CN107459578A

CN107459578A - 一种靶向cd47与pd‑l1的双功能融合蛋白

Info

Publication number: CN107459578A
Application number: CN201610372954.4A
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 寇庚; 钱卫珠; 郭怀祖; 徐进
Original assignee: Taizhou Mai Bartec Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taizhou Mai Bartec Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-05-31
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2017-12-12
Anticipated expiration: 2036-05-31
Also published as: CN107459578B

Abstract

一种靶向CD47与PD‑L1的双功能融合蛋白，属于生物医药领域，解决抗PD‑1/PD‑L1治疗对低免疫原性的肿瘤效果差、抗CD47治疗靶向性差的问题。该融合蛋白由二硫键链接的CD47结合部分和PD‑L1结合部分组成，既能阻断CD47与SIRPα的结合，又能阻断PD‑L1与PD‑1的结合，既能在天然性免疫中起到激活巨噬细胞吞噬肿瘤细胞、促进抗原递呈作用，又能在获得性免疫中起到促进肿瘤特异性T细胞活化的作用，同时具有更小的血液毒性，该融合蛋白比单独使用抗PD‑L1或抗CD47治疗具有更好的抗肿瘤疗效和血液安全性。

Description

一种靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向CD47分子与PD-L1分子的重组融合蛋白。

背景技术

癌细胞的“免疫逃逸”被认为是肿瘤发生、发展和抗药的主要机制。肿瘤一般通过直接或间接抑制T细胞的信号来保护自己躲过免疫系统的清除。肿瘤的免疫检查点疗法（immune chenkpoint therapy）是一类通过共抑制或共刺激信号等一系列途径调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫应答的治疗方法。

免疫检查点通过免疫应答过程中的共刺激和共抑制分子，发出“打开”或“关闭”免疫应答的信号，在调节T细胞应答的幅值与持续时间和维持自身耐受方面具有重要作用，防止损伤自身组织。目前已发现的免疫检查点分子有PD-1/PD-L1、CD47/SIRPα、CTLA-4/CD80/CD86等。

（1）PD-1/PD-L1

PD-1（Programmed Cell Death Protein 1，程序性细胞死亡蛋白1）是一种细胞表面受体，表达于T细胞和前B细胞表面，在活化的T细胞上表达上调，能与PD-L1和PD-L2两种配体结合。PD-1是一种具有负调控功能的免疫检查点蛋白，能够防止T细胞的活化，在降低自身免疫、促进免疫耐受上起着重要作用。PD-1的功能通过两种途径实现，一是促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡，二是减少调控性T细胞（Treg，也叫抑制性T细胞）的凋亡。

PD-L1（Programmed Death-Ligand 1，程序性死亡配体1）是PD-1的配体之一，也是一种跨膜蛋白，主要表达于胎盘、心脏、肝脏、肺、肾、骨骼肌和少数造血组织以及一些白血病细胞系。PD-L1与PD-1结合形成受体配体复合物后发出抑制性信号，包括诱导IL-10（炎症与免疫抑制因子）产生，下调抗凋亡基因bcl-2来促进抗原特异性T细胞的凋亡，抑制淋巴结中CD8+ T细胞的增殖等。PD-L1与一些特殊情形下免疫系统的抑制有关，如怀孕、组织移植、自身免疫疾病、肝炎等。PD-L1除了能与PD-1以较强的亲和力结合（K_D值770nM）外，还能与CD80以较弱的亲和力结合（K_D值1.4µM）。

PD-L1被发现表达于多种肿瘤细胞表面，使得肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤，因此可被用作抗肿瘤免疫治疗的标靶。

（2）CD47/SIRPα

CD47（白细胞分化抗原47）也叫整合素相关蛋白（Integrin Associated Protein，IAP），是一种跨膜蛋白，与膜整合素相伴，也与血小板反应素-1 (Thrombospondin-1，TSP-1)、信号调控蛋白α（Signal-Regulatory Protein α，SIRPα）结合。CD47广泛表达于人体细胞上，并在多种肿瘤细胞上过表达，参与细胞凋亡、增殖、粘附、迁移等多种细胞活动。

