WO2020250940A1 - 免疫抑制剤 - Google Patents

免疫抑制剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2020250940A1
WO2020250940A1 PCT/JP2020/022882 JP2020022882W WO2020250940A1 WO 2020250940 A1 WO2020250940 A1 WO 2020250940A1 JP 2020022882 W JP2020022882 W JP 2020022882W WO 2020250940 A1 WO2020250940 A1 WO 2020250940A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
variable region
light chain
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/022882
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
拓 岡崎
大祐 杉浦
一美 岡崎
史朗 柴山
Original Assignee
小野薬品工業株式会社
国立大学法人徳島大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 小野薬品工業株式会社, 国立大学法人徳島大学 filed Critical 小野薬品工業株式会社
Priority to US17/617,781 priority Critical patent/US20220227887A1/en
Priority to JP2021526119A priority patent/JPWO2020250940A1/ja
Priority to EP20822287.7A priority patent/EP3984554A4/en
Publication of WO2020250940A1 publication Critical patent/WO2020250940A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present disclosure relates to bispecific molecules that include a first binding site that specifically binds to LAG3 and a second binding site that specifically binds to CD3 or CD8.
  • the immune system is a mechanism in which a large number of mechanisms that protect the living body from diseases are integrated by recognizing and killing non-self substances such as pathogens and abnormal cells such as cancer cells in the living body.
  • the immune system is tightly controlled so that it attacks pathogens and abnormal cells and does not attack normal self-substances, but if the control mechanism breaks down, various intractable diseases such as autoimmune diseases and chronic inflammatory diseases Causes sexual illness.
  • various intractable diseases such as autoimmune diseases and chronic inflammatory diseases Causes sexual illness.
  • the use of immunosuppressive drugs and antibody therapy targeting cytokines are known.
  • Lymphocyte activation gene 3 is an immune checkpoint receptor protein expressed on the surface of cytotoxic T cells and regulatory T cells, and by suppressing the T cell receptor (TCR), T cells Controls response, activation, and proliferation. No method has been known so far to activate LAG3.
  • inhibition of the function of cell surface molecules can be achieved by physically inhibiting the binding between the ligand and the cell surface molecule with an antibody, but activation of the function of the cell surface molecule can be achieved by a specific ligand or the like. It is extremely difficult because it requires structural changes.
  • CD3 is mainly expressed on mature T cells and binds to the TCR to form a complex. When foreign antigens are presented to the TCR via the MHC complex and T cell activation is induced, CD3 is responsible for intracellular signal transduction.
  • CD8 is a TCR co-receptor expressed on the surface of T cells and binds to conserved regions of MHC class I molecules. When mature naive CD8 + T cells are presented with a specific antigen by dendritic cells, CD8 and TCR aggregate, intracellular signaling is initiated, and mature naive CD8 + T cells differentiate into cytotoxic T cells. .. That is, both CD3 and CD8 are cell surface molecules that assemble with the TCR during T cell activation.
  • Patent Document 1 describes regulatory T cells by an antigen-binding molecule containing a domain that binds to a molecule expressed on the surface of a cell having a function of suppressing an immune response and a domain that binds to a T cell receptor complex. It discloses that it inhibits the immune response inhibitory activity of cells having a function of suppressing the immune response such as.
  • the purpose of this disclosure is to provide a new immunosuppressant.
  • the present disclosure provides a bispecific molecule comprising a first binding site that specifically binds to LAG3 and a second binding site that specifically binds to CD3 or CD8.
  • the present disclosure provides an immunosuppressive agent comprising the bispecific molecule described above.
  • the present disclosure provides prophylactic and / or therapeutic agents for autoimmune diseases, allergic diseases or graft-versus-host diseases, including the bispecific molecules described above.
  • the present disclosure provides immunosuppressive agents, or prophylactic and / or therapeutic agents for autoimmune diseases, allergic diseases or graft-versus-host diseases, or bispecific molecules available thereto.
  • TKB58xYTS169 The binding of the bispecific molecule TKB58xYTS169 to DO11.10 cells, DO11.10-mLAG3 cells, B3Z cells and B3Z-mLAG3 cells is shown.
  • the binding of TKB58 to DO11.10 cells expressing the chimeric LAG3 molecule is shown. It shows the binding of TKB58 to DO11.10 cells expressing the wild-type LAG3, N54A / F55A mutant or V61A / I62A mutant.
  • amino acid residues are represented by the following abbreviations.
  • Ala or A Alanine Arg or R: Arginine Asn or N: Asparagine Asp or D: aspartic acid Cys or C: Cysteine Gln or Q: Glutamine Glu or E: Glutamic acid Gly or G: Glycine His or H: histidine Ile or I: isoleucine Leu or L: Leucine Lys or K: Lysine Met or M: Methionine Phe or F: Phenylalanine Pro or P: Proline Ser or S: Serine Thr or T: Threonine Trp or W: Tryptophan Tyr or Y: tyrosine Val or V: Valine
  • Bispecific molecule means a molecule that can specifically bind to two different target molecules or target sites.
  • the bispecific molecule includes a first binding site that specifically binds to the first target molecule or target site and a second binding site that specifically binds to the second target molecule or target site.
  • first binding site and second binding site are terms used for convenience to distinguish between the two binding sites, such as the position of the binding site in a bispecific molecule and the position of the binding site. It does not specify the function.
  • the bispecific molecule may be composed of one molecule (for example, a polypeptide chain) or a plurality of molecules (for example, a plurality of polypeptide chains).
  • the bispecific molecule may be a multispecific molecule having at least one additional binding site, where the additional binding site is the same as or different from the first or second binding site. It may be one that specifically binds to the first or second target molecule or target site, and to a target molecule or target site different from the first or second target molecule or target site. It may be specifically bound.
  • LAG3, CD3 and CD8 may be of any species and are typically mammals (eg, humans, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys, etc.). For example, those of mice or humans, especially humans.
  • mammals eg, humans, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys, etc.
  • amino acid sequences of LAG3, CD3 and CD8 from various species are readily available using known databases.
  • LAG3, CD3 and CD8 include the products of their naturally occurring alleles.
  • LAG3 selectively binds to the stable peptide MHCII complex and suppresses the T cell receptor (TCR), thereby suppressing the response, activation and / or proliferation of T cells.
  • Representative amino acid sequences of human and mouse LAG3 are registered as GenBank accession numbers NP_002277.4 (SEQ ID NO: 1) and NP_032505.1 (SEQ ID NO: 2), respectively.
  • the first binding site may bind anywhere in the extracellular region of LAG3.
  • the first binding site binds to the D1 region of LAG3, and in particular to a portion that is contained in the D1 region and not in the extra loop region.
  • the D1 region and the extra loop region are described in PNAS, 1997, 94 (11): 5744-5749, Journal of Immunology, 1996, 157: 3727-3736, etc.
  • the D1 region is the region from serine at position 23 to isoleucine at position 168
  • the extra loop region is from glycine at position 70 to position 95.
  • the region up to tyrosine is described in PNAS, 1997, 94 (11): 5744-5749, Journal of Immunology, 1996, 157: 3727-3736, etc.
  • the first binding site binds to the N-terminal region of the D1 region from the extra loop region (the region from position 23 serine to position 69 serine of SEQ ID NO: 2).
  • the first binding site binds to a region corresponding to the region containing serine at positions 23 to 69 of mouse LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the region containing the serine at positions 23 to 69 of human LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the region containing serine at positions 23 to 69 of mouse LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the first binding site is asparagine at position 54, phenylalanine at position 55, valine at position 61, and / or isoleucine at position 62 in mouse LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It binds to the region containing the amino acid corresponding to.
  • a region of human LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 containing serine at position 54, leucine at position 55, valine at position 61, and / or threonine at position 62 is the amino acid of SEQ ID NO: 2.
  • mouse LAG3 having a sequence containing asparagine at position 54, phenylalanine at position 55, valine at position 61, and / or isoleucine at position 62 is the amino acid of SEQ ID NO: 2.
  • the bispecific molecule allows binding of LAG3 to MHC class II molecules.
  • “Allowing binding” means that the amount of binding between LAG3 and MHC class II molecules does not substantially decrease in the presence of the bispecific molecule, for example, the amount of binding in the absence of the bispecific molecule. It means that it is about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95% or about 100% or more.
  • the binding of LAG3 to MHC class II molecules can be confirmed by experiments in which the extracellular region of LAG-3 is bound as a soluble protein to cells expressing MHC class II in the presence and absence of bispecific molecules. ..
  • the binding of LAG3 to an MHC class II molecule is a bispecific molecule, for example, in a system in which LAG3 suppresses cytokine production by TCR by binding to a peptide MHCII complex, for example, a system described in the examples below. It can be confirmed by comparing the amount of cytokine production in the presence and absence of.
  • CD3 is mainly expressed on mature T cells and forms a complex with TCR.
  • CD3 contains subunits of CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ and CD3 ⁇ .
  • the second binding site may bind to any subunit.
  • the second binding site of the bispecific molecule binds to CD3 ⁇ .
  • Representative amino acid sequences of human and mouse CD3 ⁇ are registered as GenBank accession numbers NP_000724.1 (SEQ ID NO: 3) and NP_031674.1 (SEQ ID NO: 4), respectively.
  • the second binding site may bind anywhere in the extracellular region of CD3. In certain embodiments, the second binding site binds to the extracellular region of CD3 ⁇ .
  • the extracellular region is the region from aspartic acid at position 23 to aspartic acid at position 126
  • mouse CD3 ⁇ having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 The extracellular region is the region from aspartic acid at position 22 to aspartic acid at position 108.
  • the second binding site is aspartic acid at position 22 to asparagine at position 26, asparagine at position 44 to leucine at position 49, asparagine at position 51, of mouse CD3 ⁇ having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. It binds to a region containing an amino acid corresponding to lysine at position and / or tyrosine at position 84 to asparagine at position 91.
  • CD8 is a co-receptor of TCR expressed on the surface of T cells, and when mature naive CD8 + T cells are presented with a specific antigen by dendritic cells, CD8 and TCR aggregate.
  • CD8 contains subunits of CD8 ⁇ and CD8 ⁇ .
  • the second binding site may bind to any subunit.
  • the second binding site of the bispecific molecule binds to CD8 ⁇ .
  • Representative amino acid sequences of human and mouse CD8 ⁇ are registered as GenBank accession numbers NP_001139345.1 (SEQ ID NO: 5) and NP_001074579.1 (SEQ ID NO: 6), respectively.
  • the second binding site may bind anywhere in the extracellular region of CD8.
  • the second binding site binds to the extracellular region of CD8 ⁇ .
  • the extracellular region is the region from serine at position 22 to aspartic acid at position 182, and in mouse CD8 ⁇ having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, cells.
  • the outer region is the region from lysine at position 28 to tyrosine at position 196.
  • amino acid corresponding to asparagine at position 54 of mouse LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is an optimum state of the amino acid sequence of a certain LAG3 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (the state where the amino acid match is maximized).
  • the sequences for CD3 and CD8 are similarly defined. For example, serine at position 54, leucine at position 55, valine at position 61 and threonine at position 62 of human LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 respectively have mouse LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Aspartic acid at position 23 to 27 of human CD3 ⁇ which corresponds to aspartic acid at position 54, phenylalanine at position 55, valine at position 61 and isoleucine at position 62, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Glutamic acid, glutamine at position 51 to glutamic acid at position 56, leucine at position 58, and / or aspartic acid at position 99 to position 109 aspartic acid are 22nd of mouse CD3 ⁇ having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the first and second binding sites can be derived from the antibody, especially from the antigen binding site (variable region) of the antibody.
  • the first binding site is derived from the heavy and light chain variable regions of the anti-LAG3 antibody
  • the second binding site is the heavy and light chain variable regions of the anti-CD3 or anti-CD8 antibody. Derived from the area.
  • variable region may be derived from an antibody of any animal species. Examples include mice, rats, rabbits, goats, human-derived antibodies and humanized antibodies.
  • the variable region may be derived from any immunoglobulin class antibody.
  • the immunoglobulin class includes IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and the subclass (isotype) of the immunoglobulin class includes, for example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.
  • the variable region is of an IgG subclass, such as an IgG1 or IgG4 subclass.
  • the variable region can be derived from a monoclonal antibody.
  • a hybridoma secreting a monoclonal antibody can be produced according to a well-known method, for example, the method described in Kohler et al., Nature 256: 495, 1975.
  • the immunogen is mixed with a suitable substance for enhancing antigenicity (eg, keyhole limpet hemocyanin, bovine serum albumin, etc.) and, if necessary, an immunostimulant (such as Freund's complete or incomplete adjuvant). It immunizes non-human mammals such as rats, mice, rabbits, goats and horses.
  • a suitable substance for enhancing antigenicity eg, keyhole limpet hemocyanin, bovine serum albumin, etc.
  • an immunostimulant such as Freund's complete or incomplete adjuvant
  • immunized animals are immunized multiple times at intervals of 3 to 10 days, and 1 to 100 ⁇ g of the immunogenic peptide is administered.
  • immunocompetent cells are collected from immune animals that have undergone multiple immunizations, and myeloma cells that are not capable of producing autoantibodies (eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, or rabbits).
  • myeloma cells that are not capable of producing autoantibodies (eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, or rabbits).
  • Cells derived from mammals such as humans are fused.
  • a polyethylene glycol method, an electric fusion method, or the like is used for cell fusion.
  • the monoclonal antibody can be isolated from the culture supernatant obtained by culturing the obtained hybridoma in vitro. It can also be cultured in vivo in ascites such as mice, rats, guinea pigs, hamsters or rabbits and isolated from ascites.
  • all or part of the extracellular region of LAG3 for example, about 5 to 50, about 6 to 40, about 7 to 35, about 8 of the extracellular region of LAG3.
  • Peptides containing up to 30, about 9 to 25 or about 10 to 20 amino acid sequences can be used.
  • a peptide containing a part of the D1 region of LAG3, particularly a peptide containing a portion contained in the D1 region and not in the extra loop region may be used.
  • Peptides containing regions containing asparagine at position 54, phenylalanine at position 55, valine at position 61 and / or isoleucine at position 62 can be used in mice with LAG3.
  • all or part of the extracellular region of CD3 ⁇ for example, about 5 to 50, about 6 to 40, about 7 to 35, about 8 of the extracellular region of CD3 ⁇ .
  • Peptides containing up to 30, about 9 to 25 or about 10 to 20 amino acid sequences can be used.
  • Peptides containing aspartic acid, lysine at position 51, and / or a region containing tyrosine at position 84 to aspartic acid at position 91 can be used.
  • all or part of the extracellular region of CD8 ⁇ for example, about 5 to 50, about 6 to 40, about 7 to 35, about 8 of the extracellular region of CD8 ⁇ .
  • Peptides containing up to 30, about 9 to 25 or about 10 to 20 amino acid sequences can be used.
  • 10 -8 M or less for example 10 -8 M to 10 -15 M, 10 -8 M to 10 -13 M, 10 -9 M to 10 -12 M, or 10 -9 M to 10 -11 M.
  • a monoclonal antibody that binds to the antigen with an equilibrium dissociation constant (Kd) is used. Binding of the antibody to the antigen can be confirmed by ELISA method, fluorescent antibody method, radioimmunoassay (RIA), BIACORE (registered trademark) surface plasmon resonance assay and the like. Binding of the antibody to the antigen can also be confirmed by a competitive assay. For example, it can be confirmed by FACS or ELISA whether or not an antibody competes with a known antibody in binding to an antigen.
  • anti-LAG3 antibody, anti-CD3 antibody and anti-CD8 antibody for example, an antibody having a heavy chain variable region, a light chain variable region or a CDR sequence described later can be used.
  • the antibody gene can be cloned from a hybridoma producing a desired antibody by a well-known method to determine the amino acid sequence of the variable region or the nucleic acid sequence encoding the same.
  • Amino acid sequences of known anti-LAG3 antibody, anti-CD3 antibody or anti-CD8 antibody or nucleic acid sequences encoding the same may be utilized.
  • Variable regions are usually composed of three complementarity determining regions (also referred to as CDRs) sandwiched between four framework regions (also referred to as FR).
  • amino acid positions assigned to the CDRs of the variable region of the antibody and the framework are defined according to Kabat (see Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., (1987) and (1991)). ).
  • CDR is a region that substantially determines the binding specificity of an antibody, and its amino acid sequence is rich in diversity.
  • the amino acid sequences constituting FR show high homology even among antibodies having different binding specificities. Therefore, the binding specificity of one antibody can be transplanted to another antibody by transplanting CDR.
  • CDR transplanting the CDR of an antibody derived from a non-human animal into a human antibody
  • a humanized antibody composed of the CDR of the antibody derived from a non-human animal, FR derived from the human antibody, and the constant region derived from the human antibody.
  • Humanized antibodies can be prepared by various methods, and one example is Overlap Extension PCR (Almagro and Francsson, Front. Biosci.
  • FR suitable for producing a humanized antibody
  • FR selected by the best fit method Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)
  • the light chain of a human antibody are known.
  • FR Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992); Presta et al. J. Simunol. 151: 2623 (Presta et al. J. Immunol. 151: 2623) derived from the consensus sequence of a specific subgroup of the heavy chain variable region. 1993)
  • the variable region of the humanized antibody thus obtained may be used.
  • the variable region of the human antibody may be used.
  • Human antibodies can be obtained, for example, by sensitizing human lymphocytes in vitro with the desired antigen and then fusing the sensitized lymphocytes with human myeloma cells (Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • human myeloma cells which are fusion partners, for example, U266 can be used.
  • Human antibodies can also be obtained by immunizing transgenic animals with the entire repertoire of human antibody genes with the desired antigen (Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125, 2005).
  • a technique for obtaining a human antibody by panning using a human antibody library is also known (Antibody Phase Display: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology 178, 2001).
  • variable region of a human antibody is expressed as a single-chain antibody (scFv) on the surface of a phage by a phage display method, a phage that binds to the antigen is selected, and the gene of the selected phage is analyzed to obtain an antigen.
  • the nucleic acid sequence encoding the variable region of the binding human antibody can be determined.
  • the first binding site that binds to LAG3 is Heavy chain variable region containing CDR1, CDR2 and CDR3 having the same amino acid sequence as CDR1, CDR2 and CDR3 contained in the heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and / or A light chain variable region containing CDR1, CDR2 and CDR3 having the same amino acid sequence as CDR1, CDR2 and CDR3 contained in the light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; including.
  • the first binding site that binds to LAG3 is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; and / or Light chain variable region containing light chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, light chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and light chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; including.
  • the first binding site that binds to LAG3 is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; and / or A light chain variable region containing light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; including.
  • the first binding site that binds to LAG3 is CDR1, which comprises a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 9.
  • CDR2 containing a sequence having a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more with the sequence of SEQ ID NO: 10, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 11.
  • CDR3 containing a sequence having a sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Heavy chain variable region containing; and / or CDR1 which contains a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 12.
  • CDR2 containing a sequence having a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more with the sequence of SEQ ID NO: 13, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 14.
  • CDR3 containing a sequence having a sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Light chain variable region containing including.
  • the first binding site that binds to LAG3 is CDR1, consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 9.
  • CDR2 consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 10
  • CDR3 consisting of sequences having sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Heavy chain variable region containing; and / or CDR1 consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 12.
  • CDR2 consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 13, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 14.
  • CDR3 consisting of sequences having sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Sequence identity is determined by comparing two optimally aligned sequences over the entire region of the sequence to be compared.
  • the sequence to be compared may have additions or deletions (eg, gaps, etc.) in the optimal alignment of the two sequences.
  • Sequence identity can be calculated using programs such as FASTA, BLAST, and CLUSTAL W provided in public databases (eg, DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp)). Alternatively, it can be obtained using commercially available sequence analysis software (for example, Vector NTI (registered trademark) software, GENETYX (registered trademark) ver. 12).
  • the first binding site that binds to LAG3 is CDR1, which contains a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 9.
  • CDR2 containing a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 13, and 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, in the sequence of SEQ ID NO: 14.
  • CDR3 which contains the added sequence, Light chain variable region containing; including.
  • the first binding site that binds to LAG3 is CDR1, consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 9.
  • CDR2 consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 10
  • 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, in the sequence of SEQ ID NO: 11.
  • CDR3 consisting of the added array, Heavy chain variable region containing; and / or CDR1, consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 12.
  • CDR2 consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 13, and 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, in the sequence of SEQ ID NO: 14.
  • CDR3 consisting of the added array, Light chain variable region containing; including.
  • the first binding site that binds to LAG3 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more sequence identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. Sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and the heavy chain variable region containing the sequence having sex. Includes a light chain variable region containing a sequence having.
  • the first binding site that binds to LAG3 is a heavy chain variable region containing an amino acid sequence in which 0-5 amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and / Alternatively, it comprises a light chain variable region comprising an amino acid sequence in which 0-5 amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the CDR1 consisting of the first binding site that binds to LAG3 without modification of the CDRs of the heavy chain variable region and / or the light chain variable region, specifically the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • heavy chain variable region containing CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11
  • CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. It contains a first binding site that binds to LAG3, including CDR2, and a light chain variable region containing CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the first binding site that binds to LAG3 is a heavy chain variable region comprising CDRs 1-3 of the light chain variable region and / or a light chain variable region comprising CDRs 1-3 of the heavy chain variable region.
  • the first binding site that binds to LAG3 comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and / or a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In a further embodiment, the first binding site that binds to LAG3 comprises a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and / or a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the first binding site that binds to LAG3 is a known anti-LAG3 antibody such as BMS-986016, LAG525, MK-4280, 11E3, 17B4, 3DS223H, REA351, REA776, 11C3C65, 7H2C65, C9B7W or It can be derived from the variable region of 631501.
  • the first binding site that binds to LAG3 competes with any of the first binding sites identified above for binding to LAG3.
  • the first binding site is derived from the variable region of an antibody that competes for binding to LAG3 with any of the first binding sites identified above. Competition can be confirmed, for example, by the competition assay described above.
  • a region of LAG3 to which any of the first binding sites identified above is bound is identified, a region corresponding to that region is identified in another species of LAG3 and bound to it.
  • the binding site eg, the variable region of the antibody that binds to it, can be the first binding site.
  • the second binding site that binds to CD3 is Heavy chain variable region containing CDR1, CDR2, and CDR3 having the same amino acid sequence as CDR3 contained in the heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; and / or The light chain variable region containing CDR1, CDR2, and CDR3 having the same amino acid sequence as CDR3 contained in the light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; including.
  • the second binding site that binds to CD3 is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and / or Light chain variable region containing light chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, light chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and light chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; including.
  • the second binding site that binds to CD3 is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and / or A light chain variable region containing light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; including.
  • the second binding site that binds to CD3 is CDR1, which comprises a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 17.
  • CDR2 containing a sequence having a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more with the sequence of SEQ ID NO: 18, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 19.
