，通过将各自铰链区的第一个和最后一个半胱氨酸残基(其形成重链内S-S键)放置到相同位置。对于IgG2和IgG3铰链区，不是所有残基都被EU索引编号。
“铰链区”或“铰链结构域”通常界定为从人类IgG1的Glu216延伸到Pro230。人类IgG1铰链区的氨基酸序列的实例显示在图1A(图1A中的氨基酸残基根据Kabat系统编号)。可将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对，通过将第一个和最后一个半胱氨酸残基(其形成重链内S-S键)放置到相同位置，如图1A所示。
如在此使用的，使用术语“Fc区”、“Fc结构域”或类似术语来定义IgG重链的C-末端区域。含有人类IgG1的氨基酸序列实例示于图1B。尽管根据Kabat系统编号，边界可以稍微地不同，Fc结构域从氨基酸231延伸到氨基酸447(图1B中氨基酸残基根据Kabat系统编号)。图1B还提供IgG同种型IgG2、IgG3和IgG4的Fc区的氨基酸序列实例。
IgG的Fc区包含两个恒定结构域CH2和CH3。人类IgG Fc区的CH2结构域通常从根据Kabat编号系统的氨基酸231延伸到氨基酸341(图1B)。人类IgG Fc区的CH3结构域通常从根据Kabat编号系统的氨基酸342延伸到447(图1B)。人类IgG Fc区的CH2结构域(还称为“Cγ2”结构域)是独特的，因为其不与另一结构域紧密配对。而是，两条N-连接的分支的糖类链介于完整天然IgG的两个CH2结构域之间。
如在此使用的，术语“FcγR结合蛋白”、“FcγR抗体”和“抗FcγR抗体”可交换地使用，并指多种免疫球蛋白-样或免疫球蛋白-衍生的蛋白。“FcγR结合蛋白”经由与VL和/或VH结构域的相互作用而结合FcγR(不同于Fcγ-介导的结合)。FcγR结合蛋白的实例包括完全人类、多克隆、嵌合和人源化抗体(如，包含2重链和2轻链)、其片段(如，Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段)、双功能或多功能抗体(参见例如，Lanzavecchia等人(1987)“TheUse Of Hybrid Hybridomas To Target Human Cytotoxic T Lymphocytes(使用杂合的杂交瘤来靶向人类细胞毒性T淋巴细胞)”Eur.J.Immunol.17：105-111)、单链抗体(参见例如，Bird等人(1988)“Single-ChainAntigen-Binding Proteins(单链抗原-结合蛋白)”Science 242：423-26)、融合蛋白(如，噬菌体展示融合蛋白)、“微型抗体(minibodies)”(参见例如，美国专利第5,837,821号)和包含VL和/或VH结构域或其片段的其他抗原结合蛋白。一方面，FcγRIIIA结合蛋白是“四聚抗体”，即通常具有天然存在的IgG的结构，包含可变结构域和恒定结构域，即，包含VL结构域和轻链恒定结构域的两条轻链和包含VH结构域、重链铰链和恒定结构域的两条重链。
如在此使用的，术语“FcγR拮抗剂”和类似术语是指蛋白和非-蛋白性物质，包括拮抗FcγR至少一种生物活性如，封闭信号传导的小分子。例如，本发明的分子通过封闭IgG对FcγR的结合而封闭信号传导。
如在此使用的，在多肽或蛋白质的上下文中术语“衍生物”是指包含已经通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变的氨基酸序列的多肽或蛋白质。如在此使用的术语“衍生物”还指一种多肽或蛋白质，其已经被修饰，即，通过将任何类型的分子共价附着到多肽或蛋白质上。例如，而不是限制，抗体可以被修饰，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解性裂解、连接到细胞抗原或其他蛋白，等等。可以通过使用本领域技术人员已知的技术进行化学修饰，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成，等等，来产生衍生多肽或蛋白。进一步地，衍生的多肽或蛋白衍生物具有与衍生它们的多肽或蛋白类似的或相同的功能。
如在此使用的，在非蛋白类衍生物的上下文中术语“衍生物”是指基于第一有机或无机分子的结构形成的第二有机或无机分子。有机分子的衍生物包括但不限于，例如通过添加或缺失羟基、甲基、乙基、羧基或胺基而修饰的分子。有机分子也可以被酯化、烷基化和/或磷酸化。
如在此使用的，术语“双抗体分子”是指两个或多个多肽链或蛋白的复合物，所述多肽链或蛋白各包含至少一个VL和一个VH结构域或其片段，其中两种结构域包含在单条多肽链中。在某些实施方案，“双抗体分子”包括包含Fc或铰链-Fc结构域的分子。复合物中的所述多肽链可以相同或不同，即，双抗体分子可以是同多聚体或异多聚体。在具体方面，“双抗体分子”包括二聚体或四聚体或包含VL和VH结构域两者的所述多肽链。构成多聚蛋白的单个多肽链可由链间二硫键共价连接于多聚体的至少一个其他肽。
如在此使用的，术语“病症”和“疾病”可互换地使用来指受治疗者中的状况。特别地，术语“自身免疫疾病”与术语“自身免疫病症”可互换地使用，来指在受治疗者中以由受治疗者对他自己的细胞、组织和/或器官的免疫反应引起的细胞、组织和/或器官损伤为特征的状况。术语“炎症疾病”与术语“炎症病症”可互换地使用，来指在受治疗者中以炎症、优选地慢性炎症为特征的状况。自身免疫病症可能或可能不伴随炎症。此外，炎症可能或可能不由自身免疫病症引起。因而，某些病症可能以自身免疫和炎性病症为特征。
如在此使用的，“相同多肽链”还指具有几乎相同氨基酸序列的多肽链，例如，包括具有一个或多个氨基酸差异，优选地保守氨基酸取代的链，以使两条多肽链的活性不显著地不同。
如在此使用的，术语“癌症”是指由异常的不受控制的细胞生长引起的赘生物或肿瘤。如在此使用的，癌症明确地包括白血病和淋巴瘤。在某些实施方案中，癌症是指良性肿瘤，其是保持局部化的。在其他实施方案中，癌症是指恶性肿瘤，其侵入和破坏了邻近的身体结构并扩散到远处位点。在某些实施方案中，癌症与特异性癌抗原有关。
如在此使用的，术语“免疫调节剂”和其变体是指调节宿主的免疫系统的药剂。在某些实施方案中，免疫调节剂是免疫抑制剂。在某些其他实施方案中，免疫调节剂是免疫刺激剂。免疫调节剂包括但不限于小分子、肽、多肽、融合蛋白、抗体、无机分子、模拟剂和有机分子。
如在此使用的，术语“表位”是指在动物中、优选地在哺乳动物中、和最优选地在人类中具有抗原性或免疫原性的活性的多肽或蛋白或非蛋白分子的片段。具有免疫原性活性的表位是在动物中引发抗体反应的多肽或蛋白的片段。具有抗原性活性的表位是根据本领域技术人员公知的任何方法，例如通过免疫测定来确定的抗体免疫特异性结合的多肽或蛋白质的片段。抗原性表位不必一定是免疫原性的。
如在此使用的，术语“片段”是指肽或多肽，其包含另一个多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少连续80个氨基酸残基、至少连续90个氨基酸残基、至少连续100个氨基酸残基、至少连续125个氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少连续175个氨基酸残基、至少连续200个氨基酸残基或至少连续250个氨基酸残基的氨基酸序列。在特定实施方案，多肽的片段保持所述多肽的至少一种功能。
如在此使用的，术语“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA和RNA分子的组合或杂交DNA/RNA分子，和DNA或RNA分子的类似物。可以使用例如核苷酸类似物来产生这种类似物，所述核苷酸类似物包括但不限于肌苷或三甲基化碱基。这种类似物也可以包括DNA或RNA分子，其包含给分子带来有益特质的修饰的框架，所述特质例如核酸酶抗性或提高的跨细胞膜能力。所述核酸或核苷酸序列可以是单链的、双链的，可以含有单链和双链的部分，可以含有三链的部分，但优选的是双链DNA。
如在此使用的，“治疗有效量”是指足以治疗或控制疾病或病症的治疗剂的量。治疗有效量可以指足够延迟或最小化疾病的发作，例如延迟或最小化癌症的扩散的治疗剂的量。治疗有效量也可以指在疾病的治疗或控制中提供治疗益处的治疗剂的量。进一步地，对于本发明的治疗剂，治疗有效量意思是在疾病的治疗或控制中提供治疗益处的、单独的或与其他治疗组合的治疗剂的量。
如在此使用的，术语“预防剂”或“多种预防剂”是指可用于预防病症或防止病症复发或扩散的任何药剂。预防有效量可以指足以在患者，包括但不限于易感染高增殖性疾病的那些患者，例如遗传地易感染癌症或早先暴露于致癌物质的那些患者中，防止高增殖性疾病、特别是癌症的复发或扩散、或这种疾病的发生的预防剂的量。预防有效量也可以指在疾病的预防中提供预防性益处的预防剂的量。进一步地，对于本发明的预防剂，预防有效量意思是在疾病的预防中提供预防益处的、单独的或与其他药剂组合的预防剂的量。
如在此使用的，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”)”是指作为施用预防剂或治疗剂的结果在受治疗者中防止病症的一种或多种症状的复发或发作。
如在此使用的，术语“组合”是指使用多于一种预防和/或治疗剂。使用术语“组合”不限制向患有病症的受治疗者施用预防剂和/或治疗剂的顺序。第一预防剂或治疗剂可以在向患有病症的受治疗者施用第二预防剂或治疗剂之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)、伴随地、或随后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周之后)施用。
如在此使用的“效应物功能”是指由抗体Fc区与Fc受体或抗原的相互作用引起的生物化学事件。效应物功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。效应物功能包括在抗原的结合之后作用的那些以及独立于抗原结合作用的那些。
如在此使用的“效应细胞”是指表达一种或多种Fc受体并介导一种或多种效应物功能的免疫系统的细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、树突细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、天然杀伤(NK)细胞，可以来自任何有机体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。
如在此使用的，术语“特异性地结合免疫复合物”和类似术语是指特异性地结合于免疫复合物而不特异性地结合于另一分子的分子。特异性地结合于免疫复合物的分子可以较低亲和性结合于其他肽或多肽，如以免疫测定、BIAcore或本领域已知的其他测定确定的。优选地，特异性地结合免疫复合物的分子不与其他蛋白交叉反应。可鉴定特异性地结合免疫复合物的分子，例如通过免疫测定、BIAcore或本领域技术人员已知的其他技术。
如在此使用的，“稳定融合蛋白”是指一种融合蛋白，其在制备和/或储存期间经历最小到不可测水平的降解，如使用本领域技术人员已知的常用生化和功能测定评估的，并可长时间储存而不丧失生物活性，如，结合于FcγR。
4.附图简述
图1A-B人类IgG CH1、铰链和Fc区的氨基酸序列
图1提供人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4铰链(A)和Fc(B)结构域的氨基酸序列。(IgG1铰链结构域(SEQ ID NO：1)；IgG2铰链结构域(SEQ IDNO：2)；IgG3铰链结构域(SEQ ID NO：3)；IgG4铰链结构域(SEQ ID NO：4)；IgG1 Fc结构域(SEQ ID NO：5)；IgG2 Fc结构域(SEQ ID NO：6)；IgG3 Fc结构域(SEQ ID NO：7)；IgG1 Fc结构域(SEQ ID NO：8))。图1A和1B所示的氨基酸残基根据Kabat EU编号系统编号。将同种型序列与IgG1序列比对，通过将各自铰链区的第一个和最后一个半胱氨酸残基(其形成重链内S-S键)放置到相同位置。对于图1B，CH2结构域中的残基标为+，而CH3结构域中的残基标为～。
图2共价双功能双抗体的多肽链的示意表示
共价、双功能双抗体的多肽由被短肽接头分开的抗体VL和抗体VH结构域组成。8氨基酸残基的接头阻止单个多肽链自组装为scFv构建体，相反，不同多肽链的VL和VH结构域之间的相互作用占优势。产生4种构建体(各构建体以从构建体左侧的氨基末端(“n”)到图右侧的羧基末端(“c”)来描述)：构建体(1)(SEQ ID NO：9)包含n-Hu2B6的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-和C-末端序列(LGGC)-c；构建体(2)(SEQ ID NO：11)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-和C-末端序列(LGGC)-c；构建体(3)(SEQ ID NO：12)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-和C-末端序列(LGGC)-c；构建体(4)(SEQ ID NO：13)包含n-Hu2B6的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-和C-末端序列(LGGC)-c。
图3亲和纯化的双抗体的SDS-PAGE分析
对亲和纯化的双抗体进行还原(泳道1-3)或非还原(泳道4-6)条件下的SDS-PAGE分析。标出了标准品的近似分子量(泳道3和4之间)。泳道1和4，h3G8 CMD；泳道2和5，h2B6 CMD；泳道3和6，h2B6-h3G8 CBD。
图4A-B亲和纯化的双抗体的SEC分析
对亲和纯化的双抗体进行SEC分析。(A)已知标准品的洗脱图：全长IgG(～150kDa)、IgG的Fab片段(～50kDa)和scFv(～30kDa)；(B)h2b6CMD、h3G8 CMD和h2B6-h3G8 CBD的洗脱图。
图5 h2B6-h3G8 CBD对sCD32B和sCD16A的结合
h2B6-h3G8 CBD对sCD32B和sCD16A的结合在三明治ELISA中测定。sCD32B用作靶蛋白。第二探针是HRP轭合的sCD16A。结合CD16A的h3G8 CMD用作对照。
图6A-C BIACORE分析双抗体对sCD16A、SCD32B和sCD32B的结合
由SPR分析测定h2B6-h3G8 CBD、h2B6 CMD和h3G8 CMD对sCD 16A、sCD32B和sCD32A(阴性对照)的结合。还检测h3G8 scFv作为对照。(A)对sCD16的结合；(B)对sCD32B的结合和(C)对sCD32A的结合。以100NM的浓度注射双抗体，以200nM的浓度注射scFv到受体表面上，以50ml/min的流速持续60sec。
图7A-C BIACORE分析双抗体对sCD16A和SCD32B的结合
由SPR分析测定h2B6-h3G8 CBD、h2B6 CMD和h3G8 CMD对sCD16A和sCD32B的结合。还检测h3G8 scFv作为对照。(A)h3G8 CMD对sCD16A的结合；(B)h2B6-h3G8 CBD对sCD16A的结合；(C)h3G8 scFv对sCD16A的结合；(D)h2B6 CMD对sCD32B的结合；和(E)h2B6-h3G8CBD对sCD32B的结合。以6.25-200nM的浓度注射双抗体到受体表面上，以70ml/min的流速持续180sec。
图8描绘包含VL和VH结构域的多肽链相互作用以形成共价双特异性双抗体分子的示意图
NH2和COOH分别表示各多肽链的氨基-末端和羧基末端。S表示各多肽链上的C-末端半胱氨酸残基。VL和VH分别表示可变轻链结构域和可变重链结构域。点线和短划线是为了区别两条多肽链，特别是，表示所述链的接头部分。h2B6 Fv和h3G8 Fv分别表示对CD32B和CD16特异性的表位结合位点。
图9包含共价双特异性双抗体的Fc结构域的多肽链的示意表示  
表示本发明双抗体分子的多肽构建体(各构建体以从构建体左侧的氨基末端(“n”)到图右侧的羧基末端(“c”)来描述)。构建体(5)(SEQ ID NO：14)包含n-Hu2B6的VL结构域-第一接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-第二接头(LGGC)-和人类IgG1-c的C-末端Fc结构域；构建体(6)(SEQ ID NO：15)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-和第二接头(LGGC)-和人类IgG1-c的C-末端Fc结构域；构建体(7)(SEQ ID NO：16)包含n-Hu2B6的VL结构域-第一接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-和C-末端序列(LGGCFNRGEC)(SEQ ID NO：17)-c；构建体(8)(SEQ ID NO：18)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-和第二接头(LGGC)-和人类IgG1(具有氨基酸取代A215V)-c的C-末端铰链/Fc结构域。
图10包含Fc结构域的双抗体分子对sCD32B和sCD16A的结合
在三明治ELISA中测定包含Fc结构域的双抗体分子对sCD32B和sCD16A的结合。测定的双抗体由3个重组表达系统产生：共转染pMGX669和pMGX674，分别表达构建体1和6；共转染pMGX667和pMGX676，分别表达构建体2和5；和共转染pMGX674和pMGX676，分别表达构建体5和6。sCD32B用作靶蛋白。第二探针是HRP轭合的sCD16A。
图11描绘各包含Fc结构域的两条多肽链相互作用以形成二价的共价双抗体的示意图
NH2和COOH分别表示各多肽链的氨基-末端和羧基末端。S表示各多肽链第二接头序列中半胱氨酸残基之间的至少一个二硫键。VL和VH分别表示可变轻链结构域和可变重链结构域。点线和短划线是为了区别两条多肽链，特别是，表示所述链的第一接头部分。CH2和CH3表示Fc结构域的CH2和CH3恒定结构域。h2B6 Fv和h3G8 Fv分别表示对CD32B和CD16特异性的表位结合位点。
图12包含铰链/Fc结构域的双抗体分子对sCD32B和sCD16A的结合
在三明治ELISA中测定包含Fc结构域的双抗体分子对sCD32B和sCD16A的结合。测定的双抗体由4个重组表达系统产生：共转染pMGX669+pMGX674，分别表达构建体1和6；共转染pMGX669+pMGX678，分别表达构建体2和8；共转染pMGX677+pMGX674，分别表达构建体7和6；和共转染pMGX677+pMGX678，分别表达构建体7和8。sCD32B用作靶蛋白。第二探针是HRP轭合的sCD16A。
图13描绘多肽链相互作用以形成四聚双抗体分子的示意图
NH2和COOH分别表示各多肽链的氨基-末端和羧基末端。S表示带有Fc的‘较重’多肽链的第二接头序列中的半胱氨酸残基与不带有Fc的‘较轻’多肽链C-末端序列中半胱氨酸残基之间的至少一个二硫键。VL和VH分别表示可变轻链结构域和可变重链结构域。点线和短划线是为了区别两条多肽链，特别是，表示所述较重链的第一接头部分或所述较轻链的接头。CH2和CH3表示Fc结构域的CH2和CH3恒定结构域。h2B6 Fv和h3G8Fv分别表示对CD32B和CD16特异性的表位结合位点。
图14包含形成共价双特异性双抗体的Fc结构域的多肽链的示意表示
表示形成本发明双抗体分子的多肽构建体(各构建体以从构建体左侧的氨基末端(“n”)到图右侧的羧基末端(“c”)来描述)。构建体(9)(SEQ IDNO：19)包含n-人类IgG1的铰链/Fc结构域-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-和C-末端LGGC序列-c；构建体(10)(SEQ ID NO：20)包含n-人类IgG1的Fc结构域-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-和C-末端LGGC序列-c；构建体(11)(SEQ ID NO：21)包含n-Hu2B6的VL结构域(G105C)-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-和具有氨基酸取代A215V的人类IgG1的C-末端铰链/Fc结构域-c；构建体(12)(SEQ ID NO：22)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域(G44C)-和C-末端FNRGEC(SEQ ID NO：23)序列-c。
图15 A-B亲和四聚双抗体的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
对以表达构建体10和1、构建体9和1、以及构建体11和12的载体共转染的重组表达系统产生的双抗体进行非还原条件的SDS-PAGE分析(A)和蛋白质印迹分析，使用山羊抗-人类IgG1 H+L作为探针(B)。使用Simply Blue Safestain(Invitrogen)使SDS-PAGE凝胶中的蛋白可见。对于图A和B两者，包含构建体10和1、构建体9和1、以及构建体11和12A的双抗体分子分别在泳道1、2和3。
图16包含Fc结构域和工程化的链间二硫键的双抗体分子对sCD32B和sCD16A的结合
在三明治ELISA中测定包含Fc结构域和‘较轻’与‘较重’多肽链之间工程化的二硫键的双抗体分子对sCD32B和sCD16A的结合。由3个重组表达系统产生测定的双抗体：分别表达构建体1和10、表达构建体1和9、表达构建体11和12。sCD32B用作靶蛋白。第二探针是HRP轭合的sCD16A。h3G8的结合用作对照。
图17双抗体分子多蛋白前体的示意表示和包含λ轻链和/或铰链结构域的多肽链的示意表示
表示包括本发明双抗体分子的多肽构建体(各构建体以从构建体左侧的氨基末端(“n”)到图右侧的羧基末端(“c”)来描述)。构建体(13)(SEQ IDNO：97)包含n-3G8的VL结构域-第一接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-2.4G2VH的VH结构域-第二接头(LGGC)-弗林蛋白酶识别位点(RAKR(SEQ ID NO：95))-2.4G2的VL结构域-第三接头(GGGSGGG(SEQID NO：10)-3G8的VH结构域-和C-末端LGGC结构域；(编码SEQ IDNO：97的核苷酸序列提供在SEQ ID NO：98)。构建体(14)(SEQ ID NO：99)包含n-3G8的VL结构域-第一接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-2.4G2VH的VH结构域-第二接头(LGGC)-弗林蛋白酶识别位点(RAKR(SEQ ID NO：95))-FMD(口蹄疫病毒蛋白酶C3)位点-2.4G2的VL结构域-第三接头(GGGSGGG(SEQ ID NO：10)-3G8的VH结构域-和C-末端LGGC结构域；(编码SEQ ID NO：99的核苷酸序列提供在SEQ ID NO：100)。构建体(15)(SEQ ID NO：101)包含n-Hu2B6的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-和C-末端FNRGEC(SEQ ID NO：23)结构域。构建体(16)(SEQ ID NO：103)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域(G44C)-和C-末端VEPKSC(SEQ ID NO：79)结构域；(编码SEQ ID NO：103的核苷酸序列提供在SEQ ID NO：104)。
图18来源于多蛋白前体分子的双抗体分子对mCD32B和SCD16A的结合
在三明治ELISA中测定来源于多蛋白前体分子构建体13(SEQ IDNO：97)的双抗体分子对鼠CD32B(mCD32B)和可溶的CD16A(sCD16A)的结合。mCD32B用作靶蛋白。第二探针是生物素轭合的sCD16A。
图19包含λ链和/或铰链结构域的双抗体分子对sCD32B和SCD16A的结合
在三明治ELISA中测定包含来源于IgG的人类λ轻链和/或铰链结构域C-末端的结构域的双抗体分子对sCD32B和sCD16A的结合并与包含构建体1和2的双抗体(图5)比较。测定的双抗体由表达构建体15和16(分别是SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：103)的重组表达系统产生。sCD32B用作靶蛋白。第二探针是HRP轭合的sCD16A。带有小方块的柱表示构建体15/16组合，而带有大方块的柱表示构建体1/2组合。
图20结合于位于细胞表面的CD32B和荧光素-轭合的分子的2B6/4420 DART的示意表示
该图显示DART的“通用适体”抗荧光素臂的柔性以及代替2B6臂的其他特异性的可能。V-区显示为方块，GGGSGGGG接头显示为线，显示二硫键连接两条链。一条链的组成部分显示为蓝色，而另一条链的组成部分显示为粉色。N，氨基末端；C，羧基末端；FL，荧光素，VL，轻链可变区；VH，重链可变区。
图21(图A和B)2B6/4420 DART特异性地结合于荧光素-轭合的分子并可同时结合CD32B。
(A)2B6/4420或2B6/3G8结合到包被有FITC-S蛋白的ELISA板。通过与可溶CD32B、然后是对CD32B特异性地抗体以及与HRP轭合的第二检测抗体连接而检测2B6臂的结合和功能。(B)2B6/4420或2B6/3G8结合到包被有HuIgG或FITC-HuIgG(荧光素-轭合的)的ELISA板。通过与对2B6Fv特异性的多克隆血清、然后是HRP-轭合的第二抗体连接而检测结合。
图22(图A和B)使用抗人类CD79B抗体活化纯化的B细胞。
使用增加浓度的FITC-轭合的抗人类CD79b抗体CB3.1-FITC(A)或CB3.2-FITC(B)以及50μg/ml GAM IgG Fc特异性F(ab’)2片段(x轴)活化纯化的B细胞。在PBS(白色柱)或5μg/ml αFITCαCD32BDART(黑色柱)或αCD16αCD32BDART(灰色柱)存在下B细胞被活化。反应进行三份，计算标准偏差。
图23(图A和B)活化纯化的B细胞
来自第二健康供者的纯化B细胞如图22的图B所述地活化。测量在抗CD79b抗体FITC-轭合的CB3.2-FITC存在下活化的细胞中的增殖指数(A)并与在未标记的CB3.2抗体存在下活化的细胞中的增殖指数(B)比较。
图24(上图和下图)使用MGD261在HCD16A/B转基因小鼠中体内清除小鼠B细胞
向来自MacroGenics繁殖群的mCD32-/-hCD16A+C57B1/6、mCD32-/-hCD32B+C57B1/6和mCD32-/-hCD16A+hCD32B+C57B1/6小鼠在第0、3、7、10、14和17天IV注射MGD261(10、3、1或0.3mg/kg)、或无关抗体(hE16 10mg/kg)。在第-19(放血前)、4、11、18、25和32天收集血液用于FACS分析。每周三次记录动物健康和活动性。上图：h2B6-3G8和WNV mAb；下图：h2B6-3G8-hCD16A或-hCD32B小鼠和WNV mAb-hCD16A或-hCD32B小鼠。
图25使用2.4G2-3G8 DB在HCD16A/B转基因小鼠中体内清除小鼠B细胞
向来自MacroGenics繁殖群的mCD16-/-、mCD16-/-hCD16A+C57B1/6、mCD16-/-hCD16B+和mCD16-/-hCD16A+hCD16B+小鼠在第0、2、4、7、9、11、14、16和18天IP注射2.4G2-3G8 DB(75ug/小鼠)、或PBS。在第-10(放血前)、4、11和18天收集血液用于FACS分析。每周三次记录动物健康和活动性。
图26使用人类肿瘤细胞系RAJI的静脉内(IV)模型证实MGD261的抗肿瘤活性。
向来自MacroGenics繁殖群的十二-二十周大的mCD16-/-、hCD16A+、RAG1-/-C57B1/6小鼠在第0天IV注射5x106 Raji细胞。在第6、9、13、16、20、23、27和30天还向小鼠腹膜内(IP)施用250、25或2.5ug MGD261或PBS(阴性对照)。随后每天观察小鼠，每周两次记录体重。处死发展后腿麻痹的小鼠。
图27在非哺乳动物宿主中表达DART
将BL2 1DE3细胞(Novagen)以pET25b(+)T7-lac+3G8/3G8质粒转化，氨苄抗性的集落用于接种肉汤培养。当培养物达到0.5 OD600单位时，加入0.5mM IPTG来诱导表达。在30℃生长培养物2小时，收集无细胞的培养基。
图28 DART ELISA
使用96-孔Maxisorp板进行h3G8-h3G8 DART结合ELISA。反应后，用PBS-T洗涤板三次并以80μl/孔的TMB底物显色。培养5分钟后，以40μl/孔的1％H2SO4终止反应。使用96-孔读板器和SOFTmax软件在OD450nm读数。使用GraphPadPrism 3.03软件对读出值绘图。
图29 DART-引起的人类B-细胞死亡
将人类PBMC与所示分子培养过夜。由FACS分析测定凋亡，表示为PI+膜联蛋白-V+B细胞群(CD20+细胞)对总FSC/SSC未门控群的百分比。
图30 8B5-CB3.1 DART构建体
产生多种8B5-CB3.1 DART构建体以阐释本发明。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，将编码构建体5和6、或6和7、或8和9、或9和10的表达质粒共转染到HEK-293细胞以表达带有或不带有抗flag标签的8B5-CB3.1 DART。每三天收集条件培养基，收集三次。随后使用CD32B亲和柱纯化条件培养基。
图31 8B5-CB3.1 DART ELISA
使用96-孔Maxisorp板进行8B5-CB3.1 DART/ch8B5竞争ELISA。反应后，用PBS-T洗涤板三次并以80μl/孔的TMB底物显色。培养5分钟后，以40μl/孔的1％H2SO4终止反应。使用96-孔读板器和SOFTmax软件在OD450nm读数。使用GraphPadPrism 3.03软件对读出值绘图。
图32四价DART结构的示意图示
说明经由组装四条多肽链产生的DART物类的一般结构。Ig-样DART的四个抗原-结合结构域显示为带条纹和暗灰色椭圆。
图33 Ig-样四价DART
提供Ig-样四价DART的表位结合位点的示意图。
图34 mCD32-hCD16A结合ELISA
提供ELISA的结果，证实实施例6.10的Ig-样四价DART物类比对照(ch-mCD32 mAb)抗体或其他DART物类以更大亲和性结合抗原。
图35 Ig DART分子的示意图示
提供Ig DART分子的示意图。特异性以阴影、花纹或白色区表示，恒定区显示为黑色，二硫键以黑色点线表示。所有蛋白链的N-末端向图的上端定向，而所有蛋白链的C-末端向图的下端定向。图示A-E是双特异性，图示F-J是三特异性的。图示A和E是四价的。图示B、C、F、I和J是六价的。图示D、G和H是八价的。参考图1、2、9、14和17以及第3.1节对单独结构域的详细描述。
5.优选实施方案的描述
双抗体分子的每条多肽链包括VL结构域和VH结构域，它们共价连接以使结构域不发生自组装。两条多肽链的相互作用将产生两种VL-VH配对，形成两个表位结合位点，即，二价分子。VH或VL结构域不会被限制在多肽链中的任何位置，即，限制在氨基(N)或羧基(C)末端，也不会限制在彼此的相对位置，即，VL结构域可在VH结构域的N-末端，反之亦然。唯一的限制是可获得互补(complimentary)多肽链以形成功能双抗体。当VL和VH结构域来源于相同抗体时，两条互补(complimentary)多肽链可以相同。例如，当结合结构域来源于对表位A特异性的抗体时(即，结合结构域从VLA-VHA相互作用而形成)，每条多肽将包含VHA和VLA。抗体两条多肽链的同二聚化将导致形成两个VLA-VHA结合位点，形成二价的单特异性抗体。当VL和VH结构域来源于对不同抗原特异性的抗体时，形成功能性双特异性双抗体要求两条不同多肽链相互作用，即，形成异二聚体。例如，对于双特异性双抗体，一条多肽链将包含VLA和VLB；所述链的同二聚化将导致形成两个VLA-VHB结合位点，或不结合或不可预测地结合。相反，当两条不同多肽链自由地相互作用时，如，在重组表达系统中，一条包含VLA和VHB，另一条包含VLB和VHA时，将形成两个不同结合位点：VLA-VHA和VLB-VHB。对于所有双抗体多肽链对，可能两条链错比对或错结合是可能的事，即，VL-VL或VH-VH结构域相互作用；然而，基于适当二聚化的结合位点的免疫特异性，使用本领域已知的或本文示例的任何基于亲和性的方法如亲和色谱，纯化功能性双抗体是易于操纵的。
在其他实施方案，双抗体的一条或多条多肽链包含Fc结构域。双抗体分子多肽链中的Fc结构域优先二聚化，导致形成表现免疫球蛋白-样特征如，Fc-FcγR相互作用的双抗体分子。包含Fc的双抗体可为二聚体，如，包括两条多肽链，各包含VH结构域、VL结构域和Fc结构域。所述多肽链的二聚化形成包含Fc结构域的二价双抗体，尽管具有不同于未修饰的二价的抗体的结构(图11)。这种双抗体分子将表现相对于野生型免疫球蛋白改变的表型，如，改变的血清半衰期、结合性质等等。在其他实施方案，包含Fc结构域的双抗体分子可为四聚体。这种四聚体(tertramer)包括两条‘较重’多肽链，即，包含VL、VH和Fc结构域的多肽链，和两条‘较轻’多肽链，即，包含VL和VH的多肽链。所述较轻链与较重链相互作用以形成单体，所述单体经由其未配对的Fc结构域相互作用以形成Ig-样分子。这种Ig-样双抗体是四价的，可为单特异性、双特异性或四特异性。
双抗体分子的至少两个结合位点可识别相同或不同表位。不同表位可来自相同抗原或来自不同抗原的表位。在一个实施方案，表位来自不同细胞。在另一个实施方案，表位是相同细胞或病毒上的细胞表面抗原。表位结合位点可识别可对其产生抗体的任何抗原。例如，蛋白、核酸、细菌毒素、细胞表面标记、自身免疫标记、病毒蛋白、药物等等。在具体方面，双抗体的至少一个表位结合位点是对特定细胞上的抗原特异性的，诸如B-细胞或T-细胞、吞噬细胞、天然杀伤(NK)细胞或树突细胞。
双抗体多肽链的各结构域即，VL、VH和FC结构域可由肽接头分开。肽接头可为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在某些实施方案，氨基酸接头序列是核酸序列(SEQ ID NO：76)编码的GGGSGGGG(SEQ IDNO：10)。
在某些实施方案，双抗体分子的各条多肽链工程化为包含至少一个半胱氨酸残基，其将与本发明的第二多肽链上的相应至少一个半胱氨酸残基相互作用以形成链间二硫键。所述链间二硫键用于稳定双抗体分子，改进重组系统中的表达和回收，形成稳定和一致的制剂以及改进分离和/或纯化产物的体内稳定性。所述至少一个半胱氨酸残基可作为单个氨基酸或作为更大氨基酸序列如铰链结构域的一部分引入多肽链的任何部分。在特定实施方案，所述至少一个半胱氨酸残基工程化为出现在多肽链C-末端。在一些实施方案，所述至少一个半胱氨酸残基引入多肽链的氨基酸序列LGGC中。在特定实施方案，包含多肽链C-末端的本发明的双抗体分子包括氨基酸序列LGGC。在另一个实施方案，所述至少一个半胱氨酸残基引入多肽中包含铰链结构域的氨基酸序列如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4。在特定实施方案，本发明的双抗体分子多肽链的C-末端包含IgG铰链结构域的氨基酸序列如，SEQ ID NO：1。在另一个实施方案，本发明的双抗体分子多肽链的C-末端包含氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：79)，其可被核苷酸序列(SEQ ID NO：80)编码。在其他实施方案，所述至少一个半胱氨酸残基引入多肽链的氨基酸序列LGGCFNRGEC(SEQ ID NO：17)，其可被核苷酸序列(SEQ ID NO：78)编码。在特定实施方案，包含多肽链C-末端的本发明的双抗体包括氨基酸序列LGGCFNRGEC(SEQ ID NO：17)，其可被核苷酸序列(SEQ ID NO：78)编码。在其他的实施方案，所述至少一个半胱氨酸残基引入多肽链的氨基酸序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)，其可被核苷酸序列(SEQ ID NO：77)编码。在特定实施方案，包含多肽链C-末端的本发明的双抗体包括氨基酸序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)，其可被核苷酸序列(SEQ ID NO：77)编码。
在某些实施方案，双抗体分子包括至少两条多肽链，其各包括氨基酸序列LGGC并由所述LGGC序列中半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。在另一特定实施方案，双抗体分子包括至少两条多肽链，其中一条包括序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)，而另一条包括铰链结构域(包含至少一个半胱氨酸残基)，其中所述至少两条多肽链由FNRGEC(SEQ ID NO：23)中的半胱氨酸残基与铰链结构域中的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。在具体方面，位于铰链结构域中负责二硫键的半胱氨酸残基是Cys-128(根据Kabat EU编号；位于未修饰的完整IgG重链的铰链结构域中)，SEQ IDNO：23中相应的半胱氨酸残基是Cys-214(根据Kabat EU编号；位于未修饰的完整IgG轻链的C-末端)(Elkabetz等人(2005)“Cysteines In CH1Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains(CH1中的半胱氨酸引起保持未组装的Ig重链)”J.Bio1.Chem.280：14402-14412；在此通过引用全文并入本文)。在其他的实施方案，至少一个半胱氨酸残基工程化为出现在氨基酸链N-末端。在其他实施方案，至少一个半胱氨酸残基工程化为出现在双抗体分子多肽链的接头部分。在进一步实施方案，VH或VL结构域工程化为相对于亲本VH或VL结构域包括至少一个氨基酸修饰，以使所述氨基酸修饰包括以半胱氨酸取代亲本氨基酸。
本发明包括包含Fc结构域或其部分(如，CH2结构域或CH3结构域)的双抗体分子。Fc结构域或其部分可来源于任何免疫球蛋白同种型或同种异型，包括但不限于IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在优选实施方案，Fc结构域(或其部分)来源于IgG。在特定实施方案，IgG同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其同种异型。在一个实施方案，双抗体分子包括Fc结构域，该Fc结构域包括独立选自任何免疫球蛋白同种型的CH2结构域和CH3结构域(即，包含来源于IgG的CH2结构域和来源于IgE的CH3结构域、或来源于IgG1的CH2结构域和来源于IgG2的CH3结构域等等的Fc结构域)。所述Fc结构域可被工程化到包含本发明的双抗体分子的多肽链中相对于所述多肽链其他结构域或部分的任何位置(如，Fc结构域或其部分可位于链的多肽的VL和VH结构域c-末端；可位于VL和VH结构域的n-末端；或可位于一个结构域的N-末端和另一结构域的c-末端(即，在多肽链的两个结构域之间))。
本发明还包括包含铰链结构域的分子。铰链结构域来源于任何免疫球蛋白同种型或同种异型，包括IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在优选实施方案，铰链结构域来源于IgG，其中IgG同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、或其同种异型(allotpye)。所述铰链结构域可与Fc结构域一起工程化到包含双抗体分子的多肽链中以使双抗体分子包括铰链-Fc结构域。在某些实施方案，铰链和Fc结构域独立选自本领域已知的或本文示例的任何免疫球蛋白同种型。在其他实施方案，铰链和Fc结构域间隔多肽链的至少一个其他结构域，如，VL结构域。铰链结构域或任选地铰链-Fc结构域可工程化到本发明的多肽中相对于所述多肽链的其他结构域或部分的任何位置。在某些实施方案，本发明的多肽链包括铰链结构域，该铰链结构域是在多肽链的C-末端，其中所述多肽链不包括Fc结构域。在其他的实施方案，本发明的多肽链包括铰链-Fc结构域，该铰链-Fc结构域是在多肽链的C-末端。在进一步实施方案，本发明的多肽链包括铰链-Fc结构域，该铰链-Fc结构域是在多肽链的N-末端。
如上讨论的，本发明包括多肽链的多聚体，其中每条多肽链包括VH和VL结构域。在某些方面，所述多聚体中的多肽链进一步包括Fc结构域。Fc结构域的二聚化导致形成表现免疫球蛋白-样功能即，Fc介导的功能(如，Fc-FcγR相互作用、补体结合等等)的双抗体分子。在某些实施方案，包含VL和VH结构域的各多肽链具有相同特异性，所述双抗体分子是二价和单特异性的。在其他实施方案，包含VL和VH结构域的各多肽链具有不同特异性，双抗体是二价和双特异性的。
在其他的实施方案，本发明的双抗体分子包括多肽链的四聚体，其中每条多肽链包括VH和VL结构域。在某些实施方案，四聚体的两条多肽链进一步包括Fc结构域。因此四聚体包括两条‘较重’多肽链和两条‘较轻’多肽链，每条‘较重’多肽链包含VL、VH和Fc结构域，每条‘较轻’多肽链包含VL和VH结构域。较重链与较轻链相互作用为二价的单体以及所述单体经由较重链Fc结构域的二聚化将导致形成四价的免疫球蛋白-样分子(示例在实施例6.2和实施例6.3)。在某些方面，单体是相同的，四价的双抗体分子是单特异性或双特异性。在其他方面，单体是不同的，四价的分子是双特异性或四特异性。
形成上述四特异性双抗体分子要求四条不同多肽链相互作用。这种相互作用在单细胞重组生产系统中难以有效实现，由于许多可能的链错配变体。对增加错配概率的一个解决方案是工程化“knobs-into-holes”型突变到期望的多肽链对中。这种突变有利于异二聚化而不是同二聚化。例如，关于Fc-Fc-相互作用，氨基酸取代(优选地以包含形成‘knob’的堆积侧链基团的氨基酸如色氨酸取代)可被引入CH2或CH3结构域以使位阻将阻止与类似地突变的结构域相互作用并迫使突变的结构域与一种结构域配对，该结构域中已经工程化了互补或适应的突变，即，‘hole’(如，以甘氨酸取代)。这种突变组可工程化到包含双抗体分子的任何多肽对中，且进一步工程化到任何所述对的多肽链的任何部分。有利于异二聚化而不是同二聚化的蛋白工程化方法是本领域熟知的，特别是关于工程化免疫球蛋白-样分子，并包括在本文中(参见例如，Ridgway等人(1996)“‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization(为了重链异二聚化‘Knobs-Into-Holes’工程化抗体CH3结构域)”ProteinEngr.9：617-621，Atwell等人(1997)“Stable Heterodimers From RemodelingThe Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library(使用噬菌体展示文库对同二聚体结构域界面再次建模获得的稳定异二聚体)”J.Mol.Biol.270：26-35，和Xie等人(2005)“A New Format Of BispecificAntibody：Highly Efficient Heterodimerization，Expression And Tumor CellLysis(一种新型双特异性抗体：高效异二聚化、表达和肿瘤细胞裂解)”J.Immunol.Methods 296：95-101；所有这些通过引用全文并入本文)。
本发明还包括包含变体Fc或变体铰链-Fc结构域(或其部分)的双抗体分子，该变体Fc结构域相对于相应的野生型Fc结构域或铰链-Fc结构域(或其部分)包括至少一个氨基酸修饰(如，取代、添加、缺失)。包含变体Fc结构域或铰链-Fc结构域(或其部分)的分子(如，抗体)相对于包含野生型Fc结构域或铰链-Fc结构域或其部分的分子通常具有改变的表型。变体表型可表现为改变的血清半衰期、改变的稳定性、改变的对细胞酶的敏感性或改变的效应物功能，如在NK依赖性或巨噬细胞依赖性测定中测定的。鉴定为改变的效应物功能的Fc结构域变体公开在国际申请WO04/063351、美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514、2004年11月10日提交的美国临时申请60/626,510、2004年11月15日提交的60/636,663、和2006年3月10日提交的60/781,564、以及2005年11月10日提交的美国专利申请11/271,140、2005年11月15日提交的11/305,787，这些是本发明人的同时申请，所有这些通过引用全文并入本文。
本发明的双特异性双抗体可同时结合两个分开的和不同的表位。在某些实施方案，这些表位来自相同抗原。在其他实施方案，这些表位来自不同抗原。在优选实施方案，至少一个表位结合位点是对免疫效应细胞上表达的决定簇特异性的(如，CD3、CD16、CD32、CD64等等)，其在T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞或其他单核细胞上表达。在一个实施方案，双抗体分子结合于效应细胞决定簇并还活化所述效应细胞。在这方面，本发明的双抗体分子可表现Ig-样功能，而不论其是否进一步包括Fc结构域(如，在本领域已知的或本文示例的任何效应物功能测定(如，ADCC测定)中测定的。在某些实施方案，本发明的双特异性双抗体结合肿瘤细胞上的癌抗原和效应细胞决定簇两者并活化所述细胞。在替代实施方案，本发明的双特异性双抗体或双抗体分子可通过同时结合并因此连接相同细胞上的活化和抑制性受体(如，结合CD32A和CD32B两者、BCR和CD32B两者、或IgERI和CD32B两者)而抑制靶如效应物、细胞的活化，如上述(参见发明背景部分)。在该实施方案的进一步方面，双特异性双抗体可表现抗病毒性质，通过同时结合病毒上的两个中和表位(如，RSV表位；WNV表位诸如E16和E53)。
在某些实施方案，本发明的双特异性双抗体分子提供靶向特定细胞类型的独特机会。例如，双特异性双抗体或双抗体分子可工程化为包括识别对靶细胞或组织类型独特的一组抗原的表位结合位点组合。另外，当单独抗原之一或两者分别在其他组织和/或细胞类型中相当常见时，低亲和性结合结构域可用于构建双抗体或双抗体分子。这种低亲和性结合结构域将能够以足以用于治疗目的的亲和力结合于单独表位或抗原。然而，当两种表位或抗原都存在于单独靶细胞或组织上时，双抗体或双抗体分子对细胞或组织的亲和力相对于仅表达抗原之一的细胞或组织将增加以使所述细胞或组织可被本发明有效地靶向。相对于单特异性双抗体或仅对抗原之一具有特异性的抗体，这种双特异性分子可表现对表达靶抗原两者的细胞上其所述抗原之一或两者增强的结合。
优选地，本发明双抗体的结合性质由体外功能性测定表征以确定结合活性和/或一或多种FcγR介质效应细胞功能(经由Fc-FcγR相互作用或由免疫特异性结合双抗体分子于FcγR而介导)(参见5.4.2和5.4.3节)。本发明的分子如，双抗体对FcγR的亲和性和结合性质可使用用于确定结合结构域-抗原或Fc-FcγR相互作用，即，分别是抗原对结合结构域的特异性结合或Fc区对FcγR的特异性结合的本领域已知的体外测定(基于生化或免疫学的测定)来确定，包括但不限于ELISA测定、表面等离子共振测定、免疫沉淀测定(参见5.4.2节)。在最优选的实施方案，本发明的分子在体内模型中(诸如本文描述和公开的)具有与基于体外的测定类似的结合性质。然而，本发明不排除在基于体外的测定中不表现期望表型但在体内表现期望表型的本发明的分子。
在一些实施方案，本发明的分子被工程化以包括相对于模板分子的相应部分改变的糖基化模式或改变的糖形。工程化的糖形可用于多种目的，包括但不限于增强效应物功能。工程化的糖形可由本领域技术人员已知的任何方法产生，例如通过使用工程化的或变体表达株，通过与一或多种酶例如DI N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII)共表达，通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系表达本发明的双抗体，或通过在已经表达和纯化双抗体之后修饰糖类。产生工程化的糖形的方法是本领域已知的，包括但不限于在Umana等人(1999)“Engineered Glycoforms Of AnAntineuroblastoma IgG1 With Optimized Antibody-Dependent CellularCytotoxic Activity(具有优化的抗体依赖性细胞毒活性的抗成神经细胞瘤IgG1的工程化的糖形)”Nat.Biotechnol 17：176-180；Davies等人(2001)“Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production CellLine：Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An IncreaseIn Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII(GnTIII在重组抗CD20CHO产生细胞系中的表达：表达具有改变的糖形的抗体经由对FcγRIII更高亲和性而导致Adcc增加)”Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields等人(2002)“Lack Of Fucose On Human IgGl N-Linked OligosaccharideImproves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent CellularToxicity(在人类IgG1 N-连接的寡糖上缺乏岩藻糖改进对人类FcγRIII的结合和抗体依赖性细胞毒性)”J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等人(2003)“The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose OrBisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgGl Complex-TypeOligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-DependentCellular Cytotoxicity(人类IgG1复合物-型寡糖中岩藻糖的不存在而不是半乳糖或平分的N-乙酰氨基葡糖的存在显示增强抗体依赖性细胞毒性的重要作用)”J Biol Chem 278：3466-3473)；美国专利6,602,684；USSN10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；PotillegentTM技术(Biowa，Inc.Princeton，NJ)；GlycoMAbTM糖基化工程化技术(GLYCART biotechnology AG，Zurich，Switzerland)中描述的那些；所有这些通过引用全文并入本文。参见例如，WO 00061739；EA01229125；美国专利20030115614；Okazaki等人(2004)“Fucose Depletion From Human IgG1Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate BetweenIgGl And FcGammaRIIIA(从人类IgG1寡糖清除岩藻糖增强IgG1与FcγRIIIA之间的结合焓和缔合速率)”JMB，336：1239-49，所有这些通过引用全文并入本文。
本发明进一步包括掺入非天然氨基酸以产生本发明的双抗体。这种方法是本领域技术人员已知的，诸如使用天然生物合成机制以允许掺入非天然氨基酸到蛋白中的方法，参见例如，Wang等人(2002)“Expanding TheGenetic Code(扩展遗传密码)”Chem.Comm.1：1-11；Wang等人(2001)“Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli(扩展大肠杆菌的遗传密码)”Science，292：498-500；van Hest等人(2001)“Protein-Based Materials，Toward A New Level Of Structural Control(基于蛋白的材料，朝向新水平的结构控制)”Chem.Comm.19：1897-1904，所有这些通过引用全文并入本文。替代策略关注负责生物合成氨基酰基-tRNA的酶，参见例如，Tang等人(2001)“Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein ContainingHexafluoroleucine In A n Engineered Bacterial Host(在工程化的细菌宿主中生物合成含有六氟亮氨酸的高度稳定的卷曲螺旋蛋白)”J.Am.Chem.Soc.123(44)：11089-11090；Kiick等人(2001)“Identification Of An Expanded SetOf Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli(在大肠杆菌中鉴定翻译活化的甲硫氨酸类似物的扩展组)”FEBS Lett.502(1-2)：25-30；所有这些通过引用全文并入本文。
在一些实施方案，本发明包括通过添加或缺失糖基化位点而修饰本发明分子的VL、VH或Fc结构域的方法。修饰蛋白的糖类的方法是本领域熟知的并包括在本发明中，参见例如，美国专利第6,218,149号；EP 0 359096 B1；美国专利公布US 2002/0028486；WO 03/035835；美国专利公布2003/0115614；美国专利第6,218,149号；美国专利第6,472,511号；所有这些通过引用全文并入本文。
5.1双抗体结合结构域
本发明的双抗体包括通常来源于免疫球蛋白或抗体的抗原结合结构域。本发明方法中使用的结合结构域所来源的抗体可以来自任何动物来源，包括禽类和哺乳动物(如，人类、非人类灵长类、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。优选地，所述抗体是人类或人源化的单克隆抗体。如在此使用的，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，还包括从人类免疫球蛋白文库、或合成的人类免疫球蛋白编码序列文库、或者从表达人类基因的抗体的小鼠中分离的抗体。
本发明涵盖使用本领域已知用于治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病、炎性疾病或传染病的任何抗体作为本发明的双抗体的结合结构域的来源。已知癌抗体的非限制性实例提供在5.7.1节，以及对所列靶抗原特异性的其他抗体和针对癌抗原的抗体列在5.6.1节；用于治疗和/或预防自身免疫疾病和炎性疾病的已知抗体的非限制性实例提供在5.7.2节，以及针对所列靶抗原的抗体和针对抗原的抗体列在5.6.2节；在其他实施方案，可使用针对传染病相关表位的抗体，如列在5.6.3节的。在某些实施方案，抗体包括包含一个或多个氨基酸修饰的变体Fc区，所述抗体已经被本发明的方法鉴定为相对于包含野生型Fc区的相应分子具有赋予的效应物功能和/或对FcγRIIB增强的亲和性和对FcγRIIIA减少的亲和性。可根据本发明工程化的用于治疗或预防炎性病症的抗体的非限制性实例示于表9，用于治疗或预防自身免疫病症的抗体的非限制性实例示于表10。
对于一些用途，包括在人体内使用抗体和体外的检测测定，可优选使用具有来源于人类、嵌合的或人源化抗体的可变结构域的双抗体。来自完全的人类抗体的可变结构域对人类受治疗者的治疗性处理是特别理想的。通过本领域公知的多种方法可制备人类抗体，包括上文所述的利用来自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。也参见美国专利第4,444,887和4,716,111号；以及国际公布第WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741号；所有这些通过引用全文并入本文。
人源化抗体为能够结合预先确定的抗原并包含基本上具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的框架区和基本上具有非人类免疫球蛋白氨基酸序列的CDR的抗体、其变体或片段。人源化抗体可包含基本全部的至少一个和典型的两个可变结构域，其中全部或基本上全部的CDR区域对应于非人类免疫球蛋白(即，供者抗体)的CDR区域，全部或基本上全部的框架区是人类免疫球蛋白共有序列的框架区。
人源化抗体的框架区和CDR区不必与亲本序列精确对应，例如，供者CDR或共有框架区可通过至少一个残基的取代、添加或缺失而被诱变从而使该CDR或框架在该位点处的残基与该共有抗体或供者抗体不对应。然而这种突变优选地范围不广泛。通常，至少75％的人源化抗体残基与其亲本框架区(FR)和CDR序列的残基对应、更常见地是90％、并最优选超过95％对应。人源化抗体可利用本领域公知的多种技术来产生，包括但不限于CDR-嫁接(欧洲专利EP 239,400；国际公布第WO 91/09967号；和美国专利第5,225,539、5,530,101和5,585,089号)，贴合(veneering)或表面重建(resurfacing)(欧洲专利EP 592,106和EP 519,596；Padlan(1991)“A Possible Procedure For Reducing The Immunogenicity Of AntibodyVariable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties(用于减少抗体可变结构域的免疫原性并保留其配体-结合性质的可能方案)”Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka等人(1994)“Human-Engineered Monoclonal Antibodies Retain Full Specific BindingActivity By Preserving Non-CDR Complementarity-Modulating Residues(人类-工程化的单克隆抗体通过保留非-CDR互补性调节残基保持完全的特异性结合活性)”Protein Engineering 7(6)：805-814；和Roguska等人(1994)“Humanization Of Murine Monoclonal Antibodies Through Variable DomainResurfacing(经由可变结构域表面重建将鼠单克隆抗体人源化)”Proc NatlAcad Sci USA 91：969-973)、链改组(美国专利第5,565,332号)、和以下公开的技术，如，美国专利第6,407,213、5,766,886、5,585,089号、国际公布第WO 9317105号、Tan等人(2002)“‘Superhumanized’Antibodoes：Reduction Of Immunogenic Potential By Complementarity-Determining RegionGrafting With Human Germline Sequences：Application To An Anti-CD28(‘超级人源化’抗体：通过互补决定区与人类种系序列嫁接而减少免疫原性可能：应用于抗-CD28)”J.Immunol.169：1119-25，Caldas等人(2000)“DesignAnd Synthesis Of Germline-Based Hemi-Humanized Single-Chain Fv AgainstThe CD 18 Surface Antigen(设计和合成针对CD 18表面抗原的基于种系的半-人源化单链Fv)”Protein Eng.13：353-60，Morea等人(2000)“AntibodyModeling：Implications For Engineering And Design(抗体建模：与工程化和设计的关联)”Methods 20：267-79，Baca等人(1997)“AntibodyHumanization Using Monovalent Phage Display(使用单价噬菌体展示的抗体人源化)”J.Biol.Chem.272：10678-84，Roguska等人(1996)“AComparison Of Two Murine Monoclonal Antibodies Humanized By CDR-Grafting And Variable Domain Resurfacing(比较CDR-嫁接和可变结构域表面重建人源化的两种鼠单克隆抗体)”Protein Eng.9：895-904，Couto等人(1995)“Designing Human Consensus Antibodies With Minimal PositionalTemplates(以最小位置模板设计人类共有抗体)”Cancer Res.55(23Supp)：5973s-5977s，Couto等人(1995)“Anti-BA46 Monoclonal Antibody Mc3：Humanization Using A Novel Positional Consensus And In Vivo And In VitroCharacterization(抗-BA46单克隆抗体Mc3：使用新型位置共有序列人源化和体内及体外表征)”Cancer Res.55：1717-22，Sandhu(1994)“A RapidProcedure For The Humanization Of Monoclonal Antibodies(人源化单克隆抗体的快速方案)”Gene 150：409-10，Pedersen等人(1994)“Comparison OfSurface Accessible Residues In Human And Murine Immunoglobulin FvDomains.Implication For Humanization Of Murine Antibodies(比较人类和鼠免疫球蛋白Fv结构域中的表面可得残基。涉及鼠抗体的人源化)”J.Mol.Biol.235：959-973，Jones等人(1986)“Replacing TheComplementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those FromA Mouse(以来自小鼠的互补决定区代替人类抗体的互补决定区)”Nature321：522-525，Riechmann等人(1988)“Reshaping Human Antibodies ForTherapy(为了治疗重塑人类抗体)”Nature 332：323-327，和Presta(1992)“Antibody Engineering(抗体工程化)”Cure.Op.Biotech.3(4)：394-398。通常，在框架区内的框架残基被CDR供者抗体的对应残基取代以改变，优选改善抗原结合。可用本领域公知的方法鉴定这些框架取代，例如，通过模拟所述CDR与框架残基的相互作用来鉴定对抗原结合重要的框架残基，和通过序列比较来鉴定在特定位置的不常见框架残基(参见例如，Queen等人，美国专利第5,585,089号；美国专利申请公布第2004/0049014和2003/0229208号；美国专利第6,350,861；6,180,370；5,693,762；5,693,761；5,585,089；和5,530,101以及Riechmann等人(1988)“Reshaping HumanAntibodies For Therapy(为了治疗重塑人类抗体)”Nature 332：323-327，所有这些都通过引用全文并入本文)。
在最优选实施方案，所述人源化结合结构域特异性结合与供者鼠抗体相同的表位。本领域技术人员应理解，本发明通常涵盖抗体的CDR嫁接。因此，所述供者和受者抗体可衍生自相同物种的动物甚至相同抗体类型或亚型。然而更常见的供者和受者抗体衍生自不同物种的动物。典型地所述供者抗体为非人类抗体，例如啮齿类mAb，而受者抗体为人类抗体。
在一些实施方案中，将供者抗体的至少一个CDR嫁接至人类抗体。在其他的实施方案中，将每一重链和/或轻链可变区的至少两种，优选所有的三个CDR嫁接至人类抗体。所述CDR可包括Kabat CDR、结构环CDR或其组合。在一些实施方案中，本发明包括人源化FcγRIIB抗体，其包含至少一个CDR嫁接的重链和至少一个CDR嫁接的轻链。
用于本发明方法的双抗体包括被修饰的衍生物，所述修饰即，通过共价附着任何类型的分子到双抗体。例如但不限于，双抗体衍生物包括已被修饰的双抗体，如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解性裂解、连接到细胞配体或其他蛋白，等等。可以通过已知的技术进行多种化学修饰的任何一种，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成，等等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
嵌合抗体是该抗体的不同部分来自不同的免疫球蛋白分子的分子，例如具有来自非类人抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域公知的。参见例如，Morrison(1985)“TransfectomasProvide Novel Chimeric Antibodies(转染瘤提供新型嵌合抗体)”Science229：1202-1207；Oi等人(1986)“Chimeric Antibodies(嵌合抗体)”BioTechniques 4：214-221；Gillies等人(1989)“High-Level Expression OfChimeric Antibodies Using Adapted cDNA Variable Region Cassettes(使用修饰的cDNA可变区盒高水平表达嵌合抗体)”J.Immunol.Methods125：191-202；和美国专利第6,311,415、5,807,715、4,816,567和4,816,397号，通过引用全文并入本文。
通常，在框架区内的框架残基被CDR供者抗体的对应残基取代以改变，优选改善抗原结合。可用本领域公知的方法鉴定这些框架取代，例如，通过模拟所述CDR与框架残基的相互作用来鉴定对抗原结合重要的框架残基，和通过序列比较来鉴定在特定位置的不常见框架残基(参见例如，美国专利第5,585,089号；和Riechmann等人(1988)“Reshaping HumanAntibodies For Therapy(为了治疗重塑人类抗体)”Nature 332：323-327，通过引用全文并入本文)。
本发明的双抗体的结合结构域所来自的单克隆抗体可使用本领域已知的大量技术制备，包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可使用杂交瘤技术产生，包括本领域已知和教导在例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体实验室手册)(ColdSpring Harbor Laboratory Press，第2版.1988)；Hammerling等人：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)，pp.563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(两者通过引用全文并入本文)的那些。如在此使用的术语“单克隆抗体”不限于由杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于包括任何真核、原核或噬菌体克隆的单个克隆的抗体，而不是其产生方法。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的和本领域公知的。在非限制性实例，可以用目标抗原或表达这种抗原的细胞免疫小鼠。检测到免疫应答后，如，在小鼠血清中检测到对抗原特异性的抗体后，收集小鼠脾脏并分离脾细胞。随后由已知技术将脾细胞融合到任何适合的骨髓瘤细胞。选择杂交瘤并由有限稀释克隆。随后由本领域已知的方法测定杂交瘤克隆中分泌能够结合抗原的抗体的细胞。通常含有高水平抗体的腹水可通过以阳性杂交瘤克隆腹膜内接种小鼠产生。目标抗原包括但不限于，5.8.1节提供的癌症相关抗原、5.8.2节提供的与自身免疫疾病和炎性疾病相关的抗原、5.8.3节提供的与传染病相关的抗原、和5.8.4节提供的毒素。
