JP2022517549A - 二価の二重特異性抗体およびその製造方法、コードする遺伝子、宿主細胞、組成物 - Google Patents

Abstract

二価の二重特異性抗体およびその製造方法、コードする遺伝子、宿主細胞、組成物が提供される。該二価の二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖ、フレキシブルペプチド、ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ１およびヒンジ領域の一部の配列と、ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖおよび軽鎖定常領域ＣＬ、即ちｓｃＦｖ１－ＣＬ或いはＣＬ－ｓｃＦｖ１とを含む、あるいはｃ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と、ｄ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖とを含む。

Description

この出願は、２０１８年１２月２８日に中国特許庁へ出願された、出願番号２０１８１１６２２０６９．２、発明の名称「二価の二重特異性抗体及びその製造方法、コードする遺伝子、宿主細胞、組成物」の中国特許出願に基づく優先権を主張し、その全内容を援用により本出願に組み込まれる。

本発明は抗体医薬技術分野に関し、特に、二価の二重特異性抗体およびその製造方法、コードする遺伝子、宿主細胞、組成物に関する。

二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＢｓＡｂ）は人工的に作られた２つの異なる抗原に同時に結合できる特殊な抗体である二。二重特異性抗体は、腫瘍標的細胞および免疫エフェクター細胞を同時に認識することができるため、抗体特異性とエフェクター細胞の細胞傷害作用を媒介するという二重の機能を持っている。二重特異性抗体は、エフェクター細胞を腫瘍部位に集め、そしてエフェクター細胞を活性化して抗腫瘍効果を発揮させることができる。それが腫瘍細胞を死滅させる作用機構は、細胞増殖、サイトカイン放出、細胞傷害性ポリペプチドおよび酵素の調節を含む。インビボおよび臨床研究にて実証されるように、二重特異性抗体が介した免疫治療は、一部の動物に対して腫瘍を寛解させ、臨床的に腫瘍患者の病状を軽減し、寿命を延ばすことができる。したがって、二重特異性抗体が介した免疫担当細胞は腫瘍の治療への応用が良い見通しがある。

二重特異性抗体は、自然状態で存在せず、人工的にしか調製できない。当該分野において、二重または多重特異性抗体は、２つ以上の抗原に結合することができ、細胞融合、化学的コンジュゲーションや組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。近年では、例えばＩｇＧ抗体形態と一本鎖ドメインを融合した四価二重特異性抗体など、様々な組換え二重特異性抗体の形態が広く開発されている（例えば、Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（１９９７）１５９－１６３；ＷＯ２００１０７７３４２；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２３３－１２３４を参照）。さらに、抗体の中心構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）が二重抗体、３本鎖抗体、またはいは４本鎖抗体、ミニボディおよび幾つの一本鎖のような形態などをもはや維持しない、二つ以上の抗原に結合可能な他の多くの新規形態も開発された（ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ）（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（２００５）１１２６－１１３６；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｎ．，およびＬｅｇｅｒ，Ｏ．，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３－１４；Ｓｈｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｉｃａ１ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１８（２００７）６５－７４；Ｗｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２９０－１２９７）。

１つのアプローチでは、天然の抗体によく似た二重特異性抗体が、その二重特異性抗体の所望の特異性を持つマウスモノクローナル抗体を発現する２つの異なるハイブリドーマ細胞系の体細胞融合に基づく細胞ハイブリドーマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．およびＡ．Ｃ．Ｃｕｅ１１ｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５（１９８３）５３７－４０に参照）を使って生産された。産生された細胞ハイブリドーマ細胞株における二つの異なる抗体の重鎖と軽鎖がランダムにペアリングするので、最大で１０種類の異なる抗体種が生成するが、所望の二重特異性を有する抗体はそのうちの１つだけである。ミスマッチした副生成物の存在および著しい生産収量の低減ゆえに、洗練された精製プロセスが必要になる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２５（２００７）１２３３－１２３４参照）。一般に、組換え発現技術を使用すると、同様なミスマッチした副生成物の問題は残る。

ミスマッチした副生成物の問題を克服するための、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏ１ｅｓ）」と呼ばれるものが知られているアプローチでは、ＣＨ３ドメインに突然変異を導入して接触境界面を修飾することによって、２つの異なる抗体重鎖をペアリングさせることを目指す。一方の鎖において、「ホール」を作り出すために、嵩高いアミノ酸を短い側鎖を持つアミノ酸で置き換えられた。逆に、他方のＣＨ３ドメインには、「ノブ」を作り出すために、大きな側鎖を持つアミノ酸が導入された。これら２本の重鎖を共発現させることにより、ホモ二量体の形態（「ホール一ホール」または「ノブ-ノブ」）と比較し、高収率のヘテロ二量体の形成（「ノブ－ホール」）が観察された（Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．およびＷＯ １９９６０２７０１１）。ヘテロ二量体のパーセンテージは、ファージディスプレイアプローチを用いて２つのＣＨ３ドメインの相互作用面をリモデリングすることと、ジスルフィド結合を導入して当該ヘテロ二量体を安定化させることとによって、さらに増加させることができた（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，など，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６ （１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）。この策略の重要な制約は、ミスマッチおよび不活性化分子の形成を防ぐために、両方の親抗体の軽鎖が同一でなければならないことである。

「ノブ・イントゥ・ホール」構造のほかに、ＩｇＧとＩｇＡとのＣＨ３の鎖交換（ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ドメイン，ＳＥＥＤ）技術により異なる半抗体のＦｃペアリングを達成することもできる（Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，プロテイン Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２０１０，２３（４）：１９５－２０２．）。

異なる軽鎖の正確なアセンブル問題を解決するために、近年、二重細胞系でそれぞれの半抗体を発現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブルの新たなプロセスが開発された。ＧｅｎＭａｂ社は、ヒトＩｇＧ４抗体が生理条件で自然に発生する半抗体のランダム交換プロセスの示唆下で、Ｆａｂアーム交換（Ｆａｂ－ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ、ＦＡＥ）二重機能抗体技術を開発した（Ｇｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｊ，ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ２０１３，５（６）：９６２－９７３．）。二つの目的抗体ＩｇＧ１の重鎖ＣＨ３領域へそれぞれＫ４０９ＲおよびＦ４０５Ｌの二つの点突然変異を導入すると、ＩｇＧ４抗体に類似する半抗体の交換再配列を形成できる。突然変異後の二つの異なるＩｇＧ１抗体は二つのＣＨＯ細胞系でそれぞれ発現し半抗体の軽鎖と重鎖との間のアセンブルが完了し、プロテインＡによるアフィニティー精製後、温和な酸化剤システムによってｉｎ ｖｉｔｒｏで異種半抗体同士の正確なアセンブルを実現できる。

