CN109884006B - 时间分辨型荧光材料在检测抗坏血酸含量上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种时间分辨型荧光材料在检测抗坏血酸含量上的应用,利用荧光材料的激发光谱与抗坏血酸的紫外吸收谱重叠,导致荧光内滤效应发生,通过荧光信号强度减弱实现对抗坏血酸定量检测。本发明改变了当前复杂的检测模式,实现了简易、快捷和高效的抗坏血酸含量的测定。本发明具有重现性好、准确灵敏及高选择性的特点,可以在血清中实现定量分析,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物传感分析检测领域,具体涉及了一种时间分辨型荧光材料在检测抗坏血酸含量上的应用。
背景技术
监测抗氧化剂的含量变化对于心血管或神经退行性疾病风险具有特别重要的意义。氧化应激是生物体内活性氧或活性氮物质过量表达的结果,而在某种程度上,抗氧化剂可以有效清除这些具有强氧化性的自由基以维持体内氧化/还原过程的动态平衡。在各种常见抗氧化剂中,抗坏血酸,又被称作维生素C,在结构上显著不同于生物硫醇,除了具有较好的还原活性,其生理学上的功能近年来也被陆续发现。有报道指出,抗坏血酸可以通过易位酶激活介导DNA去甲基化过程,帮助抗癌过程的进行;也有研究人员发现,抗坏血酸可以有效调解造血干细胞和骨髓细胞的增殖分化以抑制白血病的发生。上述研究案例表明,抗坏血酸含量的测定对人体生命健康具有十分重要的意义。
当前,电化学分析和光学传感是分析检测抗坏血酸含量的主要途径。然而,当使用电化学分析方法进行抗坏血酸含量测定时,尿酸和多巴胺的电化学行为与抗坏血酸类似,造成干扰,使得涉及抗坏血酸的电化学分析方法往往无法屏蔽尿酸和多巴胺的影响,导致开发针对抗坏血酸的特异性电极较为困难。光学分析法,特别是荧光分析法具有高效便捷、易于操作的显著优点,经常可被用于实际应用中。但是大多数利用荧光法进行抗坏血酸的检测,均需要一些高价态金属离子(重铬酸根离子、高锰酸根离子、铁离子等)作为媒介发生氧化还原反应,以达到荧光信号开关的效果。另一点值得说明的是,抗坏血酸在紫外区有很强的吸收值,利用其在紫外区的吸收谱与荧光材料的激发谱重叠,可以据此设计内滤效应过程达到直接测定抗坏血酸的目的。
发明内容
针对现有技术存在的问题和缺陷,本发明的目的旨在提供一种时间分辨型荧光材料在检测抗坏血酸含量上的应用,利用荧光内滤效应以快速、简单、灵敏地检测血清中的抗坏血酸含量。
实现本发明目的的具体技术方案是:
一种时间分辨型荧光材料在检测抗坏血酸含量上的应用。
所述的应用,是直接将抗坏血酸标准溶液与时间分辨型荧光材料及Tris缓冲溶液混合,利用荧光材料的激发光谱与抗坏血酸的紫外吸收谱重叠的特点,导致荧光内滤效应的发生,使时间分辨型荧光强度发生变化,通过对其导致的颜色变化的处理,实现对抗坏血酸的含量检测;其中:
所述时间分辨型荧光材料溶液浓度为0.6~3.0mg/mL;
所述抗坏血酸标准溶液的浓度为0~1mM,使用去离子水配置;
所述缓冲溶液的配制方法为:Tris作为缓冲物质,其浓度为50~400mM,使用HCl调节溶液的pH值为8.0~9.0;
所述抗坏血酸标准溶液、时间分辨型荧光材料溶液及Tris缓冲溶液的体积比为1∶8∶1。
所述的应用,具体包括以下步骤:
步骤1:制备混合溶液
以50μM的梯度浓度选取0~1mM抗坏血酸标准溶液,分别与所述时间分辨型荧光材料溶液及Tris缓冲溶液按照体积比1∶8∶1混合,设置环境温度为25~45℃,反应时间为5~30分钟;
步骤2:时间分辨型荧光信号的收集