抗体还可使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码功能性抗体结构域的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。在具体实施方案，这种噬菌体可用于展示从整套或组合抗体文库(如，人类或鼠)表达的抗原结合结构域，诸如Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。表达结合目标抗原的抗原结合结构域的噬菌体可用抗原选择或鉴定，如，使用标记的抗原或结合或捕获到固相表面或珠的抗原。用于这些方法的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13。抗原结合结构域表达为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白的重组融合蛋白。可用于制备本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括描述在以下的方法：Brinkmann等人(1995)“Phage Display Of Disulfide-Stabilized FvFragments(噬菌体展示二硫键稳定的Fv片段)”J.Immunol.Methods，182：41-50；Ames等人(1995)“Conversion Of Murine Fabs Isolated From ACombinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins(将从组合噬菌体展示文库分离的鼠Fab转化为全长免疫球蛋白)”J.Immunol.Methods，184：177-186；Kettleborough等人(1994)“Isolation Of TumorCell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-AntibodyLibraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These AntibodyFragments (使用噬菌体-抗体文库从免疫的小鼠分离肿瘤细胞特异性单链Fv并从这些抗体片段重新构建完全抗体)”Eur.J.Immunol，24：952-958；Persic等人(1997)“An Integrated Vector System For The EukaryoticExpression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From PhageDisplay Libraries(从噬菌体展示文库选择后用于真核表达抗体或其片段的整合的载体系统)”Gene，187：9-18；Burton等人(1994)“Human AntibodiesFrom Combinatorial Libraries(来自组合文库的人类抗体)”Advances inImmunology，57：191-280；PCT申请第PCT/GB91/01134号；PCT公布WO90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利第5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108号；所有这些通过引用全文并入本文。
可用噬菌体展示技术来增加抗体对其抗原的亲和性。此技术可用于获得高亲和性抗体。该技术称作亲和力成熟，其采用诱变或CDR步移和再选择，利用同源抗原来鉴定与初始抗体或亲本抗体相比以更高亲和性与所述抗原结合的抗体(参见例如，Glaser等人(1992)“Dissection Of TheCombining Site In A Humanized Anti-Tac Antibody(剖析人源化抗-Tac抗体中的组合位点)”J.Immunology 149：2607-2614)。诱变全部密码子而非单一核苷酸产生半随机的整套氨基酸突变。可将文库构建成包含一组变体克隆，每一克隆的单个CDR中的单个氨基酸改变都不同，且该克隆含有代表各个CDR残基的各个可能氨基酸取代的变体。对所述抗原的结合亲和性增加的突变体可通过将固定的突变体与标记的抗原接触来筛选。可采用任何本领域公知的筛选方法来鉴定对所述抗原的亲和力增加的突变抗体(例如ELISA)(参见Wu等人(1998)“Stepwise In Vitro Affinity MaturationOf Vitaxin，An Alphav Beta3-Specific Humanized mAb(一种αvβ3-特异性人源化mAb Vitaxin的逐步体外亲和力成熟)”Proc Natl.Acad Sci.USA95：6037-6042；Yelton等人(1995)“Affinity Maturation Of The Br96Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis(通过基于密码子的诱变Br96抗-癌抗体的亲和力成熟)”J.Immunology 155：1994-2004)。也可使用使轻链随机化的CDR步移(参见Schier等人(1996)“Isolation OfPicomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution OfThe Complementarity Determining Regions In The Center Of The AntibodyBinding Site(通过抗体结合位点中心中的互补决定区的分子进化分离皮摩尔亲和性抗-C-ErbB-2单链)”J.Mol.Bio.263：551-567)。
本发明还涵盖包含本文所述的或本领域已知的任何结合结构域的氨基酸序列、在框架或CDR区中带有突变(如，一种或多种氨基酸取代)的结合结构域的用途。优选地，这些结合结构域中的突变保持或增强结合结构域对其免疫特异性地结合的FcγRIIB的亲和力和/或亲和性。本领域技术人员已知的标准技术(如，免疫测定)可用于测定抗体对特定抗原的亲和性。
本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码抗体或其片段的核苷酸序列中引入突变，包括如，定点诱变和PCR-介导的诱变，其造成氨基酸取代。优选地，衍生物相对于原始抗体或其片段包含少于15氨基酸取代、少于10氨基酸取代、少于5氨基酸取代、少于4氨基酸取代、少于3氨基酸取代或少于2氨基酸取代。在优选实施方案，衍生物在一个或多个预测的非必需氨基酸残基中具有保守氨基酸取代。
5.1.1包含免疫特异性地结合FcγRIIB的表位结合位点的双抗体
在具体实施方案，本发明双抗体的至少一个结合结构域激动FcγRIIB的至少一种活性。在本发明的一个实施方案，所述活性是抑制B细胞受体-介导的信号传导。在另一个实施方案，结合结构域抑制B细胞的活化、B细胞增殖、抗体产生、B细胞的细胞内钙流入、细胞周期进程、或FcγRIIB信号转导途径中一种或多种下游信号传导分子的活性。在另一实施方案，结合结构域增强FcγRIIB磷酸化或SHIP募集。在本发明进一步实施方案，结合结构域抑制MAP激酶活性或B细胞受体-介导的信号传导途径中Akt募集。在另一个实施方案，结合结构域激动FcγRIIB-介导的FcεRI信号传导抑制。在具体实施方案，所述结合结构域抑制FcεRI-诱导的肥大细胞活化、钙动员、脱粒、细胞因子产生、或5-羟色胺释放。在另一个实施方案，本发明的结合结构域刺激FcγRIIB磷酸化，刺激SHIP募集，刺激SHIP磷酸化和与Shc缔合，或抑制MAP激酶家族成员(如，Erk1、Erk2、JNK、p38等等)活化。在另一实施方案，本发明的结合结构域增强p62dok的酪氨酸磷酸化和其与SHIP和rasGAP缔合。在另一个实施方案，本发明的结合结构域抑制单核细胞或巨噬细胞中FcγR-介导的吞噬作用。
在另一个实施方案，结合结构域拮抗FcγRIIB的至少一种活性。在一个实施方案，所述活性是活化B细胞受体-介导的信号传导。在具体实施方案，结合结构域增强B细胞活性、B细胞增殖、抗体产生、细胞内钙流入、或FcγRIIB信号转导途径中一种或多种下游信号传导分子的活性。在另一具体实施方案，结合结构域减少FcγRIIB磷酸化或SHIP募集。在本发明的进一步实施方案，结合结构域增强MAP激酶活性或B细胞受体介导的信号传导途径中Akt募集。在另一个实施方案，结合结构域拮抗FcγRIIB-介导的抑制FcεRI信号传导。在具体实施方案，结合结构域增强FcεRI-诱导的肥大细胞活化、钙动员、脱粒、细胞因子产生、或5-羟色胺释放。在另一个实施方案，结合结构域抑制FcγRIIB磷酸化，抑制SHIP募集，抑制SHIP磷酸化和其与Shc的缔合，增强MAP激酶家族成员(如，Erk1、Erk2、JNK、p38等等)的活化。在另一实施方案，结合结构域抑制p62dok的酪氨酸磷酸化和其与SHIP和rasGAP的缔合。在另一个实施方案，结合结构域增强单核细胞或巨噬细胞中FcγR-介导的吞噬作用。在另一个实施方案，结合结构域阻止吞噬作用、由脾脏巨噬细胞清除调理的粒子。
在其他实施方案，至少一个结合结构域可用于靶向本发明的双抗体于表达FcγRIIB的细胞。
在一个具体实施方案，结合结构域之一来源于分别具有ATCC登记号PTA-4591和PTA-4592的克隆2B6或3H7产生的小鼠单克隆抗体。产生抗体2B6和3H7的杂交瘤已经按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定在2002年8月13日保藏在美国典型培养物保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，VA.20110-2209)，指定登记号分别为PTA-4591(产生2B6的杂交瘤)和PTA-4592(产生3H7的杂交瘤)，通过引用并入本文。在优选实施方案，结合结构域是人类或已被人源化的，优选地来源于由克隆3H7或2B6产生的抗体的人源化形式。
本发明还涵盖具有来自特异性地结合FcγRIIB、优选地人类FcγRIIB、更优选地天然人类FcγRIIB的其他抗体的结合结构域的双抗体，所述其他抗体来源于包括但不限于分别具有ATCC登记号PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959的1D5、2E1、2H9、2D11和1F2的克隆。产生以上鉴定克隆的杂交瘤按照布达佩斯条约的规定在2004年5月7日保藏在美国典型培养物保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，VA.20110-2209)，通过引用并入本文。在优选实施方案，来自上述抗体的结合结构域是人源化的。
在特定实施方案，用在本发明双抗体中的结合结构域是来自由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的抗体的抗体或其抗原-结合片段(如，包含一个或多个互补决定区(CDR)，优选地所有6个CDR)。在另一个实施方案，结合结构域分别与克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体结合于相同表位，和/或与克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体竞争，如，在ELISA测定或其他合适的竞争性免疫测定确定的，还比结合FcγRIIA的结合结构域以更大亲和性结合FcγRIIB。
本发明还涵盖具有结合结构域的双抗体，所述结合结构域包含与由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的可变重链和/或轻链的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列。本发明进一步涵盖具有结合结构域的双抗体，所述结合结构域比结合FcγRIIA的所述抗体或其片段以更大亲和性特异性地结合FcγRIIB，并包含与由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的一个或多个CDR的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的一个或多个CDR的氨基酸序列。确定两条氨基酸序列的同一性百分比可由本领域技术人员已知的任何方法确定，包括BIAST蛋白检索。
本发明还涵盖包含比结合FcγRIIA的结合结构域以更大亲和性特异性地结合FcγRIIB的结合结构域的双抗体的用途，该结合结构域由与克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列编码。在优选实施方案，结合结构域以比对FcγRIIA更大的亲和性特异性地结合FcγRIIB，并包含与克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的可变轻链和/或可变重链的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列编码的可变轻链和/或可变重链。在另一优选实施方案，结合结构域以比对FcγRIIA更大的亲和性特异性地结合FcγRIIB，并包含在严格条件下与克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的一个或多个CDR的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的一个或多个CDR。严格杂交条件包括但不限于，在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃与滤器结合的DNA杂交，随后在0.2X SSC/0.1％SDS中在约50-65℃一次或多次洗涤，高度严格条件诸如在6X SSC中在约45℃与滤器结合的DNA杂交，随后在0.1X SSC/0.2％SDS中在约60℃一次或多次洗涤，或本领域技术人员已知的任何其他严格杂交条件(参见例如，Ausubel，F.M.等人编辑，1989，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.和John Wiley and Sons，Inc.，NY中第6.3.1到6.3.6页和第2.10.3页，通过引用并入本文)。
本发明还涵盖包含上述的任何结合结构域的氨基酸序列、在框架或CDR区中带有突变(如，一种或多种氨基酸取代)的结合结构域的用途。优选地，这些结合结构域中的突变保持或增强结合结构域对其免疫特异性地结合的FcγRIIB的亲和力和/或亲和性。本领域技术人员已知的标准技术(如，免疫测定)可用于测定抗体对特定抗原的亲和性。
本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码抗体或其片段的核苷酸序列中引入突变，包括如，定点诱变和PCR-介导的诱变，其造成氨基酸取代。优选地，衍生物相对于原始抗体或其片段包含少于15氨基酸取代、少于10氨基酸取代、少于5氨基酸取代、少于4氨基酸取代、少于3氨基酸取代或少于2氨基酸取代。在优选实施方案，衍生物在一个或多个预测的非必需氨基酸残基中具有保守氨基酸取代。
在优选实施方案，结合结构域来源于人源化抗体。人源化FcγRIIB特异性抗体可包括基本上所有的至少一个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非-人类免疫球蛋白(即，供者抗体)的CDR区且所有或基本上所有框架区是人类免疫球蛋白共有序列的框架区。
本发明的双抗体包括对FcγRIIB特异性的人源化可变结构域，其中人类抗体(受者抗体)的重链和/或轻链可变区的一个或多个CDR的一个或多个区已被供者单克隆抗体的一个或多个CDR的相似部分取代，所述供者单克隆抗体以比对FcγRIIA更大的亲和性特异性地结合FcγRIIB，如，克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的单克隆抗体。在其他实施方案，人源化抗体分别与2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2结合于相同表位。
在优选实施方案，人源化FcγRIIB结合结构域的CDR区来源于对FcγRIIB特异性的鼠抗体。在一些实施方案，本文所述的人源化抗体包括改变，包括但不限于受者抗体即人类抗体的重链和/或轻链可变结构域框架区对于保持供者单克隆抗体的结合特异性必需的氨基酸缺失、添加、修饰。在一些实施方案，本文所述的人源化抗体的框架区不必由天然存在的人类抗体可变区的框架区的准确氨基酸序列组成，但包含各种改变，包括但不限于改变人源化抗体特征例如改进与鼠FcγRIIB特异性抗体对相同靶特异性的人源化抗体区的结合性质的氨基酸缺失、添加、修饰。在最优选的实施方案，对框架区进行最少数目的改变以避免大规模引入非-人类框架残基并确保人源化抗体在人类中的免疫原性最小。供者单克隆抗体优选地是克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的单克隆抗体。
在特定实施方案，结合结构域涵盖以比所述抗体结合FcγRIIA更大的亲和性特异性地结合FcγRIIB的CDR-嫁接的抗体的可变结构域，其中CDR-嫁接的抗体包括包含受者抗体的框架残基和来自供者单克隆抗体的残基的重链可变区结构域，该单克隆抗体以比所述抗体结合FcγRIIA更大的亲和性特异性地结合FcγRIIB，如，克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的单克隆抗体。在另一特定实施方案，本发明的双抗体包括来自CDR-嫁接的抗体的可变结构域，所述抗体以比所述抗体结合FcγRIIA更大的亲和性特异性地结合FcγRIIB，其中CDR-嫁接的抗体包括包含受者抗体的框架残基和来自供者单克隆抗体的残基的轻链可变区结构域，该单克隆抗体以比所述抗体结合FcγRIIA更大的亲和性特异性地结合FcγRIIB，如，克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的单克隆抗体。
用于本发明的人源化抗-FcγRIIB可变结构域可具有包含CDR1(SEQID NO：24或SEQ ID NO：25)和/或CDR2(SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27)和/或CDR3(SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29)氨基酸序列的重链可变区和/或包含CDR1(SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33)和/或CDR2(SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37)和/或CDR3(SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39)氨基酸序列的轻链可变区。
在一个特定实施方案，双抗体包括来自人源化2B6抗体的可变结构域，其中VH区由来自人类种系VH区段VH1-18(Matsuda等人(1998)  “TheComplete Nucleotide Sequence Of The Human Immunoglobulin Heavy ChainVariable Region Locus(人类免疫球蛋白重链可变区基因座的完全核苷酸序列)”J.Exp.Med.188：2151-2162)和JH6的FR区段(Ravetch等人(1981)“Structure Of The Human Immunoglobulin Mu Locus：Characterization OfEmbryonic And Rearranged J And D Genes(人类免疫球蛋白Mu基因座的结构：表征胚胎的和重排的J和D基因)”Cell 27(3 Pt.2)：583-91)、以及2B6VH的一个或多个CDR区组成，具有氨基酸序列SED ID NO：24、SEQ IDNO：26或SEQ ID NO：28。在一个实施方案，2B6 VH具有氨基酸序列SEQID NO：40。在另一个实施方案，2B6 VH结构域具有Hu2B6VH的氨基酸序列SEQ ID NO：87，并可被核苷酸序列SEQ ID NO：88编码。在另一特定实施方案，双抗体进一步包括VL区，其由人类种系VL区段VK-A26(Lautner-Rieske等人(1992)“The Human Immunoglobulin Kappa Locus.Characterization Of The Duplicated A Regions(人类免疫球蛋白κ基因座。表征双重A区)”Eur.J.Immunol.22：1023-1029)和JK4的FR区段(Hieter等人(1982)“Evolution Of Human Immunoglobulin Kappa J Region Genes(人类免疫球蛋白κJ区基因的进化)”J.Biol.Chem.257：1516-22)、以及2B6VL的一个或多个CDR区组成，具有氨基酸序列SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：38。在一个实施方案，2B6 VL具有氨基酸序列SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42或SEQ IDNO：43。在特定实施方案，2B6 VL具有Hu2B6VL的氨基酸序列SEQ IDNO：89，并可被SEQ ID NO：90提供的核苷酸序列编码。
在另一特定实施方案，双抗体具有来自人源化3H7抗体的可变结构域，其中VH区由来自人类种系VH区段的FR区段和3H7 VH的CDR区组成，具有氨基酸序列SED ID NO：37。在另一特定实施方案，人源化3H7抗体进一步包括VL区，其由人类种系VL区段的FR区段和3H7VL的CDR区组成，具有氨基酸序列SEQ ID NO：44。
特别是，结合结构域免疫特异性地结合于天然人类FcγRIIB的细胞外结构域，并包括2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2的CDR序列(或可选地由其组成)，以以下的任何组合：VH CDR1与VL CDR1；VH CDR1与VL CDR2；VH CDR1与VL CDR3；VH CDR2与VL CDR1；VH CDR2与VL CDR2；VH CDR2与VL CDR3；VH CDR3与VH CDR1；VH CDR3与VL CDR2；VH CDR3与VL CDR3；VH1 CDR1、VH CDR2与VL CDR1；VH CDR1、VH CDR2与VL CDR2；VH CDR1、VH CDR2与VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3与VL CDR1、VH CDR2、VH CDR3与VL CDR2；VH CDR2、VH CDR2与VL CDR3；VH CDR1、VL CDR1与VL CDR2；VH CDR1、VL CDR1与VL CDR3；VH CDR2、VL CDR1与VL CDR2；VH CDR2、VL CDR1与VL CDR3；VH CDR3、VL CDR1与VL CDR2；VH CDR3、VL CDR1与VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3与VL CDR1；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3与VL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3与VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1与VL CDR2、VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1与VL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1与VL CDR2；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1与VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1与VL CDR2；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1与VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2与VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1与VL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1与VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2与VL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2与VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2与VL CDR3；或本文公开的VH CDR与VL CDR的其任何组合。
用于衍生将包括在本发明的双抗体中的结合结构域的抗体可进一步由表位作图表征，从而可选择与FcγRIIA相比对FcγRIIB具有最大特异性的抗体。抗体的表位作图方法是本领域公知的并涵盖在本发明的方法中。在某些实施方案，包含FcγRIIB的一个或多个区的融合蛋白可用于对本发明的抗体的表位作图。在特定实施方案，融合蛋白包含与人类IgG2的Fc部分融合的FcγRIIB区的氨基酸序列。各融合蛋白可进一步包括以来自同系受体如，FcγRIIA的相应区氨基酸取代和/或代替某些受体区，如下表2所示。pMGX125和pMGX132含有FcγRIIB受体的IgG结合位点，pMGX125带有FcγRIIB的C-末端，pMGX132带有FcγRIIA的C-末端，可用于区别C-末端结合。其他的在IgG结合位点中具有FcγRIIA取代和FcγIIA或FcγIIB N-末端。这些分子可帮助确定受体分子中结合抗体的部分。
表2.可用于研究单克隆抗-FcγRIIB抗体的表位的融合蛋白列表。残基172至180属于FcγRIIA和B的IgG结合位点。来自FcγRIIA序列的特定氨基酸以粗体表示。
Figure GPA00001026478600571
融合蛋白可用在任何生化测定如ELISA以确定结合于本发明的抗-FcγRIIB抗体。在其他实施方案，进一步证实表位特异性可以使用具有以来自FcγRIIA序列的残基代替的特定残基的肽来进行。
抗体可使用用于鉴定本发明的抗体的功能、特别是调节FcγRIIB信号传导的活性的测定来表征。例如，本发明的表征测定可测量FcγRIIB的ITIM基序中酪氨酸残基的磷酸化，或测量B细胞受体-产生的钙动员的抑制。本发明的表征测定可以是基于细胞的测定或无细胞测定。
本领域已经确定，肥大细胞中FcγRIIB与高亲和性IgE受体FcεRI共聚集导致抑制抗原-诱导的脱粒、钙动员和细胞因子产生(Metcalfe D.D.等人(1997)“Mast Cells(肥大细胞)”Physiol.Rev.77：1033-1079；Long E.O.(1999)“Regulation Of Immune Responses Through Inhibitory Receptors(经由抑制性受体调节免疫应答)”Annu.Rev.Immunol.17：875-904)。该信号传导途径的分子细节最近已经解释(Ott V.L.(2002)“Downstream Of Kinase，p62(dok)，Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling(激酶p62(dok)的下游是FcγIIB抑制FcεRI信号传导的介质)”J.Immunol.162(9)：4430-4439)。与FcεRI共聚集后，FcγRIIB ITIM基序中的酪氨酸被快速磷酸化，随后募集含有Src同源性-2的肌醇-5-磷酸酯酶(SHIP)(一种包含SH2结构域的肌醇磷酸酯5-磷酸酯酶)，其反过来被磷酸化并与Shc和p62dok缔合(p62dok是适体分子家族的原型，包括信号传导结构域诸如氨基末端普列克底物蛋白同源性结构域(PH结构域)、PTB结构域和包含PXXP基序的羧基末端区和多个磷酸化位点(Carpino等人(1997)“p62(dok)：A Constitutively Tyrosine-Phosphorylated，GAP-Associated Protein In ChronicMyelogenous Leukemia Progenitor Cells(p62(dok)：慢性髓性白血病祖细胞中一种组成型酪氨酸-磷酸化的、GAP-相关蛋白)”Cell，88：197-204；Yamanshi等人(1997)“Identification Of The Abl-And rasGAP-Associated 62kDa Protein As A Docking Protein，Dok(鉴定Abl-和rasGAP-相关的62kDa蛋白为停靠蛋白Dok)”Cell，88：205-211)。
用于本发明的抗-FcγRIIB抗体可类似地由调节一种或多种IgE介导的响应的能力而表征。优选地，共表达对IgE高亲和性的受体和对FcγRIIB低亲和性的受体的细胞系将用于表征抗-FcγRIIB抗体调节IgE介导的响应。在特定实施方案，将使用来自大鼠嗜碱细胞性白血病细胞系(RBL-H23；Barsumian E.L.等人(1981)“IgE-Induced Histamine Release FromRat Basophilic Leukemia Cell Lines：Isolation Of Releasing And NonreleasingClones(IgE-诱导的从大鼠嗜碱细胞性白血病细胞系释放组胺：分离释放性和非释放性克隆)”Eur.J.Immunol.11：317-323，其通过引用全文并入本文)、转染了全长人类FcγRIIB的细胞。RBL-2H3是一种充分表征的大鼠细胞系，已经广泛用于研究IgE-介导的细胞活化后的信号传导机理。当在RBL-2H3细胞中表达并与FcεRI共聚集时，FcγRIIB抑制FcεRI-诱导的钙动员、脱粒和细胞因子产生(Malbec等人(1998)  “Fc Epsilon Receptor I-Associated Lyn-Dependent Phosphorylation Of Fc Gamma Receptor HBDuring Negative Regulation Of Mast Cell Activation(在肥大细胞活化负调节期间Fcε受体I-相关的Lyn-依赖性磷酸化Fcγ受体HB)”J.Immunol.160：1647-1658；Daeron等人(1995)“Regulation Of High-Affinity IgEReceptor-Mediated Mast Cell Activation By Murine Low-Affinity IgGReceptors(由鼠低-亲和性IgG受体调节高-亲和性IgE受体-介导的肥大细胞活化)”J.Clin.Invest.95：577；Ott V.L.(2002)“Downstream Of Kinase，p62(dok)，Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling(激酶p62(dok)的下游是FcγIIB抑制FcεRI信号传导的介质)”J.Immunol.162(9)：4430-4439)。
用于本发明的抗体还可由抑制FcεRI诱导的肥大细胞活化而表征。例如，将来自大鼠嗜碱细胞性白血病细胞系(RBL-H23；Barsumian E.L.等人(1981)“IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia CellLines：Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones(IgE-诱导的从大鼠嗜碱细胞性白血病细胞系释放组胺：分离释放性和非释放性克隆)”Eur.J.Immunol.11：317-323)、已经转染FcγRIIB的细胞用IgE敏化并用兔抗-小鼠IgG的F(ab’)2片段刺激以仅聚集FcεRI，或用全长兔抗-小鼠IgG刺激以共聚集FcγRIIB和FcεRI。该系统中，加入本发明的抗体到被敏化和刺激的细胞后可测定对下游信号传导分子的间接调节。例如，可测定FcγRIIB的酪氨酸磷酸化和SHIP的募集与磷酸化、MAP激酶家族成员，包括但不限于Erk1、Erk2、JNK或p38的活化；和p62dok的酪氨酸磷酸化以及其与SHIP和RasGAP的缔合。
用于确定本发明的抗体对FcεRI诱导的肥大细胞活化的抑制的一种示例性测定可包括以下：用人类FcγRIIB转染RBL-H23细胞；用IgE敏化RBL-H23细胞；用兔抗-小鼠IgG的F(ab’)2刺激RBL-H23细胞(以仅聚集FcεRI并引发FcεRI-介导的信号传导，作为对照)，或用全长兔抗-小鼠IgG刺激RBL-H23细胞(以共聚集FcγRIIB和FcεRI，导致抑制FcεRI-介导的信号传导)。已用全长兔抗-小鼠IgG抗体刺激的细胞可进一步用本发明的抗体预培养。测量已用本发明的抗体预培养的细胞和未用本发明的抗体预培养的细胞的FcεRI-依赖性活性并比较这些细胞FcεRI-依赖性活性的水平将指示本发明的抗体对FcεRI-依赖性活性的调节。
上述示例性测定可例如用于鉴定封闭配体(IgG)对FcγRIIB受体的结合并通过阻止FcγRIIB与FcεRI共聚集而拮抗FcγRIIB-介导的FcεRI信号传导抑制的抗体。该测定同样地鉴定增强FcγRIIB与FcεRI共聚集并通过促进FcγRIIB与FcεRI共聚集而激动FcγRIIB-介导的FcεRI信号传导抑制的抗体。
在一些实施方案，通过优选地在基于细胞的测定中监控和/或测量肥大细胞或嗜碱白细胞的脱粒来表征包含本文所述鉴定的或本领域已知的抗-FcγRIIB抗体的表位结合结构域的本发明的抗-FcγRIIB双抗体调节IgE介导的响应的能力。优选地，用于这种测定中的肥大细胞或嗜碱白细胞已使用本领域技术人员已知的标准重组方法被工程化为含有人类FcγRIIB。在特定实施方案，本发明的抗-FcγRIIB抗体在基于细胞的β-己糖胺酶(颗粒中含有的酶)释放测定中被表征其调节IgE介导的响应的能力。β-己糖胺酶从肥大细胞和嗜碱白细胞释放是急性变应性和炎性情况的主要事件(Aketani等人(2001)“Correlation Between Cytosolic Calcium Concentration AndDegranulation In RBL-2H3 Cells In The Presence Of Various ConcentrationsOf Antigen-Specific IgEs(RBL-2H3细胞中在不同浓度的抗原-特异性IgE存在下细胞溶质钙浓度与脱粒之间的相关性)”Immunol.Lett.75：185-189；Aketani等人(2000)“A Screening Method For Antigen-Specific IgE UsingMast Cells Based On Intracellular Calcium Signaling(使用肥大细胞基于细胞内钙信号传导对抗原-特异性IgE的筛选方法)”Anal.Chem.72：2653-2658)。可测定包括但不限于5-羟色胺和组胺的其他炎症介质的释放以根据本发明的方法测量IgE介导的响应。尽管不希望受特定作用机制的限制，从肥大细胞和嗜碱白细胞释放颗粒诸如含有β-己糖胺酶的颗粒是细胞内钙浓度依赖性过程，其由FcγRI与多价抗原交联而起始。
研究人类肥大细胞的能力已经受到不存在合适的长期人类肥大细胞培养物的限制。最近从肥大细胞肉瘤/白血病患者的骨髓吸出物建立了两种新型干细胞因子依赖性人类肥大细胞系，称为LAD 1和LAD2(Kirshenbaum等人(2003)“Characterization Of Novel Stem Cell FactorResponsive Human Mast Cell Lines LAD1 And 2 Established From A PatientWith Mast Cell Sarcoma/Leukemia；Activation Following Aggregation Of FcRIOr FcγRI(表征从肥大细胞肉瘤/白血病患者建立的新型干细胞因子响应性人类肥大细胞系LAD 1和2；聚集FcRI或FcγRI后活化)”Leukemiaresearch，27：677-82，其通过引用全文并入本文。)。这两种细胞系都被描述为表达FcεRI和多种人类肥大细胞标记物。LAD 1和2细胞可用于评价本发明的抗体对IgE介导的响应的效应。在特定实施方案，基于细胞的β-己糖胺酶释放测定诸如上述测定可用于LAD细胞以确定本发明的抗-FcγRIIB抗体对IgE-介导的响应的任何调节。在示例性测定中，人类肥大细胞如，LAD1被嵌合人类IgE抗-硝基苯酚(NP)引发，并用多价抗原BSA-NP攻击，通过测量上清液中释放的β-己糖胺酶监控细胞脱粒(Kirshenbaum等人(2003)“Characterization Of Novel Stem Cell FactorResponsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A PatientWith Mast Cell Sarcoma/Leukemia；Activation Following Aggregation Of FcRIOr FcγRI(表征从肥大细胞肉瘤/白血病患者建立的新型干细胞因子响应性人类肥大细胞系LAD 1和2；聚集FcRI或FcγRI后活化)”Leukemiaresearch，27：677-82，其通过引用全文并入本文。)。
在一些实施方案，如果人类肥大细胞具有低表达的内源FcγRIIB，如使用本领域已知的标准方法如FACS染色确定的，可能难以监控和/或检测本发明的抗-FcγRIIB双抗体介导的抑制性途径的活化的差异。因此本发明涵盖替代方法，藉以FcγRIIB表达可使用细胞因子和特定生长条件而被上调。已描述FcγRIIB在人类单核细胞细胞系如THP1和U937(Tridandapani等人(2002)“Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIBIn Human Monocytic Cells(人类单核细胞中FcγRIIB的调节的表达和抑制性功能)”J.Biol.Chem.，277(7)：5082-5089)和原代人类单核细胞(Pricop等人(2001)“Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc GammaReceptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines (Th1和Th2细胞因子对人类单核细胞上刺激性和抑制性Fcγ受体的差异性调节)”J.ofImmunol，166：531-537)中被IL4高度上调。已经描述以联丁酰基环AMP分化U937细胞增加FcγRII的表达(Cameron等人(2002)“Differentiation OfThe Human Monocyte Cell Line，U937，With Dibutyryl CyclicAMP Induces TheExpression Of The Inhibitory Fc Receptor，FcgammaRIIB(以联丁酰基环AMP分化人类单核细胞细胞系U937诱导抑制性Fc受体FcγRIIB的表达)”Immunology Letters 83，171-179)。因此用于本发明方法的人类肥大细胞中的内源FcγRIIB表达可使用细胞因子如IL-4、IL-13上调以增强检测敏感性。
还可测定抗-FcγRIIB双抗体对B-细胞受体(BCR)-介导的信号传导的抑制。BCR-介导的信号传导可包括至少一种或多种下游生物学响应，诸如活化并增殖B细胞、抗体产生等等。FcγRIIB与BCR共聚集导致抑制细胞周期进程和细胞存活。进一步地，FcγRIIB与BCR共聚集导致抑制BCR-介导的信号传导。
具体地，BCR-介导的信号传导包括以下的至少一种或多种：调节下游信号传导分子(如，FcγRIIB的磷酸化状态、SHIP募集、Btk和/或PLCγ的定位、MAP激酶活性、募集Akt(抗-凋亡信号)、钙动员、细胞周期进程和细胞增殖。
尽管FcγRIIB-介导的抑制BCR信号传导的许多效应物功能是经SHIP介导的，最近已证实，脂多糖(LPS)-活化的来自SHIP缺陷型小鼠的B细胞展示显著的FcγRIIB-介导的抑制钙动员、Ins(1，4，5)P3产生和Erk以及Akt磷酸化(Brauweiler等人(2001)“Partially Distinct Molecular MechanismsMediate Inhibitory FcgammaRIIB Signaling In Resting And Activated B Cells(在静止和活化的B细胞中部分地不同的分子机制介导抑制性FcγRIIB信号传导)”Journal of Immunology，167(1)：204-211)。因此，来自SHIP缺陷型小鼠的活体外B细胞可被用于表征本发明的抗体。一种用于确定本发明抗体的FcγRIIB-介导的抑制BCR信号传导的示例性测定可包括以下：从SHIP缺陷型小鼠分离脾B细胞，以脂多糖活化所述细胞，并用F(ab’)2抗-IgM刺激所述细胞以聚集BCR或以抗-IgM刺激以共聚集BCR与FcγRIIB。已被完整抗-IgM刺激以共聚集BCR与FcγRIIB的细胞可进一步用本发明的抗体预培养。细胞的FcγRIIB-依赖性活性可由本领域已知的标准技术测量。比较已经与抗体一起预培养的细胞与未预培养的细胞的FcγRIIB-依赖性活性水平，比较水平将表示抗体对FcγRIIB-依赖性活性的调节。
测量FcγRIIB-依赖性活性可包括，例如由流式细胞术测量细胞内钙动员，测量Akt和/或Erk的磷酸化，测量BCR-介导的PI(3，4，5)P3累积，或测量FcγRIIB-介导的B细胞增殖。
测定可用于例如鉴定用于本发明的双抗体或抗-FcγRIIB抗体，其通过封闭对FcγRIIB受体的配体(IgG)结合位点而调节FcγRIIB-介导的抑制BCR信号传导并通过阻止FcγRIIB与BCR共聚集而拮抗FcγRIIB-介导的抑制BCR信号传导。测定还可用于鉴定增强FcγRIIB与BCR共聚集并激动FcγRIIB-介导的BCR信号传导抑制的抗体。
还可测定抗-FcγRIIB抗体在人类单核细胞/巨噬细胞中FcγRII-介导的信号传导。FcγRIIB与带有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的受体共聚集作用以下调FcγR-介导的吞噬作用，使用SHIP作为其效应物(Tridandapani等人(2002)“Regulated Expression And Inhibitory Function OfFcgamma RIIB In Human Monocytic Cells(人类单核细胞中FcγRIIB的调节的表达和抑制性功能)”J.Biol.Chem.，277(7)：5082-5089)。FcγRIIA与FcγRIIB共聚集造成FcγRIIB的ITIM基序上的酪氨酸残基快速磷酸化，导致SHIP磷酸化增强，SHIP与Shc缔合，和具有分子量120和60-65kDa的蛋白磷酸化。此外，FcγRIIA与FcγRIIB共聚集造成Akt磷酸化下调，Akt是牵涉在细胞调节中并作用以抑制凋亡的丝氨酸-苏氨酸激酶。
还可测定抗-FcγRIIB双抗体在人类单核细胞/巨噬细胞中对FcγR-介导的吞噬作用的抑制。例如，来自人类单核细胞系THP-1的细胞可被针对FcγRII的小鼠单克隆抗体IV.3和山羊抗-小鼠抗体的Fab片段刺激(以仅聚集FcγRIIA)，或被完全IV.3小鼠单克隆抗体和山羊抗-小鼠抗体刺激(以共聚集FcγRIIA与FcγRIIB)。该系统中，通过加入本发明的分子到刺激后的细胞可测定下游信号传导分子的调节，诸如FcγRIIB的酪氨酸磷酸化、SHIP磷酸化、SHIP与Shc缔合、Akt磷酸化、和具有分子量120和60-65kDa的蛋白磷酸化。此外，单核细胞细胞系的FcγRIIB-依赖性吞噬效力可在本发明的抗体存在和不存在下直接测量。
用于确定本发明的抗体在人类单核细胞/巨噬细胞中对FcγR-介导的吞噬作用的抑制的另一种示例性测定可包括以下：以IV.3小鼠抗-FcγRII抗体与山羊抗-小鼠抗体的Fab刺激THP-1细胞(以仅聚集FcγRIIA并引发FcγRIIA-介导的信号传导)；或以小鼠抗-FcγRII抗体和山羊抗-小鼠抗体刺激THP-1细胞(以共聚集FcγRIIA与FcγRIIB并抑制FcγRIIA-介导的信号传导)。已被小鼠抗-FcγRII抗体和山羊抗-小鼠抗体刺激的细胞可进一步与本发明的分子预培养。测量已用本发明的分子预培养的刺激后的细胞和未用本发明的抗体预培养的细胞的FcγRIIA-依赖性活性并比较这些细胞FcγRIIA-依赖性活性的水平将指示本发明的抗体对FcγRIIA-依赖性活性的调节。
上述示例性测定可例如用于鉴定封闭配体(IgG)对FcγRIIB受体的结合并通过阻止FcγRIIB与FcγRIIA共聚集而拮抗FcγRIIB-介导的FcγRIIA信号传导抑制的结合结构域。该测定同样地鉴定增强FcγRIIB与FcγRIIA共聚集并激动FcγRIIB-介导的FcγRIIA信号传导抑制的结合结构域。
可测定包含在I抗体中的目标FcγRIIB结合结构域，通过以前述方法测量THP-1细胞吞噬荧光素化的IgG-调理的绵羊红细胞(SRBC)的能力(Tridandapani等人(2000)“The Adapter Protein LAT Enhances FcgammaReceptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells(在髓样细胞中适体蛋白LAT增强Fcγ受体-介导的信号转导)”J.Biol.Chem.275：20480-7)。例如，用于测量吞噬作用的示例性测定包括：以本发明的抗体或不结合于FcγRII的对照抗体处理THP-1细胞，比较所述细胞的活性水平，其中细胞活性(如，玫瑰花结活性(结合IgG-包被的SRBC的THP-1细胞数)、粘附活性(结合THP-1细胞的SRBC总数)、和吞噬率)的差异将指示本发明的抗体对FcγRIIA-依赖性活性的调节。例如，该测定可用于鉴定封闭FcγRIIB受体的配体结合并拮抗FcγRIIB-介导的抑制吞噬作用的抗体。该测定还可鉴定增强FcγRIIB-介导的抑制FcγRIIA信号传导的抗体。
在优选实施方案，人类单核细胞/巨噬细胞中结合结构域以至少一种或多种以下方式调节FcγRIIB-依赖性活性：调节下游信号传导分子(如，调节FcγRIIB磷酸化状态，调节SHIP磷酸化，调节SHIP与Shc缔合，调节Akt磷酸化，调节大约120和60-65kDa的另外蛋白的磷酸化)并调节吞噬作用。
5.1.2 CD16A结合结构域
以下部分讨论可用作产生共价双抗体的轻链和重链可变区的来源的CD16A结合蛋白。本发明中CD16A结合蛋白包括包含抗-CD16A抗体的VL和VH结构域的分子，该VH和VL结构域用于产生本发明的双抗体。
多种CD16A结合蛋白可用于本发明。合适的CD16A结合蛋白包括人类或人源化单克隆抗体以及CD16A结合抗体片段(如，scFv或单链抗体、Fab片段、微型抗体)和另一种经由与轻链可变区结构域、重链可变区结构域、或两者相互作用结合于CD16A的抗体-样蛋白。
在一些实施方案，根据本发明使用的CD16A结合蛋白包括VL和/或VH结构域，其具有序列来源于非-人类抗-CD16A抗体诸如小鼠抗-CD16A抗体的一个或多个CDR和来源于一种或多种人类免疫球蛋白的框架序列的一个或多个框架区。大量可从其获得CDR和其他序列的非-人类抗-CD16A单克隆抗体是已知的(参见例如，Tamm等人(1996)“The BindingEpitopes Of Human CD16(Fc gamma RIII)Monoclonal Antibodies.Implications For Ligand Binding(人类CD16(FcγRIII)单克隆抗体的结合表位。牵涉配体结合)”J.Imm.157：1576-81；Fleit等人(1989)p.159；LEUKOCYTE TYPING II：HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETICCELLS(白细胞分型II：人类骨髓和造血细胞)，Reinherz等人编辑.NewYork：Springer-Verlag；(1986)；LEUCOCYTE TYPING III：WHITE CELLDIFFERENTIATION ANTIGENS(白细胞分型III：白细胞分化抗原)McMichael A J编辑，Oxford：Oxford University Press，1986)；LEUKOCYTETYPING IV：WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS(白细胞分型IV：白细胞分化抗原)，Kapp等人编辑.Oxford Univ.Press，Oxford；LEUKOCYTE TYPING V：WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS(白细胞分型V：白细胞分化抗原)，Schlossman等人编辑.Oxford Univ.Press，Oxford；LEUKOCYTE TYPING VI：WHITE CELL DIFFERENTIATIONANTIGENS(白细胞分型VI：白细胞分化抗原)，Kishimoto编辑.Taylor &Francis。此外，如实施例所示，识别细胞上表达的人类CD16A的新CD16A结合蛋白可使用产生和选择单克隆抗体或相关结合蛋白的公知方法(如，杂交瘤技术、噬菌体展示和类似技术)获得。参见例如，O′Connell等人(2002)“Phage Versus Phagemid Libraries For Generation Of Human MonoclonalAntibodies(噬菌体相对于噬菌粒文库用于产生人类单克隆抗体)”J.Mol.Biol.321：49-56；Hoogenboom等人(2000)“Natural And Designer BindingSites Made By Phage Display Technology(天然结合位点和由噬菌体展示技术设计的结合位点)”Imm.Today 21：371078；Rrebs等人(2001)“High-Throughput Generation And Engineering Of Recombinant HumanAntibodies(高通量产生和工程化重组人类抗体)”J.Imm.Methods254：67-84；和本文引用的其他参考文献。使用本领域已知的抗体人源化技术，来自非-人类物种的单克隆抗体可被嵌合化或人源化。
可选地，针对CD16A的完全人类抗体可如下产生：使用具有人类免疫系统元件的转基因动物(参见例如，美国专利第5,569,825和5,545,806号)，使用人类外周血细胞(Casali等人(1986)“Human Monoclonals FromAntigen-Specific Seletion Of B Lymphocytes And Transformation By EBV(从抗原-特异性选择B淋巴细胞并以EBV转化的人类单克隆)”Science234：476-479)，通过根据Huse等人(1989)“Generation Of A LargeCombinatorial Library Of The Immunoglobulin Repertoire In Phage Lambda(在噬菌体λ中产生免疫球蛋白整套的大的组合文库)”Science246：1275-1281列出的一般方案从人类B细胞筛选DNA文库，和通过其他方法。
在优选实施方案，结合供者是来自3G8抗体或其人源化形式，如，诸如美国专利申请公布2004/0010124公开的，其以引用的方式全文并入本文。为了某些目的，预期使用结合CD16A受体被3G8结合的相同表位、或至少足以靠近此表位以封闭3G8结合的CD16A结合蛋白可能是有益的。鉴定具有期望结合性质的结合蛋白的表位作图和竞争结合实验方法是实验免疫学领域技术人员已知的。参见例如，以上引用的Harlow和Lane；
Figure GPA00001026478600671
等人(1983)“Distinction Of Epitopes By Monoclonal Antibodies(由单克隆抗体区分表位)”Methods in Enzymology 92：242-253；Kirkland等人(1986)“Analys Of The Fine Specificity And Cross-Reactivity Of MonoclonalAnti-Lipid A Antibodies(分析单克隆抗-脂质A抗体的精细特异性和交叉反应性)”J.Immunol.137：3614-3619；Morel等人(1988)“MonoclonalAntibodies To Bovine Serum Albumin：Affinity And Specificity Determinations(针对牛血清白蛋白的单克隆抗体：确定亲和性和特异性)”Molec.Immunol.25：7-15；Cheung等人(1990)“Epitope-Specific Antibody Response To TheSurface Antigen Of Duck Hepatitis B Virus In Infected Ducks(表位-特异性抗体对受感染的鸭中鸭乙型肝炎病毒表面抗原的响应)”Virology176：546-552；和Moldenhauer等人(1990)“Identity Of HML-1 Antigen OnIntestinal Intraepithelial T Cells And Of B-ly7 Antigen On Hairy CellLeukaemia (肠上皮内T细胞上HML-1抗原和毛细胞性白血病上B-ly7抗原的鉴定)”Scand.J.Immunol.32：77-82。例如，可能确定两种抗体是否结合于相同位点，通过使用抗体之一来将抗原捕获到ELISA板上，并随后测量第二抗体结合于捕获的抗原的能力。表位比较还可实现，通过直接或间接地以酶、放射性核素或荧光团标记第一抗体，并测量未标记的第二抗体抑制第一抗体对细胞上、溶液中或固相上抗原结合的能力。
还可能测量抗体封闭CD16A受体对ELISA板上形成的免疫复合物结合的能力。这种免疫复合物通过首先以抗原诸如荧光素包被板，然后向板施加特异性抗-荧光素抗体而形成。随后该免疫复合物作为可溶性Fc受体诸如sFcRIIIa的配体。可选地，可形成可溶性免疫复合物，并直接或间接地以酶、放射性核素或荧光团标记。随后可测量抗体抑制这些标记的免疫复合物对细胞上、溶液中或固相上Fc受体的结合的能力。
本发明的CD16A结合蛋白可包括或可不包括人类免疫球蛋白Fc区。Fc区不存在于例如scFv结合蛋白中。Fc区存在于例如人类或人源化四聚单克隆IgG抗体中。如上所述，在本发明一些实施方案，CD16A结合蛋白包括具有改变的效应物功能，如，与未改变的Fc区(如，天然存在的IgG1、蛋白的Fc)相比对效应物配体诸如Fc受体或补体的C1成分亲和性减少的Fc区。在一个实施方案，该Fc区在对应于位置297的Fc区氨基酸未糖基化。这种抗体缺少Fc效应物功能。
因此，由于结合蛋白中不存在Fc结构域，CD16A结合蛋白可能不展示Fc-介导的结合于效应物配体诸如Fc受体或补体的C1成分，而在其他情形，缺少结合或效应物功能是由于抗体恒定区中的改变。
5.1.2.1包含类似于mAb 3G8 CDR序列的CDR序列的CD16A结合蛋白。
可用于实践本发明的CD16A结合蛋白包括包含来源于(即，具有相同或类似序列)小鼠单克隆抗体3G8的CDR的CDR序列的蛋白。编码小鼠3G8单克隆抗体的重链和轻链可变区、包括CDR编码序列的互补cDNA如所述地克隆并测序。3G8的核酸和蛋白序列提供如下。使用小鼠可变区和CDR序列，产生大量包含来源于3G8 CDR的互补决定区的嵌合和人源化单克隆抗体并分析其性质。为了鉴定以高亲和性结合CD16A并具有其他期望性质的人源化抗体，产生包含具有来源于3G8的CDR的VH区的抗体重链并与包含具有来源于3G8的CDR的VL区的抗体轻链组合(通过共表达)以产生用于分析的四聚抗体。如下述地确定所得四聚抗体的性质。如下述地，包含3G8 CDR的CD16A结合蛋白，诸如本文所述的人源化抗体蛋白可根据本发明使用。
5.1.2.1.1 VH区
一方面，本发明的CD16A结合蛋白可包括重链可变结构域，其中至少一个CDR(通常是三个CDR)具有小鼠单克隆抗体3G8重链的CDR(更通常是所有三个CDR)的序列，且结合蛋白的其余部分基本上是人类的(来源于且基本上类似于人类抗体的重链可变区)。
一方面，本发明提供包含以基本上人类框架来源于3G8抗体的CDR的人源化3G8抗体或抗体片段，但其中重链可变结构域的至少一个CDR的序列不同于相应的小鼠抗体3G8重链CDR。例如，在一个实施方案，CDR至少通过具有本领域已知的显示影响3G8对CD16A结合的一个或多个CDR取代而不同于3G8 CDR序列，所述取代是本领域已知的或公开在表3和4A-H。合适的CD16结合蛋白可包括0、1、2、3或4或更多的这些取代(通常具有这些取代的1到4个)，且任选地也可具有另外的取代。
表3.VH结构域取代
  No.   Kabat位置   区   取代
  1   2   FR1   Ile
  2   5   FR1   Lys
  3   10   FR1   Thr
  4   30   FR1   Arg
  5   34   CDR1   Val
  6   50   CDR2   Lcu
  7   52   CDR2   Phe或Tyr或Asp
  8   54   CDR2   Asn
  9   60   CDR2   Ser
  10   62   CDR2   Ser
  11   70   FR3   Thr
  12   94   FR3   Gln或Lys或Ala或His
  13   99   CDR3   Tyr
  14   101   CDR3   Asp
表4A.来源于3G8 VH的VH序列＊
  FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  3G8VH   A   A   A   A   A   A   A
  Ch3G8VH   A   A   A   A   A   A   B
  FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  HxC   B   A   B   A   A   A   B
  CxH   A   A   A   A   B   A   B
  Hu3G8VH-1   B   A   B   A   B   A   B
  Hu3G8VH-2   C   A   B   A   B   A   B
  Hu3G8VH-3   D   A   B   A   B   A   B
  Hu3G8VH-4   B   A   B   A   C   B   B
  Hu3G8VH-5   B   A   B   A   C   A   B
  Hu3G8VH-6   B   B   B   A   B   B   B
  Hu3G8VH-7   B   B   B   A   B   A   B
  Hu3G8VH-8   B   A   B   A   B   C   B
  Hu3G8VH-9   B   A   B   B   B   B   B
  Hu3G8VH-10   B   A   B   A   B   B   B
  Hu3G8VH-11   B   A   B   B   B   A   B
  Hu3G8VH-12   B   A   B   C   B   A   B
  Hu3G8VH-13   B   A   B   D   B   A   B
  Hu3G8VH-14   B   A   B   E   B   A   B
  Hu3G8VH-15   B   A   B   A   D   A   B
  FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  Hu3G8VH-16   B   A   B   A   E   A   B
Hu3G8VH-17   A   B   A   F   A   B
  Hu3G8VH-18   B   A   B   A   G   A   B
  Hu3G8VH-19   B   A   B   A   C   C   B
  FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  Hu3G8VH-20   B   B   B   C   B   A   B
  Hu3G8VH-21   B   A   B   A   D   B   B
  Hu3G8VH-22   B   B   B   C   B   C   B
  Hu3G8VH-23   B   B   B   C   E   C   B
  Hu3G8VH-24   B   B   B   C   F   C   B
  Hu3G8VH-25   B   B   B   C   G   C   B
  Hu3G8VH-26   B   B   B   C   C   C   B
  Hu3G8VH-27   B   B   B   C   E   D   B
  FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  Hu3G8VH-28   B   B   B   C   F   D   B
  Hu3G8VH-29   B   B   B   C   G   D   B
  Hu3G8VH-30   B   B   B   C   C   D   B
  Hu3G8VH-31   E   B   B   C   B   A   B
  Hu3G8VH-32   E   B   B   H   B   A   B
  Hu3G8VH-33   E   B   B   H   B   A   B
  Hu3G8VH-34   E   B   B   C   B   C   B
  Hu3G8VH-35   E   B   B   C   C   C   B
  Hu3G8VH-36   E   B   B   H   C   D   B
  Hu3G8VH-37   E   B   B   H   E   C   B
  Hu3G8VH-38   E   B   B   F   B   A   B
  Hu3G8VH-39   E   B   B   I   B   A   B
  Hu3G8VH-40   E   B   B   G   B   A   B
  FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  Hu3G8VH-41   E   B   B   J   B   A   B
  Hu3G8VH-42   E   B   B   C   H   A   B
  Hu3G8VH   E   B   B   C   H   C   B
  FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  4
  Hu3G8VH-44   E   B   B   C   I   D   B
  Hu3G8VH-45   E   B   B   C   J   D   B
*表4A中的字母是指表4B-H中的序列。
表4B FR1
  A   B   C   D   E   残基
  Q   Q   Q   Q   Q   1
  V   V   V   V   I   2
  T   T   T   T   T   3
  L   L   L   L   L   4
  K   R   K   R   K   5
  E   E   E   E   E   6
  S   S   S   S   S   7
  A   B   C   D   E   残基
  G   G   G   G   G   8
  P   P   P   P   P   9
  G   A   A   A   T   10
  I   L   L   L   L   11
  L   V   V   V   V   12
  Q   K   K   K   K   13
  P   P   P   P   P   14
  S   T   T   T   T   15
  Q   Q   Q   Q   Q   16
  T   T   T   T   T   17
  L   L   L   L   L   18
  S   T   T   T   T   19
  L   L   L   L   L   20
  T   T   T   T   T   21
  C   C   C   C   C   22
  S   T   T   T   T   23
  F   F   F   F   F   24
  S   S   S   S   S   25
  G   G   G   G   G   26
  F   F   F   F   F   27
  S   S   S   S   S   28
  L   L   L   L   L   29
  A   B   C   D   E   残基
  R   S   S   R   S   30
  30   31   32   33   34   Se ID No
表4C CDR1
  A   B   残基
  T   T   31
  S   S   32
  G   G   33
  M   V   34
  G   G   35
  V   V   35A
  G   G   35B
  35   36   Seq ID No
表4D FR2
  A   B   残基
  W   W   36
  I   I   37
  R   R   38
  Q   Q   39
  P   P   40
  A   B   残基
  S   P   41
  G   G   42
  K   K   43
  G   A   44
  L   L   45
  E   E   46
  W   W   47
  L   L   48
  A   A   49
  37   38   Seq ID No.
表4E CDR2
  A   B   C   D   E   F   G   H   I   J   残基
  H   H   H   H   H   L   H   L   H   L   50
  I   I   I   1   I   I   I   I   I   I   51
  W   Y   W   Y   W   D   F   W   D   W   52
  W   W   W   W   W   W   W   W   W   W   53
  D   N   D   D   N   D   D   D   D   N   54
  D   D   D   D   D   D   D   D   D   D   55
  D   D   D   D   D   D   D   D   D   D   56
  A   B   C   D   E   F   G   H   I   J   残基
  K   K   K   K   K   K   K   K   K   K   57
  R   R   R   R   R   R   R   R   R   R   58
  Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   59
  N   N   S   N   N   S   S   S   S   S   60
  P   P   P   P   P   P   P   P   P   P   61
  A   A   S   A   A   S   S   S   S   S   62
  L   L   L   L   L   L   L   L   L   L   63
  K   K   K   K   K   K   K   K   K   K   64
  S   S   S   S   S   S   S   S   S   S   65
  39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   Seq ID No
表4F FR3
  A   B   C   D   E   F   G   H   I   J   残基
  R   R   R   R   R   R   R   R   R   R   66
  L   L   L   L   L   L   L   L   L   L   67
  T   T   T   T   T   T   T   T   T   T   68
  I   I   I   I   I   I   I   I   I   I   69
  S   S   S   S   S   S   S   T   T   T   70
  K   K   K   K   K   K   K   K   K   K   71
  D   D   D   D   D   D   D   D   D   D   72
  A   B   C   D   E   F   G   H   I   J   残基
  T   T   T   T   T   T   T   T   T   T   73
  S   S   S   S   S   S   S   S   S   S   74
  S   K   K   K   K   K   K   K   K   K   75
  N   N   N   N   N   N   N   N   N   N   76.
  Q   Q   Q   Q   Q   Q   Q   Q   Q   Q   77
  V   V   V   V   V   V   V   V   V   V   78
  F   V   V   V   V   V   V   V   V   V   79
  L   L   L   L   L   L   L   L   L   L   80
  K   T   T   T   T   T   T   T   T   T   81
  I   M   M   M   M   M   M   M   M   M   82
  A   T   T   T   T   T   T   T   T   T   82A
  S   N   N   N   N   N   N   N   N   N   82B
  V   M   M   M   M   M   M   M   M   M   82C
  D   D   D   D   D   D   D   D   D   D   83
  T   P   P   P   P   P   P   P   P   P   84
  A   V   V   V   V   V   V   V   V   V   85
  D   D   D   D   D   D   D   D   D   D   86
  T   T   T   T   T   T   T   T   T   T   87
  A   A   A   A   A   A   A   A   A   A   88
  T   T   T   T   T   T   T   T   T   T   89
  A   B   C   D   E   F   G   H   I   J   残基
  Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   90
  Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   Y   91
  C   C   C   C   C   C   C   C   C   C   92
  A   A   A   A   A   A   A   A   A   A   93
  Q   R   Q   T   K   A   H   R   H   Q   94
