JP2010530756A - 共有結合型ダイアボディおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ダイアボディ分子と、免疫疾患や癌を含む様々な疾患および障害の治療におけるその使用に関する。本発明のダイアボディ分子は、少なくとも2つのエピトープ結合部位(同一のまたは異なるエピトープを認識し得る)を形成するように結合している少なくとも2つのポリペプチド鎖を含むものである。さらに、エピトープは同一のまたは異なる分子に由来しても、同一のまたは異なる細胞上に位置してもよい。ダイアボディ分子の個々のポリペプチド鎖は、非ペプチド結合型共有結合を介して共有結合されており、例えば、各ポリペプチド鎖内に存在するシステイン残基のジスルフィド結合により共有結合されるが、これに限定されない。特定の実施形態において、本発明のダイアボディ分子は、該分子に抗体様機能性をもたせるFc領域をさらに含む。
共有結合型ダイアボディ(covalent diabody)の設計は一本鎖Fv構築物(scFv)に基づいている(非特許文献1、その全内容を参照することにより本明細書に組み入れる)。完全な非修飾型のIgGでは、VLおよびVHドメインが別々のポリペプチド鎖、すなわち、それぞれ軽鎖と重鎖に位置している。抗体軽鎖と抗体重鎖の相互作用、特にVLドメインとVHドメインの相互作用により、該抗体のエピトープ結合部位の1つが形成される。これに対して、scFv構築物では、抗体のVLおよびVHドメインが1本のポリペプチド鎖に含まれているが、これらのドメインは、機能性のエピトープ結合部位へとこれら2つのドメインが自己集合することを可能にする、十分な長さの柔軟性リンカーによって分離されている。リンカーの長さが不十分なため(約12アミノ酸残基より短いため)、これらのドメインが自己集合できない場合には、2つのscFv構築物が相互作用して二価の分子を形成する(一方の鎖のVLが他方の鎖のVHと結合する)(非特許文献2)。さらに、該構築物のC末端にシステイン残基を付加させると、ポリペプチド鎖同士のジスルフィド結合が可能となり、生じる二量体はその二価分子の結合特性の妨害なしに安定化することがわかっている(例えば、非特許文献3参照)。さらに、特異性が異なっているVLおよびVHドメインを選択する場合には、二価であるだけでなく、二重特異性を示す分子を構築することができる。
伝統的な免疫機能では、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、広範囲の応答をもたらし、その範囲はエフェクター機能(例えば、抗体依存性細胞傷害作用、肥満細胞脱顆粒、および食作用)から免疫調節シグナル(例えば、リンパ球増殖および抗体分泌の調節)にまで及ぶ。これらの相互作用はすべて、抗体または免疫複合体のFcドメインが造血細胞上の特殊な細胞表面受容体と結合することにより開始される。抗体と免疫複合体により開始される細胞応答の多様性は、Fc受容体の構造上の不均一性からもたらされる。Fc受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介すると思われる構造的に関連した抗原結合ドメインを共有する。
このファミリーの各メンバーは、免疫グロブリン関連ドメインのC2セットに関係する細胞外ドメイン、1回膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質内ドメインをもつ内在性膜糖タンパク質である。3種の公知のFcγRがあり、それぞれFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIII(CD16)と呼ばれる。3種の受容体は異なる遺伝子によりコードされる;しかし3種のファミリーメンバー間の広範な相同性は、これらが共通の祖先から、おそらくは遺伝子複製により生じたことを示唆する。
FcγRIIタンパク質は40KDaの内在性膜糖タンパク質であり、モノマーIgに対して低親和性(106M−1)であるため複合体化したIgGとだけ結合する。この受容体は、単球、マクロファージ、B細胞、NK細胞、好中球、肥満細胞、および血小板を含めて、すべての造血細胞上に存在する最も広く発現されているFcγRである。FcγRIIは、その免疫グロブリン結合鎖中に免疫グロブリン様領域を2つだけ有し、したがって、IgGに対してFcγRIより遥かに低い親和性を有する。3種のヒトFcγRII遺伝子(FcγRII−A、FcγRII−BおよびFcγRII−C)が存在し、それらはすべて凝集体または免疫複合体のIgGと結合する。
このクラスの不均一性のため、FcγRIIIのサイズはマウスおよびヒトで40〜80kDaの範囲に及ぶ。2つのヒト遺伝子が2種の転写産物をコードしており、すなわち、内在性膜糖タンパク質のFcγRIIIAと、グリコシルホスファチジル−イノシトール(GPI)結合型のFcγRIIIBとをコードする。1つのマウス遺伝子は膜貫通ヒトFcγRIIIAに相同性のFcγRIIIをコードしている。FcγRIIIは他の2つのFcγRのそれぞれと構造上の特徴を共有する。FcγRIIと同様に、FcγRIIIは低い親和性でIgGと結合し、対応する2つの細胞外Ig様ドメインを含む。FcγRIIIAはマクロファージ、肥満細胞で発現され、NK細胞では唯一のFcγRである。GPI結合型のFcγRIIIBは、目下、ヒト好中球でのみ発現されることが知られている。
活性化と抑制の両方のシグナルは、ライゲーション後にFcγRを介して伝達される。これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造上の相違からもたらされる。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の2つの異なるドメイン、すなわち、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ(ITAM)または免疫受容体チロシン系抑制モチーフ(ITIM)が、この異なる応答の原因となる。これらの構造体への異なる細胞質酵素の動員が、FcγR媒介細胞応答の結果を規定する。ITAM含有FcγR複合体にはFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIAが含まれるが、ITIM含有複合体にはFcγRIIBだけが含まれる。
本発明は、共有結合型ダイアボディおよび/または共有結合型ダイアボディ分子、ならびに癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患、および細菌、真菌もしくはウイルスが原因の感染症を含む各種の疾患および障害の治療におけるその使用に関する。好ましくは、本発明のダイアボディは2つの異なる細胞上の2つの異なるエピトープに結合することができ、ここにおいて、第1のエピトープは第2のエピトープとは異なる細胞型に発現されるものであり、その結果該ダイアボディはこれら2つの細胞を寄せ集めることができる。
特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語、表記法、その他の科学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解する意味を有するものとする。いくつかの場合には、通常理解される意味の用語であっても、明確さのためにおよび/または参考までに本明細書中で定義されるが、そうした定義を本明細書に含めても、当技術分野で一般的に理解されている意味に対する大きな相違を表すと必ずしも解釈されるべきでない。本発明の実施には、特に他で示さない限り、当業者が容易に想到し得る分子生物学(組換え法を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の分野の慣用技術を利用するものとする。そうした技術は文献に詳しく説明されており、例えば、Current Protocols in Immunology (J. E. Coliganら編、1999、2001年の増刊を含む); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubelら編、1987、2001年の増刊を含む); Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版 (Sambrook and Russel、2001年); PCR: The Polymerase Chain Reaction、(Mullisら編、1994年); The Immunoassay Handbook (D. Wild編、Stockton Press NY、1994年); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson編、Academic Press、1996年); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff、W. H. Albert、およびN. A. Staines編、Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH、1993年)、Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1999年、ならびにBeaucageら編、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons、Inc.、New York、2000年)を参照されたい。
ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖は、VLドメインおよびVHドメインを含む。それらは、ドメインの自己集合が起こらないように共有結合によって連結されている。2つのポリペプチド鎖の相互作用により2つのVL−VH対合が生じ、2つのエピトープ結合部位、すなわち二価の分子を形成する。VHまたはVLドメインは、ポリペプチド鎖内のどの位置にも拘束されず、つまり、アミノ(N)末端またはカルボキシ(C)末端に制限されることはない。また前記ドメインは、互いの相対的位置に制限されることもなく、つまり、VLドメインがVHドメインに対してN末端側にあってもよいし、その逆であってもよい。唯一の制限は、機能的なダイアボディを形成するために、相補的なポリペプチド鎖が利用可能であるということである。VLおよびVHドメインが同一抗体に由来する場合、二本の相補的ポリペプチド鎖は、同一であってもよい。例えば、結合ドメインがエピトープAに特異的な抗体に由来する場合(すなわち、結合ドメインがVLA−VHA相互作用から形成される場合)、各ポリペプチドはVHAおよびVLAを含むことができる。抗体の2つのポリペプチド鎖のホモ二量体化は、2つのVLA−VHA結合部位の形成をもたらし、結果的に二価の単一特異性抗体が生じる。VLおよびVHドメインが異なる抗原に対して特異的な抗体に由来する場合、機能的な二重特異性ダイアボディの形成には、異なる二本のポリペプチド鎖の相互作用、すなわちヘテロ二量体の形成が必要となる。例えば、二重特異性ダイアボディの場合、1本のポリペプチド鎖はVLAおよびVLBから構成される。前記鎖のホモ二量体化は、結果的に、結合なしのまたは予測できない結合の、2つのVLA−VHB結合部位の形成をもたらし得る。これに対して、2つの異なるポリペプチド鎖が、例えば組換え発現系において自由に相互作用できる場合、一方はVLAおよびVHBから、他方はVLBおよびVHAからなり、2つの異なる結合部位、すなわちVLA−VHAおよびVLB−VHBを形成することができる。すべてのダイアボディポリペプチド鎖の対に関して、2つの鎖のアライメントミスまたは結合ミス、すなわちVL−VLまたはVH−VHドメインの相互作用の可能性があり得る。しかし、機能的なダイアボディの精製は、適切に二量体化した結合部位の免疫特異性に基づいて、当該分野で公知のまたは本明細書で例示した、例えばアフィニティークロマトグラフィーといった親和性を基礎とする方法を用いることで、容易に行うことができる。
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディ分子は、特定の細胞型を標的とするための無比の機会を提供する。例えば、二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子を、遺伝子操作して標的細胞型または標的組織型に特異な抗原のセットを認識するエピトープ結合部位の組合せを含むようにすることができる。さらに、個々の抗原の一方または両方が、他の組織および/または細胞型において別個にかなり一般的なものである場合、低親和性結合ドメインを用いて、ダイアボディまたはダイアボディ分子を構築することができる。このような低親和性結合ドメインは、治療目的のために十分な結合力でもって個々のエピトープまたは抗原に結合できないであろう。しかし、エピトープまたは抗原の両方が、単一標的細胞または組織上に存在する場合、その細胞もしくは組織に対するダイアボディまたはダイアボディ分子の結合力は、抗原1つだけを発現している細胞もしくは組織のそれと比べれば増加するであろう。このように前記細胞もしくは組織は、本発明によって効率的に標的化されるであろう。前記二重特異性分子は、たった1つの抗原に対する特異性をもつ単一特異性ダイアボディまたは抗体と比べると、前記両方の抗原を発現している細胞上の一方のまたは双方の標的抗原に対して強化された結合性を示し得る。
本発明のダイアボディは、一般に免疫グロブリンまたは抗体に由来する抗原結合ドメインを含む。本発明の方法に使用する結合ドメインが由来する抗体は、鳥および動物(例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ)を含むいずれの動物起源からのものであってもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。本明細書で用いる場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーもしくは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリーから、またはヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスから、単離された抗体を含む。
具体的な実施形態において、本発明のダイアボディの少なくとも1つの結合ドメインは、FcγRIIBの少なくとも1つの活性にアゴナイズする。本発明の一の実施形態で、前記活性は、B細胞受容体を介したシグナル伝達を阻害することである。他の実施形態において、結合ドメインはB細胞の活性化、B細胞の増殖、抗体産生、B細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期の進行、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における1以上の下流のシグナル伝達分子の活性を阻害する。さらなる他の実施形態で、結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸化またはSHIPの動員を増強する。本発明のさらなる実施形態で、結合ドメインはB細胞受容体を介したシグナル伝達経路でのMAPキナーゼ活性またはAkt動員を阻害する。他の実施形態において、結合ドメインは、FcεRIシグナル伝達のFcγRIIBを介した阻害にアゴナイズする。具体的な実施形態では、前記結合ドメインは、FcεRI誘導されたマスト細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を阻害する。他の実施形態で、本発明の結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸化を刺激し、SHIPの動員を刺激し、SHIPのリン酸化およびSHIPとShcとの結合を刺激し、またはMAPキナーゼファミリーメンバー(例えばErk1、Erk2、JNK、p38等)の活性化を阻害する。さらなる他の実施形態で、本発明の結合ドメインは、p62dokのチロシンリン酸化、ならびにそれとSHIPおよびrasGAPとの結合を増強する。他の実施形態で、本発明の結合ドメインは、単球またはマクロファージでのFcγRを介した食作用を阻害する。
以下のセクションでは、CD16A結合タンパク質について論ずる。このタンパク質は、共有結合型ダイアボディの作製のための軽鎖および重鎖の可変領域のソースとして使用することができる。本発明では、CD16A結合タンパク質は、抗CD16A抗体のVLおよびVHドメインからなる分子を含む。このVLおよびVHドメインを、本発明のダイアボディの作製に使用する。
本発明の実施に際して使用することができるCD16A結合タンパク質は、マウスモノクローナル抗体3G8のCDRに由来する(すなわち同一もしくは類似の配列を有している)CDR配列を含むタンパク質を包含する。マウス3G8モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする相補的cDNA(CDRをコードする配列を含む)を、記載したようにクローン化して配列決定した。3G8の核酸配列およびタンパク質配列を以下に示す。マウス可変領域およびCDR配列を用いて、3G8のCDRに由来する相補性決定領域を含む数多くのキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を作製し、それらの特性を解析した。CD16Aに高親和性で結合し、さらに他の所望の性質を有するヒト化抗体を同定するために、3G8由来のCDRを有するVH領域を含む抗体重鎖を作製し、3G8由来のCDRを有するVL領域を含む抗体軽鎖と(共発現により)結合させて、解析用の四量体抗体を作製した。得られた四量体抗体の性質を以下に記載のように測定した。以下で説明するように、3G8のCDRを含むCD16A結合タンパク質、例えば、本明細書に記載したヒト化抗体タンパク質を本発明に従って使用することができる。
一態様において、本発明のCD16A結合タンパク質は、少なくとも1つのCDR(通常は3つのCDR)がマウスモノクローナル抗体3G8重鎖の1つのCDR(一般的には3つすべてのCDR)の配列を有し、該結合タンパク質の残りの部分が実質的にヒトの配列を有する(ヒト抗体の重鎖可変領域に由来し、実質的にそれに類似する)、重鎖可変ドメインを含むことができる。
好ましい結合特性を有する軽鎖可変ドメイン配列を同定するために同様の研究を行った。一の態様において、本発明は、以下のような軽鎖可変ドメインを含むCD16A結合タンパク質を提供する。このドメインでは、少なくとも1つのCDR(通常は3つのCDR)が、マウスモノクローナル抗体3G8軽鎖の1つのCDR(通常は3つすべてのCDR)の配列を有し、該結合タンパク質の残りの部分は実質的にヒトの配列を有する(ヒト抗体の軽鎖可変領域に由来し、実質的にそれに類似する)。
当該分野では公知であり、また本明細書の他の箇所でも記載したように、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それらの鎖が結合してダイアボディを産生する条件下で、組換え技術によって発現させることができ、またin vitroでそのように組み合わせることができる。したがって、本明細書で記載した3G8由来のVLドメインを本明細書に記載した3G8由来のVHドメインと組み合わせて、CD16A結合性ダイアボディを作製することができ、そのような組合せのすべてが意図されていることがわかるであろう。
