CN108982461A - 一种时间分辨型荧光传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种时间分辨型荧光传感器及其制备方法和应用，其传感器由Mn@ZGNPs氧化物与多巴胺构成，将该传感器与缓冲溶液和生物硫醇混合，利用生物硫醇抑制多巴胺氧化聚合的原理，使用酶标仪中时间分辨荧光检测的功能获得响应信号。由于不同生物硫醇的还原性差异导致多巴胺的自氧化聚合行为受到不同程度的抑制，因此，该Mn@ZGNPs氧化物在不同浓度不同生物硫醇条件下可获得不同的时间分辨荧光信号。最后用主成分分析（PCA）的方法分析获得时间分辨荧光信号，实现了对谷胱甘肽、L‑半胱氨酸、D‑半胱氨酸和同型半胱氨酸等生物硫醇的区分和检测。本发明能够对4种生物硫醇区分和检测，还可实现人体尿液和唾液中生物硫醇的半定量检测。

Description

一种时间分辨型荧光传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物传感分析检测领域，涉及一种有机-无机杂化传感器，用免标记的时间分辨荧光方法实现了对人体内常见生物硫醇的区分及检测。

背景技术

氧化应激是造成神经退行性疾病的重要因素之一。在正常情况下，活性氧的产生和抗活性氧水平两者处于平衡状态，活性氧积蓄过多导致攻击机体的反应即为氧化应激反应。氧化应激是指由于自由基过度产生或得不到及时清除，体内氧化与抗氧化作用两者失衡，导致机体的细胞和组织被损伤。自由基是具有未配对电子的原子或原子团，主要有超氧阴离子自由基（O₂ ^-•）、过氧化自由基（ROO•）、羟自由基（OH•）、一氧化氮（NO）和过氧化氢（H₂O₂）等。这些自由基可以使生物膜的不饱和脂肪酸发生过氧化而影响膜的结构和功能，攻击蛋白质使之发生交联而改变酶的功能或DNA损伤引起突变，导致生物大分子功能和结构损伤、细胞破坏或死亡。活体生物在防御系统中已开发复杂抗氧化系统阻碍活性物质以减少氧化应激对细胞或器官的损伤。

抗氧化剂是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害并防止氧化应激产生的一类物质，在神经退行性疾病研究中具有重要意义。抗氧化剂包括各种大分子、酶和小分子，如谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）、抗坏血酸（AA）、α-维生素E、β-胡萝卜素、泛醌-10、蛋氨酸和胆红素。这些硫醇化合物在植物重金属解毒中也发挥重要的作用。由于不同抗氧化成分在生物体液中具有协同作用，最常见的测量个体的抗氧化成分策略之一是通过测量总抗氧化能力来评估自由基-抗氧化剂在生物系统的平衡。因此，建立快速、有效的抗氧化剂分析方法对于生命科学和食品科学分析具有很好的理论和应用研究价值。

聚多巴胺（Polydopamine, PDA）是一类聚合物纳米材料，它通过多巴胺自身在一定的氧化条件或者碱性条件下发生自聚合，生成一系列具有不同分子量的低聚物。这些低聚物通过去质子化和分子间迈克尔加成反应进一步氧化和聚合，发生交联反应生成分子量较高的聚合物。通过多种非共价键的协同作用, 多巴胺、多巴胺氧化产物及其低聚物、高聚物在溶液中可自发组装形成不同形态结构的组装体, 这一组装体就是聚多巴胺。近年来，研究发现聚多巴胺具有独特的物理及化学性质、良好的粘附性、良好的生物相容性和生物可降解性, 因而被广泛地应用于纳米材料的表面修饰和改性、生物传感器和电化学传感器的构建、细胞活体成像以及金属离子的检测等领域。其中，基于聚多巴胺纳米颗粒的荧光传感平台在核酸分析方面的应用引起了研究者的关注。同时，聚多巴胺是一种类似于石墨烯的新型的聚合物纳米材料，也可以用作超薄纳米材料。