  • CDR3 containing a sequence having a sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Heavy chain variable region containing; and / or CDR1 which comprises a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 20.
  • CDR2 containing a sequence having sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more with the sequence of SEQ ID NO: 21, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 22.
  • CDR3 containing a sequence having a sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Light chain variable region containing including.
  • the second binding site that binds to CD3 is CDR1, consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 17.
  • CDR2 consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 18, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 19.
  • CDR3 consisting of sequences having sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Heavy chain variable region containing; and / or CDR1 consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 20.
  • CDR2 consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 21, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 22.
  • CDR3 consisting of sequences having sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • the second binding site that binds to CD3 is CDR1, which contains a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 17.
  • CDR2 containing a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 21, and 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, in the sequence of SEQ ID NO: 22.
  • CDR3 which contains the added sequence, Light chain variable region containing; including.
  • the second binding site that binds to CD3 is CDR1, consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 17.
  • CDR2 consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 18, and 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, in the sequence of SEQ ID NO: 19.
  • CDR3 consisting of the added array, Heavy chain variable region containing; and / or CDR1, consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 20.
  • CDR2 consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 21, and 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, in the sequence of SEQ ID NO: 22.
  • CDR3 consisting of the added array, Light chain variable region containing; including.
  • the second binding site that binds to CD3 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more sequence identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. Sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and the heavy chain variable region containing the sequence having sex. Includes a light chain variable region containing a sequence having.
  • the second binding site that binds to CD3 is a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence in which 0-5 amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and /.
  • it comprises a light chain variable region comprising an amino acid sequence in which 0-5 amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • CDR1 consisting of a second binding site that binds to CD3 without modification of the CDRs of the heavy and / or light chain variable regions, specifically the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
  • CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, heavy chain variable region containing CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and / or CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. It contains a second binding site that binds to CD3, including CDR2, and a light chain variable region containing CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the second binding site that binds to CD3 is a heavy chain variable region comprising CDRs 1-3 of the light chain variable region and / or a light chain variable region comprising CDRs 1-3 of the heavy chain variable region.
  • the second binding site that binds to CD3 comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and / or a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In a further embodiment, the second binding site that binds to CD3 comprises a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and / or a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the second binding site that binds to CD3 is a known anti-CD3 antibody such as 2C11, 17A2, 500A2, KT3, OKT3 (ATCC Accession No. CRL8001) (US Pat. No. 4658019), 7D6, 12F6.
  • a known anti-CD3 antibody such as 2C11, 17A2, 500A2, KT3, OKT3 (ATCC Accession No. CRL8001) (US Pat. No. 4658019), 7D6, 12F6.
  • the second binding site that binds to CD3 competes with any of the second binding sites identified above for binding to CD3.
  • the second binding site that binds to CD3 ⁇ competes with any of the second binding sites identified above for binding to CD3 ⁇ .
  • the second binding site is derived from the variable region of the antibody that competes for binding to CD3 with any of the second binding sites identified above. Competition can be confirmed, for example, by the competition assay described above.
  • the binding site eg, the variable region of the antibody that binds to it, can be the second binding site.
  • the second binding site that binds to CD8 is Heavy chain variable region containing CDR1, CDR2, and CDR3 having the same amino acid sequence as CDR3 contained in the heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; and / or The light chain variable region containing CDR1, CDR2, and CDR3 having the same amino acid sequence as CDR3 contained in the light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; including.
  • the second binding site that binds to CD8 is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; and / or Light chain variable region containing light chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, light chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 and light chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30; including.
  • the second binding site that binds to CD8 is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; and / or A light chain variable region containing light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30; including.
  • the second binding site that binds to CD8 is CDR1, which comprises a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 25.
  • CDR2 containing a sequence having a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more with the sequence of SEQ ID NO: 26, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 27.
  • CDR3 containing a sequence having a sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Heavy chain variable region containing; and / or CDR1 which comprises a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 28.
  • CDR2 containing a sequence having a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more with the sequence of SEQ ID NO: 29, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 30.
  • CDR3 containing a sequence having a sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Light chain variable region containing including.
  • the second binding site that binds to CD8 is CDR1, consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 25.
  • CDR2 consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 26, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 27.
  • CDR3 consisting of sequences having sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Heavy chain variable region containing; and / or CDR1 consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 28.
  • CDR2 consisting of a sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 29, and 80% with the sequence of SEQ ID NO: 30.
  • CDR3 consisting of sequences having sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • the second binding site that binds to CD8 is CDR1, which contains a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 25, CDR2 containing a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 26, and 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, in the sequence of SEQ ID NO: 27.
  • CDR3 which contains the added sequence, Heavy chain variable region containing; and / or CDR1, which contains a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 28, CDR2 containing a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 29, and 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, in the sequence of SEQ ID NO: 30.
  • CDR3 which contains the added sequence, Light chain variable region containing; including.
  • the second binding site that binds to CD8 is CDR1, consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 25, CDR2 consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 26, and 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, in the sequence of SEQ ID NO: 27.
  • CDR3 consisting of the added array, Heavy chain variable region containing; and / or CDR1, consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 28,
  • CDR2 consisting of a sequence in which 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added in the sequence of SEQ ID NO: 29, and 0, 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, in the sequence of SEQ ID NO: 30.
  • CDR3 consisting of the added array, Light chain variable region containing; including.
  • the second binding site that binds to CD8 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more sequence identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23. Sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 and / or the heavy chain variable region containing the sequence having sex. Includes a light chain variable region containing a sequence having.
  • the second binding site that binds to CD8 is a heavy chain variable region containing an amino acid sequence in which 0-5 amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and /.
  • it comprises a light chain variable region comprising an amino acid sequence in which 0-5 amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the CDR1 consisting of a second binding site that binds to CD8 without modification of the CDRs of the heavy and / or light chain variable regions, specifically the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.
  • CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 and a heavy chain variable region containing CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and / or CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29. It contains a second binding site that binds to CD8, including CDR2, and a light chain variable region containing CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • the second binding site that binds to CD8 comprises a heavy chain variable region comprising CDRs 1-3 of the light chain variable region and / or a light chain variable region comprising CDRs 1-3 of the heavy chain variable region.
  • the second binding site that binds to CD8 comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and / or a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the second binding site that binds to CD8 comprises a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and / or a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the second binding site that binds to CD8 is a known anti-CD8 antibody such as YTS169, cM-T807, T8 / Leu2 / SK1, RPA-T8, HIT8a, OKT8 (Appendix 2011-522835). , 53-6.7, 53-5.8, 5H10, YTS-156, KT15, LT8 or CA-8 variable region.
  • a known anti-CD8 antibody such as YTS169, cM-T807, T8 / Leu2 / SK1, RPA-T8, HIT8a, OKT8 (Appendix 2011-522835). , 53-6.7, 53-5.8, 5H10, YTS-156, KT15, LT8 or CA-8 variable region.
  • the second binding site that binds to CD8 competes with any of the second binding sites identified above for binding to CD8.
  • the second binding site that binds to CD8 ⁇ competes with any of the second binding sites identified above for binding to CD8 ⁇ .
  • the second binding site is derived from the variable region of the antibody that competes for binding to CD8 with any of the second binding sites identified above. Competition can be confirmed, for example, by the competition assay described above.
  • the binding site eg, the variable region of the antibody that binds to it, can be the second binding site.
  • the bispecific molecule may have a structure conforming to the format of the multispecific molecule known in the art.
  • multispecific molecules are, for example, The coming of Age of Engineered Multivalent Antibodies, Nunes-Prado et al Drug Discovery Today Vol 20 Number 5 Mar 2015, page 588-594, D.I., which are incorporated herein by reference. It is disclosed in Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798, Chan and Carter, Nature Reviews Immunology vol 10, May 2010, 301 and Special Table 2017-522023.
  • the format of the bispecific molecule is diabody, bispecific sc (Fv) 2 , bispecific minibody, bispecific F (ab') 2 , bispecific antibody. , Covalently Connected Diabody (Bispecific DART) (International Publication No. 2006/113665 or International Publication No. 2008/157379), Bispecificity (FvCys) 2 (J. Immunol., 1992, Vol.149) , No.1, p.120-126), bispecific F (ab'-zipper) 2 (J.
  • the formats of the bispecific molecule are diabody, tandem scFv, sc diabody, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab-dsscFv, Fab- (dsscFv) 2, diFab, diFab. ', ScFv-Fc, Tandem scFv-Fc, sc Diabody-Fc, sc Diabody-CH3, Ig-scFv and scFv-Ig (Special Table 2017-526616).
  • the bispecific molecule is selected from diabody, tandem scFv and sc diabody.
  • the bispecific molecule is the sc diabody. In certain embodiments, the bispecific molecule is a bispecific antibody, preferably a bispecific monoclonal antibody. In certain embodiments, the bispecific molecules described herein include a constant region.
  • the bispecific antibody may be any immunoglobulin class antibody.
  • the immunoglobulin class includes IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and the subclass (isotype) of the immunoglobulin class includes, for example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.
  • the bispecific antibody is of an IgG subclass, such as an IgG1 or IgG4 subclass.
  • a dimer is a dimer composed of two polypeptide chains.
  • a heavy chain variable region (V H ) and a light chain variable region (V L ) are associated with each other in the same chain. It is linked by a linker so that it cannot be done (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1993, Vol.90, No.14, p.6444-6448).
  • the linker is not particularly limited as long as it does not inhibit the expression of V H and VL and the formation of the diabody, for example, Ser, (Gly) n -Ser, Ser- (Gly) n , ((Gly) 4 -Ser) n , (Ser- (Gly) 4 ) n [n represents an integer from 1 to 6], etc. (J. Immunol. Meth., 1999, Vol.231, p.177-189).
  • the peptide linker is short enough that V H and VL within the polypeptide chain cannot associate, eg, about 2-12 or about 3-10, especially about 5 amino acid residues in length. Or, it has a structure in which V H and V L in the polypeptide chain cannot associate.
  • Bispecific sc (Fv) 2 is a polypeptide chain in which the V H and VL of two antibodies that recognize different antigens are linked in a single chain via a linker (J. Biological Chemistry). , 1994, 269: 199-206).
  • the V H and V L of the antibody that recognizes two different antigens a and b are V H a and V L a, V H b and V, respectively.
  • L b and the peptide linkers as (L 1 ), (L 2 ) and (L 3 ), respectively, from the N-terminal side, (1) V H a- (L 1 ) -V L a- (L 2 ) -V H b- (L 3 ) -V L b, (2) V H a- (L 1 ) -V L a- (L 2 ) -V L b- (L 3 ) -V H b, (3) V L a-(L 1 ) -V H a- (L 2 ) -V H b- (L 3 ) -V L b, (4) V L a-(L 1 ) -V H a- (L 2 ) -V L b- (L 3 ) -V H b, (5) V H a- (L 1 ) -V H b- (L 2 ) -V L b- (L 3 ) -V L a, (6) V H
  • Bispecific sc (Fv) 2 is formed by the association of V H a and V L a, and the association of V H b and V L b.
  • the peptide linker is not particularly limited as long as it does not inhibit the expression and formation of bispecific sc (Fv) 2 , for example, Ser, (Gly) n -Ser, Ser- (Gly) n , ((Gly) 4- Ser) n , (Ser- (Gly) 4 ) n [n represents an integer from 1 to 6], Ser-Ser-Ala-Asp-Asp-Ala-Lys-Lys-Asp-Ala -Ala-Lys-Lys- (Asp-Asp-Ala-Lys-Lys) 2 Can be -Asp-Ala and so on.
  • tandem scFv The bispecific sc (Fv) 2 in the forms (1) to (4) above is particularly referred to as tandem scFv.
  • a tandem scFv peptide linker (L 2 ) is short enough that two adjacent variable regions cannot associate with each other, eg, about 2-12 or about 3-10, especially about 5 amino acid residues. It has a structure in which two variable regions of the same length or adjacent to each other cannot associate with each other.
  • the tandem scFv peptide linkers (L 1 ) and (L 3 ) have lengths and structures that allow two adjacent variable regions to associate with each other, eg, about 10-25 or about 13-20, especially about 15.
  • the length of the amino acid residue. (L 1 ) and (L 3 ) may be the same or different.
  • the bispecific sc (Fv) 2 in the form of (5) to (8) above is particularly referred to as an sc diabody.
  • the peptide linkers (L 1 ) and (L 3 ) of the sc diabodies are short enough that the two variable regions adjacent to them cannot associate with each other, eg, about 2-12 or about 3-10, In particular, it has a structure that is about 5 amino acid residues in length or that two variable regions adjacent to it cannot associate with each other. (L 1 ) and (L 3 ) may be the same or different.
  • the tandem scFv peptide linker (L 2 ) has a length and structure that allows two adjacent variable regions to associate with each other, eg, about 10-25 or about 13-20, especially about 15 amino acid residues. That's right.
  • Bispecific molecules of the present disclosure when a tandem scFv or sc diabody, the first binding site that binds to LAG3 is composed of V H a and V L a in the above formula, binds to CD3 or CD8
  • the second binding site may consist of V H b and V L b.
  • the first binding site that binds to LAG3 may be composed of V H b and V L b of the above formula
  • the second binding site that binds to CD 3 or CD 8 may be composed of V H a and V L a.
  • a bispecific antibody is an intact antibody in which a heavy chain / light chain complex of an antibody that recognizes two different antigens is covalently bound by a disulfide bond or the like.
  • the bispecific antibody can be produced, for example, from a hybridoma produced by the hybrid hybridoma method (US Pat. No. 4,447,93).
  • a total of four types of cDNA encoding the heavy and light chains of antibodies that recognize different antigens can be co-expressed in mammalian cells and produced by secreting proteins.
  • the bispecific antibody is of an IgG subclass, such as an IgG1 or IgG4 subclass.
  • Bispecific F (ab') 2 is a low molecular weight antibody in which Fab'fragments of an antibody that recognizes two different antigens are covalently bonded by a disulfide bond or the like.
  • the Fab'fragment is an antibody fragment prepared by cleaving the disulfide bond between two heavy chains of F (ab') 2 obtained by digesting an intact antibody with pepsin.
  • Bispecific F (ab') 2 is prepared, for example, by maleimizing a Fab'fragment prepared from one antibody with o-phenylenedimaleimide and reacting the Fab' fragment prepared from the other antibody.
  • Can be Cancer Research 1997, 57: 4008-4014).
  • There is also known a method of chemically binding a Fab'fragment-thionitrobenzoic acid derivative to one antibody fragment such as Fab'-SH Science 1985, 229: 81-83).
  • the bispecific minibody is a small molecule antibody fragment modified so that the constant region CH3 domain of an antibody is linked to scFv that recognizes different antigens, and is covalently bound by a disulfide bond or the like on the CH3 domain. It is a low molecular weight antibody (Biochemistry, 1992, Vo.31, No.6, p.1579-1584).
  • scFv is a single-chain modified low-molecular-weight antibody fragment having a form in which V H and V L are linked by a peptide linker or the like (J. Immunol. Meth., 1999, Vol.231, p. 177-189).
  • Bispecific molecules of these formats can be prepared using genes encoding the parts corresponding to V H and V L that constitute the antigen binding site.
  • the genes encoding the parts corresponding to V H and V L can be obtained by gene cloning mainly from an antibody gene library or from a hybridoma that produces a monoclonal antibody.
  • the bispecific molecule can be produced by inserting the isolated cDNA encoding it into an expression vector and expressing and secreting it in a host cell.
  • the vector expressing each single-stranded peptide constituting the diabody has a portion corresponding to V H , V L that recognizes different antigens so as to sandwich the DNA encoding the peptide linker.
  • Each encoding cDNA can be ligated in-frame and inserted into an expression vector to prepare the DNA.
  • the DNA expressing each single-stranded peptide may be inserted into the same expression vector, or may be inserted into separate expression vectors.
  • bispecific sc (Fv) 2 For example, cDNA encoding the recognized V H and V L one antigen, cDNA encoding the recognized V H and V L and the other antigens, as well as, A cDNA encoding a peptide linker can be ligated in-frame and inserted into an expression vector to prepare it.
  • bispecific sc (Fv) 2 can be directly secreted from the host cell.
  • examples of an expression vector that can be used for the expression of diabody or bispecific sc (Fv) 2 include pEBMulti-Neo (Wako) and pCANTAB5E (manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • eukaryotic cells such as animal cells, plant cells, and fungal cells
  • Animal cells include mammalian cells (eg, CHO, COS, NIH3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, 293T, platE), amphibian cells (eg, Xenopus oocytes), or insect cells (eg, Xenopus oocytes). , Sf9, Sf21, Tn5).
  • Fungal cells include yeast (eg, Saccharomyces genus, eg, Saccharomyces cerevisiae), filamentous fungi (eg, Aspergillus genus, eg, Aspergillus niger), and the like. Be done.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli (E. coli) (for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, etc.) and Bacillus subtilis can also be used as host cells.
  • the vector can be introduced into the host cell by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, an electroporation method, a lipofection method, or the like.
  • the present disclosure also provides a polynucleotide encoding a bispecific molecule, an expression vector containing the polynucleotide, and the polynucleotide or transformed cells containing the expression vector.
  • the bispecific molecule is bonded to a polymer such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, polyoxyalkylene or a copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol, for example to extend the half-life or improve stability. May be good. It may also include an additional sequence such as a signal sequence.
  • PEG polyethylene glycol
  • polypropylene glycol polypropylene glycol
  • polyoxyalkylene polyoxyalkylene
  • a copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol for example to extend the half-life or improve stability. May be good. It may also include an additional sequence such as a signal sequence.
  • the amino acid residue of the bispecific molecule may be modified by a known method.
  • the functional group in the side chain of the amino acid residue, the amino group of the N-terminal amino acid, or the carboxyl group of the C-terminal amino acid can be esterified, alkylated, halogenated, phosphorylated, or the like.
  • various substances can be bound to the N-terminal and / or C-terminal of the bispecific molecule.
  • amino acids, peptides, analogs thereof and the like may be bound.
  • tags such as a histidine tag and a FLAG tag may be added.
  • these substances When these substances are bound to a bispecific molecule, these substances are processed by, for example, an in vivo enzyme or a process such as intracellular processing to finally produce a bispecific molecule. It may be. These substances may regulate the solubility of the bispecific molecule, may improve its stability such as protease resistance, and may be specific to a predetermined tissue or organ, for example. It may deliver a bispecific molecule.
  • the bispecific molecule or immunosuppressive agent disclosed in the present specification has low toxicity, it can be safely used as a pharmaceutical product.
  • bispecific molecules disclosed herein can suppress immunity. Therefore, bispecific molecules can be used as immunosuppressants. It can also be used for the prevention and / or treatment of diseases characterized by enhanced immunity.
  • autoimmune diseases include autoimmune diseases, allergic diseases and graft-versus-host diseases.
  • Autoimmune diseases include, for example, Bechette's disease, systemic erythematosus, polyarteritis nodosa (systemic scleroderma, progressive systemic sclerosis), scleroderma, polyarteritis nodosa, dermatitis, polyarteritis nodosa.
  • the autoimmune disease is type I diabetes, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus or rheumatoid arthritis. In certain embodiments, the autoimmune disease is multiple sclerosis. Allergic diseases include, for example, asthma, atopic dermatitis, rhinitis, conjunctivitis and hay fever.
  • treating or “treating” in a subject with a disease reduces or eliminates the cause of the disease, delays or stops its progression, reduces or alleviates its symptoms. , Improving or eliminating, and / or suppressing the exacerbation of its symptoms.
  • preventing means preventing the development of a disease in a subject, especially in a subject who is likely to develop the disease but has not yet developed the disease. Alternatively, it means reducing the likelihood of developing the disease and includes prevention of recurrence.
  • Subjects who may develop an autoimmune disease or allergic disease but have not yet developed it include, for example, subjects with hyperimmunity, subjects with a genetic predisposition to an autoimmune disease or allergic disease, in the past. Includes subjects who have been affected and cured of an autoimmune or allergic disease.
  • Subjects who may develop graft-versus-host disease but have not yet developed include those who undergo organ transplantation.
  • Animals typically mammals (eg, humans, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, etc.) can be administered to prevent and / or treat diseases characterized by immunosuppressants or hyperimmunity. Cows, sheep, monkeys, etc.), but humans are particularly preferred. Further preferred subjects are those who require immunosuppression or the prevention and / or treatment, particularly those who require the treatment (eg, patients).
  • the dose of the active ingredient is appropriately selected depending on the administration method, age, body weight, health condition, etc. of the administration target. For example, 0.1 ⁇ g / kg to 300 mg / kg per day for adults with continuous administration for a period ranging from 30 minutes to 24 hours a day, or once to several times a day, or a day or a few days or a week. Alternatively, it can be administered once to several times every few weeks, for example, once every 1 to 3 weeks, but is not limited to this.
  • the administration method is also appropriately selected depending on the age, body weight, health condition and the like of the administration target.
  • the administration method may be oral administration or parenteral administration, but parenteral administration is preferable. Parenteral administration includes subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, intravenous administration, and the like, but intravenous administration is preferable.
  • Immunosuppressants or prophylactic and / or therapeutic agents for diseases characterized by enhanced immunity can be formulated by conventional methods.
  • the formulation may contain a variety of pharmaceutically acceptable pharmaceutical substances, as required by the formulation.
  • the substance for preparation can be appropriately selected depending on the dosage form of the preparation, and for example, a buffering agent, a surfactant, a stabilizer, a preservative, an excipient, a diluent, an additive, a disintegrant, a binder, etc. Examples include coating agents, lubricants, lubricants, solubilizers and the like.
  • immunosuppressants can be formulated as injections or infusions.
  • Injections or infusions can be in the form of sterile aqueous solutions, suspensions or emulsions, or in the form of solids or lyophilizers for use in dissolved, suspended or emulsions in sterilized liquids.
  • the sterilized liquid can be, for example, water for injection, saline, glucose solution or isotonic solution.
  • Immunosuppressants can also be formulated for sustained or controlled release of the active ingredient. Methods for producing these formulations are well known in the art.
  • the formulation may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier includes any substance that is non-reactive with the immune system of interest, which, when combined with an active ingredient, may retain the biological activity of that ingredient. .. Examples include stabilizers, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, soothing agents, buffers, preservatives, pH regulators and antioxidants.
  • Stabilizers include, for example, various amino acids, albumin, globulin, gelatin, mannitol, glucose, dextran, ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, Dibutylhydroxytoluene and the like can be used.
  • the dissolution aid such as an alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol, and the like), nonionic surfactants (e.g., polysorbate 20 (TM), polysorbate 80 (registered trademark ) , HCO-50, etc.) can be used.
  • suspending agent for example, glycerin monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • emulsifier for example, gum arabic, sodium alginate, tragant and the like can be used.