本発明は、Fcドメインまたはその一部(例えば、CH2もしくはCH3ドメイン)を含むダイアボディ分子を包含する。いくつかの実施形態で、Fcドメインまたはその一部は、IgG2、IgG3またはIgG4のFc領域(例えばCH2もしくはCH3)の1以上の定常ドメインを含む。他の実施形態で、本発明は、Fcドメインまたはその一部を含む分子を包含し、ここで、前記Fcドメインまたはその一部は、匹敵する野生型Fcドメインまたはその一部に対して少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、置換)を含んでいる。変異型Fcドメインは当該分野ではよく知られており、前記変異型Fcドメインを含む抗体の表現型(当該分野で周知の結合活性解析法またはエフェクター機能解析法のいずれか、例えばELISA、SPR解析もしくはADCC等でアッセイされる)を変えるのに主として用いられる。このような変異型Fcドメインまたはその一部は、Fcドメイン(またはその一部)を含む本発明のダイアボディ分子によって示されるエフェクター機能(例えばNK依存的もしくはマクロファージ依存的アッセイ等で機能的にアッセイされる)を付与するまたは改変することにより、本発明において使用される。エフェクター機能を改変すると同定されたFcドメイン変異体は、国際公開WO 04/063351号、米国特許出願公開第2005/0037000号および同第2005/0064514号、2004年11月10日に出願された米国仮出願第60/626,510号、2004年12月15日に出願された同第60/636,663号および2006年3月10日に出願された同第60/781,564号、ならびに本発明者の同時出願である2005年11月10日に出願された米国特許出願第11/271,140号および2005年12月15日に出願された同第11/305,787号中に開示されている。これらはいずれも参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる。
本発明のダイアボディ分子を、異種ポリペプチド(すなわち、関連性のないポリペプチド、またはその一部、好ましくはそのポリペプチドの少なくとも10アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも40アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも60アミノ酸、少なくとも70アミノ酸、少なくとも80アミノ酸、少なくとも90アミノ酸もしくは少なくとも100アミノ酸)と、組換えによって融合させて、または化学的に結合(共有結合、非共有結合の両方を含む)させて、融合タンパク質を作製することができる。融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
本発明のダイアボディ分子は、各種方法で性状解析することができる。特に、本発明の分子は、例えばFcRIIIAもしくはFcRIIB等の抗原と免疫特異的に結合する能力について、または当該分子がFcドメイン(もしくはその一部)を含む場合には、Fc−FcγR相互作用(すなわち、Fcドメイン(もしくはその一部)のFcγRへの特異的結合)を示す能力について、アッセイすることができる。前記アッセイは、溶液中で(例えば、Houghten、(1992年)「The Use Of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries For The Identification Of Bioactive Peptides」、Bio/Techniques、13巻、412〜421頁、1992年)、ビーズ上で(Lam (1991年)「A New Type Of Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand−Binding Activity」、Nature、354巻、82〜84頁、1991年)、チップ上で(Fodor (1993年)「Multiplexed Biochemical Assays With Biological Chips」、Nature、364巻、555〜556頁)、細菌上で(米国特許第5,223,409号)、胞子上で(米国特許第5,571,698号、第5,403,484号および第5,223,409号)、プラスミド上で(Cullら、(1992年)「Screening For Receptor Ligands Using Large Libraries Of Peptides Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、1865〜1869頁)、またはファージ上で(Scottら、(1990年)「Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library」、Science、249巻、386〜390頁、Devlin (1990年)「Random Peptide Libraries: A Source Of Specific Protein Binding Molecules」、Science、249巻、404〜406頁、Cwirlaら、(1990年)「Peptides On Phage: A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87巻、6378〜6382頁、およびFelici (1991年)「Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector」、J. Mol. Biol.、222巻、301〜310頁)(これらの文献は、参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる)実施することができる。抗原に免疫特異的に結合することが同定されている分子、例えばFcγRIIIAは、その後、抗原に対する特異性および親和性についてアッセイすることができる。
Fcドメイン(もしくはその一部)を含む、および/またはFcγRに特異的なエピトープ結合ドメインを含む分子によるFcγRへの結合の特徴付けは、限定はしないがFcγRの多型変異体を含めて、いずれのFcγRを使用しても行うことができる。いくつかの実施形態では、158位にフェニルアラニンを含むFcγRIIIAの多型変異体が使用される。他の実施形態では、158位にバリンを含むFcγRIIIAの多型変異体を用いて特徴付けが行われる。FcγRIIIA 158Vは、IgG1に対して158Fよりも高い親和性、およびADCC活性の増加を示す(例えば、Koeneら、(1997年)「Fc gammaRIIIa−158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgG By Natural Killer Cell Fc gammaRIIIa, Independently Of The Fc gammaRIIIa−48L/R/H Phenotype」、Blood、90巻、1109〜14頁、Wuら、(1997年)「A Novel Polymorphism Of FcgammaRIIIa (CD16) Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease」、J. Clin. Invest. 100巻、1059〜70頁、いずれも参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる)。この残基は、実際IgG1の下部ヒンジ領域と直接相互作用するが、このことはIgG1−FcγRIIIAの共結晶化研究によって最近明らかにされた(例えば、Sondermanら、(2000年)「The 3.2−A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment−Fc gammaRIII complex」、Nature、406巻(6793号)、267〜273頁を参照されたい。この文献は参照としてそのすべてが本明細書中に援用される)。研究により、いくつかのケースにおいて、治療用抗体はFcγRIIIA−158Vホモ接合患者で向上した効果を有することが明らかとなった。例えば、ヒト化抗CD20モノクローナル抗体リツキシマブ(Rituximab)は、FcγRIIIA−158Fホモ接合患者と比べてFcγRIIIA−158Vホモ接合患者で、より治療効果があった(例えば、Cartronら、(2002年)「Therapeutic Activity Of Humanized Anti−CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIA Gene」、Blood、99巻(3号)、754〜758頁)を参照されたい)。他の実施形態で、この領域を含む治療用分子はまた、FcγRIIIA−158VおよびFcγRIIIA−158Fに関してヘテロ接合の患者において、ならびにFcγRIIIA−131Hをもつ患者でも、効果的であり得る。特定の作用機序に縛られるつもりはないが、別のアロタイプを用いた本発明の分子の選択は、ひとたび治療用ダイアボディに作製されたら、そのようなアロタイプについてホモ接合性の患者に対して臨床的により効果があると思われる変異体を提供することができる。
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインと、場合によりFcドメイン(またはその一部)とを含む本発明の分子を、該分子のエフェクター細胞機能を同定するための当業者に知られたアッセイを使用して、特徴づけることを包含する。特に、本発明は、本発明の分子を、FcγR介在エフェクター細胞機能について特徴づけることを包含する。さらに、本発明のダイアボディ分子の標的抗原の少なくとも1つがFcγRである場合、ダイアボディ分子によるFcγRの結合は、FcγR−Fc結合により活性化される経路と類似したFcγR介在経路を活性化するのに役立ち得る。こうして、ダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合ドメインがFcγRを認識する場合には、ダイアボディ分子は、Fcドメイン(またはその一部)を含むことなく、または付随するFc−FcγR結合なしに、FcγR介在エフェクター細胞機能を誘発することができる。本発明に従ってアッセイすることができるエフェクター細胞機能の例として、限定するわけではないが、以下が含まれる:抗体依存性細胞傷害、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、Clq結合、および補体依存性細胞傷害。エフェクター細胞機能活性を判定するために、当業者に知られた細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイはいずれも使用することができる(エフェクター細胞アッセイについては、以下を参照:Perussiaら、(2000年)「Assays For Antibody−Dependent Cell−Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells」、Methods Mol. Biol.、121巻、179〜92頁、Baggioliniら、(1988年)「Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity」、Experientia、44巻(10号)、841〜848頁、Lehmannら、(2000年)「Phagocytosis: Measurement By Flow Cytometry」、J. Immunol. Methods、243巻(1〜2号)、229〜42頁、Brown (1994年)「In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction」、Methods Cell Biol.、45巻、147〜64頁、Munnら、(1990年)「Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony−Stimulating Factor」、J. Exp. Med.、172巻、231〜237頁、Abdul−Majidら、(2002年)「Fc Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central Nervous System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis」、Scand. J. Immunol.、55巻、70〜81頁、Dingら、(1998年)「Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA−A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids」、Immunity 8巻、403〜411頁(それぞれの全内容を参照として本明細書中に組み入れる))。
複数のエピトープ結合ドメイン、および場合によりFcドメイン、を含む本発明の分子は、抗原結合ドメインまたはFc−FcγR結合の速度論的パラメーターを特徴付けるための、当技術分野で知られた表面プラズモン共鳴(SPR)に基づくアッセイのいずれかを使用してアッセイすることができる。限定するわけではないが以下を含む市販のSPR装置のいずれかを本発明で使用することができる:Biacore AB製のBIAcore装置(Uppsala、Sweden);Affinity Sensors製のIAsys装置(Franklin、MA.);Windsor Scientific Limited製のIBISシステム(Berks、UK);日本レーザ電子製のSPR−CELLIAシステム(北海道、日本);およびTexas Instruments社製のSPR Detector Spreeta(Dallas、TX)。SPRに基づく技法の概説については、以下を参照されたい:Mulletら、(2000年)「Surface Plasmon Resonance−Based Immunoassays」、Methods 22巻、77〜91頁、Dongら、(2002年)「Some new aspects in biosensors」、Reviews in Mol. Biotech.、82巻、303〜23頁、Fivashら、(1998年)「BIAcore For Macromolecular Interaction」、Current Opinion in Biotechnology 9巻、97〜101頁、Richら、(2000年)「Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis」、Current Opinion in Biotechnology 11巻、54〜61頁(その全体を参照として本明細書中に組み入れる)。さらに、そのすべてが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,373,577号、同第6,289,286号、同第5,322,798号、同第5,341,215号、同第6,268,125号で説明されるタンパク質間相互作用を測定する任意のSPR測定器およびSPRに基づく方法が、本発明の方法において意図される。
本発明のダイアボディ分子は、当技術分野で周知の各種方法により製造することができ、de novoタンパク質合成、結合タンパク質をコードする核酸の組換え発現といった方法がある。所望の核酸配列は組換え法(例えば、所望のポリヌクレオチドの以前に作製された変異体のPCR突然変異誘発)により、または固相DNA合成により得ることができる。通常は組換え発現が用いられる。ある態様において、本発明はCD16A VHおよび/またはVLをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本発明はCD32B VHおよび/またはVLをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝子コードの縮重のため、それぞれの免疫グロブリンアミノ酸配列を種々の核酸配列がコードしており、本発明はここに記載する結合タンパク質をコードするあらゆる核酸を包含する。
本発明は、本発明の分子(ポリペプチドおよび抗体を含む)をコードするポリヌクレオチドをも含む。当技術分野で知られたいずれかの方法により、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。
本発明の分子(すなわち、抗体)をコードする核酸配列が得られた時点で、該分子を産生するためのベクターを、組換えDNA技術により当技術分野で周知の技術を用いて作製することができる。当業者に周知の方法を利用して、本発明の分子のコード配列および適当な転写・翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝的組換えが挙げられる(例えば、Sambrookら、1990年、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、およびAusubelら編、1998年、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NYに記載される技術を参照されたい)。
本発明の分子は、FcγRにより仲介されるエフェクター細胞機能(例えば、ADCC)が望まれる疾患、障害または感染(例えば、癌、感染性疾患)を治療および/または予防するのに特に有用である。以下で述べるように、本発明のダイアボディは、Fcドメインを含まないにもかかわらず、エフェクター機能を引き出すのに抗体に似た機能性を示し得る。FcγRを免疫特異的に認識する少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含むことにより、ダイアボディ分子はFc−FcγR相互作用に類似したFcγR結合および活性を示すことができる。例えば、本発明の分子は免疫エフェクター細胞(例えば、NK細胞)上の細胞表面抗原とFcγR(例えば、FcγRIIIA)と結合して、該細胞に対してエフェクター機能(例えば、ADCC、CDC、食作用、オプソニン化など)を刺激する。
本発明は、被験者に治療上有効な量の、複数のエピトープ結合ドメインを含む1種以上の分子を投与することを含む、被験者の癌を治療または予防するための方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、FcγR多型を有する被験者(例えば、FcγRIIIA−158VまたはFcγRIIIA−158F対立遺伝子についてホモ接合性の被験者)の癌を治療または予防するための方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、FcγRIIIA(158F)と免疫特異的に結合する、ダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを工学的に操作することを包含する。他の実施形態では、本発明は、FcγRIIIA(158V)と免疫特異的に結合する、ダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを工学的に操作することを包含する。