  49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   Scq IDNo
表4G
CDR3
  A   B   C   D   残基
  I   I   I   I   95
  N   N   N   N   96
  P   P   P   P   97
  A   A   A   A   98
  W   W   Y   Y   99
  F   F   F   F   100
  A   D   A   D   101
  Y   Y   Y   Y   102
  59   60   61   62   Seq ID No
表4H
FR4
  A   B   残基
  W   W   103
  G   G   104
  Q   Q   105
  G   G   106
  T   T   107
  L   L   108
  V   V   109
  T   T   110
  V   V   111
  S   S   112
  A   S   113
  63   64   Seq ID No
在一个实施方案，CD16A结合蛋白可包括与Hu3G8VH-1构建体的VH结构域相同或类似的重链可变结构域序列，后者的序列提供在SEQ IDNO：70。例如，本发明提供一种CD16A结合蛋白，包含的VH结构域具有(1)由表1所列的0、一个或多于一个CDR取代而不同于Hu3G8VH-1的VH结构域(SEQ ID NO：70)；(2)由表1所列的0、一个或多于一个框架取代而不同于Hu3G8VH-1的VH结构域和(3)在剩余位置与Hu3G8VH-1VH序列至少约80％相同、通常至少约90％和有时至少约95％相同、或甚至至少约98％相同的序列。
本发明的CD16结合蛋白的示例性VH结构域具有3G8VH、Hu3G8VH-5和Hu3G8VH-22的序列(分别是SEQ ID NO：81、SEQ IDNO：71和SEQ ID NO：72)。编码3G8VH和Hu3G8VH-5的序列(分别是SEQID NO：81和SEQ ID NO：71)的示例性核苷酸序列分别提供在SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83。
VH结构域可具有由至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个表3所示的取代而不同于Hu3G8VH-1(SEQ ID NO：70)的序列。相信这些取代导致对CD16A的亲和性增加和/或减少CD16A结合蛋白当施用于人类时的免疫原性。在某些实施方案，在剩余位置与Hu3G8VH-1VH结构域序列同一性的程度是至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％。
为了阐释而不是限制，大量CD16A构建蛋白VH结构域的序列显示在表4。包含这些序列融合于人类Cγ1恒定区的重链与hu3G8VL-1轻链(下述)共表达以形成四聚抗体，测量抗体对CD16A的结合以评价与hu3G8VH-1VH结构域相比氨基酸取代的效应。其中VH结构域具有hu3G8VH-1、2、3、4、5、8、12、14、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、42、43、44和45的序列的构建体显示高亲和性结合，而hu3G8VH-6和-40VH结构域显示中级结合。认为包含hu3G8VH-5和hu3G8VH-22的VH结构域(分别是SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72)的CD16A结合蛋白具有特别有利的结合性质。
5.1.2.2 VL区
进行类似研究以鉴定具有有利的结合性质的轻链可变结构域序列。一方面，本发明提供包含轻链可变结构域的CD16A结合蛋白，其中至少一个CDR(通常是三个CDR)具有小鼠单克隆抗体3G8轻链的CDR(更通常是所有三个CDR)的序列，且结合蛋白的其余部分基本上是人类的(来源于且基本上类似于人类抗体的轻链可变区)。
一方面，本发明提供包含以基本上人类框架来源于3G8抗体的CDR的人源化3G8抗体的片段，但其中轻链可变结构域的至少一个CDR的序列不同于小鼠抗体3G8轻链CDR。在一个实施方案，CDR至少通过具有CDR中的一个或多个氨基酸取代而不同于3G8序列，所述取代诸如表2中所示的一个或多个取代(如，CDR1中位置24的精氨酸；CDR1中位置25的丝氨酸；CDR1中位置32的酪氨酸；CDR1中位置33的亮氨酸；CDR2中位置50的天冬氨酸、色氨酸或丝氨酸；CDR2中位置53的丝氨酸；CDR2中位置55的丙氨酸或谷氨酸；CDR2中位置56的苏氨酸；CDR3中位置93的丝氨酸；和/或CDR3中位置94的苏氨酸)。在各实施方案，可变结构域可具有0、1、2、3、4或5或更多的这些取代(通常具有这些取代的1到4个)，且任选地也可具有另外的取代。
在一个实施方案，合适的CD16A结合蛋白可包括与Hu3G8VL-1构建体的VL结构域(SEQ ID NO：73)相同或类似的轻链可变结构域序列，后者的序列提供在表6。例如，本发明提供一种CD16A结合蛋白，包含的VL结构域具有(1)由表5所列的0、一个或多个CDR取代而不同于Hu3G8VL-1的VL结构域(SEQ ID NO：73)；(2)由表5所列的0、一个或多个框架取代而不同于Hu3G8VL-1的VL结构域；和(3)在剩余位置与Hu3G8VL-1 VL序列(SEQ ID NO：73)至少约80％相同、通常至少约90％和有时至少约95％相同、或甚至至少约98％相同的序列。
表5.3G8 VL结构域取代
  No.   Kabat位置   区   取代
  1   24   CDR1   Arg
  2   25   CDR1   Ser
  No.   Kabat位置   区   取代
  3   32   CDR1   Tyr
  4   33   CDR1   Leu
  5   50   CDR2   Asp或Trp或Ser
  6   51   CDR2   Ala
  7   53   CDR2   Ser
  8   55   CDR2   Ala或Gln
  9   56   CDR2   Thr
  10   93   CDR3   Ser
  11   94   CDR3   Thr
表6.来源于3G8 VL的VL序列＊
 FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  3G8VL  A   A   A   A   A   A   A
  Ch3G8VL  A   A   A   A   A   A   A
  Hu3G8VL-1  B   A   A   A   B   A   B
  Hu3G8VL-2  B   B   A   A   B   A   B
  Hu3G8VL-3  B   C   A   A   B   A   B
  Hu3G8VL-4  B   D   A   A   B   A   B
  Hu3G8VL-5  B   E   A   A   B   A   B
  Hu3G8VL-6  B   F   A   A   B   A   B
 FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  Hu3G8VL-7  B   G   A   A   B   A   B
  Hu3G8VL-8  B   A   A   B   B   A   B
  Hu3G8VL-9  B   A   A   C   B   A   B
  Hu3G8VL-10  B   A   A   D   B   A   B
  Hu3G8VL-11  B   A   A   E   B   A   B
  Hu3G8VL-12  B   A   A   F   B   A   B
  Hu3G8VL-13  B   A   A   G   B   A   B
  Hu3G8VL-14  B   A   A   A   B   B   B
  Hu3G8VL-15  B   A   A   A   B   C   B
  Hu3G8VL-16  B   A   A   A   B   D   B
  Hu3G8VL-17  B   A   A   A   B   E   B
  Hu3G8VL-18  B   B   A   D   B   A   B
  Hu3G8VL-19  B   B   A   D   B   D   B
  Hu3G8VL-20  B   B   A   D   B   E   B
  Hu3G8VL-21  B   C   A   D   B   A   B
  Hu3G8VL-22  B   C   A   D   B   D   B
  FR1   CDR1  FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  Hu3G8VL-23   B   C  A   D   B   E   B
  Hu3G8VL-24   B   D  A   D   B   A   B
  Hu3G8VL-25   B   D  A   D   B   D   B
 FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  Hu3G8VL-26   B   D  A   D   B   E   B
  Hu3G8VL-27   B   E  A   D   B   A   B
  Hu3G8VL-28   B   E  A   D   B   D   B
  Hu3G8VL-29   B   E  A   D   B   E   B
  Hu3G8VL-30   B   A  A   D   B   D   B
  Hu3G8VL-31   B   A  A   D   B   E   B
  Hu3G8VL-32   B   A  A   H   B   A   B
  Hu3G8VL-33   B   A  A   I   B   A   B
  Hu3G8VL-34   B   A  A   J   B   A   B
  Hu3G8VL-35   B   B  A   H   B   D   B
  Hu3G8VL-36   B   C  A   H   B   D   B
  Hu3G8VL-37   B   E  A   H   B   D   B
  Hu3G8VL-38   B   B  A   I   B   D   B
  Hu3G8VL-39   B   C  A   I   B   D   B
  Hu3G8VL-40   B   E  A   I   B   D   B
  Hu3G8VL-41   B   B  A   J   B   D   B
  Hu3G8VL-42   B   C  A   J   B   D   B
  Hu3G8VL-43   B   E  A   J   B   D   B
  Hu3G8VL-44   B   A  A   K   B   A   B
*表6A中的字母是指表6B-H中的序列。
表6B FR1
  A   B   残基
  D   D   1
  T   I   2
  V   V   3
  L   M   4
  T   T   5
  Q   Q   6
  S   S   7
  P   P   8
  A   D   9
  S   S   10
  L   L   11
  A   A   12
  V   V   13
  S   S   14
  L   L   15
  G   G   16
  Q   E   17
  R   R   18
  A   B   残基
  A   B   残基
  A   A   19
  T   T   20
  I   I   21
  S   N   22
  C   C   23
  65   66   Sea ID No
表6C CDR1
  A   B   C   D   E   F   G   残基
  K   R   K   K   K   K   K   24
  A   A   S   A   A   A   A   25
  S   S   S   S   S   S   S   26
  Q   Q   Q   Q   Q   Q   Q   27
  S   S   S   S   S   S   S   27A
  V   V   V   V   V   V   V   27B
  D   D   D   D   D   D   D   27C
  F   F   F   F   F   F   F   27D
  D   D   D   D   D   D   D   28
  G   G   G   G   G   G   G   29
  D   D   D   D   D   D   D   30
  A   B   C   D   E   F   G   残基
  S   S   S   S   S   S   S   31
  F   F   F   Y   F   F   Y   32
  M   M   M   M   L   M   L   33
  N   N   N   N   N   A   A   34
  67   68   69   70   71   72   73   Seq ID No
表6D FR2
  A   残基
  W   35
  Y   36
  Q   37
  Q   38
  K   39
  P   40
  G   41
  Q   42
  P   43
  P   44
  K   45
  L   46
  A   残基
  L   47
  I   48
  A   残基
  Y   49
  74   Seq ID No
表6E CDR2
  A   B   C   D   E   F   G   H   I   J   K   残基
  T   D   W   T   D   D   S   S   S   T   T   50
  T   A   A   T   A   A   A   T   T   T   T   51
  S   S   S   S   S   S   S   S   S   S   S   52
  N   N   N   N   N   N   N   N   N   N   S   53
  L   L   L   L   L   L   L   L   L   L   L   54
  E   E   E   E   E   A   Q   E   Q   Q   Q   55
  S   S   S   T   T   T   S   S   S   S   S   56
  75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   Seq IDNo
表6F FR3
  A   B   残基
  G   G   57
  I   V   58
  A   B   残基
  P   P   59
  A   D   60
  R   R   61
  F   F   62
  S   S   63
  A   G   64
  S   S   65
  G   G   66
  S   S   67
  G   G   68
  T   T   69
  D   D   70
  F   F   71
  T   T   72
  L   L   73
  N   T   74
  I   I   75
  H   S   76
  P   S   77
  V   L   78
  A   B   残基
  E   Q   79
  E   A   80
  E   E   81
  A   B   残基
  D   D   82
  T   V   83
  A   A   84
  T   V   85
  Y   Y   86
  Y   Y   87
  C   C   88
  86   87   Seq ID No
表6G CDR3
  A   B   C   D   E   残基
  Q   Q   Q   Q   Q   89
  Q   Q   Q   Q   Q   90
  S   S   S   S   S   91
  N   Y   Y   N   N   92
  A   B   C   D   E   残基
  E   S   E   S   E   93
  D   T   D   D   T   94
  P   P   P   P   P   95
  Y   Y   Y   Y   Y   96
  T   T   T   T   T   97
  88   89   90   91   92   Seq ID No
表6H FR4
  A   B   残基
  F   F   98
  G   G   99
  G   Q   100
  G   G   101
  T   T   102
  K   K   103
  L   L   104
  E   E   105
  I   I   106
  K   K   107
  93   94   Seq ID No
本发明的CD16结合蛋白的示例性VL结构域具有3G8VL、Hu3G8VL-1或Hu3G8VL-43的序列(分别是SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74)，如表5和表6所示。编码3G8VL(SEQ ID NO：84)和Hu3G8VL-1(SEQ ID NO：73)的示例性核苷酸序列分别提供在SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：86。
VL结构域可具有由零、一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个表2所示的取代而不同于Hu3G8VL-1(SEQ ID NO：73)的序列。相信这些取代导致对CD16A的亲和性增加和/或减少CD16A结合蛋白当施用于人类时的免疫原性。在某些实施方案，在剩余位置的序列同一性程度是至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％。
为了阐释而不是限制，大量CD16A构建蛋白VL结构域的序列显示在表6。包含这些序列融合于人类Cκ恒定区的轻链与Hu3G8VH重链(上述)共表达以形成四聚抗体，测量该抗体对CD16A的结合以评价与Hu3G8VL-1 VL结构域(SEQ ID NO：73)相比氨基酸取代的效应。其中VL结构域具有hu3G8VL-1、2、3、4、5、10、16、18、19、21、22、24、27、28、32、33、34、35、36、37和42的序列的构建体显示高亲和性结合，而hu3G8VL-15、17、20、23、25、26、29、30、31、38、39、40和41显示中级结合。认为包含hu3G8VL-1、hu3G8VL-22和hu3G8VL-43的VL结构域(分别是SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：74)的CD16A结合蛋白具有特别有利的结合性质。
5.1.2.2.1 VL和/或VH结构域的组合
如本领域已知和本文别处描述的，免疫球蛋白轻链和重链可在其中缔合以产生双抗体的条件下重组表达，或可体外如此组合。因此应理解，本文所述的3G8-衍生的VL-结构域可组合本文所述的3G8-衍生的VH-结构域以产生CD16A结合双抗体，且涵盖所有这种组合。
为了阐释而不是限制，可用的CD16A双抗体的实例是包含至少一个VH结构域和至少一个VL结构域的CD16A双抗体，其中VH结构域来自hu3G8VH-1、hu3G8VH-22或hu3G8VH-5(分别是SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：72和SEQ ID NO：71)，VL结构域来自hu3G8VL-1、hu3G8VL-22或hu3G8VL-43(分别是SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：43)。特别是，包括hu3G8VH-22(SEQ ID NO：22)与hu3G8VL-1、hu3G8VL-22或hu3G8VL-43(分别是SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：72和SEQ IDNO：74)、或hu3G8VH-5(SEQ ID NO：71)和hu3G8VL-1(SEQ ID NO：73)的人源化抗体具有有利的性质。
将由本领域技术人员理解的是，本文描述的VL和VH结构域的序列可由公知方法进一步修饰，诸如亲和力成熟(参见Schier等人(1996)“Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv ByMolecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In TheCenter Of The Antibody Binding Site(通过抗体结合位点中心中的互补决定区的分子进化分离皮摩尔亲和性抗-C-ErbB-2单链)”J.Mol.Biol.263：551-567；Daugherty等人(1998)“Antibody Affinity Maturation UsingBacterial Surface Display(使用细菌表面展示的抗体亲和力成熟)”ProteinEng.11：825-832；Boder等人(1997)“Yeast Surface Display For ScreeningCombinatorial Polypeptide Libraries(用于筛选组合多肽文库的酵母表面展示)”Nat.Biotechnol.15：553-557；Boder等人(2000)“Directed Evolution OfAntibody Fragments With Monovalent Femtomolar Antigen-Binding Affinity(定向进化具有单价的飞摩尔抗原-结合亲和性的抗体片段)”Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97：10701-10705；Hudson等人(2003)“EngineeredAntibodies(工程化的抗体)”Nature Medicine 9：129-39)。例如，可使用亲和力成熟技术修饰CD16A结合蛋白以鉴定对CD16A具有增加的亲和性和/或对CD16B具有减少的亲和性的蛋白。
一种示例性CD16结合蛋白是小鼠3G8抗体。包含人源化3G8的VH和VL结构域的氨基酸序列描述在图2、9、14，并列在SEQ ID NO：9、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ IDNO：73和SEQ ID NO：74。
5.2包含Fc区或其部分的双抗体
本发明涵盖包含Fc结构域或其部分(如，CH2或CH3结构域)的双抗体分子。在某些实施方案，Fc结构域或其部分包括IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的一个或多个恒定结构域(如，CH2或CH3)。在其他实施方案，本发明涵盖包含Fc结构域或其部分的分子，其中所述Fc结构域或其部分包括相对于相应的野生型Fc结构域或其部分的至少一个氨基酸修饰(如，取代)。变体Fc结构域是本领域公知的，主要用于改变包含所述变体Fc结构域的抗体的表型，如在本领域公知的任何结合活性或效应物功能测定如，ELISA、SPR分析或ADCC中测定的。这种变体Fc结构域或其部分通过赋予或修饰由包含Fc结构域(或其部分)的本发明的双抗体分子展示的效应物功能而在本发明中有用，如功能性地测定的，如，在NK依赖性或巨噬细胞依赖性测定中。鉴定为改变效应物功能的Fc结构域变体公开于国际申请WO04/063351、美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514、2004年11月10日提交的美国临时申请60/626,510、2004年12月15日提交的60/636,663、和2006年3月10日提交的60/781,564、2005年11月10日提交的美国专利申请11/271,140、2005年12月15日提交的11/305,787，这些是本发明人的同时申请，所有这些通过引用全文并入本文。
在其他实施方案，本发明涵盖使用本领域已知的任何Fc变体，诸如以下公开的：Duncan等人(1988)“Localization Of The Binding Site For TheHuman High-Affinity Fc Receptor On IgG(定位IgG上对人类高-亲和性Fc受体的结合位点)”Nature 332：563-564；Lund等人(1991)“Human FcGamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites OnHuman IgG(人类FcγRI和FcγRII与人类IgG上不同但重叠的位点相互作用)”J.Immunol.147：2657-2662；Lund等人(1992)“Multiple Binding SitesOn The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII(IgG的CH2结构域上对小鼠FcγRII的多个结合位点)”Mol.Immunol.29：53-59；Alegre等人(1994)“A Non-Activating″Humanized″Anti-CD3 Monoclonal AntibodyRetains Immunosuppressive Properties In Vivo(非-活化性“人源化”抗-CD3单克隆抗体在体内保持免疫抑制性质)”Transplantation 57：1537-1543；Hutchins等人(1995)“Improved Biodistribution，Tumor Targeting，AndReduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H(Campath-1H的γ4变体改善生物分布、肿瘤靶向和减少小鼠中的免疫原性)”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 92：11980-11984；Jefferis等人(1995)“Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors：The Role OfGlycosylation(人类IgG上对Fcγ受体的识别位点：糖基化的作用)”Immunol.Lett.44：111-117；Lund等人(1995)“Oligosaccharide-ProteinInteractions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors(IgG中寡糖-蛋白相互作用可调节Fcγ受体的识别)”FASEB J.9：115-119；Jefferis等人(1996)“Modulation Of Fc(Gamma)R And Human ComplementActivation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions(由IgG3-核寡糖相互作用调节Fc(γ)R与人类补体活化)”Immunol.Lett.54：101-104；Lund等人(1996)“Multiple Interactions Of Igg With Its Core Oligosaccharide CanModulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I AndInfluence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains(IgG与其核寡糖的多种相互作用可调节被补体和人类Fcγ受体I的识别并影响其寡糖链合成)”J.Immunol.157：4963-4969；Armour等人(1999)“Recombinant Human IgGMolecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte TriggeringActivities(缺少Fcγ受体I结合和单核细胞触发活性的重组人类IgG分子)”Eur.J.Immunol.29：2613-2624；Idusogie等人(2000)“Mapping Of The C1QBinding Site On Rituxan，A Chimeric Antibody With A Human IgG1 Gc(一种与人类IgG1 Fc的嵌合抗体Rituxan上C1Q结合位点的作图)”J.Immunol.164：4178-4184；Reddy等人(2000)“Elimination Of Fc Receptor-DependentEffector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4(消除修饰的IgG4单克隆抗体对人类CD4的Fc受体-依赖性效应物功能)”J.Immunol.164：1925-1933；Xu等人(2000)“In Vitro Characterization OfFive Humanized OKTS Effector Function Variant Antibodies(体外表征五种人源化OKTS效应物功能变体抗体)”Cell.Immunol.200：16-26；Idusogie等人(2001)“Engineered Antibodies With Increased Activity To RecruitComplement(具有增加的活性来募集补体的工程化的抗体)”J.Immunol.166：2571-2575；Shields等人(2001)“High Resolution Mapping Of TheBinding Site On Human IgGl For Fc gamma RI，Fc gamma RII，Fc gammaRIII，And FcRn And Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fcgamma R(人类IgG1上对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点的高分辨率作图并设计对FcγR的结合改进的IgG1变体)”J.Biol.Chem.276：6591-6604；Jefferis等人(2002)“Interaction Sites On Human IgG-Fc ForFcgammaR：Current Models(人类IgG-Fc上对FcγR的相互作用位点：最新模型)”Immunol.Lett.82：57-65；Presta等人(2002)“Engineering TherapeuticAntibodies For Improved Function(为了改善功能工程化治疗性抗体)”Biochem.Soc.Trans.30：487-490)；美国专利5,624,821；美国专利5,885,573；美国专利6,194,551；PCT WO 00/42072；PCT WO 99/58572；所有这些通过引用全文并入本文。
在某些实施方案，对Fc区氨基酸的所述一种或多种修饰减少Fc区的亲和性和亲和力以及本发明的双抗体分子对一种或多种FcγR受体亲和性和亲和力。在特定实施方案，本发明涵盖包含变体Fc区或其部分的双抗体，其中所述变体Fc区包括相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，该变体Fc区仅结合一个FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIIA。在另一特定实施方案，本发明涵盖包含变体Fc区或其部分的双抗体，其中所述变体Fc区包括相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，该变体Fc区仅结合一个FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIA。在另一特定实施方案，本发明涵盖包含变体Fc区或其部分的双抗体，其中所述变体Fc区包括相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，该变体Fc区仅结合一个FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIB。在某些实施方案，本发明涵盖包含变体Fc结构域的分子，其中所述变体赋予或介导相对于不包含Fc结构域或包含野生型Fc结构域的分子增加的ADCC活性和/或增加的对FcγRIIA(CD32A)结合，如使用本领域技术人员已知或本文所述的方法测量的。在替代实施方案，本发明涵盖包含变体Fc结构域的分子，其中所述变体赋予或介导相对于不包含Fc结构域或包含野生型Fc结构域的分子减少的ADCC活性(或其他效应物功能)和/或增加的对FcγRIIB(CD32B)结合，如使用本领域技术人员已知和本文所述的方法测量的。
本发明还涵盖包含来自两种或多种IgG同种型的结构域或区的Fc结构域的用途。如本领域已知的，Fc区的氨基酸修饰可深深地影响Fc-介导的效应物功能和/或结合活性。然而，当在选择的IgG同种型环境中实施时，功能性特征的这些改变可进一步被完善和/或操纵。类似地，同种型Fc的天然特征可被一种或多种氨基酸修饰操纵。由于铰链和/或Fc结构域氨基酸序列的差异，多种IgG同种型(即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)展示不同的物理性质和功能性性质，包括血清半衰期、补体固定、FcγR结合亲和性和效应物功能活性(如，ADCC、CDC)。在某些实施方案，氨基酸修饰和IgG Fc区基于其各自的、分别的结合和/或效应物功能活性独立地选择，以工程化具有期望性质的双抗体。在大多数实施方案，所述氨基酸修饰和IgG铰链/Fc区已经被分别测定结合和/或效应物功能活性，如本文所述的或本领域已知的在IgG1环境中。在某些实施方案，当在双抗体分子或其他含Fc的分子(如，免疫球蛋白)环境中分别测定FcγR结合或效应物功能时，所述氨基酸修饰和IgG铰链/Fc区展示类似功能，如，对FcγRIIA增加的亲和性。随后所述氨基酸修饰与选择的IgG Fc区的组合加和地或优选地协同地作用以相对于包含野生型Fc区的本发明的双抗体分子改变在本发明的双抗体分子中的所述功能。在其他实施方案，当在本文所述的或本领域已知的包含野生型Fc区的双抗体分子或其他含Fc的分子(如，免疫球蛋白)环境中分别测定FcγR结合和/或效应物功能时，所述氨基酸修饰和IgG Fc区展示相反功能，如，增加和减少分别对FcγRIIA的亲和性；随后所述“相反”氨基酸修饰与选择的IgG区的组合作用以选择性地缓和或减少本发明的双抗体中相对于不包含Fc区或包含相同同种型野生型Fc区的本发明的双抗体的特定功能。可选地，本发明涵盖包含本领域已知的氨基酸修饰与选择的IgG区的组合、展示新性质的变体Fc区，当所述修饰和/或区如本文所述的独立测定时，该性质是不可检测的。
多种IgG同种型和其结构域的功能性特征是本领域公知的。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的氨基酸序列列在图1A-1B。选择和/或组合来自特定IgG同种型的两个或多个结构域以用于本发明的方法可基于亲本同种型的任何已知参数，包括对FcγR的亲和性(表7；Flesch等人(2000)“FunctionsOf The Fc Receptors For Immunoglobulin G(免疫球蛋白G的Fc受体功能)”J.Clin.Lab.Anal.14：141-156；Chappel等人(1993)“Identification Of ASecondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered HumanIgG Antibody(鉴定遗传工程化的人类IgG抗体中第二FcγRI结合位点)”J.Biol.Chem.33：25124-25131；Chappel等人(1991)“Identification Of The FcGamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use OfRecombinant IgG1/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies(通过使用重组IgG1/IgG2杂合和点突变抗体鉴定人类IgG中Fcγ受体I类结合位点)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9036-9040，通过引用将它们每一个并入本文)。例如，使用来自展示有限结合或不结合于FcγRIIB的IgG同种型如，IgG2或IgG4的区或结构域，可特别用于当期望双抗体被工程化以使对活化性受体的结合最大和对抑制性受体的结合最小时。类似地，使用来自已知优先结合C1q或FcγRIIIAIgG同种型如，IgG3的Fc区或结构域(Bruggemann等人(1987)“Comparison Of The Effector Functions Of HumanImmunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies(使用匹配组的嵌合抗体比较人类免疫球蛋白的效应物功能)”J.Exp.Med.166：1351-1361)可联合本领域已知增强ADCC的Fc氨基酸修饰来工程化双抗体分子以使效应物功能活性如补体活化或ADCC最大化。
表7.IgG结合FcγR的一般特征，从Flesch和Neppert，1999，J.Clin.Lab.Anal.14：141-156修改
  受体   对IgG估计的亲和力(M-1)   相对亲和力
  FcγRI   108-109   IgG3＞IgG1＞＞IgG4不结合：IgG2
  FcγRIIA R131A   ＜107   IgG3＞IgG1不结合：IgG2，IgG4
  FcγRIIA H131A   ＜107   IgG3＞IgG1＞IgG2不结合：IgG4
  FcγRIIB A   ＜107   IgG3＞IgG1＞IgG4不结合：IgG2
  FcγRIII   ＜107   IgG3＝IgG1不结合：IgG2，IgG4
A仅结合复合的IgG
5.3分子轭合物
本发明的双抗体分子可以重组地融合或化学地轭合(包括共价和非共价轭合)到异源多肽(即，无关的多肽；或其部分，优选所述多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸来产生融合蛋白。融合不必是直接的，可以通过接头序列来进行。
进一步地，本发明的双抗体分子(即，多肽)可以轭合到修饰给定的生物反应的治疗剂或药物部分。作为直接轭合的替代，由于本发明的多价如，四价双抗体分子上有多个表位结合位点，双抗体的至少一个结合区可被设计以结合治疗剂或期望的药物部分而不影响双抗体结合。
治疗剂或药物部分不应被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可以包括，例如，毒素，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素(即，PE-40)或白喉毒素、蓖麻毒素、白树毒素和美洲商陆抗病毒蛋白，蛋白质，例如肿瘤坏死因子、干扰素，包括但不限于α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、组织纤溶酶原激活物(TPA)、细胞凋亡剂(例如TNF-α、TNF-β、AIM I，如PCT公布第WO 97/33899号中公开的)、AIM II(参见，PCT公布第WO 97/34911号)、Fas配体和VEGI(PCT公布第WO 99/23105号)、血栓形成剂或抗血管生成剂(例如，血管他丁或内皮他丁)，或生物应答调节物，例如，淋巴因子(例如，白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”)或生长因子(例如，生长激素(“GH”)；蛋白酶或核糖核酸酶。
本发明的双抗体分子(即，多肽)可以融合到标记物序列例如肽来便于纯化。在优选的实施方案，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)及其他中提供的标签，它们的许多是商业上可获得的。例如，如Gentz等人(1989)“Bioassay For Trans-Activation Using Purified Human ImmunodeficiencyVirus TAT-Encoded Protein：Trans-Activation Requires mRNA Synthesis(用于使用纯化的人类免疫缺陷病毒TAT-编码的蛋白的反式活化的生物测定：反式活化要求mRNA合成)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：821-824中描述的，六组氨酸提供了纯化融合蛋白的便利。对纯化有用的其他肽标签包括但不限于，血凝素″HA″标签，其相应于来自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人(1984)“The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein(蛋白中抗原决定簇的结构)”Cell，37：767-778)，和“flag”标签(Knappik等人(1994)“An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The DetectionAnd Purification Of Recombinant Antibody Fragments(用于检测和纯化重组抗体片段的基于FLAG肽的改进的亲和性标签)”Biotechniques，17(4)：754-761)。
通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术，可以产生其他的融合蛋白。可以采用DNA改组来改变本发明的分子的活性(例如，具有更高亲和性和更低解离速率的表位结合位点)。参见，一般地，美国专利第5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458号，和Patten等人(1997)“Applications Of DNA Shuffling ToPharmaceuticals And Vaccines(DNA改组在药物和疫苗中的应用)”Curr.Opinion Biotechnol.8：724-733；Harayama(1998)“Artificial Evolution ByDNA Shuffling(由DNA改组的人工进化)”Trends Biotechnol.16：76-82；Hansson等人(1999)“Evolution Of Differential Substrate Specificities In MuClass Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling(由DNA改组探测的Mu类谷胱甘肽转移酶不同底物特异性的进化)”J.Mol.Biol.287：265-276；和Lorenzo等人(1998)“PCR-Based Method For TheIntroduction Of Mutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus(在牛痘疫苗中克隆和表达的基因中引入突变的基于PCR的方法)”BioTechniques 24：308-313(通过引用将专利和出版物的每一个全文并入本文)。本发明的双抗体分子或编码本发明的分子的核酸，可以通过易错PCR、随机核苷酸添加或其他先于重组的方法经历随机诱变来进一步改变。编码本发明的分子的多核苷酸的一个或多个部分可以与一种或多种异源分子的一个或多个成分、基序、段、部分、结构域、片段等等重组。
本发明还涵盖轭合于或免疫特异性地识别期望增加/减少血清半衰期和/或靶向特定细胞子集的诊断剂或治疗剂或任何其他分子的本发明的双抗体分子。本发明的分子可以诊断性地使用，例如，作为例如确定给定治疗方式效力的临床试验过程的部分来监控疾病、病症或感染的发展或进展。通过将本发明的分子与可检测物质联结或通过免疫特异性地识别可检测物质的分子可以使检测便利化。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性物质、正电子发射金属和非放射性的顺磁性金属离子。可检测物质可以使用本领域已知的技术直接地或通过中间体(例如，本领域已知的接头)间接地联结或轭合到本发明的分子，或分子可免疫特异性地识别可检测物质：免疫特异性地结合所述物质。参见例如，美国专利第4,741,900号关于可以轭合到抗体用作根据本发明的诊断剂的金属离子。这种诊断和检测可以通过设计分子以免疫特异性地识别可检测物质或将本发明的分子联结到可检测物质来实现，所述可检测物质包括但不限于各种酶，酶包括但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物，例如但不限于，链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，例如但不限于，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料，例如但不限于，鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于，荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，例如但不限于，铋(213Bi)、碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(196Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(ruthemium)(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)；利用各种正电子发射成像的正电子发射金属，和非放射性的顺磁性金属离子。
本发明的双抗体分子可以免疫特异性地识别或轭合到治疗部分，例如细胞毒素(例如，抑制细胞的或杀细胞的试剂)、治疗剂或放射性元素(例如，α发射体、γ发射体，等等)。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、红比霉素、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，和它们的类似物或同系物。治疗剂包括但不限于，抗代谢物(例如，氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如，红比霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素(以前的纳霉素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC)、和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)。
此外，本发明的双抗体分子可以轭合到治疗部分或设计为免疫特异性地识别治疗部分，例如放射性物质或对轭合放射金属离子(例如参见上述的放射性物质)有用的大环的螯合剂。在某些实施方案，大环的螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)，其可以经由接头分子附着到多肽上。这种接头分子是本领域一般已知的并描述在Denardo等人(1998)“Comparison Of 1，4，7，10-Tetraazacyclododecane-N，N’，N”，N”’-Tetraacetic Acid(DOTA)-Peptide-ChL6，A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker，To2-Iminothiolane-2-[p-(bromoacetamido)benzyl]-DOTA-ChL6 In Breast CancerXenografts(在乳腺癌异种移植物中比较具有可降解代谢的接头的新型免疫轭合物1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)-肽-ChL6与2-亚氨硫醇-2-[p-(溴乙酰胺基)苄基]-DOTA-ChL6)”Clin.Cancer Res.4：2483-2490；Peterson等人(1999)“Enzymatic Cleavage Of Peptide-LinkedRadiolabels From Immunoconjugates(肽-连接的放射性标记从免疫轭合物的酶促裂解)”Bioconjug.Chem.10：553-；和Zimmerman等人，(1999)“ATriglycine Linker Improves Tumor Uptake And Biodistributions Of 67-Cu-Labeled Anti-Neuroblastoma mAb chCE7 F(ab)′2 Fragments(三甘氨酸接头改进67-Cu-标记的抗成神经细胞瘤mAb chCE7 F(ab)’2片段的肿瘤摄取和生物分布)”Nucl.Med.Biol.26：943-950，通过引用将它们每一个并入本文。
将这种治疗部分轭合到包含如Fc结构域的多肽的技术是公知的；参见例如，Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy(用于免疫靶向癌症疗法中药物的单克隆抗体)”，在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(单克隆抗体与癌症疗法)，Reisfeld等人(编辑)，1985，pp.243-56，Alan R.Liss，Inc.)；
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等人，“Antibodies For Drug Delivery(用于递送药物的抗体)”，在Controlled Drug Delivery(受控的药物递送)(第2版)，Robinson等人(编辑)，1987，pp.623-53，Marcel Dekker，Inc.)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy：A Review(癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述)”，在Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications(单克隆抗体′84：生物学和临床应用)，Pinchera等人(编辑)，1985，pp.475-506)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy(放射标记的抗体在癌症治疗的治疗应用的分析、结果和未来展望)”，在Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(用于癌症检测和治疗的单克隆抗体)，Baldwin等人(编辑)，1985，pp.303-16，Academic Press；和Thorpe等人(1982)“The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒性)”Immunol.Rev.，62：119-158。
本发明的双抗体分子可以在有或没有轭合到其上的治疗部分的情况下施用、单独地施用、或与用于治疗性治疗的细胞毒性因子和/或细胞因子共同施用。当单独地施用时，多价如四价双抗体分子的至少一个表位可被设计以免疫特异性地识别治疗剂，如细胞毒性因子和/或细胞因子，其可与本发明的分子同时施用或随后施用。以这种方式，双抗体分子可以类似于直接轭合的方式特异性地靶向治疗剂。作为选择，本发明的分子可以轭合到抗体来形成如Segal在美国专利第4，676,980号中描述的抗体异轭合物，通过引用将其整体并入本文。本发明的双抗体分子也可以附着于固相支持物，其对于免疫测定或纯化目标抗原是特别有用的。这种固相支持物包括但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
5.4表征双抗体分子的结合
可以以各种方法表征本发明的双抗体分子。特别地，可以测定本发明的分子与抗原，例如FcRIIIA或FcRIIB免疫特异性结合的能力，或当分子包含Fc结构域(或其部分)时测定其显示Fc-FcγR相互作用，即，Fc结构域(或其部分)对FcγR特异性结合的能力。这种测定可以在溶液中(例如，Houghten(1992)“The Use Of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries ForThe Identification Of Bioactive Peptides(使用合成肽组合文库来鉴定生物活性肽)”BioTechniques，13：412-421)、在珠子上(Lam(1991)“A New TypeOf Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand-Binding Activity(用于鉴定配体-结合活性的新型合成肽文库)”Nature，354：82-84)、在芯片上(Fodor(1993)“Multiplexed Biochemical Assays With Biological Chips(以生物芯片进行多路生化测定)”Nature，364：555-556)、在细菌上(美国专利第5,223,409号)、在孢子上(美国专利第5,571,698；5,403,484；和5,223,409号)、在质粒上(Cull等人(1992)“Screening For Receptor Ligands UsingLarge Libraries Of Peptides Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor(使用连接到Lac阻遏子的C末端的肽的大文库筛选受体配体)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：1865-1869)、或在噬菌体上(Scott等人(1990)“SearchingFor Peptide Ligands With An Epitope Library(以表位文库搜寻肽配体)”Science，249：386-390；Devlin(1990)“Random Peptide Libraries：A Source OfSpecific Protein Binding Molecules(随机肽文库：特异性蛋白结合分子的来源)”Science，249：404-406；Cwirla等人(1990)“Peptides On Phage：A VastLibrary Of Peptides For Identifying Ligands(噬菌体上的肽：用于鉴定配体的肽的巨大文库)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378-6382；和Felici(1991)“Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of OligopeptidesExpressed On A Multivalent Exposition Vector(从多价展示载体上表达的寡肽的大文库筛选抗体配体)”J.Mol.Biol，222：301-310)进行(通过引用将这些参考文献的每一个全文并入本文)。已经被鉴定与抗原例如FcγRIIIA免疫特异性结合的分子然后可以测定它们对该抗原的特异性和亲和性。
已经被工程化以包含多个表位结合结构域的本发明的分子，可以通过本领域已知的任何方法测定与一种或多种抗原(例如，癌抗原和与其他抗原(如，FcγR)的交叉反应性)的免疫特异性结合，或当分子包含Fc结构域(或其部分)时，测定Fc-FcγR相互作用。可用于分析免疫特异性结合、交叉反应性和Fc-FcγR相互作用的免疫测定包括但不限于使用如下技术的竞争性和非竞争性测定系统：蛋白质点杂交、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体-固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定、仅举几个例子。这些测定是常规的和本领域公知的(参见，例如，Ausubel等人编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，第1版，John Wiley& Sons，Inc.，New York中描述的技术，通过引用将其全文并入本文)。
可以通过竞争性结合测定来确定抗原-结合结构域相互作用或Fc-FcγR相互作用的结合亲和性和解离速率。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫分析，包括在增加数量的未标记表位例如FcγR(参见5.4.1节)的存在下，孵育标记的抗原例如四聚FcγR(例如，3H或125I，参见5.4.1节)与目标分子(例如，包含多个表位结合结构域的本发明分子)，并检测与标记的抗原结合的分子。通过Scatchard分析根据饱和数据，可以确定本发明的分子与抗原的亲和性和结合解离速率。
本发明的分子对抗原或FcγR的亲和性和结合性质可使用本领域已知用于抗原-结合结构域或Fc-FcγR相互作用的体外测定(基于生化或免疫学的测定)来最初确定，包括但不限于ELISA测定、表面等离子共振测定、免疫沉淀测定。优选地，本发明的分子的结合性质还由确定一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的体外功能性测定表征，如5.4.2节所述。在最优选的实施方案，本发明的分子在体内模型中(诸如本文描述和公开的)具有与基于体外的测定类似的结合性质。然而，本发明不排除在基于体外的测定中不表现期望表型但在体内表现期望表型的本发明的分子。
在一些实施方案，筛选和鉴定包含多个表位结合结构域和任选地Fc结构域(或其部分)的分子由基于功能性的测定进行，优选地以高通量方式。基于功能性的测定可为本领域已知的用于表征一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的任何测定，诸如在5.4.2和5.4.3节所述的。可根据本发明的方法使用的效应细胞功能的非限制性实例包括但不限于，抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体-依赖性吞噬作用、吞噬作用、调理作用、调理吞噬作用、细胞结合、玫瑰花结、C1q结合和补体依赖性细胞介导的细胞毒性。
在优选的实施方案，使用BIAcore动力学分析来确定本发明的分子与抗原或FcγR的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析抗原或FcγR从芯片的结合和解离，所述芯片在它们的表面上具有固定化的分子(例如，分别包含表位结合结构域或Fc结构域(或其部分)的分子)。BIAcore分析描述在5.4.3节。
优选地，运用本领域技术人员已知的任何技术的荧光活化的细胞分选(FACS)被用于基于免疫学或功能性的测定来表征本发明的分子。流式分选机能够快速地检查大量的已被本发明的分子结合，如调理的单独的细胞(例如，每小时1000-10000万个细胞)(Shapiro等人(1995)Practical Flow Cytometry)。此外，用于优化双抗体行为的特定参数包括但不限于，抗原浓度(即，FcγR四聚复合物，参见5.4.1节)、动力学竞争时间或FACS严格度，这些都可以变化，以选择包含展示了特定结合性质的本发明的分子的双抗体分子，所述特定结合性质例如同时结合于多个表位。用于分选和检查生物细胞的流式细胞计是本领域公知的。例如，在美国专利第4,347,935；5,464,581；5,483,469；5,602,039；5,643,796；和6,211,477号中描述已知的流式细胞计；通过引用将它们全文并入本文。其他已知的流式细胞计是Becton Dickinson and Company制造的FACS VantageTM系统，和Union Biometrica制造的COPASTM系统。
靶抗原结合亲和性或Fc-FcγR结合亲和性的表征，和评价细胞表面上的靶抗原或FcyR密度可通过本领域公知的方法进行，诸如Scatchard分析或通过如制造商的说明使用试剂盒，诸如QuantumTM Simply
Figure GPA00001026478600971
(Bangs Laboratories，Inc.，Fishers，IN)。一种或多种功能性测定可以是本领域已知用于表征一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的任何测定，如本领域技术人员已知或本文描述的。在特定的实施方案，在ELISA测定中测定包含多个表位结合结构域和任选地Fc结构域(或其部分)的本发明的分子与一种或多种靶抗原或一种或多种FcYR，例如，FcγRIIIA、FcγRIIA、FcγRIIA的结合；继之以一种或多种ADCC测定。在某些实施方案，进一步使用基于表面等离子共振的测定例如BIAcore来测定本发明的分子。基于表面等离子共振的测定是本领域公知的，在5.4.3节中进一步讨论，在实施例6.1中在本文例示。
在最优选的实施方案，进一步在动物模型中表征包含多个表位结合结构域和任选地Fc结构域(或其部分)的本发明分子与靶抗原(如，FcγR)的相互作用或Fc-FcγR相互作用。当评价Fc-FcγR相互作用时，用于本发明方法的优选的动物模型是，例如，表达人类FcγR的转基因小鼠，例如，在美国专利第5,877,397和6,676,927号中描述的任何小鼠模型，通过引用将它们整体并入本文。在本发明的方法中进一步使用的转基因小鼠包括但不限于，携带人类FcγRIIIA的裸敲除FcγRIIIA小鼠；携带人类FcγRIIA的裸敲除FcγRIIIA小鼠；携带人类FcγRIIB和人类FcγRIIIA的裸敲除FcγRIIIA小鼠；携带人类FcγRIIB和人类FcγRIIA的裸敲除FcγRIIIA小鼠；携带人类FcγRIIIA和FcγRIIA的裸敲除FcγRIIIA和FcγRIIA小鼠以及携带人类FcγRIIIA、FcγRIIA和FcγRIIB的裸敲除FcγRIIIA、FcγRIIA和FcγRIIB小鼠。
5.4.1包含FcγR的结合测定
可以使用任何FcγR，包括但不限于FcγR的多态性变体来进行包含Fc结构域(或其部分)和/或包含对FcγR特异性的表位结合结构域的分子对FcγR结合的表征。在某些实施方案，使用在位置158含有苯丙氨酸的FcγRIIIA的多态性变体。在其他实施方案，使用在位置158含有缬氨酸的FcγRIIIA的多态性变体来进行表征。FcγRIIIA 158V显示了比158F更高的IgG1亲和性和提高的ADCC活性(参见，例如Koene等人(1997)“FcgammaRIIIa-158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgG By NaturalKiller Cell Fc gammaRIIIa，Independently Of The Fc gammaRIIIa-48L/R/HPhenotype (FcγRIIIa-158V/F多态性影响天然杀伤细胞FcγRIIIa对IgG的结合，而不论FcγRIIIa-48L/R/H表型)”Blood，90：1109-14；Wu等人(1997)“A Novel Polymorphism Of FcgammaRIIIa(CD 16)Alters Receptor FunctionAnd Predisposes To Autoimmune Disease(FcγRIIIa(CD16)的新多态性改变受体功能和对自身免疫疾病的倾向)”J.clin.Invest.100：1059-70，通过引用将两者整体并入本文)；根据近来由IgG1-FcγRIIIA共结晶研究显示的，这个残基实际上与IgG1的较低的铰链区直接相互作用，参见，例如Sondermann等人(2000)“The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgGl FcFragment-Fc gammaRIII complex(人类IgG1 Fc片段-FcγRIII复合物的3.2-A晶体结构)”Nature，406(6793)：267-273，通过引用将它整体并入本文。研究显示，在某些情况下治疗性抗体在FcγRIIIA-158V纯合的患者中具有改善的效力。例如，与FcγRIIIA 158F纯合的患者相比，在FcγRIIIA158V纯合的患者中人源化抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗治疗上更有效(参见，例如，Cartron等人(2002)“Therapeutic Activity Of HumanizedAnti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc ReceptorFcgammaRIIIA Gene(人源化抗-CD20单克隆抗体的治疗活性与IgG Fc受体FcγRIIIA基因的多态性)”Blood，99(3)：754-758)。在其他实施方案，包含该区的治疗性分子对FcγRIIIA-158V和FcγRIIIA-158F杂合的患者和带有FcγRIIA-131H的患者可能也更有效。尽管不希望受特定作用机制的限制，用替代的同种型来选择本发明的分子能够提供这样的变体，所述变体一旦被工程化为治疗性双抗体，将在临床上对所述同种型纯合的患者更有效。
开发了FcγR结合测定用于确定本发明的分子与FcγR的结合，特别是用于确定Fc结构域对FcγR的结合。该测定容许Fc-FcγR相互作用的检测和定量，不论受体对它的配体的固有地弱的亲和性，例如，对于FcγRIIB和FcγRIIIA在微摩尔的范围内。该方法详细描述在国际申请WO04/063351和美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514，所有文献都通过引用全文并入本文。简言之，所述方法包括形成可用于本领域已知的任何标准免疫测定如，FACS、ELISA、表面等离子共振等等的FcγR复合物。此外，相对于未复合的FcγR，该FcγR复合物具有对Fc区的改善的亲和力。根据本发明，优选的分子复合物是四聚的免疫复合物，包括：(a)FcγR的可溶区域(例如，FcγRIIIA、FcγRIIA或FcγRIIB的可溶区)；(b)与FcγR的可溶区域(例如，FcγRIIIA、FcγRIIA或FcγRIIB的可溶区域)的C-末端可操作连接的生物素化的15氨基酸AVITAG序列(AVITAG)；和(c)链霉抗生物素蛋白-藻红素(SA-PE)；以一定摩尔比来形成四聚FcγR复合物(优选的以5∶1的摩尔比)。所述融合蛋白以酶学手段生物素化，使用例如，大肠杆菌BirA酶，一种特异地将15氨基酸AVITAG序列中的赖氨酸残基生物素化的生物素连接酶。随后以1X SA-PE∶5X生物素化可溶FcγR的摩尔比将生物素化的可溶FcγR蛋白与SA-PE混合，来形成四聚FcγR复合物。
包含Fc区的多肽已显示以比单体未复合的FcγR高至少8倍的亲和性结合根据四聚FcγR复合物。包含Fc区的多肽与四聚FcγR复合物的结合可以使用本领域技术人员已知的标准技术来确定，实例例如，荧光活化的细胞分选(FACS)、放射性免疫测定、ELISA测定，等等。
本发明涵盖使用根据如上所述的方法形成的包含本发明分子的免疫复合物来在基于细胞的或无细胞的测定中确定包含Fc区的分子的功能。
为了方便，可以以测定试剂盒来提供试剂，即，用于测定包含Fc区的分子结合FcγR四聚复合物的能力的试剂的封装组合。用于确定Fc-FcγR相互作用的其他形式的分子复合物也预期用于本发明的方法中，例如，如2003年1月13日提交的美国临时申请60/439,709中描述所形成的融合蛋白；通过引用将它整体并入本文。
5.4.2具有变体重链的分子的功能性测定
本发明涵盖使用本领域技术人员已知用于鉴定分子的效应细胞功能的测定来表征包含多个表位结合结构域和任选地Fc结构域(或其部分)的本发明的分子。特别地，本发明涵盖表征本发明的分子的FcγR介导的效应细胞功能。另外，当本发明的双抗体分子的至少一个靶抗原是FcγR时，FcγR被双抗体分子的结合可用作活化FcγR-介导的途径，类似于被FcγR-Fc结合活化的途径。因此，当双抗体分子的至少一个表位结合结构域识别FcγR时，双抗体分子可能展现FcγR-介导的效应细胞功能而不含有Fc结构域(或其部分)，或没有相伴的Fc-FcγR结合。根据本发明可以测定的效应细胞功能的实例包括但不限于，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、吞噬作用、调理作用、调理吞噬作用(opsonophagocytosis)、C1q结合以及补体依赖性细胞介导的细胞毒性。可以使用本领域技术人员已知用于确定效应细胞功能活性的任何基于细胞的或无细胞的分析(对于效应细胞测定，参见，Perussia等人(2000)“Assays For Antibody-Dependent Cell-MediatedCytotoxicity(ADCC)And Reverse ADCC(Redirected Cytotoxicity)In HumanNatural Killes Cells(用于人类天然杀伤细胞中抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和反向ADCC(重定向的细胞毒性)的测定)”Methods Mol Biol.121：179-92；Baggiolini等人(1988)“Cellular Models For The Detection AndEvaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity(检测和评价调节人类吞噬活性的药物的细胞模型)”Experientia，44(10)：841-848；Lehmann等人(2000)“Phagocytosis：Measurement By Flow Cytometry(吞噬作用：由流式细胞术测量)”J.Immunol.Methods，243(1-2)：229-42；Brown(1994)“In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral BloodLeukocytes：Receptor Modulation And Signal Transduction(人类外周血白细胞的吞噬功能的体外测定：受体调节和信号传导)”Methods Cell Biol.，45：147-64；Munn等人(1990)“Phagocytosis Of Tumor Cells By HumanMonocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony-Stimulating Factor(重组巨噬细胞集落刺激因子中培养的人类单核细胞对肿瘤细胞的吞噬作用)”J.Exp.Med.，172：231-237，Abdul-Majid等人(2002)“Fc Receptors AreCritical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central NervousSystem In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis(在实验性自身免疫脑脊髓炎中Fc受体对中枢神经系统的自身免疫炎性损伤是关键的)”Scand.J.Immunol.55：70-81；Ding等人(1998)“Two Human T Cell ReceptorsBind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex UsingDifferent TCR Amino Acids(使用不同TCR氨基酸，两种人类T细胞受体以类似的对角线方式结合于HLA-A2/Tax肽复合物)”Immunity 8：403-411，所有文献都通过引用全文并入本文)。