  • pain-relieving agent for example, benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol and the like can be used.
  • a phosphate buffer solution for example, a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a borate buffer solution, a carbonic acid buffer solution, a citrate buffer solution, a Tris buffer solution, a glutamate buffer solution, an epsilon aminocaproic acid buffer solution and the like can be used.
  • the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, butyl paraoxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, and borax. Sand or the like can be used.
  • preservative for example, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • pH adjuster for example, hydrochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, acetic acid and the like can be used.
  • antioxidants for example, (1) water-soluble antioxidants such as (1) ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfite, sodium metabisulfite, sodium sulfite, etc., (2) ascorbyl palmitate, butylated hydroxyanisol, Use oil-soluble antioxidants such as butylated hydroxytoluene, lecithin, propyl gallate, ⁇ -tocopherol and (3) metal chelating agents such as citric acid, ethylenediamine tetraacetic acid, sorbitol, tartaric acid, phosphoric acid and the like. Can be done.
  • the infusion solution for injection or infusion can be produced by sterilization in the final step or by aseptic technique, for example, filtering with a filter or the like to sterilize, and then filling in a sterile container.
  • Infusions for injections or infusions should be vacuum-dried and lyophilized sterile powders (which may contain pharmaceutically acceptable carrier powders) dissolved in a suitable solvent before use. You can also.
  • Immunosuppressive agents or prophylactic and / or therapeutic agents for diseases characterized by enhanced immunity may be used alone or as one or more additional active ingredients, particularly effective for suppressing immunity. It may be used in combination with an ingredient.
  • the "combination" of ingredients is characterized by the use of dosage forms containing all components and the use of combinations of dosage forms containing each component separately, as well as their suppression or enhancement of immunity. It also means that each component is administered simultaneously or with a delay, as long as it is used for the treatment and / or prevention of the disease. When any component is administered with a delay, there may be a period during which each component is co-administered. It is also possible to combine two or more additional active ingredients.
  • the combination can, for example, complement the effects of prevention and / or treatment of other active ingredients, and maintain and / or reduce the dose or frequency of administration.
  • Active ingredients suitable for concomitant use include, for example, anti-inflammatory agents, antibacterial agents, antifungal agents, antiviral agents, immunosuppressants, molecular targeting agents and the like.
  • insulin preparations eg, human insulin, insulin glargine, etc.
  • Insulin lispro insulin detemil, insulin aspart, etc.
  • sulfonylureas eg, glibenclamide, gliclazide, glimepiride, etc.
  • hasty insulin secretagogues eg, nateglycinide, etc.
  • biguanide preparations eg, metformin, etc.
  • insulin resistance Ameliorating agents eg, pioglycazone, etc.
  • ⁇ -glucosidase inhibitors eg, acarbose, boglibose, etc.
  • therapeutic agents for diabetic neuropathy eg, epalrestat, mexiretin, imidapril, etc.
  • GLP-1 analog e.g, epalrestat, mexiretin, imidapril, etc.
  • steroid agents eg, cortisone acetate, etc.
  • Hydrocortisone sodium hydrocortisone phosphate, sodium hydrocortisone succinate, fludrocortisone acetate, prednisolone, prednisolone acetate, prednisolone sodium succinate, prednisolone butylacetate, prednisolone sodium phosphate, halopredone acetate, methylprednisolone, methylpredonizolone acetate, methylpredonizolone Sodium, triamsinolone, triamsinolone acetate, triamsinolone acetonide, dexamethasone, dexamethasone acetate, dexamethasone sodium phosphate, dexamet
  • a steroid drug for example, the steroid drug described above
  • Immunosuppressants eg, cyclosporine, tacrolimus, fingolimod, etc.
  • belimumab may be used in combination with any one or more agents selected.
  • a steroid drug for example, the steroid drug described above
  • Anti-rheumatic drugs eg, methotrexate, sulfasalazine, bushilamine, leflunomide, misolivin, tacrolimus, etc.
  • anti-cytogenic drugs eg, infliximab, adalimumab, tocilizumab, etanercept, golimumab, sertrizumab, etc.
  • infliximab eg, methotrexate, sulfasalazine, bushilamine, leflunomide, misolivin, tacrolimus, etc.
  • anti-cytogenic drugs eg, infliximab, adalimumab, tocilizumab, etanercept, golimumab, sertrizumab, etc. It may be used in combination with the above drugs.
  • the immunosuppressive agents or prophylactic and / or therapeutic agents of diseases characterized by enhanced immunity described above. It may be used in combination with any one or more of the other agents listed.
  • a bispecific molecule comprising a first binding site that specifically binds to LAG3 and a second binding site that specifically binds to CD3 or CD8 is effective for subjects in need of immune suppression.
  • Methods of suppressing immunity are provided, including administration in volume.
  • the term "effective amount" means an amount capable of exerting an effect of suppressing immunity in a subject.
  • a bispecific molecule comprising a first binding site that specifically binds to LAG3 and a second binding site that specifically binds to CD3 or CD8 is provided for use in immunosuppression.
  • bispecificity in the manufacture of a pharmaceutical composition for suppressing immunity comprising a first binding site that specifically binds to LAG3 and a second binding site that specifically binds to CD3 or CD8. The use of molecules is provided.
  • a method of preventing and / or treating a disease characterized by enhanced immunity the first binding site that specifically binds to LAG3 and specific to CD3 or CD8 in a subject in need thereof.
  • a method comprising administering an effective amount of a bispecific molecule comprising a second binding site that binds to is provided.
  • a bispecific molecule containing a site is provided.
  • a first binding site that specifically binds to LAG3 and a second binding site that specifically binds to CD3 or CD8 in the manufacture of prophylactic and / or therapeutic agents for diseases characterized by enhanced immunity is provided.
  • an anti-LAG3 antibody or fragment thereof is provided.
  • Anti-LAG3 antibodies can suppress the function of LAG3 and thereby activate immunity.
  • the anti-LAG3 antibody can be the antibody described above for obtaining the binding site of a bispecific molecule, such as a monoclonal antibody.
  • the anti-LAG3 antibody is an amino acid corresponding to asparagine at position 54, phenylalanine at position 55, valine at position 61 and / or isoleucine at position 62 in mouse LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It binds to the region containing.
  • the heavy and light chain variable regions of the anti-LAG3 antibody are selected from the heavy and light chain variable regions described for the first binding site of the bispecific molecule that binds to LAG3. It is a thing.
  • these antibodies are provided with anti-LAG3 antibodies that compete for binding to LAG3.
  • the anti-LAG3 antibody may be derived from any animal species such as mouse, rat, rabbit, goat, etc., and may be a human-derived antibody or a humanized antibody.
  • the anti-LAG3 antibody may be any immunoglobulin class antibody.
  • the immunoglobulin class includes IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and the subclass (isotype) of the immunoglobulin class includes, for example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.
  • the anti-LAG3 antibody is of an IgG subclass, such as an IgG1 or IgG4 subclass.
  • Fragments of anti-LAG3 antibodies include a portion of the anti-LAG3 antibody as a component and are molecules that retain binding to LAG3, such as the heavy and light chain variable regions (V H and VL ) of LAG3 antibodies, F. (Ab') 2 , Fab', Fab, Fv, disulphide-linked FV (sdFv), Single-Chain FV (scFV), Fab3, Diabody, Triabody, Tetrabody, Minibody, Bis-scFv, (scFv) 2- Fc, intact-IgG, sc (Fv) 2 , covalent diabody, (FvCys) 2 , F (ab'-zipper) 2 , (Fv-zipper) 2 , triple chain antibody, mAb 2 , tandem scFv , Sc Diabody, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab-dsscFv, Fab- (
  • the first binding site binds to the region corresponding to the serine at position 23 to the serine at position 69 of mouse LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 [1] to [1].
  • the immunosuppressant according to any one of 3].
  • the immunosuppressive agent according to any one of [1] to [4] above, which binds to a region containing.
  • the immunosuppressive agent according to any one of [1] to [5] above, wherein the first binding site comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region of an anti-LAG3 antibody.
  • the first binding site is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; Containing a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and a light chain variable region comprising the light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the first binding site has a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the first binding site is for binding to LAG3
  • a light chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 a light chain variable region containing a light chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14
  • the immunosuppressive agent according to any one of [1] to [6] above, which competes with an anti-LAG3 antibody containing.
  • [10] The binding to LAG3 by the first binding site (i) Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; A light chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, a light chain variable region containing a light chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or (ii) A heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the immunosuppressive agent according to any one of [1] to [6] above, which is competed by an
  • the second binding site is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; Containing a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and a light chain variable region comprising the light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the immunosuppressant according to the above [13].
  • the second binding site has a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the second binding site is for binding to CD3
  • the immunosuppressive agent according to any one of [11] to [13] above, which competes with an anti-CD3 antibody containing.
  • [17] The binding to CD3 by the second binding site (i) Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; A light chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, a light chain variable region containing a light chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or (ii) A heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the immunosuppressive agent according to any one of [11] to [13] above, which is competed by an anti-
  • the second binding site is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; Containing a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 and a light chain variable region comprising a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • the immunosuppressant according to the above [20].
  • the second binding site has a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the second binding site is for binding to CD8
  • the immunosuppressive agent according to any one of [18] to [20] above, which competes with an anti-CD8 antibody containing.
  • Bispecific molecules are bispecific antibodies, diabodies, tandem scFv, sc diabodies, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab-dsscFv, Fab- (dsscFv) 2, diFab. , DiFab', scFv-Fc, Tandem scFv-Fc, sc Diabody-Fc, sc Diabody-CH3, Ig-scFv and scFv-Ig, any of the above [1] to [24].
  • the immunosuppressive agent described in Crab described in Crab.
  • an effective amount of an immunosuppressive drug according to any one of [1] to [27] above, which is a method for preventing and / or treating an autoimmune disease, an allergic disease or a graft-versus-host disease. A method that involves administering to a subject in need of it.
  • the first binding site binds to the region corresponding to the serine at position 23 to serine at position 69 of mouse LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 [32] to [].
  • the first binding site is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; Containing a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and a light chain variable region comprising the light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the bispecific molecule according to [37] above.
  • the first binding site has a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the first binding site is for binding to LAG3
  • a light chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 a light chain variable region containing a light chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14
  • the bispecific molecule according to any one of [32] to [37] above, which competes with an anti-LAG3 antibody containing.
  • [41] The binding to LAG3 by the first binding site (i) Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; A light chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, a light chain variable region containing a light chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or (ii) A heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the second binding site is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; Containing a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and a light chain variable region comprising the light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the bispecific molecule according to [44] above.
  • the second binding site has a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the second binding site is for binding to CD3
  • the bispecific molecule according to any one of [42] to [44] above, which competes with an anti-CD3 antibody containing.
  • [48] The binding to CD3 by the second binding site (i) Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; A light chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, a light chain variable region containing a light chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or (ii) A heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the second binding site is Heavy chain variable region containing heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; Containing a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 and a light chain variable region comprising a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • the bispecific molecule according to [51] above.
  • the second binding site has a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the second binding site is for binding to CD8
  • the bispecific molecule according to any one of [49] to [51] above, which competes with an anti-CD8 antibody containing.
  • the bispecific molecule according to any one of [32] to [56] above which is in any form of diabody, tandem scFv and sc diabody (preferably in the form of sc diabody).
  • the bispecific molecule according to any one of [32] to [56] above which is in the form of a bispecific antibody (preferably in the form of a bispecific monoclonal antibody).
  • a method for suppressing immunity which comprises administering an effective amount of the bispecific molecule according to any one of [32] to [58] to a subject in need thereof. ..
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease characterized by enhanced immunity which comprises the bispecific molecule according to any one of [32] to [58] as an active ingredient.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent according to [64] above further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a method for preventing and / or treating a disease characterized by enhanced immunity wherein an effective amount of the bispecific molecule according to any one of the above [32] to [58] is used.
  • a method comprising administering to a subject in need.
  • [68] Use of the bispecific molecule according to any one of [32] to [58] above, for the production of a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease characterized by enhanced immunity.
  • [70] The prophylactic and / or therapeutic agent, method, bispecific molecule or use according to [69] above, wherein the disease characterized by enhanced immunity is an autoimmune disease.
  • Autoimmune diseases include Bechet's disease, systemic erythematosus, polysclerosis, scleroderma, polymyositis, dermatomyitis, periarteritis nodule, aortitis syndrome, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile Idiopathic arthritis, Wegener's granulomatosis, mixed connective tissue disease, Schegren's syndrome, adult Still's disease, allergic granulomatous vasculitis, hypersensitivity vasculitis, Cogan's syndrome, RS3PE syndrome, temporal arteritis, rheumatic polymuscular Pain, fibromyalgia, antiphospholipid antibody syndrome, eosinophilic granulomatitis, IgG4-related disease, Giant Valley syndrome, severe myasthenia, chronic atrophic gastric inflammation, autoimmune hepatitis, primary biliary Liver cirrhosis, aortitis
  • [75] A polynucleotide encoding the bispecific molecule according to any one of the above [32] to [58].
  • [76] An expression vector containing the polynucleotide according to [75] above.
  • [77] A host cell containing the polynucleotide according to [75] or the expression vector according to [76].
  • [78] It binds to a region containing an amino acid corresponding to asparagine at position 54, phenylalanine at position 55, valine at position 61 and / or isoleucine at position 62 in mouse LAG3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • An anti-LAG3 antibody or fragment thereof comprising a light chain CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, a light chain CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and a light chain variable region containing the light chain CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. ..
  • the anti-LAG3 antibody has a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • Example 1 Preparation of bispecific molecules 2C11xTKB58 and TKB58x2C11 that bind to LAG3 and CD3 ⁇ Nucleic acid encoding the heavy and light chain variable regions of anti-mouse LAG3 antibody (TKB58) and anti-mouse CD3 ⁇ antibody (2C11). After synthesis, it is amplified by PCR and cloned into an expression plasmid vector prepared by modifying pEBMulti-Neo (Wako) or pSecTag2 / Hygro (Thermo Fisher Scientific) to recognize bispecific mice LAG3 and mouse CD3 ⁇ .
  • Expression plasmids for the sex molecules 2C11xTKB58 (SEQ ID NO: 31) and TKB58x2C11 (SEQ ID NO: 32) were prepared.
  • the expression plasmid was introduced into platE cells using Avalanche-Omni Transfection Reagent (EZ Biosystems), and the culture supernatant was collected 48 hours later. BW5147, DO11.10, and DO11.10-mL AG3 cells were stained with the culture supernatant.
  • Example 2 Bispecific molecules 2C11xTKB58 and TKB58x2C11 suppress antigen-specific activation of T cells in a LAG3-dependent manner ⁇ br />
  • Example 2-1 Using antigen-presenting cells that strongly induce suppression by LAG3 It is known that the experimental DO11.10 cells recognized the OVA-derived peptide (pOVA323-339, ISQAVHAAHAEINEAGR) presented on the mouse MHC class II molecule IA d and produced IL-2 depending on the amount of antigen peptide. ing.
  • OVA-derived peptide pOVA323-339, ISQAVHAAHAEINEAGR
  • IL-2 production was observed when IA d- expressing IIA 1.6 cells were pulsed with pOVA323-339 to stimulate DO11.10 cells (mock), but both TKB58x2C11 and 2C11xTKB58 were involved in IL-2 production. It had no effect (Fig. 2). From this, it was confirmed that these bispecific molecules do not affect the antigen-specific activation of T cells that do not express LAG3.
  • DO11.10-mLAG3 cells in which mouse LAG3 was forcibly expressed in DO11.10 cells were similarly antigen-stimulated (Fig. 2).
  • IL-2 production was strongly suppressed in a LAG3-dependent manner.
  • TKB58 anti-mouse LAG3 antibody
  • TKB58x2C11 or 2C11xTKB58 did not inhibit the suppression of IL-2 production by LAG3.
  • Example 2-2 Experiment using antigen-presenting cells that do not induce suppression by LAG3 very strongly LAG3 selectively binds to the stable peptide MHCII complex and does not bind to the unstable peptide MHCII complex.
  • pOVA323-339 was pulsed into BW5147-mCD86 / IA d cells in which IA d was forcibly expressed in BW5147-mCD86 cells, pOVA323-339 was presented to IA d in an unstable structure and could not bind to mouse LAG3. , Mouse LAG3-mediated inhibition works very little.
  • Example 2-3 Experiment using MHC class I-restricted cells in which LAG3 shows almost no inhibitory effect B3Z cells are OVA-derived peptides presented in mouse MHC class I molecule H-2K b (pOVA257-264, SIINFEKL). It is known that IL-2 is produced depending on the amount of antigenic peptide. IL-2 production was observed when OVA peptide was pulsed to H-2Kb-expressing IIA 1.6 cells to stimulate B3Z cells (mock), but IL-2 was also observed when mouse LAG3 was expressed (mLAG3 WT). Did not inhibit the production of (Fig. 4). This is because LAG3 cannot exert its inhibitory function in MHCI class I-restricted B3Z cells.
  • TKB58x2C11 or 2C11xTKB58 strongly suppressed IL-2 production only when B3Z cells expressed mouse LAG3. These results indicate that TKB58x2C11 and 2C11xTKB58 suppress antigen-specific activation of LAG3-expressing cells, even in MHC class I-restricted CD8-positive cells.
  • Example 2-4 Experiment using a LAG3 mutant having no ligand-binding ability
  • the amino acid mutant LAG3-P111A of LAG3 lacks the ability to bind to pMHCII and therefore does not exert a T cell inhibitory function even when subjected to antigen stimulation. .. Using this mutant, the same experiment as in Example 2-1 was performed. The results are shown in Fig. 5. When TKB58x2C11 or 2C11xTKB58 was added under these stimulation conditions, IL-2 production was strongly suppressed in a LAG3-P111A-dependent manner.
  • TKB58x2C11 and 2C11xTKB58 suppress the antigen-specific activation of LAG3-expressing cells even in the absence of binding between LAG3 and the ligand pMHCII. These results indicate that TKB58x2C11 and 2C11xTKB58 activate LAG3 and suppress TCR even in situations where LAG3 cannot bind to MHCII.
  • Example 3 Evaluation of bispecific molecules using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • Dead tuberculosis H37Ra (BD Biosciences, model number 231141)
  • incomplete Freund's adjuvant (BD Biosciences, model number 263910) were mixed to prepare a complete Freund's adjuvant (CFA) containing 4 mg / mL killed tuberculosis H37Ra.
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • An emulsion was prepared by mixing 1 mg / mL MOG peptide (ANASPEC, model number AS-60130) and an equal amount of CFA, and used as an inducer for the EAE model.
  • Example 4 Binding experiment of mouse LAG3-soluble protein to IIA 1.6 cells in the presence of bispecific molecule
  • a mouse LAG3-soluble protein was obtained as follows.
  • the cDNA fragments encoding D1 to D4 (LAG3-EC) of mouse LAG3 were amplified by PCR.
  • a five-stranded coiled coil domain of cartilage oligomeric matrix protein (COMP) with DYKDDDDK-tag, TEV cleavage site and PA-tag was added to the C-terminus of LAG3-EC.
  • Chimeric cDNA was cloned into a modified expression vector from pEB Multi-Neo (Wako).
  • the plasmid was introduced into Plat-E cells using Avalanche-Omni Transfection Reagent (EZ Biosystems) and the culture supernatant was collected after 48 hours.
  • TKB58x2C11, 2C11xTKB58, or TKB58 antibody which is a complete anti-mouse LAG3 antibody, and then stained with mouse LAG3 soluble protein.
  • the results are shown in Fig. 7.
  • the complete TKB58 antibody completely inhibited the binding of mouse LAG3 soluble protein to IIA 1.6 cells, but not TKB58x2C11 and 2C11xTKB58.
  • Example 5 Preparation of bispecific molecule TKB58xYTS169 that binds to LAG3 and CD8 Nucleic acid encoding the heavy chain variable region and light chain variable region of anti-mouse LAG3 antibody (TKB58) and anti-mouse CD8 antibody (YTS169) was synthesized. After that, it was amplified by PCR and cloned into an expression plasmid vector prepared by modifying pEBMulti-Neo (Wako), and the expression plasmid of the bispecific molecule TKB58xYTS169 (SEQ ID NO: 33) that recognizes mouse LAG3 and mouse CD8. was produced.
  • TKB58 anti-mouse LAG3 antibody
  • YTS169 anti-mouse CD8 antibody
  • the expression plasmid was introduced into platE cells using Avalanche-Omni Transfection Reagent (EZ Biosystems), and the culture supernatant was collected 48 hours later. The culture supernatant was used to stain DO11.10, DO11.10-mLAG3, B3Z, and B3Z-mLAG3 cells.
  • Example 6 Evaluation of the bispecific molecule TKB58xYTS169 for antigen-specific activation of T cells
  • B3Z cells recognize OVA-derived peptides (pOVA257-264, SIINFEKL) presented in mouse MHC class I molecule H-2K b.
  • OVA-derived peptides pOVA257-264, SIINFEKL
  • IL-2 is produced depending on the amount of antigen peptide.
  • IL-2 production was observed when H-2Kb-expressing IIA 1.6 cells were pulsed with pOVA257-264 to stimulate B3Z cells, but expression of mouse LAG3 did not inhibit IL-2 production. (Fig. 9). This is because LAG3 cannot exert its inhibitory function in MHCI class I-restricted B3Z cells even though IIA 1.6 cells express the ligand of LAG3.
  • TKB58xYTS169 strongly suppressed IL-2 production only when B3Z cells expressed mouse LAG3. This revealed that TKB58xYTS169 suppress
  • Example 7 Binding of anti-mouse LAG3 antibody TKB58 to LAG3 mutant
  • Example 7-1 Mouse LAG3 recognition region of anti-mouse LAG3 antibody TKB58
  • Mouse LAG3 has four Ig-like domains in the extracellular region ( It has D1, D2, D3, D4).
  • Chimeric molecules in which each Ig-like domain was replaced with the corresponding Ig-like domain of humans were prepared and forcibly expressed in DO11.10 cells. Briefly, each cDNA fragment was amplified by PCR and cloned into a modified retrovirus expression plasmid vector of pFB-ires-Neo (Agilent). Chimeric cDNAs of mouse and human LAG3 were prepared by overlap extension PCR.
  • the plasmid was introduced into Plat-E cells (D'MEM, high glucose (Gibco) addition, 20% (v / v) FBS, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin) using FuGENE HD (Promega). .. Genes were introduced into target cells using a supernatant containing the virus. Infected cells were selected by G418 (Wako), puromycin (Sigma-Aldrich) or cell sorting. Each cell was stained with an anti-mouse LAG3 antibody (TKB58) and analyzed by flow cytometry. The results are shown in Fig. 10. TKB58 did not bind to the chimeric molecule that replaced mouse D1 with human D1, demonstrating that it recognizes D1 in mouse LAG3.
  • TKB58 anti-mouse LAG3 antibody
  • Example 7-2 Binding of anti-mouse LAG3 antibody TKB58 to various LAG3 mutants DO11.10 T cells were forcibly expressed with wild-type mouse LAG3, N54A / F55A mutant or V61A / I62A mutant, and anti-mouse LAG3 antibody ( The binding to TKB58) was evaluated by flow cytometry. The results are shown in FIG. The N54A / F55A and V61A / I62A mutants had diminished binding to TKB58.
  • Example 7-3 Suppression of T cell function by LAG3 mutant DO11.10 T cells were forcibly expressed with wild-type mouse LAG3, N54A / F55A mutant or V61A / I62A mutant.
  • DO11.10 T cells were stimulated using IIA 1.6 cells pulsed with OVA peptide, and the concentration of IL-2 secreted in the culture supernatant was measured by ELISA. The results are shown in Fig. 12.
  • the production of -2 was significantly reduced, confirming that both mutants retained LAG3 activity. Therefore, it was confirmed that the epitope of TKB58 contains a region that is not essential for the TCR inhibitory function of LAG3.
  • Example 8 Binding affinity of anti-mouse LAG3 antibody TKB58 to LAG3
  • the binding affinity of anti-mouse LAG3 antibody (TKB58 and C9B7W) to mouse LAG3 soluble protein was measured by biolayer interferometry. Briefly, cDNA fragments encoding D1 to D4 (LAG3-EC) in mouse LAG3 were amplified by PCR. A strep tag was added to the C-terminus of LAG3-EC. Chimeric cDNA was cloned into a modified expression vector from pEB Multi-Neo (Wako).
  • the plasmid was introduced into Plat-E cells using Avalanche-Omni Transfection Reagent (EZ Biosystems) and the culture supernatant was collected after 48 hours.
  • Monomeric mouse LAG3-EC (tagged with strep) was immobilized on a streptavidin-coated biosensor chip (Pall ForteBio) and binding of anti-mouse LAG3 antibodies at various concentrations was monitored with BLItz (Pall ForteBio).
  • the chips were washed with PBS and the dissociation rate was analyzed.
  • the binding rate constant (ka), dissociation rate constant (kd) and dissociation constant (kD) were calculated with BLItz Pro software.
  • the results are shown in Fig. 13.
  • TKB58 had ka about 26 times faster and kd 3.6 times slower.
  • the KD of TKB58 was 94 times lower than that of C9B7W, which was 4,395 nM.
  • the bispecific molecules of the present disclosure are useful as immunosuppressants or for the prevention and / or treatment of autoimmune diseases, allergic diseases or graft-versus-host diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本開示は、LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子を含む免疫抑制剤を提供する。