聚多巴胺具有一个很宽波段的紫外-可见吸收光谱，这一特性使其能够作为广谱淬灭剂，结合荧光共振能量转移（FRET）原理构建荧光传感器。虽然已经出现了诸多如碳纳米管、石墨烯、二硫化钼纳米片和金属有机框架材料等许多纳米材料用作淬灭剂的报道，但是很少有能够像PDA一样兼具制备简便且具有优异的黏附性、生物可降解性及亲水性等优点的材料。开发基于PDA优异理化性质和生物分子特异性识别结合特性的新型生物传感器件或分子探针已成为当前国内外的研究热点。从近几年的发展情况来看，制备结构性能优异的PDA并对其表面进行生物分子功能化修饰及改性是促进基于PDA的生物传感器件或分子探针快速发展的重要因素之一。例如，将PDA作为淬灭剂并与DNA探针组装或结合可以构筑新型荧光传感方法应用于生物分析等领域。单链DNA（ssDNA）能够通过其碱基与 PDA 的芳香基团之间发生高亲和π-π堆积相互作用而组装到 PDA 表面上；PDA较大的比表面积使其能够作为组装ssDNA探针的基质材料，并可通过FRET方式淬灭ssDNA上标记染料的荧光^[25]。近几年基于PDA与荧光染料标记ssDNA相互作用的荧光传感分析方法得到长足发展，这些分析方法主要是基于靶标诱导荧光染料标记ssDNA从PDA表面释放，从而产生荧光“开启”信号用于检测mRNA、DNA、凝血酶等靶标物。但荧光染料价格昂贵，且具光漂白性，从实际应用上看仍不能较好地满足当今检测的需要。因而，开发更稳定的荧光探针，提高检测的灵敏度与实际可操作性，成为众多研究者关注的焦点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种时间分辨型荧光传感器及制备方法和应用，首次从生物分子化学活泼性差异的角度，克服了当前生物硫醇模式识别方法重现性差、灵敏度低的缺陷，以及需要昂贵的染料标记、染料荧光且易被背景信号干扰的不足。

实现本发明目的的具体技术方案是：

一种时间分辨型荧光传感器的制备方法，该方法包括以下具体步骤：

步骤1：制备锰离子掺杂的锌锗氧化物

将GeO₂与NaOH于70~90 ℃下冷凝回流20~36 h，得到0.1~0.6 M Na₂GeO₃溶液，其中GeO₂与NaOH的摩尔比为1∶2；配置1~4 M 的Zn(NO₃)₂、0.02~0.08 M 的Mn(NO₃)₂溶液；将 Zn(NO₃)₂溶液、Mn(NO₃)₂溶液、浓硝酸溶液（wt = 98%）、Na₂GeO₃溶液与去离子水以体积比为392∶25∶120∶150∶4400混合，其中Na₂GeO₃溶液需要缓慢加入，用氨水调节混合溶液pH为8.0~10.0，置于常温下用磁力搅拌0.5~2 h，再转移至反应釜中，设定200~300℃并反应5~8 h；反应结束后，取出固体，设定10000~12000 rpm，10~20 min的条件，水洗离心三次，将所得固体置于烘箱中设定50~70 ℃烘干，制得锰离子掺杂的锌锗氧化物记作Mn@ZGNPs，其具有时间分辨荧光性质；

步骤2：制备时间分辨型荧光传感器

将不同浓度的多巴胺标准溶液、相同浓度的Mn@ZGNPs溶液和缓冲溶液按体积比1∶1∶1混合，得到荧光强度不同的时间分辨型荧光传感器；其中：

所述不同浓度的多巴胺标准溶液、相同浓度的Mn@ZGNPs和缓冲溶液均使用去离子水配制；

所述多巴胺标准溶液的浓度为300~2000 μM，使用时以300 μM为浓度梯度；

所述Mn@ZGNPs溶液的浓度为0.6~3.0 mg/mL；

所述缓冲溶液的配制方法为：Tris作为缓冲物质，其浓度为50~400 mM，使用HCl调节溶液的pH值为8.0～9.0。

一种以上述方法制得的时间分辨型荧光传感器。

一种上述时间分辨型荧光传感器在区分和检测生物硫醇上的应用，直接将生物硫醇标准溶液或待测样品溶液与所述时间分辨型荧光传感器混合，通过生物硫醇抑制聚多巴胺的形成，导致时间分辨型荧光信号的增大，经过主成分分析法对荧光信号的处理，实现对生物硫醇的种类区分和浓度检测；其中：

所述生物硫醇为谷胱甘肽、L-半胱氨酸、D-半胱氨酸和同型半胱氨酸；

所述生物硫醇标准溶液或待测样品溶液的浓度为0~300 μM，使用去离子水配置；

所述待测样品溶液为人的尿液或唾液。

所述应用包括以下具体步骤：

步骤1：生物硫醇与荧光传感器的混合

以50 μM的梯度浓度选取0~300 μM生物硫醇标准溶液和待测样品溶液，分别与所述时间分辨型荧光传感器按照体积比1∶9混合，设置环境温度为25～45 ℃，反应时间为40～80分钟；平行重复配制5次；