在一个实施方案，可以在人类单核细胞中测定本发明的分子的FcγR介导的吞噬作用。作为选择，本发明的分子的FcγR介导的吞噬作用可以在其他吞噬细胞中测定，例如嗜中性白细胞(多形核白细胞；PMN)；人类外周血单核细胞，单核细胞衍生的巨噬细胞，其可以通过本领域技术人员已知的标准过程来获得(例如，参见Brown(1994)“In Vitro Assays OfPhagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes：ReceptorModulation And Signal Transduction(人类外周血白细胞的吞噬功能的体外测定：受体调节和信号转导)”Methods Cell Biol.，45：147-164)。在一个实施方案，通过早先描述的方法(Tridandapani等人(2000)“The AdapterProtein LA T Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction InMyeloid Cells(适体蛋白LAT在脊髓细胞中增强Fcγ受体-介导的信号转导)”J.Biol.Chem.275：20480-20487)，通过测量THP-1细胞吞噬荧光化的IgG调理的绵羊红细胞(SRBC)的能力，来表征本发明的分子的功能。
用于确定本发明的分子的吞噬作用的另一个示范性的测定是抗体依赖性调理吞噬作用测定(ADCP)，其可以包括以下：用(i)针对荧光素的抗体，野生型4-4-20抗体(参见Bedzyk等人(1989)“Comparison Of VariableRegion Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family(比较抗-荧光素独特型家族中的可变区基本结构)”J.Biol.Chem，264(3)：1565-1569，通过引用将它全文并入本文)，作为FcγR依赖性ADCP的对照抗体；或(ii)携带敲出了对FcγRIII的结合的D265A突变的4-4-20抗体，作为FcγR依赖性ADCP的背景对照，(iii)包含4-4-20的表位结合结构域和Fc结构域和/或对FcγRIII特异性的表位结合结构域的双抗体包被目标生物粒子，例如大肠杆菌标记的FITC(Molecular Probes)或金黄色葡萄球菌-FITC；并形成调理的粒子；以1∶1、10∶1、30∶1、60∶1、75∶1或100∶1的比例将任何所描述的调理的粒子(i-iii)添加到THP-1效应细胞(可从ATCC获得的单核细胞系)以容许FcγR介导的吞噬作用发生；优选地在37℃培养细胞和大肠杆菌-FITC/抗体1.5小时；培养(优选地在室温下2-3分钟)之后向细胞添加台盼蓝，来猝灭附着于细胞表面之外没有被内在化的细菌的荧光；将细胞转移到FACS缓冲液(例如，PBS中的0.1％BSA、0.1％叠氮化钠)中，使用FACS(例如，BD FACS Calibur)分析THP1细胞的荧光。优选地，通过FACS来分析在测定中使用的THP-1细胞的细胞表面FcγR的表达。THP-1细胞表达CD32A和CD64。CD64是高亲和性FcγR，其在根据本发明的方法进行ADCP测定时被封闭。优选地用100μg/mL可溶性IgG1或10％人类血清封闭THP-1细胞。为了分析ADCP的程度，优选地将门设置在THP-1细胞上，测量中值荧光强度。计算单个突变体的ADCP活性，作为相对于获得的野生型chMab 4-4-20的标准值来报道。将调理的粒子添加到THP-1细胞，从而调理的粒子与THP-1细胞的比例是30∶1或60∶1。在最优选的实施方案，使用对照例如培养基中的大肠杆菌-FITC、大肠杆菌-FITC和THP-1细胞(作为FcγR非依赖性ADCP活性)、大肠杆菌-FITC、THP-1细胞和野生型4-4-20抗体(作为FcγR依赖性ADCP活性)、大肠杆菌-FITC、THP-1细胞、4-4-20 D265A(作为FcγR依赖性ADCP活性的背景对照)，进行ADCP测定。
在另一个实施方案，可以使用本领域技术人员已知的任何标准方法，在效应细胞例如天然杀伤细胞中测定本发明的分子的FcγR介导的ADCC活性(参见例如，Perussia等人(2000)“Assays For Antibody-DependentCell-Mediated Cytotoxicity(ADCC)And Reverse ADCC(RedirectedCytotoxicity)In Human Natural Killer Cells(用于人类天然杀伤细胞中抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和反向ADCC(重定向的细胞毒性)的测定)”Methods Mol.Biol.121：179-92；Weng等人(2003)“TwoImmunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms IndependentlyPredict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma(两种免疫球蛋白G片段C受体多态性独立地预测滤泡性淋巴瘤患者对利妥昔单抗的响应)”J.Clin.Oncol.21：3940-3947；Ding等人(1998)“Two Human TCell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax PeptideComplex Using Different TCR Amino Acids(使用不同TCR氨基酸，两种人类T细胞受体以类似的对角线方式结合于HLA-A2/Tax肽复合物)”Immunity8：403-411)。确定本发明的分子的ADCC活性的示范性的测定是基于51Cr释放分析，包括：用[51Cr]Na2CrO4(这种细胞膜可透过的分子一般被用于标记，因为它结合胞浆蛋白，虽然以缓慢动力学从细胞自发释放，在靶细胞坏死之后大量地释放)标记靶细胞；用包含变体重链的本发明的分子调理靶细胞；在微量滴定板上以合适的靶细胞对效应细胞比例来组合调理的放射性标记的靶细胞和效应细胞；在37℃培养细胞的混合物16-18小时；收集上清液；并分析放射性。随后可以确定本发明的分子的细胞毒性，例如，使用以下公式：裂解％＝(实验的cpm-靶渗漏cpm)/(洗涤剂裂解cpm-靶渗漏cpm)x100％。作为选择，裂解％＝(ADCC-AICC)/(最大释放-自发释放)。特异性裂解可以使用以下公式计算：特异性裂解＝本发明的分子的裂解％-不存在本发明分子时的裂解％。通过改变靶细胞∶效应细胞比例或抗体浓度，可以产生图表。
优选地，在本发明的ADCC测定中使用的效应细胞是外周血单核细胞(PBMC)，其优选地是使用本领域技术人员已知的标准方法，例如使用Ficoll-Paque密度梯度离心从正常人类血液纯化的。在本发明的方法中使用的优选的效应细胞表达不同的FcγR活化性受体。本发明涵盖表达FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIB的效应细胞THP-1，以及来自全人类血液、表达FcγRIIIA和FcγRIIB的单核细胞衍生的原代巨噬细胞，来确定重链抗体突变体是否相对于野生型IgG1抗体显示增加的ADCC活性和吞噬作用。
人类单核细胞系THP-1通过高亲和性受体FcγRI和低亲和性受体FcγRIIA的表达来活化吞噬作用(Fleit等人(1991)“The HumanMonocyte-Like Cell Line THP-1 Expresses Fc Gamma RI And Fc Gamma RII(人类单核细胞-样细胞系THP-1表达FcγRI和FcγRII)”J.Leuk.Biol.49：556-565)。THP-1细胞不组成性地表达FcγRIIA或FcγRIIB。用细胞因子刺激这些细胞影响FcR表达模式(Pricop等人(2001)“DifierentialModulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptots On HumanMonocytes By TH1 And Th2 Cytokines(Th1和Th2细胞因子不同地调节人类单核细胞上的刺激性和抑制性Fcγ受体)”J.of Immunol.，166：531-537)。在细胞因子IL4的存在下TRP-1细胞的生长诱导FcγRIIB表达并引起FcγRIIA和FcγRI表达的减少。FcγRIIB表达也可以通过增加细胞密度来增强(Tridandapani等人(2002)“Regulated Expression And Inhibitory FunctionOf Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells(人类单核细胞中FcγRIIB的调节的表达和抑制性功能)”J.Biol.Chem.，277(7)：5082-5089)。相比之下，已经报道IFNγ可以引起FcγRIIIA的表达(Pearse等人(1993)“InterferonGamma-Induced Transcription Of The High-Affinity Fc Receptor For IgGRequires Assembly Of A Complex That Includes The 91-kDa Subunit OfTranscription Factor ISGF 3(干扰素γ-诱导的对IgG高亲和性的Fc受体的转录需要组装包括转录因子ISGF 3的91-kDa亚基的复合物)”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：4314-4318)。细胞表面上受体的存在或缺乏可以使用本领域技术人员已知的常规方法通过FACS来确定。在细胞表面上细胞因子诱导的FcγR表达提供了在FcγRIIB存在下测试活化作用和抑制作用的系统。如果THP-1细胞不能表达FcγRIIB，本发明还涵盖另一种人类单核细胞系U937。这些细胞已经显示了在IFNγ和TNF存在下末期分化成巨噬细胞(Koren等人(1979)“In Vitro Activation Of A Human Macrophage-Like CellLine(体外活化人类巨噬细胞-样细胞系)”Nature 279：328-331)。
在小鼠肿瘤模型中FcγR依赖性肿瘤细胞杀伤是由巨噬细胞和NK细胞介导的(Clynes等人(1998)“Fc Receptors Are Required In Passive AndActive Immunity To Melanoma(在对黑素瘤的被动免疫和主动免疫中需要Fc受体)”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：652-656)。本发明涵盖使用来自供者的淘析的单核细胞作为效应细胞来分析Fc突变体在吞噬作用和ADCC测定中触发靶细胞的细胞毒性的效力。FcγRI、FcγRIIIA和FcγRIIB的表达模式受不同生长条件的影响。冷冻淘析的单核细胞、新鲜淘析的单核细胞、维持在10％FBS中的单核细胞和培养在FBS+GM-CSF和/或在人类血清中的单核细胞的FcγR表达可以使用本领域技术人员已知的常规方法来测定。例如，细胞可以用FcγR特异性抗体染色并通过FACS分析以确定FcR分布型。然后将最好地模拟巨噬细胞体内FcγR表达的条件用于本发明的方法。
在某些实施方案，本发明涵盖使用小鼠细胞，特别是在不能获得具有正确FcγR分布型的人类细胞时。在某些实施方案，本发明涵盖小鼠巨噬细胞系RAW264.7(ATCC)，其可以使用本领域已知的方法用人类FcγRIIIA转染并分离稳定的转染子，参见，例如，Ralph等人(1977)“Antibody-Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor Targets ByMacrophage-Related Cell Lines：Enhancement By PPD And LPS(由巨噬细胞-相关细胞系抗体-依赖性地杀伤红细胞和肿瘤靶：被PPD和LPS增强)”J.Immunol.119：950-4)。使用常规实验通过FACS分析可以定量转染子的FcγRIIIA表达，高表达体可以用于本发明的ADCC测定。在其他实施方案，本发明涵盖从敲除的转基因小鼠，例如本文公开的那些小鼠分离表达人类FcγR的脾腹膜巨噬细胞。
使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)可从供者的外周血(PBM)收获淋巴细胞。在分离的单核的细胞群体中，大多数ADCC活性经由在其表面含有FcγRIIIA而没有FcγRIIB的天然杀伤细胞(NK)发生。这些细胞的结果表明了突变体触发NK细胞ADCC的效力，并确定了用淘析的单核细胞进行测试的试剂。
用于本发明的ADCC测定的靶细胞包括但不限于，乳腺癌细胞系，例如，具有ATCC登记号HTB-30的SK-BR-3(参见，例如Tremp等人(1976)“Human Breast Cancer In Culture(培养的人类乳腺癌)”Recent ResultsCancer Res.33-41)；B-淋巴细胞；来自伯基特淋巴瘤的细胞，例如具有ATCC登记号CCL-86的Raji细胞(参见，例如Epstein等人(1965)“CharacteristicsAnd Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain(EB1)Of Human LymphoblastsFrom Burkitt′s Lymphoma(来自伯基特淋巴瘤的人类成淋巴细胞的组织培养株(EB1)的生长特征和模式)”J.Natl.Cancer Inst.34：231-240)，和具有ATCC登记号CCL-213的Daudi细胞(参见，例如，Klein等人(1968)“SurfaceIgM-Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell In Vivo And In DerivedCulture Lines (体内伯基特淋巴瘤细胞和伯基特淋巴瘤细胞衍生的培养系的表面IgM-κ特异性)”Cancer Res.28：1300-1310)。靶细胞必须被待测定的双抗体分子的抗原结合位点识别。
ADCC测定是基于NK细胞经由细胞凋亡途径介导细胞死亡的能力。NK细胞部分地通过FcγRIIIA识别结合到细胞表面上抗原的IgG Fc结构域来介导细胞死亡。根据本发明的方法使用的ADCC测定可以是基于放射性的分析或基于荧光的分析。用于表征包含变体Fc区的本发明的分子的ADCC测定包括，标记靶细胞，例如SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji、Daudi细胞，用抗体调理靶细胞，所述抗体经由其抗原结合位点识别靶细胞上的细胞表面受体；以合适的比例组合标记的调理的靶细胞和效应细胞，所述比例可以通过常规实验来确定；收获细胞；根据所使用的标记使用适当的检测方案，检测裂解的靶细胞的上清液中的标记。可以使用本领域已知的标准方法用放射性标记或荧光标记来标记靶细胞。例如，标记包括但不限于，[51Cr]Na2CrO4；和荧光增强配体2，2’：6’，2”-四吡啶-6-6″二羧酸(TDA)的乙酰氧基甲基酯。
在特别优选的实施方案，时间分辨荧光测定被用于测量针对靶细胞的ADCC活性，所述靶细胞已经用荧光增强配体2，2’：6’，2”-四吡啶-6-6″二羧酸(TDA)的乙酰氧基甲基酯标记。这种荧光测定是本领域已知的，例如，参见Blomberg等人(1996)“Time-Resolved Fluorometric Assay For NaturalKiller Activity Using Target Cells Labelled With A Fluorescence EnhancingLigand(使用以荧光增强配体标记的靶细胞对自然杀伤活性的时间分辨荧光测定)”Journal of Immunological Methods，193：199-206；通过引用将它全文并入本文。简要地说，用TDA的膜可透性乙酰氧基甲基二酯(二(乙酰氧基甲基)2，2’：6’，2”-四吡啶-6-6”二羧酸(BATDA)来标记靶细胞，其快速地扩散跨越活细胞的细胞膜。细胞内的酯酶裂解酯基，再生的膜不透性TDA分子被捕获在细胞内部。在37℃、5％CO2下孵育效应细胞和靶细胞，例如，至少两个小时、多至3.5小时之后，用Eu3+螯合从裂解的靶细胞释放的TDA，在时间分辨荧光计(例如，Victor 1420，Perkin Elmer/Wallace)中定量所形成的铕-TDA螯合物的荧光。
在另一个特定实施方案，用于表征包含多个表位结合位点和任选地Fc结构域(或其部分)的本发明的分子的ADCC测定包括以下步骤：优选地用二(乙酰氧基甲基)2，2’：6’，2”-四吡啶-t-6”二羧酸酯(DELFIA BATDA试剂，Perkin Elmer/Wallac)标记4-5x106靶细胞(例如，SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji细胞)。对于最佳的标记效力，用于ADCC测定的靶细胞数目应优选地不超过5x106个。将BATDA试剂添加到细胞，在37℃、优选地在5％CO2下培养混合物至少30分钟。然后用生理缓冲液，例如，带有0.125mM亚磺吡唑的PBS，和含有0.125mM亚磺吡唑的介质洗涤细胞。然后用包含对FcγRIIA特异性的表位结合结构域和任选地Fc结构域(或其部分)的本发明的分子来调理(包被)标记的靶细胞。在优选的实施方案，在ADCC测定中使用的分子还对细胞表面受体、肿瘤抗原或癌抗原是特异性的。本发明的双抗体分子可以特异性结合任何癌症或肿瘤抗原，诸如5.6.1节列出的那些。根据工程化入本发明的双抗体的表位结合位点选择ADCC测定中的靶细胞，从而双抗体特异性地结合靶细胞的细胞表面受体。
将靶细胞添加到效应细胞例如PBMC，来产生约1∶1、10∶1、30∶1、50∶1、75∶1、或100∶1的效应物∶靶比例。在37℃、在5％CO2下，培养效应细胞和靶细胞至少两小时、多至3.5小时。收获细胞上清液并添加到酸性铕溶液(例如，DELFIA铕溶液，Perkin Elmer/Wallac)。在时间分辨的荧光计(例如，Victor 1420，Perkin Elmer/Wallac)中定量形成的铕-TDA螯合物的荧光。通过分别与1％TX-100和单独的培养基培养靶细胞，确定最大释放(MR)和自发的释放(SR)。通过在不存在测试分子如，本发明的双抗体的情况下培养靶细胞和效应细胞，测量抗体依赖性细胞毒性(AICC)。每个分析优选进行三份。将特异性裂解平均百分比计算为：实验释放(ADCC)-AICC)/(MR-SR)x100。
本发明涵盖本领域已知和本文示例的测定，来表征包含Fc结构域(或其部分)的本发明的分子的结合C1q和介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。为了确定C1q结合，可以进行C1q结合ELISA。示范性的测定可以包含以下：用包含本发明的分子的多肽或起始多肽(对照)在包被缓冲液中包被测定平板在4℃过夜。然后可以洗涤和封闭平板。在洗涤之后，将等分量的人类C1q添加到每个孔，在室温下孵育2小时。进一步的洗涤之后，可以将100uL绵羊抗补体C1q过氧化物酶轭合的抗体添加到每个孔，在室温下孵育1小时。可以再次用洗涤缓冲液洗涤平板，将含有OPD(O-苯二胺二氢氯化物(Sigma))的100ul底物缓冲液添加到每个孔中。通过黄色的出现观察到的氧化反应可以容许进行30分钟，通过添加100ul 4.5 NH2SO4来停止。然后可以在(492-405)nm读取吸光度。
为了评估补体活化，可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)分析，例如Gazzano-Santoro等人(1997)“A Non-Radioactive Complement-DependentCytotoxicity Assay For Anti-CD20 Monoclonal Antibody(对抗-CD20单克隆抗体的非放射活性补体依赖性细胞毒性测定)”J.Immunol.Methods202：163-171中所描述的，通过引用将其全文并入本文。简要地说，可以用缓冲液稀释各种浓度的包含(变体)Fc结构域(或其部分)的分子和人类补体。表达被双抗体分子所结合的抗原的细胞可以被稀释到约1x106细胞/ml的密度。包含(变体)Fc结构域(或其部分)的双抗体分子、稀释的人类补体和表达抗原的细胞的混合物可以添加到平底组织培养96孔平板上，容许在37℃、5％CO2下孵育2小时以促进补体介导的细胞裂解。然后可以向每个孔添加50uL的阿尔玛蓝(Accumed International)，并在37℃孵育过夜。用530nm的激发和590nm的发射，使用96孔荧光计测量吸光度。结果可以相对荧光单位(RFU)表示。可以根据标准曲线计算样品浓度，报告每个感兴趣变体与非变体分子，即，不包含Fc结构域或包含非-变体Fc结构域的分子相比的活性百分比。
5.4.3其他测定
包含多个表位结合结构域和任选地Fc结构域的本发明的分子可以使用本领域已知用于表征抗原-结合结构域或Fc-FcγR结合的动力学参数的任何基于表面等离子共振的测定来测定。包括但不限于可从Biacore AB(Uppsala，Sweden)获得的BIAcore仪器；可从Affinity Sensors(Franklin，MA.)获得的IAsys仪器；可从Windsor Scientific Limited(Berks，UK)获得的IBIS系统，可从Nippon Laser and Electronics Lab(Hokkaido，Japan)获得的SPR-CELLIA系统以及可从Texas Instruments(Dallas，TX)获得的SPRDetector Spreeta的任何商业上可获得的SPR仪器可以用于本发明。基于SPR的技术的综述参见Mullet等人(2000)“Surface PlasmonResonance-Based Immunoassays(基于表面等离子共振的免疫测定)”Methods 22：77-91；Dong等人(2002)“Some new aspects in biosensors(生物传感器的一些新方面)″Reviews in Mol.Biotech.82：303-23；Fivash等人(1998)″BIAcore For Macromolecular Interaction(用于大分子相互作用的BIAcore)”Current Opinion in Biotechnology 9：97-101；Rich等人(2000)“Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis(表面等离子共振生物传感器分析进展)”Current Opinion in Biotechnology 11：54-61，通过引用将它们全文并入本文。此外，在美国专利第6,373,577；6,289,286；5,322,798；5,341,215；6,268,125号中描述用于测量蛋白-蛋白相互作用的任何SPR仪器和基于SPR的方法涵盖在本发明的方法中，通过引用将它们全文并入本文。
简要地说，基于SPR的测定包括将结合对的成员之一固定在表面上，在溶液中实时地监视它与结合对的另一个成员的相互作用。SPR基于测量在发生复合物形成或解离的表面附近溶剂折射率的变化。在其上发生固定的表面是传感器芯片，它是SPR技术的核心；它由包被有金的薄层的玻璃表面组成，形成了一批专门化的表面的基础，所述表面被设计以优化分子与表面的结合。各种传感器芯片是商业上可获得的，特别是来自以上列出的公司，所有这些都可以用于本发明的方法中。传感器芯片的实例包括可从BIAcore AB，Inc.获得的那些，例如，传感器芯片CM5、SA、NTA和HPA。可以使用本领域已知的任何固定方法和化学作用将本发明的分子固定在传感器芯片的表面上，包括但不限于，经由胺基的直接共价偶合、经由硫氢基的直接共价偶合、生物素附着到抗生物素蛋白包被的表面、醛偶合到糖类基团、以及通过组氨酸标签与NTA芯片附着。
在某些实施方案，可以使用BIAcore仪器(例如，BIAcore仪器1000，BIAcore Inc.，Piscataway，NJ)来确定包含多个表位结合位点和任选地Fc结构域的本发明的分子，对抗原或FcγR的结合的动力学参数。如上讨论的，参见5.4.1节，任何FcγR可以用于评估其中双抗体分子的至少一个表位结合位点免疫特异性地识别FcγR和/或其中双抗体分子包含Fc结构域(或其部分)的本发明的分子的结合。在特定的实施方案，FcγR是FcγRIIIA，优选可溶的单体FcγRIIIA。例如，在一个实施方案，可溶的单体FcγRIIIA是连接到接头-AVITAG序列的FcγRIIIA的细胞外区域(参见，2003年1月9日提交的美国临时申请第60/439,498号和2003年3月19日提交的美国临时申请第60/456,041号，通过引用将它们全文并入本文)。在另一个特定的实施方案，所述FcγR是FcγRIIB，优选的是可溶的二聚FcγRIIB。例如，在一个实施方案，根据在2003年1月13日提交的美国临时申请第60/439,709号中描述的方法制备可溶的二聚FcγRIIB蛋白，通过引用将它们全文并入本文。
对于所有免疫学测定，本发明分子的FcγR识别/结合可由多个结构域实现：在某些实施方案，本发明的分子经由多个表位结合结构域之一免疫特异性地识别FcγR；在其中本发明的分子包含Fc结构域(或其部分)的其他的实施方案，双抗体分子可经由Fc-FcγR相互作用免疫特异性地识别FcγR；在其中本发明的分子包含Fc结构域(或其部分)和免疫特异性地识别FcγR的表位结合位点两者的又进一步的实施方案，双抗体分子可经由表位结合结构域和Fc结构域(或其部分)之一或两者识别FcγR。使用BIAcore仪器测定包含多个表位结合结构域和任选地Fc结构域(或其部分)的分子对抗原和/或FcγR的动力学参数的示范性的测定包括以下：将第一抗原固定在传感器芯片表面的四个流动小室之一上，优选的通过胺偶合化学作用，从而所述第一抗原的约5000个应答单位(RU)被固定在表面上。制备了合适表面之后，使免疫特异性地识别所述第一抗原的本发明的分子通过所述表面，优选的通过以5μL/mL的流速、20μg/mL溶液的一分钟注射。这一阶段结合到表面的本发明的分子的水平通常在400至700RU之间。然后，将HBS-P缓冲液(20mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA，pH 7.5)中第二抗原(如，FcγR)或FcγR受体的系列稀释以100μL/min注射到表面上。不同的第二抗原或受体稀释之间的分子再生优选通过100mM NaHCO3pH 9.4；3M NaCl的单次5秒注射来进行。本领域已知的任何再生技术涵盖在本发明的方法内。
收集到完整的数据集之后，使用由SPR仪器厂家，例如BIAcore，Inc.(Piscataway，NJ)提供的计算机算法将产生的结合曲线全局拟合。这些算法计算Kon和Koff，从中推出作为两个速率常数的比例(即，Koff/Kon)的表观平衡结合常数Kd。如何产生单独的速率常数的更详细的处理可以在BIAevaluaion软件手册(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)中找到。使用本领域已知的任何方法可以对产生的数据进行分析。解释所产生的动力学数据的各种方法的综述，参见Myszka(1997)“Kinetic Analysis Of MacromolecularInteractions Using Surface Plasmon Resonance Biosensors(使用表面等离子共振生物传感器动力学分析大分子相互作用)”Current Opinion inBiotechnology 8：50-7；Fisher等人(1994)“Surface Plasmon Resonance BasedMethods For Measuring The Kinetics And Binding Affinities Of BiomolecularInteractions(为了测量大分子相互作用的动力学和结合亲和性的基于表面等离子共振的方法)”Current Opinion in Biotechnology 5：389-95；O′Shannessy(1994)“Determination Of Kinetic Rate And Equilibrium BindingConstants For Macromolecular Interactions：A Critique Of The SurfacePlasmon Resonance Literature(确定大分子相互作用的动力学速率和平衡结合常数：对表面等离子共振文献的评论)”Current Opinion in Biotechnology，5：65-71；Chaiken等人(1992)“Analysis Of Macromolecular InteractionsUsing Immobilized Ligands(使用固定的配体分析大分子相互作用)”Analytical Biochemistry，201：197-210；Morton等人(1995)“InterpretingComplex Binding Kinetics From Optical Biosensors：A Comparison OfAnalysis By Linearization，The Integrated Rate Equation，And NumericalIntegration(从光学生物传感器解释复合物结合动力学：比较由线性化、积分的速率方程和数字积分分析)”Analytical Biochemistry 227：176-85；O′Shannessy等人，1996，Analytical Biochemistry 236：275-83；所有文献都通过引用全文并入本文。
在优选的实施方案，使用SPR分析例如BIAcore确定的动力学参数可以用作本发明的分子在功能测定例如ADCC中如何起作用的预示性量度。根据从SPR分析获得的动力学参数预测本发明的分子的效力的示例性的方法可以包括以下：确定本发明的分子对FcγRIIIA和FcγRIIB的结合(经由表位结合结构域和/或Fc结构域(或其部分))的Koff值；相对ADCC数据绘制(1)FcγRIIIA的Koff(wt)/Koff(mut)；(2)FcγRIIB的Koff(mut)/Koff(wt)。比1高的数字显示了相对于野生型、对FcγRIIIA降低的解离速率和对FcγRIIB升高的解离速率；并具有增强的ADCC功能。
5.5产生本发明双抗体分子的方法
本发明双抗体分子可使用本领域公知的多种方法产生，包括从头合成蛋白和重组表达编码结合蛋白的核酸。期望的核酸序列可通过重组方法(如，PCR诱变之前制备的期望多核苷酸的变体)或通过固相合成DNA而产生。通常使用重组表达方法。一方面，本发明提供包含编码CD16AVH和/或VL的序列的多核苷酸；在另一方面，本发明提供包含编码CD32B VH和/或VL的序列的多核苷酸。由于遗传密码的简并性，多种核酸序列编码每种免疫球蛋白氨基酸序列，本发明包括编码本文所述结合蛋白的所有核酸。
5.5.1编码本发明分子的多核苷酸.
本发明还包括编码本发明的分子的多核苷酸，所述分子包括多肽和抗体。通过本领域已知的任何方法可以获得编码本发明的分子的多核苷酸，确定所述多核苷酸的核苷酸序列。
确定了通过本发明的方法鉴定的分子的核苷酸序列之后，可以使用本领域公知的方法操作该核苷酸序列，例如，重组DNA技术、定点诱变、PCR等等(参见，例如，在Sambrook等人，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第3版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等人编辑，1998，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，John Wiley & Sons，NY中描述的技术，通过引用将它们全文并入本文)，通过例如产生氨基酸取代、缺失和/或添加来产生，例如，具有不同氨基酸序列的抗体。
在一个实施方案，本领域中可用的人类文库或任何其他文库可以通过本领域已知的标准技术来筛选，以克隆编码本发明的分子的核酸。
5.5.2重组表达本发明的分子
获得了编码本发明的分子(例如，抗体)的核酸序列之后，可以使用本领域公知的技术通过DNA重组技术产生用于生产该分子的载体。本领域技术人员公知的方法可用于构建表达载体，所述表达载体含有本发明的分子的编码序列和合适的转录和翻译控制信号。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成的技术和体内遗传重组。(参见，例如在Sambrook等人，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等人编辑，1998，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，John Wiley & Sons，NY中描述的技术)。
包含通过本发明的方法鉴定的分子的核苷酸序列的表达载体，可以通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)转移到宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞来产生本发明的分子。在特定的实施方案，本发明的分子的表达受到组成型、诱导型、或组织特异性启动子的调节。
用于表达通过本发明的方法鉴定的分子的宿主细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌，或优选地真核细胞，特别是对于完全重组免疫球蛋白分子的表达。特别地，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，以及载体，例如来自人类巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件，是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking等人(1986)“Powerful And VersatileEnhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors(用于哺乳动物表达载体的有效和通用增强子-启动子单元)”Gene 45：101-106；Cockett等人(1990)“High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of MetalloproteinasesIn Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase GeneAmplification(使用谷氨酰胺合成酶基因扩增在中国仓鼠卵巢细胞中高水平表达金属蛋白酶的组织抑制剂)”Biotechnology 8：662-667)。
可以利用各种宿主-表达载体系统来表达通过本发明的方法鉴定的分子。这种宿主-表达系统代表载体，通过所述载体可以产生和随后纯化本发明的分子的编码序列，还代表细胞，当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，所述细胞可以原位表达本发明的分子。这些包括但不限于，用含有通过本发明的方法鉴定的分子的编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有编码本发明的方法鉴定的分子的序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母)；用含有编码本发明的方法鉴定的分子的序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有编码本发明的方法鉴定的分子的序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV)感染的，或重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利第5,807,715号)、Per C.6细胞(由Crucell开发的人类视网膜细胞)，所述构建体含有来自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。
在细菌系统中，取决于要表达的分子的预定用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量的这种蛋白，用于抗体的药物组合物的生产时，指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体是期望的。这种载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Rüther等人(1983)“Easy Identification Of cDNA Clones(容易地鉴定cDNA克隆)”EMBO J.2：1791-1794)，其中抗体编码序列可以与lac Z编码区符合读框地单独连接到载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye等人(1985)“Up-PromoterMutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli(大肠杆菌lpp基因中启动子上游的突变)”Nucleic Acids Res.13：3101-3110；Van Heeke等人(1989)“Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli(在大肠杆菌中表达人类天冬酰胺合成酶)”J.Biol.Chem.24：5503-5509)；等等。pGEX载体也可以用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般地，这种融合蛋白是可溶的，通过吸附和结合到基质谷胱甘肽-琼脂糖珠，随后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱，可以容易地从裂解的细胞纯化。pGEX载体被设计以包括凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶裂解位点，从而克隆的目标基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)被用作载体来表达外源基因。病毒在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可以单独地克隆到病毒的非关键区(例如，多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，感兴趣的抗体编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三联的前导序列。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组。在病毒基因组的非关键区(例如，区域E1或E3)中的插入将产生存活的和能在感染的宿主中表达免疫球蛋白分子的重组病毒(例如参见，Logan等人(1984)“AdenovirusTripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late AfterInfection(腺病毒三联前导序列在感染后晚期增强mRNA的翻译)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。特定的起始信号也可能是插入的抗体编码序列的有效翻译所需的。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框相符以确保翻译完整的插入物。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，天然的和合成的。通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子，等等，可以增强表达的效力(参见，Bitter等人(1987)“Expression And SecretionVectors For Yeast(用于酵母的表达和分泌载体)”Methods in Enzymol.153：516-544)。
此外，可以选择宿主细胞株，其调节插入的序列的表达，或以期望的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能可能是重要的。例如，在某些实施方案，包含本发明的双抗体分子的多肽可能表达为单基因产物(如，作为单个多肽链，即，作为多蛋白前体)，要求由天然或重组细胞机制的蛋白水解性裂解以形成本发明双抗体分子的单独多肽。因此，本发明涵盖工程化核酸序列以编码包含本发明的多肽的多蛋白前体分子，所述核酸序列包括能够指导所述多蛋白前体的翻译后裂解的编码序列。多蛋白前体的翻译后裂解形成本发明的多肽。包含本发明的多肽的前体分子的翻译后裂解可在体内发生(即，在宿主细胞中由天然或重组细胞系统/机制，如，弗林蛋白酶在合适的位点裂解)或在体外发生(如，在包含已知活性的蛋白酶或肽酶的组合物和/或包含已知促进期望的蛋白水解作用的条件或试剂的组合物中培养所述多肽链)。重组蛋白的纯化和修饰是本领域公知的，以使多蛋白前体的设计可包括本领域技术人员易于理解的许多实施方案。本领域已知的任何已知蛋白酶或肽酶可用于前体分子的期望修饰，如，凝血酶(其识别氨基酸序列LVPR^GS(SEQ ID NO：91))、或凝血因子Xa(其识别氨基酸序列I(E/D)GR^(SEQ ID NO：92)(Nagai等人(1985)“Oxygen Binding PropertiesOf Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli(大肠杆菌中合成的人类突变血红蛋白的氧结合性质)”Proc.Nat.Acad.Sci.USA82：7252-7255，并综述于Jenny等人(2003)“A Critical Review Of TheMethods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa(用凝血酶和凝血因子Xa裂解融合蛋白的方法的重要综述)”Protein Expr.Purif.31：1-11，全部通过引用全文并入本文))、肠激酶(其识别氨基酸序列DDDDK^(SEQ ID NO：93)(Collins-Racie等人(1995)“Production OfRecombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli UsingThe Novel Secretory Fusion Partner DsbA (使用新型分泌融合伴侣DsbA在大肠杆菌中产生重组牛肠激酶催化亚基)”Biotechnology 13：982-987，在此通过引用全文并入本文))、弗林蛋白酶(其识别氨基酸序列RXXR^，优先识别RX(K/R)R^(分别是SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95)(P6位置另外的R表现为增强裂解))、和AcTEV(其识别氨基酸序列ENLYFQ^G(SEQID NO：96)(Parks等人(1994)“Release Of Proteins And Peptides FromFusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase(使用重组植物病毒蛋白酶从融合蛋白释放蛋白和肽)”Anal.Biochem.216：413-417，在此通过引用全文并入本文))和口蹄疫病毒蛋白酶C3。参见例如上述6.4节。
不同的宿主细胞对于翻译后加工和蛋白与基因产物的修饰具有特征性和特定的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统来确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用真核的宿主细胞，其具有用于原始转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。
对于长期的、高产量的重组蛋白质生产，稳定的表达是优选的。例如，可以工程化稳定表达本发明的抗体的细胞系。不使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用由适合的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸位点，等等)控制的DNA和选择标记来转化宿主细胞。在导入外源DNA之后，可以容许工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转移到选择培养基。重组质粒中的选择标记赋予了对选择的抗性，容许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中，并生长形成聚集(foci)，其随后可被克隆和扩大成细胞系。这种方法可以有利地用于工程化表达本发明的抗体的细胞系。这种工程化的细胞系在筛选和评估与本发明的分子直接或间接作用的化合物中是特别有用的。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯性疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人(1977)“Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine KinaseGene To Cultured Mouse Cells(转移纯化的单纯性疱疹病毒胸苷激酶基因到培养的小鼠细胞中)”Cell 11：223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska等人(1992)“Use Of The HPRT Gene And The HAT SelectionTechnique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells：First StepsToward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy(在DNA-介导的转化哺乳动物细胞中使用HPRT基因和HAT筛选技术：朝向开发杂交瘤技术和基因治疗的第一步)”Bioessays 14：495-500)、和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人(1980)“Isolation Of Transforming DNA：Cloning TheHamster aprt Gene(分离转化DNA：克隆仓鼠aprt基因)”Cell 22：817-823)基因，可以分别应用于tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞。并且，抗代谢物抗性可以用作以下基因的筛选的基础：dhfr，其赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler等人(1980)“Transformation Of Mammalian Cells With AnAmplifiable Dominant-Acting Gene(以可扩增的显性作用基因转化哺乳动物细胞)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567-3570；O′Hare等人(1981)“Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By ARecombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase(由表达原核细胞二氢叶酸还原酶的重组质粒转化小鼠成纤维细胞对氨甲喋呤的抗性)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527-1531)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等人(1981)“Selection For Animal Cells That Express TheEscherichia coli Gene Coding For Xanthine-GuaninePhosphoribosyltransferase(筛选表达编码黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的大肠杆菌基因的动物细胞)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-2076)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Tolstoshev(1993)“Gene Therapy，Concepts，Current Trials And Future Directions(基因治疗的概念、目前的试验和未来方向)”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science Of Gene Therapy(基因治疗的基本原理)”Science260：926-932；和Morgan等人(1993)“Human Gene Therapy(人类基因治疗)”Ann.Rev.Biochem.62：191-217)、和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人(1984)“Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin BAnd G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells(表达潮霉素B和G418抗性的原核细胞基因作为小鼠L细胞中的显性筛选标记)”Gene 30：147-156)。可以使用的重组DNA技术领域通常已知的方法是Ausubel等人(编辑)，1993，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，John Wiley & Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual(基因转移和表达的实验室手册)，StocktonPress，NY；和Dracopoli等人(编辑)，1994，Current Protocols in Human Genetics(人类遗传学最新方案)的第12和13章，John Wiley & Sons，NY.；Colberre-Garapin等人(1981)“A New Dominant Hybrid Selective Marker ForHigher Eukaryotic Cells(用于更高等真核细胞的新的显性杂合筛选标记)”J.Mol.Biol.150：1-14中描述的。
通过载体扩增(对于综述，参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning(在DNA克隆中，使用基于基因扩增的载体以在哺乳动物细胞中表达克隆的基因).第3卷(Academic Press，NewYork，1987)，可以增加本发明的分子的表达水平。当表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的时，宿主细胞的培养物中存在的抑制物水平的增加将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与双抗体分子的多肽的核苷酸序列相连，多肽的产生也将增加(Crouse等人(1983)“Expression AndAmplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes(表达和扩增工程化的小鼠二氢叶酸还原酶小基因)”Mol.Cell.Biol.3：257-266)。
可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码双抗体分子的第一多肽，第二载体编码双抗体分子的第二多肽。两种载体可以含有相同的选择标记，其允许两种多肽的等量表达。作为选择，可以使用编码两种多肽的单个载体。本发明的分子的多肽的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。
重组表达了本发明的分子(即，双抗体)之后，它可以通过本领域已知用于纯化多肽、多蛋白或双抗体的任何方法(如，类似于基于抗原选择性的抗体纯化方案)来纯化，例如，通过色谱(例如，离子交换、亲和性、特别是通过对特定抗原的亲和性(任选地当双抗体分子包含Fc结构域(或其部分)时在蛋白A筛选后)，和尺寸柱色谱)、离心、差异溶解，或通过用于纯化多肽、多蛋白或双抗体的任何其他标准技术。
5.6预防和治疗方法
本发明的分子特别有用于治疗和/或预防其中期望FcγR介导的效应细胞功能(如，ADCC)的疾病、病症或感染(如，癌症、传染病)。如上讨论的，本发明的双抗体在引发效应物功能方面可展现抗体-样功能，尽管双抗体分子不包含Fc结构域。通过包含至少一个免疫特异性地识别FcγR的表位结合结构域，双抗体分子可展现类似于Fc-FcγR相互作用的FcγR结合和活性。例如，本发明的分子可能结合免疫效应细胞(如，NK细胞)上的细胞表面抗原和FcγR(如，FcγRIIIA)，刺激针对所述细胞的效应物功能(如，ADCC、CDC、吞噬作用、调理作用等等)。
在其他实施方案，本发明的双抗体分子包含Fc结构域(或其部分)。在这种实施方案，Fc结构域可进一步包含相对于野生型Fc结构域(或其部分)的至少一个氨基酸修饰和/或可包括来自一种或多种IgG同种型(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的结构域。本发明的包含变体Fc结构域的分子相对于包含野生型Fc结构域的分子可展现赋予的或改变的表型，诸如改变的或赋予的效应物功能活性(如，在NK依赖性或巨噬细胞依赖性测定中测定的)。在所述实施方案，本发明的具有赋予的或改变的效应物功能活性的分子可用于治疗和/或预防其中期望增强效力的效应物功能活性的疾病、病症或感染。在某些实施方案，包含Fc结构域(或其部分)的本发明双抗体分子介导补体依赖性级联。鉴定为改变效应物功能的Fc结构域变体公开于国际申请WO04/063351、美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514、2004年11月10日提交的美国临时申请60/626,510、2004年12月15日提交的60/636,663、和2006年3月10日提交的60/781,564、2005年11月10日提交的美国专利申请11/271,140、2005年12月15日提交的11/305,787，这些是本发明人的同时申请，所有这些通过引用全文并入本文。
本发明涵盖在受治疗者治疗、预防或控制癌症的方法和组合物，包括向受治疗者施用治疗有效量的包含一种或多种表位结合位点和任选地根据本发明工程化的Fc结构域(或其部分)的一种或多种分子，该分子进一步结合癌抗原。本发明的分子特别有用于预防、抑制、减少生长或消退原代肿瘤、癌症细胞转移灶和传染病。虽然不希望受特定作用机制的限制，本发明的分子介导效应物功能，导致清除肿瘤、减少肿瘤或其组合。在替代实施方案，本发明的双抗体通过交联细胞表面抗原和/或受体和增强凋亡或负生长调控信号传导而介导治疗活性。
虽然不希望受特定作用机制的限制，本发明的双抗体分子相对于本领域已知的治疗性抗体展现增强的治疗效力，部分地由于双抗体免疫特异性地结合以减少的水平表达特定抗原(如，FcγR)的靶细胞的能力，例如借助由于双抗体-表位相互作用的改进的亲和力，双抗体保持在靶细胞上时间更长的能力。
具有对抗原(如，FcγR)增强的亲和性和亲和力的本发明的双抗体特别有用于在受治疗者治疗、预防或控制癌症或另一种疾病或病症，其中FcγR在靶细胞群中以低水平表达。如在此使用的，FcγR在细胞中的表达定义为如使用本领域技术人员已知的常用方法测量的关于这种分子在每细胞中  的密度。包含多个表位结合位点和任选地FcγR(或其部分)的本发明的分子优选地在以30,000至20,000分子/细胞的密度、以20,000至10,000分子/细胞的密度、以10,000分子/细胞或更少的密度、以5000分子/细胞或更少的密度、或以1000分子/细胞或更少的密度表达靶抗原(如，癌抗原)的细胞中还具有赋予的或增强的亲和力和亲和性和/或效应物功能。本发明的分子在治疗、预防或控制亚群中的疾病或病症诸如癌症中有特别的效用，其中靶抗原在靶细胞群中以低水平表达。
本发明的分子也可以有利地与本领域已知用于疾病诸如癌症、自身免疫疾病、炎性病症或传染病的治疗或预防的其他治疗剂一同使用。在特定的实施方案，本发明的分子可以与单克隆或嵌合抗体、淋巴因子或造血生长因子(例如，IL-2、IL-3和IL-7)组合使用，它们例如被用来提高与所述分子相互作用的效应细胞的数目或活性，和提高免疫应答。本发明的分子也可以有利地与用于治疗疾病、病症或感染的药物组合使用，例如抗癌剂、抗炎剂或抗病毒剂，例如以下的5.7节中详述的。
5.6.1癌症
本发明涵盖用于在受治疗者中治疗或预防癌症的方法和组合物，包括向受治疗者施用治疗有效量的包含多个表位结合结构域的一种或多种分子。在一些实施方案，本发明涵盖在具有FcγR多态性的受治疗者，例如对fγRIIIA-158V或FcγRIIIA-158F等位基因纯合的那些受治疗者中治疗或预防癌症的方法和组合物。在一些实施方案，本发明涵盖工程化双抗体分子的至少一个表位结合结构域以免疫特异性地结合FcγRIIIA(158F)。在其他实施方案，本发明涵盖工程化双抗体分子的至少一个表位结合结构域以免疫特异性地结合FcγRIIIA(158V)。
标准单克隆抗体疗法的效力取决于受治疗者的FcγR多态性(Cartron等人(2002)“Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 MonoclonalAntibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcRIIIa Gene(人源化抗CD20单克隆抗体的治疗活性与IgG Fc受体FcRIIIa基因的多态性)”Blood99：754-758；Weng等人(2003)“Two Immunoglobulin G Fragment C ReceptorPolymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients WithFollicular Lymphoma(两种免疫球蛋白G片段C受体多态性独立地预测在滤泡性淋巴瘤患者对利妥昔单抗的响应)”J Clin Oncol.21(21)：3940-3947，通过引用将这两篇全文并入本文)。这些受体在效应细胞表面表达并介导ADCC。低亲和性活化受体的高亲和性等位基因改善效应细胞介导ADCC的能力。不同于依赖于Fc-FcγR相互作用来引起效应物功能，本发明的方法涵盖工程化分子以免疫特异性地识别低亲和性活化受体，容许为了特定多态性来设计分子。可选地或另外地，本发明的分子可被工程化为包含对效应细胞上的FcγR展现增强的亲和性的变体Fc结构域(相对于野生型Fc结构域)。本发明的工程化的分子为患者提供了更好的免疫治疗剂，而不论患者的FcγR多态性。
使用培养的细胞系或来源于患者的PMBC细胞通过ADCC测试根据本发明工程化的双抗体分子，来确定Fc突变增强ADCC的能力。使用本文公开的方法进行标准的ADCC。使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)从外周血收集淋巴细胞。用铕(PerkinElmer)加载靶细胞即，培养的细胞系或来源于患者的细胞，在37℃与效应物孵育4h。使用荧光板读数器(Wallac)检测释放的铕。产生的ADCC数据表明本发明的分子触发NK细胞介导的细胞毒性的效力，并确定了哪些分子可以用患者样品和淘析的单核细胞来测试。然后使用来自患者的PBMC在ADCC测定中测试显示了引发ADCC活性的最大可能性的双抗体分子。来自健康供者的PBMC用作效应细胞。
因此，本发明提供了预防或治疗以癌抗原为特征的癌症的方法，通过根据本发明工程化双抗体分子以免疫特异性地识别所述癌抗原以使双抗体分子本身是细胞毒性的(如，经由交联表面受体，导致凋亡增加或下调增殖信号)和/或包括Fc结构域、和/或介导一种或多种效应物功能(如，ADCC、吞噬作用)。已根据本发明工程化的双抗体可用于预防或治疗癌症，因为其具有细胞毒性活性(如，增强的肿瘤细胞杀伤和/或增强的例如ADCC活性或CDC活性)。
与癌抗原相关的癌症可以通过施用双抗体来治疗或预防，所述双抗体结合癌抗原并且是细胞毒性的，和/或已经根据本发明的方法工程化以展现效应物功能。例如而不是为了限制，与以下癌抗原相关的癌症可以通过本发明的方法和组合物来治疗或预防：KS 1/4泛癌抗原(Perez等人(1989)“Isolation And Characterization Of A Cdna Encoding The Ks1/4 EpithelialCarcinoma Marker(分离和表征编码Ks1/4上皮癌标记物的cDNA)”  J.Immunol.142：3662-3667；
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等人(1991)“Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human TLymphocytes(双特异性单克隆抗体指导由活化的人类T淋巴细胞裂解卵巢癌细胞)”Cancer Immunol.Immunothe r.33(4)：210-216)、卵巢癌抗原(CA125)(Yu等人(1991)“Coexpression Of Different Antigenic Markers On MoietiesThat Bear CA 125 Determinants(在携带CA 125决定簇的部分上共表达不同抗原性标记物)”Cancer Res.51(2)：468-475)、前列腺酸磷酸盐(Tailor等人(1990)“Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid PhosphataseDetermined From A Full-Length cDNA Clone(从全长cDNA克隆确定的人类前列腺酸磷酸酶的核苷酸序列)”Nucl.Acids Res.18(16)：4928)、前列腺特异性抗原(Henttu等人(1989)“cDNA Coding For The Entire Human ProstateSpecific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue KallikreinGenes(编码完全人类前列腺特异性抗原的cDNA显示对人类组织血管舒缓素基因的高度同源性)”Biochem.Biophys.Res.Comm.10(2)：903-910；Israeli等人(1993)“Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding AProstate-Specific Membrane Antigen(编码前列腺特异性膜抗原的互补DNA的分子克隆)”Cancer Res.53：227-230)、黑素瘤相关抗原p97(Estin等人(1989)“Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels OfHuman Melanoma-Associated Antigen p97(表达不同水平的人类黑素瘤相关抗原p97的转染的小鼠黑素瘤系)”J.Natl.Cancer Instit.81(6)：445-454)、黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等人(1990)“The Melanoma Antigen Gp75 IsThe Human Homologue Of The Mouse B(Brown)Locus Gene Product(黑素瘤抗原Gp75是小鼠B(Brown)基因座基因产物的人类同系物)”J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)、高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等人(1987)“Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary AndMetastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its PossiblePrognostic Significance(由单克隆抗体140.240免疫组化检测人类原代和转移的黑素瘤中的抗原和其可能的预后重要性)”Cancer 59：55-63；Mittelman等人(1990)“Active Spesific Immunotherapy In Patients With Melanoma.AClinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited WithSyngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated AntigenMonoclonal Antibodies(在黑素瘤患者中的活性特异性免疫疗法。以小鼠抗独特型单克隆抗体的临床试验引发同基因的抗高分子量-黑素瘤-相关抗原单克隆抗体)”J.Clin.Invest.86：2136-2144))、前列腺特异性膜抗原、癌胚抗原(CEA)(Foon等人(1995)“Immune Response To The CarcinoembryonicAntigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine(以抗独特型抗体疫苗治疗的患者中对癌胚抗原的免疫应答)”J.Clin.Invest.96(1)：334-42)、多态性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、结肠直肠肿瘤相关抗原诸如：CEA、TAG-72(Yokota等人(1992)“Rapid Timor PenetrationOf A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms(单链Fv的快速肿瘤渗透并与其他免疫球蛋白形式比较)”Cancer Res.52：3402-3408)、CO17-1A(Ragnhammar等人(1993)“Effect Of MonoclonalAntibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced ColorectalCarcinoma-Long-Lasting，Complete Remissions Can Be Induced(单克隆抗体17-1A和GM-CSF在患有晚期结肠直肠癌的患者中的效应-可诱导长期、完全的缓解)”Int.J.Cancer 53：751-758)；GICA 19-9(Herlyn等人(1982)“Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen.I.Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal，Gastric，AndPancreatic Carcinoma(循环肿瘤相关抗原的单克隆抗体检测。I.结肠直肠癌、胃癌和胰腺癌患者的血清中抗原的存在)”J.Clin.Immunol.2：135-140)、CTA-1和LEA、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、CD19(Ghetie等人(1994)“Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines InVitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest(抗CD19通过诱导细胞周期阻滞而体外抑制人类B-细胞肿瘤细胞系的生长和SCID小鼠中Daudi细胞的生长)”Blood 83：1329-1336)、人类B-淋巴瘤抗原-CD20(Reff等人(1994)“Depletion Of B Cells In Vivo By A ChimericMouse Human Monoclonal Antibody To CD20(与CD20的嵌合小鼠人类单克隆抗体体内清除B细胞)”Blood 83：435-445)、CD33(Sgouros等人(1993)“Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195(Anti-CD33) InAcute Myelogenous Leukemia(在急性骨髓性白血病中建模和放射量测定单克隆抗体M195(抗CD33))”J.Nucl.Med.34：422-430)、黑素瘤特异性抗原例如神经节苷脂GD2(Saleh等人(1993)“Generation Of A HumanAnti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen(产生模拟GD2抗原的人类抗独特型抗体)”T.Immunol.，151，3390-3398)、神经节苷脂GD3(Shitara等人(1993)“A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3)Antibody With Enhanced Antitumor Activities(具有增强的抗肿瘤活性的一种小鼠/人类嵌合抗(神经节苷脂GD3)抗体)”Cancer Immunol.Immunother.36：373-380)、神经节苷脂GM2(Livingston等人(1994)“Improved SurvivalIn Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies：A Randomized Trial OfAdjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside(以GM2抗体改善III期黑素瘤患者的存活：以GM2神经节苷脂佐剂接种的随机化试验)”J.Clin.Oncol.12：1036-1044)、神经节苷脂GM3(Hoon等人(1993)“Molecular Cloning OfA Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen OnHuman Cancers(对人类癌症上的神经节苷脂GM3抗原反应性的人类单克隆抗体的分子克隆)”Cancer Res.53：5244-5250)、细胞表面抗原的肿瘤特异性移植类型(TSTA)诸如病毒诱导的肿瘤抗原，包括T抗原DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原，癌胚抗原-甲胎蛋白例如结肠的CEA、膀胱肿瘤癌胚抗原(