Description

免疫抑制剤
　本特許出願は、日本国特許出願第2019-108906号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本開示は、LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子に関する。
　免疫系は、生体内で病原体などの非自己物質やがん細胞などの異常な細胞を認識して殺滅することにより、生体を疾患から保護する多数の機構が集積した機構である。免疫系は病原体や異常な細胞を攻撃し、正常な自己物質を攻撃しないように緻密に制御されているが、その制御機構が破綻すると、自己免疫性疾患や慢性炎症性疾患など、種々の難治性疾患を引き起こす。自己免疫疾患の治療に関しては、免疫抑制剤の使用や、サイトカインを標的とする抗体療法が知られている。
　リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)は、細胞傷害性T細胞および制御性T細胞の表面に発現する免疫チェックポイント受容体タンパク質であり、T細胞レセプター(TCR)を抑制することにより、T細胞の応答、活性化、増殖を制御する。LAG3を賦活化する方法はこれまで知られていない。一般に、細胞表面分子の機能の阻害は、リガンドと細胞表面分子の結合を抗体で物理的に阻害することにより達成できるが、細胞表面分子の機能の賦活化は、リガンドなどに誘導される特定の構造変化を要するため、極めて困難である。
　CD3は、主に成熟T細胞に発現し、TCRと結合して複合体を形成する。外来抗原がMHC複合体を介してTCRに提示され、T細胞の活性化が誘導される際に、CD3が細胞内シグナル伝達の機能を担う。CD8はT細胞の表面に発現するTCRの補助受容体であり、MHCクラスI分子の保存された領域に結合する。成熟ナイーブCD8＋T細胞が樹状細胞により特異的抗原を提示されると、CD8とTCRは集合し、細胞内シグナル伝達が開始され、成熟ナイーブCD8＋T細胞は細胞傷害性T細胞に分化する。即ち、CD3とCD8は、いずれもT細胞活性化の際にTCRと集合する細胞表面分子である。
　特許文献1は、免疫応答を抑制する機能を有する細胞の表面に発現している分子に結合するドメイン、および、T細胞受容体複合体に結合するドメインを含む抗原結合分子により、制御性T細胞などの免疫応答を抑制する機能を有する細胞の免疫応答抑制活性を阻害することを開示している。
国際公開2015/174439号公報
　本開示は、新たな免疫抑制剤を提供することを目的とする。
　ある態様において、本開示は、LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子を提供する。
　ある態様において、本開示は、上記の二重特異性分子を含む免疫抑制剤を提供する。
　ある態様において、本開示は、上記の二重特異性分子を含む、自己免疫疾患、アレルギー疾患もしくは移植片対宿主病の予防および/または治療剤を提供する。
　本開示により、免疫抑制剤、または自己免疫疾患、アレルギー疾患もしくは移植片対宿主病の予防および/または治療剤、または、これらに利用可能な二重特異性分子が提供される。
LAG3およびCD3に結合する二重特異性分子2C11xTKB58およびTKB58x2C11の、BW5147細胞、DO11.10細胞およびDO11.10-mLAG3細胞に対する結合を示す。 抗マウスLAG3抗体TKB58、2C11xTKB58またはTKB58x2C11の存在下における、LAG3による抑制を強く誘導する条件での抗原刺激によるDO11.10細胞およびDO11.10-mLAG3細胞のIL-2産生を示す。 TKB58、2C11xTKB58またはTKB58x2C11の存在下における、LAG3による抑制をあまり強く誘導しない条件での抗原刺激によるDO11.10細胞およびDO11.10-mLAG3細胞のIL-2産生を示す。 TKB58、2C11xTKB58またはTKB58x2C11の存在下における、MHCクラスI拘束性B3Z細胞およびB3Z-mLAG3細胞の抗原刺激によるIL-2産生を示す。 TKB58、2C11xTKB58またはTKB58x2C11の存在下における、抗原刺激によるDO11.10細胞およびDO11.10-mLAG3-P111A細胞のIL-2産生を示す。 実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおける、2C11xTKB58の神経症状に対する効果を示す。 TKB58、2C11xTKB58またはTKB58x2C11で処理したIIA1.6細胞に対するLAG3可溶性タンパク質の結合を示す。 二重特異性分子TKB58xYTS169の、DO11.10細胞、DO11.10-mLAG3細胞、B3Z細胞およびB3Z-mLAG3細胞に対する結合を示す。 TKB58xYTS169の存在下における、B3Z細胞およびB3Z-mLAG3細胞の抗原刺激によるIL-2産生を示す。 キメラLAG3分子を発現するDO11.10細胞に対するTKB58の結合を示す。 野生型LAG3、N54A/F55A変異体またはV61A/I62A変異体を発現させたDO11.10細胞に対するTKB58の結合を示す。 野生型LAG3、N54A/F55A変異体またはV61A/I62A変異体を発現させたDO11.10細胞における、抗原刺激によるIL-2産生を示す。 マウスLAG3可溶性タンパク質に対する抗マウスLAG3抗体TKB58およびC9B7Wの結合親和性を示す。 抗マウスLAG3抗体TKB58の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。各CDRを四角で囲んで示す。 抗マウスCD3ε抗体2C11の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。各CDRを四角で囲んで示す。 抗マウスCD8抗体YTS169の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。各CDRを四角で囲んで示す。
　本開示では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±10%の範囲を含むことを意図する。例えば、「約20」は、「18～22」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約20～30」は、「18～33」を含むものとする。
　本開示において、アミノ酸残基は以下の略号で表される。
AlaまたはA：アラニン
ArgまたはR：アルギニン
AsnまたはN：アスパラギン
AspまたはD：アスパラギン酸
CysまたはC：システイン
GlnまたはQ：グルタミン
GluまたはE：グルタミン酸
GlyまたはG：グリシン
HisまたはH：ヒスチジン
IleまたはI：イソロイシン
LeuまたはL：ロイシン
LysまたはK：リジン
MetまたはM：メチオニン
PheまたはF：フェニルアラニン
ProまたはP：プロリン
SerまたはS：セリン
ThrまたはT：スレオニン
TrpまたはW：トリプトファン
TyrまたはY：チロシン
ValまたはV：バリン
　「二重特異性分子」とは、2種類の異なる標的分子または標的部位に特異的に結合できる分子を意味する。二重特異性分子は、第1の標的分子または標的部位に特異的に結合する第1の結合部位と、第2の標的分子または標的部位に特異的に結合する第2の結合部位を含む。ここで、「第1の結合部位」および「第2の結合部位」は、2つの結合部位を区別するために便宜的に使用される用語であり、二重特異性分子における結合部位の位置や機能を特定するものではない。二重特異性分子は、1つの分子(例えばポリペプチド鎖)で構成されても、複数の分子(例えば複数のポリペプチド鎖)で構成されてもよい。二重特異性分子は、少なくとも1つのさらなる結合部位を有する多重特異性分子であってもよく、ここで、さらなる結合部位は、第1または第2の結合部位と同じものであっても異なるものであってもよく、第1または第2の標的分子または標的部位に特異的に結合するものであってもよく、第1または第2の標的分子または標的部位とは異なる標的分子または標的部位に特異的に結合するものであってもよい。
　本開示において、LAG3、CD3およびCD8はいかなる種のものであってもよく、典型的には哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等)、例えばマウスまたはヒト、特にヒトのものである。種々の生物種に由来するLAG3、CD3およびCD8のアミノ酸配列は、公知のデータベースを利用して、容易に入手できる。本開示において、LAG3、CD3およびCD8は、それらの天然に存在する対立遺伝子の産物を含む。
　LAG3は、安定なペプチドMHCII複合体と選択的に結合し、T細胞レセプター(TCR)を抑制することにより、T細胞の応答、活性化および/または増殖を抑制する。ヒトおよびマウスのLAG3の代表的なアミノ酸配列は、各々、GenBankアクセッション番号NP_002277.4(配列番号1)およびNP_032505.1(配列番号2)として登録されている。
　第1の結合部位はLAG3の細胞外領域のどこに結合してもよい。ある実施形態では、第1の結合部位は、LAG3のD1領域に結合し、特に、D1領域に含まれ、かつ、エキストラループ(extra loop)領域に含まれない部分に結合する。D1領域およびエキストラループ領域は、PNAS, 1997, 94(11):5744-5749、Journal of Immunology, 1996, 157:3727-3736等に記載されている。例えば、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3において、D1領域は、第23位のセリンから第168位のイソロイシンまでの領域であり、エキストラループ領域は、第70位のグリシンから第95位のチロシンまでの領域である。好ましくは、第1の結合部位は、D1領域における、エキストラループ領域よりN末端側の領域（配列番号2の第23位のセリンから第69位のセリンまでの領域）に結合する。一実施形態において、第1の結合部位は、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第23位のセリンから第69位のセリンを含む領域に相当する領域に結合する。例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有するヒトLAG3の第23位のロイシンから第69位のセリンを含む領域は、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第23位のセリンから第69位のセリンを含む領域に相当する。ある実施形態では、第1の結合部位は、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギン、第55位のフェニルアラニン、第61位のバリン、および/または、第62位のイソロイシンに相当するアミノ酸を含む領域に結合する。例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有するヒトLAG3の第54位のセリン、第55位のロイシン、第61位のバリン、および/または、第62位のスレオニンを含む領域は、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギン、第55位のフェニルアラニン、第61位のバリン、および/または、第62位のイソロイシンを含む領域に相当する。
　好ましくは、二重特異性分子は、LAG3とMHCクラスII分子との結合を許容する。「結合を許容する」とは、二重特異性分子の存在下で、LAG3とMHCクラスII分子の結合量が実質的に低下しないこと、例えば、二重特異性分子の非存在下の結合量の約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%または約100%以上であることを意味する。LAG3とMHCクラスII分子の結合は、MHCクラスIIを発現する細胞に、二重特異性分子の存在下および非存在下でLAG-3の細胞外領域を可溶性タンパク質として結合させる実験により確認し得る。あるいは、LAG3とMHCクラスII分子の結合は、例えば、LAG3がペプチドMHCII複合体との結合によりTCRによるサイトカイン産生を抑制する系、例えば下記の実施例に記載される系において、二重特異性分子の存在下および非存在下でサイトカイン産生量を比較することにより、確認し得る。
　CD3は、主に成熟T細胞に発現し、TCRと複合体を形成する。CD3は、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δおよびCD3ηのサブユニットを含む。第2の結合部位はどのサブユニットに結合してもよい。ある実施形態では、二重特異性分子の第2の結合部位はCD3εに結合する。ヒトおよびマウスのCD3εの代表的なアミノ酸配列は、各々、GenBankアクセッション番号NP_000724.1(配列番号3)およびNP_031674.1(配列番号4)として登録されている。第2の結合部位はCD3の細胞外領域のどこに結合してもよい。ある実施形態では、第2の結合部位は、CD3εの細胞外領域に結合する。例えば、配列番号3のアミノ酸配列を有するヒトCD3εにおいて、細胞外領域は、第23位のアスパラギン酸から第126位のアスパラギン酸までの領域であり、配列番号4のアミノ酸配列を有するマウスCD3εにおいて、細胞外領域は、第22位のアスパラギン酸から第108位のアスパラギン酸までの領域である。ある実施形態では、第2の結合部位は、配列番号4のアミノ酸配列を有するマウスCD3εの第22位のアスパラギン酸～第26位のアスパラギン、第44位のロイシン～第49位のアスパラギン、第51位のリジン、および/または、第84位のチロシン～第91位のアスパラギンに相当するアミノ酸を含む領域に結合する。
　CD8はT細胞の表面に発現するTCRの補助受容体であり、成熟ナイーブCD8+T細胞が樹状細胞により特異的抗原を提示されると、CD8とTCRは集合する。CD8は、CD8αおよびCD8βのサブユニットを含む。第2の結合部位はどのサブユニットに結合してもよい。ある実施形態では、二重特異性分子の第2の結合部位はCD8αに結合する。ヒトおよびマウスのCD8αの代表的なアミノ酸配列は、各々、GenBankアクセッション番号NP_001139345.1(配列番号5)およびNP_001074579.1(配列番号6)として登録されている。第2の結合部位はCD8の細胞外領域のどこに結合してもよい。ある実施形態では、第2の結合部位は、CD8αの細胞外領域に結合する。例えば、配列番号5のアミノ酸配列を有するヒトCD8αにおいて、細胞外領域は、第22位のセリンから第182位のアスパラギン酸までの領域であり、配列番号6のアミノ酸配列を有するマウスCD8αにおいて、細胞外領域は、第28位のリジンから第196位のチロシンまでの領域である。
　「配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギンに相当するアミノ酸」とは、あるLAG3のアミノ酸配列と配列番号2のアミノ酸配列を最適な状態(アミノ酸の一致が最大となる状態)にアラインメントしたときに、配列番号2の第54位のアスパラギンと一致する、当該LAG3におけるアミノ酸を意味する。CD3およびCD8の配列についても、同様に定義される。例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有するヒトLAG3の第54位のセリン、第55位のロイシン、第61位のバリンおよび第62位のスレオニンは、それぞれ、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギン、第55位のフェニルアラニン、第61位のバリンおよび第62位のイソロイシンに相当し、配列番号3のアミノ酸配列を有するヒトCD3εの第23位のアスパラギン酸～第27位のグルタミン酸、第51位のグルタミン～第56位のグルタミン酸、第58位のロイシン、および/または、第99位のチロシン～第109位のアスパラギンは、配列番号4のアミノ酸配列を有するマウスCD3εの第22位のアスパラギン酸～第26位のアスパラギン、第44位のロイシン～第49位のアスパラギン、第51位のリジン、および/または、第84位のチロシン～第91位のアスパラギンに相当する。
　第1および第2の結合部位は抗体に由来し得、特に、抗体の抗原結合部位(可変領域)に由来し得る。典型的には、第1の結合部位は抗LAG3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来し、第2の結合部位は抗CD3抗体または抗CD8抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来する。
　可変領域は、いかなる動物種の抗体に由来してもよい。例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒト由来の抗体およびヒト化抗体が挙げられる。可変領域は、いかなるイムノグロブリンクラスの抗体に由来してもよい。イムノグロブリンクラスとしては、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが、イムノグロブリンクラスのサブクラス(アイソタイプ)としては、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2が挙げられる。ある実施形態では、可変領域は、IgGサブクラス、例えば、IgG1またはIgG4サブクラスのものである。
　可変領域は、モノクローナル抗体に由来し得る。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、周知の方法、例えば、Kohler et al., Nature 256:495, 1975に記載の方法に準じて作製することができる。まず、免疫原を、抗原性を高めるための適当な物質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンやウシ血清アルブミン等）、および必要に応じて免疫賦活剤（フロイントの完全若しくは不完全アジュバント等）とともに混合し、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する。通常、免疫動物は3～10日間隔で複数回免疫され、免疫原であるペプチドは1～100μｇが投与される。次いで、複数回の免疫を経た免疫動物から免疫担当細胞（免疫動物において抗体産生能を有する細胞）を回収し、自己抗体産生能のないミエローマ細胞（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する細胞）とを、細胞融合させる。細胞融合には、ポリエチレングリコール法、電気融合法などが用いられる。さらに、融合細胞が有する選択マーカーに基づき細胞融合に成功した細胞を選択し、選択された細胞が産生する抗体の免疫原に対する反応性を、ELISA法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法などにより確認することにより、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。モノクローナル抗体は、得られたハイブリドーマをインビトロで培養した培養上清から単離することができる。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹水中等のインビボで培養し、腹水から単離することもできる。
　抗LAG3抗体を得るための免疫原として、LAG3の細胞外領域の全部または一部、例えば、LAG3の細胞外領域の約5～50個、約6～40個、約7～35個、約8～30個、約9～25個または約10～20個のアミノ酸配列を含むペプチドを使用し得る。例えば、LAG3のD1領域の一部を含むペプチド、特に、D1領域に含まれ、かつ、エキストラループ領域に含まれない部分を含むペプチドを使用し得る。あるいは、例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有するヒトLAG3の第54位のセリン、第55位のロイシン、第61位のバリンおよび/または第62位のスレオニンを含む領域、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギン、第55位のフェニルアラニン、第61位のバリンおよび/または第62位のイソロイシンを含む領域を含むペプチドを使用し得る。
　抗CD3抗体を得るための免疫原として、CD3εの細胞外領域の全部または一部、例えば、CD3εの細胞外領域の約5～50個、約6～40個、約7～35個、約8～30個、約9～25個または約10～20個のアミノ酸配列を含むペプチドを使用し得る。例えば、配列番号3のアミノ酸配列を有するヒトCD3εの第23位のアスパラギン酸～第27位のグルタミン酸、第51位のグルタミン～第56位のグルタミン酸、第58位のロイシン、および/または、第99位のチロシン～第109位のアスパラギンを含む領域を含むペプチド、配列番号4のアミノ酸配列を有するマウスCD3εの第22位のアスパラギン酸～第26位のアスパラギン、第44位のロイシン～第49位のアスパラギン、第51位のリジン、および/または、第84位のチロシン～第91位のアスパラギンを含む領域を含むペプチドを使用し得る。
　抗CD8抗体を得るための免疫原として、CD8αの細胞外領域の全部または一部、例えば、CD8αの細胞外領域の約5～50個、約6～40個、約7～35個、約8～30個、約9～25個または約10～20個のアミノ酸配列を含むペプチドを使用し得る。
　例えば、10-8M以下、例えば10-8M～10-15M、10-8M～10-13M、10-9M～10-12M、または10-9M～10-11Mの平衡解離定数(Kd)で抗原に結合するモノクローナル抗体を使用する。抗体の抗原への結合は、ELISA法、蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ(RIA)、BIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴アッセイなどにより確認することができる。抗体の抗原への結合は、競合アッセイにより確認することもできる。例えば、ある抗体が既知の抗体と抗原への結合において競合するか否かを、FACSまたはELISAなどで確認できる。既知の抗LAG3抗体、抗CD3抗体および抗CD8抗体として、例えば、後述する重鎖可変領域、軽鎖可変領域またはCDRの配列を有する抗体を用いることができる。
　所望の抗体を産生するハイブリドーマから周知の方法により抗体遺伝子をクローニングし、可変領域のアミノ酸配列またはそれをコードする核酸配列を決定し得る。公知の抗LAG3抗体、抗CD3抗体または抗CD8抗体のアミノ酸配列またはそれをコードする核酸配列を利用してもよい。可変領域は、通常、4つのフレームワーク領域(framework region)(FRとも記載する)にはさまれた3つの相補性決定領域(complementarity determining region)(CDRとも記載する)で構成される。本開示において、抗体の可変領域のCDRとフレームワークに割り当てられるアミノ酸位置はKabatに従って規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., (1987)および(1991)参照)。
　CDRは、実質的に抗体の結合特異性を決定する領域であり、そのアミノ酸配列は多様性に富む。一方、FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも高い相同性を示す。そのため、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を他の抗体に移植することができる。例えば、ヒト以外の動物由来の抗体のCDRをヒト抗体に移植することにより、ヒト以外の動物由来の抗体のCDRとヒト抗体由来のFRおよびヒト抗体由来の定常領域とから構成されるヒト化抗体を得ることができる。ヒト化抗体は種々の方法により作製することができるが、一例として、Overlap Extension PCRが挙げられる(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633(2008))。ヒト化抗体の作製に好適なFRの選択方法は公知であり、例えば、ベストフィット法(Sims et al. J. Immunol. 151:2296(1993))により選択されたFRや、ヒト抗体の軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのコンセンサス配列に由来するFR(Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285(1992); Presta et al. J. Immunol. 151:2623(1993))を用いることができる。かくして得られたヒト化抗体の可変領域を使用してもよい。
　ヒト抗体の可変領域を使用してもよい。ヒト抗体は、例えば、ヒトリンパ球をインビトロで所望の抗原で感作し、次いで、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞と融合させることによって取得することができる(特公平1-59878号公報)。融合パートナーであるヒトミエローマ細胞には、例えばU266などを利用することができる。また、ヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することによっても取得することができる(Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125, 2005)。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている(Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology 178, 2001)。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体(scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択し、選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする核酸配列を決定することができる。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、
　配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2およびCDR3と同じアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2およびCDR3と同じアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域；
　を含む。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、
　配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、
　配列番号9のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号12のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、
　配列番号9の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR1、
　配列番号10の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR2、および
　配列番号11の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号12の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR1、
　配列番号13の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR2、および
　配列番号14の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、
　配列番号9の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR1、
　配列番号10の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR2、および
　配列番号11の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号12の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR1、
　配列番号13の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR2、および
　配列番号14の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた2つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の配列は、2つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失(例えばギャップ等)を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース(例えば、DDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp))で提供されるFASTA、BLAST、CLUSTAL W等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア(例えば、Vector NTI(登録商標)ソフトウェア、GENETYX(登録商標) ver. 12)を用いて求めることもできる。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、
　配列番号9の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR1、
　配列番号10の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR2、および
　配列番号11の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号12の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR1、
　配列番号13の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR2、および
　配列番号14の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、
　配列番号9の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR1、
　配列番号10の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR2、および