同じ配列の軽鎖を共用したり、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブルを実行したりするだけでなく、Ｃｒｏｓｓｍａｂテクノロジーにより抗体の軽鎖の正確なアセンブルを促進することもできる。代表的な製品は、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社のＡｎｇ－２／ＶＥＧＦ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＣＨ１－ＣＬである。Ｃｒｏｓｓｍａｂテクノロジーは、「ノブ・イントゥ・ホール」交換に基づいて、Ａｎｇ－２抗体のＦａｂドメインにおけるＣＬとＣＨ１とを互いに置き換え、ＶＥＧＦ抗体のＦａｂ構造が変化しないことである。改造されたＡｎｇ－２抗体の軽鎖は、ＶＥＧＦ抗体の重鎖とのミスマッチが起こしにくく、また「ノブ・イントゥ・ホール」構造は２本の重鎖のヘテロ二量体化を促進することができる（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１１，１０８（２７）：１１１８７－１１１９２．）。

また、２つの一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または２つのＦａｂをペプチドセグメントで連結、二重機能性抗体断片を形成されることも可能である。代表的な製品は、ドイツのＭｉｃｒｏｍｅｔ社によって開発されたＢｉＴＥ（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）シリーズである。当該一連のシリーズの製品は、ペプチドセグメントを介して抗ＣＤ３一本鎖抗体を異なる抗腫瘍細胞表面抗原の一本鎖抗体と結合して得られたものである（Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００９，６９（１２）：４９４１－４９４４．）。このタイプの抗体は、構造的な利点は分子量が低く、原核細胞で発現でき、正確なアセンブルの問題を考慮する必要がないことであり、欠点はが、抗体Ｆｃセグメントがないため、対応する生物学的な機能を仲介できなく、半減期が短いなどのことである。

公開番号ＵＳ２０１５／０２８４４７５Ａ１およびＣＮ１０１８９６５０４Ａの特許には、二価の二重特異性抗体が開示されるが、その二つの特許に記載の二価の二重特異性抗体と抗原との親和力は低い。前記の二つの特許における二価の二重特異性抗体は、邵長利による発表された「フレキシブル鎖に基づいて連結した二重特異性抗体分子の設計および構造シミュレーション」におけるフレキシブルペプチド構造によって変更されたが、抗体の親和力は依然として理想的ではない。

上記の二重特異性抗体技術プラットフォームの軽鎖のミスマッチ、軽鎖と重鎖との正確なアセンブルの精度が低く、あるいは分子が大きすぎたり小さすぎたりするなどの問題は、新規の二価の二重特異性抗体を発明する必要ことがある。

上述の問題に鑑みて、本発明は二価の二重特異性抗体およびその製造方法、コードする遺伝子、宿主細胞、組成物を提供する。当該抗体は、軽鎖と重鎖との正確なアセンブルの精度が高く、かつ分子の大きさが適当である。

上述の発明の目的を達成するために、本発明は以下の技術案を提供する。

本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖ、フレキシブルペプチド、ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ１およびヒンジ領域の一部の配列、即ち、ＣＨ１－ｐａｒｔｉａｌ ｈｉｎｇｅ（ヒンジ領域の一部の配列）－ｌｉｎｋｅｒ（フレキシブルペプチド）－ｓｃＦｖ２或いはｓｃＦｖ２－ｌｉｎｋｅｒ－ＣＨ１－ｐａｒｔｉａｌ ｈｉｎｇｅと、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖおよび軽鎖定常領域ＣＬ、即ちｓｃＦｖ１－ＣＬ或いはＣＬ－ｓｃＦｖ１と、を含み、
あるいは
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と、
ｄ）軽鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーに連結し、重鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーを介して重鎖のＦｃ断片に連結する、第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と、を含む、二価の二重特異性抗体を提供する。

好ましくは、フレキシブルペプチドが（Ｇ４Ｓ／Ｇ４ＳＡＳ）ｎ、０又は０より大きい整数であるｎであり、かつフレキシブルペプチドに連結するＩｇＧ１ヒンジ領域の一部の配列がＥＰＫＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）であり。ここで、（Ｇ４Ｓ／Ｇ４ＳＡＳ）ｎは（Ｇ４Ｓ）ｎ又は（Ｇ４ＳＡＳ）ｎを示し、ｎは０又は０より大きい整数である。

リンカーがＬ／ＧＧＧＣ（Ｌ／ＧＧＧＣはＬＧＧＣ或いはＧＧＧＣを示す）であり、かつリンカーに連結する重鎖ヒンジ領域の第１システイン残基（Ｃ）突然変異がセリン（Ｓ）である。

好ましくは、ａ）およびｂ）ステップにおいて、ＣＬおよびＣＨ１がヘテロ二量体を形成することができ、ＣＬの末端システイン残基が重鎖のヒンジ領域のシステイン残基とジスルフィド結合を形成することができる。

好ましくは、ｃ）およびｄ）ステップにおいて、そのうちの１つの重鎖のリンカーＬ／ＧＧＧＣと１つの軽鎖のリンカーＬ／ＧＧＧＣとの末端システイン残基がジスルフィド結合を形成することができ、またそのうちの１つの重鎖のＣＨ３ドメインと他の重鎖のＣＨ３ドメインが二価の二重特異性抗体の構造の形成を促進するように変更される。

好ましくは、変更が
ａ）二価の二重特異性抗体の第２の重鎖のＣＨ３ドメインのオリジナル界面と接触する第１の重鎖のＣＨ３ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基が元のアミノ酸残基よりも体積が大きいアミノ残基に置換され、第１の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に突起を生じ、当該突起は、第２の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の凹みに位置決定できる、第１の重鎖のＣＨ３ドメインの変更であり、かつ
ｂ）二価の二重特異性抗体の第１の重鎖のＣＨ３ドメインのオリジナル界面と接触する第２の重鎖のＣＨ３ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基が元のアミノ酸残基よりも体積が小さいアミノ酸残基に置換され、第２の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に凹みを生じ、当該凹みは、第１の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の突起を位置決定できる、第２の重鎖のＣＨ３ドメインの変更であり、
ここで、第１の重鎖可変領域と軽鎖可変領域はそれぞれ（Ｇ４Ｓ／Ｇ４ＳＡＳ）ｎとＬ／ＧＧＧＣに連結し、かつ二つのＬ／ＧＧＧＣのシステイン残基間でジスルフィド結合を形成する。

好ましくは、元のアミノ酸残基より体積の大きいアミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｐ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群より選ばれる。

元のアミノ酸残基より体積の小さいアミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、およびバリン（Ｖ）からなる群より選ばれる。

好ましくは、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖ、フレキシブルペプチド、ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ１およびヒンジ領域の一部の配列、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖおよび軽鎖定常領域ＣＬ、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列と、を含み、
あるいは
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるアミノ酸配列と、
ｄ）軽鎖可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーに連結し、重鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーを介して重鎖Ｆｃ断片に連結する、第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列とを含む、二価の二重特異性抗体を提供する。