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等人(1985)“Monoclonal Antibodies To CellSurface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas(针对化学诱导的小鼠膀胱癌共有的细胞表面抗原的单克隆抗体)”Cancer.Res.45：2210-2188)、分化抗原，例如人类肺癌抗原L6、L20(
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等人(1986)“Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human LungCarcinoma(针对人类肺癌产生的单克隆小鼠抗体)”Cancer Res.46：3917-3923)、纤维肉瘤的抗原、人类白血病T细胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等人(1988)“Idiotype Vaccines Against Human TCell Leukemia.II.Generation And Characterization Of A Monoclonal IdiotypeCascade(Ab1，Ab2，andAb3) (针对人类T细胞白血病的独特型疫苗。II.产生和表征单克隆独特型级联(Ab1、Ab2和Ab3))”J.Immunol.141：1398-1403)、新糖蛋白、鞘脂类、乳癌抗原例如EGFR(表皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)、多态上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens等人(1992)“Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-ModulatingProperty(细胞膜相关的粘蛋白和其粘附调节性)”Trends in Biochem.Sci.17：359-363)、恶性人类淋巴细胞抗原-APO-1(Trauth等人(1989)“Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction OfApoptosis(单克隆抗体-介导的由凋亡引起的肿瘤消退)”Science245：301-304)、分化抗原(Feizi(1985)“Demonstration By MonoclonalAntibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids AreOnco-Developmental Antigens(单克隆抗体证实，糖蛋白和糖脂的糖类结构是肿瘤发育抗原)”Nature 314：53-57)诸如胎儿红细胞和原内胚层中发现的I抗原、胃腺癌中发现的I(Ma)、乳腺上皮细胞中发现的M18和M39、髓样细胞中发现的SSEA-1、结肠直肠癌症中发现的VEP8、VEP9、My1、VIM-D5和D156-22、TRA-1-85(血型H)、结肠腺癌中发现的C14、肺腺癌中发现的F3、胃癌中发现的AH6、Y半抗原、胚胎癌细胞中发现的Ley、TL5(血型A)、A431细胞中发现的EGF受体、胰腺癌中发现的E1系列(血型B)、胚胎癌细胞、胃腺癌中发现的FC10.2、腺癌中发现的CO-514(血型Lea)、腺癌中发现的NS-10、CO-43(血型Leb)、G49、EGF受体、结肠腺癌中发现的(血型ALeb/Ley)、结肠癌中发现的19.9、胃癌粘蛋白、髓样细胞中发现的T5A7、黑素瘤中发现的R24、胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1：22：25：8和4-8细胞分裂期胚中发现的SSEA-3、SSEA-4。在另一个实施方案，抗原是来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生的肽(参见Edelson(1998)“Cutaneous T-CellLymphoma：A Model For Selective Immunotherapy(皮肤T细胞淋巴瘤：选择性免疫治疗的模型)”Cancer J Sci Am.4：62-71)。
可以通过本发明的方法和组合物治疗或预防的癌症和相关的病症包括但不限于以下：白血病，包括但不限于急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病，例如成髓细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性、红白血病白血病和脊髓发育不良综合征，慢性白血病，例如但不限于，慢性的髓细胞的(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于郁积多发性骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、骨硬化的骨髓瘤、浆细胞性白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；未确定显著性的单克隆的丙种球蛋白病；良性的单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨骼和结缔组织肉瘤，例如但不限于，骨骼肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，包括但不限于，胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、非胶质细胞瘤(nonglial tumor)、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、成松果体细胞瘤、原发脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于，腺癌、小叶(小细胞)癌、管内癌、髓质乳腺癌、粘质乳腺癌、管性乳腺癌、乳头乳腺癌、佩吉特病和炎性的乳腺癌；肾上腺癌症，包括但不限于，嗜铬细胞瘤(pheochromocytom)和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于，乳头状的或滤泡性甲状腺癌、髓质甲状腺癌和退行的甲状腺癌；胰腺癌，包括但不限于，胰岛瘤、胃泌素瘤、胰升血糖素瘤、舒血管肠肽瘤、促生长素释放抑制因子分泌肿瘤、和类癌瘤或胰岛细胞瘤；垂体癌症，包括但不限于，库兴氏病、分泌促黄体分泌素的肿瘤、肢端肥大症和尿崩症(diabetesinsipius)；眼癌症，包括但不限于，眼黑素瘤，例如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤和睫状体黑素瘤(cilliary body melanoma)，和成视网膜细胞瘤；阴道的癌症，包括但不限于，鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤；阴部癌症，包括但不限于，鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和佩吉特病；子宫颈癌症，包括但不限于，鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，包括但不限于，子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌症，包括但不限于，卵巢上皮癌、交界瘤、生殖细胞肿瘤和基质肿瘤；食管癌症，包括但不限于，鳞状癌症、腺癌、腺样囊性癌(adenoid cyctic carcinoma)、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦形细胞(小细胞)癌；胃癌，包括但不限于，腺癌、真菌样生长(息肉样)、溃烂、浅表散布、广泛地散布、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，包括但不限于肝细胞癌和肝胚细胞瘤，胆囊癌症，包括但不限于腺癌；胆管细胞癌，包括但不限于，乳头状(pappillary)、结节的和弥散的；肺癌，包括但不限于，非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌症，包括但不限于，生殖肿瘤、精原细胞瘤、退性发育的、经典的(典型的)、精细胞的、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、恶性合胞体瘤(卵黄囊肿瘤)、前列腺癌症，包括但不限于，腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；penal癌症(penal cancer)；口腔癌，包括但不限于，鳞状细胞癌；基底癌症；唾液腺癌症，包括但不限于，腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，包括但不限于，鳞状细胞癌症和疣；皮肤癌，包括但不限于，基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤，浅表散布黑素瘤、结节的黑素瘤、斑点恶性黑色素瘤、肢端的斑点的黑素瘤；肾癌，包括但不限于，肾细胞癌症、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管(uterer))；维尔姆斯肿瘤；膀胱癌，包括但不限于，移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤、骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(这些疾病的综述，参见Fishman等人(1985)Medicine(药物学)，第2版，J.B.LippincottCo.，Philadelphia；和Murphy等人(1997)Informed Decisions：The Complete Book of Cancer Diagnosis，Treatment，and Recovery(知情决定：癌症诊断、治疗和恢复大全)，Viking Penguin，Penguin Books U.S.A.，Inc.，United Statesof America)。
因此，本发明的方法和组合物在各种癌症或其他异常增殖性疾病的治疗或预防中也是有用的，包括(但不限于)以下：癌，包括膀胱、乳腺、结肠、肾脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、宫颈、甲状腺和皮肤的癌；包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burketts lymphoma)；骨髓谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性粒性白血病和早幼粒细胞性白血病；间质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌(tetratocarcinoma)、成神经细胞瘤和胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤和许旺氏细胞瘤；间质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤(fibrosafcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarama)和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病(xenodermapegmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原细胞瘤、甲状腺滤泡性癌症和畸胎癌。还预期的是由细胞凋亡中的畸变引起的癌症也将通过本发明的方法和组合物来治疗。这些癌症可以包括但不限于，滤泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌、乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤，和癌前期病变，例如家族性腺瘤息肉病，和脊髓发育不良综合征。在特定的实施方案，卵巢、膀胱、乳腺、结肠、肺、皮肤、胰腺或子宫中的恶性肿瘤或异常增殖变化(例如组织化生和发育异常)，或过度增殖性病症，通过本发明的方法和组合物来治疗或预防。在其他特定实施方案，肉瘤、黑素瘤或白血病通过本发明的方法和组合物来治疗或预防。
在特定的实施方案，相对于不存在本发明的所述分子的情况下癌细胞的生长，本发明的分子(例如，包含多个表位结合结构域以及任选地Fc结构域(或其部分)的双抗体)抑制或减少癌细胞的生长至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％。
在特定实施方案，本发明的分子(如，包含多个表位结合结构域以及任选地Fc结构域(或其部分)的双抗体)比母体分子在杀伤细胞或抑制或减少癌细胞的生长方面好至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
5.6.2自身免疫疾病和炎性疾病
在一些实施方案，本发明的分子包含根据本发明的方法工程化的对FcγRIIB特异性的表位结合结构域和/或变体Fc结构域(或其部分)，所述Fc结构域相对于野生型Fc结构域展现对FcγRIIB更大的亲和性和对FcγRIIIA和/或FcγRIIA减少的亲和性。带有这种结合特征的本发明的分子可用于调节免疫应答，如，抑制与自身免疫疾病或炎性疾病相关的免疫应答。虽然不希望受任何作用机制的限制，具有对FcγRIIB的亲和性和/或包含具有对FcγRIIB增加的亲和性和对FcγRIIIA和/或FcγRIIA减少的亲和性的Fc结构域的本发明的分子可引起对FcγR的活化应答的阻抑并抑制细胞响应性，并因此具有治疗和/或预防自身免疫病症的治疗效力。
本发明还提供了在受治疗者中预防、治疗或控制与炎性病症相关的一种或多种症状的方法，进一步包括向所述受治疗者施用治疗或预防有效量的一种或多种抗炎剂。本发明还提供了预防、治疗或控制与自身免疫疾病相关的一种或多种症状的方法，进一步包括向所述受治疗者施用治疗或预防有效量的一种或多种免疫调节剂。5.7节提供了抗炎剂和免疫调节剂的非限制性实例。
可以通过施用本发明的分子治疗的自身免疫病症的实例包括但不限于，斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自体免疫阿狄森病、肾上腺的自身免疫疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫卵巢炎和睾丸炎、自身免疫血小板减少、贝切特病、大疱性类天疱疮、心肌炎、腹口炎性皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘多神经病、丘-施二氏综合征、疤痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克隆氏病、盘状狼疮、基本混合的冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、血管球性肾炎、格雷夫斯病、格-巴二氏病、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫瘢(ITP)、IgA神经病、少年关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、梅尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、多发性结节性动脉炎、多软骨炎(polychrondritis)、多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发丙种球蛋白缺乏症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、莱特尔综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮症、斯耶格伦综合征、全身肌强直综合征、全身性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎(temporal arteristis)/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎例如疱疹样皮炎、脉管炎、白斑病和韦格纳肉芽肿病。炎性病症的实例包括但不限于，哮喘、脑炎(encephilitis)、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性病症、脓毒性休克、肺纤维化、未分化的脊椎关节病、未分化的关节病、关节炎、炎性骨质溶解和由长期的病毒或细菌感染引起的慢性炎症。如在本文的2.2.2节中描述的，某些自身免疫病症与炎性状况相关。因而，存在着被认为是自身免疫病症和炎性病症的重叠。因此，某些自身免疫病症也可能被表征为炎性病症。可以根据本发明的方法预防、治疗或控制的炎性病症的实例包括但不限于，哮喘、脑炎(encephilitis)、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性病症、脓毒性休克、肺纤维化、未分化的脊椎关节病、未分化的关节病、关节炎、炎性骨质溶解和由慢性的病毒或细菌感染引起的慢性炎症。
包含至少一个对FcγRIIB特异性的表位结合结构域和/或具有对FcγRIIB增强的亲和性和对FcγRIIIA减少的亲和性的变体Fc结构域的本发明的分子也可以用于减少患有炎性病症的动物、特别是哺乳动物所经历的炎症。在特定的实施方案，相对于没有施用本发明的分子的动物中的炎症，本发明的分子减少动物中的炎症99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％。
包含至少一个对FcγRIIB特异性的表位结合结构域和/或具有对FcγRIIB增强的亲和性和对FcγRIIIA减少的亲和性的变体Fc结构域的本发明的分子也可以用于预防移植物排斥。
5.6.3传染病
本发明还涵盖在受治疗者中治疗或预防传染病的方法，包括施用治疗或预防有效量的一种或多种包含至少一个对与所述传染病相关的传染原特异性的表位结合结构域的本发明的分子。在某些实施方案，本发明的分子对传染原有毒，相对于所述分子不存在时的免疫应答，增强针对所述传染原的免疫应答或增强针对所述传染原的效应物功能。可以通过本发明的分子治疗或预防的传染病是由传染原，包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物和病毒引起的。
可以使用本发明的分子连同本发明的方法治疗或预防的病毒疾病包括但不限于，由甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、水痘、腺病毒、单纯性疱疹I型(HSV-I)、单纯性疱疹II型(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、组病毒、巨细胞病毒、echino病毒(echinovirus)、虫媒病毒、汉坦病毒(huntavirus)、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、骨髓灰质炎病毒、天花、Epstein Barr病毒、人类免疫缺陷性病毒I型(HIV-I)、人类免疫缺陷性病毒II型(HIV-II)，和病毒疾病例如病毒脑膜炎(miningitis)、脑炎、登革热或天花的病原体引起的那些。
可以使用本发明的分子连同本发明的方法治疗或预防的、起因于细菌的细菌疾病包括但不限于，分支杆菌立克次氏体、支原体、奈瑟氏菌、肺炎链球菌、博氏疏螺旋体(莱姆病)、炭疽杆菌(Bacillus antracis)(炭疽)、破伤风、链球菌、葡萄球菌、分枝杆菌、破伤风、百日咳(pertissus)、霍乱、鼠疫、白喉(diptheria)、衣原体、黄色葡萄球菌和军团杆菌。
可以使用本发明的分子连同本发明的方法治疗或预防的、起因于原生动物的原生动物疾病包括但不限于，利什曼虫、kokzidioa、锥虫或疟疾。
可以使用本发明的分子连同本发明的方法治疗或预防的、起因于寄生虫的寄生虫疾病包括但不限于，衣原体和立克次氏体。
根据本发明的一个方面，包含至少一个对传染原特异性的表位结合结构域的本发明的分子表现针对所述传染原例如病原性蛋白的抗体效应物功能。传染原的实例包括但不限于细菌(如，大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecials)、白色念珠菌(Candida albicans)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、绿色葡萄球菌(Staphylococcus viridans)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、病原体(例如B-亲淋巴性的乳多空病毒(LPV)；百日咳杆菌(Bordatellapertussis)；波尔纳病病毒(BDV)；牛冠状病毒；脉络丛脑膜炎病毒；登革热病毒；病毒，大肠杆菌；埃博拉病毒；艾柯病毒1；艾柯病毒-11(EV)；内毒素(LPS)；肠细菌；肠孤病毒；肠道病毒；猫白血病病毒；口蹄疫病毒；长臂猿猿白血病病毒(GALV)；革兰氏阴性细菌；幽门螺杆菌；乙型肝炎病毒(HBV)；单纯性疱疹病毒；HIV-1；人类巨细胞病毒；人类冠状病毒；流感A、B&C；军团菌；墨西哥利什曼原虫；单核细胞增多性李斯特氏菌；麻疹病毒；脑膜炎球菌；麻疹病毒；小鼠肝炎病毒；鼠白血病病毒；鼠γ疱疹病毒；鼠逆转录病毒；鼠冠状病毒小鼠肝炎病毒；鸟分枝杆菌-M；淋病奈瑟氏菌；新城疫病毒；细小病毒B19；恶性疟原虫；痘病毒；假单胞菌；轮状病毒；鼠伤寒沙门氏菌(Samonella typhiurium)；志贺氏菌；链球菌；T细胞亲淋巴性病毒1；牛痘病毒)。
5.6.4解毒
本发明还涵盖在暴露于毒素(如，毒性药物分子)的受治疗者解毒的方法，包括施用治疗或预防有效量的一种或多种包含至少一个对毒性药物分子特异性的表位结合结构域的本发明的分子。在某些实施方案，本发明的分子对毒素的结合减少或消除所述毒素的不利生理效应。在其他的实施方案，相对于所述双抗体不存在时的排除、降解或中和，本发明的双抗体对毒素的结合增加或增强对毒素的排除、降解或中和。根据本发明的方法的免疫毒性疗法可用于治疗过量或暴露于以下药物，所述药物包括但不限于地高辛(digixin)、PCP、可卡因、秋水仙碱和三环的抗抑郁药。
5.7组合治疗
本发明进一步涵盖施用本发明的分子连同本领域技术人员已知用于癌症、自身免疫疾病、传染病或中毒的治疗或预防的其他治疗，包括但不限于，当前标准的和实验的化学疗法、激素治疗、生物学治疗、免疫治疗、放射治疗或手术。在某些实施方案，本发明的分子可以连同治疗或预防有效量的一种或多种药剂、治疗性抗体或本领域技术人员已知用于癌症、自身免疫疾病、传染病或中毒的治疗和/或预防的其他药剂来施用。
在某些实施方案，同时地随同一种或多种对癌症的治疗有用的其他治疗剂向哺乳动物、优选地人类施用一种或多种本发明的分子。术语“同时地”不限于在完全相同的时间施用预防剂或治疗剂，而是意味着，按顺序和在一定时间间隔内向哺乳动物施用本发明的分子和另一种药剂，从而本发明的分子可以与另一种药剂一同起作用，来提供与以其他方式施用它们相比增加的益处。例如，每种预防剂或治疗剂(例如，化学疗法、放射疗法、激素治疗或生物学疗法)可以同时地施用或者以任何顺序在不同时间点顺序地施用；然而，如果不是同时施用的，它们应当在时间上足够接近地施用以便提供期望的治疗或预防效果。每种治疗剂可以单独地、以任何合适的形式和通过任何适合的途径来施用。在各种实施方案，以低于1小时的间隔、约1小时的间隔、约1小时到约2小时的间隔、约2小时到约3小时的间隔、约3小时到约4小时的间隔、约4小时到约5小时的间隔、约5小时到约6小时的间隔、约6小时到约7小时的间隔、约7小时到约8小时的间隔、约8小时到约9小时的间隔、约9小时到约10小时的间隔、约10小时到约11小时的间隔、约11小时到约12小时的间隔、不超过24小时的间隔或不超过48小时的间隔，来施用预防剂或治疗剂。在优选的实施方案，在患者同一次就诊时施用两种或多种成分。
在其他实施方案，预防剂或治疗剂以约2到4天的间隔、约4到6天的间隔、约1周的间隔、约1到2周的间隔、或超过2周的间隔施用。在优选的实施方案，在预防剂或治疗剂都仍然有效的时间框内施用两种药剂。通过确定施用的药剂的半衰期，本领域技术人员将能确定这种时间框。
在某些实施方案，本发明的预防剂或治疗剂循环地施用给受治疗者。循环治疗包括施用第一药剂一段时间，随后施用第二药剂和/或第三药剂一段时间，并重复这种顺序的施用。循环治疗可以减少对一种或多种治疗的抗性的发展，避免或减少治疗之一的副作用，和/或改善治疗的效力。
在某些实施方案，以不超过约3周的循环、每两周约1次、每10天约1次或每周约1次施用预防剂或治疗剂。一个循环可以包括，通过每个循环约90分钟、每个循环约1小时、每个循环约45分钟的输注来施用治疗剂或预防剂。每个循环可以包括至少1周的休息、至少2周的休息、至少3周的休息。所施用的循环的数目从约1到约12个循环、更一般地从约2到约10个循环、更一般地从约2到约8个循环。
在其他的实施方案，本发明的治疗剂和预防剂以节奏给药方式施用，通过没有延伸的休息期的连续输注或频繁施用。这种节奏施用可以包括以没有休息期的固定间隔给药。一般地，治疗剂、特别是细胞毒性剂以较低的剂量使用。这种给药方式涵盖相对低剂量的长期每天施用持续延长的时段。在优选的实施方案，较低剂量的使用可以最小化毒性副作用并消除休息期。在某些实施方案，通过从约24小时到约2天、到约1周、到约2周、到约3周、到约1个月、到约2个月、到约3个月、到约4个月、到约5个月、到约6个月的长期低剂量或连续输注，来递送治疗剂和预防剂。这种给药方式的时间安排可以由熟练的肿瘤学家来优化。
在其他实施方案，同时地向哺乳动物施用治疗的进程，即，分别地但又在一定时间间隔之内施用单独的治疗剂的剂量，从而本发明的分子可以与其他药剂一同起作用。例如，一种成分可以每周施用一次，结合其他成分每两周施用一次或每三周施用一次。换言之，即使治疗剂不被同时地施用或在患者同一次就诊时施用，也同时地进行治疗剂的给药方案。
当与其他预防剂和/或治疗剂组合使用时，本发明的分子和所述预防剂和/或治疗剂可以附加地、或更优选的协同地起作用。在一个实施方案，本发明的分子与一种或多种治疗剂在相同的药物组合物中同时施用。在另一个实施方案，本发明的分子与一种或多种其他治疗剂在独立的药物组合物中同时施用。在又一个实施方案，本发明的分子在另一种预防剂或治疗剂的施用之前或之后施用。本发明预期通过相同或不同的施用途径，例如口服和胃肠外途径，与其他预防剂或治疗剂组合施用本发明的分子。在某些实施方案，当与可能产生不良副作用，包括但不限于毒性的另一种预防剂或治疗剂同时地施用本发明的分子时，可以有利地以低于引发不良副作用的阈值的剂量施用所述预防剂或治疗剂。
本文提供的给药剂量和施用频率被术语治疗有效的和预防有效的涵盖。根据特异于每个患者的因素，取决于所施用的特定治疗剂或预防剂、癌症的严重度和类型、给药途径、以及患者的年龄、体重、反应和的以往病史，剂量和频率进一步地一般将不同。通过考虑这些因素，并通过遵循，例如，在文献中报道的以及在Physician′s Desk Reference(医师案头参考)(第56版，2002)中推荐的剂量，本领域技术人员可以选择适合的服法。
5.7.1抗癌剂
在特定实施方案，本发明的方法涵盖施用一种或多种本发明的分子和用于癌症的治疗和/或预防的一种或多种治疗剂。在一个实施方案，血管生成抑制物可以与本发明的分子组合施用。可用于本发明的方法和组合物的血管生成抑制物包括但不限于：血管他丁(血纤维蛋白溶酶原片段)；抗血管生成抗凝血酶III；Angiozyme；ABT-627；Bay 12-9566；氟草胺(Benefin)；贝伐单抗；BMS-275291；软骨衍生的抑制物(CDI)；CAI；CD59补体片段；CEP-7055；Col3；考布他汀A-4；内皮他丁(胶原XVIII片段)；纤连蛋白片段；Gro-β；溴氯哌喹酮(Halofuginone)；肝素酶；肝素己糖片段；HMV833；人类绒毛膜促性腺激素(hCG)；IM-862；干扰素α/β/γ；干扰素诱导蛋白(IP-10)；白细胞介素-12；Kringle 5(血纤维蛋白溶酶原片段)；马立马司他；金属蛋白酶抑制物(TIMP)；2-甲氧雌甾二醇；MMI 270(CGS 27023A)；MoAb IMC-1C11；新伐司他；NM-3；Panzem；PI-88；胎盘核糖核酸酶抑制物；纤溶酶原激活物抑制物；血小板因子-4(PF4)；普啉司他；促黄体分泌素16kDa片段；增殖蛋白相关蛋白(PRP)；PTK 787/ZK 222594；类视黄醇；索利司他；角鲨胺；SS 3304；SU 5416；Su6668；SU11248；四氢皮质醇-S；四硫钼酸盐；沙利度胺；血小板反应蛋白-1(TSP-1)；TNP-470；转化生长因子-β(TGF-b)；Vasculostatin；Vasostatin(钙网膜蛋白片段)；ZD6126；ZD 6474；法呢基转移酶抑制物(FTI)；和双膦酸盐类。
可以在本发明的各种实施方案中与本发明的分子，包括本发明的药物组合物和剂型和药盒组合使用的抗癌剂包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；二霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；二甲睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；氮烯唑胺；放线菌素；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西紫杉醇；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；重氮霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌氮芥；雌氮芥磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；5-氟脱氧尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸依达比星；异环磷酰胺；依莫福新；白细胞介素II(包括重组白细胞介素II或rIL2)，干扰素a-2a；干扰素α-2b；干扰素a-n1；干扰素a-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸依立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；环己亚硝脲；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；苯丙氨酸氮芥；美诺立尔；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；氨甲蝶呤钠；氯苯氨啶；米得派；米丁度胺；米托克星；丝裂红素；丝裂吉霉素；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；亚磺酰吡啶；紫杉醇；天门冬酰胺酶；佩里霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；双溴丙基哌嗪；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；甲基丝裂霉素；松龙苯芥；盐酸甲基苄肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；甲基环己亚硝脲；二甲二苯四氮烯；磷乙酰天冬氨酸钠；稀疏霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾丸内脂；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；硫替派；噻唑呋林；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；尿烷亚胺；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；去乙酸长春酰胺；硫酸去乙酸长春酰胺；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸环氧长春碱；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其他抗癌药物包括但不限于：20-表-1，25二羟维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；adecypenol；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；氨吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管发生抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1；抗雄激素物质，前列腺癌；抗雌激素物质；抗肿瘤物质；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；细胞凋亡基因调节物；细胞凋亡调节物；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨基酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟吩；苯甲酰基十字孢碱；β内酰胺衍生物；β-alethine；β-克拉霉素B(betaclamycin B)；白桦脂酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)；双奈法德；双枸橼酸环己噻卓酯A(bistratene A)；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；丁硫氨酸亚矾胺；卡泊三醇；钙感光蛋白C；喜树碱衍生物；雀痘IL-2；卡培他滨；羧酰胺-氨基-三唑；羧基氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳粟精胺；天蚕素B；西曲瑞克；chlorlns；磺胺氯喹喔啉；西卡前列素；顺式-卟琳；克拉曲滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；考布他汀A4；考布他汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托；collismycins；cryptophycin A衍生物；curacin A；环戊蒽醌(cyclopentanthraquinones)；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠(cytarabine ocfosfate)；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；dehydrodidemnin B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；代代宁B；didox；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-阿扎胞苷；9-二氢紫杉醇；dioxamycin；联苯螺莫司汀；多西紫杉醇；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；duocarmycin SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；fluorodaunorunicin hydrochloride；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；钆替沙林(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制物；吉西他滨；谷胱甘肽抑制物；hepsulfam；heregulin；环己二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；依达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮类；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素类；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；4-甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalideF；lamellarin-N triacetate；兰瑞肽；leinamycin；来格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白血病α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋四咪唑；利阿唑；线性聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；lutetium texaphyrin；lysofylline；溶胞肽；美坦新；mannostatin A；马立马司他；马索罗酚；maspin；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙；美替瑞林；甲硫氨基丁酸酶；灭吐灵；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托孤腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素；成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体，人类绒毛膜促性腺激素；单磷酸基脂质A+分枝杆菌(myobacterium)细胞壁sk；莫派达醇；多药物抗性基因抑制剂；基于多肿瘤抑制剂1的治疗；芥子抗癌剂；mycaperoxide B；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替喷；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；nisamycin；氮氧化物调节物；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；O6-苯甲基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口细胞因子诱导物；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米磷酸；人参三醇；帕诺米芬；parabactin；帕折普汀；天门冬酰胺酶；培得星；戊聚糖多硫酸钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇；phenazinomycin；乙酸苯酯；磷酸脂酶抑制剂；溶链菌；盐酸匹鲁卡品；吡柔比星；吡曲克辛；placetinA；placetin B；血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟菲尔钠；甲基丝裂霉素；强的松；丙基二-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制物；基于蛋白A的免疫调节物；蛋白激酶C抑制物；蛋白激酶C抑制物，microalgal；蛋白酪氨酸磷酸酯酶抑制物；嘌呤核苷磷酸化酶抑制物；羟基茜草素；吡唑啉吖啶；吡醇羟乙化血红蛋白聚氧乙烯轭合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制物；ras抑制物；ras-GAP抑制物；脱甲基的瑞替普汀；铼Re 186依替膦酸；根霉素；核酶；RII维甲酰胺(retinamide)；罗谷亚胺；rohitukine；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi 1模拟信号物；司莫司汀；衰老衍生的抑制物1；有义寡核苷酸；信号传导抑制物；转导调节物；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；乙酸苯酯钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；spicamycin D；螺莫司汀；splenopentin；spongistatin 1；角鲨胺；干细胞抑制物；干细胞分化抑制物；stipiamide；基质降解酶抑制物；sulfinosine；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆碱；合成糖胺聚糖；他莫司汀；三苯氧胺甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠(tecogalan sodium)；替加氟；tellurapyrylium；端粒末端转移酶抑制物；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；thaliblastine；噻可拉林；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；甲状腺刺激激素；锡乙基初紫红素(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明；二氯钛省；topsentin；托瑞米芬；全能性干细胞因子；翻译抑制物；维甲酸；三乙酰基尿嘧啶；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制物；tyrphostins(酪氨酸磷酸化抑制剂)；UBC抑制物；乌苯美司；泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；载体系统，红细胞基因治疗；维拉雷琐；藜芦明；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；zilascorb；和净司他丁激动剂。优选的其他抗癌药物是5-氟尿嘧啶和亚叶酸。
可以用于本发明方法的治疗性抗体的实例包括但不限于
Figure GPA00001026478601411
(达克珠单抗)(Roche Pharmaceuticals，Switzerland)，其是用于防止急性的肾脏同种异体移植排斥的免疫抑制性、人源化抗CD25单克隆抗体；PANOREXTM，其是鼠抗17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(GlaxoWellcome/Centocor)；BEC2，其是鼠抗独特型(GD3表位)IgG抗体(ImCloneSystem)；IMC-C225，其是嵌合的抗EGFR IgG抗体(ImClone System)；VITAXINTM，其是人源化的抗-αVβ3整联蛋白抗体(Applied MolecularEvolution/Medlmmune)；Smart M195，其是人源化的抗-CD33 IgG抗体(Protein Design Lab/Kanebo)；LYMPHOCIDETM，其是人源化的抗-CD22IgG抗体(Immunomedics)；ICM3是人源化抗-ICAM3抗体(ICOS Pharm)；IDEC-114是灵长类化的抗-CD80抗体(IDEC Pharm/Mitsubishi)；IDEC-131是人源化抗-CD40L抗体(IDEC/Eisai)；IDEC-151是灵长类化的抗-CD4抗体(IDEC)；IDEC-152是灵长类化的抗-CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3是人源化的抗-CD3 IgG(Protein Design Lab)；5G1.1是人源化的抗-补体因子5(C5)抗体(Alexion Pharm)；D2E7是人源化的抗-TNF-α抗体(CAT/BASF)；CDP870是人源化的抗-TNF-αFab片段(Celltech)；IDEC-151是灵长类化的抗-CD4 IgGl抗体(IDECPharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4是人类抗-CD4 IgG抗体(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化的抗-TNF-αIgG4抗体(Celltech)；LDP-02是人源化的抗-α4β7抗体(Leukosite/Genentech)；OrthoClone OKT4A是人源化的抗-CD4 IgG抗体(ortho Biotech)；ANTOVATM是人源化的抗-CD40L IgG抗体(Biogen)；ANTEGRENTM是人源化的抗-VLA-4 IgG抗体(Elan)；和CAT-152是人类抗-TGF-β2抗体(Cambridge Ab Tech)。可根据本发明使用的治疗性抗体的其他实例在表8中列出。
表8：抗癌治疗性抗体
Figure GPA00001026478601421
Figure GPA00001026478601431
Figure GPA00001026478601441
Figure GPA00001026478601461
Figure GPA00001026478601471
5.7.2免疫调节剂和抗炎剂
本发明提供了治疗自身免疫疾病和炎性疾病的方法，包括连同其他治疗剂一起施用本发明的分子。免疫调节剂的实例包括但不限于，氨甲喋呤(methothrexate)、ENBREL、REMICADETM、来氟米特、环磷酰胺、环孢霉素A和大环内酯抗生素(例如，FK506(他克莫司))、甲基强的松龙(MP)、皮质类固醇、类固醇、麦考酚酸吗乙酯、雷帕霉素(西罗莫司)、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、malononitriloamindes(例如，lenunamide)、T细胞调节物和细胞因子受体调节物。
抗炎剂已经在炎性和自身免疫病症的治疗中展现了成功，现在是这些病症的常规和标准的疗法。本领域技术人员公知的任何抗炎剂都可以用于本发明的方法。抗炎剂的非限制性实例包括非甾族抗炎药物(NSAID)、甾族的抗炎药物、β-激动剂、抗胆碱药(anticholingeric agent)和甲基黄嘌呤。NSAID的实例包括但不限于阿司匹林、布洛芬、塞来考昔(CELEBREXTM)、双氯芬酸(VOLTARENTM)、依托度酸(LODINETM)、非诺洛芬(NALFONTM)、茚甲新(INDOCINTM)、酮咯酸(ketoralac)(TORADOLTM)、奥沙普秦(DAYPROTM)、萘丁美酮(nabumentone)(RELAFENTM)、舒林酸(CLINORILTM)、托美丁(tolmentin)(TOLECTINTM)、罗非考昔(VIOXXTM)、萘普生(ALEVETM，NAPROSYNTM)、酮洛芬(ACTRONTM)和萘丁美酮(RELAFENTM)。这些NSAID通过抑制环氧合酶(例如，COX-1和/或COX-2)来起作用。甾族抗炎药物的实例包括但不限于，糖皮质激素、地塞米松(DECADRONTM)、可的松、氢化可的松、泼尼松(DELTASONETM)、氢化泼尼松、氟羟脱氢皮质醇、柳氮磺胺吡啶和类花生酸(eicosanoids)例如前列腺素、凝血烷和白细胞三烯。
可联合本发明的分子用于治疗或预防炎性病症的抗体的非限制性实例在表9中呈现，可用于治疗或预防自身免疫病症的抗体的非限制性实例在表10中呈现。
表9：用于治疗炎性疾病的治疗性抗体
  抗体名称   目标抗原   产品类型   同种型   供应商   适应症
  5G1.1   补体(C5)   人源化的   IgG   Alexion Pharm Inc   类风湿性关节炎
  5G1.1   补体(C5)   人源化的   IgG   Alexion Pharm Inc   SLE
  5G1.1   补体(C5)   人源化的   IgG   Alexion Pharm Inc   肾炎
  5G1.1-SC   补体(C5)   人源化的   ScFv   Alexion Pharm Inc   心肺转流术
  5G1.1-SC   补体(C5)   人源化的   ScFv   Alexion Pharm Inc   心肌梗死
  5G1.1-SC   补体(C5)   人源化的   ScFv   Alexion Pharm Inc   血管成形术
  ABX-CBL   CBL   人类   Abgenix Inc   GvHD
  抗体名称   目标抗原   产品类型   同种型   供应商   适应症
  ABX-CBL   CD147   鼠   IgG   Abgenix Inc   同种异体移植排斥
  ABX-IL8   IL-8   人类   IgG2   Abgenix Inc   银屑病
  Antegren   VLA-4   人源化的   IgG   Athena/Elan   多发性硬化
  抗-CD11a   CD11a   人源化的   IgG1   GenentechInc/Xoma   银屑病
  抗体名称   目标抗原   产品类型   同种型   供应商   适应症
  抗-CD18   CD18   人源化的   Fab’2   Genentech Inc   心肌梗死
  抗-LFA1   CD18   鼠   Fab’2   Pasteur-Merieux/Immunotech   同种异体移植排斥
  Antova   CD40L   人源化的   IgG   Biogen   同种异体移植排斥
  Antova   CD40L   人源化的   IgG   Biogen   SLE
  BTI-322   CD2   大鼠   IgG   Medimmune Inc   GvHD，银屑病
  CDP571   TNF-α   人源化的   IgG4   Celltech   克隆氏病
  CDP571   TNF-α   人源化的   IgG4   Celltech   类风湿性关节炎
  CDP850   E-选择蛋白   人源化的   Celltech   银屑病
  Corsevin M   Fact VII   嵌合的   Centocor   抗凝剂
  D2E7   TNF-α   人类   CAT/BASF   类风湿性关节炎
  Hu23F2G   CD11/18   人源化的   ICOS Pharm Inc   多发性硬化
  Hu23F2G   CD11/18   人源化的   IgG   ICOS Pharm Inc   中风
  抗体名称   目标抗原   产品类型   同种型   供应商   适应症
  IC14   CD14   ICOS Pharm Inc   中毒性休克
  ICM3   ICAM-3   人源化的   ICOS Pharm Inc   银屑病
  IDEC-114   CD80   灵长类化   IDECPharm/Mitsubishi   银屑病
  IDEC-131   C040L   人源化的   IDEC Pharm/Eisai   SLE
  IDEC-131   CD40L   人源化的   IDEC Pharm/Eisai   多发性硬化
  IDEC-151   CD4   灵长类化   IgG1   IDECPharm/GlaxoSmithKline   类风湿性关节炎
  IDEC-152   CD23   灵长类化   IDEC Pharm   哮喘/过敏症
  英利昔单抗   TNF-α   嵌合的   IgG1   Centocor   类风湿性关节炎
  英利昔单抗   TNF-α   嵌合的   IgG1   Centocor   克隆氏病
  抗体名称   目标抗原   产品类型   同种型   供应商   适应症
  抗体名称   目标抗原   产品类型   同种型   供应商   适应症
  LDP-01   β2-整联蛋白   人源化的   IgG   Millennium Inc(LeukoSite Inc.)   中风
  LDP-01   β2-整联蛋白   人源化的   IgG   Millennium Inc(LeukoSite Inc.)   同种异体移植排斥
  LDP-02   α4β7   人源化的   Millennium Inc(LeukoSite Inc.)   溃疡性结肠炎
  MAK-195F   TNFα   鼠   Fab’2   Knoll Pharm，BASF   中毒性休克
  MDX-33   CD64(FcR)   人类   Medarex/Centeon   自身免疫血液病症
  MDX-CD4   CD4   人类   IgG   Medarex/Eisai/Genmab   类风湿性关节炎
  MEDI-507   CD2   人源化的   Medimmune Inc   银屑病
  MEDI-507   CD2   人源化的   Medimmune Inc   GvHD
  OKT4A   CD4   人源化的   IgG   Ortho Biotech   同种异体移植排斥
  抗体名称   目标抗原   产品类型   同种型   供应商   适应症
  OrthoCloneOKT4A   CD4   人源化的   IgG   Ortho Biotech   自身免疫疾病
  Orthoclone/抗-CD3OKT3   CD3   鼠   mlgG2a   Ortho Biotech   同种异体移植排斥
  RepPro/阿昔单抗   gpIIbIIIa   嵌合的   Fab   Centocor/Lilly   冠状动脉血管成形术的并发症
  rhuMab-E25   IgE   人源化的   IgG1   Genentech/Novartis/Tanox Biosystems   哮喘/过敏症
  SB-240563   IL5   人源化的   GlaxoSmithKline   哮喘/过敏症
  SB-240683   IL-4   人源化的   GlaxoSmithKline   哮喘/过敏症
  SCH55700   IL-5   人源化的   Celltech/Schering   哮喘/过敏症
  Simulect   CD25   嵌合的   IgG1   Novartis Pharm   同种异体移植排斥
  SMARTa-CD3   CD3   人源化的   Protein Design Lab   自身免疫疾病
  抗体名称   目标抗原   产品类型   同种型   供应商   适应症
  SMART   CD3   人源化的   Protein Design Lab   同种异体移植排斥
  抗体名称   目标抗原   产品类型   同种型   供应商   适应症
  a-CD3
  SMARTa-CD3   CD3   人源化的   IgG   Protein Design Lab   银屑病
  Zenapax   CD25   人源化的   IgG1   Protein DesignLab/Hoffman-La Roche   同种异体移植排斥
表10：用于治疗自身免疫病症的治疗性抗体
  抗体   适应症   目标抗原
  ABX-RB2   针对T细胞、B细胞和NK细胞上的CBL抗原的抗体来自xenomouse的完全人类抗体
  5c8(抗CD-40抗原抗体)   在10月停止了II期试验99例检查“不利事件”   CD-40
  IDEC 131   系统性红斑狼疮(SLE)   抗CD40人源化的
  IDEC 151   类风湿性关节炎   灵长类化的；抗-CD4
  IDEC 152   哮喘   灵长类化的；抗-CD23
  IDEC 114   银屑病   灵长类化的抗-CD80
  MEDI-507   类风湿性关节炎；多发性硬化克隆氏病银屑病   抗-CD2
  LDP-02(抗-b7mAb)   炎症性肠病克隆氏病溃疡性结肠炎   白血球(白细胞)上的a4b7整联蛋白受体
  SMART抗-γ干扰素抗体   自身免疲病症   抗-γ干扰素
  抗体   适应症   目标抗原
  Verteportin   类风湿性关节炎
  MDX-33   起因于自身免疫反应的血液病症突发性的血小板减少紫癜(Purpurca)(ITP)自身免疫性溶血性贫血   针对FcRI受体的单克隆抗体
  MDX-CD4   治疗类风湿性关节炎和其他自身免疫性   针对CD4受体分子的单克隆抗体
  VX-497   自身免疫病症多发性硬化类风湿性关节炎炎性肠病狼疮银屑病   肌苷单磷酸酯脱氢酶的抑制物(淋巴细胞增殖所需的核苷酸生产中使用的新RNA和DNA的生产所需的酶)
  抗体   适应症   目标抗原
  VX-740   类风湿性关节炎   ICE白细胞介素-1β的抑制物(控制引起侵略性免疲应答的途径的转化酶)
  VX-745   精异于免疫应答发作和炎症发展的化学信号传导中涉及的炎症   P38MAP激酶的抑制物促分裂素活化的蛋白激酶
  Enbrel(依那西普)   靶向TNF(肿瘤坏死因子)
  IL-8   针对IL-8(白细胞介素8)的完全人类单克隆抗体
  凋亡原MP4   重组抗原有选择地破坏与T细胞相关的疾病诱导细胞凋亡由程序的细胞死亡消除的T细胞不再攻击身体自己的细胞特异性凋亡原靶向特异性T细胞
5.7.3用于治疗传染病的药剂
在一些实施方案，本发明的分子可以与本领域技术人员已知用于治疗和/或预防传染病的、治疗或预防有效量的一种或另外的治疗剂组合施用。本发明涵盖使用本发明的分子与本领域技术人员已知用于治疗和/或预防传染病的抗生素组合。可用于与本发明的分子组合的抗生素包括但不限于，大环内酯(例如，托普霉素(
Figure GPA00001026478601531
)、头孢菌素(例如，头孢氨苄
Figure GPA00001026478601532
头孢霉定
Figure GPA00001026478601533
头孢呋辛
Figure GPA00001026478601534
头孢罗齐
Figure GPA00001026478601535
头孢克洛
Figure GPA00001026478601536
头孢克肟
Figure GPA00001026478601537
或头孢羟氨苄
Figure GPA00001026478601538
克拉霉素(例如，克拉霉素
Figure GPA00001026478601539
)、红霉素(例如，红霉素)、青霉素(例如，青霉素V(V-Cillin
Figure GPA000010264786015311
或Pen Vee
Figure GPA000010264786015312
))或喹诺酮(例如，氧氟沙星环丙沙星
Figure GPA000010264786015314
或诺氟沙星
Figure GPA000010264786015315
)、氨基糖苷类抗生素(例如，安普霉素、阿贝卡星、班贝霉素、丁胺菌素、地贝卡星、新霉素、新霉素、十一碳烯酸酯、奈替米星、巴龙霉素、核糖霉素、紫苏霉素和奇霉素)，酰胺醇抗生素(例如，叠氮氯霉素、氯霉素、氟苯尼考和甲砜氯霉素)、安沙霉素抗生素(例如，利福酰胺和利福平)、碳头孢烯类(例如，氯碳头孢)、碳青霉素烯类(例如，比阿培南和亚胺培南)、头孢菌素类(例如，头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢羟唑、头孢曲秦、头孢西酮、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹胺和头孢匹罗)、头霉素类(例如，头孢拉宗、头孢美唑、和头孢米诺)，单环内酰胺类(例如，氨曲南、卡芦莫南和替吉莫南)、氧头孢烯类(例如，氟氧头孢和拉氧头孢)、青霉素类(例如氮卓西林、匹伏基氮卓西林、阿莫西林、巴氨西林、苄青霉素酸、苄青霉素钠、依匹西林、芬贝西林、氟氯西林、培那西林(penamccillin)、氢碘酸喷沙西林、青霉素o-苯乙苄胺、青霉素0、青霉素V、苄星青霉素V、哈胺青霉素V、青哌四环素和苯氧乙基青霉素钾(phencihicillin potassium))、林肯酰胺类(例如，氯林肯霉素、和林肯霉素)、安福霉素、杆菌肽、卷曲霉素、粘菌素、持久杀霉素、恩维霉素、四环素类(例如，阿哌环素、氯四环素、氯莫环素、和地美环素)、2，4-二氨基嘧啶(例如，溴莫普林)、硝基呋喃类(例如，呋喃它酮和呋噻咪唑氯)、喹诺酮类和其类似物(例如西诺沙星、克林沙星、氟甲喹和格帕沙星(grepagloxacin))、磺胺类(例如，乙酰基磺胺甲氧吡嗪、苄磺胺、诺丙磺胺、邻苯二甲酰基磺胺醋酰、磺胺柯定和磺胺西汀)、砜(例如，地百里砜、葡糖砜钠和苯丙砜)、环丝氨酸、莫匹罗星和抗结核菌素。
在某些实施方案，本发明的分子可以与治疗或预防有效量的一种或多种抗真菌剂组合施用。可用于与本发明的分子组合的抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、伊曲康唑、酮康唑、氟康唑、鞘内的(intrathecal)、氟胞嘧啶、咪康唑、布康唑、克霉唑、制霉菌素、特康唑、噻康唑、环吡酮、益康唑、卤普罗近(haloprogrin)、萘替芬、特比萘芬、十一烯酸酯和灰黄霉素(griseofuldin)。
在某些实施方案，本发明的分子可以与治疗或预防有效量的一种或多种抗病毒剂组合施用。可用于与本发明的分子组合的有用的抗病毒剂包括但不限于，蛋白酶抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和核苷类似物。抗病毒剂的实例包括但不限于，齐多夫定、无环鸟苷、更昔洛韦(gangcyclovir)、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷和病毒唑，以及膦甲酸、金刚烷胺、金刚烷乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、安泼那韦、洛匹那韦、利托那韦、α干扰素；阿德福韦、克来夫定(clevadine)、恩替卡韦、普来可那立。
5.8疫苗治疗
本发明进一步涵盖使用本发明的组合物来诱导针对抗原或免疫原性剂的免疫应答，所述抗原或免疫原性剂包括但不限于，癌抗原和传染病抗原(其实例在下文公开)。本发明的疫苗组合物包含一种或多种抗原或免疫原性剂，针对它们的免疫应答是期望的，其中所述一种或多种抗原或免疫原性剂包被有具有增强的FcγRIIIA亲和性的、本发明的变体抗体。本发明的疫苗组合物在引发免疫应答、优选针对抗原或免疫原性剂的保护性免疫应答方面是特别有效的。
在某些实施方案，本发明的疫苗组合物中的抗原或免疫原性剂包括病毒，针对所述病毒的免疫应答是期望的。病毒可以是重组或嵌合的，优选地是减毒的。重组、嵌合和减毒的病毒的生产可以使用本领域技术人员已知的标准方法来进行。本发明涵盖根据本发明配制的活重组病毒疫苗或灭活重组病毒疫苗。活疫苗可以是优选的，因为在宿主中的增殖产生与自然感染中发生的相类似的种类和数量的延长的刺激，因而赋予了相当的、持久的免疫性。这种活重组病毒疫苗制剂的生产可以使用常规方法实现，包括在细胞培养物或鸡胚的尿囊中增殖病毒随后纯化。
在特定实施方案，重组病毒对于施用它的受治疗者是非致病的。在这点上，使用为疫苗目的遗传工程化的病毒需要这些毒株中减毒特征的存在。向用于转染的模板中导入合适的突变(例如，缺失)可以提供具有减毒特征的新的病毒。例如，可以使与温度敏感性或冷适应相关的特定错义突变成为缺失突变。这些突变应当比与冷或温度敏感突变体相关的点突变更稳定，并且回复频率应当极其低。用于工程化重组病毒的重组DNA技术是本领域已知的，并涵盖在本发明中。例如，修饰负链RNA病毒的技术是本领域已知的，参见例如，美国专利第5,166,057号，通过引用将它全文并入本文。
替代地，可以构建具有“自杀”特征的嵌合病毒用于本发明的皮内疫苗制剂。这种病毒在宿主内将经历仅一轮或几轮复制。当用作疫苗时，重组病毒将经历有限的复制循环，并诱导足够水平的免疫应答，但它不会在人类宿主中走得更远和引起疾病。作为选择，根据本发明可以配制灭活的(杀死的)病毒。使用常规技术来“杀死”嵌合病毒可以制备灭活疫苗制剂。在它们的传染性被破坏的意义上，灭活疫苗是“死的”。理想地，病毒的传染性被破坏而不影响它的免疫原性。为了制备灭活疫苗，可以在细胞培养物或鸡胚的尿囊中生长嵌合病毒，通过区域超速离心法纯化、通过甲醛或β-丙内酯来灭活，并收集。
在某些实施方案，完全外源的表位，包括来自其他病毒或非病毒病原体的抗原，可以被工程化到病毒中用于本发明的皮内疫苗制剂。例如，非相关病毒例如HIV的抗原(gp160、gp120、gp41)、寄生虫抗原(例如，疟疾)、细菌或真菌抗原或肿瘤抗原可以被工程化到减毒的毒株中。
实际上任何异源基因序列都可以被构建入本发明的嵌合病毒用于皮内疫苗制剂。优选地，异源基因序列是作用为生物应答调节物的部分和肽。优选地，诱导针对任何各种病原体的保护性免疫应答的表位、或结合中和抗体的抗原，可以被嵌合病毒或作为嵌合病毒的部分表达。例如，可以被构建入本发明的嵌合病毒的异源基因序列包括但不限于，流感和副流感血球凝集素神经氨糖酸苷酶和融合糖蛋白例如人类PIV3的HN和F基因。在又一个实施方案，可以被工程化入嵌合病毒的异源基因序列包括编码具有免疫调节活性的蛋白质的那些。免疫调节蛋白的实例包括但不限于，细胞因子、1型干扰素、γ干扰素、集落刺激因子、白细胞介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-12，和这些药剂的拮抗剂。
在其他的实施方案，本发明涵盖病原性的细胞或病毒，优选地减毒病毒，其在它们的表面表达变体抗体。
在替代实施方案，本发明的疫苗组合物包含融合多肽，其中抗原或免疫原性剂可操作地连接到具有增强的FcγRIIIA亲和性的本发明的变体抗体。使用常规DNA重组技术方法进行用于本发明的疫苗组合物的融合多肽的工程化，处于普通技术人员的能力范围中。
本发明进一步涵盖通过施用本发明的组合物在受治疗者中诱导耐受性的方法。优选地，适合于在受治疗者中诱导耐受性的组合物包含包被有本发明的变体抗体的抗原或免疫原性剂，其中所述变体抗体具有对FcγRIIB更高的亲和性。虽然不希望受特定作用机制的限制，通过活化FcγRIIB介导的抑制途径，这种组合物在诱导耐受性方面是有效的。
5.9组合物和施用方法
本发明提供了包含本发明的分子(即，双抗体)的方法和药物组合物，所述分子包含多个表位结合结构域和任选地Fc结构域(或其部分)。本发明还提供了通过向受治疗者施用有效量的本发明的融合蛋白或轭合分子、或包含本发明的融合蛋白或轭合分子的药物组合物来治疗、预防和改善与疾病、病症或感染相关的一种或多种症状的方法。在优选的方面，抗体、融合蛋白或轭合分子是基本上纯的(即，基本上不含限制它的效果或产生不期望的副作用的物质)。在特定的实施方案，受治疗者是动物，优选地是哺乳动物，例如非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠，等等)和灵长类(例如，猴，如食蟹猴(cynomolgous monkey)和人类)。在优选的实施方案，受治疗者是人。在又一个优选的实施方案，本发明的抗体来自与受治疗者相同的物种。