　配列番号11の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号12の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR1、
　配列番号13の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR2、および
　配列番号14の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、配列番号7のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および/または、配列番号8のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、配列番号7のアミノ酸配列において0～5個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または、配列番号8のアミノ酸配列において0～5個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。これらの実施形態には、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域のCDRに改変が生じていないLAG3に結合する第1の結合部位、具体的には、配列番号9のアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号10のアミノ酸配列からなるCDR2、および配列番号11のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域、および/または、配列番号12のアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号13のアミノ酸配列からなるCDR2、および配列番号14のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、LAG3に結合する第1の結合部位が含まれる。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、上記軽鎖可変領域のCDR1～3を含む重鎖可変領域および/または上記重鎖可変領域のCDR1～3を含む軽鎖可変領域を含む。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および/または配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、配列番号7のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および/または配列番号8のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。
　ある実施形態において、LAG3に結合する第1の結合部位は、公知の抗LAG3抗体、例えば、BMS-986016、LAG525、MK-4280、11E3、17B4、3DS223H、REA351、REA776、11C3C65、7H2C65、C9B7Wまたは631501の可変領域に由来し得る。
　ある実施形態では、LAG3に結合する第1の結合部位は、上記で特定される第1の結合部位のいずれかとLAG3への結合を競合するものである。例えば、第1の結合部位は、上記で特定される第1の結合部位のいずれかとLAG3への結合を競合する抗体の可変領域に由来する。競合は、例えば、上記の競合アッセイにより確認することができる。
　ある実施形態では、上記で特定される第1の結合部位のいずれかが結合するLAG3の領域が特定される場合に、他の種のLAG3においてその領域に相当する領域を特定し、それに結合する結合部位、例えば、それに結合する抗体の可変領域を、第1の結合部位とすることができる。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、
　配列番号15のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3と同じアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号16のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3と同じアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域；
　を含む。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、
　配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、
　配列番号17のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号18のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2および配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号20のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号21のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2および配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、
　配列番号17の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR1、
　配列番号18の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR2、および
　配列番号19の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号20の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR1、
　配列番号21の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR2、および
　配列番号22の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、
　配列番号17の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR1、
　配列番号18の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR2、および
　配列番号19の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号20の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR1、
　配列番号21の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR2、および
　配列番号22の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、
　配列番号17の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR1、
　配列番号18の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR2、および
　配列番号19の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号20の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR1、
　配列番号21の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR2、および
　配列番号22の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、
　配列番号17の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR1、
　配列番号18の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR2、および
　配列番号19の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号20の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR1、
　配列番号21の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR2、および
　配列番号22の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、配列番号15のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および/または、配列番号16のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、配列番号15のアミノ酸配列において0～5個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または、配列番号16のアミノ酸配列において0～5個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。これらの実施形態には、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域のCDRに改変が生じていないCD3に結合する第2の結合部位、具体的には、配列番号17のアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号18のアミノ酸配列からなるCDR2、および配列番号19のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域、および/または、配列番号20のアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号21のアミノ酸配列からなるCDR2、および配列番号22のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、CD3に結合する第2の結合部位が含まれる。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、上記軽鎖可変領域のCDR1～3を含む重鎖可変領域および/または上記重鎖可変領域のCDR1～3を含む軽鎖可変領域を含む。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および/または配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、配列番号15のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および/または配列番号16のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。
　ある実施形態において、CD3に結合する第2の結合部位は、公知の抗CD3抗体、例えば、2C11、17A2、500A2、KT3、OKT3(ATCC受託番号CRL8001)(米国特許第4658019号)、7D6、12F6、38.1、89b1、131F26、BL-A8、BW239/347、BW264/56、CD3-4B5、CLB-T3/3、CRIS-7、F111-409、G19-4.1、HIT3a、ICO-90、IP30、Leu-4、LY17.2G3、M-T301、M-T302、MEM-57、MEM-92、NU-T3、OKT3D、SMC2、T3、T3(2Ad2)、T3/2Ad2A2、T3/2AD、T3(2ADA)、T3/2T8-2F4、T3/RW2-4B6、T3/RW2-8C8、T10B9、T101-01、UCHT1、VIT3、VIT3b、X35-3、XXIII.46、XXIII.87、XXIII.141、YTH12.5、YTH12.5、CLB-T3.4.2、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、M291、Leu4、500A2、SP34、RIV-9、BH11、T2/30、AG3、BC3、OKT3γ1(ala-ala)(米国特許第6491916号)、ChAglyCD3(国際公開第93/19196号)またはHUM291(国際公開第97/44362号)の可変領域に由来し得る。
　ある実施形態では、CD3に結合する第2の結合部位は、上記で特定される第2の結合部位のいずれかとCD3への結合を競合するものである。ある実施形態では、CD3εに結合する第2の結合部位は、上記で特定される第2の結合部位のいずれかとCD3εへの結合を競合するものである。例えば、第2の結合部位は、上記で特定される第2の結合部位のいずれかとCD3への結合を競合する抗体の可変領域に由来する。競合は、例えば、上記の競合アッセイにより確認することができる。
　ある実施形態では、上記で特定される第2の結合部位のいずれかが結合するCD3の領域が特定される場合に、他の種のCD3においてその領域に相当する領域を特定し、それに結合する結合部位、例えば、それに結合する抗体の可変領域を、第2の結合部位とすることができる。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、
　配列番号23のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3と同じアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号24のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3と同じアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域；
　を含む。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、
　配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、
　配列番号25のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2および配列番号27のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号28のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2および配列番号30のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、
　配列番号25の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR1、
　配列番号26の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR2、および
　配列番号27の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号28の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR1、
　配列番号29の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR2、および
　配列番号30の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含むCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、
　配列番号25の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR1、
　配列番号26の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR2、および
　配列番号27の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号28の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR1、
　配列番号29の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR2、および
　配列番号30の配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列からなるCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、
　配列番号25の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR1、
　配列番号26の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR2、および
　配列番号27の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号28の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR1、
　配列番号29の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR2、および
　配列番号30の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列を含むCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、
　配列番号25の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR1、
　配列番号26の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR2、および
　配列番号27の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR3、
を含む重鎖可変領域；および/または、
　配列番号28の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR1、
　配列番号29の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR2、および
　配列番号30の配列において0、1または2個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列からなるCDR3、
を含む軽鎖可変領域；
を含む。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、配列番号23のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および/または、配列番号24のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、配列番号23のアミノ酸配列において0～5個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または、配列番号24のアミノ酸配列において0～5個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。これらの実施形態には、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域のCDRに改変が生じていないCD8に結合する第2の結合部位、具体的には、配列番号25のアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号26のアミノ酸配列からなるCDR2、および配列番号27のアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域、および/または、配列番号28のアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号29のアミノ酸配列からなるCDR2、および配列番号30のアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、CD8に結合する第2の結合部位が含まれる。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、上記軽鎖可変領域のCDR1～3を含む重鎖可変領域および/または上記重鎖可変領域のCDR1～3を含む軽鎖可変領域を含む。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、配列番号23のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および/または配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、配列番号23のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および/または配列番号24のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。
　ある実施形態において、CD8に結合する第2の結合部位は、公知の抗CD8抗体、例えば、YTS169、cM-T807、T8/Leu2/SK1、RPA-T8、HIT8a、OKT8(特表2011-522835)、53-6.7、53-5.8、5H10、YTS-156、KT15、LT8またはCA-8の可変領域に由来し得る。
　ある実施形態では、CD8に結合する第2の結合部位は、上記で特定される第2の結合部位のいずれかとCD8への結合を競合するものである。ある実施形態では、CD8αに結合する第2の結合部位は、上記で特定される第2の結合部位のいずれかとCD8αへの結合を競合するものである。例えば、第2の結合部位は、上記で特定される第2の結合部位のいずれかとCD8への結合を競合する抗体の可変領域に由来する。競合は、例えば、上記の競合アッセイにより確認することができる。
　ある実施形態では、上記で特定される第2の結合部位のいずれかが結合するCD8の領域が特定される場合に、他の種のCD8においてその領域に相当する領域を特定し、それに結合する結合部位、例えば、それに結合する抗体の可変領域を、第2の結合部位とすることができる。
　二重特異性分子は、当技術分野で公知の多重特異性分子のフォーマットに即した構造を有し得る。多重特異性分子の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、The coming of Age of Engineered Multivalent Antibodies, Nunez-Prado et al Drug Discovery Today Vol 20 Number 5 Mar 2015, page 588-594、D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798, Chan and Carter, Nature Reviews Immunology vol 10, May 2010, 301および特表2017-522023に開示されている。
　ある実施形態では、二重特異性分子のフォーマットは、ダイアボディ、二重特異性sc(Fv)2、二重特異性ミニボディ、二重特異性F(ab')2、二重特異性抗体、共有結合型ダイアボディ(二重特異性DART)(国際公開第2006/113665号または国際公開第2008/157379号)、二重特異性(FvCys)2(J. Immunol.,1992, Vol.149, No.1, p.120-126)、二重特異性F(ab'-ジッパー)2(J. Immunol.,1992, Vol.148, No.5, p.1547-1553)、二重特異性(Fv-ジッパー)2(Biochemistry, 1992, Vol.31, No.6, p.1579-1584)、二重特異性三鎖抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1993, Vol.90, No.14, p.6444-6448)および二重特異性mAb2(www.f-star.com/technology_mab.html)から選択される。ある実施形態では、二重特異性分子のフォーマットは、ダイアボディ、タンデムscFv、scダイアボディ、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、diFab、diFab’、scFv-Fc、タンデムscFv-Fc、scダイアボディ-Fc、scダイアボディ-CH3、Ig-scFvおよびscFv-Ig(特表2017-526616)から選択される。ある実施形態では、二重特異性分子は、ダイアボディ、タンデムscFvおよびscダイアボディから選択される。ある実施形態では、二重特異性分子はscダイアボディである。ある実施形態では、二重特異性分子は二重特異性抗体、好ましくは二重特異性モノクローナル抗体である。ある実施形態では、本明細書に記載の二重特異性分子は定常領域を含む。二重特異性抗体は、いかなるイムノグロブリンクラスの抗体であってもよい。イムノグロブリンクラスとしては、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが、イムノグロブリンクラスのサブクラス(アイソタイプ)としては、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2が挙げられる。ある実施形態では、二重特異性抗体は、IgGサブクラス、例えば、IgG1またはIgG4サブクラスのものである。
　ダイアボディとは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、各ポリペプチド鎖において、重鎖可変領域(VH)と軽鎖可変領域(VL)が、同じ鎖中で互いに会合できないように、リンカーにより連結されている(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1993, Vol.90, No.14, p.6444-6448)。一方のポリペプチド鎖上のVHおよびVLが、他方のポリペプチド鎖上のVLおよびVHとそれぞれ会合するため、ダイアボディは2つの抗原結合部位を有する。リンカーは、VHおよびVLの発現並びにダイアボディの形成を阻害するものでなければ特に限定されず、例えば、Ser、(Gly)n-Ser、Ser-(Gly)n、((Gly)4-Ser)n、(Ser-(Gly)4)n [nは1～6の整数を表す]などであり得る (J. Immunol. Meth., 1999, Vol.231, p.177-189)。典型的には、ペプチドリンカーは、ポリペプチド鎖内のVHとVLが会合できない程度に短く、例えば、約2～12または約3～10、特に約5アミノ酸残基の長さであるか、または、ポリペプチド鎖内のVHとVLが会合できない構造を有する。
　二重特異性sc(Fv)2は、異なる抗原を認識する2つの抗体のVHおよびVLが、リンカーを介して一本鎖中に連結されているポリペプチド鎖である(J. Biological Chemistry, 1994, 269: 199-206)。ここで、二重特異性sc(Fv)2の形態には、2つの異なる抗原aおよび抗原bを認識する抗体のVHおよびVLを各々VHaおよびVLa、VHbおよびVLbと表し、ペプチドリンカーを各々(L1)、(L2)および(L3)と表すと、N末端側から、
(1)VHa-(L1)-VLa-(L2)-VHb-(L3)-VLb、
(2)VHa-(L1)-VLa-(L2)-VLb-(L3)-VHb、
(3)VLa-(L1)-VHa-(L2)-VHb-(L3)-VLb、
(4)VLa-(L1)-VHa-(L2)-VLb-(L3)-VHb、
(5)VHa-(L1)-VHb-(L2)-VLb-(L3)-VLa、
(6)VHa-(L1)-VLb-(L2)-VHb-(L3)-VLa、
(7)VLa-(L1)-VLb-(L2)-VHb-(L3)-VHa、および
(8)VLa-(L1)-VHb-(L2)-VLb-(L3)-VHa、
で配列されているものが含まれる。二重特異性sc(Fv)2は、VHaとVLaが会合し、VHbとVLbが会合することによって形成される。ここで、ペプチドリンカーは、二重特異性sc(Fv)2の発現並びに形成を阻害するものでなければ特に限定されず、例えば、Ser、(Gly)n-Ser、Ser-(Gly)n、((Gly)4-Ser)n、(Ser-(Gly)4)n[nは1～6の整数を表す]、Ser-Ser-Ala-Asp-Asp-Ala-Lys-Lys-Asp-Ala-Ala-Lys-Lys-(Asp-Asp-Ala-Lys-Lys)2-Asp-Alaなどであり得る。
　上記(1)～(4)の形態の二重特異性sc(Fv)2を、特にタンデムscFvと称する。典型的には、タンデムscFvのペプチドリンカー(L2)は、それに隣接する２つの可変領域が相互に会合できない程度に短く、例えば、約2～12または約3～10、特に約5アミノ酸残基の長さであるか、または、それに隣接する２つの可変領域が相互に会合できない構造を有する。タンデムscFvのペプチドリンカー(L1)および(L3)は、それに隣接する２つの可変領域が相互に会合できる長さと構造を有し、例えば、約10～25または約13～20、特に約15アミノ酸残基の長さである。(L1)および(L3)は同じであっても異なっていてもよい。
　上記(5)～(8)の形態の二重特異性sc(Fv)2を、特にscダイアボディと称する。典型的には、scダイアボディのペプチドリンカー(L1)および(L3)は、それに隣接する２つの可変領域が相互に会合できない程度に短く、例えば、約2～12または約3～10、特に約5アミノ酸残基の長さであるか、または、それに隣接する２つの可変領域が相互に会合できない構造を有する。(L1)および(L3)は同じであっても異なっていてもよい。タンデムscFvのペプチドリンカー(L2)は、それに隣接する２つの可変領域が相互に会合できる長さと構造を有し、例えば、約10～25または約13～20、特に約15アミノ酸残基の長さである。
　本開示の二重特異性分子が、タンデムscFvまたはscダイアボディである場合、LAG3に結合する第1の結合部位が上記式のVHaおよびVLaで構成され、CD3またはCD8に結合する第2の結合部位がVHbおよびVLbで構成され得る。あるいは、LAG3に結合する第1の結合部位が上記式のVHbおよびVLbで構成され、CD3またはCD8に結合する第2の結合部位がVHaおよびVLaで構成され得る。