さらに、本発明は、
ａ）以下のベクターで宿主細胞を形質転換するステップと、
第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントおよび重鎖定常領域ＣＨ１をコードする核酸分子を含む第１のベクター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をコードする遺伝子を含む）と、
第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントおよび軽鎖定常領域をコードする核酸分子を含む第２のベクター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１をコードする遺伝子を含む）、
あるいは、
第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸分子を含む第３のベクター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４をコードする遺伝子を含む）と、
第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸分子を含む第４のベクター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５をコードする遺伝子を含む）と、
第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸分子を含むベクターであって、軽鎖の可変領域がリンカーに連結する第５のベクター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５をコードする遺伝子を含む）と、
第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸分子を含むベクターであって、重鎖の可変領域がリンカーを介して重鎖Ｆｃ断片に連結する第６のベクター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６をコードする遺伝子を含む）、
ｂ）抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養するステップと、
ｃ）前記抗体分子を培養物から回収するステップと、
を含む、当該二価の二重特異性抗体の製造方法を提供する。

さらに、本発明は、
第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖ、フレキシブルペプチド、ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ１およびヒンジ領域の一部の配列をコードする第１核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をコードする遺伝子）と、
第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖおよび軽鎖定常領域ＣＬをコードする第２核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１をコードする遺伝子）と、
を含み、あるいは
第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする第３核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４をコードする遺伝子）と、
第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする第４核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５をコードする遺伝子）と、
第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸分子であって、軽鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーに連結する第５核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５をコードする遺伝子）と、
第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸分子であって、重鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーを介して重鎖Ｆｃ断片に連結する第６核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６をコードする遺伝子）と、
を含む本発明における二価の二重特異性抗体をコードする遺伝子を提供する。

さらに、本発明は
第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントおよび重鎖定常領域ＣＨ１をコードする核酸分子を含む第１のベクターと、
第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントおよび軽鎖定常領域をコードする核酸分子を含む第２のベクターと、
を含み、あるいは
第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸分子を含む第３のベクターと、
第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸分子を含む第４のベクターと、
第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸分子を含むベクターであって、軽鎖の可変領域がリンカーに連結する第５のベクターと、
第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸分子を含むベクターであって、重鎖の可変領域がリンカーを介して重鎖Ｆｃ断片に連結する第６のベクターと、
を含む、宿主細胞を提供する。

さらに、本発明は、当該二価の二重特異性抗体を含む組成物を提供し、二価の二重特異性抗体の組成物は医薬組成物或いは診断用組成物である。

好ましくは、医薬組成物はさらに少なくとも一つの医薬の賦形剤を含む。

本発明は二価の二重特異性抗体およびその製造方法、コードする遺伝子、宿主細胞、組成物を提供する。当該二価の二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖ、フレキシブルペプチド、ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ１およびヒンジ領域の一部の配列、即ちＣＨ１－ｐａｒｔｉａｌ ｈｉｎｇｅ－ｌｉｎｋｅｒ－ｓｃＦｖ２或いはｓｃＦｖ２－ｌｉｎｋｅｒ－ＣＨ１－ｐａｒｔｉａｌ ｈｉｎｇｅと、ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖおよび軽鎖定常領域ＣＬ、即ちｓｃＦｖ１－ＣＬ或いはＣＬ－ｓｃＦｖ１と、を含み、
あるいは
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と、ｄ）軽鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーに連結し、重鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーを介して重鎖のＦｃ断片に連結する、第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖とを含む。

本発明は、以下の効果を奏する。
本発明の二価の二重特異性抗体は第１の抗原分子及び第２の抗原分子のいずれかとの親和力も高く、親のモノクローナル抗体分子と同等であり、例えば、Ｂ２およびＦＶ１はＰＤ－Ｌ１との親和力がそれぞれ１．０９Ｅ－１０Ｍおよび２．７１Ｅ－１０Ｍであり、Ｂ２およびＦＶ１はＰＤ－Ｌ１との親和力がそれぞれ２．５８Ｅ－８Ｍおよび１．５０Ｅ－８Ｍである。これから分かれるように、本発明の抗体の軽鎖と重鎖との正確なアセンブルの精度が高く、かつ分子サイズが適度である。

図１は、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４の四つの構造を含む、Ｂ構造の二価の二重特異性抗体の模式図である。 図２は、ＦＶ１、ＦＶ２、ＦＶ３およびＦＶ４の四つの構造を含む、ＦＶ構造の二価の二重特異性抗体の模式図である。 図３はＢおよびＦＶ構造の二重特異性抗体の一過性発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出の結果を示し、ここで、Ｍはマーカーであり、レーン１、３、５、７、９、１１、１３、１５はそれぞれＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、ＦＶ１、ＦＶ２、ＦＶ３、ＦＶ４の非還元電気泳動であり、レーン２、４、６、８、１０、１２、１４、１６はそれぞれＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、ＦＶ１、ＦＶ２、ＦＶ３、ＦＶ４の還元電気泳動である。 図４はＢおよびＦＶ構造の二価の二重特異性抗体のＥｌｉｓａ検出の結果を示し、ここで、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４の四つの構造（４－１）、およびＦＶ１、ＦＶ２、ＦＶ３およびＦＶ４の四つの構造（４－２）のＥｌｉｓａ検出の結果を含む。 図５は好ましいＢ２およびＦＶ１構造の二重特異性抗体の精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出の結果を示し、ここで、Ｍはマーカーであり、レーン１、２、３はＢ２二重特異性抗体の非還元一過性上清、プロテインＬアフィニティークロマトグラフィー非還元溶離液、ＰＤ－Ｌ１アフィニティークロマトグラフィー非還元溶離液であり、レーン４、６、８はＦＶ１二重特異性抗体のＭａｂ ＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅアフィニティークロマトグラフィーによる非還元溶離液、プロテインＬアフィニティークロマトグラフィーによる非還元溶離液、ｈＣＤ４７アフィニティークロマトグラフィーによる非還元溶離液であり、レーン５、７、９はＦＶ１二重特異性抗体のＭａｂ ＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅアフィニティークロマトグラフィーによる還元溶離液、プロテインＬアフィニティークロマトグラフィーによる還元溶離液、ｈＣＤ４７アフィニティークロマトグラフィーによる還元溶離液である。 図６は好ましいＢ２およびＦＶ１構造の二価の二重特異性抗体の精製後のＥｌｉｓａ検出の結果を示す。

本発明は二価の二重特異性抗体およびその製造方法、コードする遺伝子、宿主細胞、組成物を開示し、当業者はこれらの記載を参考し、プロセスパラメータを適切に改善して実現されることが可能である。なお、全ての類似な置換および変更が当業者にとって明白であり、それらは本発明に含まれたものとみなされることを指摘すべきである。本発明の方法および応用は好ましい実施例を用いて説明したが、当業者は、本発明の技術を実施および適用するために、本発明の内容、思想、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および応用を変更または適切な変更および組み合わせを行うことができることが明らかである。