胞中のYハプテンであるLeY、TL5(血液型A)、A431細胞中のEGF受容体、膵癌中のElシリーズ(血液型B)、胚性癌細胞中のFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中のCO−514(血液型Lea)、腺癌中のNS−10、CO−43(血液型Leb)、G49、EGF受容体、結腸腺癌中のMH2(血液型ALeb/Ley)、結腸癌、胃癌ムチン中の19.9、骨髄細胞中のT5A7、黒色腫中のR24、胚性癌細胞中の4.2、GD3、Dl.1、OFA−1、GM2、OFA−2、GD2、およびMl:22:25:8、ならびに4〜8細胞胚中のSSEA−3およびSSEA−4。別の実施形態では、抗原は皮膚T細胞リンパ腫からのT細胞受容体由来ペプチドである(Edelson、(1998年)「Cutaneous T−Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy」、Cancer J Sci Am.、4巻、62〜71頁)。
いくつかの実施形態において、本発明の分子は、本発明の方法に従って操作された、FcγRIIBに特異的なエピトープ結合ドメインおよび/または変異型Fcドメイン(またはその一部)を含み、該Fcドメインが野生型Fcドメインと比べてより大きなFcγRIIBに対する親和性、および低下したFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を示す。そのような結合特性を有する本発明の分子は、免疫応答の調節、例えば自己免疫疾患または炎症性疾患に関連する免疫応答の抑制、において有用である。いずれの作用機構にも拘束されることを意図しないが、FcγRIIBに対する親和性を有する、および/または増大したFcγRIIBに対する親和性と低下したFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を有するFcドメインを含む、本発明の分子は、FcγRに対する活性化応答を弱め、かつ細胞応答性の抑制をもたらし、したがって自己免疫疾患の治療および/または予防において治療効力を有すると考えられる。
本発明はまた、被験者における感染症の治療または予防の方法を包含し、該方法は、感染症と関連した感染性病原体に特異的な少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含む、1種以上の本発明の分子の治療上または予防上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態において、本発明の分子は感染性病原体に対して毒性であり、該分子の不在下での免疫応答と比べて、該病原体に対する免疫応答を増強するか、または該病原体に対するエフェクター機能を増強する。本発明の分子によって治療または予防し得る感染症は、限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原虫、およびウイルスを含む感染性病原体により引き起こされる。
本発明はまた、毒素(例えば、毒性の薬物分子)に曝された被験者の解毒方法を包含し、該方法は、毒性の薬物分子に特異的な少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含む1種以上の本発明の分子の治療上または予防上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態において、本発明の分子の毒素への結合は該毒素の有害な生理学的作用を軽減または排除する。さらに他の実施形態では、本発明のダイアボディの毒素への結合は、該ダイアボディの不在下での毒素の除去、分解もしくは中和と比べて、毒素の除去、分解もしくは中和を増大または増強する。本発明の方法に従う免疫毒素療法は、ジゴキシン、PCP、コカイン、コルヒチン、三環式抗うつ薬を含むがこれらに限らない薬物の過剰投与または該薬物への曝露を治療するために使用することができる。
本発明はさらに、限定するわけではないが、現行の標準的および実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法または外科手術を含む、癌、自己免疫疾患、感染症、または中毒の治療または予防について当業者に知られたその他の療法と併用して、本発明の分子を投与することを包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子を、治療上または予防上有効な量の1種以上の薬剤、治療用抗体、または癌、自己免疫疾患、感染症、もしくは中毒の治療および/または予防について当業者に知られた他の薬剤と併用して、投与することができる。
特定の実施形態では、本発明の方法は、1以上の本発明の分子を、癌の治療および/または予防のために使用される1以上の治療薬とともに投与することを包含する。1つの実施形態では、血管新生阻害薬を本発明の分子と併用して投与することができる。本発明の方法および組成物中で使用することができる血管新生阻害薬としては、限定するわけではないが以下が含まれる:アンギオスタチン(Angiostatin)(プラスミノーゲン断片);抗血管新生抗トロンビンIII;アンギオザイム(Angiozyme);ABT−627;Bay 12−9566;ベネフィン(Benefin);ベバシズマブ(Bevacizumab);BMS− 275291;軟骨由来阻害薬(CDI);CAI;CD59 補体断片;CEP−7055;Col 3;コンブレタスタチン(Combretastatin)A−4;エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片);フィブロネクチン断片;Gro−β;ハロフギノン(Halofuginone);ヘパリナーゼ類;ヘパリンヘキササッカライド断片;HMV833;ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG);IM−862;インターフェロンα/β/γ;インターフェロン誘導性タンパク質(IP−10);インターロイキン−12;クリングル(Kringle)5(プラスミノーゲン断片);マリマスタット(Marimastat);メタロプロテイナーゼ阻害薬(TIMPs);2−メトキシエストラジオール;MMI 270(CGS 27023A);MoAb IMC−1C11;ネオバスタット(Neovastat);NM−3;パンゼム(Panzem);PI−88;胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;血小板因子−4(PF4);プリノマスタット(Prinomastat);プロラクチン16kDa断片;プロリフェリン(Proliferin)関連タンパク質(PRP);PTK787/ZK 222594;レチノイド;ソリマスタット(Solimastat);スクアラミン(Squalamine);SS 3304;SU 5416;SU6668;SU11248;テトラヒドロコルチゾール−S;テトラチオモリブダート;サリドマイド;トロンボスポンジン−1(TSP−1);TNP−470;トランスフォーミング増殖因子β(TGF−b);バスキュロスタチン(Vasculostatin);バソスタチン(Vasostatin)(カルレチキュリン断片);ZD6126;ZD 6474;ファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬(FTI);およびビスホスホナート類。
スナフィド(bisnafide);ビストラテン(bistratene)A;ビゼレシン(bizelesin);ブレフラート(breflate);ブロピリミン(bropirimine);ブドチタン(budotitane);ブチオニンスルホキシイミン(buthionine sulfoximine);カルシポトリオル(calcipotriol);カルホスチン(calphostin)C;カンプトテシン(camptothecin)誘導体;カナリポクス(canarypox)IL−2;カペシタビン(capecitabine);カルボキサミド−アミノ−トリアゾール;カルボキシアミドトリアゾール;CaRest M3;CARN 700;軟骨由来阻害薬;カルゼレシン(carzelesin);カゼインキナーゼ阻害薬(ICOS);カスタノスペルミン(castanospermine);セクロピン(cecropin)B;セトロレリクス(cetrorelix);クロルン(chlorlns);クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト(cicaprost);cisポルフィリン;クラドリビン(cladribine);クロミフェン(clomifene)類似体;クロトリマゾール(clotrimazole);コリスマイシン(collismycin)A;コリスマイシンB;コンブレタスタチン(combretastatin)A4;コンブレタスタチン類似体;コナゲニン(conagenin);クランベシジン(crambescidin)816;クリスナトル(crisnatol);クリプトフィシン(cryptophycin)8;クリプトフィシンA誘導体;キュラシン(curacin)A;シクロペンタアントラキノン類;シクロプラタム(cycloplatam);シペマイシン(cypemycin);シタラビンオクホスファート(cytarabineocfosfate);細胞溶解因子;シトスタチン(cytostatin);ダクリキシマブ(dacliximab);デシタビン(decitabine);デヒドロジデムニン(dehydrodidemnin)B;デスロレリン(deslorelin);デキサメタゾン(dexamethasone);デキシホスファミド(dexifosfamide);デクスラゾキサン(dexrazoxane);デクスベラパミル(dexverapamil);ジアジクオン(diaziquone);ジデミン(didemnin)B ;ジドクス(didox);ジエチルノルスペニン(diethylnorspennine);ジヒドロ−5−アザシチジン;ジヒドロタキソール,9− ;ジオキサマイシン(dioxamycin);ジフェニルスピロムスチン(diphenyl spiromustine);ドセタキセル(docetaxel);ドコサノル(docosanol);ドラセトロン(dolasetron);ドキシフルリジン(doxifluridine);ドロロキシフェン(droloxifene);ドロナビノル(dronabinol);ジュオカルマイシン(duocarmycin)SA;エブセレン(ebselen);エコムスチン(ecomustine);エデルフォシン(edelfosine);エドレコロマブ(edrecolomab);エフロルニチン(eflornithine);エレメン(elemene);エミテフル(emitefur);エピルビシン(epirubicin);エプリステリド(epristeride);エストラムスチン(estramustine)類似体;エストロゲン作動薬;エストロゲン拮抗薬;エタニダゾール(etanidazole);リン酸エトポシド(etoposide);エキセメスタン(exemestane);ファドロゾール(fadrozole);ファザラビン(fazarabine);フェンレチニド(fenretinide);フィルグラスチム(filgrastim);フィナステリド(finasteride);フラボピリドル(flavopiridol);フレゼラスチン(flezelastine);フルアステロン(fluasterone);フルダラビン(fludarabine) ;塩酸フルロダウノルニシン(fluorodaunorunicin);ホルフェニメクス(forfenimex);ホルメスタン(formestane);ホストリエシン(fostriecin);ホテムスチン(fotemustine);テキサフィリンガドリニウム(gadolinium texaphyrin);硝酸ガリウム;ガロシタビン(galocitabine);ガニレリクス(ganirelix);ゲラチナーゼ阻害薬;ゲムシタビン(gemcitabine);グルタチオン阻害薬;ヘプスルファム(hepsulfam);ヘレグリン(heregulin);ヘキサメチレンビスアセトアミド;ハイペリシン(hypericin);イバンドロン酸;イダルビシン(idarubicin);イドキシフェン(idoxifene);イドラマントン(idramantone);イルモフォシン(ilmofosine);イロマスタット(ilomastat);イミダゾアクリドン類;イミキモド(imiquimod);免疫刺激ペプチド類;インスリン様成長因子−1受容体阻害薬;インターフェロン作動薬;インターフェロン類;インターロイキン類;イオベングアン(iobenguane);ヨードドキソルビシン(iododoxorubicin);イポメアノル(ipomeanol),4−;イロプラクト(iroplact);イルソグラジン(irsogladine);イソベンガゾール(isobengazole);イソホモハリコンドリン(isohomohalicondrin)B;イタセトロン(itasetron);ジャスプラキノリド(jasplakinolide);カハラリド(kahalalide)F;3酢酸ラメラリン(lamellarin)−N;ランレオチド(lanreotide);レイナマイシン(leinamycin);レノグラスチム(lenograstim);硫酸レンチナン(lentinan);レプトルスタチン(leptolstatin);レトロゾール(letrozole);白血病抑制因子;白血球αインターフェロン;ロイプロリド+エストロゲン+プロゲステロン;ロイプロレリン(leuprorelin);レバミソール(levamisole);リアロゾール(liarozole);線状ポリアミン類似体;親油性ジサッカライドペプチド;親油性白金化合物;リソクリナミド(lissoclinamide)7;ロバプラチン(lobaplatin);ロンブリシン(lombricine);ロメトレキソル(lometrexol);ロニダミン(lonidamine);ロソキサントロン(losoxantrone);ロバスタチン(lovastatin);ロキソリビン(loxoribine);ルルトテカン(lurtotecan);テキサフィリンルテチウム(lutetium texaphyrin);リソフィリン(lysofylline) ;溶解性ペプチド類;マイタンシン(maitansine);マンノスタチン(mannostatin)A;マリマスタット(marimastat);マソプロコル(masoprocol);マスピン(maspin);マトリリシン(matrilysin)阻害薬;マトリックス金属プロテイナーゼ阻害薬;メノガリル(menogaril);メルバロン(merbarone);メテレリン(meterelin);メチオニナーゼ;メトクロプラミド(metoclopramide);MIF阻害薬;ミフェプリストン(mifepristone);ミルテホシン(miltefosine);ミリモスチム(mirimostim);ミスマッチ二本鎖RNA;ミトグアゾン(mitoguazone);ミトラクトル(mitolactol);マイトマイシン類似体;ミトナフィド(mitonafide);マイトトキシン線維芽成長因子−サポリン(saporin);ミトキサントロン(mitoxantrone);モファロテン(mofarotene);モルグラモスチム(molgramostim);モノクローナル抗体、ヒト絨毛ゴナドトロフィン;モノホスホリルリピドA+ミオバクテリウム細胞壁sk;モピダモル(mopidamol);多重薬剤耐性遺伝子阻害薬;多発性腫瘍抑制因子1ベースの治療;マスタード抗癌薬;マイカペルオキシドB;マイコバクテリア細胞壁抽出物;ミリアポロン(myriaporone);N−アセチルジナリン(acetyldinaline);N−置換ベンズアミド類;ナファレリン(nafarelin);ナグレスチップ(nagrestip);ナロキソン(naloxone)+ペンタゾシン(pentazocine);ナパビン(napavin);ナフテルピン(naphterpin);ナルトグラスチム(nartograstim);ネダプラチン(nedaplatin);ネモルビシン(nemorubicin);ネリドロン酸;中性エンドペプチダーゼ;ニルタミド(nilutamide);ニサマイシン(nisamycin);一酸化窒素モジュレーター;ニトロキシド抗酸化剤;ニトルリン(nitrullyn);06−ベンジルグアニン;オクトレオチド(octreotide);オキセノン(okicenone);オリゴヌクレオチド類;オナプリストン(onapristone);オンダンセトロン(ondansetron);オンダンセトロン(ondansetron);オラシン(oracin);経口サイトカイン誘導薬;オルマプラチン(ormaplatin);オサテロン(osaterone);オキサリプラチン(oxaliplatin);オキサウノマイシン(oxaunomycin);パクリタキセル(paclitaxel);パクリタキセル類似体;パクリタキセル誘導体類 ;パラウアミン(palauamine);パルミトイルリゾキシン(palmitoylrhizoxin);パミドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン(panomifene);パラバクチン(parabactin);パゼリプチン(pazelliptine);ぺグアスパルガーゼ(pegaspargase);ペルデシン(peldesine);ポリ硫酸ペントサンナトリウム;ペントスタチン(pentostatin);ペントロゾール(pentrozole);パーフルブロン(perflubron);パーホスファミド;ペリリルアルコール;フェナジノマイシン(phenazinomycin);酢酸フェニル;リン酸塩阻害薬;ピシバニル(picibanil);塩酸ピロカルピン(pilocarpine);ピラルビシン(pirarubicin);ピリトレキシム(piritrexim);プラセチン(placetin)A;プラセチンB;プラスミノーゲン活性化因子阻害薬;白金複合体;白金化合物;白金−トリアミン複合体;ポルフィマー(porfimer)ナトリウム;ポルフィロマイシン(porfiromycin);プレドニゾン(prednisone);プロピルbis−アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソーム阻害薬;タンパク質Aベースの免疫モジュレーター;タンパク質キナーゼC阻害薬;タンパク質キナーゼC阻害薬類、ミクロアルガル(microalgal);タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害薬;プルプリン類;ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート;raf拮抗薬;ラルチトレキセド(raltitrexed);ラモセトロン(ramosetron);rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬;ras阻害薬;ras−GAP阻害薬;脱メチル化レテリプチン(retelliptine);レニウムRe186エチドロナート;リゾキシン(rhizoxin);リボザイム類;RIIレチナミド(retinamide);ログレチ