步骤2：时间分辨型荧光信号的收集

取步骤1混合溶液90~100 μL，分别加入到384孔黑色不透明酶标板中，使用InfiniteM200酶标仪对酶标板中溶液的时间分辨型荧光信号进行收集，室温条件下，激发波长为230~270 nm，扫描范围为400～700 nm，延迟时间50 μs，门控时间2 ms；

步骤3：主成分分析法对信号进行处理

使用主成分分析（PCA）法分别对得到的时间分辨型荧光信号进行处理，分别获得标准生物硫醇及待测样品的信号区间，通过对比，区分生物硫醇的种类和检测浓度。

所述应用为一种微量检测。

与现有技术相比，本发明有益效果包括如下：

本发明改变了目前常用的生物硫醇的检测模式，无需复杂的有机荧光探针合成，无须购买昂贵的荧光标记物，节约了成本。同时也改变了生物硫醇的区分方法，无需复杂的探针制备过程，所需多巴胺均可通过商业化的试剂获得。相较于传统的荧光分析方法，不仅具备荧光寿命长的特点，还具有屏蔽背景荧光和干扰信号的优势。本发明是一种有机-无机杂化传感模式识别体系，采用不同浓度的多巴胺与长寿面荧光材料组成传感器元件，并利用无标记的时间分辨荧光分析方法实现对其荧光的分析和检测。最后结合主成分分析方法和聚类分析方法进行荧光数据的分析实现生物硫醇的区分和检测。本发明所述检测方法用量少，整个反应体系仅需微量级探针即可，节约了探针的使用量，实现了微量低成本的检测。本发明检测方法使用一种锰离子掺杂的锌锗纳米氧化物的荧光作为信号，具有很长的荧光寿命（达到μs级），从而可以采用时间分辨荧光分析的方法，可有效消除检测过程中的背景荧光和散射荧光的影响，并显著提高灵敏度和信噪比。

附图说明

图1为本发明传感器的制备、应用流程图；

图2中 a、b分别为荧光材料对不同浓度多巴胺响应的光谱图和点图，c、d分别为荧光材料在加入500 μM多巴胺溶液时对不同反应时间响应的光谱图和点图；

图3为本发明预实验中四个样品对不同反应时间响应的紫外吸收光谱图和归一化结果图；

图4中 a为干扰生物分子的选择性结果图，b、c、d分别为谷胱甘肽、L-半胱氨酸和同型半胱氨酸的竞争性结果图；

图5为不同荧光传感器对不同硫醇响应的柱状图；

图6为不同浓度的三种生物硫醇的主成分分析结果图；

图7为不同浓度的三种生物硫醇的线性相关图；

图8为不同荧光传感器对不同手性的半胱氨酸响应的柱状图；

图9为两种不同手性的半胱氨酸及其混合物的主成分分析结果图；

图10为两种不同手性的半胱氨酸及其混合物的线性相关图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

将0.04 mol GeO₂与0.008 mol NaOH加入20 mL去离子水中，于80 ℃下冷凝回流24 h，得到0.4 M 的Na₂GeO₃溶液。配置2 M 的Zn(NO₃)₂溶液和0.08 M 的Mn(NO₃)₂溶液。分别取 1mL Zn(NO₃)₂溶液、62.5 μL Mn(NO₃)₂溶液、300 μL浓硝酸溶液（wt = 98%）和11 mL去离子水混合，向其中逐滴滴加2.5 mL Na₂GeO₃溶液，加入600 μL氨水调节混合溶液pH至9.5左右，置于常温下用磁力搅拌1 h再转移至反应釜中，设定220 ℃并反应6 h；反应结束后取出固体，设定12000 rpm，15 min的条件，用去离子水洗得到的固体离心三次，将最终所得固体置于烘箱中设定70 ℃烘干，由此制得具有时间分辨荧光性质的锰离子掺杂的锌锗氧化物，记作Mn@ZGNPs。

实施例2

使用去离子水配置900 μM的多巴胺溶液，1.5 mg/mL的Mn@ZGNPs溶液和300 mM的Tris-HCl缓冲溶液（pH值为8.5），分别取30 μL混合，于37 ℃条件下反应1小时，反应后的溶液通过时间分辨荧光的方法进行检测，该溶液即一种时间分辨型荧光传感器（Mn@ZGNPs/DPA）。如图2a、b所示，当以浓度梯度配置多巴胺溶液，使其在混合溶液中的终浓度在0-500 μM范围内时，随着多巴胺浓度的增加，Mn@ZGNPs的荧光逐渐减弱，当多巴胺终浓度为300 μM时，荧光强度已接近淬灭的平台值。如图2c、d所示，当以5 min为间隔，检测不同反应时间下混合溶液的时间分辨荧光强度值时， Mn@ZGNPs的荧光在1 h后可几乎淬灭完全。