取步骤1混合溶液90~100μL,分别加入到384孔黑色不透明酶标板中,使用Infinite M200酶标仪对酶标板中溶液的时间分辨型荧光信号进行收集,室温条件下,激发波长为230~270nm,扫描范围为400~700nm,延迟时间50μs,门控时间2ms;得到不同强度的最大荧光发射峰,利用其强度对应水溶液中抗坏血酸的含量,最终实现抗坏血酸含量的检测。
与现有技术相比,本发明有益效果包括如下:
1)本发明改变了当下常用检测抗坏血酸含量的方法,无需复杂的前期样品准备,无需昂贵的精密仪器,大大降低了成本;
2)本发明是目前第一次提出利用荧光内滤效应检测抗坏血酸含量的方法。只需时间分辨型荧光传感器与抗坏血酸直接混合,不需要其他物质媒介传导信号;
3)本发明用量小,整个反应体系仅需微量级,较为节约,实现低成本的检测。荧光材料的原料易获得、价格低廉,合成步骤及后处理简单,应用到血清中抗坏血酸检测的实用性强;
4)本发明能够有效减少环境因素的影响,使用时间分辨荧光为信号,可以有效消除检测过程中的散射荧光和背景荧光的影响,显著提高灵敏度和信噪比。
5)本发明响应时间短,整个检测过程不超过10分钟。本发明可测定抗坏血酸的浓度范围为0~500μM,最低检测浓度为0.13μM,具有较高的灵敏度和选择性。
附图说明
图1为本发明的流程图;
图2为本发明所述时间分辨型荧光材料Mn@ZGNPs的激发光谱、发射光谱及抗坏血酸的吸收光谱图;
图3为本发明预实验中两个样品的归一化的荧光光谱结果图和归一化的紫外吸收光谱图;
图4为本发明对氨基酸分子的选择性和竞争性结果图;
图5为本发明对金属离子的选择性和竞争性结果图;
图6为本发明对多巴胺、尿酸、葡萄糖、谷胱甘肽、果糖和蔗糖的选择性和竞争性结果图;
图7为本发明对不同浓度抗坏血酸的检测结果图及线性拟合结果图;
图8为本发明联用手机应用软件检测抗坏血酸的结果图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
将0.04mol GeO2与0.008mol NaOH加入20mL去离子水中,于80℃下冷凝回流24h,得到0.4M的Na2GeO3溶液。配置2M的Zn(NO3)2溶液和0.08M的Mn(NO3)2溶液。分别取1mL Zn(NO3)2溶液、62.5μL Mn(NO3)2溶液、300μL浓硝酸溶液(wt=98%)和11mL去离子水混合,向其中逐滴滴加2.5mL Na2GeO3溶液,加入600μL氨水调节混合溶液pH至9.5左右,置于常温下用磁力搅拌1h再转移至反应釜中,设定220℃并反应6h;反应结束后取出固体,设定12000rpm,15min的条件,用去离子水洗得到的固体离心三次,将最终所得固体置于烘箱中设定70℃烘干,由此制得具有时间分辨荧光性质的锰离子掺杂的锌锗氧化物,记作Mn@ZGNPs即为所述时间分辨型荧光材料。
实施例2
在浓度为300mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH值为8.5)中配置浓度为1.0mg/mL的Mn@ZGNPs溶液。在水溶液中配置浓度为500μM的抗坏血酸标准溶液。使用酶标仪测定Mn@ZGNPs溶液在230nm~400nm的激发光谱和254nm激发下在400nm~700nm的荧光光谱。使用紫外-可见分光光度计测定抗坏血酸标准溶液在200nm~400nm之间的吸收光谱图。如图2所示,Mn@ZGNPs溶液的激发光谱与抗坏血酸的吸收光谱存在一定程度的重叠,表明具有发生荧光内滤效应的能力。
实施例3