ミド(rogletimide);ロヒツキン(rohitukine);ロムルチド(romurtide);ロキニメクス(roquinimex);ルビギノン(rubiginone)Bl;ルボキシル(ruboxyl);サフィンゴル(safingol);サイントピン(saintopin);SarCNU;サルコフィトル(sarcophytol)A;サルグラモスチン(sargramostim);Sdi 1模倣体;セムスチン(semustine);セネセンス誘導阻害薬1;センスオリゴヌクレオチド類;シグナル導入阻害薬;シグナル導入モジュレーター;一本鎖抗原結合性タンパク質;シゾフィラン(sizofiran);ソブゾキサン(sobuzoxane);ボロカプト酸ナトリウム;フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロル(solverol);ソマトメジン結合性タンパク質;ソネルミン(sonermin);スパルホジン酸(sparfosic acid);スピカマイシンD;スピロムスチン(spiromustine);スプレノペンチン(splenopentin);スポンギスタチン(spongistatin)1;スクアラミン;幹細胞阻害薬;幹細胞分裂阻害薬;スチピアミド(stipiamide);ストロメリシン(stromelysin)阻害薬;スルフィノシン(sulfinosine);高作用性血管作用性腸内ペプチド拮抗薬;スラジスタ(suradista);スラミン(suramin);スウェインソニン(swainsonine);合成グリコサミンオグリカン;タリムスチン(tallimustine);タモキシフェンメチオジド(tamoxifen methiodide);タウロムスチン(tauromustine);タザロテン(tazarotene);テコガラン(tecogalan)ナトリウム;テガフル(tegafur);テルラピリリウム(tellurapyrylium);テロメラーゼ阻害薬;テモポルフィン(temoporfin);テモゾロミド(temozolomide);テニポシド(teniposide);テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン(tetrazomine);タリブラスチン(thaliblastine);チオコラリン(thiocoraline);トロンボポエチン;トロンボポエチン模倣体;チマルファシン(thymalfasin);チモポエチン(thymopoietin)受容体作動薬;チモトリナン(thymotrinan) ;甲状腺刺激ホルモン;チエニルエチオプルプリン;チラパザミン(tirapazamine);2塩化チタノセン;トプセンチン(topsentin);トレミフェン(toremifene);全能性幹細胞因子;翻訳阻害薬;トレチノイン(tretinoin);トリアセチルウリジン;トリシリビン(triciribine);トリメトレキサート;トリプトレリン(triptorelin);トロピセトロン(tropisetron);ツロステリド(turosteride);チロシンキナーゼ阻害薬;チルホスチン類;UBC阻害薬;ウベニメクス(ubenimex);尿生殖洞由来成長抑制因子;ウロキナーゼ受容体拮抗薬;バプレオチド(vapreotide);バリオリン(variolin)B;ベクターシステム、赤血球遺伝子治療;ベラレソル(velaresol);ベラミン(veramine);ベルジン類;ベルテポルフィン(verteporfin);ビノレルビン(vinorelbine);ビンキサルチン(vinxaltine);ビタキシン(vitaxin);ボロゾール(vorozole);ザノテロン(zanoterone);ゼニプラチン(zeniplatin);ジラスコルブ(zilascorb);およびジノスタチンスチマラマー(zinostatin stimalamer)。好ましいその他の抗癌薬は5−フルオロウラシルおよびロイコボリン(leucovorin)である。
本発明は、本発明の分子を他の治療薬とともに投与することを含む、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療方法を提供する。免疫調節薬の例としては、限定するものではないが、メトトレキセート、エンブレル(ENBREL)、レミケード(REMICADETM)、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、およびマクロライド抗生物質(例えば、FK506(タクロリムス))、メチルプレドニゾロン(MP)、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン(シロリムス)、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)、ブレキナル(brequinar)、マロノニトリルアミド(例えば、レフルナミド)、T細胞受容体モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレーターを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、感染症の治療および/または予防のために、当業者に公知の1種以上のさらなる治療薬の治療上または予防上有効な量と組み合わせて投与することができる。本発明は、感染症の治療および/または予防のための当業者に公知の抗生物質と組み合わせた、本発明の分子の使用を想定している。本発明の分子と組み合わせて用いることができる抗生物質としては、限定するものではないが、マクロライド(例えばトブラマイシン(Tobi(登録商標)))、セファロスポリン(例えばセファレキシン(Keflex(登録商標))、セフラジン(Velocef(登録商標))、セフロキシム(Ceftin(登録商標))、セフプロジル(Cefzil(登録商標))、セファクロール(Ceclor(登録商標))、セフィキシム(Suprax(登録商標))またはセファドロキシル(Duricef(登録商標)))、クラリスロマイシン(例えばクラリスロマイシン(Biaxin(登録商標)))、エリスロマイシン(例えばエリスロマイシン(EMycin(登録商標)))、ペニシリン(例えば、ペニシリンV(V−Cillin K(登録商標)またはPen Vee K(登録商標)))またはキノロン(例えばオフロキサシン(Floxin(登録商標))、シプロフロキサシン(Cipro(登録商標))またはノルフロキサシン(Noroxin(登録商標)))、アミノ配糖体系抗生物質(例えばアプラマイシン、アルベカシン、バンバーマイシン(bambermycin)、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレネート、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、およびスペクチノマイシン)、アンフェニコール(amphenicol)系抗生物質(例えばアジダムフェニコール(azidamphenicol)、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、およびチアンフェニコール)、アンサマイシン系抗生物質(例えばリファマイド(riphamide)およびリファンピン)、カルバセフェム系(例えばロラカルベフ)、カルバペネム系(例えばビアペネムおよびイミペネム)、セファロスポリン系(例えばセファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン(cefazedone)、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピロム)、セファマイシン系(例えばセフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス)、モノバクタム系(例えばアズトレオナム、カルモナム、およびチゲモナム(tigemonam))、オキサセフェム系(例えばフロモキセフ、およびモキサラクタム)、ペニシリン系(例えばアムジノシリン(amdinocillin)、アムジノシリンピボキシル(amdinocillin pivoxil)、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナムシリン、ペネタメートヒドリオダイド(penethamate hydriodide)、ペニシリンo−ベネタミン、ペニシリンO、ペニシリンV、ペニシリンVベンザチン、ペニシリンVヒドラバミン(penicillin V hydrabamine)、ペニメピシクリン(penimepicycline)、およびフェンシヒシリン(phencihicillin)カリウム)、リンコサミド系(例えばクリンダマイシン、およびリンコマイシン)、アンフォマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンジュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイクリン系(例えばアピサイクリン(apicycline)、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、およびデメクロサイクリン)、2,4−ジアミノピリミジン系(例えばブロジモプリム(brodimoprim))ニトロフラン系(例えばフラルタドン、および塩化フラゾリウム(furazolium chloride))、キノロンおよびその類似体(例えばシノキサシン、クリナフロキサシン、フルメキン、およびグレパグロキサシン(grepagloxacin))、スルホンアミド系(例えばアセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルフアミド、ノプリルスルフアミド、フタリルスルフアセトアミド、スルフアクリソイジン(sulfachrysoidine)、およびスルファシチン(sulfacytine))、スルホン系(例えばジアチモスルホン(diathymosulfone)、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン(solasulfone))、シクロセリン、ムピロシンおよびチュベリン(tuberin)を含む。
本発明は、本発明の組成物を用いて、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答を誘発することをさらに包含し、該物質としては、限定するものではないが、癌抗原および感染症抗原(これらの例は後述する)が含まれる。本発明のワクチン組成物は、1以上の抗原性または免疫原性物質(それに対する免疫応答が望まれる)を含み、該1以上の抗原性または免疫原性物質は、FcγRIIIAに対する増大した親和性を有する本発明の変異型抗体によりコートされる。本発明のワクチン組成物は、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答、好ましくは防御性免疫応答を引き起こすのに特に有効である。
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインおよび任意にFcドメイン(またはその一部)を含む本発明の分子(すなわちダイアボディ)を含む方法および医薬組成物を提供する。本発明はまた、疾患、障害または感染に関連する1以上の症状を治療、予防、および改善する方法であって、被験者に有効な量の、本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子、または本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を投与することによる上記方法をさらに提供する。好ましい態様では、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子は、実質的に精製されている(すなわち、その効果を限定するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない)。具体的な実施形態では、被験者は動物、好ましくは哺乳動物、例えば非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)および霊長類(例えば、サル、例えばカニクイザルおよびヒト)である。好ましい実施形態では、被験者はヒトである。また別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は被験者と同じ生物種に由来するものである。
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用であるバルク薬組成物(例えば、不純なまたは非滅菌の組成物)および単位投与剤形の調製に利用できる医薬組成物(すなわち、被験者または患者に投与するのに適した組成物)を含む。そのような組成物は、予防上または治療上有効な量の本明細書中に開示した予防薬および/または治療薬またはそれらの薬剤の組合せと、製薬上許容し得る担体とを含む。好ましくは本発明の組成物は、予防上または治療上有効な量の1種以上の本発明の分子および製薬上許容される担体を含む。
特定の実施形態では、本発明の分子をコードする配列を含む核酸を投与することにより、遺伝子治療を用いて疾患、障害、または感染に関連する1以上の症状を治療、予防、または改善する。遺伝子治療は、発現されるまたは発現可能な核酸を被験者に投与することにより行われる治療を意味する。本発明のこの実施形態では、核酸が、治療または予防効果を媒介するそのコード化抗体または融合タンパク質を産生する。
本発明は、本発明の分子を充填した1以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な1以上の他の予防または治療薬を、医薬パックまたはキット中に含んでもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物の1以上の成分を充填した1以上の容器を含む医薬パックまたはキットも含む。場合によっては、このような容器に、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局が指示した形式で、ヒト投与のための製造、使用または販売の行政当局による認可を反映する注意書きを添付してもよい。
ヒトに使用する前に、本発明の医薬組成物、予防または治療薬のいくつかの態様は、好ましくは、in vitroで、細胞培養系で、および動物モデル生物で、例えばげっ歯類動物モデル系で、所望の治療活性について試験される。例えば、特定の医薬組成物の投与が適切なものかを確認するのに用いることができるアッセイは、細胞培養アッセイを含み、該アッセイにおいては、患者組織サンプルを培養で増殖させ、本発明の医薬組成物に曝すかまたは別の方法で接触させ、そして組織サンプルに対する該組成物の効果を観察する。組織サンプルは患者から生検により得ることができる。この試験により、個々の患者に対して治療上最も有効な予防または治療分子を同定することができる。様々な具体的実施形態では、in vitroアッセイを、自己免疫疾患または炎症性疾患に関係する細胞型の代表的細胞(例えば、T細胞)を用いて実施し、本発明の医薬組成物がそのような細胞型に対して所望の効果を奏するかを確認することができる。
単一特異性共有結合型ダイアボディおよび二重特異性共有結合型ダイアボディを構築し、それぞれの組換え体の作製、精製および結合特性を評価した。本明細書に記載した組換え発現系によって作製され、アフィニティー精製されたダイアボディ分子は、SDS−PAGEおよびSEC解析により単一の二量体種からなることが判明した。ELISAおよびSPR解析により、共有結合型二重特異性ダイアボディは双方の標的抗原に親和性を示すこと、および双方の抗原と同時に結合できることがさらに明らかになった。
ポリペプチド分子の構築および設計
核酸発現ベクターを設計し、図2で模式図により示した4つのポリペプチド構築物を作製した。構築物1(配列番号9)は、FcγRIIBを認識するヒト化2B6抗体のVLドメイン、およびFcγRIIIAを認識するヒト化3G8抗体のVHドメインを含む。構築物2(配列番号11)は、Hu3G8のVLドメイン、およびHu2B6のVHドメインを含む。構築物3(配列番号12)は、Hu3G8のVLドメイン、およびHu3G8のVHドメインを含む。構築物4(配列番号13)は、Hu2B6のVLドメイン、およびHu2B6のVHドメインを含む。
VLおよびVHドメインのコード配列を、第1PCR産物が重複配列を含むように設計したフォワードおよびリバースプライマーを用いて鋳型DNAから増幅した。これにより、重複PCRで所望のポリペプチド構築物のコード配列を作製することが可能となる。
約35ngの鋳型DNA(例えば、目的の抗体の軽鎖および重鎖)、1μlの10μMフォワードプライマーおよびリバースプライマー、2.5μlの10×pfuUltraバッファー(Stratagene, Inc.)、1μlの10mM dNTP、1μlの2.5ユニット/μlのpfuUltra DNAポリメラーゼ(Stratagene, Inc.)、および総量25μlになるように加えた蒸留水を、微量遠心チューブ内で静かに混合し、微量遠心機で短時間スピンして反応混合物をチューブの底に集めた。PCR反応を、GeneAmp PCR System 9700(PE Applied Biosystem)を用いて行った。反応は、94℃で2分間;続いて94℃で15秒間、58℃で30秒間および72℃で1分間を25サイクルに設定した。
第1PCR産物を下記のように結合させて、鋳型DNAの最初の増幅で説明したPCR条件と同一の条件を用いて増幅した。重複PCRの産物も、上記のように精製した。
構築物1をコードするpMGX0669を、構築物2をコードするpMGX0667と共に、リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を用いて、使用説明書に従ってHEK−293細胞にコトランスフェクションした。これら2つのプラスミドのコトランスフェクションは、FcγRIIBおよびFcγRIIIAの双方に対して免疫特異的な共有結合型二重特異性ダイアボディ(CBD)(h2B6−h3G8ダイアボディ)が発現するように設計されている。構築物3および4をそれぞれコードするpMGX0666およびpMGX0668を、それぞれFcγRIIIAに対して免疫特異的な共有結合型単一特異性ダイアボディ(CMD)(h3G8ダイアボディ)およびFcγRIIBに対して免疫特異的な共有結合型単一特異性ダイアボディ(CMD)(h2B6ダイアボディ)の発現のために、HEK−293細胞に別々にトランスフェクトした。培養3日後、分泌された産物を条件培地から精製した。
ダイアボディを条件培地から、CNBr活性型セファロース4Bと結合させた関連する抗原を用いて回収した。ローディング前にアフィニティーセファロース樹脂を20mM Tris/HCl(pH8.0)で平衡化した。ローディング後、溶出前に、樹脂を平衡バッファーで洗浄した。ダイアボディを、50mMグリシン(pH3.0)を用いて洗浄済み樹脂から溶出した。溶出したダイアボディを、1M Tris/HCl(pH8.0)で直ちに中和し、遠心分離型濃縮器を用いて濃縮した。濃縮したダイアボディを、さらにPBSで平衡化したSuperdex 200カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって精製した。
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、カラムから溶出されたダイアボディのおおよそのサイズと異質性を分析した。SEC解析は、PBSで平衡化したGEヘルスケア社のSuperdex 200HR 10/30カラムで行われた。全長IgG(約150kDa)、Fabフラグメント(約50kDa)および一本鎖Fv(約30kDa)の溶出プロファイルとの比較を対照として用いた。