用語の解釈
本明細書において使用する場合、「抗体」という用語とは、完全モノクローナル抗体を意味する。前記完全な抗体は２対の「軽鎖」（ＬＣ）と「重鎖」（ＨＣ）からなる。前記抗体の軽鎖および重鎖はいくつのドメインからなるポリペプチドである。完全な抗体において、各重鎖は重鎖可変領域ＶＨおよび重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３（抗体タイプＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧ）および任意選択的な重鎖定常ドメインＣＨ４（抗体タイプＩｇＥおよびＩｇＭ）を含む。各軽鎖は軽鎖可変ドメインＶＬおよび軽鎖定常ドメインＣＬを含む。一つの天然に存在する完全な抗体、即ちＩｇＧ抗体である。可変ドメインＶＨおよびＶＬはさらに相補性決定領域ＣＤＲと呼ばれる超可変領域に分けられ、それらの間にフレームワーク領域ＦＲと称する、より保存される領域がある。個々のＶＨおよびＶＬは、次の順番でアミノ基端からカルボキシル基端へ並んでいる三つのＣＤＲおよびよつのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、Ｆ３、ＣＤ３及びＦＲ４（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．ら，（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，およびＷｏｏｆ，Ｊ．，Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２００４）８９－９９）。２対の重鎖および軽鎖は同じ抗原に対して特異的に結合することができる。従って、前記完全な抗体は二価の単特異性抗体である。かかる「抗体」は、例えばマウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および遺伝子的に構築された抗体を、それらの特徴的性質が保持される限り含む。ヒト或いはヒト化抗体、特に好ましくは組換えヒト或いはヒト化抗体が特に好ましい。

α、δ、ε、γおよびμのギリシャ文字で表される５種類の哺乳動物抗体重鎖がある（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．ら．，（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。重鎖のタイプに対応する抗体のタイプが存在している。存在する重鎖タイプが抗体の種類を定義し、これらの鎖はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体に見られる（Ｒｈｏａｄｅｓ，Ｒ．Ａ．，Ｐｆｌａｎｚｅｒ，Ｒ．Ｇ．（２００２）．Ｈｕｍａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，第４版，Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｌｅａｒｎｉｎｇ）。異なる重鎖は、サイズおよび組成が異なる。αおよびγは約４５０個のアミノ酸を含有し、μおよびεは約５５０個のアミノ酸を有する。

各重鎖は二つの領域を有し、即ち、定常領域および可変領域を有している。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体において同じであるが、異なるアイソタイプの抗体において異なる。重鎖γ、αおよびδは三つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる定常領域およびレキシブルを増加するためのヒンジ領域を有する（Ｗｏｏｆ，Ｊ．，Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２００４）８９－９９）。重鎖μおよびεは、四つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４からなる定常領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．ら，（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。重鎖の可変領域は異なるＢ細胞により産生された抗体において異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンによって産生されたすべての抗体で同一である。各重鎖の可変領域は約１１０個アミノ酸であり、かつ単一の抗体ドメインから構成される。

哺乳動物にはλおよびＫと呼ばれる、わずか二つ種類の軽鎖が存在し、軽鎖は二つの連続的ドメインを有し、一つは定常ドメインＣＬであり、もう一つは可変ドメインＶＬである。軽鎖の近似長さは２１１－２１７個のアミノ酸である。好ましくは、軽鎖は、Ｋ軽鎖であり、かつ、定常ドメインＣＬはＣＫであることが好ましい。

「モノクローナル抗体」或いは「モノクローナル抗体組成物」という用語とは、本明細書において使用される場合、単一のアミノ酸組成物の抗体分子製剤を意味する。

本発明による「抗体」は、任意のタイプ（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、好ましくはＩｇＧあるいはＩｇＥである）のものでもよく、あるいはサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、好ましくはＩｇＧ１である）であり、そのうち、本発明による二価の二重特異性抗体が由来する二つの抗体は、同じサブタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ４など、好ましいＩｇＧ１）のＦｃ部分を有し、好ましくは同じアロタイプのＦｃ部分を有する。

「抗体のＦｃ部分」とは、当業者がよく知られており、パパイン酵素による抗体の切断に基づいて定義される用語である。本発明による抗体は、例えばＦｃ部分、好ましくはヒト由来のＦｃ部分および好ましいヒト定常領域の全ての他の部分を含む。抗体のＦｃ部分分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化およびＦｃ受容体結合に直接関与する。抗体は、補体系への抗体の影響が特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合はＦｃ部分における決定される結合部位により引起される。前記結合部位は、先行技術であり、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ；Ｃｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８－３４４；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１－１２１６８；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９－３２４；およびＥＰ０３０７４３４に記載される。前記結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（ＫａｂａｔによるＥＵディレクトリ番号）である。通常には、サブタイプＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、およびＣ３活性化を示すが、ＩｇＧ４のは補体系を活性化させず、Ｃ１ｑに結合せず、Ｃ３を活性化させない。好ましくは、Ｆｃ部分がヒトＦｃ部分である。

本明細書に使用される「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段により製造、発現、産生あるいは単離された全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞例えばＮＳＯやＣＨＯ細胞、又はヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子導入動物から単離された抗体、又は宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターにより発現される抗体を含むことを意味する。これらの組換えヒト抗体は、転位された形態の可変領域および定常領域を有する。

「可変ドメイン」は、本明細書において使用される場合、抗体の抗原への結合に直接関与する軽鎖と重鎖との対の個々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、かつ各ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、当該フレームワーク領域は、一般に保存され、３つの超可変領域（ＣＤＲｓ）によって連結される。フレームワーク領域は、自己折り畳み構造を取り、かつＣＤＲは、自己折り畳み構造を連結するループを形成することができる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によってその３次元構造で保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３領域は本発明による抗体の結合特異性/親和性において非常に重要な役割を果たす。

「超可変領域」或いは「抗体の抗原と結合する部分」という用語とは、本明細書に使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は「相補性決定領域」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク領域」は本明細書に定義された超可変領域の残基以外のそれらの可変ドメインの領域である。そのため、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含み、各鎖におけるＣＤＲは前記フレームワークアミノ酸によって分離される。特に、重鎖のＣＤＲ３は抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，免疫学的に重要なタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），第５版，公衆健康サービス；国家健康研究所（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）の基準の定義に従って決定される。

重鎖および軽鎖の「定常ドメイン」は抗体の抗原への結合に直接に関与しないが、さまざまなエフェクター機能を示す。

「二価の二重特異性抗体」という用語とは、本明細書において使用される場合、２つの一本鎖可変フラグメントが、それぞれ異なる抗原に特異的に結合する、即ち、第１の一本鎖可変フラグメントおよび軽鎖定常領域は、第１の抗原に特異的に結合し、第２の一本鎖可変フラグメント、重鎖定常領域１およびヒンジ領域の一部が、第２の抗原に特異的に結合する、上述した抗体を指す。前記二価の二重特異性抗体は、二つの異なる抗原に同時に結合することができ、かつ２種類の抗原を超えず、それと対照的に、一方、１つの抗原のみに結合することができる単一特異性抗体であり、他方、４つの抗原分子に同時に結合することができる４価の四特異性抗体である。