各种递送系统是已知的，可以用于施用包含本发明分子的组合物，例如，封装在脂质体、微粒、微囊、能表达抗体或融合蛋白的重组细胞中，受体介导的内吞作用(参见，例如Wu等人(1987)“Receptor-Mediated InVitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System(受体介导的由可溶性DNA载体系统的体外基因转化)”J.Biol.Chem.262：4429-4432)，构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的部分，等等。施用本发明的分子的方法包括但不限于，肠胃外施用(例如，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外的和粘膜的(例如，鼻内和口腔途径)。在特定实施方案，肌肉内地、静脉内地或皮下地施用本发明的分子。可以通过任何便利的途径施用组合物，例如，通过输注或弹丸注射，通过上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜，等等)的吸收，并且可以与其他生物活性剂一同施用。施用可以是全身性或局部的。此外，也可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和具有雾化剂的制剂。参见例如，美国专利第6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078号；和PCT公布第WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903号，所有这些通过引用全文并入本文。
本发明还提供了本发明的分子被封装在标明了抗体量的密闭容器例如安瓿瓶或小袋中。在一个实施方案，本发明的分子作为密闭容器中的干燥灭菌冻干粉剂或无水浓缩物来提供，并可以用例如水或盐水重构成合适的浓度用于向受治疗者施用。优选地，本发明的分子以至少5mg、更优选地至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、或至少75mg的单位剂量在密闭容器中作为干燥的无菌冻干粉剂来提供。冻干的本发明分子应在它们的原始容器中存储在2到8℃之间，分子应当在重构后12小时、优选地6小时、5小时、3小时、或1小时之内施用。在可选择的实施方案，本发明的分子在标明所述分子、融合蛋白或轭合分子的量和浓度的密闭容器中以液体形式提供。优选地，本发明分子的液体形式以至少1mg/ml、更优选地至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml所述分子在密闭容器中提供。
在治疗、预防或改善与病症相关的一种或多种症状中有效的本发明组合物的量可以通过标准的临床技术来确定。在制剂中采用的准确剂量也将取决于给药途径、状况的严重度，并且应当根据医师的判断和每个患者的情况来决定。有效的剂量可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线推断。
对于本发明涵盖的双抗体，向患者施用的剂量一般是0.0001mg/kg到100mg/kg患者体重。优选地，向患者施用的剂量在0.0001mg/kg和20mg/kg、0.0001mg/kg和10mg/kg、0.0001mg/kg和5mg/kg、0.0001和2mg/kg、0.0001和1mg/kg、0.0001mg/kg和0.75mg/kg、0.0001mg/kg和0.5mg/kg、0.0001mg/kg到0.25mg/kg、0.0001到0.15mg/kg、0.0001到0.10mg/kg、0.001到0.5mg/kg、0.01到0.25mg/kg或0.01到0.10mg/kg患者体重之间。通过修饰例如脂质化来增强双抗体的摄取和组织穿透，可以减少或改变本发明的双抗体的施用剂量和频率。
在一个实施方案，当用作单药剂治疗时，向患者施用的本发明的分子的剂量是0.01mg到1000mg/天。在另一个实施方案，本发明的分子用于与其他治疗组合物组合，向患者施用的剂量比所述分子用作单药剂治疗时的更低。
在特定实施方案，期望的是局部地向需要治疗的区域施用本发明的药物组合物；这可以通过，例如但不是限制，局部输注、通过注射、或通过植入物的方式来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜，例如硅橡胶膜(sialastic membrane)，或纤维。优选地，当施用本发明的分子时，必须小心使用不吸附所述分子的材料。
在另一个实施方案，组合物可以在媒介物、特别是脂质体中递送(参见Langer(1990)“New Methods Of Drug Delivery(药物递送新方法)”Science 249：1527-1533)；Treat等人，在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer(传染病和癌症治疗中的脂质体)，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同前，pp.317-327；一般地参见同上)。
在又一个实施方案，组合物可以在控释或持续释放系统中递送。本领域技术人员已知的任何技术可以用于生产包含一种或多种本发明的分子的持续释放制剂。参见例如，美国专利第4,526,938号；PCT公布WO91/05548；PCT公布WO 96/20698；Ning等人(1996)“IntratumoralRadioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using ASustained-Release Gel(使用持续释放凝胶肿瘤内地放射免疫治疗人类结肠癌异种移植物)”Radiotherapy & Oncology 39：179-189，Song等人(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions(抗体介导的长循环的乳剂靶向肺)”PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50：372-397；Cleek等人(1997)“Biodegradable PolymericCarriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application(用于心血管应用bFGF抗体的生物可降解的聚合载体)”Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam等人(1997)“Microencapsulation OfRecombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery(用于局部递送的重组人源化单克隆抗体的微囊化)”Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，所有这些通过引用全文并入本文。在一个实施方案，泵可以用于控释系统(参见上述Langer；Sefton，(1987)“ImplantablePumps(可植入的泵)”CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.14：201-240；Buchwald等人(1980)“Long-Term，Continuous Intravenous Heparin Administration ByAn Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent VenousThrombosis(患有复发性静脉血栓形成的可走动的患者中由可植入的输注泵长期、持续地静脉施用肝素)”Surgery 88：507-516；和Saudek等人(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication SystemFor Insulin Delivery(用于胰岛素递送的可编程的可植入药物系统的初步试验)”N.Engl.J.Med.321：574-579)。在另一个实施方案，聚合材料可以用于实现抗体的控释(参见例如，Medical Applications of Controlled Release(控释的医学应用)，Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance(控释药物的生物利用率、药物产品设计和表现)，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Levy等人(1985)“Inhibition Of Calcification OfBioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate(通过局部控释二膦酸盐抑制人造生物瓣的钙化)”Science 228：190-192；During等人(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric BrainImplant：In Vivo Characterization(多巴胺从聚合脑植入物的控释：体内表征)”Ann.Neural.25：351-356；Howard等人(1989)“Intracerebral DrugDelivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits(患有损伤引起的记忆缺陷的大鼠中脑内药物递送)”J.Neurosurg.7(1)：105-112)；美国专利第5,679,377号；美国专利第5,916,597号；美国专利第5,912,015号；美国专利第5,989,463号；美国专利第5,128,326号；PCT公布第WO 99/15154号；和PCT公布第WO 99/20253号)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于，聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)，和聚正酯。在另一实施方案，控释系统可以置于治疗目标(例如，肺)附近，因而仅需要全身性剂量的一部分(参参见例如，Goodson，在Medical Applications of Controlled Release(控释的医学应用)，上述，第2卷，pp.115-138(1984))。在另一个实施方案，根据Dunn等人(参见美国专利5,945,155)使用作为控释植入物有用的聚合组合物。这种特定方法是基于来自聚合物系统的生物活性材料的原位受控释放的治疗效果。植入一般可以在需要治疗性治疗的患者体内任何位置进行。在另一个实施方案，使用非聚合的持续递送系统，其中受治疗者体内的非聚合的植入物被用作药物递送系统。在植入体内之后，植入物的有机溶剂将从组合物中消散、分散或浸出到周围的组织液，非聚合材料将逐渐地凝结或沉淀来形成固体的、多微孔的基质(参见美国专利5,888,533)。
在Langer的综述(1990，“New Methods Of Drug Delivery(药物递送的新方法)”Science 249：1527-1533)中讨论了控释系统。本领域技术人员已知的任何技术可以用于生产包含一种或多种本发明的治疗剂的持续释放制剂。参见例如，美国专利第4,526,938号；国际公布WO 91/05548和WO96/20698；Ning等人(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A HumanColon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel(使用持续释放凝胶肿瘤内地放射免疫治疗人类结肠癌异种移植物)”Radiotherapy & Oncology39：179-189，Song等人(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting OfLong-Circulating Emulsions(抗体介导的长循环的乳剂靶向肺)”PDAJournal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397；Cleek等人(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody ForCardiovascular Application(用于心血管应用bFGF抗体的生物可降解的聚合载体)”Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam等人(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody For Local Delivery(用于局部递送的重组人源化单克隆抗体的微囊化)”Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，通过完全引用将它们每一个并入本文。
在特定的实施方案，其中本发明的组合物是编码本发明双抗体的核酸，所述核酸可以体内施用来促进它编码的双抗体的表达，通过将所述核酸构建为合适的核酸表达载体的部分并施用，使它成为细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过连接到已知进入核内的同源盒样肽来施用它(参见例如，Jo Hot等人(1991)“Antennapedia Homeobox PeptideRegulates Neural Morphogenesis(触角足同源盒肽调节神经的形态发生)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)等等。作为选择，可以通过同源重组将核酸细胞内地导入并掺入宿主细胞DNA中用于表达。
用治疗或预防有效量的本发明的分子治疗受治疗者可以包括单次治疗，或优选地可包括一系列治疗。在优选的实例中，在约0.1到30mg/kg体重的范围内，每周一次地持续约1到10周之间、优选地2到8周之间、更优选地约3到7周之间、更优选地约4、5或6周，用本发明的分子治疗受治疗者。在其他实施方案，每天一次、每天两次、或每天三次地施用本发明的药物组合物。在其他实施方案，每周一次、每周两次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两月一次、每年两次或每年一次地施用药物组合物。还应理解的是，用于治疗的分子的有效剂量可以在特定治疗的过程中增加或减少。
5.9.1药物组合物
本发明的组合物包括在药物组合物的制造中有用的散装药物组合物(例如，不纯的或非无菌的组合物)和可用于单位剂型的制备的药物组合物(即，适合于向受治疗者或患者施用的组合物)。这种组合物包含预防或治疗有效量的本文公开的预防剂和/或治疗剂，或这些药剂与药学上可接受的载体的组合。优选地，本发明的组合物包含预防或治疗有效量的一种或多种本发明的分子和药学上可接受的载体。
本发明还涵盖包含本发明的双抗体分子和对特定癌抗原特异性的治疗性抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)和药学上可接受的载体的药物组合物。
在特定的实施方案，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的，或在美国药典或其他一般公认的药典中列出的，用于动物、更特别地用于人类。术语“载体”是指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全的和不完全的)、赋形剂或媒介物，伴随它们施用治疗剂。这种药物载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内地施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液和含水葡萄糖和甘油溶液也可以被用作液体载体，特别是对于注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及类似物。如果希望，组合物也可包含少量的湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放的制剂及类似形式。
一般地，在单位剂型中分别地或混合地提供本发明的组合物的成分，例如，在标明了活性剂量的密闭容器例如安瓿瓶或者小袋中，作为干燥的冻干粉末或无水的浓缩物。当通过输注来施用组合物时，可以用含有无菌的药物级水或盐水的输注瓶进行分配。当通过注射施用组合物时，可以提供无菌注射水或盐水的安瓿瓶以便在施用前将各成分混合。
本发明的组合物可以配制为中性的或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于，与例如来自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等的阴离子形成的那些，和与例如来自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的阳离子形成的那些。
5.9.2基因治疗
在特定的实施方案，施用包含编码本发明的分子的序列的核酸，通过基因治疗的方法来治疗、预防或改善与疾病、病症或感染相关的一种或多种症状。基因治疗是指通过向受治疗者施用表达的或可表达的核酸来进行的治疗。在本发明的这个实施方案中，核酸产生它们编码的抗体或融合蛋白，所述抗体或融合蛋白介导治疗或预防效果。
本领域中可用的基因治疗的任何方法都可以根据本发明使用。示范性的方法描述如下。
对于基因治疗方法的一般性综述，参见Goldspiel等人(1993)“HumanGene Therapy(人类基因治疗)”Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu等人(1991)“Delivery Systems For Gene Therapy(基因治疗的递送系统)”Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev(1993)“Gene Therapy，Concepts，CurrentTrials And Future Directions(基因治疗的概念、目前的试验和未来方向)”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)“The BasicScience Of Gene Therapy(基因治疗的基本原理)”Science 260：926-932；和Morgan等人(1993)“Human Gene Therapy(人类基因治疗)”Ann.Rev.Biochem.62：191-217。可使用的重组DNA技术领域公知的方法描述于Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，John Wiley & Sons，NY(1993)；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual(基因转移和表达的实验室手册)，StocktonPress，NY(1990)。
在优选的方面，本发明的组合物包含编码本发明的双抗体的核酸，所述核酸是表达载体的部分，所述表达载体在适合的宿主中表达所述抗体。特别地，这种核酸具有可操作地与抗体编码区连接的启动子、优选地异源启动子，所述启动子是可诱导的或组成型的，任选地是组织特异性的。在另一个特定的实施方案，使用核酸分子，在所述核酸分子中，抗体编码序列和任何其他期望的序列侧翼是促进基因组中期望位点处同源重组的区域，因而提供了所述抗体编码核酸的染色体内的表达(Koller等人(1989)“Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic StemCells By Homologous Recombination(由同源重组失活小鼠胚胎干细胞中的β2-微球蛋白基因座)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；和Zijlstra等人(1989)“Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-MicroglobulinGene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells(胚胎干细胞中由同源重组产生的破坏的β2-微球蛋白基因的种系传递)”Nature342：435-438)。
在另一个优选的方面，本发明的组合物包含编码融合蛋白的核酸，所述核酸是表达载体的一部分，所述表达载体在适合的宿主中表达所述融合蛋白。特别地，这种核酸具有可操作地与融合蛋白的编码区连接的启动子、优选地异源启动子，所述启动子是可诱导的或组成型的，任选地是组织特异性的。在另一个特定实施方案，使用核酸分子，在所述核酸分子中，融合蛋白的编码序列和任何其他期望的序列侧翼是促进基因组中期望位点处同源重组的区域，因而提供了所述融合蛋白的染色体内的表达。
递送核酸到受治疗者中可以是直接的，在这种情况下，受治疗者直接暴露于所述核酸或携带核酸的载体；或者是间接的，在这种情况下，首先用所述核酸体外转化细胞，然后将细胞移植到受治疗者中。作为体内或离体基因治疗，这两种方法分别是已知的。
在特定的实施方案，所述核酸序列直接地体内施用，其中它被表达以产生编码的产物。这可以本领域已知的许多方法的任一种实现，例如通过作为合适的核酸表达载体的部分来构建它们并施用其以使它们成为细胞内的，例如通过使用缺陷的或减毒的逆转录病毒或其他病毒载体进行感染(例如，美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，DuPont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，封装在脂质体、微粒或微囊中，或通过连接到已知进入核内的肽来施用它们，或通过连接到遭受受体介导的内吞作用的抗原来施用它(参见，例如，Wu等人(1987)“Receptor-Mediated In Vitro GeneTransformation By A Soluble DNA Carrier System(受体介导的由可溶性DNA载体系统的体外基因转化)”J.Biol.Chem.262：4429-4432)(其可用于靶向特异性表达受体的细胞类型)，等等。在另一个实施方案，可以形成核酸-抗原复合物，其中抗原包括融合病毒肽以破坏内涵体，容许核酸避免溶酶体降解。在又一个实施方案，通过靶向特异性受体，核酸可以在体内被靶向用于细胞特异性摄取和表达(参见，例如，PCT公布WO 92/06180；WO 92/22635；W092/20316；W093/14188；WO 93/20221)。作为选择，可以细胞内地导入核酸并通过同源重组掺入用于表达的宿主细胞DNA内(Koller等人(1989)“Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In MouseEmbryonic Stem Cells By Homologous Recombination(由同源重组失活小鼠胚胎干细胞中的β2-微球蛋白基因座)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；和Zijlstra等人(1989)“Germ-Line Transmission Of ADisrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By HomologousRecombination In Embryonic Stem Cells(胚胎干细胞中由同源重组产生的破坏的β2-微球蛋白基因的种系传递)”Nature 342：435-438)。
在特定实施方案，使用含有编码本发明的分子(例如，双抗体或融合蛋白)的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见，Miller等人(1993)“Use Of Retroviral Vectors For Gene Transfer AndExpression(使用逆转录病毒载体用于基因转移和表达)”Meth.Enzymol.217：581-599)。这些逆转录病毒载体含有病毒基因组的正确封装和整合入宿主细胞DNA所必需的成分。用于基因治疗、编码抗体或融合蛋白的核酸序列被克隆到一种或多种载体中，其促进所述核苷酸序列向受治疗者中的递送。关于逆转录病毒载体的更多细节可以见于Boesen等人(1993)“Circumvention Of Chemotherapy-Induced Myelosuppression By Transfer OfThe Mdr1 Gene(通过转移Mdr1基因规避化疗引起的骨髓抑制)”Biotherapy 6：291-302)，其描述了使用逆转录病毒载体来递送mdr1基因到造血干细胞中以使所述干细胞对化学疗法更有抗性。说明在基因治疗中使用逆转录病毒载体的其他参考文献是：Clowes等人(1994)“Long-TermBiological Response Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth MuscleCells Expressing Retrovirally Introduced Human Genes(接种表达逆转录病毒引入的人类基因的平滑肌细胞的受损大鼠颈动脉的长期生物响应)”J.Clin.Invest.93：644-651；Keim等人(1994)“Retrovirus-Mediated GeneTransduction Into Canine Peripheral Blood Repopulating Cells(逆转录病毒介导基因转导到犬外周血再注入的细胞)”Blood 83：1467-1473；Salmons等人(1993)“Targeting Of Retroviral Vectors For Gene Therapy(靶向逆转录病毒载体用于基因治疗)”Human Gene Therapy 4：129-141；和Grossman等人(1993)“Retroviruses：Delivery Vehicle To The Liver(逆转录病毒：向肝脏递送的载体)”Curr.Opin.Genetics and Devel.3：110-114。
腺病毒是可用于基因治疗的其他病毒载体。腺病毒是用于将基因递送到呼吸上皮的特别有吸引力的媒介物。腺病毒天然地感染呼吸上皮，其中它们引起轻微的疾病。基于腺病毒的递送系统的其他目标是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky等人(1993，“Gene Therapy：Adenovirus Vectors(基因治疗：腺病毒载体)”Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503)提出了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等人(1994，“Lung Gene Therapy：In VivoAdenovirus-Mediated Gene Transfer To Rhesus Monkey Airway Epithelium(肺的基因治疗：体内腺病毒介导向恒河猴气道上皮的基因转移)”HumanGene Therapy，5：3-10)表明了腺病毒载体将基因转移到恒河猴的呼吸上皮的用途。在基因治疗中使用腺病毒的其他例子可以在Rosenfeld等人(1991)“Adenovirus-Mediated Transfer Of A Recombinant Alpha I-Antitrypsin GeneTo The Lung Epithelium In Vivo(腺病毒介导的体内转移重组αI-抗胰蛋白酶基因到肺上皮)”Science 252：431-434；Rosenfeld等人(1992)“In VivoTransfer Of The Human Cystic Fibrosis Transmembrane ConductanceRegulator Gene To The Airway Epithelium(体内转移人类囊性纤维化跨膜传导调节子基因到气道上皮)”Cell 68：143-155；Mastrangeli等人(1993)“Diversity Of Airway Epithelial Cell Targets For In Vivo RecombinantAdenovirus-Mediated Gene Transfer(重组腺病毒介导的体内基因转移的气道上皮细胞靶的多样性)”J.Clin.Invest.91：225-234；PCT公布W094/12649；和Wang等人(1995)“A Packaging Cell line For PropagationOf Recombinant Adenovirus Vectors Containing Two Lethal Gene-RegionDeletions(用于繁殖含有两种致死基因区缺失的重组腺病毒载体的包装细胞系)”Gene Therapy 2：775-783中找到。在优选的实施方案，使用腺病毒载体。
腺病毒相关病毒(AAV)也被建议用于基因治疗(参见例如，Walsh等人(1993)“Gene Therapy For Human Hemoglobinopathies(人类血红蛋白病的基因治疗)”Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300和美国专利第5,436,146号)。
基因治疗的另一种方法包括通过如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染这些方法将基因转移到组织培养中的细胞。通常，转移的方法包括将选择标记转移到细胞。然后将这些细胞置于选择之下以分离已经被吸收并表达转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送给受治疗者。
在这个实施方案中，在体内施用产生的重组细胞之前将核酸导入细胞。这种导入可以通过本领域已知的任何方法来进行，包括但不限于，转染、电穿孔、显微注射、用包含核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合，等等。许多技术是本领域已知的用于将外源基因导入细胞中(参见例如，Loeffler等人(1993)“Gene Transfer Into Primary And EstablishedMammalian Cell Lines With Lipopolyamine-Coated DNA(以脂多胺包被的DNA转移基因到原代和确立的哺乳动物细胞系)”Meth.Enzymol.217：599-618，Cotten等人(1993)“Receptor-Mediated Transport Of DNA IntoEukaryotic Cells(受体介导运输DNA到真核细胞中)”Meth.Enzymol.217：618-644)，并可以根据本发明来使用，条件是不破坏受者细胞的必需的发育和生理功能。所述技术应当提供核酸向细胞的稳定转移，从而所述核酸是可由所述细胞表达的，优选地可遗传的和可由它的细胞子代表达。
产生的重组细胞可以通过本领域已知的各种方法递送给受治疗者。优选地静脉内地施用重组血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)。预期使用的细胞量取决于期望的效果、患者状态等等，可以由本领域技术人员确定。
其中可以导入核酸用于基因治疗目的的细胞涵盖任何期望的、可获得的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如，从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏获得的，等等。
在优选实施方案，用于基因治疗的细胞对于受治疗者是自体的。
在重组细胞被用于基因治疗的实施方案，将编码抗体或融合蛋白的核酸序列导入细胞内，从而它们可被细胞或它们的子代表达，然后为了治疗效果体内施用重组细胞。在特定的实施方案，使用干细胞或祖细胞。可以在体外分离和维持的任何干细胞和/或祖细胞潜在地可以根据本发明的这个实施方案使用。(参见例如，参见例如，PCT公布WO 94/08598；Stemple等人(1992)“Isolation Of A Stem Cell For Neurons And Glia From TheMammalian Neural Crest(从哺乳动物神经嵴分离神经元和神经胶质的干细胞)”Cell 71：973-985；Rheinwald(1980)“Serial Cultivation Of NormalHuman Epidermal Keratinocytes(正常人类表皮角质形成细胞的系列培养)”Meth.Cell Bio.21A：229-254；和Pittelkow等人(1986)“New Techniques ForThe In Vitro Culture Of Human Skin Keratinocytes And Perspectives On TheirUse For Grafting Of Patients With Extensive Burns(体外培养人类皮肤角质形成细胞的新技术和其用于移植具有大范围烧伤的患者的展望)”MayoClinic Proc.61：771-777)。
在特定实施方案，为了基因治疗的目的导入的核酸包括与编码区可操作连接的可诱导启动子，从而通过控制合适的转录诱导物的存在或缺乏，所述核酸的表达是可控制的。
5.9.3药盒
本发明提供了药物包装或药盒，其包含装有本发明的分子的一个或多个容器。此外，对疾病的治疗有用的一种或多种其他预防剂或治疗剂也可以被包括入药物包装或药盒。本发明还提供了药物包装或药盒，其包含装有本发明的药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。任选地，这种容器带有的可以是管理药物或生物制品生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的提示，所述提示反映机构对用于人类施用的生产、使用或销售的许可。
本发明还提供了可在上述方法中使用的药盒。在一个实施方案，药盒包含一种或多种本发明的分子。在另一个实施方案，药盒进一步在一个或多个容器中包含对癌症治疗有用的一种或多种其他预防剂或治疗剂。在另一个实施方案，药盒进一步包含结合与癌症相关的一种或多种癌抗原的一种或多种细胞毒性抗体。在某些实施方案，所述其他预防剂或治疗剂是化学治疗剂。在其他实施方案，预防剂或治疗剂是生物学的或激素治疗剂。
5.10治疗效用的表征和证实
本发明药物组合物、预防剂或治疗剂的几个方面，优选地在人类使用之前在体外、在细胞培养系统中、在动物模型生物体例如啮齿动物模型系统中测试期望的治疗活性。例如，可用于确定特定药物组合物的施用是否是期望的测定，包括细胞培养测定，其中在培养中生长患者组织样品，并暴露于或以其他方式与本发明的药物组合物接触，并观察这种组合物对组织样品的影响。可以通过患者的活组织检查获得组织样品。这种测试允许鉴定对单个患者治疗上最有效的预防或治疗分子。在各种特定的实施方案，可以用涉及自身免疫或炎性病症的细胞类型的代表性的细胞(例如，T细胞)进行体外测定，来确定本发明的药物组合物是否对这些细胞类型具有期望的效果。
可以在人类使用之前在适合的动物模型系统中测试预防剂和/或治疗剂的组合。这种动物模型系统包括但不限于，大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔等等。可以使用本领域公知的任何动物系统。在本发明的特定实施方案中，在小鼠模型系统中测试预防剂和/或治疗剂的组合。这种模型系统是广泛使用的，并且是技术人员公知的。可以重复地施用预防剂和/或治疗剂。该过程的几个方面可以不同。所述方面包括施用预防剂和/或治疗剂的时间安排，以及这些药剂是单独地还是作为混合物施用。
用于本发明的方法的优选的动物模型是，例如，在小鼠效应细胞上表达人类FcγR的转基因小鼠，例如，在美国专利5,877,396中(通过引用将其全文并入本文)描述的任何小鼠模型，可以用于本发明。用于本发明方法的转基因小鼠包括但不限于，携带人类FcyRIIIA的小鼠；携带人类FcγRIIA的小鼠；携带人类FcyRIIB和人类FcγRIIIA的小鼠；携带人类FcγRIIB和人类FcγRIIA的小鼠。优选地，将测试在上述功能性测定中显示最高水平活性的突变在人类使用之前用在动物模型研究中。使用上述方法可制备用在动物模型中的足量的抗体，例如使用本文公开和示例的哺乳动物表达系统和纯化方法。
小鼠异种移植模型可以用于检查小鼠抗体的效力，所述小鼠抗体是根据本发明的双抗体分子的表位结合(bing)结构域的亲和性和特异性以及双抗体引发免疫反应的能力针对肿瘤特异性靶产生的(Wu等人(2001)“Mouse Models For Multistep Tumorigenesis(多步肿瘤发生的小鼠模型)”Trends Cell Biol.11：S2-9)。在小鼠效应细胞上表达人类FcγR的转基因小鼠是独特的，是定制的动物模型，来测试人类Fc-FcγR相互作用的效力。可以使用在Dr.Jeffrey Ravetch的实验室中产生的FcγRIIIA、FcγRIIIB和FcγRIIA转基因小鼠系的配对(经过Rockefeller U.和Sloan Kettering Cancercenter的许可)，如以下表11列出的那些。
表11：小鼠品系
  品系背景   人类FcR
  裸/CD16A KO   无
  裸/CD16A KO   FcγRIIIA
  裸/CD16A KO   FcγRIIA
  裸/CD16A KO   FcγRIIA和IIIA
  裸/CD32B KO   无
  裸/CD32B KO   FcγRIIB
通过使用本领域已知的和在Crofford L.J.和Wilder R.L.，“Arthritis andAutoimmunity in Animals(动物中的关节炎和自身免疫性)”，在Arthritis and Allied Conditions：A Textbook of Rheumatology(关节炎和伴随状况：风湿病学教科书)，McCarty等人(编辑)，第30章(Lee和Febiger，1993)中描述的炎性关节炎的各种实验动物模型，可以确定本发明的组合治疗的抗炎活性。炎性关节炎和自身免疫风湿疾病的实验的和天然的动物模型也可以用于评定本发明的组合治疗的抗炎活性。以下是作为实例而不是为了限制而提供的一些测定。
本领域已知和广泛使用的关节炎或炎性疾病的基本动物模型包括：佐剂诱导的关节炎大鼠模型、胶原诱导的关节炎大鼠和小鼠模型，和抗原诱导的关节炎大鼠、兔和仓鼠模型，所有的都在Crofford L.J.和Wilder R.L.，“Arthritis and Autoimmunity in Animals(动物中的关节炎和自身免疫)”，在Arthritis and Allied Conditions：A Textbook of Rheumatology(关节炎和伴随状况：风湿病学教科书)，McCarty等人(编辑)，第30章(Lee和Febiger，1993)中描述，通过引用将其并入本文。
本发明的组合治疗的抗炎活性可以使用角叉菜聚糖诱导的关节炎大鼠模型来评定。角叉菜聚糖诱导的关节炎也已经在慢性关节炎或炎症的研究中用于兔、狗和猪。定量的组织形态评定用于确定治疗效力。在HansraP.等人(2000)“Carrageenan-induced Arthritis In The Rat(大鼠中角叉菜聚糖诱导的关节炎)”Inflammation，24(2)：141-155中描述了使用这种角叉菜聚糖诱导的关节炎模型的方法。通常还使用的是本领域已知和已描述的酵母多糖诱导的炎症动物模型。
本发明组合治疗的抗炎活性也可以通过使用Winter C A.等人(1962)“Carrageenan-Induced Edema In Hind Paw Of The Rat As An Assay ForAnti-Inflammatory Drugs(角叉菜聚糖诱导的大鼠后爪水肿作为用于抗炎药物的测定)”Proc.Soc.Exp.Biol Med.111，544-547中描述的方法的修改、测量大鼠中对角叉菜聚糖诱导的爪水肿的抑制来评定。这种测定已经用于大多数NSAID的抗炎活性的初步体内筛选，并认为是人类效力的预示。测试的预防剂或治疗剂的抗炎活性表示为测试组相对于媒介物给药的对照组在后爪重量增加方面的抑制百分比。
另外，炎性肠病的动物模型也可以用于评定本发明组合治疗的效力(Kim等人(1992)“Experimental Colitis In Animal Models(动物模型中的实验性结肠炎)”Scand.J.Gastroentrol.27：529-537；Strober(1985)“AnimalModels Of Inflammatory Bowel Disease-An Overview(炎性肠病的动物模型-综述)”Dig.Dis.Sci.30(12增刊)：3S-10S)。溃疡性的结肠炎(cholitis)和克隆氏病是可以在动物中诱导的人类炎性肠病。可以向动物口服施用硫酸化的多糖，包括但不限于，支链淀粉、角叉菜、硫酸支链淀粉和硫酸葡聚糖或化学刺激物包括但不限于三硝基苯磺酸(TNBS)和乙酸来诱导炎性肠病。
自身免疫病症的动物模型也可以用于评定本发明组合治疗的效力。已经开发了自身免疫病症例如1型糖尿病、甲状腺自身免疫、系统性红斑狼疮和血管球性肾炎的动物模型(Flanders等人(1999)“Prevention Of Type IDiabetes From Laboratory To Public Health(从实验室到公众健康预防1型糖尿病)”Autoimmunity 29：235-246；Rasmussen等人(1999)“Models ToStudy The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity(研究甲状腺自身免疫发病机理的模型)”Biochimie 81：511-515；Foster(1999)“Relevance Of SystemicLupus Erythematosus Nephritis Animal Models To Human Disease(系统性红斑狼疮动物模型与人类疾病的关联)”Semin.Nephrol.19：12-24)。
进一步的，本领域技术人员已知的任何测定可以用于评估本文公开的组合治疗对于自身免疫和/或炎性疾病的预防和/或治疗效用。
本发明的预防和/或治疗方案的毒性和效力可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学过程来测定，例如，测定LD50(对50％群体的致死剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。在有毒与治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，它可以被表示为LD50/ED50的比例。显示大的治疗指数的预防剂和/或治疗剂是优选的。当可以使用展现了毒性副作用的预防剂和/或治疗剂时，应当小心地设计递送系统，所述递送系统将这些药剂靶向受感染组织的位点以最小化对未感染细胞的潜在损害，从而降低副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人类的预防剂和/或治疗剂的剂量范围。这些药剂的剂量优选地处在包括很小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。取决于采用的剂型和使用的给药途径，剂量可以在这个范围内变动。对于用于本发明方法的任何药剂，可以最初地从细胞培养测定来估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量来达到包括在细胞培养中确定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这种信息可用于更精确地测定人类中有用的剂量。可以通过例如高效液相色谱测定血浆中的水平。
根据本发明使用的治疗的抗癌活性也可以通过使用本领域已知和在Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development(抗癌药物开发的肿瘤模型的关联)(1999，Fiebig和Buyer编辑)；Contributions to Oncology(对肿瘤学的贡献)(1999，Karger)；The Nude Mouse in Oncology Research(肿瘤学研究中的裸小鼠)(1991，Boven和Winograd编辑)；和Anticancer DrugDevelopment Guide(抗癌药物开发指南)(1997 Teicher编辑)中描述的各种用于癌症研究的实验动物模型，例如SCID小鼠模型或转基因小鼠或带有人类异种移植物的裸小鼠，动物模型，例如仓鼠、兔等等来确定，通过引用将其全文并入本文。
用于测定本发明分子的治疗效力的优选的动物模型是小鼠异种移植模型。可以用作异种移植肿瘤来源的肿瘤细胞系包括但不限于SKBR3和MCF7细胞，其可以来自患有乳腺癌的患者。这些细胞具有erbB2和促乳素受体。已经在本领域中常规地使用SKBR3细胞作为ADCC和异种移植肿瘤模型。作为选择，来自人类卵巢腺癌的OVCAR3细胞可被用作异种移植肿瘤的来源。
在人类使用前，优选地在体外、然后在体内测试本发明的方案和组合物的期望的治疗或预防活性。可以使用肿瘤或恶性细胞系的细胞筛选治疗剂和方法。本领域的许多标准测定可以用于评定这种存活率和/或生长；例如，通过测量3H-胸苷掺入、通过直接细胞计数、通过检测已知基因例如原癌基因(例如，fos、myc)或细胞周期标记物的转录活性的变化可以测定细胞增殖；通过台盼蓝染色可以评定细胞生存力，根据形态学、降低的生长和/或在软琼脂中的集落形成或在三维的基底膜或细胞外基质制备物中的管性网络形成等等，可以视觉上地评定分化。
可以在人类中测试之前在适合的动物模型系统中测试治疗中使用的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔、仓鼠等等，例如，如上所述的动物模型。然后可以在合适的临床试验中使用化合物。
进一步的，本领域技术人员已知的任何测定可以用于评估本文公开的组合治疗对于癌症、炎性病症或自身免疫疾病的治疗或预防的预防和/或治疗效用。
6.实施例
6.1设计和表征共价双特异性双抗体
构建单特异性共价双抗体和双特异性共价双抗体以评价每种的重组产生、纯化和结合特征。通过SDS-PAGE和SEC分析发现本文所述的由重组表达系统产生的亲和纯化的双抗体分子由单种二聚物质组成。ELISA和SPR分析进一步揭示，共价双特异性双抗体对两种靶抗原展示亲和性并能同时结合两种抗原。
材料和方法：
构建和设计多肽分子：设计核酸表达载体以产生四种多肽构建体，示意性地表示在图2。构建体1(SEQ ID NO：9)包括识别FcγRIIB的人源化2B6抗体的VL结构域，和识别FcγRIIIA的人源化3G8抗体的VH结构域。构建体2(SEQ ID NO：11)包括Hu3G8的VL结构域和Hu2B6的VH结构域。构建体3(SEQ ID NO：12)包括Hu3G8的VL结构域和Hu3G8的VH结构域。构建体4(SEQ ID NO：13)包括Hu2B6的VL结构域和Hu2B6的VH结构域。
PCR和表达载体构建：使用正向引物和反向引物从模板DNA扩增VL或VH结构域的编码序列，所述引物设计为以使初始(intial)PCR产物将包含重叠序列，允许重叠PCR来产生期望的多肽构建体的编码序列。
初始PCR扩增模板DNA：大约35ng的模板DNA，如，目标抗体的轻链和重链；1μl的10μM正向引物和反向引物；2.5μl的10x pfuUltra缓冲液(Stratagene，Inc.)；1μl的10mM dNTP；1μl的2.5单位/μl pfuUltra DNA聚合酶(Stratagene，Inc.)；和蒸馏水到25μl总体积在microfuge管中轻柔混合，并在微量离心机中快速旋转以收集反应混合物到管底。使用GeneAmpPCR System 9700(PE Applied Biosystem)和以下设置进行PCR反应：94℃，2分钟；94℃，每次15秒的25个循环；58℃，30秒；和72℃，1分钟。
分别使用正向引物和反向引物SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58从Hu2B6的轻链扩增Hu2B6的VL。分别使用正向引物和反向引物SEQ IDNO：59和SEQ ID NO：60从Hu2B6的重链扩增Hu2B6的VH。分别使用正向引物和反向引物SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：61从Hu3G8的轻链扩增Hu3G8的VL。分别使用正向引物和反向引物SEQ ID NO：62和SEQ IDNO：63从Hu3G8的重链扩增Hu3G8的VH。
将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上在120伏电泳30分钟。从凝胶切下PCR产物并使用MinElute GE1提取试剂盒(Qiagen，Inc.)纯化。
重叠PCR：如下述地组合初始(Intitial)PCR产物并使用初始扩增模板DNA所述的相同PCR条件扩增。重叠PCR的产物也如上述地纯化。
编码构建体1的核酸序列SEQ ID NO：9(示意性地显示在图2)，通过组合分别用正向引物和反向引物SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：63扩增VL Hu2B6和VH Hu3G8的PCR产物而扩增。编码构建体2的核酸序列SEQ ID NO：11(示意性地显示在图2)，通过组合分别用正向引物和反向引物SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：60扩增VL Hu3G8和VH Hu2B6的PCR产物而扩增。编码构建体3的核酸序列SEQ ID NO：12(示意性地显示在图2)，通过组合分别用正向引物和反向引物SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：63扩增VL Hu3G8和VH Hu3G8的PCR产物而扩增。编码构建体4的核酸序列SEQ ID NO：13(示意性地显示在图2)，通过组合分别用正向引物和反向引物SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：60扩增VL Hu2B6和VH Hu2B6的PCR产物而扩增。
VL结构域的正向引物(即，SEQ ID NO：57)和VH结构域的反向引物(即，SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：63)包含独特的限制性位点以允许克隆终产物到表达载体中。用限制性内切酶Nhe I和EcoR I消化纯化的重叠PCR产物，克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega，Inc.)中。编码构建体的质粒命名为如表12中鉴定的：
表12.质粒构建体
  编码构建体   质粒名称   插入片段
  1   pMGX0669   hu2B6VL-hu3G8VH
  2   pMGX0667   hu3G8VL-hu2B6VH
  3   pMGX0666   hu3G8VL-hu3G8VH
  4   pMGX0668   hu2B6VL-hu2B6VH
多肽/双抗体表达：根据制造商的说明书(Invitrogen)，使用Lipofectamine 2000将编码构建体1的pMGX0669与编码构建体2的pMGX0667一起共转染到HEK-293细胞中。设计共转染这两种质粒以导致表达对FcγRIIB和FcγRIIIA两者免疫特异性的共价双特异性双抗体(CBD)(h2B6-h3G8双抗体)。将分别编码构建体3和4的pMGX0666和pMGX0668分别转染到HEK-293细胞以分别表达对FcγRIIIA(h3G8双抗体)和FcγRIIB(h2B6双抗体)免疫特异性的共价单特异性双抗体(CMD)。培养三天后，从条件培养基纯化分泌产物。
纯化：使用偶合于CNBr活化的琼脂糖凝胶4B的相关抗原从条件培养基捕获双抗体。在上样之前在20mM Tris/HCl，pH 8.0中平衡亲和琼脂糖凝胶树脂。上样之后，洗脱之前用平衡缓冲液洗涤树脂。使用50mM甘氨酸pH 3.0从洗涤的树脂洗脱双抗体。立即用1M Tris/HCl pH 8.0中和洗脱的双抗体，并使用离心型浓缩器浓缩。使用PBS中平衡的Superdex 200柱，由尺寸排阻色谱进一步纯化浓缩的双抗体。
SEC.尺寸排阻色谱用于分析从柱洗脱的双抗体的近似大小和异质性。SEC分析在以PBS平衡的GE healthcare Superdex 200HR 10/30柱上进行。比较全长IgG(～150kDa)、Fab片段(～50kDa)和单链Fv(～30kDa)的洗脱图用作对照)。
ELISA：洗脱和纯化的双抗体的结合由ELISA测定表征，描述在5.4.2。将50μl/孔的2μg/ml sCD32B-Ig溶液包被在碳酸盐缓冲液中的96-孔Maxisorp板上，在4℃过夜。用PBS-T(PBS，0.1％Tween 20)洗涤板三次并在室温由PBS-T中的0.5％BSA封闭30分钟。随后，将h2B6-h3G8 CBD、h2B6 CMD或h3G8CMD以一系列二倍稀释而稀释到封闭缓冲液以产生一定范围的双抗体浓度，从0.5μg/ml到0.001μg/ml。随后在室温孵育板1小时。用PBS-T洗涤三次后，将50μl/孔0.2μg/ml sCD16A-生物素加入各孔。再次在室温孵育板1小时。用PBS-T洗涤三次后，50μl/孔1∶5000稀释的HRP轭合的链霉抗生素蛋白(Amersham Pharmacia Biotech)用于检测。HRP-链霉抗生素蛋白允许在室温孵育45分钟。用PBS-T洗涤板三次并使用80μl/孔的TMB底物显色。孵育10分钟后，通过加入40μl/孔的1％H2SO4终止HRP-TMB反应。通过使用96-孔读板器和SOFTmax软件读取OD450nm，使用GraphPadPrism 3.03软件对结果绘图。
BIAcore测定：使用BIAcore测定(BIAcore仪器1000，BIAcore Inc.，Piscataway，N.J.)和相关软件分析洗脱和纯化的双抗体的结合的动力学参数，如5.4.3节所述。
经由胺偶合化学(通过以NHS/EDC混合物修饰羧甲基)将sCD16A、sCD32B或sCD32A(阴性对照)固定到传感器芯片表面四个流动池之一(流动池2)上，以使约1000响应单位(RU)的每种受体固定到表面上。随后，将未反应的活性酯通过注射1M Et-NH2而“脱帽”。制备合适的表面后，将共价双特异性双抗体(h2B6-h3G8 CBD)或共价单特异性双抗体(h2B6CMD或h3G8 CMB)流经表面，通过以70mL/min流速注射6.25-200nM溶液180秒。还测试h3G8 scFV以比较。
收集到完整的数据集之后，使用由厂家BIAcore，Inc.(Piscataway，NJ)提供的计算机算法将产生的结合曲线全局性地拟合。这些算法计算Kon和Koff，从中推出作为两个速率常数的比例(即，Koff/Kon)的表观平衡结合常数KD。如何产生单独的速率常数的更详细的处理可以在BIAevaluaion软件手册(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)中找到。
分别拟合缔合和解离阶段。对180秒的解离阶段间隔32-34秒获得解离速率常数；由1∶1朗缪尔模型获得缔合阶段拟合，基于对双特异性双抗体和scFv的Rmax和chi2标准选择基础拟合；二价的分析物拟合用于CMD结合。
结果
非还原条件下的SDS-PAGE分析揭示，h3G8 CMD、h2B6 CMD和h2B6-h3G8 CBD表达系统的纯化产物各是估计分子量为大约50kDa的单独物质(分别是图3的泳道4、5和6)。在还原条件下，从CMD表达系统纯化的产物电泳为单个条带(泳道1和2)，而揭示从h2B6-h3G8 CBD系统纯化的产物是2种分别的蛋白(图3，泳道3)。从表达系统纯化并还原条件下通过SDS-PAGE可见的所有多肽迁移在大约28kDa。
每种表达系统产物的SEC分析还揭示了单个分子物质(图4B)，其各在与IgG的Fab片段相同的大致时间洗脱(～50kDa)(图4A)。结果表示，亲和纯化的产物对于CMD表达系统是同源共价同二聚体，对于h2B6-h3G8CBD是同源共价异二聚体。
ELISA三明治测定用于测试h2B6-h3G8 CBD对CD32B和/或CD16A之一或两者的结合特异性(图5)。CD32B用作靶抗原，CD16A用作第二探针。ELIZA中的阳性信号揭示，异二聚h2B6-h3G8 CBD具有对两种抗原的特异性。对h3G8 CMD(其不应结合CD32B)的类似测试显示无信号。
SPR分析表示，h3G8 CMD免疫特异性地识别sCD16而不是sCD32B，h2B6 CMD免疫特异性地识别sCD32B而不是sCD16，h2B6-h3G8 CBD免疫特异性地识别sCD16和sCD32B两者(图6A-B)。测试的所有双抗体都不结合对照受体sCD32A(图6C)。
SPR分析还用于估计CMD和h2B6-h3G8 CBD对sCD16和/或sCD32B的动力学和平衡常数。将结果与从h3G8 scFV计算的相同常数比较。图7A-E显示SPR分析的图示结果。从图7描述的结果计算的动力学缔合速率和解离速率、以及平衡常数提供在表13。
表13.从BIAcore数据计算的动力学和平衡常数。
  受体/分析物   k-on   k-off   Kd
  sCD16/h3G8双抗体   2.3x105   0.004   18.0
  sCD16/h2B6-h3G8 CBD   4.6x105   0.010   22.7
  sCD16/h3G8 scFv   3.2x105   0.013   38.7
  sCD32B/h2B6-h3G8 CBD   3.6x105   0.005   15.0
  sCD32B/h2B6双抗体   6.2x105   0.013   21.0
联合ELISA分析结果，研究证实，h2B6-h3G8共价异二聚体保持对CD32B和CD16两者的特异性，并能够同时结合两种抗原。分子示意性地描绘在图8。
6.2设计和表征包含FC结构域的共价双特异性双抗体
试图产生IgG样分子，即，包含Fc结构域的分子时，实施例6.1呈现的包含异二聚CBD分子的多肽之一被修饰以进一步包括Fc结构域(产生类似抗体重链和轻链的‘较重’和‘较轻’链)。随后异二聚双特异性分子将包含Fc结构域，该Fc结构域将与同源分子二聚化形成具有四价的四聚IgG-样分子(即，经由异二聚双特异性分子的Fc结构域二聚化而形成)。有趣地，这种四聚分子在重组表达系统的条件培养基中使用功能性测定检测不到，如，测试条件培养基对靶抗原的免疫特异性结合。相反，在这种功能性测定中只检测到包含由VL、VH和Fc结构域组成的单体的二聚分子。为了测试理论四聚结构的稳定性是否有争论，将包含Fc结构域的多肽工程化为进一步包括铰链区，而将包含‘较轻’链的多肽工程化为进一步包括人类κ轻链恒定结构域的6个C-末端氨基酸。当这种重新工程化的‘较重’和‘较轻’链在重组表达系统共表达时，功能性测定检测能够免疫特异性地结合靶抗原和抗-Fc抗体两者的双抗体分子。
材料和方法
构建和设计多肽分子：将核酸表达载体设计为产生实施例6.1呈现的构建体1和2的修饰形式。通过分别工程化构建体1和2以进一步包括Fc结构域来产生构建体5(SEQ ID NO：14)和6(SEQ ID NO：15)。通过工程化构建体1以进一步在其C-末端包括序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)来产生构建体7(SEQ ID NO：16)。通过工程化构建体2以进一步包括铰链区和Fc结构域(包含V215A突变)来产生构建体8(SEQ ID NO：18)。构建体5-8的示意表示显示在图9。
PCR和表达载体构建：所有PCR和PCR产物纯化方案如实施例6.1所述。质粒pMGX0669和pMGX0667分别作为构建体1和2编码序列的模板。HuIgG Fc结构域和/或铰链结构域的编码序列分别是SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5。使用正向引物和反向引物扩增模板DNA的编码序列以使PCR产物将包含重叠序列，允许重叠PCR来产生期望的产物的编码序列。
分别使用正向引物和反向引物SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：64从pMGX0669扩增构建体1的编码序列。分别使用正向引物和反向引物SEQID NO：57和SEQ ID NO：65从pMGX0667扩增构建体2的编码序列。分别使用正向引物和反向引物SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68扩增HuIgG铰链-Fc。使用正向引物和反向引物SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：69从pMGX0669扩增构建体7(SEQ ID NO：16)。
重叠PCR：初始PCR产物如下述地组合，如实施例6.1所述的扩增和纯化。
编码构建体5的核酸序列SEQ ID NO：14(示意性地显示在图9)，通过组合用正向引物和反向引物SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：66分别扩增构建体1和HuIgG Fc的PCR产物而扩增。编码构建体6的核酸序列SEQ IDNO：15(示意性地显示在图9)，通过组合用正向引物和反向引物SEQ IDNO：57和SEQ ID NO：66分别扩增构建体2和HuIgG Fc的PCR产物而扩增。编码构建体8的核酸序列SEQ ID NO：18(示意性地显示在图9)，通过组合用正向引物和反向引物SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：68分别扩增构建体2和HuIgG铰链-Fc的PCR产物而扩增。
如前所述地将终产物克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega，Inc.)。编码构建体的质粒命名为如表14中鉴定的：
表14.质粒构建体
  编码构建体   质粒名称   插入片段
  5   pMGX0676   hu2B6VL-hu3G8VH-huFc
  6   pMGX0674   hu3G8VL-hu2B6VH-huFc
  7   pMGX0677   Hu2B6VL-hu3G8VH-FNRGEC
  8   pMGX0678   Hu3G8VL-hu2B6VH-hu铰链-Fc(A215V)
多肽/双抗体表达：如节6.1所述的使用Lipofectamine 2000向HEK-293细胞进行四次分别的共转染：分别编码构建体1和6的pMGX0669和pMGX0674；分别编码构建体2和5的pMGX0667和pMGX0676；以及分别编码构建体7和8的pMGX0677和pMGX0678。
设计这些质粒的共转染以造成表达具有IgG-样结构、对FcγRIIB和FcγRIIIA两者免疫特异性的四价双特异性双抗体(CBD)。还进行另外的共转染：分别编码构建体6和5的pMGX0674和pMGX0676。培养三天后，收集条件培养基。使用纯化的Fc作为标准，由抗IgG Fc ELISA定量条件培养基中分泌产物的量。随后基于定量将样品中产物的浓度标准化，标准化的样品用于其余的测定。
ELISA：由上述三明治ELISA测定分泌到培养基中的双抗体分子的结合。除非指明，否则CD32B用于包被板，即，作为靶蛋白，HRP-轭合的CD16用作探针。
结果
ELISA测定用于测试来自包含构建体1和6(pMGX669-pMGX674)、构建体2和5(pMGX667-pNGX676)和构建体5和6(pMGX674-pMGX676)的重组表达系统的标准化样品中能够同时结合CD32B和CD16A的双抗体分子的表达(图10)。ELISA数据表示，共转染构建体1和6或共转染构建体2和5未能产生能够结合两种抗原之一或两者的产物(图10，分别是□和▲)。然而，共转染构建体5和6导致分泌能够结合于CD32B和CD16抗原两者的产物。后一种产物是构建体5和6的二聚体，包含对每种抗原的一个结合位点，结构示意性地表示在图11。
为了驱动形成IgG样异四聚结构，将六个另外的氨基酸的编码序列添加到构建体1的C-末端，产生构建体7(SEQ ID NO：16并示意性地显示在图9)。六个另外的氨基酸FNRGEC(SEQ ID NO：23)来源于κ轻链的C-末端并通常与IgG分子中重链的上部铰链结构域相互作用。随后将铰链结构域工程化到构建体6中，产生构建体8(SEQ ID NO：18和图9)。构建体8另外包括上部铰链区中的一个氨基酸突变A215V。随后将分别编码构建体7和构建体8的表达质粒即pMGX677和pMGX678共转染到HEK-293细胞并如所述地表达。
将从包含构建体7和8(pMGX0677+pMGX0678)的重组表达系统产生的双抗体分子与从包含构建体1和6(pMGX669+pMGX674)、构建体2和8(pMGX669+pMGX678)、和构建体6和7(pMGX677+pMGX674)的表达系统产生的双抗体分子在ELISA测定中比较对CD32B和CD16A的结合(图12)。
如前所述，证明从包含构建体1和6(pMGX669+pMGX674)的表达系统产生的分子不能结合CD32A和CD16A两者(图10和图12)。相反，共表达构建体7和6(pMGX0677+pMGX0674)或共表达构建体7和8(pMGX0677-pMGX0678)的产物能够结合CD32B和CD16两者(图12)。注意到构建体7与构建体1相似，除了构建体7包括C-末端序列FNRGEC(SEC ID NO：23)；构建体8与构建体6相似，除了构建体8包括铰链结构域和突变A215V。数据表示，加入来自C-κ轻链C-末端的6个另外的氨基酸(FNRGEC；SEQ ID NO：23)到不带有Fc的‘较轻’链帮助稳定四聚IgG-样双抗体分子的形成，而不论相应的较重链是否包括铰链结构域(即，pMGX0677+pMGX0674和pMGX0677-pMGX0678，图12)。加入铰链结构域到带有Fc的‘较重’多肽而不加入FNRGEC(SEQ ID NO：23)C-末端序列到相应的‘较轻’链，显然不能实现类似的稳定(即，缺乏被共转染构建体2和8(pMGX669+pMGX678)产物结合)。四聚双抗体分子的结构示意性地表示在图13。
6.3结构域顺序和另外的二硫键对四聚IgG-样双抗体形成的作用
通过以半胱氨酸取代多肽链上选择的残基来研究四聚IgG-样双抗体分子‘较轻’和‘较重’多肽链之间另外稳定化的作用。另外的半胱氨酸残基提供‘较重’和‘较轻’链之间另外的二硫键。此外，通过将Fc结构域或铰链-Fc结构域从多肽链的C-末端移动到N-末端研究结构域顺序对结合活性的作用。尽管包含另外的二硫键的分子的结合活性相对于带有这种键的此前构建的双抗体分子未改变，转移Fc或铰链-Fc结构域到构成双抗体的‘较重’多肽链的N-末端令人惊讶地改进双特异性分子对其靶抗原之一或两者的结合亲和性和/或亲和力。
材料和方法
构建和设计多肽分子：将核酸表达载体设计为产生实施例6.2所示的构建体5、6和8的修饰形式。构建体9(SEQ ID NO：19)和构建体10(SEQID NO：20)(都示意性地显示在图13)与构建体8和6相似，除了Fc结构域或铰链-Fc结构域分别从多肽的C-末端转移到N-末端。另外，使用的所有Fc结构域是野生型IgG1 Fc结构域。构建体11即SEQ ID NO：21(示意性地显示在图14)与实施例6.1的构建体2相似，除了将C-末端设计为进一步包括序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)。构建体12即SEQ ID NO：22(示意性地显示在图14)与实施例6.2的构建体5相似，除了Fc结构域进一步包括铰链区。同样，对于构建体11和12，2B6 VL结构域和2B6 VH结构域包括单个氨基酸修饰(分别是G105C和G44C)以使各结构域中的甘氨酸被半胱氨酸代替。
PCR和表达载体构建：所有PCR和PCR产物纯化方案如实施例6.1和6.2所述。
重叠PCR：使用实施例6.1和实施例6.2所述的方法构建、扩增和纯化终产物。
如前所述地将终产物克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega，Inc.)。编码构建体的质粒命名为如表15中鉴定的：
表15.质粒构建体
  编码构建体   质粒名称   插入片段
  9   pMGX0719   Hu铰链/Fc-hu3G8VL-hu2B6VH
  10   pMGX0718   HuFc-hu2B6VL-hu3G8VH
  11   pMGX0716   Hu2B6VL(G/C)-hu3G8VH-hu铰链FC
  12   pMGX0717   Hu3G8VL-hu2B6VH(G/C)-FNRGEC
多肽/双抗体表达：如节6.1所述的使用Lipofectamine 2000向HEK-293细胞进行三次分别的共转染：分别编码构建体1和9的pMGX0669和pMGX0719；分别编码构建体1和10的pMGX0669和pMGX0718；以及分别编码构建体11和12的pMGX0617和pMGX0717。设计这些质粒的共转染以造成表达具有IgG-样结构、对FcγRIIB和FcyRIIIA两者免疫特异性的四价双特异性双抗体(CBD)。培养三天后，收集条件培养基。使用纯化的Fc作为标准，由抗IgG Fc ELISA定量条件培养基中分泌产物的量。随后基于定量将样品中产物的浓度标准化，标准化的样品用于其余的测定。
ELISA：由上述三明治ELISA测定分泌到培养基中的双抗体分子的结合。除非指明，否则CD32B用于包被板，即，作为靶蛋白，HRP-轭合的CD16用作探针。
蛋白质印迹：在非还原条件下由SDS-PAGE分析来自三次上述共转染的大约15ml条件培养基。用Simply Blue Safestain(Invitrogen)染色一块凝胶，并使用标准转移方法将相同凝胶转移到PVDF膜(Invitrogen)。转移后，用1X PBS中的5％脱脂奶粉封闭膜。随后将膜在10ml的2％脱脂奶粉1XPBS/0.1％Tween 20中1∶8,000稀释的HRP轭合的山羊抗人类IgG1 H+L中室温培养1h，伴随轻柔搅动。用1X PBS/0.3％Tween 20各洗涤2X 5min，随后在室温20min后，将膜根据制造商的说明书用ECL蛋白质印迹检测系统(Amersham Biosciences)显色。膜在X-射线处理器中显色。
结果
来自包含构建体1和9；构建体1和10；以及构建体11和12的重组表达系统的条件培养基由SDS-PAGE(在非还原条件下)分析和蛋白质印迹(使用抗-IgG作为探针)分析。蛋白质印迹揭示，来自包含构建体11和12或包含构建体9和1的系统的产物主要形成大约150kDa的单种物质分子(图14，分别是泳道3和2)。这些产物两者在构成双抗体的‘较轻’和‘较重’链之间具有工程化的内部二硫键。相反，‘较轻’和‘较重’链之间没有工程化的内部二硫键的分子形成构建体10和1，形成至少两种分子量是～75和～100kDa的分子物质(图14，泳道1)。
尽管蛋白质印迹的结果如此，发现三种产物都能够结合CD32A和CD16两者(图15)。令人惊讶地，相对于包含c-末端铰链-Fc结构域的产物(由构建体11和12形成)，来自其中Fc(或Fc-铰链)结构域位于包含Fc的多肽链(即，‘较重’链)氨基末端的两种系统的产物(构建体9+1和构建体10+1)证实对其靶肽之一或两者(即，CD32B和/或CD16)增强的亲和性和/或亲和力。