溶出および精製されたダイアボディの結合性を、ELISAアッセイによってセクション5.4.2で説明したように、性状解析した。1ウェルあたり50μlの2μg/mlのsCD32B−Ig溶液を、炭酸バッファーの入った96ウェルMaxisorpプレート上に4℃で一晩コーティングした。プレートをPBS−T(PBS+0.1% Tween20)で3回洗浄し、PBS−T中の0.5% BSAで30分間、室温にてブロッキングした。続いて、h2B6−h3G8 CBD、h2B6 CMDまたはh3G8 CMDを、ブロッキングバッファーを用いて2倍希釈で連続希釈し、0.5μg/mlから0.001μg/mlまでの範囲のダイアボディ濃度を作製した。その後、プレートを室温で1時間インキュベーションした。PBS−Tで3回洗浄した後、0.2μg/mlのsCD16A−ビオチンを1ウェルあたり50μlで、各ウェルに加えた。プレートを再び室温で1時間インキュベーションした。PBS−Tで3回洗浄した後、1:5000希釈したHRP結合ストレプトアビジン(Amersham Pharmacia Biotech)を検出のために1ウェルあたり50μl用いた。HRP−ストレプトアビジンを45分間、室温でインキュベーションした。プレートをPBS−Tで3回洗浄し、TMB基質を1ウェルあたり80μl用いて発色させた。10分間のインキュベーション後、1% H2SO4を1ウェルあたり40μl加えることによって、HRP−TMB反応を停止させた。OD450を96ウェルプレートリーダーとSOFTmaxソフトウェアを用いて読み込み、結果をGraphPadPrism 3.03ソフトウェアを用いてプロットした。
溶出および精製されたダイアボディの動態パラメーターを、セクション5.4.3で説明したようにBIAcoreアッセイ(BIAcore instrument 1000、BIAcore Inc.、Piscataway、N.J.)および付属のソフトウェアを用いて解析した。
非還元条件下でのSDS−PAGE解析により、h3G8 CMD、h2B6 CMDおよびh2B6−h3G8 CBD発現系の精製産物は、それぞれ単一種であり、約50kDa(図3のそれぞれレーン4、5および6)の推定分子量をもつことが明らかとなった。還元条件下では、CMDの各発現系から精製された産物は、単一バンド(レーン1および2)として移動したが、h2B6−h3G8 CBD系から精製された産物は、2つに分離するタンパク質(図3、レーン3)であることが明らかとなった。発現系から精製され、還元条件下でSDS−PAGEによって視覚化された全ポリペプチドは、約28kDaの位置に移動した。
IgG様分子、つまりFcドメインを含む分子を作るために、実施例6.1で示したヘテロ二量体CBD分子を含むポリペプチドの1つを、Fcドメインをさらに含む(抗体の重鎖および軽鎖に類似する「重い」鎖および「軽い」鎖を作り出す)ように改変した。したがって、ヘテロ二量体の二重特異性分子が同種分子と二量体化するFcドメインを含むことで、四価の四量体IgG様分子(すなわち、ヘテロ二量体の二重特異性分子のFcドメインを介して二量体化することで形成される分子)が形成されるだろう。興味深いことに、このような四量体分子は、例えば標的抗原に対する免疫特異的結合性について条件培地を試験するといった機能アッセイを用いて、組換え発現系の条件培地中には検出されなかった。その代わりに、VL、VHおよびFcドメインからなる単量体を含む二量体分子のみが、前記機能アッセイで検出された。理論上の四量体構造が安定性の面で問題となるかどうかを試験するために、Fcドメインを含むポリペプチドがヒンジ領域をさらに含むように遺伝子操作し、一方「軽い」鎖を含むポリペプチドはヒトκ型軽鎖の定常ドメインの6個のC末端アミノ酸を含むように遺伝子操作した。このように遺伝子操作した「重い」および「軽い」鎖を組換え発現系で共発現させたとき、機能アッセイによって、標的抗原と抗Fc抗体の双方に免疫特異的に結合できるダイアボディ分子が検出された。
ポリペプチド分子の構築および設計
実施例6.1で示した構築物1および2の改変型を作製するために、核酸発現ベクターを設計した。構築物5(配列番号14)および6(配列番号15)は、さらにFcドメインを含むように、それぞれ構築物1および2を遺伝子操作することにより作製された。構築物7(配列番号16)は、構築物1を遺伝子操作して、さらにそのC末端に配列FNRGEC(配列番号23)を含むように作製された。構築物8(配列番号18)は、構築物2を遺伝子操作して、さらにヒンジ領域とFcドメイン(V215A変異を含む)を含むように作製された。構築物5〜8の模式図を図9に示す。
PCRおよびPCR産物の精製プロトコルはすべて、実施例6.1で説明した通りである。プラスミドpMGX0669およびpMGX0667を、それぞれ構築物1および2のコード配列用の鋳型として用いた。HuIgGのFcドメイン用のおよび/またはヒンジドメイン用のコード配列は、それぞれ配列番号5または配列番号1および配列番号5とした。鋳型DNAのコード配列はフォワードおよびリバースプライマーを用いて増幅したが、PCR産物が重複配列を含み、重複PCRが所望の産物のコード配列を生成させるようなプライマーを用いた。
第1PCR産物を以下に記載したように組み合わせ、実施例6.1で説明したように増幅および精製した。
セクション6.1で記載したように、リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を用いてHEK−293細胞内に別個に4つのコトランスフェクションを行った。前記コトランスフェクションは、すなわち、構築物1および6をそれぞれコードするpMGX0669およびpMGX0674、構築物2および5をそれぞれコードするpMGX0667およびpMGX0676、ならびに構築物7および8をそれぞれコードするpMGX0677およびpMGX0678である。
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を、上記サンドイッチELISAでアッセイした。特に示した場合を除き、CD32Bをプレートコーティング用に、つまり標的タンパク質として用いた。また、HRP結合CD16をプローブとして使用した。
ELISAアッセイを用いて、構築物1および6(pMGX669−pMGX674)、構築物2および5(pMGX667−pNGX676)、ならびに構築物5および6(pMGX674−pMGX676)を含む組換え発現系由来の正規化したサンプルを、CD32BおよびCD16Aと同時に結合可能なダイアボディ分子の発現について試験した(図10)。ELISAデータは、構築物1および6を用いたコトランスフェクション、または構築物2および5を用いたコトランスフェクションでは、一方または両方の抗原に結合できる産物は生じなかった(図10、それぞれ□および▲)。しかしながら、構築物5および6のコトランスフェクションは、CD32BおよびCD16Aの両抗原に結合できる産物の分泌をもたらした。後者の産物は、構築物5および6の二量体であり、図11に模式図で示した構造を有し、それぞれの抗原に対する1つの結合部位を含んでいる。
四量体IgG様ダイアボディ分子の「軽い」および「重い」ポリペプチド鎖間の追加的な安定化の効果を、ポリペプチド鎖上の選択された残基のシステインによる置換によって調べた。付加的なシステイン残基は、「重い」および「軽い」鎖間に付加的なジスルフィド結合を付与する。さらに、Fcドメインまたはヒンジ−Fcドメインをポリペプチド鎖のC末端からN末端に移すことで、結合活性おけるドメインの順番を調べた。付加的なジスルフィド結合を含む分子の結合活性は、そのような結合をもつ先に構築されたダイアボディ分子と比べて変わらなかったが、Fcもしくはヒンジ−Fcドメインを、ダイアボディを構成する「重い」ポリペプチド鎖のN末端に移すと、その標的抗原の一方もしくは双方に対する二重特異性分子の結合親和性および/または結合力が驚くほど改善された。
ポリペプチド分子の構築および設計
実施例6.2で示した構築物5、6および8の改変型を作製するために、核酸発現ベクターを設計した。構築物9(配列番号19)および構築物10(配列番号20)(いずれも図13に模式図で示す)は、それぞれFcドメインまたはヒンジ−FcドメインがポリペプチドのC末端からN末端にシフトしていることを除けば、構築物8および6と類似する。さらに、使用したFcドメインはすべて、野生型IgG1のFcドメインである。構築物11(配列番号21)(図14に模式図で示す)は、C末端が配列FNRGEC(配列番号23)をさらに含むように設計されていることを除けば、実施例6.1からの構築物2に類似する。構築物12(配列番号22)(図14に模式図で示す)は、Fcドメインがさらにヒンジ領域を含むことを除けば、実施例6.2からの構築物5に類似する。また、構築物11および12に関しては、2B6のVLドメインおよび2B6のVHドメインは、各ドメイン中のグリシンをシステインに置換するための単一アミノ酸変異(それぞれG105CおよびG44C)を含んでいる。
PCRおよびPCR産物の精製プロトコルはすべて、実施例6.1および6.2で説明した通りである。
実施例6.1および6.2に記載の方法を用いて、最終産物を構築し、増幅し、精製した。
セクション6.1で記載したようにリポフェクトアミン2000を用いてHEK−293細胞内に別個に3つのコトランスフェクションを行った。前記コトランスフェクションは、すなわち構築物1および9をそれぞれコードするpMGX0669およびpMGX0719、構築物1および10をそれぞれコードするpMGX0669およびpMGX0718、ならびに構築物11および12をそれぞれコードするpMGX0617およびpMGX0717である。これらのプラスミドのコトランスフェクションは、FcγRIIBおよびFcγRIIIAの双方に免疫特異的なIgG様構造をもった四価の二重特異性ダイアボディ(CBD)を発現するように設計されている。培養3日後、条件培地を回収した。条件培地中の分泌産物の量を、抗IgG Fc ELISAによって、精製したFcを基準として用いて定量化した。その後、サンプル中の産物の濃度を定量値に基づいて正規化し、この正規化したサンプルを以降のアッセイに使用した。
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を、上記サンドイッチELISAによってアッセイした。特に示した場合を除き、CD32Bをプレートコーティング用に、つまり標的タンパク質として用いた。また、HRP結合CD16をプローブとして使用した。
上記3つのコトランスフェクションからの条件培地約15mlをSDS−PAGEによって非還元条件下で解析した。一枚のゲルをSimply Blue Safestain(Invitrogen)で染色し、続いて、同一ゲルを一般的な転写方法を用いてPVDFメンブレン(Invitrogen)に転写した。転写後、メンブレンを1×PBS中の5%脱脂粉乳でブロッキングした。その後、メンブレンを、2%脱脂粉乳1×PBS/0.1% Tween 20中の1:8000希釈したHRP結合ヤギ抗ヒトIgG1 H+L抗体 10ml中で室温にて1時間静かに撹拌しながらインキュベーションした。1×PBS/0.3% Tween 20で、それぞれ5分間ずつ2回洗浄した後、ECLウェスタンブロッティング検出システム(Amersham Biosciences)を用いて、使用説明書に従って室温で20分間、メンブレンを露光した。フィルムをX線処理装置で現像した。
構築物1および9、構築物1および10、ならびに構築物11および12を含む組換え発現系由来の条件培地を、SDS−PAGE(非還元条件下)解析およびウェスタンブロッティング(抗IgGをプローブとして使用)によって解析した。ウェスタンブロットにより、構築物11および12を含む系または構築物9および1を含む系由来の産物は、主に約150kDaの単一分子種(それぞれ図15のレーン3および2)を形成することが明らかとなった。これらの産物はいずれも、内部ジスルフィド結合がダイアボディを構成する「軽い」および「重い」鎖の間に設計されている。一方、「軽い」および「重い」鎖の間に内部ジスルフィド結合を設計されていない構築物10および1から形成された分子は、分子量約75kDaおよび約100kDa(図15のレーン1)の少なくとも2つの分子種を形成した。
本明細書で説明したように、本発明のダイアボディの個々のポリペプチド鎖またはダイアボディ分子を、単一のポリプロテイン前駆体分子として発現させることができる。実施例6.1〜6.3で説明した組換え系の、前記ポリプロテイン前駆体から機能的なCBDを適切にプロセシングして発現する能力は、内部切断部位(特にフューリン切断部位)によって分離されるCBDの第1および第2ポリペプチド鎖の両方をコードする核酸を作製することによって試験した。機能的なCBDは、ポリプロテイン前駆体分子を含む組換え系から単離した。
ポリペプチド分子の構築および設計
(ポリプロテイン前駆体)
2つのポリプロテイン前駆体分子を作製するために核酸発現ベクターを設計した。両分子とも図17に模式図で示してある。構築物13(配列番号97)は、ポリペプチド鎖のN末端側から順に、3G8のVLドメイン、2.4G2のVHドメイン(mCD32Bに結合する)、フューリン切断部位、2.4G2のVLドメイン、および3G8のVHドメインを含んでいる。構築物13をコードするヌクレオチド配列を配列番号98に示す。構築物14(配列番号99)(図17)は、ポリペプチド鎖のN末端側から順に、3G8のVLドメイン、2.4G2のVHドメイン(mCD32Bに結合する)、フューリン切断部位、FMD(口蹄疫ウイルスプロテアーゼC3)部位、2.4G2のVLドメイン、および3G8のVHドメインを含んでいる。構築物14をコードするヌクレオチド配列を配列番号100に示す。
PCRおよびPCR産物の精製プロトコルはすべて、実施例6.1および6.2で説明した通りである。
実施例6.1および6.2に記載の方法を用いて、適当なプライマーを使って、最終産物を構築し、増幅し、精製した。
セクション6.1で記載したようにリポフェクトアミン2000を用いてHEK−293細胞内に1回のトランスフェクションおよび1回のコトランスフェクションを行った。単独のトランスフェクションでは、構築物13をコードするpMGX0750を、また、コトランスフェクションでは構築物15および16をそれぞれコードするpMGX0752およびpMGX0753を用いた。培養3日後、条件培地を回収し、分泌された産物を上記のようにアフィニティー精製した。
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を上記サンドイッチELISAによってアッセイした。マウスCD32Bを標的タンパク質として用いてプレートをコーティングした。また、HRP結合CD16を、構築物15および16のコトランスフェクションの産物用プローブとして使用した。mCD32Bを標的タンパク質として使用し、またビオチン結合CD16Aを構築物13を含む組換え系用のプローブとして使用した。
構築物13を含む組換え発現系から得られた条件培地を、サンドイッチELISAで解析した。ELISAアッセイは、mCD32Bおよび/またはCD16の一方または両方への特異性についてCBDの結合性を試験した(図18)。CD32Bを標的抗原として利用し、またCD16Aを二次プローブとして用いた。ELISAにおける陽性シグナルにより、ポリプロテイン前駆体から生成されるヘテロ二量体h2.4G2−h3G8 CBDは両抗原に対して特異性を有することが明らかとなった。
本発明の一態様は、新規の二重親和性再標的化試薬(「DART」)の他、複数の親和性を共に連関させる新規の方法に関する。「DART」は、単一特異性、二重特異性、三重特異性などであり得、このため、1個、2個、3個またはそれ以上の異なるエピトープ(同じ抗原または異なる抗原のものであり得る)に同時に結合することが可能である。「DART」は、さらに、一価、二価、三価、四価、五価、六価などでもあり得、このため、1個、2個、3個、4個、5個、6個またはそれ以上の分子に同時に結合することが可能である。図35に示すように、DARTのこれら2つの属性を組み合わせて、例えば、四価である二重特異性抗体などを作製することができる。
プラスミド構築物
2B6/4420は、ヒト化2B6MAb(hu2B6、MGA321)と、抗フルオレセインMAbのキメラマウスFv/ヒトFc変化形である4420との配列に由来する。完全に構築されたDARTは、2つのポリペプチドからなり、その結果、2つのFv領域の共有結合がもたらされる。第1のポリペプチドは、分泌シグナル配列に後続する、アミノ酸残基GGGSGGGGからなるリンカーにより分離される4420VHとの融合タンパク質として作製されるhu2B6VLからなる。カッパ軽鎖のC末端に由来する配列FNRGECを、このポリペプチドのC末端に付加する。他のポリペプチドは、シグナル配列−4420VL−GGGSGGGG−hu2B6VHからなり、ヒトIgG1 FdフラグメントのC末端に由来する配列VEPKSCをC末端に付加する。2つの鎖中のシステインがジスルフィド結合を形成し、2つのポリペプチドを一緒に共有結合させる(図20)。説明したポリペプチドをコードするDNA配列を既存のプラスミドからPCR増幅し、重複PCRにより組み合わせ、Nhe I部位とEcoRI部位との間のpCIneo(Promega社製)内にクローニングした。最後に、上述した方法と同様の方法を用いて既に構築しておいた、huCD32BとhuCD16とに対する親和性を有するDART(2B6/3G8)を、対照として用いた。
抗ヒトCD79bマウスモノクローナル抗体であるCB3.1およびCB3.2(ハイブリドーマ)は、アラバマ州、バーミンガム、アラバマ大学バーミンガム校のCooper MD博士から入手した。製造元の指示書(イリノイ州、ロックフォード、Pierce社製)に従い、イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)により、CB3.1およびCB3.2に標識した。Fcフラグメント特異的なヤギ抗マウス(GAM)IgGのF(ab’)2フラグメントは、Jackson Laboratories社(ペンシルベニア州、ウェストグローブ)から入手した。抗huCD32BマウスMAbである3H7は、自社で作製し精製した。ヤギ抗2B6Fv抗体は、hu2B6全抗体によりヤギに対して免疫感作し、hu2B6のFv領域に対してアフィニティー精製することにより作製した。huIgG、FITC−huIgG、およびHRP−抗マウスIgGは、Jackson ImmunoResearch社から入手した。HRP−抗ヤギは、Southern Biotech社から入手した。
製造元の指示書に従い、リポフェクトアミン2000(Invitrogen社製)を用いて、各鎖をコードするプラスミドを、293H細胞(Invitrogen社製)内に同時トランスフェクトした。3日間隔で3〜4回、分泌されたタンパク質を回収し、CD32Bの固定化可溶性形態に対する液体クロマトグラフィーにより精製した。
FITC標識プロテインS(Novagen社製)、ヒトIgG、またはFITC−huIgGでコーティングしたMaxiSorpプレート(Nalge Nunc社製)上において、2B6/4420 DARTまたは2B6/3G8 DARTを捕捉した。検出は、可溶性CD32B細胞外ドメインに対する結合の後、3H7(CD32Bに対して特異的なマウスモノクローナル抗体)、最後に抗マウスHRPにより行った。あるいは、アフィニティー精製したヤギ抗2B6 Fvポリクローナル抗血清に対する結合の後、抗ヤギ抗体−HRPにより検出を実施した。HRP活性は、比色分析用TMB基質(BioFX社製)を用いて検出し、VersaMax ELISAプレートリーダー上で読み取った。