「抗原」あるいは「抗原分子」という用語とは、本明細書において使用される場合、交換可能的に使用され、抗体によって特異的に結合されることができる全ての分子を意味する。二価の二重特異性抗体は第１の抗原及び異なる第２の抗原に特異的に結合する。「抗原」という用語は、本明細書において使用される場合、例えばタンパク質、タンパク質上の異なるエピトープ（本発明の意味の範囲内で異なる抗原とする）及び多糖体を含む。これは主に、細菌、ウィルス、その他の微生物の部分（外殻、被膜、細胞壁、鞭毛、線毛および毒素）を含む。脂質および核酸は、タンパク質および多糖体と結合する場合にのみ抗原性を示す。非微生物外因性（非自己）抗原は、花粉、卵白および移植された組織および臓器からのタンパク質、または輸血された血液細胞の表面上のタンパク質を含むことができる。好ましくは、抗原は、サイトカイン、細胞表面タンパク質、酵素および受容体サイトカイン、細胞表面タンパク質、酵素および受容体からなる群から選ばれる。

腫瘍抗原は、腫瘍細胞の表面上のＭＨＣＩ或いはＭＨＣＩＩ分子内の抗原である。これらの抗原は、腫瘍細胞によって提示されることがあり、正常細胞によっては提示されないことがない。したがって、それらは腫瘍特異抗原（ＴＳＡｓ）と呼ばれ、かつ典型的には腫瘍特異的変異によって産生される。最も見られるのは、腫瘍細胞および正常細胞によって提示される抗原であり、腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）と呼ばれる。これらの抗原を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球は、腫瘍細胞の増殖または転移前にそれらを破壊することができる。腫瘍抗原はまた、例えば、腫瘍表面上に変異受容体の形態として存在する可能性があり、この場合、それらがＢ細胞によって認識されるべきである。

好ましい一実施形態においては、二価の二重特異性抗体が特異的に結合する２種類の異なる抗原（第１および第２の抗原）のうちの少なくとも１つは腫瘍抗原である。

別の好ましい実施形態においては、二価の二重特異性抗体が特異的に結合する２種類の異なる抗原（第１および第２の抗原）はいずれも腫瘍抗原である。この場合には、前記第１および第２の抗原はさらに同じの腫瘍特異的タンパク質での２種類の異なるエピトープであってもよい。

別の好ましい実施形態においては、二価の二重特異性抗体が特異的に結合する２種類の異なる抗原（第１および第２の抗原）の一つは腫瘍抗原であり、かつもう１種類はエフェクター細胞抗原、例えばＴ細胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ１６などである。

別の好ましい実施形態においては、二価の二重特異性抗体が特異的に結合する２種類の異なる抗原（第１および第２の抗原）の一つは腫瘍抗原であり、かつもう１種類は抗癌物質、例えば、毒素やキナーゼ阻害剤である。

「特異的に結合」或いは「…に特異的に結合する」とは、本明細書において使用される場合に、抗原に特異的に結合する抗体を指す。該抗原に特異的に結合する抗体の結合親和性は、１０^－９ｍｏｌ／Ｌ以下、例えば１０^－１０ｍｏｌ／ＬのＫＤ値、好ましくは、１０^－１０ｍｏ１／Ｌ以下、例えば１０^－１２ｍｏ１／ＬのＫＤ値を有する。結合親和性は、基準結合測定、例えば表面プラズモン共鳴技術（Ｂｉａｃｏｒｅ）により決定される。

「エピトープ」という用語は特異的に抗体に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。ある実施形態においては、エピトープ決定基は、分子の化学的に清浄な表面のグループ、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルを含み、ある実施形態においては、特定の三次元構造特徴を有し、かつ、特定の帯電性能を有することができる。エピトープは抗体により結合される抗原の領域である。ある実施形態においては、抗体がタンパク質および／または高分子の複雑な混合物において、その標的抗原を優先的に認識する場合、該抗体は抗原に特異的に結合すると称される。

「核酸又は核酸分子」という用語とは、本明細書において使用される場合に、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でもよく二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

「細胞」、「細胞系」および「細胞培養物」という表現は、本明細書において使用される場合に、可換的に使用されることができ、かつこれらの名称には全て子孫も含まれる。したがって、「形質転換体」および「形質転換された細胞」という言葉は、その継代数にかかわらず、初代対象細胞およびそれから派生した培養物を含む。また、全ての子孫は、意図的な又は意図しない突然変異により、ＤＮＡ含有量が正確に同じではないことも理解される。元の形質転換された細胞からスクリーニングされた同じ機能的又は生物学的活性を有する変異体子孫も含まれる。異なる名称が意図される場合、その文脈から明らかになる。

「形質転換」という用語とは、本明細書において使用される場合、ベクター/核酸を宿主細胞導入するプロセスを意味する。細胞壁の障壁を克服することが困難な細胞が宿主細胞として使用される場合、トランスフェクションは、例えば、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｈ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７８）５４６ｆｆに記載のリン酸カルシウム沈殿法によって行われる。また、例えば核注入プロトプラスト融合による細胞中へＤＮＡの導入するための他の方法を使用できる。原核細胞又は実質的な細胞壁構造を有する細胞を用いる場合、例えば、トランスフェクションの一方法は、Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｎ．，など，ＰＮＡＳ．６９（１９７２）７１１０ｆｆに記載の酸化カルシウムを用いるカルシウム処理である。

形質転換を用いる抗体の組換え生成は、先行技術においてよく知られ、例えば、レビュー文献Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，プロテイン Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３－２０２；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１－２８２；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１－１６１；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４８（１９９８）８７０－８８０、ＵＳ６，３３１，４１５やＵＳ４，８１６，５６７に記載されている。

本明細書において使用される場合、「発現」とは、核酸をｍＲＮＡに転写するプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡをペプチド、ポリペプチド又はタンパク質にその後に翻訳するプロセスを意味する。転写物およびコードされたポリペプチドは、遺伝子産物と総称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞における発現はｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。

「ベクター」とは、核酸分子、特に自己複製する核酸分子であり、それは、組み込まれた核酸分子を宿主細胞内及び／又は宿主細胞間にトランスファーすることを含む。この用語は、細胞へＤＮＡまたはＲＮＡを組み込むために主に機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡを複製するために主に機能する複製ベクター、およびＤＮＡまたはＲＮＡを転写および／または翻訳するために主に機能する発現ベクターを含む。さらに、上記の機能の１つ以上を提供するベクターを含む。

「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞に導入された後でポリペプチドに転写および翻訳されることができるポリヌクレオチドである。「発現システム」とは、一般に、所望の発現産物を産生するために機能する発現ベクターを含む適切な宿主細胞を意味する。