　二重特異性抗体とは、異なる2つの抗原を認識する抗体の重鎖/軽鎖複合体がジスルフィド結合等によって共有結合したインタクトな抗体である。二重特異性抗体は、例えば、ハイブリッドハイブリドーマ法(米国特許第4474893号)で作製されたハイブリドーマから産生させることができる。また、異なる抗原を認識する抗体の重鎖および軽鎖を各々コードする計4種類のcDNAを哺乳動物細胞に共発現させ、タンパク質を分泌させて製造することができる。ある実施形態では、二重特異性抗体はIgGサブクラス、例えば、IgG1またはIgG4サブクラスのものである。
　二重特異性F(ab')2とは、異なる2つの抗原を認識する抗体のFab'断片が、ジスルフィド結合等により共有結合した低分子化抗体である。ここで、Fab'断片は、インタクトな抗体をペプシンで消化したF(ab')2の2つの重鎖間のジスルフィド結合の切断により調製される抗体断片である。二重特異性F(ab')2は、例えば、一方の抗体から調製したFab'断片をo-フェニレンジマレイミドにてマレイミド化し、もう一方の抗体から調製したFab'断片を反応させることにより作製することができる(Cancer Research 1997, 57: 4008-4014)。また、Fab'断片-チオニトロ安息香酸誘導体と一方のFab'-SH等の抗体断片を化学的に結合する方法も知られている(Science 1985, 229: 81-83)。
　二重特異性ミニボディとは、各々異なる抗原を認識するscFvに抗体の定常領域CH3ドメインが連結されるよう改変された低分子抗体断片を、そのCH3ドメイン上のジスルフィド結合等によって共有結合させた低分子化抗体である(Biochemistry, 1992, Vo.31, No.6, p.1579-1584)。ここで、scFvとは、VHとVLがペプチドリンカー等によって連結された形態を有する一本鎖の改変低分子抗体断片である(J. Immunol. Meth., 1999, Vol.231, p.177-189)。
　これらのフォーマットの二重特異性分子は、その抗原結合部位を構成するVHおよびVLに相当する部分を各々コードする遺伝子を用いて製造することができる。VHおよびVLに相当する部分を各々コードする遺伝子は、主に抗体遺伝子ライブラリーから、あるいはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから遺伝子クローニングして取得することができる。
　二重特異性分子は、それをコードする単離cDNAを発現ベクターに挿入し、宿主細胞で発現・分泌させて製造することができる。例えば、ダイアボディの場合、ダイアボディを構成する各々の一本鎖ペプチドを発現するベクターは、ペプチドリンカーをコードするDNAを挟むように、異なる抗原を認識するVH、VLに相当する部分を各々コードするcDNAをインフレームで連結し、これを発現ベクターに挿入して作製することができる。各々の一本鎖ペプチドを発現するDNAは同一の発現ベクターに挿入されてもよく、また、別々の発現ベクターに挿入されてもよい。この発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して発現させると、宿主細胞からダイアボディを直接分泌させることができる。また、二重特異性sc(Fv)2の場合、例えば、一方の抗原を認識するVHおよびVLをコードするcDNA、他方の抗原を認識するVHおよびVLをコードするcDNA、並びに、ペプチドリンカーをコードするcDNAをインフレームで連結し、これを発現ベクターに挿入して作製することができる。この発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して発現させると、宿主細胞から二重特異性sc(Fv)2を直接分泌させることができる。ここで、ダイアボディあるいは二重特異性sc(Fv)2の発現に使用できる発現ベクターとしては、例えば、pEBMulti-Neo (Wako)、pCANTAB5E(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)などが挙げられる。
　宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などの真核細胞を用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞(例えば、CHO、COS、NIH3T3、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero、293T、platE)、両生類細胞(例えばアフリカツメガエル卵母細胞)、または昆虫細胞(例えば、Sf9、Sf21、Tn5)が挙げられる。真菌細胞としては、酵母(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))、糸状菌(例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、例えば、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger))などが挙げられる。また、大腸菌(E. coli)(例えば、JM109、DH5α、HB101等)、枯草菌などの原核細胞を宿主細胞として用いることもできる。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法により行うことができる。
　本開示はまた、二重特異性分子をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および当該ポリヌクレオチドまたは当該発現ベクターを含む形質転換細胞を提供する。
　二重特異性分子は、例えば半減期延長、または安定性の改善等のため、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンまたはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーなどのポリマーと結合していてもよい。また、シグナル配列等の付加配列を含んでもよい。
　二重特異性分子のアミノ酸残基は、公知の方法で修飾されていてもよい。例えば、アミノ酸残基の側鎖中の官能基、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基に、エステル化、アルキル化、ハロゲン化、リン酸化などを施し得る。また、二重特異性分子のＮ末端および/またはＣ末端に、種々の物質を結合させることができる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグなどのタグを付加してもよい。二重特異性分子にこれらの物質が結合している場合、これらの物質が例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的に二重特異性分子を生じるものであってもよい。これらの物質は、二重特異性分子の溶解性を調節するものであってもよく、耐プロテアーゼ作用等その安定性を向上させるものであってもよく、また例えば、所定の組織・器官に特異的に二重特異性分子をデリバリーするものであってもよい。
　本明細書に開示される二重特異性分子または免疫抑制剤の毒性は低いものであるため、医薬品として安全に使用することができる。
［医薬品への適用］
　実施例により立証される通り、本明細書に開示される二重特異性分子は、免疫を抑制し得る。従って、二重特異性分子を免疫抑制剤として使用し得る。また、免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療に使用し得る。
　免疫の亢進を特徴とする疾患には、自己免疫疾患、アレルギー疾患および移植片対宿主病が含まれる。自己免疫疾患には、例えば、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症(全身性強皮症、進行性全身性硬化症)、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎(結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎)、大動脈炎症候群(高安動脈炎)、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、コーガン症候群、RS3PE症候群、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、IgG4関連疾患(例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など)、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病(甲状腺機能亢進症)、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病(慢性副腎皮質機能低下症)、I型糖尿病、緩徐進行性I型糖尿病(成人潜在性自己免疫性糖尿病)、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、アトピー性皮膚炎、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、サルコイドーシス、水疱性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病)およびセリアック病などが含まれる。ある実施形態では、自己免疫疾患は、I型糖尿病、多発性硬化症、全身エリテマトーデスまたは関節リウマチである。ある実施形態では、自己免疫疾患は多発性硬化症である。アレルギー疾患には、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、鼻炎、結膜炎および花粉症などが含まれる。
　本明細書で使用されるとき、「治療する」または「治療」は、疾患を有する対象において、疾患の原因を軽減または除去すること、その進行を遅延または停止させること、その症状を軽減、緩和、改善または除去すること、および/または、その症状の悪化を抑制することを意味する。
　本明細書で使用されるとき、「予防する」または「予防」は、対象において、特に、疾患を発症する可能性が高いが、未だ発症していない対象において、疾患の発症を防止すること、または、疾患を発症する可能性を低減することを意味し、再発予防を含む。自己免疫疾患またはアレルギー疾患を発症する可能性があるが、未だ発症していない対象には、例えば、免疫が亢進している対象、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の遺伝的素因を有する対象、過去に自己免疫疾患またはアレルギー疾患に罹患し、治癒した対象が含まれる。移植片対宿主病を発症する可能性があるが、未だ発症していない対象には、臓器移植を受ける対象が含まれる。
　免疫抑制剤または免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療剤の投与対象としては、動物、典型的には哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等)が挙げられるが、ヒトが特に好ましい。また好ましい対象は、免疫の抑制または上記予防および/または治療を必要とする対象、特に上記治療を必要とする対象（例えば患者）である。
　有効成分の投与量は、投与方法、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、成人1日当たり、0.1μg/kg～300mg/kgを、1日30分から24時間の範囲の期間の持続投与で、または、1日1回から数回、または1日もしくは数日または1週間もしくは数週間に1回から数回、例えば1～3週間に1回投与することができるが、これに限定されない。投与方法も、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。投与方法は、経口投与であっても非経口投与であってもよいが、非経口投与が好ましい。非経口投与としては、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられるが、静脈内投与が好ましい。
　免疫抑制剤または免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療剤は、常法により製剤化することができる。製剤は、製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を含んでもよい。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、可溶化剤等が挙げられる。例えば、免疫抑制剤は、注射液または輸液として製剤化され得る。注射剤または輸液は、滅菌水溶液、懸濁液または乳濁液等の形態であり得、あるいは、滅菌された液体に溶解、懸濁または乳濁して使用するための固形剤または凍結乾燥剤の形態であり得る。滅菌された液体は、例えば、注射用水、生理食塩水、ブドウ糖溶液または等張液等であり得る。また、免疫抑制剤は、有効成分が持続放出または制御放出されるように製剤化され得る。これらの製剤の製造方法は、当分野で周知である。
　製剤は、薬学的に許容できる担体を含み得る。本開示において、「薬学的に許容できる担体」は、有効成分と組み合わせられた場合にその成分の生物学的活性を保持し得る、対象の免疫系と非反応性である任意の物質が含まれる。例えば、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、pH調整剤および抗酸化剤などが挙げられる。安定剤としては、例えば、各種アミノ酸、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン等を用いることができる。溶解補助剤としては、例えば、アルコール(例えば、エタノール等)、ポリアルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、非イオン性界面活性剤(例えば、ポリソルベート20(登録商標)、ポリソルベート80(登録商標)、HCO-50等)等を用いることができる。懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等を用いることができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等を用いることができる。防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等を用いることができる。抗酸化剤として、例えば、(1)アスコルビン酸、システインハイドロクロライド、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤、(2)アスコルビルパルミテート、ブチル化ハイドロキシアニソール、ブチル化ハイドロキシトルエン、レシチン、プロピルガレート、α－トコフェロール等のような油溶性抗酸化剤および(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤等を用いることができる。
　注射剤または点滴のための輸液は、その最終工程において滅菌するかあるいは無菌操作法、例えば、フィルターなどで濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することによって製造することができる。また、注射剤または点滴のための輸液は、真空乾燥および凍結乾燥による無菌粉末(薬学的に許容できる担体の粉末を含んでいてもよい)を、適切な溶剤に用時溶解して使用することもできる。
　免疫抑制剤または免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療剤は、単独で使用してもよく、または、1種またはそれ以上のさらなる有効成分、特に、免疫を抑制するための有効成分と併用してもよい。成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが免疫の抑制または免疫の亢進を特徴とする疾患の治療および/または予防のために使用される限り、各成分を同時に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。いずれかの成分を遅延して投与する場合に、各成分を同時投与する期間があってもよい。2種またはそれ以上のさらなる有効成分を併用することも可能である。その併用により、例えば、その他の有効成分の予防および/または治療の効果の補完、投与量あるいは投与回数の維持および/または低減が可能になる。併用に適する有効成分には、例えば、抗炎症剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、免疫抑制剤、分子標的薬等が含まれる。
　例えば、本開示の免疫抑制剤または免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療剤をI型糖尿病の予防および/または治療に適用する場合、インスリン製剤(例えば、ヒトインスリン、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリンアスパルト等)、スルホニルウレア剤(例えば、グリベンクラミド、グリクラジド、グリメピリド等)、速攻型インスリン分泌促進薬(例えば、ナテグリニド等)、ビグアナイド製剤(例えば、メトホルミン等)、インスリン抵抗性改善薬(例えば、ピオグリタゾン等)、α-グルコシダーゼ阻害薬(例えば、アカルボース、ボグリボース等)、糖尿病性神経症治療薬(例えば、エパルレスタット、メキシレチン、イミダプリル等)、GLP-1アナログ製剤(例えば、リラグルチド、エクセナチド、リキシセナチド等)およびDPP-4阻害剤(例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン等)等から選択される何れか一以上の薬剤と組み合わせて使用してもよい。
　また、例えば、本開示の免疫抑制剤または免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療剤を多発性硬化症の予防および/または治療に適用する場合、ステロイド薬(例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、ブチル酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酢酸ハロプレドン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パルミチン酸デキサメタゾン、酢酸パラメタゾン、ベタメタゾン等)、インターフェロンβ-1a、インターフェロンβ-1b、酢酸グラチラマー、ミトキサントロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、クラドリビン、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、コルチコトロピン、ミゾリビン、タクロリムス、フィンゴリモドおよびアレムツズマブ等から選択される何れか一以上の薬剤と組み合わせて使用してもよい。
　また、例えば、本開示の免疫抑制剤または免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療剤を全身エリテマトーデスの予防および/または治療に適用する場合、ステロイド薬(例えば、上記記載のステロイド薬)、免疫抑制剤(例えば、シクロスポリン、タクロリムス、フィンゴリモド等)およびベリムマブから選択される何れか一以上の薬剤と組み合わせて使用してもよい。
　また、例えば、本開示の免疫抑制剤または免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療剤を関節リウマチの予防および/治療に適用する場合、ステロイド薬(例えば、上記記載のステロイド薬)、抗リウマチ薬(例えば、メトトレキサート、スルファサラジン、ブシラミン、レフルノミド、ミゾリビン、タクロリムス等)あるいは抗サイトカイン薬(例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、トシリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブおよびセルトリズマブ等)およびアバタセプト等から選択される何れか一以上の薬剤と組み合わせて使用してもよい。
　その他の自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植片対宿主病の予防および/または治療に適用する場合、本開示の免疫抑制剤または免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療剤と上記に記載した他の薬剤の何れか一以上と組み合わせて使用してもよい。
　ある態様では、免疫の抑制を必要としている対象に、LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子を有効量で投与することを含む、免疫の抑制方法が提供される。本明細書における「有効量」とは、対象において免疫を抑制する効果を発揮し得る量を意味する。
　ある態様では、免疫の抑制において使用するための、LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子が提供される。
　ある態様では、免疫を抑制するための医薬組成物の製造における、LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子の使用が提供される。
　ある態様では、免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療方法であって、それを必要としている対象に、LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子を有効量で投与することを含む方法が提供される。
　ある態様では、免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療において使用するための、LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子が提供される。
　ある態様では、免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および/または治療剤の製造における、LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子の使用が提供される。
　また別の態様では、抗LAG3抗体またはその断片が提供される。抗LAG3抗体は、LAG3の機能を抑制し、それにより免疫を活性化し得る。抗LAG3抗体は、二重特異性分子の結合部位の取得に関して上記で説明した抗体、例えばモノクローナル抗体であり得る。
　ある実施形態では、抗LAG3抗体は、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギン、第55位のフェニルアラニン、第61位のバリンおよび／または第62位のイソロイシンに相当するアミノ酸を含む領域に結合するものである。ある実施形態では、抗LAG3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、二重特異性分子のLAG3に結合する第1の結合部位に関して説明した重鎖可変領域および軽鎖可変領域から選択されるものである。別の実施形態では、これらの抗体と、LAG3への結合に対して競合する抗LAG3抗体が提供される。
　抗LAG3抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどのいかなる動物種に由来してもよく、ヒト由来の抗体またはヒト化抗体であってもよい。抗LAG3抗体は、いかなるイムノグロブリンクラスの抗体であってもよい。イムノグロブリンクラスとしては、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが、イムノグロブリンクラスのサブクラス(アイソタイプ)としては、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2が挙げられる。ある実施形態では、抗LAG3抗体は、IgGサブクラス、例えば、IgG1またはIgG4サブクラスのものである。
　抗LAG3抗体の断片には、抗LAG3抗体の一部分を構成要素として含み、LAG3への結合性を保持する分子、例えば、LAG3抗体の重鎖および軽鎖可変領域（VHおよびVL）、F（ab'）2、Fab'、Fab、Fv、disulphide-linked FV（sdFv）、Single-Chain FV（scFV）、Fab3、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、Bis-scFv、（scFv）2-Fc、intact-IgG、sc(Fv)2、共有結合型ダイアボディ、(FvCys)2、F(ab'-ジッパー)2、(Fv-ジッパー)2、三鎖抗体、mAb2、タンデムscFv、scダイアボディ、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、diFab、diFab’、scFv-Fc、タンデムscFv-Fc、scダイアボディ-Fc、scダイアボディ-CH3、Ig-scFvおよびscFv-Igが含まれる。
　本開示は、例えば、下記の実施形態を提供する。
［1］LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子を含む、免疫抑制剤。
［2］二重特異性分子が、LAG3とMHCクラスII分子との結合を許容する、前記［1］に記載の免疫抑制剤。
［3］第1の結合部位が、LAG3のD1領域に含まれ、かつ、エキストラループ領域に含まれない部分に結合するものである、前記［1］または［2］に記載の免疫抑制剤。
［4］第1の結合部位が、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第23位のセリンから第69位のセリンまでに相当する領域に結合するものである、前記［1］～［3］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［5］第1の結合部位が、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギン、第55位のフェニルアラニン、第61位のバリンおよび／または第62位のイソロイシンに相当するアミノ酸を含む領域に結合するものである、前記［1］～［4］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［6］第1の結合部位が抗LAG3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、前記［1］～［5］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［7］第1の結合部位が、
配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
　前記［6］に記載の免疫抑制剤。
［8］第1の結合部位が、配列番号7のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記［6］または［7］に記載の免疫抑制剤。
［9］第1の結合部位が、LAG3との結合に対して
(i)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗LAG3抗体と競合する、前記［1］～［6］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［10］第1の結合部位によるLAG3への結合が、
(i)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗LAG3抗体によって競合される、前記［1］～［6］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［11］第2の結合部位がCD3に特異的に結合するものである、前記［1］～［10］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［12］第2の結合部位がCD3εに特異的に結合するものである、前記［11］に記載の免疫抑制剤。
［13］第2の結合部位が抗CD3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、前記［11］または［12］に記載の免疫抑制剤。
［14］第2の結合部位が、
配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
　前記［13］に記載の免疫抑制剤。
［15］第2の結合部位が、配列番号15のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号16のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記［13］または［14］に記載の免疫抑制剤。
［16］第2の結合部位が、CD3との結合に対して
(i)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗CD3抗体と競合する、前記［11］～［13］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［17］第2の結合部位によるCD3への結合が、
(i) 配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗CD3抗体によって競合される、前記［11］～［13］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［18］第2の結合部位がCD8に特異的に結合するものである、前記［1］～［10］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［19］第2の結合部位がCD8αに特異的に結合するものである、前記［18］に記載の免疫抑制剤。
［20］第2の結合部位が抗CD8抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、前記［18］または［19］に記載の免疫抑制剤。
［21］第2の結合部位が、
配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
　前記［20］に記載の免疫抑制剤。
［22］第2の結合部位が、配列番号23のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号24のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記［20］または［21］に記載の免疫抑制剤。
［23］第2の結合部位が、CD8との結合に対して
(i)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号23のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗CD8抗体と競合する、前記［18］～［20］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［24］第2の結合部位によるCD8への結合が、