健康なドナー由来の血液を用いるFicoll/Paque Plus(英国、Amersham Pharmacia Biotech社製)勾配法により、末梢血単核細胞を分離した。製造元の指示書に従い、Dynal B細胞陰性単離キット(ニューヨーク州、Dynal Biotechnology社製)を用いて、Bリンパ球を単離した。単離されたB細胞(CD20+)の純度は、FACS解析による推定で90%を超えた。増殖アッセイでは、精製されたB細胞を、平底96ウェルマイクロ滴定プレート内の完全RPMI 1640培地中に、200μlの最終容量におけるウェルあたり1×105個の細胞密度で播種し、5%のCO2中37℃の抗体およびダイアボディの存在または不在下において48時間にわたりインキュベートした。次いで、1μCi/ウェルの[3H]チミジン(マサチューセッツ州、ウェルズリー、Perkin Elmer社製)を添加し、回収前にさらに16〜18時間にわたりインキュベーションを継続した。[3H]チミジンの取込みは、液体シンチレーションカウント法により測定した。
2B6/4420 DARTが活性であり特異的であることを示すため、2つのELISA実験を実施した。まず、2B6/4420または2B6/3G8(陰性対照として)を、ELISAプレート上にコーティングさせておいたフルオレセインコンジュゲートタンパク質(Sタンパク質)に結合させた。次に、DARTの2B6アームを可溶性CD32Bにより結合させる。結合は、2B6のエピトープと重複しないエピトープを有するCD32Bに対する別の抗体の後、HRPコンジュゲート二次抗体により検出した。2B6/4420 DARTにはフルオレセインとCD32Bとに対して同時に結合する能力があるのに対し、2B6/3G8にはその能力がない(図21、パネルA)。可溶性CD32Bでコーティングしたプレート上において該DARTを捕捉し、hu2B6 Fvに対して特異的な抗体により結合を検出すると、いずれのDARTも良好な結合を示す。2B6/4420 DARTには、ヒトIgGにコンジュゲートさせたフルオレセインに結合する能力があることを示す(これが、本試薬の最初の実装形態の場面であるとする)ため、フルオレセインにより標識されないかまたは標識されたHuIgGをELISAプレートに結合させ、これを用いて2B6/4420を捕捉した。ここでもまた、2B6/3G8を陰性対照として用いた。結合は、Hu2B6 Fvに対して特異的な抗体を用いて検出した。2B6/4420 DARTは、FITC−HuIgGに結合することが明らかであるが、非標識のHuIgGには結合せず、このDARTには抗体にコンジュゲートさせたフルオレセインに結合する能力があり、抗体単独に対しては顕著な結合が見られないことを示す。予測したように、これらの場面のいずれにおいても、2B6/3G8 DARTによる結合は検出されなかった。
現在のところ、B細胞悪性疾患は、リツキサン(登録商標)抗CD20抗体を用いて治療されている。しかし、一部のB細胞悪性疾患はCD20を発現しないか、またはリツキサンに対して耐性となる。本発明のDARTは、リツキサン(登録商標)抗CD20抗体と関連する問題を克服する能力がある代替的な免疫療法剤を提供する。
第0、3、7、10、14、および17日において、MarcoGenics社製繁殖コロニーのmCD32−/− hCD16A+ C57Bl/6マウス、mCD32−/− hCD32B+ C57Bl/6マウス、およびmCD32−/− hCD16A+ hCD32B+ C57Bl/6マウスに、MGD261(10、3、1、または0.3mg/kg)または非関連抗体(10mg/kgのhE16)を静脈内注射した。第−19(血液採取前)、4、11、18、25、および32日において血液を採取し、FACS解析にかけた。毎週3回、動物の健康および活動を記録した。
h2B6−h3G8投与の18日前、ならびに該治療の4、11、18、25、および32日後において、全血液試料を採取した。FACSベースのアッセイにより血液試料を解析して、h2B6−h3G8のB細胞カウントに対する効果を決定した。Bechman Coulter社製のFlowCountビーズを用いることにより、洗浄なしのプロトコールをB細胞カウント、T細胞カウント、およびPMNカウントに用いた。解析で用いた抗体パネルは、PMNが1A8−FITC、T細胞がCD3−PE、B細胞がCD19−APC、および全白血球がCD45−PerCPであった。
hE16またはMGD261(任意の濃度で)により処理したマウスは、実験期間中のどの時点でも不快感の徴候を示さなかった。
第0、2、4、7、9、11、14、16、および18日において、MarcoGenics社製繁殖コロニーのmCD16−/−マウス、mCD16−/− hCD16A+ C57Bl/6マウス、mCD16−/− hCD16B+マウス、およびmCD16−/− hCD16A+ hCD16B+マウスに、2.4G2−3G8 DB(75ug/匹)またはPBSを腹腔内注射した。第−10(血液採取前)、4、11、および18日において血液を採取し、FACS解析にかけた。毎週3回、動物の健康および活動を記録した。
2.4G2−3G8投与の10日前、ならびに該治療開始の4、11、および18日後において、全血液試料を採取した。FACSベースのアッセイにより血液試料を解析して、2.4G2−3G8のB細胞カウントに対する効果を決定した。BD Immunocytometry System社製のTruCOUNTチューブを用いることにより、洗浄なしのプロトコールをB細胞カウント、T細胞カウント、およびPMNカウントに用いた。解析で用いた抗体パネルは、PMNが1A8−FITC、T細胞がCD3−PE、B細胞がCD19−APC、および全白血球がCD45−PerCPであった。
hE16または2.4G2−3G8 DBにより処理したマウスは、実験期間中のどの時点でも不快感の徴候を示さなかった。
ヒト腫瘍細胞株Rajiの静脈内(IV)モデルを用いて、MGD261の抗腫瘍活性を試験した。Rajiは、hCD32Bを発現するヒトバーキットリンパ腫細胞株である。mCD16−/−マウス、hCD16A+マウス、RAG1−/−マウスに静脈内注射すると、腫瘍細胞が脊椎に局在化され、結果的に後肢麻痺が生じる。
第0日において、MarcoGenics社製繁殖コロニーで20週齢のmCD16−/−マウス、hCD16A+マウス、RAG1−/− C57Bl/6マウス12匹に、5×106個のRaji細胞を静脈内注射した。第6、9、13、16、20、23、27、および30日において、マウスはまた、250、25、または2.5ugのMGD261またはPBS(陰性対照)による腹腔内(IP)治療も受けた。次いで、マウスを毎日観察し、毎週2回体重を記録した。後肢麻痺を発症するマウスは安楽死させた。
PBSで治療したマウスは、第25日と第50日との間に死亡した。MGD261で治療したマウスは、少なくとも第90日まで生存した(図26)。生存の延長は、統計学的に有意であった。ログランク検定を用いる生存曲線の比較により、96.46のχ2(df=9;P値<0.0001)が得られた。
非哺乳動物宿主においてDARTを作製できることを裏付けるために、実験を実施した。したがって、DART発現プラスミドにより大腸菌(Escherichia coli)を形質転換し、DART発現をモニタリングした。
プラスミドの構築
3G8は、HuCD16に対するヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で説明するDARTは、その各々がVLの後にスペーサーを有し、次いで、VHの後に対向鎖に対するジスルフィド結合を形成するのに良好な前後関係でCysを有する、2本の共有結合鎖からなる。3G8VL−GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly−3G8VH−LeuGlyGlyCysをコードするDART配列を既存の真核細胞発現構築物からPCR増幅し、Nco IおよびEcoRIにより消化した。標的ベクターは、大腸菌内における分泌のためのpelBリーダー配列を含有するpET25b(+)ベクター(Novagen社製)であった。3G8/3G8 DART配列の挿入前に、ベクターを以下の通りに改変した:まず、たとえより低レベルであってもタンパク質の可溶性発現がその制御下にあることを促すため、より低活性のlacプロモーターによりT7プロモーターを置換した。さらに、pelBリーダーの開始部に存在するMetでの開始を促すため、2カ所の点変異を導入して、多重クローニング部位(MCS)の開始部に存在する2個の内部Metコドンを除去した。この構築物により作製されるDARTは、同一の特異性、すなわち、HuCD16を有する2本のV領域アームからなる。
pET25b(+) T7− lac+ 3G8/3G8プラスミドによりBL21DE3細胞(Novagen社製)を形質転換させ、amp耐性コロニーを用いてブロス培地に播種した。培養物が0.5 OD600単位に達したところで、0.5mMのIPTGを添加して発現を誘導した。30℃で2時間にわたり培養物を増殖させ、無細胞培地を回収した。
アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーを用いる2段階で3G8/3G8 DARTを精製した。アフィニティークロマトグラフィーを用いて、条件培地からDARTを捕捉した。特に、CD16AをCNBr活性化セファロース4B(GE Healthcare社製)に結合させた。ローディング前に、pH8.0の20mMトリス/HCl中でCD16A−セファロース樹脂を平衡化した。ローディングが完了したら、pH3.0の50mMグリシンによる結合したDARTの溶出前に、平衡化緩衝液により該樹脂を洗浄した。溶出したDARTは、即座にpH8.0の1Mトリス/HClにより中和化させ、遠心分離型濃縮器(VivaScience社製のVivaspin 20、10k MWCO PES)を用いて濃縮した。濃縮されたDARTは、PBS中で平衡化されたSuperdex 200カラム(GE Healthcare社製)を用いるサイズ除外クロマトグラフィーによりさらに精製した。
CD16Aセファロースカラムにより、大腸菌を培養した1.7リットルの条件培地を処理した。DARTの収量は、0.12mgであった。精製したDARTのSDS−PAGEおよびSECによる解析は、哺乳動物細胞(CHO細胞)により発現した対照DARTとの同等性を示した(図27)。
ELISAを用いて、大腸菌内におけるh3G8−h3G8 DARTの発現を測定した。4℃の炭酸緩衝液中で一晩にわたり、96ウェルMaxisorpプレート上に、50μl/ウェルで2μg/mlの抗h3G8 Fv特異的抗体である2C11をコーティングした。PBS−T(PBS、0.1% Tween 20)によりプレートを3回洗浄し、次いで、試験対象のDARTを添加する前に、室温で30分間にわたり、PBS−T中において0.5%のBSAによりブロックした。ブロッキング時において、大腸菌により発現したh3G8−h3G8 DART、h2B6−h3G8 DART、およびh2B6−h2B6 DART(陰性対照)を、PBST/BSA中において1μg/mlおよび0.3μg/mlに希釈した。50μl/ウェルの希釈したDARTを各ウェルに添加した。室温で1時間にわたりプレートをインキュベートした。PBS−Tによる3回の洗浄後、50μl/ウェルで0.1μg/mlのビオチニル化したsCD16−Fc融合体をプレートに添加した。室温で1時間にわたりプレートをインキュベートした。PBS−Tによる3回の洗浄後、50μl/ウェルのHRPコンジュゲートストレプトアビジン(Amersham Pharmacia Biotech社製)の1:5000希釈液を検出に用い、室温で1時間にわたりインキュベートした。PBS−Tによりプレートを3回洗浄し、80ul/ウェルのTMB基質を用いて発色させた。5分間のインキュベーション後、40μl/ウェルの1% H2SO4により反応を停止させた。96ウェルプレートリーダーおよびSOFTmaxソフトウェアを用いてOD450nmを読み取った。GraphPadPrism 3.03ソフトウェアを用いてリードアウトをプロットした(図28)。
一晩にわたり、ヒトPBMCを、CD16−CD32B−hu3G8−hu2b6(上述)、ch2B6−aglyc―非グリコシル化キメラ2B6抗体(参照により本明細書に組み込む、US2005/0260213として公開された同時係属の米国特許出願第11/108,135号で説明した)、およびCD16−CD79と共にインキュベートした。CD16−CD79のDNA配列およびコードされたタンパク質配列は、以下の通りである。
8B5VL−CB3.1VH−VEPKSC
8B5VLは、H9およびlgh630Rをプライマー、ch8B5Lcを鋳型として用いることにより増幅した。CB3.1は、lgh628Fおよびlgh629Rをプライマー、ch8B5Hcを鋳型として用いることにより増幅した。リンカー配列は、プライマーlgh630Rおよびlgh628F内に組み込んだ。c末端のリンカーおよび終止コドンは、lgh629Rプライマー内に組み込んだ。PCR産物をゲル精製して等モル比で共に混合し、次いで、H9およびlgh630Rをプライマーとして用いることにより増幅した。次いで、重複PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pCIneoベクター内にクローニングした。
CB3.1VLは、H9と、FR4において8B5VLと同じ配列を共有するlgh630Rとをプライマーとして、chCB3.1Lcを鋳型として用いることにより増幅した。8B5VHは、lgh631Fおよびlgh640Rをプライマー、ch8B5Hcを鋳型として用いることにより増幅した。リンカー配列は、プライマーlgh630Rおよびlgh631F内に組み込んだ。c末端のリンカーおよび終止コドンは、lgh640Rプライマー内に組み込んだ。PCR産物をゲル精製して等モル比で共に混合し、次いで、H9およびlgh640Rをプライマーとして用いることにより増幅した。次いで、重複PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pCIneoベクター内にクローニングした。
抗Flagタグは、重複PCRによりシグナル配列と8B5VLとの間に挿入した。シグナル配列およびFlagタグは、H9およびlgh647Rをプライマー、ch8B5Lcを鋳型として用いることにより増幅した。8B5VL−CB3.1VH−VEPKSCは、lgh647Fおよびlgh629Rをプライマー、8B5VL−CB3.1VH−VEPKSCを鋳型として用いることにより再増幅した。PCR産物をゲル精製して等モル比で共に混合し、次いで、H9およびlgh629Rをプライマーとして用いることにより増幅した。次いで、重複PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pCIneoベクター内にクローニングした。
8B5VL−CB3.1VH−VEPKSC構築物内において異なるC末端リンカーを作製するため、H9およびlgh646Rをプライマーとして用いることにより該構築物を再増幅した。C末端LGGCリンカーは、lgh646Rプライマー内に組み込んだ。次いで、PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pCIneoベクター内にクローニングした。
同じ戦略を用いて、CB3.1VL−8B5VH−LGGCを作製した。C末端LGGCリンカーは、lgh648Rプライマー内に組み込み、CB3.1VL−8B5VH−FNRGECを鋳型として用いた。次いで、PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pCIneoベクター内にクローニングした。
また同じ戦略を用いて、抗Flagタグ−8B5VL−CB3.1VH−LGGCを作製した。C末端LGGCリンカーは、lgh648Rプライマー内に組み込み、抗Flagタグ−8B5VL−CB3.1VH−VEPKSCを鋳型として用いた。次いで、PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pCIneoベクター内にクローニングした。
8B5VLは、H9およびlgh694Rをプライマー、ch8B5Lcを鋳型として用いることにより増幅した。8B5VHは、lgh695Fおよびlgh696Rをプライマー、ch8B5Hcを鋳型として用いることにより増幅した。リンカー配列は、プライマーlgh694Rおよびlgh695F内に組み込んだ。HuIgG1Fcは、lgh355Fおよびlgh366Rをプライマー、ch8B5Hcを鋳型として用いることにより増幅した。PCR産物をゲル精製して等モル比で共に混合し、次いで、H9およびlgh366Rをプライマーとして用いることにより増幅した。次いで、重複PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pCIneoベクター内にクローニングした。
リポフェクトアミン2000(Invitrogen社製)を用いて、構築物5および6、または6および7、または8および9、または9および10によりコードされる発現プラスミド(図30)を、HEK−293細胞内に同時トランスフェクトし、抗flagタグを伴うかまたは伴わない8B5−CB3.1 DARTを発現させた。3日毎に3回にわたり条件培地を回収した。次いで、CD32Bアフィニティーカラムを用いて条件培地を精製した。
ELISAは、以下の通りに実施した。4℃の炭酸緩衝液中で一晩にわたり、96ウェルMaxisorpプレート上に、50μl/ウェルで2ug/mlのCD32B−Fcをコーティングした。PBS−T(PBS、0.1% Tween 20)によりプレートを3回洗浄し、次いで、試験対象の単鎖Fc融合タンパク質を添加する前に、室温で30分間にわたり、PBS−T中において0.5%のBSAによりブロックした。ブロッキング時において、8B5−CB3.1 DARTを、2μg/mlに始まる2倍濃度の希釈系列で希釈した。25μl/ウェルで50ng/mlのch8B5と混合した25μl/ウェルの希釈したDARTを、希釈プレートからELISAプレートに移した。室温で1時間にわたりプレートをインキュベートした。PBS−Tによる3回の洗浄後、50μl/ウェルの1:10,000に希釈したHRPコンジュゲートF(ab’)2ヤギ抗ヒトIgG F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch社製)をプレートに添加した。プレートを室温で1時間にわたりインキュベートした。PBS−Tによりプレートを3回洗浄し、80ul/ウェルのTMB基質により発色させた。5分間のインキュベーション後、40μl/ウェルの1% H2SO4により反応を停止させた。96ウェルプレートリーダーおよびSOFTmaxソフトウェアを用いてOD450nmを読み取った。GraphPadPrism 3.03ソフトウェアを用いてリードアウトをプロットした(図31)。