对Mn@ZGNPs溶液、Mn@ZGNPs溶液+500μM抗坏血酸进行预实验,进行对比。使用去离子水配制抗坏血酸标准溶液和抗坏血酸氧化酶标准溶液,并将之与Mn@ZGNPs溶液充分混合,在37℃条件下反应10min后测定荧光光谱和吸收光谱图。结果如图3a所示,当加入抗坏血酸时,Mn@ZGNPs溶液的荧光淬灭。紫外吸收光谱图也显示出类似的结果(图3b),当加入抗坏血酸时,200nm~300nm范围内出现明显的抗坏血酸吸收峰,证明了所述本发明的可行性。
实施例4
选取以下氨基酸分子进行选择性及竞争性证明:L-天冬酰胺(L-Asn),L-天冬氨酸(L-Asp),L-亮氨酸(L-Leu),L-谷氨酸(L-Glu),L-丙氨酸(L-Ala),L-异亮氨酸(L-Ile),L-酪氨酸(L-Tyr),L-缬氨酸(L-Val),L-苏氨酸(L-Thr),甘氨酸(Gly),DL-苯丙氨酸(DL-Phe),L-谷氨酰胺(L-Gln),L-丝氨酸(L-Ser),L-脯氨酸(L-Pro),L-组氨酸(L-His),L-色氨酸(L-Trp),L-赖氨酸(L-Lys),L-甲硫氨酸(L-Met),L-精氨酸(L-Arg),L-半胱氨酸(L-Cys)。使用时间分辨荧光分析方法进行检测,一方面,分别证明上述物质终浓度为500μM对Mn@ZGNPs溶液的荧光无影响;另一方面,证明上述物质和抗坏血酸等浓度条件下混合后均可对Mn@ZGNPs溶液的荧光淬灭。结果如图4(氨基酸分子,a为选择性结果,b为对抗坏血酸的竞争性结果)所示,Mn@ZGNPs/DPA对抗坏血酸在氨基酸干扰下的选择性十分优异,表明这是一种新型的针对抗坏血酸的荧光传感器。
实施例5
选取以下金属离子进行选择性及竞争性证明:Na+,K+,Mg2+,Ca2+,Al3+,Cr3+,Mn2+,Co2+,Cu2+和Zn2+。使用时间分辨荧光分析方法进行检测,一方面,分别证明上述物质终浓度为500μM对Mn@ZGNPs溶液的荧光无影响;另一方面,证明上述物质和抗坏血酸等浓度条件下混合后均可对Mn@ZGNPs溶液的荧光淬灭。结果如图5(金属离子,a为选择性结果,b为对抗坏血酸的竞争性结果)所示,Mn@ZGNPs/DPA对抗坏血酸在金属离子干扰下的选择性十分优异,表明这是一种新型的针对抗坏血酸的荧光传感器。
实施例6
选取以下有机分子进行选择性及竞争性证明:多巴胺、尿酸、葡萄糖、谷胱甘肽、果糖和蔗糖。使用时间分辨荧光分析方法进行检测,一方面,分别证明上述物质终浓度为500μM对Mn@ZGNPs溶液的荧光无影响;另一方面,证明上述物质和抗坏血酸等浓度条件下混合后均可对Mn@ZGNPs溶液的荧光淬灭。结果如图6(有机分子,a为选择性结果,b为对抗坏血酸的竞争性结果)所示,Mn@ZGNPs/DPA对抗坏血酸在有机分子干扰下的选择性十分优异,表明这是一种新型的针对抗坏血酸的荧光传感器。特别指出,多巴胺和尿酸分子会影响电分析化学对抗坏血酸的特异性检测,因而本发明的应用有效地解决了电分析化学方法的这一不足。
实施例7
为了进一步研究所述利用荧光材料内滤效应检测抗坏血酸含量的可行性,用时间分辨荧光进行了验证。将不同浓度的抗坏血酸标准溶液(0~500μM)加入到0.5mg/mL的Mn@ZGNPs溶液中,37℃孵育10min后,用酶标仪记录254nm波长激发下的荧光强度。从图7a可以看到,随着抗坏血酸标准溶液浓度的增加,Mn@ZGNPs溶液的荧光强度逐渐降低;从图7b可以观察到,当抗坏血酸浓度达到300μM以后,Mn@ZGNPs溶液的荧光强度基本保持不变。以抗坏血酸标准溶液的浓度为横坐标,536nm处反应体系的荧光强度的变化值F/F0为纵坐标,拟合可以得到检测抗坏血酸水溶液的线性范围。如图7c所示,抗坏血酸标准溶液浓度在0~100μM范围内呈良好的线性关系(Y=-0.003459X+0.9937,R2=0.9947,X单位为μM),最低检测浓度为0.13μM。