(i)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号23のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗CD8抗体によって競合される、前記［18］～［20］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［25］二重特異性分子が、二重特異性抗体、ダイアボディ、タンデムscFv、scダイアボディ、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、diFab、diFab’、scFv-Fc、タンデムscFv-Fc、scダイアボディ-Fc、scダイアボディ-CH3、Ig-scFvおよびscFv-Igのいずれかの形態である、前記［1］～［24］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［26］二重特異性分子が、ダイアボディ、タンデムscFvおよびscダイアボディのいずれかの形態（好ましくは、scダイアボディの形態）である、前記［1］～［25］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［27］二重特異性分子が、二重特異性抗体（好ましくは、二重特異性モノクローナル抗体の形態）の形態である、前記［1］～［25］のいずれかに記載の免疫抑制剤。
［28］自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植片対宿主病の予防および／または治療のための、前記［1］～［27］のいずれか一項に記載の免疫抑制剤。
［29］自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植片対宿主病の予防および／または治療方法であって、前記［1］～［27］のいずれか一項に記載の免疫抑制剤の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法。
［30］自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植片対宿主病の予防および／または治療における使用のための、前記［1］～［27］のいずれか一項に記載の免疫抑制剤。
［31］自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植片対宿主病の予防および／または治療剤の製造のための、前記［1］～［27］のいずれか一項に記載の免疫抑制剤の使用。
［32］LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子。
［33］LAG3とMHCクラスII分子との結合を許容する、前記［32］に記載の二重特異性分子。
［34］第1の結合部位が、LAG3のD1領域に含まれ、かつ、エキストラループ領域に含まれない部分に結合するものである、前記［32］または［33］に記載の二重特異性分子。
［35］第1の結合部位が、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第23位のセリンから第69位のセリンまでに相当する領域に結合するものである、前記［32］～［34］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［36］第1の結合部位が、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギン、第55位のフェニルアラニン、第61位のバリンおよび／または第62位のイソロイシンに相当するアミノ酸を含む領域に結合するものである、前記［32］～［35］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［37］第1の結合部位が抗LAG3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、前記［32］～［36］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［38］第1の結合部位が、
配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
　前記［37］に記載の二重特異性分子。
［39］第1の結合部位が、配列番号7のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記［37］または［38］に記載の二重特異性分子。
［40］第1の結合部位が、LAG3との結合に対して
(i)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗LAG3抗体と競合する、前記［32］～［37］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［41］第1の結合部位によるLAG3への結合が、
(i)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗LAG3抗体によって競合される、前記［32］～［37］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［42］第2の結合部位がCD3に特異的に結合するものである、前記［32］～［41］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［43］第2の結合部位がCD3εに特異的に結合するものである、前記［42］に記載の二重特異性分子。
［44］第2の結合部位が抗CD3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、前記［42］または［43］に記載の二重特異性分子。
［45］第2の結合部位が、
配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
　前記［44］に記載の二重特異性分子。
［46］第2の結合部位が、配列番号15のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号16のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記［44］または［45］に記載の二重特異性分子。
［47］第2の結合部位が、CD3との結合に対して
(i)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗CD3抗体と競合する、前記［42］～［44］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［48］第2の結合部位によるCD3への結合が、
(i)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗CD3抗体によって競合される、前記［42］～［44］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［49］第2の結合部位がCD8に特異的に結合するものである、前記［32］～［41］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［50］第2の結合部位がCD8αに特異的に結合するものである、前記［49］に記載の二重特異性分子。
［51］第2の結合部位が抗CD8抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、前記［49］または［50］に記載の二重特異性分子。
［52］第2の結合部位が、
配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
　前記［51］に記載の二重特異性分子。
［53］第2の結合部位が、配列番号23のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号24のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記［51］または［52］に記載の二重特異性分子。
［54］第2の結合部位が、CD8との結合に対して
(i)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号23のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗CD8抗体と競合する、前記［49］～［51］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［55］第2の結合部位によるCD8への結合が、
(i)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
(ii)配列番号23のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗CD8抗体によって競合される、前記［49］～［51］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［56］二重特異性抗体、ダイアボディ、タンデムscFv、scダイアボディ、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、diFab、diFab’、scFv-Fc、タンデムscFv-Fc、scダイアボディ-Fc、scダイアボディ-CH3、Ig-scFvおよびscFv-Igのいずれかの形態である、前記［32］～［55］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［57］ダイアボディ、タンデムscFvおよびscダイアボディのいずれかの形態（好ましくは、scダイアボディの形態）である、前記［32］～［56］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［58］二重特異性抗体（好ましくは、二重特異性モノクローナル抗体の形態）の形態である、前記［32］～［56］のいずれかに記載の二重特異性分子。
［59］前記［32］～［58］のいずれか一項に記載の二重特異性分子を有効成分として含む免疫抑制剤。
［60］薬学的に許容できる担体をさらに含む、前記［59］に記載の免疫抑制剤。
［61］免疫の抑制方法であって、前記［32］～［58］のいずれか一項に記載の二重特異性分子の有効量をそれを必要としている対象に投与することを含む、方法。
［62］免疫の抑制において使用するための、前記［32］～［58］のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
［63］免疫抑制剤の製造のための、前記［32］～［58］のいずれか一項に記載の二重特異性分子の使用。
［64］前記［32］～［58］のいずれか一項に記載の二重特異性分子を有効成分として含む、免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および／または治療剤。
［65］薬学的に許容できる担体をさらに含む、前記［64］に記載の予防および／または治療剤。
［66］免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および／または治療方法であって、前記［32］～［58］のいずれか一項に記載の二重特異性分子の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法。
［67］免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および／または治療において使用するための、前記［32］～［58］のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
［68］免疫の亢進を特徴とする疾患の予防および／または治療剤の製造のための、前記［32］～［58］のいずれか一項に記載の二重特異性分子の使用。
［69］免疫の亢進を特徴とする疾患が、自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植片対宿主病である、前記［64］または［65］に記載の予防および／または治療剤、前記［66］に記載の方法、前記［67］に記載の二重特異性分子、または、前記［68］に記載の使用。
［70］免疫の亢進を特徴とする疾患が自己免疫疾患である、前記［69］に記載の予防および／または治療剤、方法、二重特異性分子または使用。
［71］自己免疫疾患が、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎、大動脈炎症候群、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、コーガン症候群、RS3PE症候群、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、IgG4関連疾患、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、I型糖尿病、緩徐進行性I型糖尿病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、アトピー性皮膚炎、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、サルコイドーシス、水疱性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、炎症性腸疾患およびセリアック病からなる群から選択される、前記［70］に記載の予防および／または治療剤、方法、二重特異性分子または使用。
［72］自己免疫疾患が、I型糖尿病、多発性硬化症、全身エリテマトーデスまたは関節リウマチである、前記［70］または［71］に記載の予防および／または治療剤、方法、二重特異性分子または使用。
［73］自己免疫疾患が多発性硬化症である、前記［70］～［72］のいずれか一項に記載の予防および／または治療剤、方法、二重特異性分子または使用。
［74］多発性硬化症が全身性強皮症または進行性全身性硬化症である、前記［73］に記載の予防および／または治療剤、方法、二重特異性分子または使用。
［75］前記［32］～［58］のいずれか一項に記載の二重特異性分子をコードするポリヌクレオチド。
［76］前記［75］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［77］前記［75］に記載のポリヌクレオチドまたは前記［76］に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
［78］配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギン、第55位のフェニルアラニン、第61位のバリンおよび／または第62位のイソロイシンに相当するアミノ酸を含む領域に結合する、抗LAG3抗体またはその断片。
［79］配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗LAG3抗体またはその断片。
［80］該抗LAG3抗体が、配列番号7のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記［79］に記載の抗LAG3抗体またはその断片。
［81］LAG3への結合に対して、前記［79］または［80］に記載の抗体と競合する抗LAG3抗体またはその断片。
　本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
実施例1: LAG3およびCD3εに結合する二重特異性分子2C11xTKB58およびTKB58x2C11の作製
　抗マウスLAG3抗体(TKB58)および抗マウスCD3ε抗体(2C11)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸を合成した後、PCRにて増幅し、pEBMulti-Neo(Wako)またはpSecTag2/Hygro(Thermo Fisher Scientific)を改変して作製した発現プラスミドベクターにクローニングして、マウスLAG3およびマウスCD3εを認識する二重特異性分子2C11xTKB58(配列番号31)およびTKB58x2C11(配列番号32)の発現プラスミドを作製した。発現プラスミドをAvalanche-Omni Transfection Reagent(EZ Biosystems)を用いてplatE細胞に導入し、48時間後に培養上清を回収した。培養上清を用いて、BW5147、DO11.10、DO11.10-mLAG3細胞を染色した。
　結果を図1に示す。マウスCD3εを発現しマウスLAG3を発現しないDO11.10細胞への結合が確認されたことから、二重特異性分子がマウスCD3εに対する結合能を有していることが確認された。また、DO11.10細胞と比較して、マウスLAG3を強制発現させたDO11.10-mLAG3細胞に強く結合したことから、二重特異性分子がマウスLAG3に対する結合能を有していることも確認できた。一方、マウスCD3εおよびマウスLAG3を発現しないBW5147細胞には結合が認められなかったことから、結合が両分子に特異的であることが確認された。TKB58x2C11と比較して、2C11xTKB58を用いた場合にはより強い結合が観察された。
実施例2: 二重特異性分子2C11xTKB58およびTKB58x2C11はT細胞の抗原特異的活性化をLAG3依存的に抑制する
実施例2-1: LAG3による抑制を強く誘導する抗原提示細胞を用いた実験
　DO11.10細胞は、マウスMHCクラスII分子I-Adに提示されるOVA由来ペプチド(pOVA323-339, ISQAVHAAHAEINEAGR)を認識し、抗原ペプチドの量に応じてIL-2を産生することが知られている。I-Adを発現するIIA1.6細胞にpOVA323-339をパルスしてDO11.10細胞（mock）を刺激するとIL-2の産生が見られたが、TKB58x2C11および2C11xTKB58は、いずれもIL-2産生に影響を与えなかった(図2)。このことから、LAG3を発現しないT細胞の抗原特異的活性化に、これらの二重特異性分子が影響を与えないことが確認された。
　さらに、DO11.10細胞にマウスLAG3を強制発現させたDO11.10-mLAG3細胞（mLAG3 WT）を同様に抗原刺激した(図2)。IL-2の産生は、LAG3依存的に強く抑制された。抗マウスLAG3抗体TKB58を添加するとマウスLAG3の機能が阻害され、IL-2の産生が回復した。一方、TKB58x2C11または2C11xTKB58を添加してもLAG3によるIL-2産生抑制は阻害されなかった。
実施例2-2: LAG3による抑制をあまり強く誘導しない抗原提示細胞を用いた実験
　LAG3は安定なペプチドMHCII複合体と選択的に結合し、不安定なペプチドMHCII複合体には結合しない。BW5147-mCD86細胞にI-Adを強制発現させたBW5147-mCD86/I-Ad細胞にpOVA323-339をパルスすると、pOVA323-339は不安定な構造でI-Adに提示されるため、マウスLAG3に結合できず、マウスLAG3を介した抑制はほとんど機能しない。
　この刺激条件において、TKB58x2C11または2C11xTKB58を添加したところ、LAG3を発現させたDO11.10細胞（mLAG3 WT）を用いた場合にのみ、IL-2の産生が強く抑制された(図3)。細胞への結合実験(図1)において、2C11xTKB58がTKB58x2C11よりも強く標的細胞に結合した結果と同様に、2C11xTKB58がTKB58x2C11よりも強い抑制効果を示した。
実施例2-3: LAG3が殆ど抑制効果を示さないMHCクラスI拘束性細胞を用いた実験
　B3Z細胞はマウスMHCクラスI分子H-2Kbに提示されるOVA由来ペプチド(pOVA257-264、SIINFEKL)を認識し、抗原ペプチドの量に応じてIL-2を産生することが知られている。H-2Kbを発現するIIA1.6細胞にOVAペプチドをパルスしてB3Z細胞（mock）を刺激するとIL-2の産生が見られたが、マウスLAG3を発現（mLAG3 WT）させてもIL-2の産生を阻害しなかった(図4)。これは、MHCIクラスI拘束性のB3Z細胞では、LAG3が抑制機能を発揮できないためである。TKB58x2C11または2C11xTKB58を添加すると、B3Z細胞がマウスLAG3を発現する場合にのみ、IL-2の産生が強く抑制された。これらの結果は、TKB58x2C11および2C11xTKB58が、MHCクラスI拘束性CD8陽性細胞であっても、LAG3発現細胞の抗原特異的な活性化を抑制することを示す。
実施例2-4: リガンド結合能力が無いLAG3変異体を用いた実験
　LAG3のアミノ酸変異体LAG3-P111Aは、pMHCIIとの結合能を欠くため、抗原刺激を受けてもT細胞抑制機能を発揮しない。この変異体を用いて、実施例2-1と同様の実験を行った。結果を図5に示す。この刺激条件において、TKB58x2C11または2C11xTKB58を添加したところ、LAG3-P111A依存的にIL-2の産生が強く抑制された。従って、TKB58x2C11および2C11xTKB58は、LAG3とリガンドであるpMHCIIとの結合が無い条件でも、LAG3発現細胞の抗原特異的な活性化を抑制することが明らかとなった。これらの結果は、TKB58x2C11および2C11xTKB58が、LAG3がMHCIIに結合できない状況であっても、LAG3を賦活化し、TCRを抑制することを示す。
実施例3: 実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を用いた二重特異性分子の評価
　C57BL/6マウスを用いたEAEモデルにおいて、2C11xTKB58のインビボ作用を評価した。結核死菌H37Ra(BD Biosciences、型番231141)と不完全フロイントアジュバント(BD Biosciences、型番263910)を混合して、4mg/mLの結核死菌H37Raを含む完全フロイントアジュバント(CFA)を調製した。1mg/mLのMOGペプチド(ANASPEC、型番AS-60130)と等量のCFAを混合してエマルジョンを調製し、EAEモデルの惹起剤とした。200μLの当該惹起剤をC57BL/6マウス尾根部に皮下投与し、その免疫処置当日および2日目に、各々200μLの1μg/mL百日咳毒素(SIGMA-ALDRICH、型番P7208)を尾静脈内投与した。次に、C57BL/6マウスに、2C11xTKB58を、免疫処置6日目から10日目に、各々0.3mg/kgの投与量で1日1回腹腔内投与した。免疫処置日以降、神経症状を大貫らの方法 (Onuki M,et al., Microsc Res Tech 2001;52:731-9.)に準じて評価し、神経症状スコアを記録した(正常:スコア0;尾弛緩:スコア1;後肢部分麻痺:スコア2;後肢麻痺:スコア3;前肢麻痺:スコア4;瀕死または死亡:スコア5)。複数の神経症状が認められる場合は高い値を評価日の神経症状スコアとして採用した。評価結果(平均値+標準誤差)を図6に示す。二重特異性分子である2C11xTKB58は実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の症状を緩和した。
実施例4: 二重特異性分子存在下でのマウスLAG3可溶性タンパク質のIIA1.6細胞への結合実験
　以下の通りにマウスLAG3可溶性タンパク質を得た。マウスLAG3のD1からD4(LAG3-EC)をコードするcDNA断片を、PCRにより増幅した。DYKDDDDK-タグ、TEV切断部位およびPA-タグを有する軟骨オリゴマー基質タンパク質(COMP)の五本鎖コイルドコイルドメインを、LAG3-ECのC末端に付加した。キメラcDNAを、pEBMulti-Neo (Wako)から改変した発現ベクターにクローニングした。Avalanche-Omni Transfection Reagent (EZ Biosystems)を使用してプラスミドをPlat-E細胞に導入し、培養上清を48時間後に回収した。
　マウスLAG3のリガンドであるpMHCIIを発現するIIA1.6細胞を、TKB58x2C11、2C11xTKB58、または完全体の抗マウスLAG3抗体であるTKB58抗体で処理した後、マウスLAG3可溶性タンパク質で染色した。結果を図7に示す。完全体のTKB58抗体はマウスLAG3可溶性タンパク質のIIA1.6細胞への結合を完全に阻害したが、TKB58x2C11および2C11xTKB58は阻害しなかった。
実施例5: LAG3およびCD8に結合する二重特異性分子TKB58xYTS169の作製
　抗マウスLAG3抗体(TKB58)および抗マウスCD8抗体(YTS169)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸を合成した後、PCRにて増幅し、pEBMulti-Neo (Wako)を改変して作製した発現プラスミドベクターにクローニングして、マウスLAG3およびマウスCD8を認識する二重特異性分子TKB58xYTS169(配列番号33)の発現プラスミドを作製した。発現プラスミドをAvalanche-Omni Transfection Reagent (EZ Biosystems) を用いてplatE細胞に導入し、48時間後に培養上清を回収した。培養上清を用いて、DO11.10、DO11.10-mLAG3、B3Z、およびB3Z-mLAG3細胞を染色した。
　結果を図8に示す。DO11.10細胞(マウスLAG3を発現しマウスCD8を発現しない)およびB3Z細胞(マウスCD8を発現しマウスLAG3を発現しない)への結合が確認されたことから、TKB58xYTS169がマウスCD8およびマウスLAG3に対する結合能を有していることが確認された。また、マウスCD8およびマウスLAG3を発現するB3Z-mLAG3細胞にはより強力に結合したことから、同一細胞上のマウスCD8とマウスLAG3に二重特異性分子TKB58xYTS169が結合していることが示唆された。一方、両分子を発現しないDO11.10細胞には結合が認められなかったことから、結合が両分子に特異的であることが確認された。
実施例6: 二重特異性分子TKB58xYTS169のT細胞の抗原特異的活性化に対する評価
　B3Z細胞はマウスMHCクラスI分子H-2Kbに提示されるOVA由来ペプチド(pOVA257-264、SIINFEKL)を認識し、抗原ペプチドの量に応じてIL-2を産生することが知られている。H-2Kbを発現するIIA1.6細胞にpOVA257-264をパルスしてB3Z細胞を刺激するとIL-2の産生が見られたが、マウスLAG3を発現させてもIL-2の産生を阻害しなかった(図9)。これは、IIA1.6細胞がLAG3のリガンドを発現していても、MHCIクラスI拘束性のB3Z細胞では、LAG3が抑制機能を発揮できないためである。TKB58xYTS169を添加すると、B3Z細胞がマウスLAG3を発現する場合にのみ、IL-2の産生が強く抑制された。これにより、TKB58xYTS169がLAG3発現細胞の抗原特異的な活性化を抑制することが明らかとなった。
実施例7: 抗マウスLAG3抗体TKB58のLAG3変異体への結合
実施例7-1: 抗マウスLAG3抗体TKB58のマウスLAG3認識領域
　マウスLAG3は細胞外領域に4個のIg様ドメイン(D1、D2、D3、D4)を有する。各Ig様ドメインをヒトの対応するIg様ドメインに置換したキメラ分子を作製し、DO11.10細胞に強制発現させた。簡単に述べると、各cDNAの断片をPCRにより増幅し、pFB-ires-Neo (Agilent)を改変したレトロウィルス発現プラスミドベクターにクローニングした。マウスおよびヒトLAG3のキメラcDNAをオーバーラップエクステンションPCRにより作製した。FuGENE HD (Promega) を用いてプラスミドをPlat-E細胞(D'MEM、高グルコース(Gibco)添加、20% (v/v) FBS、100 U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン含有)に導入した。ウィルスを含む上清を使用して標的細胞に遺伝子を導入した。感染細胞を、G418(Wako)、ピューロマイシン(Sigma-Aldrich)またはセルソーティングにより選択した。抗マウスLAG3抗体(TKB58)を用いて各細胞を染色し、フローサイトメトリーにて解析した。結果を図10に示す。TKB58は、マウスD1をヒトD1と置換したキメラ分子に結合しなかったことから、マウスLAG3のD1を認識することが明らかとなった。
実施例7-2: 抗マウスLAG3抗体TKB58の各種LAG3変異体に対する結合
　DO11.10 T細胞に野生型マウスLAG3、N54A/F55A変異体またはV61A/I62A変異体を強制発現させ、抗マウスLAG3抗体(TKB58)との結合をフローサイトメトリーにて評価した。結果を図11に示す。N54A/F55A変異体とV61A/I62A変異体は、TKB58との結合が減弱していた。
実施例7-3: LAG3変異体によるT細胞機能の抑制
　DO11.10 T細胞に野生型マウスLAG3、N54A/F55A変異体またはV61A/I62A変異体を強制発現させた。OVAペプチドをパルスしたIIA1.6細胞を用いて、DO11.10 T細胞を刺激し、培養上清中に分泌されたIL-2の濃度をELISAにて測定した。結果を図12に示す。マウスLAG3を発現させていないDO11.10-mock細胞と比較して、野生型マウスLAG3、N54A/F55A変異体またはV61A/I62A変異体を強制発現させたDO11.10 T細胞では、抗原刺激によるIL-2の産生が著しく減少しており、両変異体がLAG3の活性を保持していることが確認された。従って、TKB58のエピトープは、LAG3のTCR抑制機能に必須ではない領域を含むことが確認された。
実施例8: 抗マウスLAG3抗体TKB58のLAG3への結合親和性
　マウスLAG3可溶性タンパク質に対する抗マウスLAG3抗体(TKB58およびC9B7W)の結合親和性を、バイオレイヤー干渉法にて測定した。簡潔に述べると、マウスLAG3のD1からD4(LAG3-EC)をコードするcDNA断片を、PCRにより増幅した。strepタグをLAG3-ECのC末端に付加した。キメラcDNAを、pEBMulti-Neo (Wako)から改変した発現ベクターにクローニングした。Avalanche-Omni Transfection Reagent (EZ Biosystems)を使用してプラスミドをPlat-E細胞に導入し、培養上清を48時間後に回収した。単量体のマウスLAG3-EC(strepタグ付き)を、ストレプトアビジン被覆バイオセンサーチップ (Pall ForteBio) に固定し、様々な濃度の抗マウスLAG3 抗体の結合をBLItz (Pall ForteBio)でモニターした。チップをPBSで洗浄し、解離速度を分析した。結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)および解離定数(kD)をBLItz Proソフトウェアで算出した。結果を図13に示す。TKB58は、C9B7Wと比較して、kaが約26倍早く、kdが3.6倍遅かった。その結果、TKB58のKDはC9B7Wより94倍低く、4,395nMであった。
　本開示の二重特異性分子は、免疫抑制剤として、または、自己免疫疾患、アレルギー疾患もしくは移植片対宿主病の予防および/または治療に、有用である。