本発明による二価の二重特異性抗体は、組換え手段により生じることが好ましい。前記方法は、当技術分野において広く知られており、原核および真核細胞におけるタンパク質の発現、その後の抗体ポリペプチドの単離、および通常の医薬的に許容できる純度までの精製を含む。タンパク質を発現するために、軽鎖および重鎖をコードする核酸またはその断片を、標準方法により発現ベクターに組み込む。発現は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの適切な原核または真核宿主細胞において行われ、そして前記細胞（細胞溶解後の上清または細胞）から抗体を回収される。二価の二重特異性抗体は、完全な細胞、細胞ライセート、或いは一部精製されたもしくは実質的に純粋な形で存在することができる。精製は、アルカリ/ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィー、および当技術分野で周知の他の技術を含む標準技術により行われる。これによって、他の細胞成分または他の細胞核酸やタンパク質などの汚染物を排除する。Ａｕｓｕｂｅ ｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇとＷｉｌｅｙｌｎｔｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク（１９８７）を参照する。ＮＳＯ細胞における発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９－１２３；およびＢａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ，７３（２００１）２６１－２７０に記載されている。一過性表現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（２００２）四に記載されている。可変ドメインのクローンは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３－３８３７；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５－４２８９；およびＮｏｒｄｅｒｈａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７－８７に記載されている。好ましい一過性表現システム（ＨＥＫ ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．Ｊ．とＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１－８３；およびＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．Ｊ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１－１９９に記載されている。

原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択のオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。

核酸は、別の核酸配列との機能性的関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される条件で、リーダー配列または分泌リーダー配列のＤＮＡはポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結し、それが配列の転写に影響を及ぼす条件で、プロモーターまたはエンハンサーをコード配列に作動可能に連結し、または、翻訳を促進するために局在化される条件で、リボソーム結合部位はコード配列に作動可能に連結する。一般的には、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続的であり、そして分泌リーダー配列の場合、連続的かつ読み取りの位相内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続する必要がない。連結は、都合のよい制限部位での連結により達成される。前記サイトが存在しない場合には、従来の慣行に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。

二価の二重特異性抗体は、例えば、プロテインＡ－アガロース、アパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製プロセスによって、培地から適切に単離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、従来の方法により容易に単離され、シークエンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、前記ＤＮＡおよびＲＮＡの由来として作用することができる。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに組み込むことができ、次に、前記発現ベクターを、さもなければ免疫グロブリンを産生しない宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされ、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成を達成する。

二価の二重特異性抗体のアミノ酸配列バリアント（または突然変異体）は、適切なヌクレオチド変化を抗体ＤＮＡに導入することにより、またはヌクレオチド合成により調製される。ただし、そのような修飾は、非常に制限された範囲内、例えば、上記のような範囲内でのみ行うことができる。また、前記修飾は、上記抗体特性、ＩｇＧアイソタイプおよび抗原結合を変更させないが、組換え産物の収率、タンパク質安定性を増加させるか、または精製を促進することができる。しかし組換え生成の収率、タンパク質安定性を改良するか、又は精製を促進する。

本発明によって提供される二価の二重特異性抗体及びその調製方法、コードする遺伝子、宿主細胞、組成物に用いられる原料又は試薬はすべて、市場から購入することができる。

以下では、実施例を参照しながら、本発明をさらに説明する。

実施例１：二価の二重特異性抗体の製造
１．二価の二重特異性抗体の一過性トランスフェクションのための発現ベクターの構築

（１）材料
抗ヒトＣＤ４７のヒト化モノクローナル抗体０５９－４．１６．２Ｈ１Ｌ２のＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）およびＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）の配列；０５９－４．１６．２Ｈ１Ｌ２は、ハイブリドーマからマウス抗体（２０１６１０４３６５１９．３）を得て、次いでヒト化遺伝子改造を行うことにより得られた。
抗ヒトＰＤ－Ｌ１のヒトモノクローナル抗体０４７ Ａｂ－６のＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）とＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）の配列、０４７ Ａｂ－６は、ナイーブヒューマンライブラリーからパニングして得られた（２０１８１００４４３０３．１）。ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ１のコードするヌクレオチド、ヒンジ領域とＦｃのコードするヌクレオチド、およびカッパ鎖定常領域のヌクレオチド。

（２）方法
ｐＧＳ００３を選択して、二価の二重特異性抗体（８つ、構造模式図は図１および図２に示す）の重鎖および軽鎖の発現ベクターを構築した。抗ヒトＣＤ４７のヒト化モノクローナル抗体０５９－４．１６．２ Ｈ１Ｌ２のＶＬおよびＶＨのコードヌクレオチド、抗ヒトＰＤ－Ｌ１のヒト化モノクローナル抗体０４７ Ａｂ－６のＶＬおよびＶＨのコードヌクレオチド、ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ１のコードヌクレオチド、ヒンジ領域およびＦｃのコードヌクレオチド、およびカッパ鎖の定常領域のヌクレオチド配列、並びにベクターおけるマルチクローニングサイトに基づき、プライマーを設計した。表１に示すように、ＰＣＲ増幅後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え法（蘇州泓迅、ｉＭｕｌｌｉ多断片の組換えクローニングキット）を用い、９つの重鎖コード配列および８つの軽鎖コード配列をｐＧＳ００３にクローニングした。シークエンシングにより抗体遺伝子の正確な挿入を確認した後、組換え発現ベクターを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に形質転換し、シングルコロニーを採取して１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈのエンドトキシンを特異的に効率よく除去するマキキットを用い、プラスミドを抽出し、最後にプラスミドを超純水１ｍＬに溶解し、分光光度計でプラスミド濃度およびＯＤ２６０／２８０を測定した。ＯＤ２６０／２８０は１．８～１．９で純度の高いプラスミドＤＮＡである。

２．哺乳動物細胞２９３Ｅにおけるトランスフェクション、発現および検出
上記９つの重鎖発現ベクターおよび８つの軽鎖発現ベクターにおけるＨ１、Ｌ２、Ｌ３およびＨ４のａｎｔｉ－ｈ ＣＤ４７を発現するｓｃＦｖ；Ｌ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ４のａｎｔｉ－ｈ ＰＤ－Ｌ１を発現するｓｃＦｖ；Ｈ５およびＬ５のそれぞれａｎｔｉ－ｈ ＰＤ－Ｌ１を発現するＶＨおよびＶＬ；Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８およびＨ９のａｎｔｉ－ｈ ＣＤ４７を発現するＶＨ；Ｌ６、Ｌ７およびＬ８のａｎｔｉ－ｈ ＣＤ４７を発現するＶＬ。