实施例8
为了进一步研究本发明是否可以应用于实际生物样本中抗坏血酸的检测。使用本发明来检测血清样品中的抗坏血酸含量。通过标准加入方法将含有不同浓度抗坏血酸的一系列血清样品、时间分辨型荧光材料及Tris缓冲溶液按照体积比1∶8∶1混合,进行抗坏血酸含量的检测。表1是本发明用于血清中检测抗坏血酸的实验结果,如表1所示,血清样品的回收率在98.47%至106.60%之间,相对标准偏差(RSD,n=3)都低于5%。证明了本发明所提出的利用荧光内滤效应定量检测抗坏血酸可适用于复杂实际样品中抗坏血酸的检测。
表1
实施例9
为了进一步研究本发明是否可以更加良好的应用于实际检测。使用本发明联用一款可扫描读取颜色的手机应用软件来检测水溶液中的抗坏血酸含量。各反应体系的配置方法同实施例7。通过颜色识别手机软件,扫描分析颜色的红色Red,绿色Green,蓝色Blue数值,加入抗坏血酸后绿色(G)强度值不断小,G的数值和抗坏血酸浓度的线性关系间接确定出抗坏血酸的浓度(图8)。表明本发明所提出的利用荧光材料内滤效应定量检测抗坏血酸的方法与手机软件联用具有快速便携,价格低廉的优点并且在实际应用中具有巨大的应用潜力。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用来限定本发明范围。凡依本发明内容所作的等效变化与修饰,都应为本发明保护范畴。
Claims (2)
1.一种时间分辨型荧光材料基于荧光内滤效应检测抗坏血酸含量的应用,其特征在于,直接将抗坏血酸标准溶液与时间分辨型荧光材料及Tris缓冲溶液混合,利用荧光材料的激发光谱与抗坏血酸的紫外吸收谱重叠的特点,导致荧光内滤效应的发生,使时间分辨型荧光强度发生变化,通过对其导致的颜色变化的处理,实现对抗坏血酸的含量检测;其中:
所述时间分辨型荧光材料溶液浓度为0.6~3.0 mg/mL;
所述抗坏血酸标准溶液的浓度为0~1 mM,使用去离子水配置;
所述缓冲溶液的配制方法为:Tris作为缓冲物质,其浓度为50~400 mM,使用HCl调节溶液的pH值为8.0~9.0;
所述抗坏血酸标准溶液、时间分辨型荧光材料溶液及Tris缓冲溶液的体积比为1∶8∶1;
所述时间分辨型荧光材料为锰离子掺杂的锌锗氧化物,记作Mn@ZGNPs。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,具体包括以下步骤:
步骤1:制备混合溶液:
以50 μM的梯度浓度选取0~1 mM抗坏血酸标准溶液,分别与所述时间分辨型荧光材料溶液及Tris缓冲溶液按照体积比1∶8∶1混合,设置环境温度为25~45 ℃,反应时间为5~30分钟;
步骤2:时间分辨型荧光信号的收集:
取步骤1混合溶液90~100 μL,分别加入到384孔黑色不透明酶标板中,使用InfiniteM200酶标仪对酶标板中溶液的时间分辨型荧光信号进行收集,室温条件下,激发波长为230~270 nm,扫描范围为400~700 nm,延迟时间50 μs,门控时间2 ms;得到不同强度的最大荧光发射峰,利用其强度对应水溶液中抗坏血酸的含量,最终实现抗坏血酸含量的检测。
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