6.4内部/外部裂解位点对加工多蛋白前体和表达共价双特异性双抗体的作用；设计和表征包含人类IgGλ链和铰链结构域的部分的双特异性双抗体
如本文所述的，本发明的双抗体或双抗体分子的单独多肽链可表达为单个多蛋白前体分子。测试实施例6.1-6.3所述的重组系统从这种多蛋白前体正确地加工和表达功能性CBD的能力，通过工程化核酸以编码由内部裂解位点特别是，弗林蛋白酶裂解位点分隔的CBD的第一和第二多肽链两者。从包含多蛋白前体分子的重组系统分离功能性CBD。
如实施例6.3讨论的，发现加入来自人类κ轻链的6个C-末端氨基酸FNRGEC(SEQ ID NO：23)会稳定双抗体形成-可能通过包含SEQ IDNO：23的结构域与包含Fc结构域或铰链-Fc结构域的那些结构域之间增强的链间相互作用。在CBD中测试该λ链/Fc样相互作用的稳定作用，其中多肽链都不包括Fc结构域。双抗体的一条多肽链被工程化为在其C-末端包括SEQ ID NO：23；伴侣多肽链被工程化为包括来源于IgG铰链结构域的氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：79)。比较该CBD与包括构建体1和2的CBD(来自实施例6.1)揭示，包含来源于铰链结构域和λ链的结构域的CBD对其靶表位之一或两者展示略微更大亲和性。
材料和方法
·构建和设计多肽分子：多蛋白前体：将核酸表达载体设计为产生2种多蛋白(poyprotein)前体分子，化学表示在图17。构建体13(SEQ IDNO：97)从多肽链N-末端起包括3G8的VL结构域、2.4G2(其结合mCD32B)的VH结构域、弗林蛋白酶裂解位点、2.4G2的VL结构域和3G8的VH结构域。编码构建体13的核苷酸序列提供在SEQ ID NO：98。构建体14(SEQ ID NO：99)(图17)从多肽链的N-末端包括3G8的VL结构域、2.4G2(其结合mCD32B)的VH结构域、弗林蛋白酶裂解位点、FMD(口蹄疫病毒蛋白酶C3)位点、2.4G2的VL结构域和3G8的VH结构域。编码构建体14的核苷酸序列提供在SEQ ID NO：100。
将核酸表达载体设计为产生实施例6.1所示构建体1和2的修饰形式。构建体15(SEQ ID NO：101)(图17)与实施例6.1所示的构建体1(SEQ IDNO：9)相似，除了构建体15的C-末端包括氨基酸序列FNRGEC(SEQ IDNO：23)。编码构建体15的核酸序列提供在SEQ ID NO：102。构建体16(SEQ ID NO：103)(图17)与实施例6.1所示的构建体2相似，除了构建体16的C-末端包括氨基酸序列VEPSK(SEQ ID NO：79)。编码构建体16的核酸序列提供在SEQ ID NO：104。
PCR和表达载体构建：所有PCR和PCR产物纯化方案如实施例6.1和6.2所述。
重叠PCR：以合适的引物，使用实施例6.1和实施例6.2所述的方法构建、扩增和纯化终产物。
如前所述地将终产物克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega，Inc.)。编码构建体的质粒命名为如表16中鉴定的：
表16.质粒构建体
  编码构建体   质粒名称   插入片段
  13   pMGX0750   3G8VL-2.4G2VH-弗林蛋白酶-2.4G2VL-3G8VH
  15   pMGX0752   Hu2B6VL-Hu3G8VH-FNRGEC
  16   pMGX0753   Hu3G8VL-Hu2B6VH-VEPKSC
多肽/双抗体表达：如节6.1所述的使用Lipofectamine 2000向HEK-293细胞进行一次转染和一次共转染：单独转染：编码构建体13的pMGX0750；共转染：分别编码构建体15和16的pMGX0752和pMGX0753。培养三天后，收集条件培养基，如所述地亲和纯化分泌产物。
ELISA：由上述三明治ELISA测定分泌到培养基中的双抗体分子的结合。鼠CD32B用于包被板，即作为靶蛋白，HRP-轭合的CD16用作共转染构建体15和16的产物的，探针。对于包含构建体13的重组系统，mCD32B用作靶抗原，生物素-轭合的CD16A用作探针。
结果
由三明治ELISA分析来自包含构建体13的重组表达系统的条件培养基。ELISA测定测试了CBD对mCD32B和/或CD16之一或两者的结合特异性(图18)。CD32B作为靶抗原，CD16A用作第二探针。ELISA中的阳性信号揭示，从多蛋白前体产生的异二聚h2.4G2-h3G8CBD对两种抗原都具有特异性。
类似地，在ELISA测定中测试共转染编码构建体15和16的载体产生的纯化产物，并与包括构建体1和2的产物比较(实施例6.1)。CD32B作为靶抗原，CD16A用作第二探针。如同包括构建体1和2的产物，发现构建体15和16的产物能够同时结合CD32B和CD16A。事实上，构建体15和16的产物显示对靶抗原即，CD32B或CD16A之一或两者略微增强的亲和性。这可能是因为λ链区FNRGEC(SEQ ID NO：23)与铰链区VEPKSC(SEQ ID NO：79)相互作用提供的链间缔合的增加的稳定性和/或保真性(fidelity)(相对于野生型VH-VL结构域相互作用)，这在包括构建体1和2的产物中不存在。
6.5使用双重亲和性再靶向试剂(“DART”)来将多种亲和性连在一起
本发明的一个方面涉及新型双重亲和性再靶向试剂(“DART”)以及将多种亲和性连在一起的新方式。“DART”可为单特异性、双特异性、三特异性等等，从而能够同时结合一个、两个、三个或更多不同表位(可为相同抗原或不同抗原的表位)。“DART”可另外为单价的、二价的、三价的、四价的、五价的、六价的等等，从而能够同时结合一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多分子。如图35所示，DART的这两种特性可组合，例如产生为四价等等的双特异性抗体。
一个进展是开发对原型免疫受体huCD32B具有亲和性以及对半抗原荧光素具有亲和性的DART。该DART称为“2B6/4420”，作为通用适体，能够共连接huCD32B和与荧光素-轭合的结合伴侣相互作用的分子。CD32B是一种Fc受体，具有借助与活化信号传导免疫复合物成簇而猝灭活化性信号的能力。在最初实施时，该技术允许快速筛选多种生物靶以与huCD32B成簇而不需要产生新的DART构建体。2B6/4420可仅仅与针对细胞表面受体的荧光素化的抗体混合并藉以模拟对该受体具有亲和性的DART的作用(图20)。进一步地，该试剂允许有效连接不易表达或产生的亲和性试剂，允许人们克服技术限制。包含2B6/4420的DART明显地可用作研究工具并也作为临床候选物。在ELISA测定中从HEK293细胞产生的2B6/4420可同时结合CD32B和荧光素。另外，其可经由与CD79连接，通过募集CD32B到BCR复合物而抑制细胞增殖。DART的2B6臂可被不同抗体序列或具有其他相关特异性的结合序列代替。
材料和方法：
质粒构建体
2B6/4420来源于人源化2B6MAb(hu2B6、MGA321)和抗-荧光素MAb4420的嵌合小鼠Fv/人类Fc形式的序列。完全组装的DART由两条多肽组成，导致共价连接两个Fv区。第一多肽由分泌信号序列、随后是作为与4420VH的融合蛋白产生的hu2B6VL组成，该分泌信号序列与hu2B6VL被由氨基酸残基GGGSGGGG组成的接头间隔。序列FNRGEC来源于κ轻链的C-末端，附加到该多肽C-末端。其他多肽由信号序列-4420VL-GGGSGGGG-hu2B6VH组成，来源于人类IgG1 Fd片段C-末端的序列VEPKSC附加到C-末端。两条链中的半胱氨酸形成二硫键，共价地将两条多肽连接在一起(图20)。从现有质粒PCR扩增编码所述多肽的DNA序列，由重叠PCR组合并克隆到pCIneo(Promega)的Nhe I和EcoR I位点之间。最后，使用类似于上述的方法此前已经构建的对huCD32B和huCD16(2B6/3G8)具有亲和性的DART用作对照。
抗体
鼠单克隆抗体抗-人类CD79b、CB3.1和CB3.2(杂交瘤)从Dr.CooperMD，University of Alabama at Birmingham，Birmingham AL获得。将CB3.1和CB3.2根据制造商的说明书(Pierce，Rockford IL)用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记。Fc-片段-特异性山羊抗-小鼠(GAM)IgG的F(ab’)2片段从Jackson Laboratories(West Grove，PA)获得。抗-huCD32B小鼠MAb即3H7由内部产生和纯化。通过用hu2B6完整抗体免疫山羊并针对hu2B6的Fv区亲和纯化而产生山羊抗-2B6Fv。HuIgG、FITC-huIgG和HRP-抗-小鼠IgG从Jackson Immunoresearch获得。HRP-抗-山羊从Southern Biotech获得。
DART表达
根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将编码各链的质粒共转染到293H细胞(Invitrogen)。以三天的间隔收集分泌的蛋白3-4次，并由针对固定的CD32B可溶性形式的液相色谱纯化。
ELISA
将2B6/4420或2B6/3G8 DART捕获到包被有FITC-标记的蛋白S(Novagen)、人类IgG或FITC-huIgG的MaxiSorp板上(Nalge Nunc)。检测通过结合可溶性CD32B外结构域、随后是3H7(一种对CD32B特异性的小鼠单克隆抗体)、最终是抗-小鼠-HRP而进行。可选地，检测通过结合山羊抗-2B6Fv多克隆亲和纯化的抗血清、随后是抗-山羊-HRP而进行。使用比色TMB底物(BioFX)检测HRP活性并在VersaMax ELISA读板器上读数。
B细胞纯化和增殖测定
使用来自健康供者的血液，由Ficoll/Paque Plus(Amersham PharmaciaBiotech，UK)梯度方法分离外周血单核细胞。根据制造商的说明书使用Dynal B细胞负分离试剂盒(Dynal Biotechnology Inc.，NY)分离B淋巴细胞。分离的B细胞(CD20+)的纯度大于90％，如由FACS分析估计的。对于增殖测定，将纯化的B细胞接种到平底96-孔微滴定板中的完全RPMI1640培养基，以细胞密度1x105细胞/孔，终体积200μl并在37℃、5％CO2中存在或不存在抗体和双抗体下培养48h。随后加入1μCi/孔的[3H]胸苷(Perkin Elmer，Wellesley，MA)并继续培养另外的16-18h，随后收集。[3H]胸苷掺入由液体闪烁计数测量。
结果
为了证实2B6/4420 DART是活性和特异性的，进行两种ELISA实验。首先，将2B6/4420或2B6/3G8(作为阴性对照)结合到已包被到ELISA板上的荧光素-轭合的蛋白(S-蛋白)。然后，将DART的2B6臂与可溶性CD32B连接。由针对CD32B、带有不与2B6的表位重叠的表位的另一种抗体而检测结合，随后是HRP-轭合的第二抗体。尽管2B6/4420DART能够同时结合荧光素和CD32B，2B6/3G8不能如此(图21，图A)。当DART被捕获到包被有可溶性CD32B的板，并由对hu2B6 Fv特异性的抗体检测结合时，两种DART都显示良好的结合。为了证实2B6/4420DART能够结合轭合于人类IgG的荧光素(考虑到这是初始实施该试剂的环境)，将未用荧光素标记或用荧光素标记的HuIgG结合到ELISA板并用于捕获2B6/4420。2B6/3G8再次用作阴性对照。使用对Hu2B6Fv特异性的抗体检测结合。2B6/4420DART明显地结合于FITC-HuIgG，但不结合未标记的HuIgG，证实该DART能够结合轭合于抗体的荧光素，对单独抗体没有显著的结合。如预期的，在这些环境中的任一种没有检测到被2B6/3G8DART结合。
进行实验以证实2B6/4420DART能够作为双重亲和性试剂起作用，双重亲和性试剂在基于细胞的测定环境中能够对信号传导有作用。已经显示CD32B与BCR的共聚集抑制B细胞活化。探究了2B6/4420DART共连接CD32B与包被有荧光素标记的αCD79b抗体的BCR和触发抑制细胞增殖的能力。从人类血液负选择B细胞并通过以增加浓度的小鼠抗-人类-CD79bFITC-标记的克隆CB3.1和CB3.2处理而活化，并加入Fc-特异性GAM的F(ab’)2片段作为第二试剂来交联BCR，以及固定浓度(5μg/mL)的2B6/4420DART或相当量的2B6/3G8DART(一种不靶向荧光素的分子)用作对照。以[3H]-胸苷掺入测量的细胞增殖在不存在DART或在对照2B6/3G8 DART存在下随着增加浓度的单克隆抗-CD79b-FITC活化物而增加。2B6/4420DART的存在导致在所有浓度的抗-人类CD79b-FITC下B-细胞增殖严重减少(图22，图A和B和图23，图A)。
当包被有未标记的CB3.2并使用相同实验条件活化的B细胞用2B6/4420 DART处理时未观察到增殖的抑制，证明其靶-特异性(图23，图B)。这些数据证实，2B6/4420 DART能够交联CD32B和BCR并递送能够封闭抗原-受体-诱导的细胞活化的抑制性信号。
6.6对表达CD32B的B细胞恶性肿瘤的DART免疫疗法
当前，使用
Figure GPA00001026478601911
抗-CD20抗体治疗B细胞恶性肿瘤。然而有些B细胞恶性肿瘤不表达CD20或变得对Rituxan耐受。本发明的DART提供替代的免疫疗法，能够克服
Figure GPA00001026478601912
抗-CD20抗体相关的问题。
MGD261是一种双重-亲和性再靶向(DART)分子，结合于hCD32B(经由h2B6抗体)和hCD16A和hCD16B(经由h3G8抗体)。
MGD261的效力(B细胞清除)和安全性在mCD32-/-hCD16A+C57BI/6、mCD32-/-hCD32B+C57B1/6和mCD32-/-hCD16A+hCD32B+C57B1/6中测试。在该重复剂量实验，小鼠接受6次IV注射(每周两次，3周)。B细胞清除由FACS监控。安全性由笼侧观察监控。
数据表示，MGD261能够在双转基因小鼠清除B细胞而不引起任何显著的副作用。
数据
对来自MacroGenics繁殖群的mCD32-/-hCD16A+C57B1/6、mCD32-/-hCD32B+C57B1/6和mCD32-/-hCD16A+hCD32B+C57B1/6小鼠在第0、3、7、10、14和17天IV注射MGD261(10、3、1或0.3mg/kg)、或无关抗体(hE16 10mg/kg)。在第-19(采血前)、4、11、18、25和32天收集血液用于FACS分析。每周三次记录动物健康和活动性。
设计：
Figure GPA00001026478601921
FACS分析方法：
在施用h2B6-h3G8之前18天和处理后4、11、18、25和32天收集全血样品。分析血液样品以由基于FACS的测定确定h2B6-h3G8对B细胞计数的作用。不-洗涤方案用于B细胞、T细胞和PMN计数，通过使用从Beckman Coulter获得的FlowCount珠。用于分析的抗体组是：1A8-FITC用于PMN，CD3-PE用于T细胞，CD19-APC用于B细胞和CD45-PerCP用于总白细胞。
结果
用hE16或MGD261处理(以任何浓度)的小鼠在实验持续期间的任何时间未显示任何的不适迹象。
在hCD16A和hCD32B双转基因小鼠观察到B细胞清除。双抗体h2B6-3G8连接表达hCD16A的效应细胞和表达hCD32B的B细胞；该连接是B细胞杀伤所需的。在单转基因小鼠(图24)未观察到B细胞清除。研究期间T细胞和PMN水平没有显著改变。
作为本发明替代免疫疗法的进一步证实，构建MGD261的替代品，称为“2.4G2-3G8 DB”。2.4G2-3G8 DB是一种双重-亲和性再靶向(DART)分子，结合于mCD32B(经由2.4G2抗体)和hCD16A以及hCD16B(经由h3G8抗体)。
在mCD16-/-、mCD16-/-hCD16A+C57B1/6、mCD16-/-hCD16B+和mCD16-/-hCD16A+hCD16B+小鼠测试2.4G2-3G8DB的效力(B细胞清除)和安全性。在该重复剂量实验，小鼠接受9次IP注射(每周三次，3周)。B细胞清除由FACS监控。安全性由笼侧观察监控。
数据表示，2.4G2-3G8 DB能够在hCD16转基因小鼠清除B细胞而不引起任何显著的副作用。
数据
对来自MacroGenics繁殖群的mCD16-/-、mCD16-/-hCD16A+C57B1/6、mCD16-/-hCD16B+和mCD16-/-hCD16A+hCD16B+小鼠在第0、2、4、7、9、11、14、16和18天IP注射2.4G2-3G8DB(75μg/小鼠)、或PBS。在第-10(采血前)、4、11和18天收集血液用于FACS分析。每周三次记录动物健康和活动性。
组 动物的#   剂量μg/ms 测试品 途径   收集血液的时间点
  A   2mCD16-/-   -   PBS   IP   第-10，4，11，18天
  B   2mCD16-/-16A+B6   -   PBS   IP   第-10，4，11，18天
  C   2mCD16-/-16B+   -   PBS   IP   第-10，4，11，18天
  D   2mCD16-/-16A+16B+   -   PBS   IP   第-10，4，11，18天
  E   6mCD16-/-   75   2.4G2-3G8 DB   IP   第-10，4，11，18天
  F   6mCD16-/-16A+B6   75   2.4G2-3G8 DB   IP   第-10，4，11，18天
  G   6mCD16-/-16B+   75   2.4G2-3G8 DB   IP   第-10，4，11，18天
  H   6mCD16-/-16A+16B+   75   2.4G2-3G8 DB   IP   第-10，4，11，18天
FACS分析方法：
在施用2.4G2-3G8之前10天和开始处理后4、11和18天收集全血样品。分析血液样品以由基于FACS的测定确定2.4G2-3G8对B细胞计数的作用。不-洗涤方案用于B细胞、T细胞和PMN计数，通过使用从BDImmunocytometry System获得的TruCOUNT管。用于分析的抗体组是：1A8-FITC用于PMN，CD3-PE用于T细胞，CD19-APC用于B细胞和CD45-PerCP用于总白细胞。
结果
用hE16或2.4G2-3G8DB处理的小鼠在实验持续期间的任何时间未显示任何的不适迹象。
在mCD16-/-hCD16A+或mCD16-/-hCD16A+hCD16B+小鼠观察到B细胞清除，但在mCD16-/-小鼠未观察到。这些数据表示，携带hCD16A的效应细胞是B细胞杀伤所需的(图25)。研究期间T细胞和PMN水平没有显著改变。
静脉内(IV)模型
使用人类肿瘤细胞系Raji的静脉内(IV)模型测试MGD261的抗肿瘤活性。Raji是表达hCD32B的人类伯基特淋巴瘤细胞系。当静脉内注射到mCD16-/-、hCD16A+、RAG1-/-小鼠时，肿瘤细胞定位于脊柱并造成后腿麻痹。
数据表示，MGD261能够封闭Raji肿瘤细胞在mCD16-/-、hCD16A+、RAG1-/-小鼠的体内生长。数据表示，MGD261可用于治疗人类表达CD32B的B细胞恶性肿瘤。
数据
对来自MacroGenics繁殖群的十二周-二十周大的mCD16-/-、hCD16A+、RAG1-/-C57B/6小鼠在第0天IV注射5x106 Raji细胞。在第6、9、13、16、20、23、27和30天，还用250、25或2.5μg MGD261或PBS(阴性对照)腹膜内(intraperitoneously)(IP)处理小鼠。随后每天观察小鼠，每周两次记录体重。处死发展后腿麻痹的小鼠。
结果
用PBS处理的小鼠在第25天和第50天之间死亡。用MGD261处理的小鼠存活到至少第90天(图26)。增加的存活率是统计学上显著的。使用时序检验(Logrank Test)比较存活曲线获得96.46的χ2(df9；P值＜0.0001)。
6.7DART在原核生物中的表达
进行实验以证实在非哺乳动物宿主产生DART的能力。因此，用表达DART的质粒转化大肠杆菌，并监控DART表达。
材料和方法：
质粒构建
3G8是一种针对HuCD16的人源化单克隆抗体。本文所述的DART由两条共价连接的链组成，其中每一条具有VL、随后是间隔区，然后是VH、随后是良好背景的Cys以与相对链形成二硫键。编码3G8VL-GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly-3G8VH-LeuGlyGlyCys的DART序列从现有的真核表达构建体PCR扩增，并用Nco I和EcoR I消化。靶载体是pET25b(+)(Novagen)，其包含pelB前导序列以在大肠杆菌中分泌。在插入3G8/3G8DART序列之前，载体被如下修饰：首先，T7启动子被较低活性lac启动子代替以有利于可溶性，虽然在其控制下蛋白表达水平较低。另外，引入两个点突变以消除在多克隆位点(MCS)开始处存在的两个内部Met密码子，以利于在pelB前导序列开始处存在的Met起始。该构建体产生的DART由具有相同特异性的两个V-区臂组成，即HuCD16。
表达
用pET25b(+)T7-lαc+3G8/3G8质粒转化BL21DE3细胞(Novagen)，氨苄抗性集落用于接种肉汤培养基。当培养物达到0.5 OD600单位时，加入0.5mM IPTG以诱导表达。培养物在30℃生长2小时并收集无细胞培养基。
纯化
利用亲和色谱和尺寸排阻色谱在两步骤方法中纯化3G8/3G8DART。使用亲和色谱从条件培养基捕获DART。特异性地，CD16A偶合到CNBr活化的琼脂糖凝胶4B(GE Healthcare)。上样之前，CD16A-琼脂糖凝胶树脂在20mM Tris/HCl，pH 8.0中平衡。完成上样后，用平衡缓冲液洗涤树脂，随后用50mM甘氨酸pH 3.0洗脱结合的DART。洗脱的DART立即用1MTris/HCl pH 8.0中和并使用离心型浓缩器(Vivaspin 20，10k MWCO PES，VivaScience Inc.)浓缩。浓缩的DART被尺寸排阻色谱进一步纯化，使用PBS中平衡的Superdex 200柱(GE Healthcare)。
结果
1.7升的大肠杆菌培养的条件培养基经由CD16A琼脂糖凝胶柱处理。DART的产量是0.12mg。由SDS-PAGE和SEC分析纯化的DART证实与哺乳动物细胞(CHO)表达的对照DART的可比性(图27)。
大肠杆菌表达的h3G8-h3G8DART结合ELISA
使用ELISA测量大肠杆菌中h3G8-h3G8DART的表达。将50μl孔的2μg/ml抗-h3G8Fv特异性抗体2C11包被在碳酸盐缓冲液中的96-孔Maxisorp板上，在4℃过夜。用PBS-T(PBS，0.1％Tween 20)洗涤板三次，然后在室温由PBS-T中的0.5％BSA封闭30分钟，随后加入测试DART。封闭期间，大肠杆菌表达的h3G8-h3G8 DART、h2B6-h3G8 DART和h2B6-h2B6 DART(阴性对照)被稀释到PBST/BSA中1μg/ml和0.3μg/ml。50μl/孔稀释的DART加入到各孔。在室温孵育板1小时。用PBS-T洗涤三次后，将50μl/孔0.1μg/ml生物素化的sCD16-Fc融合蛋白加入板。在室温孵育板1小时。用PBS-T洗涤三次后，50μl/孔1∶5000稀释的HRP轭合的链霉抗生素蛋白(Amersham Pharmacia Biotech)用于检测，并在室温孵育1小时。用PBS-T洗涤板三次并使用80μl/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，由40μl/孔的1％H2SO4终止反应。通过使用96-孔读板器和SOFTmax软件读取OD450nm。使用GraphPadPrism 3.03软件对读出值绘图(图28)。
6.8 DART诱导的人类B-细胞死亡
将人类PBMC与以下培养过夜：CD16-CD32B-hu3G8-hu2b6(上述)；ch2B6-aglyc-去糖基化嵌合2B6抗体(描述在共同待审的美国专利申请序列号11/108,135，公布为US2005/0260213，通过引用并入本文)和CD16-CD79。CD16-CD79的DNA和编码的蛋白序列如下：
H3G8VL-CB3.1VH
核苷酸序列(SEQ ID NO：105)
GACATCGTGA TGACCCAATC TCCAGACTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGGA GAGGGCCACC     60
ATCAACTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TTTGATGGTG ATAGTTTTAT GAACTGGTAC    120
CAACAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC CTCATCTATA CTACATCCAA TCTAGAATCT    180
GGGGTCCCAG ACAGGTTTAG TGGCAGTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CACCATCAGC    240
AGCCTGCAGG CTGAGGATGT GGCAGTTTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA GGATCCGTAC    300
ACGTTCGGAC AGGGGACCAA GCTTGAGATC AAAGGAGGCG GATCCGGAGG CGGAGGCCAG    360
GTCCAACTGC AGCAGCCTGG GGCTGAGCTG GTGAGGCCTG GGGCTTCAGT GAAGCTGTCC    420
TGCAAGGCTT CTGGCTACAC CTTCACCAGC TACTGGATGA ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT    480
GGACAAGGCC TTGAATGGAT TGGTATGGTT GATCCTTCAG ACAGTGAAAC TCACTACAAT    540
CAAATGTTCA AGGACAAGGC CACATTGACT GTTGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATG    600
CAGCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG AGCTATGGGC    660
TACTGGGGTC AAGGAACCTC AGTCACCGTC TCCTCAGTTG AGCCCAAATC TTGTTAG       717
氨基酸序列(SEQ ID NO：106)
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL
LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY
TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLQQPGAEL VRPGASVKLS CKASGYTFTS
YWMNWVKQRP GQGLEWIGMV DPSDSETHYN QMFKDKATLT VDKSSSTAYM
QLSSLTSEDS AVYYCARAMG YWGQGTSVTV SSVEPKSC
CB3.1VL-h3G8VH
核苷酸序列(SEQ ID NO：107)
GATGTTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCACT TTGTCGGTTA ACATTGGACA ACCAGCCTCC     60
ATCTCTTGTA AGTCAAGTCA GAGCCTCTTA GATACTGATG GAAAGACATA TTTGAATTGG    120
TTGTTACAGA GGCCAGGCCA GTCTCCAAAC CGCCTAATCT ATCTGGTGTC TAAACTGGAC    180
TCTGGAGTCC CTGACAGGTT CACTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC    240
AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TTTGGGAATT TATTATTGCT GGCAAGGTAC ACATTTTCCG    300
CTCACGTTCG GTGCTGGGAC CAAGCTGGAG CTGAAAGGAG GCGGATCCGG AGGCGGAGGC    360
CAGGTTACCC TGAGAGAGTC TGGCCCTGCG CTGGTGAAGC CCACACAGAC CCTCACACTG    420
ACTTGTACCT TCTCTGGGTT TTCACTGAGC ACTTCTGGTA TGGGTGTAGG CTGGATTCGT    480
CAGCCTCCCG GGAAGGCTCT AGAGTGGCTG GCACACATTT GGTGGGATGA TGACAAGCGC    540
TATAATCCAG CCCTGAAGAG CCGACTGACA ATCTCCAAGG ATACCTCCAA AAACCAGGTA    600
GTCCTCACAA TGACCAACAT GGACCCTGTG GATACTGCCA CATACTACTG TGCTCAAATA    660
AACCCCGCCT GGTTTGCTTA CTGGGGCCAA GGGACTCTGG TCACTGTGAG CTCATTCAAC    720
AGGGGAGAGT GTTAG                                                     735
氨基酸序列(SEQ ID NO：108)
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS
TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV
VLTMTNMDPV DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSSFN RGEC
由FACS分析测定凋亡，表示为B细胞的PI+膜联蛋白-V+群(CD20+细胞)相对总的FSC/SSC未门控的群的百分比(图29)。
6.9 8B5-CB3.1 DART
8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC
使用H9和lgh630R作为引物，ch8B5Lc作为模板扩增8B5VL。使用lgh628F和lgh629R作为引物，ch8B5Hc作为模板扩增CB3.1VH。接头序列掺入引物lgh630R和lgh628F。c-末端接头和终止密码子掺入lgh629R引物。凝胶纯化PCR产物并以等摩尔比混合到一起，随后使用H9和lgh629R作为引物扩增。随后用NheI/EcoRI限制性内切酶消化重叠的PCR产物，并克隆到pCIneo载体。
CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC
使用在FR4与8B5VL共有相同序列的H9和lgh630R作为引物，chCB3.1Lc作为模板扩增CB3.1VL。使用lgh63IF和lgh640R作为引物，ch8B5Hc作为模板扩增8B5VH。接头序列掺入引物lgh630R和Igh63IF。c-末端接头和终止密码子掺入lgh640R引物。凝胶纯化PCR产物并以等摩尔比混合到一起，随后使用H9和lgh640R用作引物扩增。随后用NheI/EcoRI限制性内切酶消化重叠的PCR产物，并克隆到pCIneo载体。
抗Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC
由重叠PCR将抗-Flag标签插入到信号序列和8B5VL之间。使用H9和lgh647R作为引物和ch8B5Lc作为模板扩增信号序列和Flag标签。使用lgh647F和lgh629R作为引物和8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC作为模板再次扩增8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC。凝胶纯化PCR产物并以等摩尔比混合到一起，随后使用H9和lgh629R用作引物扩增。随后用NheI/EcoRI限制性内切酶消化重叠的PCR产物，并克隆到pCIneo载体。
8B5VL-CB3.1VH-LGGC
为了在8B5 VL-CB3.1VH-VEPKSC构建体中产生不同C-末端接头，使用H9和lgh646R作为引物再次扩增该构建体。将C-末端LGGC接头整合到1gh646R引物中。随后用NheI/EcoRI限制性内切酶消化PCR产物，并克隆到pCIneo载体。
CB3.1VL-8B5VH-LGGC
相同策略用于产生CB3.1VL-8B5VH-LGGC。将C-末端LGGC接头整合到lgh648R引物中，CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC用作模板。随后用NheI/EcoRI限制性内切酶消化PCR产物，并克隆到pCIneo载体。
抗Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-LGGC
相同策略还用于产生抗-Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-LGGC。将C-末端LGGC接头整合到lgh648R引物，抗-Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC用作模板。随后用NheI/EcoRI限制性内切酶消化PCR产物，并克隆到pCIneo载体。
序列
8B5-CB3.1-VEPKSC核苷酸序列(SEQ ID NO：109)：
GACATTCAGA TGACACAGTC TCCATCCTCC CTACTTGCGG CGCTGGGAGA AAGAGTCAGT     60
CTCACTTGTC GGGCAAGTCA GGAAATTAGT GGTTACTTAA GCTGGCTTCA GCAGAAACCA    120
GATGGAACTA TTAAACGCCT GATCTACGCC GCATCCACTT TAGATTCTGG TGTCCCAAAA    180
AGGTTCAGTG GCAGTGAGTC TGGGTCAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG TCTTGAGTCT    240
GAAGATTTTG CAGACTATTA CTGTCTACAA TATTTTAGTT ATCCGCTCAC GTTCGGTGCT    300
GGGACCAAGC TGGAGCTGAA AGGAGGCGGA TCCGGAGGCG GAGGCCAGGT CCAACTGCAG    360
CAGCCTGGGG CTGAGCTGGT GAGGCCTGGG GCTTCAGTGA AGCTGTCCTG CAAGGCTTCT    420
GGCTACACCT TCACCAGCTA CTGGATGAAC TGGGTGAAGC AGAGGCCTGG ACAAGGCCTT    480
GAATGGATTG GTATGGTTGA TCCTTCAGAC AGTGAAACTC ACTACAATCA AATGTTCAAG    540
GAAAGGCCAC ATTGACTGTT GACAAATCCT CCAGCACAGC CTACATGCAG CTCAGCAGCC    600
TGACATCTGA GGACTCTGCG GTCTATTACT GTGCAAGAGC TATGGGCTAC TGGGGTCAAG    660
GAACCTCAGT CACCGTCTCC TCAGTTGAGC CCAAATCTTG TTAG                     704
氨基酸序列(SEQ ID NO：110)：
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA
GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN
WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS
LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSVE PKSC
CB3.1-8B5-FNRGEC
核苷酸序列(SEQ ID NO：111)：
GATGTTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCACT TTGTCGGTTA ACATTGGACA ACCAGCCTCC     60
ATCTCTTGTA AGTCAAGTCA GAGCCTCTTA GATACTGATG GAAAGACATA TTTGAATTGG    120
TTGTTACAGA GGCCAGGCCA GTCTCCAAAC CGCCTAATCT ATCTGGTGTC TAAACTGGAC    180
TCTGGAGTCC CTGACAGGTT CACTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC    240
AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TTTGGGAATT TATTATTGCT GGCAAGGTAC ACATTTTCCG    300
CTCACGTTCG GTGCTGGGAC CAAGCTGGAG CTGAAAGGAG GCGGATCCGG AGGCGGAGGC    360
GAAGTGAAGC TTGAGGAGTC TGGAGGAGGC TTGGTGCAAC CTGGAGGATC CATGAAACTC    420
TCTTGTGAAG CCTCTGGATT CACTTTTAGT GACGCCTGGA TGGACTGGGT CCGTCAGTCT    480
CCAGAGAAGG GGCTTGAGTG GGTTGCTGAA ATTAGAAACA AAGCTAAAAA TCATGCAACA    540
TACTATGCTG AGTCTGTGAT AGGGAGGTTC ACCATCTCAA GAGATGATTC CAAAAGTAGT    600
GTCTACCTGC AAATGAACAG CTTAAGAGCT GAAGACACTG GCATTTATTA CTGTGGGGCT    660
CTGGGCCTTG ACTACTGGGG CCAAGGCACC ACTCTCACAG TCTCCTCGTT CAACAGGGGA    720
GAGTGTTAG                                                            729
氨基酸序列(SEQ ID NO：112)：
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS
DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS
VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSFNRG EC
8B5VL-CB3.1VH-LGGC
使用H9和lgh694R作为引物，ch8B5Lc作为模板扩增8B5VL。使用lgh695F和lgh696R作为引物，ch8B5Hc作为模板扩增8B5VH。接头序列掺入引物lgh694R和lgh695F。使用lgh355F和lgh366R作为引物，ch8B5Hc作为模板扩增HuIgG1Fc。凝胶纯化PCR产物并以等摩尔比混合到一起，随后使用H9和lgh366R用作引物扩增。随后用NheI/EcoRI限制性内切酶消化重叠的PCR产物，并克隆到pCIneo载体。
核苷酸序列(SEQ ID NO：113)：
GACATTCAGA TGACACAGTC TCCATCCTCC CTACTTGCGG CGCTGGGAGA AAGAGTCAGT     60
CTCACTTGTC GGGCAAGTCA GGAAATTAGT GGTTACTTAA GCTGGCTTCA GCAGAAACCA    120
GATGGAACTA TTAAACGCCT GATCTACGCC GCATCCACTT TAGATTCTGG TGTCCCAAAA    180
AGGTTCAGTG GCAGTGAGTC TGGGTCAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG TCTTGAGTCT    240
GAAGATTTTG CAGACTATTA CTGTCTACAA TATTTTAGTT ATCCGCTCAC GTTCGGTGCT    300
GGGACCAAGC TGGAGCTGAA AGGAGGCGGA TCCGGAGGCG GAGGCCAGGT CCAACTGCAG    360
CAGCCTGGGG CTGAGCTGGT GAGGCCTGGG GCTTCAGTGA AGCTGTCCTG CAAGGCTTCT    420
GGCTACACCT TCACCAGCTA CTGGATGAAC TGGGTGAAGC AGAGGCCTGG ACAAGGCCTT    480
GAATGGATTG GTATGGTTGA TCCTTCAGAC AGTGAAACTC ACTACAATCA AATGTTCAAG    540
GACAAGGCCA CATTGACTGT TGACAAATCC TCCAGCACAG CCTACATGCA GCTCAGCAGC    600
CTGACATCTG AGGACTCTGC GGTCTATTAC TGTGCAAGAG CTATGGGCTA CTGGGGTCAA    660
GGAACCTCAG TCACCGTCTC CTCACTGGGA GGCTGCTAG                           699
氨基酸序列(SEQ ID NO：114)：
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA
GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN
WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS
LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSLG GC
CB3.1-8B5-LGGC
核苷酸序列(SEQ ID NO：115)：
GATGTTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCACT TTGTCGGTTA ACATTGGACA ACCAGCCTCC     60
ATCTCTTGTA AGTCAAGTCA GAGCCTCTTA GATACTGATG GAAAGACATA TTTGAATTGG    120
TTGTTACAGA GGCCAGGCCA GTCTCCAAAC CGCCTAATCT ATCTGGTGTC TAAACTGGAC    180
TCTGGAGTCC CTGACAGGTT CACTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC    240
AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TTTGGGAATT TATTATTGCT GGCAAGGTAC ACATTTTCCG    300
CTCACGTTCG GTGCTGGGAC CAAGCTGGAG CTGAAAGGAG GCGGATCCGG AGGCGGAGGC    360
GAAGTGAAGC TTGAGGAGTC TGGAGGAGGC TTGGTGCAAC CTGGAGGATC CATGAAACTC    420
TCTTGTGAAG CCTCTGGATT CACTTTTAGT GACGCCTGGA TGGACTGGGT CCGTCAGTCT    480
CCAGAGAAGG GGCTTGAGTG GGTTGCTGAA ATTAGAAACA AAGCTAAAAA TCATGCAACA    540
TACTATGCTG AGTCTGTGAT AGGGAGGTTC ACCATCTCAA GAGATGATTC CAAAAGTAGT    600
GTCTACCTGC AAATGAACAG CTTAAGAGCT GAAGACACTG GCATTTATTA CTGTGGGGCT    660
CTGGGCCTTG ACTACTGGGG CCAAGGCACC ACTCTCACAG TCTCCTCGCT GGGAGGCTGC    720
TAG                                                                  723
氨基酸序列(SEQ ID NO：116)：
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS
DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS
VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSLGGC
引物：
Lgh628F(SEQ ID NO：117)：
GGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGG
Lgh629R(SEQ ID NO：118)
TTTGAATTCTAACAAGATTTGGGCTCAACTGAGGAGACGGTGACTGAGG
Lgh630R(SEQ ID NO：119)
GCCTCCGCCTCCGGATCCGCCTCCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC
Lgh631F(SEQ ID NO：120)
GGAGGCGGATCCGGAGGCGGAGGCGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGG
Lgh640R(SEQ ID NO：121)
TTTGAATTCTAACACTCTCCCCTGTTGAACGAGGAGACTGTGAGAGTGG
Lgh644R(SEQ ID NO：122)
TTTGTCGTCATCATCGTCTTTGTAGTCGGAGTGGACACCTGTGGAGAG
Lgh646R(SEQ ID NO：123)
TTTGAATTCTAGCAGCCTCCCAGTGAGGAGACGGTGACTGAG
Lgh647F(SEQ ID NO：124)
CAAAGACGATGATGACGACAAAGACATTCAGATGACACAGTCTCC
Lgh648R(SEQ ID NO：125)
TTTGAATTCTAGCAGCCTCCCAGCGAGGAGACTGTGAGAGTGG
表达：
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，将编码构建体5和6、或6和7、或8和9、或9和10的表达质粒(图30)共转染到HEK-293细胞以表达带有或不带抗flag标签的8B5-CB3.1 DART。每三天收集条件培养基，收集三次。随后使用CD32B亲和柱纯化条件培养基。
ELISA
ELISA如下进行：将50μl/孔的2μg/ml CD32B-Fc包被在碳酸盐缓冲液中的96-孔 Maxisorp板上，在4℃过夜。用PBS-T(PBS，0.1％Tween 20)洗涤板三次并在室温由PBS-T中的0.5％BSA封闭30分钟，随后加入测试的单链Fc融合蛋白。封闭期间，从2μg/ml开始，将8B5-CB3.1 DART稀释到一系列两倍稀释液。将25μl/孔的稀释DART与25μl/孔的50ng/mlch8B5混合，从稀释板转移到ELISA板。在室温孵育板1小时。用PBS-T洗涤三次后，向板加入50μl/孔1∶10,000稀释的HRP轭合的F(ab’)2山羊抗人类IgG F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch)。在室温孵育板1小时。用PBS-T洗涤板三次并使用80μl/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，通过加入40μl/孔的1％H2SO4终止反应。通过使用96-孔读板器和SOFTmax软件读取OD450nm。使用GraphPadPrism 3.03软件对读出值绘图(图31)。
6.10设计和表征Ig-样四价DART
采用四条多肽链来产生具有四价的抗原结合位点的Ig-样DART物质(图32；图33)。Ig-样DART物质具有独特性质，因为其结构域可设计为结合于相同表位(从而形成能够结合四种相同抗原分子的四价、单-表位特异性Ig-样DART)，或结合于不同表位或抗原，例如，其结构域可设计为结合于相同抗原的两个表位(从而形成四价、单-抗原特异性、双表位特异性Ig-样DART)，或结合于不同抗原分子的表位从而形成具有对第一抗原特异性的一对结合位点和对第二抗原特异性的第二对结合位点的四价的Ig-样DART)。可易于产生具有这种特性组合的杂合分子。
为了阐释这种Ig-样DART物质的特征，产生具有对CD32特异性的一对结合位点和对CD16A特异性的第二对结合位点的示例性四价的Ig-样DART物质。该Ig-样DART物质使用以下四条多肽链产生：
2.4G2-3G8-h K核苷酸序列(SEQ ID NO：126)：
GATGTCCAGA TGACCCAGTC TCCATCTAAT CTTGCTGCCT CTCCTGGAGA
AAGTGTTTCC ATCAATTGCA AGGCAAGTGA GAGCATTAGC AAGTATTTAG
CCTGGTATCT ACAGAAACCT GGGAAAGCAA ATAAGCTTCT TATGTACGAT
GGGTCAACTT TGCAATCTGG AATTCCATCG AGGTTCAGTG GCAGTGGATC
TGGTACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGAAG CCTGGAGCCT GAAGATTTTG
GACTCTATTA CTGTCAACAG CATTATGAAT ATCCAGCCAC GTTCGGTTCT
GGGACCAAGC TGGAGATCAA AGGAGGCGGA TCCGGAGGCG GAGGCCAGGT
TACCCTGAAA GAGTCTGGCC CTGGGATATT GCAGCCCTCC CAGACCCTCA
GTCTGACTTG TTCTTTCTCT GGGTTTTCAC TGAGGACTTC TGGTATGGGT
GTAGGCTGGA TTCGTCAGCC TTCAGGGAAG GGTCTAGAGT GGCTGGCACA
CATTTGGTGG GATGATGACA AGCGCTATAA TCCAGCCCTG AAGAGCCGAC
TGACAATCTC CAAGGATACC TCCAGCAACC AGGTATTCCT CAAAATCGCC
AGTGTGGACA CTGCAGATAC TGCCACATAC TACTGTGCTC AAATAAACCC
CGCCTGGTTT GCTTACTGGG GCCAAGGGAC TCTGGTCACT GTGAGCTCAC
TGGGAGGCTG CGGCGGAGGG AGCCGTACGG TGGCTGCACC ATCGGTCTTC
ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA TCTGGAACTG CCTCTGTTGT
GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG
TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC AGGAGAGTGT CACAGAGCAG
GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC AGCACCCTGA CGCTGAGCAA
AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC CTGCGAAGTC ACCCATCAGG
GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA ACAGGGGAGA GTGTTAG
2.4G2-3G8-h K编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：127)：
DVQMTQSPSN LAASPGESVS INCKASESIS KYLAWYLQKP GKANKLLMYD
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTIRSLEP EDFGLYYCQQ HYEYPATFGS
GTKLEIKGGG SGGGGQVTLK ESGPGILQPS QTLSLTCSFS GFSLRTSGMG
VGWIRQPSGK GLEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SSNQVFLKIA
SVDTADTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSLGGCGGG SRTVAAPSVF
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ
DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
3G8-2.4G2-hG1核苷酸序列(SEQ ID NO：128)：
GACACTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGCA
GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TTTGATGGTG
ATAGTTTTAT GAACTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC
CTCATCTATA CTACATCCAA TCTAGAATCT GGGATCCCAG CCAGGTTTAG
TGCCAGTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG
AGGAGGATAC TGCAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA GGATCCGTAC
ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATA AAAGGAGGCG GATCCGGAGG
CGGAGGCGAG GTGGAGCTAG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTA GTGCAGCCTG
GAAGGTCCCT GAAACTCTCG TGTGCAGCCT CAGGATTCAC TTTCAGTGAC
TATTACATGG CCTGGGTCCG GCAGGCTCCA ACGACGGGTC TGGAGTGGGT
CGCATCCATT AGTTATGATG GTGGTGACAC TCACTATCGA GACTCCGTGA
AGGGCCGATT TACTATTTCC AGAGATAATG CAAAAAGCAG CCTATACCTG
CAAATGGACA GTCTGAGGTC TGAGGACACG GCCACTTATT ACTGTGCAAC
AGAGACTACG GGAATACCTA CAGGTGTTAT GGATGCCTGG GGTCAAGGAG
TTTCAGTCAC TGTCTCCTCA CTGGGAGGCT GCGGCGGAGG GAGCGCCTCC
ACCAAGGGCC CATCGGTCTT CCCCCTGGCA CCCTCCTCCA AGAGCACCTC
TGGGGGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT CAAGGACTAC TTCCCCGAAC
CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCCC TGACCAGCGG CGTGCACACC
TTCCCGGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC TACTCCCTCA GCAGCGTGGT
GACCGTGCCC TCCAGCAGCT TGGGCACCCA GACCTACATC TGCAACGTGA
ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA AGAGAGTTGA GCCCAAATCT
TGTGACAAAA CTCACACATG CCCACCGTGC CCAGCACCTG AACTCCTGGG
GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA
TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA
GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA
TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG
TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC
AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA GCCCCCATCG AGAAAACCAT
CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC
CATCCCGGGA TGAGCTGACC AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC
AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA
GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC CGTGCTGGAC TCCGACGGCT
CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG
GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA
CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG TAAATGA
3G8-2.4G2-hG1编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：129)：
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL
LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VELVESGGGL VQPGRSLKLS CAASGFTFSD
YYMAWVRQAP TTGLEWVASI SYDGGDTHYR DSVKGRFTIS RDNAKSSLYL
QMDSLRSEDT ATYYCATETT GIPTGVMDAW GQGVSVTVSS LGGCGGGSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT
FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS
CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE
DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY
KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV
KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
具有上述序列的Ig-样DART分子制品从不同质粒分离物获得并命名为“Ig DART1”和“Ig DART2”。在ELISA中将这些Ig-样DART物质结合mCD32-hCD16A的能力与仅培养基、具有单个CD32和单个CD16A结合位点的DART(“DART”)、和对照抗-ch-mCD32 mAb的能力比较(图34)。发现本发明的Ig-样DART比DART或对照抗体具有大得多的抗原结合亲和性。
6.11设计和表征CD32B-CD79-1和CD32B-CD79-2双特异性双抗体
将编码CD79VL-CD32BVH(序列1)、CD32BVL-CD79VH-1(序列2)和CD32BVL-CD79VH-2(序列3)的基因克隆到表达载体pEE13，分别获得表达构建体1、2和3。将构建体1表达质粒与表达质粒2或3一起共转染到HEK-293细胞以分别制备CD32B-CD79-1和CD32B-CD79-2双特异性双抗体。每三天收集条件培养基，收集三次。随后使用CD32B亲和柱纯化条件培养基。
ELISA如下进行：将50μl/孔的2μg/ml CD32B-Fc包被在碳酸盐缓冲液中的96-孔Maxisorp板上，在4℃过夜。用PBS-T(PBS，0.1％Tween 20)洗涤板三次并在室温由PBS-T中的0.5％BSA封闭30分钟，随后加入测试的单链Fc融合蛋白。封闭期间，从2μg/ml开始，将CD32B-CD79-1或CD32B-CD79-2双特异性双抗体以一系列两倍稀释而稀释。将25μl/孔的稀释双特异性双抗体与25μl/孔的50ng/ml抗-CD32B抗体混合，并加入到ELISA板。在室温孵育板1小时。用PBS-T洗涤三次后，向板加入50μl/孔1∶10,000稀释的HRP轭合的F(ab’)2山羊抗人类IgG F(ab’)2(JacksonImmunoResearch)。在室温孵育板1小时。用PBS-T洗涤板三次并使用80μl/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，通过加入40μl/孔的1％H2SO4终止反应。通过使用96-孔读板器和SOFTmax软件读取OD450nm。使用GraphPadPrism 3.03软件对读出值绘图。实验揭示，CD32B-CD79-1和CD32B-CD79-2双特异性双抗体能够免疫特异性地结合于CD32-Fc，亲和性与抗-CD32B对照抗体的相当。上述构建体的核苷酸和编码的氨基酸序列提供如下：
序列1-CD79VL-CD32BVH核苷酸序列(SEQ ID NO：130)：
GATGTTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA CCCTTGGACA
GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCAAGTCA GAGCCTCTTA GATAGTGATG
GAAAGACATA TTTGAATTGG TTTCAGCAGA GGCCAGGCCA ATCTCCAAAC
CGCCTAATTT ATCTGGTGTC TAAACTGGAC TCTGGGGTCC CAGACAGATT
CAGCGGCAGT GGGTCAGGCA CTGATTTCAC ACTGAAAATC AGCAGGGTGG
AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCT GGCAAGGTAC ACATTTTCCG
CTCACGTTCG GCGGAGGGAC CAAGCTTGAG ATCAAAGGAG GCGGATCCGG
AGGCGGAGGC GAAGTGAAGC TTGAGGAGTC TGGAGGAGGC TTGGTGCAAC
CTGGAGGATC CATGAAACTC TCTTGTGAAG CCTCTGGATT CACTTTTAGT
GACGCCTGGA TGGACTGGGT CCGTCAGTCT CCAGAGAAGG GGCTTGAGTG
GGTTGCTGAA ATTAGAAACA AAGCTAAAAA TCATGCAACA TACTATGCTG
AGTCTGTGAT AGGGAGGTTC ACCATCTCAA GAGATGATTC CAAAAGTAGT
GTCTACCTGC AAATGAACAG CTTAAGAGCT GAAGACACTG GCATTTATTA
CTGTGGGGCT CTGGGCCTTG ACTACTGGGG CCAAGGCACC ACTCTCACAG
TCTCCTCGCT GGGAGGCTGC TAG
序列2-CD79-CD32BVH氨基酸序列(SEQ ID NO：131)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC
序列3-CD32BVL-CD79VH-1核苷酸序列(SEQ ID NO：132)：
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC TTATCTGCCT CTGTGGGAGA
TAGAGTCACC ATCACTTGTC GGGCAAGTCA GGAAATTAGT GGTTACTTAA
GCTGGCTGCA GCAGAAACCA GGCAAGGCCC CTAGACGCCT GATCTACGCC
GCATCCACTT TAGATTCTGG TGTCCCATCC AGGTTCAGTG GCAGTGAGTC
TGGGACCGAG TTCACCCTCA CCATCAGCAG CCTTCAGCCT GAAGATTTTG
CAACCTATTA CTGTCTACAA TATTTTAGTT ATCCGCTCAC GTTCGGAGGG
GGGACCAAGG TGGAAATAAA AGGAGGCGGA TCCGGAGGCG GAGGCCAGGT
TCAGCTGGTG CAGTCTGGAG CTGAGGTGAA GAAGCCTGGC GCCTCAGTGA
AGGTCTCCTG CAAGGCTTCT GGTTACACCT TTACCAGCTA CTGGATGAAC
TGGGTGCGAC AGGCCCCTGG ACAAGGGCTT GAGTGGATCG GAATGATTGA
TCCTTCAGAC AGTGAAACTC ACTACAATCA AATGTTCAAG GACAGAGTCA
CCATGACCAC AGACACATCC ACGAGCACAG CCTACATGGA GCTGAGGAGC
CTGAGATCTG ACGACACGGC CGTGTATTAC TGTGCGAGAG CTATGGGCTA
CTGGGGGCAA GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCACTGGGA GGCTGCTGA
序列4-CD32BVL-CD79VH-1氨基酸序列(SEQ ID NO：133)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC
序列5-CD32BVL-CD79VH-2核苷酸序列(SEQ ID NO：134)：
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC TTATCTGCCT CTGTGGGAGA
TAGAGTCACC ATCACTTGTC GGGCAAGTCA GGAAATTAGT GGTTACTTAA
GCTGGCTGCA GCAGAAACCA GGCAAGGCCC CTAGACGCCT GATCTACGCC
GCATCCACTT TAGATTCTGG TGTCCCATCC AGGTTCAGTG GCAGTGAGTC
TGGGACCGAG TTCACCCTCA CCATCAGCAG CCTTCAGCCT GAAGATTTTG
CAACCTATTA CTGTCTACAA TATTTTAGTT ATCCGCTCAC GTTCGGAGGG
GGGACCAAGG TGGAAATAAA AGGAGGCGGA TCCGGAGGCG GAGGCCAGGT
TCAGCTGGTG CAGTCTGGAG CTGAGGTGAA GAAGCCTGGC GCCTCAGTGA
AGGTCTCCTG CAAGGCTTCT GGTTACACCT TTACCAGCTA CTGGATGAAC
TGGGTGCGAC AGGCCCCTGG ACAAGGGCTT GAGTGGATCG GAATGATTGA
TCCTTCAGAC AGTGAAACTC ACTACAATCA AAAGTTCAAG GACAGAGTCA
CCATGACCAC AGACACATCC ACGAGCACAG CCTACATGGA GCTGAGGAGC
CTGAGATCTG ACGACACGGC CGTGTATTAC TGTGCGAGAG CTATGGGCTA
CTGGGGGCAA GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCACTGGGA GGCTGCTGAA
TTC
序列6-CD32BVL-CD79VH-2氨基酸序列(SEQ ID NO：135)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC
对本领域技术人员明显的是，可对本发明进行许多修饰和改变而不偏离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅通过示例的方式提供，本发明仅由所附的权利要求以及这些权利要求的等价物的全部范围界定。这种修饰意为落入所附的权利要求的范围内。
本文引用的专利和非专利的所有参考文献通过引用为所有目的全文并入本文，达到如同每种单独出版物或专利或专利申请具体和单独地通过引用为所有目的全文并入的程度。
序列表
<110>宏观基因有限公司
     莱斯利·S·约翰逊
     黄菱
 