上記ベクターが、Ｈ１＋Ｌ１（Ｂ１構造）、Ｈ２＋Ｌ２（Ｂ２構造）、Ｈ３＋Ｌ３（Ｂ３構造）、Ｈ４＋Ｌ４（Ｂ４構造）、Ｈ５＋Ｌ５＋Ｈ６＋Ｌ６（ＦＶ１構造）、Ｈ５＋Ｌ５＋Ｈ７＋Ｌ７（ＦＶ２構造）、Ｈ５＋Ｌ５＋Ｈ８＋Ｌ８（ＦＶ３構造）およびＨ５＋Ｌ５＋Ｈ９＋Ｌ７（ＦＶ４構造）に従い組み合った後、２ｍＬの２９３Ｅシステムの一過性トランスフェクション発現し、評価した。ここで、ＦＶ１構造が（Ｇ４Ｓ／Ｇ４ＳＡＳ）_０＋Ｌ／ＧＧＧＣであり、ＦＶ２構造が（Ｇ４Ｓ／Ｇ４ＳＡＳ）_１＋Ｌ／ＧＧＧＣであり、ＦＶ３構造が（Ｇ４Ｓ／Ｇ４ＳＡＳ）_３＋Ｌ／ＧＧＧＣであり、ＦＶ４構造の軽鎖が（Ｇ４Ｓ／Ｇ４ＳＡＳ）_１＋Ｌ／ＧＧＧＣであり、重鎖がＬ／ＧＧＧＣ＋（Ｇ４Ｓ／Ｇ４ＳＡＳ）_１であった。発現量および抗体がヒトＣＤ４７及びヒトＰＤ－Ｌ１と結合したＥＬＩＳＡ検出値を検出した結果、図３、図４（ただし、４－１はＢ構造の二価の二重特異性抗体のＥｌｉｓａ検出結果を示し、４－２はＦＶ構造の二価の二重特異性抗体Ｅｌｉｓａ検出結果を示した）に示した。Ｂ２構造は、Ｂ系構造の二重特異性抗体において、発現、構築、及び抗原への結合のいずれかが最適であった。ＦＶ１構造は、ＦＶ系構造の二重特異性抗体において、発現、アセンブル、及び抗原への結合がすべて最適であった。従って、抗体は、Ｂ２、ＦＶ１が好ましい。

Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地で２９３Ｅを用い、Ｂ２およびＦＶ１構造の二つの好ましい抗体を、増幅された一過性トランスフェクションし、発現させた。トランスフェクションの２４時間前に、１Ｌ細胞培養フラスコに０．５×１０^６細胞／ｍＬで２９３Ｅ細胞 ３００ｍＬを接種し、３７℃ ５％ ＣＯ_２インキュベーターに１２０ｒｐｍでシェーカーで培養した。トランスフェクションする際に、先に、３００μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎを取って５．７ｍＬのＯＰｔｉＭＥＭに加え、十分に混合した後、室温で２分間インキュベートした。また、Ｂ２構造およびＦＶ１構造分子のために使用された、それぞれ総量３００μｇの発現プラスミドを、ＯＰｔｉＭＥＭを用いて６ｍＬに希釈した。上記希釈したトランスフェクション試薬及びプラスミドをよく混合し、室温で１５分間インキュベートした後、すべての混合物を細胞に加え、十分に混合し、３７℃ ５％ ＣＯ_２インキュベーターでシェーカーにより１２０ｒｐｍで７日間培養した。

実施例２：好ましい抗体的精製および検出
Ｂ２構造のタンパク質の精製：
細胞培養液２０００ｇを、２０分間遠心分離し、上清を集めた。上清を０．２２マイクロメートルのろ過膜で濾過し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ（ＧＥ）クロマトグラフィーにより、クエン酸－クエン酸ナトリウム２０ｍＭ、ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅでｐＨを中性に調整した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌクロマトグラフィーされたサンプルを、またヒトＰＤＬ１タンパク質がカップリングされたアフィニティークロマトグラフィーに供し、クエン酸－クエン酸ナトリウム２０ｍＭを用い、ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅでｐＨを中性に調整した。精製サンプルは、４～２０％グラジエントゲル（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥで精製タンパク質を検出した。結果は図５に示し、好ましい抗体Ｂ２の純度は９５％であった。

ＦＶ１構造のタンパク質の精製：
細胞培養液２０００ｇを、２０分間遠心して上清を集めた。上清を０．２２マイクロメートルのろ過膜で濾過し、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ）クロマトグラフィーにより、クエン酸－クエン酸ナトリウム２０ｍＭ、ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅでｐＨを中性に調整した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅクロマトグラフィー後のサンプルを、さらにＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ（ＧＥ）クロマトグラフィーにかけ、クエン酸－クエン酸ナトリウム２０ｍＭ、ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅでｐＨを中性に調整した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌクロマトグラフィー後のサンプルを、さらにヒトＣＤ４７タンパク質がカップリングされたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、クエン酸－クエン酸ナトリウム２０ｍＭ、ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅでｐＨを中性に調整した。精製サンプルは、４～２０％グラジエントゲル（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥで精製タンパク質を検出し、結果は図５に示し、好ましい抗体ＦＶ１の純度は９０．８％であった。

実施例３：好ましい抗体がヒトＣＤ４７およびヒトＰＤ－Ｌ１との結合のＥＬＩＳＡ検出
１．第１の抗原のコーティング：ヒトＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃ（ＧｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが自社構築され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルマイクロプレートにウェル当たり５０μＬ添加し、４℃で一晩インキュベートした。

２．ブロッキング：プレートを３回洗浄した後、３％ＢＳＡでウェル当たり２５０μＬでブロッキングし、３７℃で２時間インキュベートした。

３．候補抗体の添加：プレートを３回洗浄した後、初期濃度が１０ｍｇ／ｍＬである、２倍希釈した、１２個の濃度勾配の候補抗体サンプルまたは陽性対照または陰性対照を添加した。ウェル当たり５０μＬ、２５℃の条件下で１時間インキュベーションした。

４．第２の抗原の添加：ヒトＣＤ４７－Ｈｉｓ（ＧｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが自社構築され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）を、ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルマイクロプレートにウェル当たり５０μＬ添加し、２５℃の条件下で１時間インキュベートした。

５．二次抗体の添加：プレートを３回洗浄した後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（１：１００００）をウェル当たり５０μＬ添加し、２５℃の条件下で１時間インキュベートした。

６．発色：プレートを４回洗浄した後、ＴＭＢ発色液をウェルあたり５０μＬ加え、室温で１０分間遮光して発色させる。

７．停止：１ウェルあたり５０μＬのように反応停止液を直接添加し、反応を停止させた。

８．検出：反応停止後、すぐにマイクロプレートをマイクロプレートリーダーにセットし、４５０ｎｍでＯＤ値を測定し、元のデータを保存して整理した。その結果を図６に示した。精製後の好ましい抗体Ｂ２がＥＣ５０＝０．５６３６であり、ＦＶ１がＥＣ５０＝１．６６２であった。