4本のポリペプチド鎖を用いて、四価の抗原結合部位を有するIg様DARTを作製した(図32、図33)。Ig様DART分子種は、そのドメインが同じエピトープ(4個の同一の抗原分子に結合する能力がある四価のモノエピトープ特異的Ig様DARTを形成するように)または異なるエピトープもしくは抗原に結合するように設計し得るので、独自の特性を有する。例えば、そのドメインを、同じ抗原の2個のエピトープ(四価で単一抗原特異的なバイエピトープ特異的Ig様DARTを形成するように)または異なる抗原分子のエピトープ(第1の抗原に対して特異的な結合部位の対と、第2の抗原に対して特異的な第2の結合部位の対とを有する四価のIg様DARTを形成するように)に結合するように設計することができる。このような属性の組合せを有するハイブリッド分子を容易に作製することができる。
CD79VL−CD32BVH(配列1)、CD32BVL−CD79VH−1(配列2)、およびCD32BVL−CD79VH−2(配列3)をコードする遺伝子を、発現ベクターpEE13内にクローニングした結果、それぞれ、発現構築物1、2、および3がもたらされた。構築物1の発現プラスミドを、発現プラスミド2または3と共にHEK−293細胞内に同時トランスフェクトし、それぞれ、CD32B−CD79−1およびCD32B−CD79−2の二重特異性ダイアボディを作製した。3日毎に3回にわたり条件培地を回収した。次いで、CD32Bアフィニティーカラムを用いて条件培地を精製した。
Claims (131)
- 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第1のポリペプチド鎖は、(i) 第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第1のドメイン、(ii) 第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第2のドメイン、および(iii) Fcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含んでなり、第1のドメインと第2のドメインが共有結合で連結されているが、第1のドメインと第2のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく;
第2のポリペプチド鎖は、(i) 第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2)を含む第4のドメイン、(ii) 第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1)を含む第5のドメイン、および(iii) Fcドメインを含む第6のドメインを含んでなり、第4のドメインと第5のドメインが共有結合で連結されているが、第4のドメインと第5のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく;
ここにおいて、第1のドメインと第5のドメインが会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており;さらに、第2のドメインと第4のドメインが会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位(VL2)(VH2)を形成している;
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。 - 第3のドメインがヒンジドメインをさらに含む、請求項1に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第1のポリペプチド鎖は、(i) 第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第1のドメイン、(ii) 第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第2のドメイン、および(iii) ヒンジドメインとFcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含んでなり、第1のドメインと第2のドメインが共有結合で連結されているが、第1のドメインと第2のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく;
第2のポリペプチド鎖は、(i) 第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2)を含む第4のドメイン、(ii) 第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1)を含む第5のドメイン、および(iii) ヒト軽鎖定常ドメインのC末端の少なくとも2〜8アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む第6のドメインを含んでなり、第4のドメインと第5のドメインが共有結合で連結されているが、第4のドメインと第5のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく;
ここにおいて、第1のドメインと第5のドメインが会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており;
第2のドメインと第4のドメインが会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位(VL2)(VH2)を形成している;
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。 - 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第1のポリペプチド鎖は、(i) 第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第1のドメイン、(ii) 第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第2のドメイン、および(iii) ヒンジドメインを含む第3のドメインを含んでなり、第1のドメインと第2のドメインが共有結合で連結されているが、第1のドメインと第2のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく;
第2のポリペプチド鎖は、(i) 第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2)を含む第4のドメイン、(ii) 第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1)を含む第5のドメイン、および(iii) ヒト軽鎖定常ドメインのC末端の少なくとも2〜8アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む第6のドメインを含んでなり、第4のドメインと第5のドメインが共有結合で連結されているが、第4のドメインと第5のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく;
ここにおいて、第1のドメインと第5のドメインが会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており;
第2のドメインと第4のドメインが会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位(VL2)(VH2)を形成している;
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。 - ヒト軽鎖がヒトκ軽鎖である、請求項3または4に記載のダイアボディ分子。
- ヒト軽鎖がλ軽鎖である、請求項3または4に記載のダイアボディ分子。
- 第6のドメインがC末端の6アミノ酸のアミノ酸配列を含み、該配列がPheAsnArgGlyGluCys(配列番号23)である、請求項5に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖が、第1のポリペプチド鎖上の第1ドメインと第2ドメインの外側の少なくとも1個のシステイン残基と、第2のポリペプチド鎖上の第4ドメインと第5ドメインの外側の少なくとも1個のシステイン残基の間の少なくとも1個のジスルフィド結合を介して共有結合で連結されている、請求項1、2、3または4に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖上のシステイン残基が第3のドメインにあり、第2のポリペプチド鎖上のシステイン残基が第6のドメインにある、請求項8に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第1のポリペプチド鎖は、(i) 第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第1のドメイン、(ii) 第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第2のドメイン、および(iii) Fcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含んでなり、第1のドメインと第2のドメインが共有結合で連結されているが、第1のドメインと第2のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく;
第2のポリペプチド鎖は、(i) 第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2)を含む第4のドメイン、および(ii) 第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1)を含む第5のドメインを含んでなり、第4のドメインと第5のドメインが共有結合で連結されているが、第4のドメインと第5のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく;
ここにおいて、第1のドメインと第5のドメインが会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており;
第2のドメインと第4のドメインが会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位(VL2)(VH2)を形成しており;そして
第3のドメインが第1のドメインと第2のドメインの両方のN末端側にある;
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。 - 第3のドメインがヒンジ領域をさらに含む、請求項10に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖が、第1のポリペプチド鎖上の第1ドメインと第2ドメインの外側の少なくとも1個のシステイン残基と、第2のポリペプチド鎖上の第4ドメインと第5ドメインの外側の少なくとも1個のシステイン残基の間の少なくとも1個のジスルフィド結合を介して共有結合で連結されている、請求項10または11に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖上の前記少なくとも1個のシステイン残基が第1ドメイン、第2ドメインおよび第3ドメインのC末端側にあり、第2のポリペプチド鎖上の前記少なくとも1個のシステイン残基が第4ドメインおよび第5ドメインのC末端側にある、請求項12に記載のダイアボディ分子。
- 前記分子が野生型第1ドメインに対して第1ドメインの少なくとも1個のアミノ酸改変と、野生型第5ドメインに対して第5ドメインの少なくとも1個のアミノ酸改変を含み、第1ドメインと第5ドメインのそれぞれにおける該少なくとも1個のアミノ酸改変がシステインによる置換を含んでなり、その結果第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖が、第1ドメイン中の置換システイン残基と第5ドメイン中の置換システイン残基の間のジスルフィド結合を介して共有結合で連結される、請求項1、3または10に記載のダイアボディ分子。
- Fcドメインが野生型Fcドメインに対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がアラニンによる215位の置換を含んでなる、請求項1、3または10に記載のダイアボディ分子。
- 前記分子が2つの単量体からなり、各単量体が第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含んでなり、該単量体同士が各単量体の第1のポリペプチド鎖の第3ドメイン中の少なくとも1個のシステイン残基間の少なくとも1個のジスルフィド結合を介して共有結合で連結される、請求項3、10または11に記載のダイアボディ分子。
- 第1ドメインと第4ドメインがそれぞれ第2ドメインおよび第5ドメインのN末端側に位置する、請求項1、3または10に記載のダイアボディ分子。
- 第1ドメインと第4ドメインがそれぞれ第2ドメインおよび第5ドメインのC末端側に位置する、請求項1、3または10に記載のダイアボディ分子。
- 第6ドメインが第4ドメインおよび第5ドメインのC末端側にある、請求項1または2に記載のダイアボディ分子。
- 第1および第2ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、請求項1、3、4または10に記載のダイアボディ分子。
- 第4および第5ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、請求項1、3、4または10に記載のダイアボディ分子。
- 第1および第2ドメインが0、1、2、3、4、5、6、7、8または9アミノ酸残基により分離されている、請求項20に記載のダイアボディ分子。
- 第4および第5ドメインが0、1、2、3、4、5、6、7、8または9アミノ酸残基により分離されている、請求項21に記載のダイアボディ分子。
- 第1および第2のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第1のポリペプチド鎖は、(i) 第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第1のドメイン、および(ii) 第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第2のドメインを含んでなり、第1のドメインと第2のドメインが共有結合で連結されているが、第1のドメインと第2のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく;
第2のポリペプチド鎖は、(i) 第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2)を含む第3のドメイン、および(ii) 第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1)を含む第4のドメインを含んでなり、第3のドメインと第4のドメインが共有結合で連結されているが、第3のドメインと第4のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく;
ここにおいて、第1のドメインと第3のドメインが会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており、該エピトープ結合部位はCD32Bに対して特異的であり;
第2のドメインと第4のドメインが会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位(VL2)(VH2)を形成しており、該エピトープ結合部位は CD16に対して特異的であり;そして
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖が、第1のポリペプチド鎖上の第1ドメインと第2ドメインの外側の少なくとも1個のシステイン残基と、第2のポリペプチド鎖上の第3ドメインと第4ドメインの外側の少なくとも1個のシステイン残基の間のジスルフィド結合を介して共有結合で連結されており、第1のポリペプチド鎖上の該システイン残基は第1のポリペプチド鎖のC末端にはなく、また第2のポリペプチド鎖上の該システイン残基は第2のポリペプチド鎖のC末端にはない;
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。 - 第1および第2ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、請求項24に記載のダイアボディ分子。
- 第3および第4ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、請求項24に記載のダイアボディ分子。
- ジスルフィド結合が第1のポリペプチド鎖上の少なくとも2個のシステイン残基と第2のポリペプチド鎖上の少なくとも2個のシステイン残基の間にある、請求項24に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープと第2のエピトープが異なるものである、請求項1、3、4、10または24に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープと第2のエピトープが同一分子に由来するエピトープである、請求項28に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープと第2のエピトープが異なる分子に由来するエピトープである、請求項28に記載のダイアボディ分子。
- 第1の免疫グロブリンまたは第2の免疫グロブリンがヒトまたはヒト化免疫グロブリンである、請求項1、3、4、10または24に記載のダイアボディ分子。
- 第1の免疫グロブリンまたは第2の免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンであり、該ヒト免疫グロブリンがIgA、IgE、IgD、IgGまたはIgMである、請求項31に記載のダイアボディ分子。
- ヒト免疫グロブリンがIgGであり、該IgGがIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される、請求項32に記載のダイアボディ分子。
- FcドメインがヒトFcドメインである、請求項1、3または10に記載のダイアボディ分子。
- FcドメインがIgA、IgE、IgD、IgGまたはIgMのFcドメインである、請求項34に記載のダイアボディ分子。
- FcドメインがIgGのFcドメインであり、該IgGがIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される、請求項35に記載のダイアボディ分子。
- 少なくとも1つのエピトープ結合部位がB細胞、T細胞、食細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、または樹状細胞に対して特異的である、請求項1、3、4または10に記載のダイアボディ分子。
- 少なくとも1つのエピトープ結合部位が細胞表面マーカーに対して特異的である、請求項1、3、4または10に記載のダイアボディ分子。
- 細胞表面マーカーがFc受容体である、請求項38に記載のダイアボディ分子。
- Fc受容体が活性化性Fc受容体である、請求項39に記載のダイアボディ分子。
- Fc受容体が抑制性Fc受容体である、請求項39に記載のダイアボディ分子。
- Fc受容体がFcγ受容体である、請求項39に記載のダイアボディ分子。