<120>共价双抗体及其用途
 
<130>1301.0007I2
 
<140>
<141>
 
<150>60/945,523
<151>2007-06-21
 
<150>60/019,051
<151>2008-01-04
 
<160>104
 
<170>PatentIn version 3.4
 
<210>1
<211>13
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<220>
<223>人IgG1铰链
 
<400>1
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
 1               5                  10
 
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>智人
 
<220>
<223>人IgG2铰链
 
<400>2
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
 1               5                  10
 
<210>3
<211>60
<212>PRT
<213>智人
 
<220>
<223>人IgG3铰链
 
<400>3
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
 1               5                  10                  15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
            20                  25                  30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
        35                  40                  45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
    50                  55                  60
 
<210>4
 
<211>10
<212>PRT
<213>智人
 
<220>
<223>人IgG4铰链
 
<400>4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser
 1               5                  10
 
<210>5
<211>217
<212>PRT
<213>智人
<220>
<223>人IgG1Fc结构域
 
<400>5
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
 1               5                  10                  15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            20                  25                  30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
        35                  40                  45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    50                  55                  60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65                  70                  75                  80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                85                  90                  95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
            100                 105                 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
        115                 120                 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    130                 135                 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                165                 170                 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
            180                 185                 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        195                 200                 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215
 
<210>6
<211>216
<212>PRT
<213>智人
 
<220>
<223>人IgG2Fc结构域
 
<400>6
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
 1               5                  10                  15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
            20                  25                  30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
        35                  40                  45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
    50                  55                  60
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
65                  70                  75                  80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
                85                  90                  95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
            100                 105                 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
        115                 120                 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
    130                 135                 140
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
                165                 170                 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
            180                 185                 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
        195                 200                 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215
 
<210>7
<211>217
<212>PRT
<213>智人
 
<220>
<223>人IgG3Fc结构域
 
<400>7
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
 1               5                  10                  15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            20                  25                  30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
        35                  40                  45
Val Asp Gly Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln
    50                  55                  60
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65                  70                  75                  80
Gln Asn Trp Leu Asp Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                85                  90                  95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
            100                 105                 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
        115                 120                 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    130                 135                 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                165                 170                 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
            180                 185                 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
        195                 200                 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215
 
<210>8
<211>217
<212>PRT
<213>智人
 
<220>
<223>人IgG4Fc结构域
 
<400>8
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
 1               5                  10                  15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            20                  25                  30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
        35                  40                  45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    50                  55                  60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65                  70                  75                  80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                85                  90                  95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
            100                 105                 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
        115                 120                 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    130                 135                 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                165                 170                 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
            180                 185                 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        195                 200                 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215
 
<210>9
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体1
 
<400>9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
 1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Glu Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
        115                 120                 125
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
                165                 170                 175
Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
            180                 185                 190
Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
        195                 200                 205
Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
    210                 215                 220
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys
225                 230                 235
 
<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>接头
 
<400>10
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
 1               5
 
<210>11
<211>244
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体2
 
<400>11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
        115                 120                 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
    130                 135                 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr
                165                 170                 175
Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Val
            180                 185                 190
Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp
        195                 200                 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr
    210                 215                 220
Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Cys
 
<210>12
<211>240
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体3
 
<400>12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
 1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Glu Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
        115                 120                 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
    130                 135                 140
Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
145                 150                 155                 160
Glu Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr Pro Asn Tyr Asn
                165                 170                 175
Lys Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Val Val Ser Thr Ser
            180                 185                 190
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
        195                 200                 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp
    210                 215                 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys
225                 230                 235                 240
 
<210>13
<211>241
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体4
 
<400>13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro
        115                 120                 125
Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
    130                 135                 140
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln
145                 150                 155                 160
Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp
                165                 170                 175
Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys
            180                 185                 190
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro
        195                 200                 205
Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe
    210                 215                 220
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Cys
 
<210>14
<211>470
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体5
 
<400>14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
 1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Glu Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
        115                 120                 125
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
                165                 170                 175
Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
            180                 185                 190
Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
        195                 200                 205
Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
    210                 215                 220
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys Val Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
                245                 250                 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
            340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
    370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                405                 410                 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
 
<210>15
<211>477
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体6
 
<400>15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
        115                 120                 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
    130                 135                 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr
                165                 170                 175
Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Val
            180                 185                 190
Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp
        195                 200                 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr
    210                 215                 220
Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Cys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
                245                 250                 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
            260                 265                 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
        275                 280                 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
    290                 295                 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305                 310                 315                 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
                325                 330                 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
            340                 345                 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
        355                 360                 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
    370                 375                 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
385                 390                 395                 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
                405                 410                 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
            420                 425                 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
        435                 440                 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
    450                 455                 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470                 475
 
<210>16
<211>243
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体7
 
<400>16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
 1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Glu Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
        115                 120                 125
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
                165                 170                 175
Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
            180                 185                 190
Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
        195                 200                 205
Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
    210                 215                 220
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys Phe Asn Arg
225                 230                 235                 240
Gly Glu Cys
 
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>接头+人IgG-κ链的C-末端
 
<400>17
Leu Gly Gly Cys Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1                5                  10
<210>18
<211>477
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体8
 
<400>18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
        115                 120                 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
    130                 135                 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr
                165                 170                 175
Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Val
            180                 185                 190
Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp
        195                 200                 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr
    210                 215                 220
Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Cys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
                245                 250                 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
            260                 265                 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
        275                 280                 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
    290                 295                 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305                 310                 315                 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
                325                 330                 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
            340                 345                 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
        355                 360                 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
    370                 375                 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
385                 390                 395                 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
                405                 410                 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
            420                 425                 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
        435                 440                 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
    450                 455                 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470                 475
 
<210>19
<211>485
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体9
 
<400>19
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
 1               5                  10                  15
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
            20                  25                  30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
        35                  40                  45
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
    50                  55                  60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                85                  90                  95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
            100                 105                 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
        115                 120                 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
    130                 135                 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
                165                 170                 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
            180                 185                 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
        195                 200                 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
    210                 215                 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu
                245                 250                 255
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe
            260                 265                 270
Asp Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
        275                 280                 285
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro
    290                 295                 300
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
305                 310                 315                 320
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
               325                 330                 335
Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            340                 345                 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
        355                 360                 365
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
    370                 375                 380
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala
385                 390                 395                 400
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr
                405                 410                 415
Tyr Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val
            420                 425                 430
Val Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser
        435                 440                 445
Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr
    450                 455                 460
Tyr Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
465                 470                 475                 480
Ser Leu Gly Gly Cys
                485
 
<210>20
<211>469
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体10
 
<400>20
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
 1               5                  10                  15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            20                  25                  30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
        35                  40                  45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    50                  55                  60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65                  70                  75                  80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                85                  90                  95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
            100                 105                 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
        115                 120                 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    130                 135                 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                165                 170                 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
            180                 185                 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        195                 200                 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
    210                 215                 220
Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu
225                 230                 235                 240
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe
                245                 250                 255
Asp Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
            260                 265                 270
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro
        275                 280                 285
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
    290                 295                 300
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
305                 310                 315                 320
Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
                325                 330                 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
            340                 345                 350
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
        355                 360                 365
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala
    370                 375                 380
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr
385                 390                 395                 400
Tyr Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val
                405                 410                 415
Val Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser
            420                 425                 430
Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr
        435                 440                 445
Tyr Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
    450                 455                 460
Ser Leu Gly Gly Cys
465
 
<210>21
<211>466
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体11
 
<400>21
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
 1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Glu Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
        115                 120                 125
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
                165                 170                 175
Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
            180                 185                 190
Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
        195                 200                 205
Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
    210                 215                 220
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225                 230                 235                 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
                245                 250                 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
            260                 265                 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
        275                 280                 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
    290                 295                 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305                 310                 315                 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
                325                 330                 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
            340                 345                 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
        355                 360                 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
    370                 375                 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385                 390                 395                 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
                405                 410                 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
            420                 425                 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
        435                 440                 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
    450                 455                 460
Gly Lys
465
 
<210>22
<211>246
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体12
 
<400>22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
           20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
        115                 120                 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
    130                 135                 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr
                165                 170                 175
Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Val
            180                 185                 190
Val Ser Thr Ser rhr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp
        195                 200                 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr
    210                 215                 220
Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225                 230                 235                 240
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
                245
 
<210>23
<211>6
<212>PRT
<213>智人
 
<220>
<223>人IgGκ链的C-末端
 
<400>23
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
 1               5
 
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>2B6重链可变区-CDR1
<400>24
Asn Tyr Trp Ile His
 1               5
 
<210>25
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>3H7重链可变区-CDR1
 
<400>25
Asp Ala Trp Met Asp
 1               5
 
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>2B6重链可变区-CDR2
 
<400>26
Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe Lys
 1               5                  10                  15
Gly
 
<210>27
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>3H7重链可变区-CDR2
 
<400>27
Glu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn Leu Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser
 1               5                  10                  15
Val Lys Gly
 
<210>28
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>2B6重链可变区-CDR3
 
<400>28
Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Tyr
 1               5                  10
 
<210>29
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>3H7重链可变区-CDR3
 
<400>29
Tyr Ser Pro Phe Ala Tyr
 1               5
 
<210>30
<400>30
000
 
<210>31
<400>31
000
 
<210>32
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>2B6轻链可变区-CDR1
 
<400>32
Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His
 1               5                  10
 
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>3H7轻链可变区-CDR1
 
<400>33
Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser
 1               5                  10
 
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>2B6轻链可变区-CDR2
 
<400>34
Asn Val Ser Glu Ser Ile Ser
 1               5
 
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>2B6轻链可变区-CDR2
 
<400>35
Tyr Val Ser Glu Ser Ile Ser
 1               5
 
<210>36
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>2B6轻链可变区-CDR2
 
<400>36
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
 1               5
 
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>3H7轻链可变区-CDR2
 
<400>37
Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser
 1               5
 
<210>38
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>2B6轻链可变区-CDR3
 
<400>38
Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe Thr
 1               5
 
<210>39
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>3H7轻链可变区-CDR3
 
<400>39
Leu Gln Tyr Val Ser Tyr Pro Tyr Thr
 1               5
 
<210>40
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>2B6重链可变区
 
<400>40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>41
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>2B6轻链可变区-Hu2B6VL-1
 
<400>41
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
 1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Asn Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>42
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化2B6轻链可变区-Hu2B6VL-2
 
<400>42
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
 1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>43
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化2B6轻链可变区-Hu2B6VL-3
 
<400>43
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
 1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>44
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠(mus sp.)
 
<220>
<223>小鼠3H7轻链可变区
 
<400>44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Arg Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Trp Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Ser Tyr Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>45
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>45
Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn
 1               5
 
<210>46
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>46
Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Asn
 1               5
 
<210>47
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>47
Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr
 1               5
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>48
Lys Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr
 1               5
 
<210>49
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>49
Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr
 1               5
 
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>50
Lys Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr
 1               5
 
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>51
Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Asn
 1               5
 
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>52
Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn
 1               5
 
<210>53
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>53
Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr
 1               5
 
<210>54
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
<400>54
Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr
 1               5
 
<210>55
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>55
Lys Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr
 1               5
 
<210>56
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-γ-RIIB受体的IgG结合位点
 
<400>56
Lys Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr
 1               5
 
<210>57
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh321F引物
 
<400>57
cgagctagct ctagatgaga tcacagttct ctctac    36
 
<210>58
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh318R引物
 
<400>58
gcctccgcct ccggatccgc ctcctttgat ctccaccttg gtccctc          47
 
<210>59
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh319F引物
 
<400>59
ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtt cagctggtgc agtctgg          47
 
<210>60
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh320R引物
 
<400>60
tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgaccg tgg              43
 
<210>61
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh315R引物
 
<400>61
gcctccgcct ccggatccgc ctcctttgat ctcaagcttg gtcccc           46
 
<210>62
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh316F引物
 
<400>62
ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtt accctgagag agtctggc         48
 
<210>63
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
 
<223>Lgh317R引物
 
<400>63
tttgaattcc tagcagcctc ccagtgagct cacagtgacc agagtcc          47
 
<210>64
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh339R引物
 
<400>64
ctcaacgcag cctcccagtg agctcac                                27
 
<210>65
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh340R引物
 
<400>65
aacgcagcct cccagtgagg agacggtgac c                           31
<210>66
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh366R引物
 
<400>66
tttgaattct atttacccgg agacagg                                27
 
<210>67
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh367F引物
 
<400>67
ctgggaggct gcgcagagcc caaatcttgt gac                         33
 
<210>68
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh368R引物
 
<400>68
gtcacaagat ttgggctctg cgcagcctcc cag                         33
 
<210>69
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Lgh369R引物
 
<400>69
tttgaattct aacactctcc cctgttgaag cagcctccca gtgaggagac       50
<210>70
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗-CD16A重链可变区(Hu3G8VH-1)
 
<400>70
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
 1               5                  10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>71
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗-CD16A重链可变区(Hu3G8VH-5)
 
<400>71
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
 1               5                  10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>72
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗-CD16A重链可变区(Hu3G8VH-22)
 
<400>72
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
 1               5                  10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser
        115
 
<210>73
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗-CD16A轻链可变区(Hu3G8VL-1)
<400>73
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                 10                 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                 25                 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>74
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗-CD16A轻链可变区(Hu3G8VL-43)
 
<400>74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Ser Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>75
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗-CD16A轻链可变区(Hu3G8VL-22)
 
<400>75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Ser Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>76
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>接头的DNA序列(SEQ ID NO.10)
 
<400>76
ggaggcggat ccggaggcgg aggc                                   24
 
<210>77
<211>18
<212>DNA
<213>智人
 
<220>
<223>人IgGκ链的C-末端的DNA序列
 
<400>77
ttcaacaggg gagagtgt                                          18
 
<210>78
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>接头+人IgGκ链的C-末端
 
<400>78
ctgggaggct gcttcaacag gggagagtgt                             30
 
<210>79
<211>6
<212>PRT
<213>智人
 
<220>
<223>人IgG铰链结构域
 
<400>79
Val Glu Pro Lys Ser Cys
 1               5
 
<210>80
<211>18
<212>DNA
<213>智人
 
<220>
<223>人IgG铰链结构域
 
<400>80
gttgagccca aatcttgt                                          18
 
<210>81
<211>118
<212>PRT
<213>智人
 
<220>
<223>3G8抗体的VH结构域
<400>81
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
 1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>82
<211>354
<212>DNA
<213>智人
 
<220>
<223>3G8抗体的VH结构域
 
<400>82
caggttaccc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg  60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagg acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc 180
tataatccag ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccag caaccaggta 240
ttcctcaaaa tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcaaata 300
aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtgag ctca       354
 
<210>83
<211>354
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗-CD16A重链可变区(Hu3G8VH-5)
<400>83
caggttaccc tgagagagtc tggccctgcg ctggtgaagc ccacacagac cctcacactg  60
acttgtacct tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagcctcccg ggaaggctct agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc 180
tataatccag ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 240
gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg tgctcaaata 300
aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtgag ctca       354
 
<210>84
<211>111
<212>PRT
<213>智人
 
<220>
<223>3G8抗体的VL结构域
 
<400>84
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>85
<211>333
<212>DNA
<213>智人
 
<220>
<223>3G8抗体的VL结构域
 
<400>85
gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa                              333
 
<210>86
<211>333
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗-CD16A轻链可变区(Hu3G8VL-1)
 
<400>86
gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc  60
atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct 180
ggggtcccag acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc 240
agcctgcagg ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaa                              333
 
<210>87
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化2B6重链可变区
 
<400>87
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Val Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>88
<211>363
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化2B6重链可变区
 
<400>88
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc  60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactactgga tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gattggagtg attgatcctt ctgatactta tccaaattac 180
aataaaaagt tcaagggcag agtcaccatg accgtagtcg tatccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaaacggt 300
gattccgatt attactctgg tatggactac tgggggcaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca                                                               363
 
<210>89
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化2B6轻链可变区
 
<400>89
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>90
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化2B6轻链可变区
 
<400>90
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc  60
ttcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca 120
gatcagtctc caaagctcct catcaaggag gtttctgagt ctatctctgg agtcccatcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240
gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a                                           321
 
<210>91
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>凝血酶切割识别位点
 
<400>91
Leu Val Pro Arg Gly Ser
 1               5
 
<210>92
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>凝血因子Xa切割识别位点
 
<220>
<221>变体
<222>2
<223>Xaa＝Glu or Asp
 
<400>92
Ile Xaa Gly Arg
 1
 
<210>93
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>肠激酶切割识别位点
 
<400>93
Asp Asp Asp Asp Lys
 1               5
 
<210>94
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>弗林蛋白酶切割识别位点
 
<220>
<221>变体
<222>2，3
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<400>94
Arg Xaa Xaa Arg
 1
 
<210>95
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>优选的弗林蛋白酶切割识别位点
 
<220>
<221>变体
<222>2
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<220>
<221>变体
<222>3
<223>Xaa＝Lys or Arg
 
<400>95
Arg Xaa Xaa Arg
 1
 
<210>96
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>AcTEV切割识别位点
 
<400>96
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
 1               5
 
<210>97
<211>487
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>共价双抗体多蛋白前体
 
<400>97
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
    130                 135                 140
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro
145                 150                 155                 160
Thr Thr Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Gly Asp
                165                 170                 175
Thr His Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
            180                 185                 190
Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu
        195                 200                 205
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Glu Thr Thr Gly Ile Pro Thr
    210                 215                 220
Gly Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Val Ser Val Thr Val Ser Ser
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Cys Gly Gly Arg Ala Lys Arg Asp Val Gln Met Thr Gln
                245                 250                 255
Ser Pro Ser Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Asn
            260                 265                 270
Cys Lys Ala Ser Glu Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln
        275                 280                 285
Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Met Tyr Asp Gly Ser Thr Leu
    290                 295                 300
Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
305                 310                 315                 320
Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Gly Leu Tyr
                325                 330                 335
Tyr Cys Gln Gln His Tyr Glu Tyr Pro Ala Thr Phe Gly Ser Gly Thr
            340                 345                 350
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Thr
        355                 360                 365
Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser
    370                 375                 380
Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser Gly Met Gly
385                 390                 395                 400
Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
                405                 410                 415
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
            420                 425                 430
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys
        435                 440                 445
Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln
    450                 455                 460
Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465                 470                 475                 480
Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys
                485
 
<210>98
<211>1464
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>共价双抗体多蛋白前体(SEQ ID NO.97的DNA序列)
 
<400>98
gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc   60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac  120
 
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct  180
gggatcccag ccaggtttag tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat  240
cctgtggagg aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac  300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggaggcg gatccggagg cggaggcgag  360
gtggagctag tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gaaggtccct gaaactctcg  420
tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac tattacatgg cctgggtccg gcaggctcca  480
acgacgggtc tggagtgggt cgcatccatt agttatgatg gtggtgacac tcactatcga  540
gactccgtga agggccgatt tactatttcc agagataatg caaaaagcag cctatacctg  600
caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac agagactacg  660
ggaataccta caggtgttat ggatgcctgg ggtcaaggag tttcagtcac tgtctcctca  720
ctgggaggct gcggcgggag agctaagagg gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat  780
cttgctgcct ctcctggaga aagtgtttcc atcaattgca aggcaagtga gagcattagc  840
aagtatttag cctggtatct acagaaacct gggaaagcaa ataagcttct tatgtacgat  900
gggtcaactt tgcaatctgg aattccatcg aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat  960
ttcactctca ccatcagaag cctggagcct gaagattttg gactctatta ctgtcaacag 1020
cattatgaat atccagccac gttcggttct gggaccaagc tggagatcaa aggaggcgga 1080
tccggaggcg gaggccaggt taccctgaaa gagtctggcc ctgggatatt gcagccctcc 1140
cagaccctca gtctgacttg ttctttctct gggttttcac tgaggacttc tggtatgggt 1200
gtaggctgga ttcgtcagcc ttcagggaag ggtctagagt ggctggcaca catttggtgg 1260
gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac tgacaatctc caaggatacc 1320
tccagcaacc aggtattcct caaaatcgcc agtgtggaca ctgcagatac tgccacatac 1380
tactgtgctc aaataaaccc cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 1440
gtgagctcac tgggaggctg ctag                                        1464
 
<210>99
<211>511
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>共价双抗体多蛋白前体
 
<400>99
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
    130                 135                 140
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro
145                 150                 155                 160
Thr Thr Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Gly Asp
                165                 170                 175
Thr His Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
            180                 185                 190
Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu
        195                 200                 205
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Glu Thr Thr Gly Ile Pro Thr
    210                 215                 220
Gly Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Val Ser Val Thr Val Ser Ser
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Cys Gly Gly Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Thr
                245                 250                 255
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
            260                 265                 270
Gly Pro Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Asn Leu Ala Ala Ser
        275                 280                 285
Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Ile Ser
    290                 295                 300
Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu
305                 310                 315                 320
Leu Met Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe
                325                 330                 335
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu
            340                 345                 350
Glu Pro Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Glu Tyr
        355                 360                 365
Pro Ala Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly
    370                 375                 380
Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile
385                 390                 395                 400
Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe
                405                 410                 415
Ser Leu Arg Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser
            420                 425                 430
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
        435                 440                 445
Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr
    450                 455                 460
Ser Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp
465                 470                 475                 480
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr
                485                 490                 495
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys
            500                 505                 510
 
<210>100
<211>1536
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共价双抗体多蛋白前体(SEQ ID NO.99的DNA序列)
 
<400>100
gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc   60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac  120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct  180
gggatcccag ccaggtttag tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat  240
cctgtggagg aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac  300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggaggcg gatccggagg cggaggcgag  360
gtggagctag tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gaaggtccct gaaactctcg  420
tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac tattacatgg cctgggtccg gcaggctcca  480
acgacgggtc tggagtgggt cgcatccatt agttatgatg gtggtgacac tcactatcga  540
gactccgtga agggccgatt tactatttcc agagataatg caaaaagcag cctatacctg  600
caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac agagactacg  660
ggaataccta caggtgttat ggatgcctgg ggtcaaggag tttcagtcac tgtctcctca  720
ctgggaggct gcggcgggag agctaagagg gcccctgtga agcagaccct gaacttcgac  780
ctgctgaagc tggccggaga cgtggagagc aaccccggcc ccgatgtcca gatgacccag  840
tctccatcta atcttgctgc ctctcctgga gaaagtgttt ccatcaattg caaggcaagt  900
gagagcatta gcaagtattt agcctggtat ctacagaaac ctgggaaagc aaataagctt  960
cttatgtacg atgggtcaac tttgcaatct ggaattccat cgaggttcag tggcagtgga 1020
tctggtacag atttcactct caccatcaga agcctggagc ctgaagattt tggactctat 1080
tactgtcaac agcattatga atatccagcc acgttcggtt ctgggaccaa gctggagatc 1140
aaaggaggcg gatccggagg cggaggccag gttaccctga aagagtctgg ccctgggata 1200
ttgcagccct cccagaccct cagtctgact tgttctttct ctgggttttc actgaggact 1260
tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag ccttcaggga agggtctaga gtggctggca 1320
cacatttggt gggatgatga caagcgctat aatccagccc tgaagagccg actgacaatc 1380
tccaaggata cctccagcaa ccaggtattc ctcaaaatcg ccagtgtgga cactgcagat 1440
actgccacat actactgtgc tcaaataaac cccgcctggt ttgcttactg gggccaaggg 1500
actctggtca ctgtgagctc actgggaggc tgctag                           1536
 
<210>101
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体
 
<400>101
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
 1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Glu Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
        115                 120                 125
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
                165                 170                 175
Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
            180                 185                 190
Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
        195                 200                 205
Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
    210                 215                 220
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
 
<210>102
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体(SEQ ID NO.101的DNA序列)
 
<400>102
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc  60
ttcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca 120
gatcagtctc caaagctcct catcaaggag gtttctgagt ctatctctgg agtcccatcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240
gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt taccctgaga 360
gagtctggcc ctgcgctggt gaagcccaca cagaccctca cactgacttg taccttctct 420
gggttttcac tgagcacttc tggtatgggt gtaggctgga ttcgtcagcc tcccgggaag 480
gctctagagt ggctggcaca catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg 540
aagagccgac tgacaatctc caaggatacc tccaaaaacc aggtagtcct cacaatgacc 600
aacatggacc ctgtggatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc cgcctggttt 660
gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctcat tcaacagggg agagtgttag 720
 
<210>103
<211>246
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体
 
<400>103
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
        115                 120                 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
    130                 135                 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr
                165                 170                 175
Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Val
            180                 185                 190
Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp
        195                 200                 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr
    210                 215                 220
Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225                 230                 235                 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys
                245
 
<210>104
<211>741
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>双抗体构建体(SEQ ID NO.103的DNA序列)
 
<400>104
gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc  60
atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct 180
ggggtcccag acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc 240
agcctgcagg ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg cggaggccag 360
gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 420
tgcaaggctt ctggttacac ctttaccaac tactggatac actgggtgcg acaggcccct 480
ggacaagggc ttgagtggat tggagtgatt gatccttctg atacttatcc aaattacaat 540
aaaaagttca agggcagagt caccatgacc gtagtcgtat ccacgagcac agcctacatg 600
gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aaacggtgat 660
tccgattatt actctggtat ggactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctca 720
gttgagccca aatcttgtta g                                           741
 
<210>105
<211>717
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>H3G8VL-CB3.1VH
 
<400>105
gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc    60
atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac    120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct    180
ggggtcccag acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc    240
agcctgcagg ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac    300
acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg cggaggccag    360
gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc    420
tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct    480
ggacaaggcc ttgaatggat tggtatggtt gatccttcag acagtgaaac tcactacaat    540
caaatgttca aggacaaggc cacattgact gttgacaaat cctccagcac agcctacatg    600
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag agctatgggc    660
tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagttg agcccaaatc ttgttag       717
 
<210>106
<211>238
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>H3G8VL-CB3.1VH
 
<400>106
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala
        115                 120                 125
Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
    130                 135                 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Val Asp Pro Ser Asp Ser Glu
                165                 170                 175
Thr His Tyr Asn Gln Met Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp
            180                 185                 190
Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln
    210                 215                 220
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Val Glu Pro Lys Ser Cys
225                 230                 235
 
<210>107
<211>735
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>CB3.1VL-h3G8VH
 
<400>107
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca accagcctcc     60
atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg gaaagacata tttgaattgg    120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac cgcctaatct atctggtgtc taaactggac    180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc    240
agcagagtgg aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg    300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg aggcggaggc    360
caggttaccc tgagagagtc tggccctgcg ctggtgaagc ccacacagac cctcacactg    420
acttgtacct tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt    480
cagcctcccg ggaaggctct agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc    540
tataatccag ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta    600
gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg tgctcaaata    660
aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtgag ctcattcaac    720
aggggagagt gttag                                                     735
 
<210>108
<211>244
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>CB3.1VL-h3G8VH
 
<400>108
 
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Asn Ile Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Thr
            20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly
        115                 120                 125
Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe
    130                 135                 140
Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg
145                 150                 155                 160
Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp
                165                 170                 175
Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser
            180                 185                 190
Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp
        195                 200                 205
Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp
    210                 215                 220
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Asn
225                 230                 235                 240
Arg Gly Glu Cys
 
<210>109
<211>704
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>8B5-CB3.1-VEPKSC
 
<400>109
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga aagagtcagt     60
ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca    120
gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa    180
aggttcagtg gcagtgagtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct    240
gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct    300
gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt ccaactgcag    360
cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga agctgtcctg caaggcttct    420
ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt    480
gaatggattg gtatggttga tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag    540
gaaaggccac attgactgtt gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc    600
tgacatctga ggactctgcg gtctattact gtgcaagagc tatgggctac tggggtcaag    660
gaacctcagt caccgtctcc tcagttgagc ccaaatcttg ttag                     704
 
<210>110
<211>234
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>8B5-CB3.1-VEPKSC
 
<400>110
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Leu Ala Ala Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Glu Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
        115                 120                 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
    130                 135                 140
Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
145                 150                 155                 160
Glu Trp Ile Gly Met Val Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn
                165                 170                 175
Gln Met Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
            180                 185                 190
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
        195                 200                 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
    210                 215                 220
Thr Val Ser Ser Val Glu Pro Lys Ser Cys
225                 230
<210>111
<211>729
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>CB3.1-8B5-FNRGEC
 
<400>111
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca accagcctcc     60
atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg gaaagacata tttgaattgg    120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac cgcctaatct atctggtgtc taaactggac    180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc    240
agcagagtgg aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg    300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg aggcggaggc    360
gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc    420
tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct    480
ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca    540
tactatgctg agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt    600
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtggggct    660
ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcgtt caacagggga    720
gagtgttag                                                            729
 
<210>112
<211>242
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>CB3.1-8B5-FNRGEC
<400>112
 
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Asn Ile Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Thr
            20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Glu Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser
145                 150                 155                 160
Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys
                165                 170                 175
Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile
            180                 185                 190
Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
        195                 200                 205
Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp
    210                 215                 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Phe Asn Arg Gly
225                 230                 235                 240
Glu Cys
 
<210>113
<211>699
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>8B5VL-CB3.1VH-LGGC
<400>113
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga aagagtcagt     60
ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca    120
gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa    180
aggttcagtg gcagtgagtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct    240
gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct    300
gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt ccaactgcag    360
cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga agctgtcctg caaggcttct    420
ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt    480
gaatggattg gtatggttga tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag    540
gacaaggcca cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc    600
ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta ctggggtcaa    660
ggaacctcag tcaccgtctc ctcactggga ggctgctag                           699
 
<210>114
<211>232
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>8B5VL-CB3.1VH-LGGC
 
<400>114
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Leu Ala Ala Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Glu Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
        115                 120                 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
    130                 135                 140
Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
145                 150                 155                 160
Glu Trp Ile Gly Met Val Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn
                165                 170                 175
Gln Met Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
            180                 185                 190
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
        195                 200                 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
    210                 215                 220
Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys
225                 230
 
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tag                                                                  723
 
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<213>人工的
 
<220>
<223>CB3.1-8B5-LGGC
 
<400>116
 
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Asn Ile Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Thr
            20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly
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Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Glu Ala
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Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser
145                 150                 155                 160
Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys
                165                 170                 175
Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile
            180                 185                 190
Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
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Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys
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ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg aagcttgagg agtctgg                47
 
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<220>
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Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Met
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Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln
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Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
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Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala
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<212>DNA
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<220>
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<210>129
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<213>人工的
 
<220>
<223>3G8-2.4G2-hG1
 
<400>129
 
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
    130                 135                 140
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro
145                 150                 155                 160
Thr Thr Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Gly Asp
                165                 170                 175
Thr His Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
            180                 185                 190
Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu
        195                 200                 205
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Glu Thr Thr Gly Ile Pro Thr
    210                 215                 220
Gly Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Val Ser Val Thr Val Ser Ser
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Cys Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
                245                 250                 255
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
            260                 265                 270
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
        275                 280                 285
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
    290                 295                 300
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
305                 310                 315                 320
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                325                 330                 335
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
            340                 345                 350
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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385                 390                 395                 400
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
                405                 410                 415
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
            420                 425                 430
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
465                 470                 475                 480
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                485                 490                 495
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
        515                 520                 525
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
    530                 535                 540
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
 
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
            20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala
145                 150                 155                 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys
                165                 170                 175
Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile
            180                 185                 190
Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
        195                 200                 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
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Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile
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Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu
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Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
        115                 120                 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
145                 150                 155                 160
Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn
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Gln Met Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
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Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
            195                 200                 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
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Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn
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Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
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Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
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Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
    210                 215                 220
Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys
225                 230

Claims (131)

1.一种双抗体分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，
所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和(iii)包含Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；
所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，和(iii)包含Fc结构域的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；
其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合所述第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；且
其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合所述第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
2.根据权利要求1所述的双抗体分子，其中所述第三结构域还包含铰链结构域。
3.一种双抗体分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，
所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和(iii)包含铰链结构域和Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；
所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，和(iii)包含人类轻链恒定结构域的至少C-末端2至8氨基酸残基的氨基酸序列的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；
其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合所述第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；且
其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合所述第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
4.一种双抗体分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，
所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和(iii)包含铰链结构域的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；
所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，和(iii)包含人类轻链恒定结构域的至少C-末端2至8氨基酸残基的氨基酸序列的第六结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；
其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合所述第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；且
其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合所述第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
5.根据权利要求3或4所述的双抗体分子，其中所述人类轻链是人类κ轻链。
6.根据权利要求3或4所述的双抗体分子，其中所述人类轻链是λ轻链。
7.根据权利要求5所述的双抗体分子，其中所述第六结构域包含所述C-末端6氨基酸的氨基酸序列，所述序列为PheAsnArgGlyGluCys(SEQ IDNO：23)。
8.根据权利要求1、2、3或4所述的双抗体分子，其中所述第一多肽链与所述第二多肽链经由所述第一多肽链上所述第一结构域和所述第二结构域之外的至少一个半胱氨酸残基与所述第二多肽链上所述第四结构域和所述第五结构域之外的至少一个半胱氨酸残基之间的至少一个二硫键共价连接。
9.根据权利要求8所述的双抗体分子，其中所述第一多肽链上的半胱氨酸残基在所述第三结构域中，并且所述第二多肽链上的半胱氨酸残基在所述第六结构域中。
10.一种双抗体分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，
所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，和(iii)包含Fc结构域或其部分的第三结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；
所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第四结构域，和(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第五结构域，所述第四结构域与所述第五结构域共价连接以使所述第四结构域与所述第五结构域不缔合形成表位结合位点；
其中所述第一结构域与所述第五结构域缔合形成结合所述第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；
其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合所述第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)；且
其中所述第三结构域位于所述第一结构域和所述第二结构域两者的N-末端。
11.根据权利要求10所述的双抗体分子，其中所述第三结构域还包括铰链区。
12.根据权利要求10或11所述的双抗体分子，其中所述第一多肽链与所述第二多肽链经由所述第一多肽链上所述第一结构域和所述第二结构域之外的至少一个半胱氨酸残基与所述第二多肽链上所述第四结构域和所述第五结构域之外的至少一个半胱氨酸残基之间的至少一个二硫键共价连接。
13.根据权利要求12所述的双抗体分子，其中所述第一多肽链上的所述至少一个半胱氨酸残基在所述第一结构域、第二结构域和第三结构域的C-末端，且所述第二多肽链上的所述至少一个半胱氨酸残基在所述第四结构域和第五结构域的C-末端。
14.根据权利要求1、3或10所述的双抗体分子，其中所述分子包含相对于野生型第一结构域的第一结构域中的至少一个氨基酸修饰和相对于野生型第五结构域的第五结构域中的至少一个氨基酸修饰，所述第一结构域和所述第五结构域各自的所述至少一个氨基酸修饰包括以半胱氨酸取代，以使所述第一多肽链和所述第二多肽链经由所述第一结构域中所述取代的半胱氨酸残基与所述第五结构域中所述取代的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。
15.根据权利要求1、3或10所述的双抗体分子，其中所述Fc结构域包含相对于野生型Fc结构域的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰包括在位置215以丙氨酸取代。
16.根据权利要求3、10或11所述的双抗体分子，所述分子包含两个单体，其中每个单体包含所述第一多肽链和所述第二多肽链且其中所述单体经由每个单体第一多肽链的第三结构域中的至少一个半胱氨酸残基之间的至少一个二硫键共价连接。
17.根据权利要求1、3或10所述的双抗体分子，其中所述第一结构域和所述第四结构域分别位于所述第二结构域和所述第五结构域的N-末端。
18.根据权利要求1、3或10所述的双抗体分子，其中所述第一结构域和所述第四结构域分别位于所述第二结构域和所述第五结构域的C-末端。
19.根据权利要求1或2所述的双抗体分子，其中所述第六结构域在所述第四结构域和所述第五结构域的C-末端。
20.根据权利要求1、3、4或10所述的双抗体分子，其中所述第一结构域和所述第二结构域之间的共价连接是肽键。
21.根据权利要求1、3、4或10所述的双抗体分子，其中所述第四结构域和所述第五结构域之间的共价连接是肽键。
22.根据权利要求20所述的双抗体分子，其中所述第一结构域和所述第二结构域间隔0、1、2、3、4、5、6、7、8或9氨基酸残基。
23.根据权利要求21所述的双抗体分子，其中所述第四结构域和第五结构域间隔0、1、2、3、4、5、6、7、8或9氨基酸残基。
24.一种双抗体分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，
所述第一多肽链包括(i)包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)的第一结构域，和(ii)包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)的第二结构域，所述第一结构域与所述第二结构域共价连接以使所述第一结构域与所述第二结构域不缔合形成表位结合位点；
所述第二多肽链包括(i)包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)的第三结构域，和(ii)包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)的第四结构域，所述第三结构域与所述第四结构域共价连接以使所述第三结构域与所述第四结构域不缔合形成表位结合位点；
其中所述第一结构域与所述第三结构域缔合形成结合所述第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)，该表位结合位点是对CD32B特异性的；
其中所述第二结构域与所述第四结构域缔合形成结合所述第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)，该表位结合位点是对CD16特异性的；且
其中所述第一多肽链和所述第二多肽链经由所述第一多肽链上所述第一结构域和所述第二结构域之外的至少一个半胱氨酸残基与所述第二多肽链上所述第三结构域和所述第四结构域之外的至少一个半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接，所述第一多肽链上的半胱氨酸残基不位于所述第一多肽链的C-末端，且所述第二多肽链上的半胱氨酸残基不位于所述第二多肽链的C-末端。
25.根据权利要求24所述的双抗体分子，其中所述第一结构域与所述第二结构域之间的共价连接是肽键。
26.根据权利要求24所述的双抗体分子，其中所述第三结构域与所述第四结构域之间的共价连接是肽键。
27.根据权利要求24所述的双抗体分子，其中二硫键在所述第一多肽链上的至少两个半胱氨酸残基与所述第二多肽链上的至少两个半胱氨酸残基之间。
28.根据权利要求1、3、4、10或24所述的双抗体分子，其中所述第一表位与所述第二表位不同。
29.根据权利要求28所述的双抗体分子，其中所述第一表位与所述第二表位是来自相同分子的表位。
30.根据权利要求28所述的双抗体分子，其中所述第一表位与所述第二表位是来自不同分子的表位。
31.根据权利要求1、3、4、10或24所述的双抗体分子，其中所述第一免疫球蛋白或所述第二免疫球蛋白是人类或人源化免疫球蛋白。
32.根据权利要求31所述的双抗体分子，其中所述第一免疫球蛋白或所述第二免疫球蛋白是人类免疫球蛋白，所述人类免疫球蛋白是IgA、IgE、IgD、IgG或IgM。
33.根据权利要求32所述的双抗体分子，其中所述人类免疫球蛋白是IgG，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的列表。
34.根据权利要求1、3或10所述的双抗体分子，其中所述Fc结构域是人类Fc结构域。
35.根据权利要求34所述的双抗体分子，其中所述Fc结构域是IgA、IgE、IgD、IgG或IgM的Fc结构域。
36.根据权利要求35所述的双抗体分子，其中所述Fc结构域是IgG的Fc结构域，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4组成的列表。
37.根据权利要求1、3、4或10所述的双抗体分子，其中至少一个表位结合位点是对B-细胞、T-细胞、吞噬细胞、天然杀伤(NK)细胞或树突细胞特异性的。
38.根据权利要求1、3、4或10所述的双抗体分子，其中至少一个表位结合位点是对细胞表面标记特异性的。
39.根据权利要求38所述的双抗体分子，其中所述细胞表面标记是Fc受体。
40.根据权利要求39所述的双抗体分子，其中所述Fc受体是活化性Fc受体。
41.根据权利要求39所述的双抗体分子，其中所述Fc受体是抑制性Fc受体。
42.根据权利要求39所述的双抗体分子，其中所述Fc受体是Fcγ受体。
43.根据权利要求42所述的双抗体分子，其中所述Fcγ受体是FcγRI、FcγRII或FcγRIII受体。
44.根据权利要求43所述的双抗体分子，其中所述Fcγ受体是FcγRIII受体，所述FcγRIII受体是FcγRIIIA(CD16A)受体或FcγRIIIB(CD16B)受体。
45.根据权利要求44所述的双抗体分子，其中所述FcγRIII受体是FcγRIIIA(CD16A)受体。
46.根据权利要求42所述的双抗体分子，其中所述VL1区和VH1区包含来源于第一免疫球蛋白的第一表位结合位点，所述免疫球蛋白是抗体3G8。
47.根据权利要求24所述的双抗体分子，其中所述VL1区和VH1区包含来源于第二免疫球蛋白的第二表位结合位点，所述免疫球蛋白是抗体3G8。
48.根据权利要求46所述的双抗体分子，其中所述抗体3G8是人源化的。
49.根据权利要求47所述的双抗体分子，其中所述抗体3G8是人源化的。
50.根据权利要求48所述的双抗体分子，其中所述VL1区包含氨基酸序列SEQ ID NO：73，且所述VH1区包含氨基酸序列Seq ID NO：71。
51.根据权利要求49所述的双抗体分子，其中所述VL1区包含氨基酸序列SEQ ID NO：73，且所述VH1区包含氨基酸序列Seq ID NO：71。
52.根据权利要求43所述的双抗体分子，其中所述Fcγ受体是FcγRII受体，所述FcγRII受体是FcγRIIA(CD32A)受体或FcγRIIB(CD32B)受体。
53.根据权利要求52所述的双抗体分子，其中所述FcγRII受体是FcγRIIA(CD32A)受体。
54.根据权利要求53所述的双抗体分子，其中所述VL1区和所述VH1区包含来源于第一免疫球蛋白的第一表位结合位点，所述免疫球蛋白是抗体IV.3。
55.根据权利要求54所述的双抗体分子，其中抗体IV.3.是人源化的。
56.根据权利要求53所述的双抗体分子，其中所述FcγRII受体是FcγRIIB(CD32B)受体。
57.根据权利要求56所述的双抗体分子，其中所述VL1区和VH1区包含来源于第一免疫球蛋白的第一表位结合位点，所述免疫球蛋白是抗体2B6。
58.根据权利要求24所述的双抗体分子，其中所述VL1区和VH1区包含来源于第一免疫球蛋白的第一表位结合位点，所述免疫球蛋白是抗体2B6。
59.根据权利要求57所述的双抗体分子，其中抗体2B6是人源化的。
60.根据权利要求58所述的双抗体分子，其中抗体2B6是人源化的。
61.根据权利要求59所述的双抗体分子，其中所述VL1区包含氨基酸序列SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43且所述VH1区包含氨基酸序列SEQ ID NO：40。
62.根据权利要求60所述的双抗体分子，其中所述VL1区包含氨基酸序列SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43且所述VH1区包含氨基酸序列SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43且所述VH1区包含氨基酸序列SEQ ID NO：40。
63.根据权利要求59所述的双抗体分子，其中所述VL1区包含相对于野生型2B6 VL1区的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰包括在位置105以半胱氨酸取代；且其中所述VH1区包含相对于野生型2B6 VH1区的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰包括在位置44以半胱氨酸取代。
64.根据权利要求60所述的双抗体分子，其中所述VL1区包含相对于野生型2B6 VL1区的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰包括在位置105以半胱氨酸取代；且其中所述VH1区包含相对于野生型2B6 VH1区的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰包括在位置44以半胱氨酸取代。
65.根据权利要求42所述的双抗体分子，其中所述第二表位结合位点是对致病抗原特异性的。
66.根据权利要求65所述的双抗体分子，其中所述致病抗原是肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原或自身免疫抗原。
67.根据权利要求66所述的双抗体分子，其中所述致病抗原是细菌抗原。
68.根据权利要求67所述的双抗体分子，其中所述细菌抗原是脂多糖。
69.根据权利要求66所述的双抗体分子，其中所述致病抗原是病毒抗原。
70.根据权利要求69所述的双抗体分子，其中所述病毒抗原选自由人类免疫缺陷病毒、腺病毒和肝炎病毒的抗原组成的组。
71.根据权利要求66所述的双抗体分子，其中所述致病抗原是自身免疫抗原。
72.根据权利要求71所述的双抗体分子，其中所述自身免疫抗原选自由DNA、RNA和胶原组成的组。
73.根据权利要求38所述的双抗体分子，其中所述第二表位结合位点是对毒素特异性的。
74.根据权利要求38所述的双抗体分子，其中所述第二表位结合位点是对药物特异性的。
75.根据权利要求39所述的双抗体分子，其中所述第二表位结合位点是对毒素特异性的。
76.根据权利要求39所述的双抗体分子，其中所述第二表位结合位点是对药物特异性的。
77.根据权利要求1所述的双抗体分子，其中所述第一表位结合位点是对CD32B特异性的且所述第二表位结合位点是对CD16A特异性的。
78.根据权利要求3所述的双抗体分子，其中所述第一表位结合位点是对CD16A特异性的且所述第二表位结合位点是对CD32B特异性的。
79.根据权利要求4所述的双抗体分子，其中所述第一表位结合位点是对CD16A特异性的且所述第二表位结合位点是对CD32B特异性的。
80.根据权利要求10所述的双抗体分子，其中所述第一表位结合位点是对CD32B特异性的且所述第二表位结合位点是对CD16A特异性的。
81.根据权利要求11所述的双抗体分子，其中所述第一表位结合位点是对CD32B特异性的且所述第二表位结合位点是对CD16A特异性的。
82.根据权利要求24所述的双抗体分子，其中所述第一表位结合位点是对CD32B特异性的且所述第二表位结合位点是对CD16A特异性的。
83.根据权利要求77所述的双抗体分子，其中所述第一多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，且其中所述第二多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO：15。
84.根据权利要求78所述的双抗体分子，其中所述第一多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO：18，且其中所述第二多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO：16。
85.根据权利要求81所述的双抗体分子，其中所述第一多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO：19，且所述第二多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO：9。
86.根据权利要求80所述的双抗体分子，其中所述第一多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO：20，且所述第二多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO：9。
87.根据权利要求82所述的双抗体分子，其中所述第一多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO：9，且所述第二多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO：11。
88.根据权利要求82所述的双抗体分子，其中所述第一多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO：11，且所述第二多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO：9。
89.根据权利要求1、3、4或10所述的双抗体分子，其中所述第三结构域包含变体Fc区，所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰。
90.根据权利要求89所述的双抗体分子，其中所述修饰造成所述Fc区与Fc受体之间改变的结合亲和性。
91.根据权利要求90所述的双抗体分子，其中所述修饰造成所述Fc区与Fc受体之间无结合。
92.一种核酸，其包含编码权利要求1、3、4、10或24所述的双抗体分子的第一多肽链或第二多肽链的核苷酸序列。
93.一种核酸，其包含编码权利要求1、3、4、10或24所述的双抗体分子的第一多肽链和第二多肽链的核苷酸序列。
94.一种载体，其包含权利要求92所述的核酸。
95.一种载体，其包含权利要求93所述的核酸。
96.根据权利要求94所述的载体，其是表达载体。
97.根据权利要求95所述的载体，其是表达载体。
98.一种宿主细胞，其包含权利要求94所述的核酸。
99.一种宿主细胞，其包含权利要求95所述的核酸。
100.一种重组地产生双抗体分子的方法，所述方法包括：
a.在适于表达所述双抗体分子的条件下在培养基中培养权利要求98所述的宿主细胞；并
b.从所述培养基回收所述双抗体分子。
101.一种重组地产生双抗体分子的方法，所述方法包括：
a.在适于表达所述双抗体分子的条件下在培养基中培养权利要求98所述的宿主细胞；并
b.从所述培养基回收所述双抗体分子。
102.一种治疗特征为致病抗原的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的患者施用有效量的权利要求66所述的双抗体分子，所述双抗体分子结合于所述致病抗原。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
104.根据权利要求102所述的方法，其中所述疾病或病症是传染病。
105.一种诱导对致病抗原免疫耐受的方法，其包括向需要其的患者施用有效量的权利要求66所述的双抗体分子。
106.一种解毒方法，其包括向需要其的患者施用有效量的权利要求73所述的双抗体分子。
107.一种解毒方法，其包括向需要其的患者施用有效量的权利要求74所述的双抗体分子。
108.根据权利要求28所述的双抗体分子，其中所述第一表位和所述第二表位来自不同细胞。
109.根据权利要求1、3或10所述的双抗体分子，其中所述Fc结构域部分包含CH2缺失的部分。
110.根据权利要求1、3或10所述的双抗体分子，其中所述Fc结构域部分包含CH3缺失的部分。
111.根据权利要求3、10或11所述的双抗体分子，所述分子是二聚体，所述二聚体包含：
(a)第一单体，其包含一组所述第一多肽链和所述第二多肽链；和
(b)第二单体，其包含一组所述第一多肽链和所述第二多肽链，其中所述第一单体和第二单体经由每个单体的第一多肽链的第三结构域中至少一个半胱氨酸残基之间的至少一个二硫键共价连接。
112.根据权利要求111所述的双抗体分子，其中所述第一单体和所述第二单体相同。
113.根据权利要求112所述的双抗体分子，其中所述第一单体和所述第二单体不同。
114.一种双重亲和性再靶向试剂(DART)。
115.根据权利要求114所述的DART，其中所述DART将多种亲和性连在一起。
116.根据权利要求114所述的DART，其中所述DART具有对huCD32B、huCD16A、huCD16B、半抗原或荧光素的亲和性。
117.一种治疗患者B细胞恶性肿瘤的方法，其包括向所述患者施用有效量的权利要求114-116任一项所述的DART。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤的至少一些B细胞不表达CD20或已变得对
Figure FPA00001026478500131
抗CD20抗体治疗耐受。
119.一种双抗体分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中：
(A)所述第一多肽链包含：
(i)结构域(A)，其包含对表位(1)特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)；
(ii)结构域(B)，其包含对表位(2)特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)；和
(iii)结构域(C)，其包含轻链恒定区(CL)结构域或其部分；
(B)所述第二多肽链包含：
(i)结构域(D)，其包含对所述表位(2)特异性的所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)；
(ii)结构域(E)，其包含对所述表位(1)特异性的所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)；
(iii)结构域(F)，其包含重链恒定区1(CH1)结构域或其部分，和
(iv)铰链区、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)；
其中：
所述结构域(A)和(B)不互相缔合以形成表位结合位点；
所述结构域(D)和(E)不互相缔合以形成表位结合位点；
所述结构域(A)和(E)缔合以形成结合所述表位(1)的结合位点；所述结构域(B)和(D)缔合以形成结合所述表位(2)的结合位点；且
所述结构域(C)和(F)经由二硫键缔合在一起以形成CH1结构域或其部分。
120.根据权利要求119所述的双抗体分子，其中所述分子另外包含第三多肽链和第四多肽链，其中：
(A)所述第三多肽链包含：
(i)结构域(G)，其包含对表位(3)特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)；
(ii)结构域(H)，其包含对表位(4)特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)；和
(iii)结构域(I)，其包含轻链恒定区(CL)结构域或其部分；
(B)所述第四多肽链包含：
(i)结构域(J)，其包含对所述表位(4)特异性的所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL2)；
(ii)结构域(K)，其包含对所述表位(3)特异性的所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH1)；
(iii)结构域(L)，其包含重链恒定区1(CH1)结构域或其部分；
其中：
所述结构域(G)和(H)不互相缔合以形成表位结合位点；
所述结构域(J)和(K)不互相缔合以形成表位结合位点；
所述结构域(G)和(K)缔合以形成结合所述表位(3)的结合位点；所述结构域(H)和(J)缔合以形成结合所述表位(4)的结合位点；
所述结构域(I)和(L)经由二硫键缔合在一起以形成CH1结构域或其部分；且
所述第二多肽链与第四多肽链的所述铰链区、重链恒定区2(CH2)和所述重链恒定区3(CH3)缔合以形成Fc区。
121.根据权利要求120所述的双抗体分子，其中所述表位(1)和(3)都存在于抗原分子上。
122.根据权利要求120所述的双抗体分子，其中所述表位(1)和(3)相同。
123.根据权利要求120所述的双抗体分子，其中所述表位(2)和(4)都存在于抗原分子上。
124.根据权利要求120所述的双抗体分子，其中所述表位(2)和(4)相同。
125.根据权利要求119或120所述的双抗体分子，其中至少一个表位是以下的表位：病原体的抗原、自身免疫抗原、毒素、药物。
126.根据权利要求119或120所述的双抗体分子，其中至少一个表位是CD32B且至少一个表位是CD16A。
127.编码权利要求119所述的第一多肽链和第二多肽链的核酸分子。
128.编码权利要求120所述的第一、第二、第三和第四多肽链的核酸分子。
129.一种治疗特征为致病抗原的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的患者施用有效量的权利要求119或120所述的双抗体分子，所述双抗体分子具有结合于所述致病抗原的表位结合位点。
130.一种双重亲和性再靶向试剂(“DART”)，所述试剂包括多条多肽链并能够同时结合于两个、三个或更多表位。
131.根据权利要求130所述的双重亲和性再靶向试剂(“DART”)，其中所述DART是二价的、四价的；六价的或八价的。
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