実施例４：好ましい抗体の親和力の測定
ＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器を用い、Ｂ２およびＦＶ１構造の抗体の親和力を検出した。具体的な方法は以下の通りであった。ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ及びヒトＣＤ４７－ＨｉｓをＣＭ５バイオセンサーチップ（ＧＥ）にカップリングし、様々な濃度の抗体が３０μＬ／ｍｉｎの流速でチップを流れ、抗原は結合時間１２０ｓ及び解離時間３００ｓで候補抗体に結合した。ＢＩＡｅｖａｌｕｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ）を用い、動力学フィッティングを行い、親和性定数を求めた。その結果は、表２、表３に示される。Ｂ２およびＦＶ１とＰＤ－Ｌ１との親和力はそれぞれ１．０９Ｅ－１０Ｍおよび２．７１Ｅ－１０Ｍであり、Ｂ２およびＦＶ１とＣＤ４７との親和力はそれぞれ２．５８Ｅ－８Ｍおよび１．５０Ｅ－８Ｍであった。

上記は、本発明の好適な実施例に過ぎず、当業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、幾つの改善及び修飾を行うことができ、これらも本発明の特許請求の範囲に含まれると見られるべきである。

Claims (11)

1. ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖ、フレキシブルペプチド、ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ１およびヒンジ領域の一部の配列と、
   ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖおよび軽鎖定常領域ＣＬと、を含み、
   あるいは
   ｃ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と、
   ｄ）軽鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーに連結し、重鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーを介して重鎖のＦｃ断片に連結する、第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖とを含む、ことを特徴とする二価の二重特異性抗体。
2. 前記フレキシブルペプチドが（Ｇ４Ｓ／Ｇ４ＳＡＳ）ｎであり、ここで、ｎは０或いは０より大きい整数であり、かつフレキシブルペプチドに連結するＩｇＧ１ヒンジ領域の一部の配列がＥＰＫＳＣＤＫであり、
   前記リンカーがＬ／ＧＧＧＣであり、かつリンカーに連結する重鎖のヒンジ領域における第１システイン残基がセリンに変異する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の二価の二重特異性抗体。
3. ＣＬおよびＣＨ１がヘテロ二量体を形成し、ＣＬの末端システイン残基が重鎖のヒンジ領域のシステイン残基とジスルフィド結合を形成する、ことを特徴とする請求項１或いは２に記載の二価の二重特異性抗体。
4. １つの重鎖のリンカーＬ／ＧＧＧＣと１つの軽鎖のリンカーＬ／ＧＧＧＣとの末端システイン残基がジスルフィド結合を形成すること、および一方の重鎖のＣＨ３ドメインと他方の重鎖のＣＨ３ドメインが前記二価の二重特異性抗体の構造の形成を促進するように変更されること、を特徴とする請求項１或いは２に記載の二価の二重特異性抗体。
5. 前記変更が
   ａ）二価の二重特異性抗体内の第２の重鎖のＣＨ３ドメインのオリジナル界面と接触する第１の重鎖のＣＨ３ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基が元のアミノ酸残基よりも体積が大きいアミノ残基に置換され、第１の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に突起を生じ、前記突起は、前記第２の重鎖のＣＨ３のドメインの界面内の凹みに位置決定できる、第１の重鎖のＣＨ３ドメインの変更であり、かつ
   ｂ）二価の二重特異性抗体内の第１の重鎖のＣＨ３ドメインのオリジナル界面と接触する第２の重鎖のＣＨ３ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基が元のアミノ酸残基よりも体積が小さいアミノ酸残基に置換され、第２の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に凹みを生じ、前記凹みに前記第１の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の突起を位置決定できる、第２の重鎖のＣＨ３ドメインの変更であり、
   第１の重鎖可変領域と軽鎖可変領域がそれぞれ（Ｇ４Ｓ／Ｇ４ＳＡＳ）ｎとＬ／ＧＧＧＣに連結し、かつ二つのＬ／ＧＧＧＣのシステイン残基間でジスルフィド結合が形成される、ことを特徴とする請求項４に記載の二価の二重特異性抗体。
6. 前記元のアミノ酸残基より体積の大きいアミノ酸残基がアルギニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群より選ばれ、
   前記元のアミノ酸残基より体積の小さいアミノ酸残基がアラニン、セリン、トレオニン、およびバリンからなる群より選ばれる、
   ことを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の二価の二重特異性抗体。
7. 前記二価の二重特異性抗体が、
   ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖ、フレキシブルペプチド、ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ１およびヒンジ領域の一部の配列、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と、
   ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖおよび軽鎖定常領域ＣＬ、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列と、を含み、
   あるいは、
   ｃ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるアミノ酸配列と、
   ｄ）軽鎖可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーに連結し、重鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーを介して重鎖Ｆｃ断片に連結する、第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列とを含むこと、
   を特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の二価の二重特異性抗体。
8. ａ）以下のベクターで宿主細胞を形質転換するステップと、
   第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントおよび重鎖定常領域ＣＨ１をコードする核酸分子を含む第１のベクターと、
   第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントおよび軽鎖定常領域をコードする核酸分子を含む第２のベクターと、
   あるいは、
   第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸分子を含む第３のベクターと、
   第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸分子を含む第４のベクターと、
   第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸分子を含むベクターであって、軽鎖の可変領域がリンカーに連結する第５のベクターと、
   第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸分子を含むベクターであって、重鎖の可変領域がリンカーを介して重鎖Ｆｃ断片に連結する第６のベクターと、
   ｂ）抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養するステップと、
   ｃ）前記抗体分子を培養物から回収するステップと、を含む、
   ことを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の二価の二重特異性抗体の製造方法。
9. 第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖ、フレキシブルペプチド、ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ１およびヒンジ領域の一部の配列をコードする第１核酸分子と、
   第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖおよび軽鎖定常領域ＣＬをコードする第２核酸分子とを含み、
   あるいは、
   第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする第３核酸分子と、
   第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする第４核酸分子と、
   第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸分子であって、軽鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーに連結する第５核酸分子と、
   第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸分子であって、重鎖の可変領域がフレキシブルペプチドおよびリンカーを介して重鎖Ｆｃ断片に連結する第６核酸分子と、を含む、
   ことを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の前記二価の二重特異性抗体をコードする遺伝子。
10. 第１の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントおよび重鎖定常領域ＣＨ１をコードする核酸分子を含む第１のベクターと、
    第２の抗原に特異的に結合する抗体の一本鎖可変フラグメントおよび軽鎖定常領域をコードする核酸分子を含む第２のベクターと、を含み、
    あるいは、
    第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸分子を含む第３のベクターと、
    第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸分子を含む第４のベクターと、
    第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸分子を含むベクターであって、軽鎖の可変領域がリンカーに連結する第５のベクターと、
    第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸分子を含むベクターであって、重鎖の可変領域がリンカーを介して重鎖Ｆｃ断片に連結する第６のベクターと、を含む、ことを特徴とする宿主細胞。
11. 請求項１ないし７のいずれかに記載の二価の二重特異性抗体を含む組成物であって、医薬組成物或いは診断組成物であることを特徴とする、組成物。

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