Claims (36)

  1. 　LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子を含む、免疫抑制剤。
  2. 　二重特異性分子が、LAG3とMHCクラスII分子との結合を許容する、請求項1に記載の免疫抑制剤。
  3. 　第1の結合部位が、LAG3のD1領域に含まれ、かつ、エキストラループ領域に含まれない部分に結合するものである、請求項1または2に記載の免疫抑制剤。
  4. 　第1の結合部位が、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギン、第55位のフェニルアラニン、第61位のバリンおよび／または第62位のイソロイシンに相当するアミノ酸を含む領域に結合するものである、請求項1～3のいずれかに記載の免疫抑制剤。
  5. 　第1の結合部位が抗LAG3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項1～4のいずれかに記載の免疫抑制剤。
  6. 　第1の結合部位が、
    配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
    配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
    　請求項5に記載の免疫抑制剤。
  7. 　第1の結合部位が、配列番号7のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項5または6に記載の免疫抑制剤。
  8. 　第1の結合部位が、LAG3との結合に対して
    (i)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
    配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
    (ii)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    を含む抗LAG3抗体と競合する、請求項1～5のいずれかに記載の免疫抑制剤。
  9. 　第2の結合部位がCD3に特異的に結合するものである、請求項1～8のいずれかに記載の免疫抑制剤。
  10. 　第2の結合部位が抗CD3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項9に記載の免疫抑制剤。
  11. 　第2の結合部位が、
    配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
    配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
    　請求項10に記載の免疫抑制剤。
  12. 　第2の結合部位が、配列番号15のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号16のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項10または11に記載の免疫抑制剤。
  13. 　第2の結合部位がCD8に特異的に結合するものである、請求項1～8のいずれかに記載の免疫抑制剤。
  14. 　第2の結合部位が抗CD8抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項13に記載の免疫抑制剤。
  15. 　第2の結合部位が、
    配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
    配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
    　請求項14に記載の免疫抑制剤。
  16. 　第2の結合部位が、配列番号23のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号24のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項14または15に記載の免疫抑制剤。
  17. 　自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植片対宿主病の予防および／または治療のための、請求項1～16のいずれかに記載の免疫抑制剤。
  18. 　自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植片対宿主病の予防および／または治療方法であって、請求項1～16のいずれかに記載の免疫抑制剤の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法。
  19. 　自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植片対宿主病の予防および／または治療における使用のための、請求項1～16のいずれかに記載の免疫抑制剤。
  20. 　自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植片対宿主病の予防および／または治療剤の製造のための、請求項１～１６のいずれかに記載の免疫抑制剤の使用。
  21. 　LAG3に特異的に結合する第1の結合部位およびCD3またはCD8に特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性分子。
  22. 　LAG3とMHCクラスII分子との結合を許容する、請求項21に記載の二重特異性分子。
  23. 　第1の結合部位が、LAG3のD1領域に含まれ、かつ、エキストラループに含まれない部分に結合するものである、請求項21または22に記載の二重特異性分子。
  24. 　第1の結合部位が、配列番号2のアミノ酸配列を有するマウスLAG3の第54位のアスパラギン、第55位のフェニルアラニン、第61位のバリンおよび／または第62位のイソロイシンに相当するアミノ酸を含む領域に結合するものである、請求項21～23のいずれかに記載の二重特異性分子。
  25. 　第1の結合部位が抗LAG3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項21～24のいずれかに記載の二重特異性分子。
  26. 　第1の結合部位が、
    配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
    配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
    　請求項25に記載の二重特異性分子。
  27. 　第1の結合部位が、配列番号7のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項25または26に記載の二重特異性分子。
  28. 　第1の結合部位が、LAG3との結合に対して
    (i)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
    配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
    (ii) 配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む
    二重特異性分子の第1の結合部位と競合する、請求項21～25のいずれかに記載の二重特異性分子。
  29. 　第2の結合部位がCD3に特異的に結合するものである、請求項21～28のいずれかに記載の二重特異性分子。
  30. 　第2の結合部位が抗CD3抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項29に記載の二重特異性分子。
  31. 　第2の結合部位が、
    配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
    配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
    　請求項30に記載の二重特異性分子。
  32. 　第2の結合部位が、配列番号15のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号16のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項30または31に記載の二重特異性分子。
  33. 　第2の結合部位がCD8に特異的に結合するものである、請求項21～28のいずれかに記載の二重特異性分子。
  34. 　第2の結合部位が抗CD8抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項33に記載の二重特異性分子。
  35. 　第2の結合部位が、
    配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域；および、
    配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、
    　請求項34に記載の二重特異性分子。
  36. 　第2の結合部位が、配列番号23のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、配列番号24のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項34または35に記載の二重特異性分子。
PCT/JP2020/022882 2019-06-11 2020-06-10 免疫抑制剤 WO2020250940A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/617,781 US20220227887A1 (en) 2019-06-11 2020-06-10 Immunosuppressant
JP2021526119A JPWO2020250940A1 (ja) 2019-06-11 2020-06-10
EP20822287.7A EP3984554A4 (en) 2019-06-11 2020-06-10 IMMUNOSUPPRESSION AGENT

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-108906 2019-06-11
JP2019108906 2019-06-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020250940A1 true WO2020250940A1 (ja) 2020-12-17

Family

ID=73781452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/022882 WO2020250940A1 (ja) 2019-06-11 2020-06-10 免疫抑制剤

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220227887A1 (ja)
EP (1) EP3984554A4 (ja)
JP (1) JPWO2020250940A1 (ja)
WO (1) WO2020250940A1 (ja)

Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4658019A (en) 1979-04-26 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells
JPH0159878B2 (ja) 1982-05-21 1989-12-20 Yunibaashitei Obu Karifuorunia
WO1993019196A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 British Technology Group Ltd. ANTI-CD3 AGLYCOSYLATED IgG ANTIBODY
JPH07505609A (ja) * 1991-11-08 1995-06-22 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ Ｃｄ８結合ドメイン・ペプチド
WO1997044362A1 (en) 1996-05-20 1997-11-27 Protein Design Labs, Inc. MUTATED NONACTIVATING IgG2 DOMAINS AND ANTI-CD3 ANTIBODIES INCORPORATING THE SAME
US6491916B1 (en) 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
WO2006113665A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
WO2008157379A2 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP2009539841A (ja) * 2006-06-06 2009-11-19 トラークス，インコーポレイテッド 自己免疫疾患の治療における抗ｃｄ３抗体の投与
JP2010115202A (ja) * 1995-07-10 2010-05-27 Inst Pasteur 細胞内および核内輸送に使用しうるイムノベクター
JP2011522835A (ja) 2008-06-06 2011-08-04 ベイラー リサーチ インスティテュート 抗ｃｄ８抗体は、細胞傷害性エフェクターのプライミングを遮断し、制御性ｃｄ８＋ｔ細胞の生成を導く
JP2013005798A (ja) * 2005-07-11 2013-01-10 Macrogenics Inc 毒性の低下した免疫抑制モノクローナル抗体を使用する自己免疫疾患の治療法
WO2014025828A1 (en) * 2012-08-06 2014-02-13 The Regents Of The University Of California Engineered antibody fragments for targeting and imaging cd8 expression in vivo
JP2014231515A (ja) * 2007-04-30 2014-12-11 イミュテップＩｍｍｕｔｅｐ 細胞傷害活性抗ｌａｇ−３モノクローナル抗体および臓器移植拒絶および自己免疫疾患の治療または予防における該抗体の使用方法
WO2015174439A1 (ja) 2014-05-13 2015-11-19 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子
WO2017004563A1 (en) * 2015-07-02 2017-01-05 Cidara Therapeutics, Inc. Multi-specific binding compounds
JP2017507936A (ja) * 2014-02-21 2017-03-23 アイビーシー ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド Ｔｒｏｐ−２発現細胞に対する免疫応答を誘発することによる疾患治療
JP2018501297A (ja) * 2014-11-04 2018-01-18 グレンマーク ファーマシューティカルズ， エセ．アー． Ｃｄ３／ｃｄ３８ ｔ細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン及びその製造方法
JP2018007668A (ja) * 2013-03-15 2018-01-18 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 抗ｌａｇ−３結合タンパク質
JP2018537400A (ja) * 2015-09-02 2018-12-20 イムテップ エス．アー．エス． 抗ｌａｇ−３抗体
JP2019108906A (ja) 2017-12-15 2019-07-04 日本ボデーパーツ工業株式会社 ナットキャップ

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018120842A1 (zh) * 2016-12-30 2018-07-05 上海欣百诺生物科技有限公司 一种双功能分子及其应用

Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4658019A (en) 1979-04-26 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
JPH0159878B2 (ja) 1982-05-21 1989-12-20 Yunibaashitei Obu Karifuorunia
JPH07505609A (ja) * 1991-11-08 1995-06-22 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ Ｃｄ８結合ドメイン・ペプチド
WO1993019196A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 British Technology Group Ltd. ANTI-CD3 AGLYCOSYLATED IgG ANTIBODY
US6491916B1 (en) 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
JP2010115202A (ja) * 1995-07-10 2010-05-27 Inst Pasteur 細胞内および核内輸送に使用しうるイムノベクター
WO1997044362A1 (en) 1996-05-20 1997-11-27 Protein Design Labs, Inc. MUTATED NONACTIVATING IgG2 DOMAINS AND ANTI-CD3 ANTIBODIES INCORPORATING THE SAME
WO2006113665A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP2013005798A (ja) * 2005-07-11 2013-01-10 Macrogenics Inc 毒性の低下した免疫抑制モノクローナル抗体を使用する自己免疫疾患の治療法
JP2009539841A (ja) * 2006-06-06 2009-11-19 トラークス，インコーポレイテッド 自己免疫疾患の治療における抗ｃｄ３抗体の投与
JP2014231515A (ja) * 2007-04-30 2014-12-11 イミュテップＩｍｍｕｔｅｐ 細胞傷害活性抗ｌａｇ−３モノクローナル抗体および臓器移植拒絶および自己免疫疾患の治療または予防における該抗体の使用方法
WO2008157379A2 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP2011522835A (ja) 2008-06-06 2011-08-04 ベイラー リサーチ インスティテュート 抗ｃｄ８抗体は、細胞傷害性エフェクターのプライミングを遮断し、制御性ｃｄ８＋ｔ細胞の生成を導く
WO2014025828A1 (en) * 2012-08-06 2014-02-13 The Regents Of The University Of California Engineered antibody fragments for targeting and imaging cd8 expression in vivo
JP2018007668A (ja) * 2013-03-15 2018-01-18 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 抗ｌａｇ−３結合タンパク質
JP2017507936A (ja) * 2014-02-21 2017-03-23 アイビーシー ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド Ｔｒｏｐ−２発現細胞に対する免疫応答を誘発することによる疾患治療
WO2015174439A1 (ja) 2014-05-13 2015-11-19 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子
JP2018501297A (ja) * 2014-11-04 2018-01-18 グレンマーク ファーマシューティカルズ， エセ．アー． Ｃｄ３／ｃｄ３８ ｔ細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン及びその製造方法
WO2017004563A1 (en) * 2015-07-02 2017-01-05 Cidara Therapeutics, Inc. Multi-specific binding compounds
JP2018537400A (ja) * 2015-09-02 2018-12-20 イムテップ エス．アー．エス． 抗ｌａｇ−３抗体
JP2019108906A (ja) 2017-12-15 2019-07-04 日本ボデーパーツ工業株式会社 ナットキャップ

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"GenBank", Database accession no. NP 001139345.1
ALMAGROFRANSSON, FRONT. BIOSCI., vol. 13, 2008, pages 1619 - 1633
BIOCHEMISTRY, vol. 31, no. 6, 1992, pages 1579 - 1584
CANCER RESEARCH, vol. 57, 1997, pages 4008 - 4014
CARTER ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 89, 1992, pages 4285
CHANCARTER, NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY VOL, 10 May 2010 (2010-05-10), pages 301
D. HOLMES, NATURE REV DRUG DISC, vol. 10, November 2011 (2011-11-01), pages 798
J. BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 269, 1994, pages 199 - 206
J. IMMUNOL. METH, vol. 231, 1999, pages 177 - 189
J. IMMUNOL. METH., vol. 231, 1999, pages 177 - 189
J. IMMUNOL., vol. 148, no. 5, 1992, pages 1547 - 1553
JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 157, 1996, pages 3727 - 3736
KABAT: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1987
KOHLER ET AL., NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
LONBERG, NAT. BIOTECH., vol. 23, 2005, pages 1117 - 1125
M ANGIN, BRIGNONE C., TRIEBEL F.: "IMP761, a novel anti-LAG-3 agonist antibody for the treatment of auto-immune diseases.", JOURNAL OF CROHN'S AND COLITIS, vol. 13, no. DOP07, March 2019 (2019-03-01), pages S031, XP055771610 *
NUNEZ-PRADO ET AL.: "The coming of Age of Engineered Multivalent Antibodies", DRUG DISCOVERY TODAY, vol. 20, no. 5, March 2015 (2015-03-01), pages 588 - 594, XP029576646, DOI: 10.1016/j.drudis.2015.02.013
ONUKI M ET AL., MICROSC RES TECH, vol. 52, 2001, pages 731 - 9
PNAS, vol. 94, no. 11, 1997, pages 5744 - 5749
PRESTA ET AL., J. IMMUNOL., vol. 151, 1993, pages 2623
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, no. 14, 1993, pages 6444 - 6448
SCIENCE, vol. 229, 1985, pages 81 - 83

Also Published As

Publication number Publication date
EP3984554A4 (en) 2023-11-08
JPWO2020250940A1 (ja) 2020-12-17
US20220227887A1 (en) 2022-07-21
EP3984554A1 (en) 2022-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102633423B1 (ko) 항-bcma 중쇄-단독 항체
JP7436603B2 (ja) レプチン受容体を活性化させる抗原結合タンパク質
TWI804572B (zh) 雙特異性抗體
US20170008960A1 (en) TCR Complex Immunotherapeutics
JP7476997B2 (ja) 二重特異性抗体
US10683358B2 (en) Human TNFRSF25 antibody
RU2770209C2 (ru) Терапевтические антитела против лиганда cd40
JP2022514187A (ja) ＩＶＩＧの代替のための多量体ハイブリッドＦｃ蛋白質
KR20200143718A (ko) 이식편 거부반응 예방에 사용하기 위한 항-cd40 항체
CN113660952B (zh) 双特异性抗体
EP1972640A1 (en) Apoptosis inducing antibodies
WO2020250940A1 (ja) 免疫抑制剤
JP6856183B1 (ja) 二重特異性抗体
WO2021025140A1 (ja) 二重特異性タンパク質
JP7457330B2 (ja) 免疫抑制剤
RU2781301C2 (ru) Анти-bcma антитела, содержащие только тяжёлую цепь
JP2022060182A (ja) 二重特異性抗体を有効成分として含む医薬組成物
TW202340259A (zh) 抗cd19藥劑之劑量方案及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20822287

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021526119

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020822287

Country of ref document: EP

Effective date: 20220111