实施例3

选取不同浓度的谷胱甘肽溶液进行预实验，进行对比。使用去离子水配制溶液，取30 μL 1 mM的多巴胺溶液，30 μL 1.5 mg/mL的 Mn@ZGNPs溶液，30 μL 300 mM的Tris-HCl缓冲溶液（pH值为8.5）和10 μL的浓度分别为0, 300, 600 μM的谷胱甘肽溶液，将四种溶液混合，于37 ℃条件下反应，每隔5 min用紫外-可见光吸收和时间分辨荧光分析的方法进行检测，共测定1 h内的变化情况。谷胱甘肽作为一种具有还原性的生物硫醇，可以有效抑制多巴胺的自由基氧化聚合行为。结果如图3所示，根据各组别在60 min内的结果显示，高浓度谷胱甘肽条件下400 nm处的吸收值和536 nm处的荧光强度和空白组几乎保持一致，表明高浓度的谷胱甘肽在1 h内均抑制了聚多巴胺的生成，而低浓度的谷胱甘肽从第35 min起，开始出现和空白组一样的趋势，证明该组中谷胱甘肽已反应完全，因此继续进行多巴胺聚合反应。

实施例4

将不同种类氨基酸与生物硫醇进行对比，证实时间分辨型荧光传感器对生物硫醇的特异性响应。选取一下生物分子进行选择性及竞争性证明：L-天冬酰胺 (L-Asn), L-天冬氨酸 (L-Asp), L-亮氨酸 (L-Leu), L-谷氨酸 (L-Glu), L-丙氨酸 (L-Ala), L-异亮氨酸(L-Ile), L-酪氨酸 (L-Tyr), L-缬氨酸 (L-Val), L-苏氨酸 (L-Thr), 甘氨酸 (Gly),DL-苯丙氨酸 (DL-Phe), L-谷氨酰胺 (L-Gln), L-丝氨酸 (L-Ser), L-脯氨酸 (L-Pro),L-组氨酸 (L-His), L-色氨酸 (L-Trp), L-赖氨酸 (L-Lys), L-甲硫氨酸 (L-Met), L-精氨酸 (L-Arg), L-半胱氨酸 (L-Cys), L-同型半胱氨酸 (L-Hcys), 过氧化氢, 5-羟色胺 (5-HT)，抗坏血酸 (AA), 葡萄糖, 乳糖, 氧化型谷胱甘肽 (GSSG)。使用时间分辨荧光分析方法进行检测，一方面，分别证明上述物质终浓度为500 μM对Mn@ZGNPs/DPA的影响；另一方面，证明上述物质和生物硫醇等浓度条件下混合后对Mn@ZGNPs/DPA的影响。结果如图4（氨基酸等生物分子，a为选择性结果，b-d分别为谷胱甘肽、L-半胱氨酸和同型半胱氨酸的竞争性结果）所示，Mn@ZGNPs/DPA对生物硫醇的选择性十分优异，表明这是一种新型的针对生物硫醇的荧光传感器。

实施例5

为了测试时间分辨型荧光传感器对三种常见生物硫醇的灵敏度区分，选择终浓度为300 μM、400 μM和500 μM的多巴胺溶液构成三个荧光强度不同的时间分辨型荧光传感器，对终浓度范围在0-30 μM内的谷胱甘肽溶液、L-半胱氨酸溶液和同型半胱氨酸溶液，按照前述实施例3中的反应条件进行模式识别分析和灵敏度分析。在主成分分析法中，判别因子（PC）被用于衡量数据之间的相关性。结果如图5、6所示，三个荧光传感器对三种不同浓度的硫醇类物质进行了显著区分。且如图7所示，由于第二个判别因子（PC2）小于2%，所以第一个判别因子（PC1）即可描述荧光响应情况与金属浓度的关系，呈现一个良好的线性关系。该传感器在浓度为亚微摩尔级时也有良好的响应，表明该传感器可以实现对生物硫醇的半定量检测。

实施例6

为了证明所述传感器可以区分不同手性的硫醇物种，进行了半胱氨酸不同手性的实验。实验对象为L-半胱氨酸（L-Cys）、D-半胱氨酸（D-Cys）和DL-半胱氨酸（DL-Cys，由等量等浓度的L-Cys和D-Cys混合得到）。如图8、9所示，应用主成分分析法，可以观察到传感器对不同浓度不同手性的半胱氨酸有不同的响应，可以被良好地区分。如图10所示，第一个判别因子（PC1）对相同物种不同浓度的半胱氨酸也具有良好的线性关系。以上结果证明所述传感器可以有效地区分不同手性的硫醇，显示出强大的应用前景。