- Fcγ受容体がFcγRI、FcγRIIまたはFcγRIII受容体である、請求項42に記載のダイアボディ分子。
- Fcγ受容体がFcγRIII受容体であり、該FcγRIII受容体がFcγRIIIA(CD16A)受容体またはFcγRIIIB(CD16B)受容体である、請求項43に記載のダイアボディ分子。
- FcγRIII受容体がFcγRIIIA(CD16A)受容体である、請求項44に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープ結合部位を構成するVL1領域とVH1領域が第1の免疫グロブリンに由来し、該免疫グロブリンが抗体3G8である、請求項42に記載のダイアボディ分子。
- 第2のエピトープ結合部位を構成するVL1領域とVH1領域が第2の免疫グロブリンに由来し、該免疫グロブリンが抗体3G8である、請求項24に記載のダイアボディ分子。
- 抗体3G8がヒト化されている、請求項46に記載のダイアボディ分子。
- 抗体3G8がヒト化されている、請求項47に記載のダイアボディ分子。
- VL1領域が配列番号73のアミノ酸配列を含み、VH1領域が配列番号71のアミノ酸配列を含む、請求項48に記載のダイアボディ分子。
- VL1領域が配列番号73のアミノ酸配列を含み、VH1領域が配列番号71のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載のダイアボディ分子。
- Fcγ受容体がFcγRII受容体であり、該FcγRII受容体がFcγRIIA(CD32A)受容体またはFcγRIIB(CD32B)受容体である、請求項43に記載のダイアボディ分子。
- FcγRII受容体がFcγRIIA(CD32A)受容体である、請求項52に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープ結合部位を構成するVL1領域とVH1領域が第1の免疫グロブリンに由来し、該免疫グロブリンが抗体IV.3である、請求項53に記載のダイアボディ分子。
- 抗体IV.3がヒト化されている、請求項54に記載のダイアボディ分子。
- FcγRII受容体がFcγRIIB(CD32B)受容体である、請求項53に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープ結合部位を構成するVL1領域とVH1領域が第1の免疫グロブリンに由来し、該免疫グロブリンが抗体2B6である、請求項56に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープ結合部位を構成するVL1領域とVH1領域が第1の免疫グロブリンに由来し、該免疫グロブリンが抗体2B6である、請求項24に記載のダイアボディ分子。
- 抗体2B6がヒト化されている、請求項57に記載のダイアボディ分子。
- 抗体2B6がヒト化されている、請求項58に記載のダイアボディ分子。
- VL1領域が配列番号41、配列番号42、配列番号43のアミノ酸配列を含み、VH1領域が配列番号40のアミノ酸配列を含む、請求項59に記載のダイアボディ分子。
- VL1領域が配列番号41、配列番号42、配列番号43のアミノ酸配列を含み、VH1領域が配列番号40のアミノ酸配列を含む、請求項60に記載のダイアボディ分子。
- VL1領域が野生型2B6 VL1領域に対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がシステインによる105位の置換からなり、かつVH1領域が野生型2B6 VH1領域に対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がシステインによる44位の置換からなる、請求項59に記載のダイアボディ分子。
- VL1領域が野生型2B6 VL1領域に対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がシステインによる105位の置換からなり、かつVH1領域が野生型2B6 VH1領域に対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がシステインによる44位の置換からなる、請求項60に記載のダイアボディ分子。
- 第2のエピトープ結合部位が病原性抗原に対して特異的である、請求項42に記載のダイアボディ分子。
- 病原性抗原が腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または自己免疫抗原である、請求項65に記載のダイアボディ分子。
- 病原性抗原が細菌抗原である、請求項66に記載のダイアボディ分子。
- 細菌抗原がリポ多糖である、請求項67に記載のダイアボディ分子。
- 病原性抗原がウイルス抗原である、請求項66に記載のダイアボディ分子。
- ウイルス抗原がヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルスおよび肝炎ウイルスに由来する抗原からなる群より選択される、請求項69に記載のダイアボディ分子。
- 病原性抗原が自己免疫抗原である、請求項66に記載のダイアボディ分子。
- 自己免疫抗原がDNA、RNAおよびコラーゲンからなる群より選択される、請求項71に記載のダイアボディ分子。
- 第2のエピトープ結合部位が毒素に対して特異的である、請求項38に記載のダイアボディ分子。
- 第2のエピトープ結合部位が薬物に対して特異的である、請求項38に記載のダイアボディ分子。
- 第2のエピトープ結合部位が毒素に対して特異的である、請求項39に記載のダイアボディ分子。
- 第2のエピトープ結合部位が薬物に対して特異的である、請求項39に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的で、第2のエピトープ結合部位がCD16Aに特異的である、請求項1に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープ結合部位がCD16Aに特異的で、第2のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的である、請求項3に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープ結合部位がCD16Aに特異的で、第2のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的である、請求項4に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的で、第2のエピトープ結合部位がCD16Aに特異的である、請求項10に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的で、第2のエピトープ結合部位がCD16Aに特異的である、請求項11に記載のダイアボディ分子。
- 第1のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的で、第2のエピトープ結合部位がCD16Aに特異的である、請求項24に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖が配列番号14のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖が配列番号15のアミノ酸配列を含む、請求項77に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖が配列番号18のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖が配列番号16のアミノ酸配列を含む、請求項78に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖が配列番号19のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖が配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項81に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖が配列番号20のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖が配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項80に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖が配列番号9のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖が配列番号11のアミノ酸配列を含む、請求項82に記載のダイアボディ分子。
- 第1のポリペプチド鎖が配列番号11のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖が配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項82に記載のダイアボディ分子。
- 第3のドメインが変異型Fc領域を含み、該変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1つのアミノ酸改変を含んでなる、請求項1、3、4または 10に記載のダイアボディ分子。
- 前記改変がFc領域とFc受容体間の結合親和性を改変させる、請求項89に記載のダイアボディ分子。
- 前記改変がFc領域とFc受容体間の結合をゼロにする、請求項90に記載のダイアボディ分子。
- 請求項1、3、4、10または24に記載のダイアボディ分子の第1のポリペプチド鎖または第2のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
- 請求項1、3、4、10または24に記載のダイアボディ分子の第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
- 請求項92に記載の核酸を含有するベクター。
- 請求項93に記載の核酸を含有するベクター。
- 発現ベクターである、請求項94に記載のベクター。
- 発現ベクターである、請求項95に記載のベクター。
- 請求項94に記載の核酸を含有する宿主細胞。
- 請求項95に記載の核酸を含有する宿主細胞。
- ダイアボディ分子の組換え生産方法であって、
a. 請求項98に記載の宿主細胞を、ダイアボディ分子の発現に好適な条件下に培地中で培養し、
b. 該培地からダイアボディ分子を回収する、
ことを含んでなる上記方法。 - ダイアボディ分子の組換え生産方法であって、
a. 請求項98に記載の宿主細胞を、ダイアボディ分子の発現に好適な条件下に培地中で培養し、
b. 該培地からダイアボディ分子を回収する、
ことを含んでなる上記方法。 - 病原性抗原により特徴づけられる疾患または障害の治療方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項66に記載のダイアボディ分子を投与することを含んでなり、該ダイアボディ分子が該病原性抗原と結合するものである、上記方法。
- 前記疾患または障害が癌である、請求項102に記載の方法。
- 前記疾患または障害が感染性疾患である、請求項102に記載の方法。
- 病原性抗原に対する免疫寛容の誘発方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項66に記載のダイアボディ分子を投与することを含んでなる上記方法。
- 解毒方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項73に記載のダイアボディ分子を投与することを含んでなる上記方法。
- 解毒方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項74に記載のダイアボディ分子を投与することを含んでなる上記方法。
- 第1のエピトープと第2のエピトープが異なる細胞に由来するものである、請求項28に記載のダイアボディ分子。
- Fcドメイン部分がCH2欠失部分からなる、請求項1、3または10に記載のダイアボディ分子。
- Fcドメイン部分がCH3欠失部分からなる、請求項1、3または10に記載のダイアボディ分子。
- 前記分子が二量体であり、該二量体が
(a) 前記第1のポリペプチド鎖と前記第2のポリペプチド鎖の対からなる第1の単量体、および
(b) 前記第1のポリペプチド鎖と前記第2のポリペプチド鎖の対からなる第2の単量体、
からなり、第1および第2の単量体が各単量体の第1のポリペプチド鎖の第3ドメイン中の少なくとも1個のシステイン残基間の少なくとも1つのジスルフィド結合を介して共有結合で連結されている、請求項3、10または11に記載のダイアボディ分子。 - 第1の単量体と第2の単量体が同一のものである、請求項111に記載のダイアボディ分子。
- 第1の単量体と第2の単量体が異なるものである、請求項112に記載のダイアボディ分子。
- 二重親和性再標的化試薬(DART)。
- 複数の親和性を共に連関させる、請求項114に記載のDART。
- huCD32B、huCD16A、huCD16B、ハプテン、またはフルオレセインに対する親和性を有する、請求項114に記載のDART。
- 患者におけるB細胞悪性疾患を治療する方法であって、前記患者に請求項114から116のいずれかに記載の有効量のDARTを投与することを含む、方法。
- 前記B細胞悪性疾患の少なくとも一部のB細胞が、CD20を発現しないか、またはリツキサン(登録商標)抗CD20抗体による治療に対して耐性となっている、請求項117に記載の方法。
- 第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖を含むダイアボディ分子であって、
(A)前記第1のポリペプチド鎖は、
(i)エピトープ(1)に特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン(VL1)の結合領域を含むドメイン(A)、
(ii)エピトープ(2)に特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン(VH2)の結合領域を含むドメイン(B)、および
(iii)軽鎖定常領域(CL)ドメインまたはその一部を含むドメイン(C)
を含み、
(B)前記第2のポリペプチド鎖は、
(i)前記エピトープ(2)に特異的な第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン(VL2)の結合領域を含むドメイン(D)、
(ii)前記エピトープ(1)に特異的な第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン(VH1)の結合領域を含むドメイン(E)、
(iii)重鎖定常領域1(CH1)ドメインまたはその一部を含むドメイン(F)、および
(iv)重鎖定常領域2(CH2)と重鎖定常領域3(CH3)のヒンジ領域
を含み、
前記ドメイン(A)と(B)は互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはなく、
前記ドメイン(D)と(E)は互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはなく、
前記ドメイン(A)と(E)は会合して前記エピトープ(1)に結合する結合部位を形成し、前記ドメイン(B)と(D)は会合して前記エピトープ(2)に結合する結合部位を形成し、また、
前記ドメイン(C)と(F)はジスルフィド結合を介して一緒に会合してCH1ドメインまたはその一部を形成する、ダイアボディ分子。 - 第3のポリペプチド鎖および第4のポリペプチド鎖をさらに含み、
(A)前記第3のポリペプチド鎖は、
(i)エピトープ(3)に特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン(VL1)の結合領域を含むドメイン(G)、
(ii)エピトープ(4)に特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン(VH2)の結合領域を含むドメイン(H)、および
(iii)軽鎖定常領域(CL)ドメインまたはその一部を含むドメイン(I)
を含み、
(B)前記第4のポリペプチド鎖は、
(i)前記エピトープ(4)に特異的な第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン(VL2)の結合領域を含むドメイン(J)、
(ii)前記エピトープ(3)に特異的な第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン(VH1)の結合領域を含むドメイン(K)、
(iii)重鎖定常領域1(CH1)ドメインまたはその一部を含むドメイン(L)
を含み、
前記ドメイン(G)と(H)は互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはなく、
前記ドメイン(J)と(K)は互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはなく、
前記ドメイン(G)と(K)は会合して前記エピトープ(3)に結合する結合部位を形成し、前記ドメイン(H)と(J)は会合して前記エピトープ(4)に結合する結合部位を形成し、
前記ドメイン(I)と(L)はジスルフィド結合を介して一緒に会合してCH1ドメインまたはその一部を形成し、また、
前記第2および第4のポリペプチド鎖の前記ヒンジ領域、重鎖定常領域2(CH2)、および前記重鎖定常領域3(CH3)は会合してFc領域を形成する、請求項119に記載のダイアボディ分子。 - 前記エピトープ(1)と(3)がどちらも抗原分子上に存在する、請求項120に記載のダイアボディ分子。
- 前記エピトープ(1)と(3)が同一である、請求項120に記載のダイアボディ分子。
- 前記エピトープ(2)と(4)がどちらも抗原分子上に存在する、請求項120に記載のダイアボディ分子。
- 前記エピトープ(2)と(4)が同一である、請求項120に記載のダイアボディ分子。
- 少なくとも1つのエピトープが、病原体抗原、自己免疫抗原、毒素、薬物のエピトープである、請求項119または120に記載のダイアボディ分子。
- 少なくとも1つのエピトープがCD32Bであり、少なくとも1つのエピトープがCD16Aである、請求項119または120に記載のダイアボディ分子。
- 請求項119に記載の第1および第2のポリペプチド鎖をコードする核酸分子。
- 請求項120に記載の第1、第2、第3および第4のポリペプチド鎖をコードする核酸分子。
- 病原性抗原によって特徴づけられる疾患または障害を治療するための方法であって、前記病原性抗原に結合するエピトープ結合部位を有する、有効量の請求項119または120に記載のダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
- 複数のポリペプチド鎖からなり、同時に2個、3個またはそれ以上のエピトープに結合する能力がある、二重親和性再標的化試薬(「DART」)。
- 二価、四価、六価、または八価である、請求項130に記載の二重親和性再標的化試薬(「DART」)。
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