本发明第一次提出了用一种时间分辨型荧光传感器实现生物硫醇的区分及半定量检测，这也是首次利用检测对象的化学还原性差异进行模式识别和区分。只需不同浓度的多巴胺和无标记的长寿命荧光材料组合，即可构建该荧光传感器，多个荧光传感器组成传感器阵列，不同生物硫醇的还原性微弱差异，可以通过抑制多巴胺聚合反应放大，最终实现对生物硫醇的模式识别分析检测和区分。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明范围。凡依本发明内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明保护范畴。

Claims (5)

1.一种时间分辨型荧光传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：

步骤1：制备锰离子掺杂的锌锗氧化物

将GeO₂与NaOH于70~90 ℃下冷凝回流20~36 h，得到0.1~0.6 M Na₂GeO₃溶液，其中GeO₂与NaOH的摩尔比为1∶2；配置1~4 M 的Zn(NO₃)₂、0.02~0.08 M 的Mn(NO₃)₂溶液；将 Zn(NO₃)₂溶液、Mn(NO₃)₂溶液、浓硝酸溶液（wt = 98%）、Na₂GeO₃溶液与去离子水以体积比为392∶25∶120∶150∶4400混合，其中Na₂GeO₃溶液需要缓慢加入，用氨水调节混合溶液pH为8.0~10.0，置于常温下用磁力搅拌0.5~2 h，再转移至反应釜中，设定200~300℃并反应5~8 h；反应结束后，取出固体，设定10000~12000 rpm，10~20 min的条件，水洗离心三次，将所得固体置于烘箱中设定50~70 ℃烘干，制得锰离子掺杂的锌锗氧化物记作Mn@ZGNPs，其具有时间分辨荧光性质；

步骤2：制备时间分辨型荧光传感器

将不同浓度的多巴胺标准溶液、相同浓度的Mn@ZGNPs溶液和缓冲溶液按体积比1∶1∶1混合，得到荧光强度不同的时间分辨型荧光传感器；其中：

所述不同浓度的多巴胺标准溶液、相同浓度的Mn@ZGNPs和缓冲溶液均使用去离子水配制；

所述多巴胺标准溶液的浓度为300~2000 μM，使用时以300 μM为浓度梯度；

所述Mn@ZGNPs溶液的浓度为0.6~3.0 mg/mL；

所述缓冲溶液的配制方法为：Tris作为缓冲物质，其浓度为50~400 mM，使用HCl调节溶液的pH值为8.0～9.0。

2.一种以权利要求1所述方法制得的时间分辨型荧光传感器。

3.一种权利要求2所述时间分辨型荧光传感器在区分和检测生物硫醇上的应用，其特征在于，直接将生物硫醇标准溶液或待测样品溶液与所述时间分辨型荧光传感器混合，通过生物硫醇抑制聚多巴胺的形成，导致时间分辨型荧光信号的增大，经过主成分分析法对荧光信号的处理，实现对生物硫醇的种类区分和浓度检测；其中：

所述生物硫醇为谷胱甘肽、L-半胱氨酸、D-半胱氨酸和同型半胱氨酸；

所述生物硫醇标准溶液或待测样品溶液的浓度为0~300 μM，使用去离子水配置；

所述待测样品溶液为人的尿液或唾液。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，该应用包括以下具体步骤：

步骤1：生物硫醇与荧光传感器的混合

以50 μM的梯度浓度选取0~300 μM生物硫醇标准溶液和待测样品溶液，分别与所述时间分辨型荧光传感器按照体积比1∶9混合，设置环境温度为25～45 ℃，反应时间为40～80分钟；平行重复配制5次；

步骤2：时间分辨型荧光信号的收集

取步骤1混合溶液90~100 μL，分别加入到384孔黑色不透明酶标板中，使用InfiniteM200酶标仪对酶标板中溶液的时间分辨型荧光信号进行收集，室温条件下，激发波长为230~270 nm，扫描范围为400～700 nm，延迟时间50 μs，门控时间2 ms；

步骤3：主成分分析法对信号进行处理

使用主成分分析（PCA）法分别对得到的时间分辨型荧光信号进行处理，分别获得标准生物硫醇及待测样品的信号区间，通过对比，区分生物硫醇的种类和检测浓度。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为一种微量检测。