SIRPα是一种跨膜受体糖蛋白，在免疫细胞中特异性表达于巨噬细胞、树突状细胞等髓系细胞表面，对免疫有负调控作用，与CD47结合后能够抑制吞噬作用和T细胞活化。

CD47与SIRPα结合后向免疫系统发出“Don’t eat me”（别吃我）信号，该机制能够保护人体正常细胞免遭免疫系统误杀，但是也能被肿瘤细胞所利用达到免疫逃逸。

截至2015年12月已经有Ipilimumab（抗CTLA-4）、Nivolumab（抗PD-1）、Pembrolizumab（又称Lambrolizumab，抗PD-1）等3个免疫检查点药物被美国食品药品管理局（FDA）批准上市，用于转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌等癌症的治疗。此外，还有抗PD-L1单抗Atezolizumab（也叫MPDL3280A，Roche公司）、抗CD47单抗Hu5F9-G4（斯坦福大学）等免疫检查点药物进入临床试验。

然而，在免疫检查点药物中还存在以下问题：

由于PD-1/PD-L1信号通路仅作用于T细胞的效应阶段，抗PD-1/PD-L1药物效果的发挥需要肿瘤抗原的递呈，临床上对于低免疫原性的肿瘤往往治疗无效（70%），需要与化疗、放疗、单抗药物连用；

靶向CD47的抗体具有激活巨噬细胞、增强T细胞抗原递呈等功能，与抗PD-1/PD-L1在功能上互补。然而CD47的表达并非严格意义上的肿瘤特异性，在健康的血红细胞表面也有表达，而且肿瘤细胞表面CD47表达仅仅高于正常细胞3.3倍，因此体内使用CD47抗体往往会引起贫血等不良反应。为了减轻副反应，与CD47高亲和力的SIRPα突变体只能以免疫增强剂的形式，以无Fc单体形式与其他抗体联用进行治疗。

如果能够开发一种药物，将抗PD-1/PD-L1、抗CD47/SIRPα两种免疫检查点药物在抗肿瘤免疫不同阶段的作用结合起来，预计将形成协同效应，产生比单用一种药物更高的有效率和更强的疗效，并提高药物的肿瘤细胞靶向性、降低血液毒性，解决现有免疫检查点药物疗效或安全性上的不足。

发明内容

本发明提供一种靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白，既能与PD-L1结合、阻断PD-1/PD-L1信号通路，又能与CD47结合、阻断CD47/SIRPα信号通路，解决现有免疫检查点抗体药在疗效和安全性上不足的问题。

本发明的技术方案如下：

一种靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白，其特征在于，既能与CD47分子结合，也能与PD-L1分子结合。

上述的融合蛋白，其特征在于，由二硫键链接的两个部分组成，其中一部分能与CD47结合，由SIRPα突变体（记作SIRPα-m）和抗体的Fc段连接而成；另一部分能与PD-L1结合，由抗PD-L1抗体的轻链和重链通过二硫键链接而成。

上述的融合蛋白，其特征在于，所述的抗体的Fc段为IgG型，优选的，为IgG1亚型。

上述的融合蛋白，其特征在于，CD47结合部分具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列；PD-L1结合部分的轻链具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，重链具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。

上述的融合蛋白，其特征在于，CD47结合部分由SEQ ID NO: 4的核苷酸序列编码；PD-L1结合部分的轻链由SEQ ID NO:5 的核苷酸序列编码，重链由SEQ ID NO: 6的氨基酸序列编码。

上述靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白在制造肿瘤防治药物上的应用。

上述靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白在制造免疫调节药物上的应用。

抗体（antibody）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白，在体外也可通过杂交瘤、基因工程等方法制备。按理化性质和生物学功能，抗体可分为IgM、IgG、IgA、IgE、IgD五类。IgG（免疫球蛋白G，Immunoglobulin G）型抗体是血清主要的抗体成分，约占血清免疫球蛋白的75%，也是国内外现有抗体药的主要类型。

通常的，一个完整的IgG型抗体由四条肽链组成（图1），包括对称的两条重链（Heavy Chain）和两条轻链（Light Chain），并通过二硫键结合在一起。其中每条轻链由可变区VL和恒定区CL组成，重链由可变区VH和恒定区CH组成。IgG型抗体的重链恒定区可分为CH1、CH2、CH3三个部分。轻链和重链的可变区VL、VH是与抗原结合的部分，重链的CH2、CH3区具有与补体、Fc受体、蛋白A结合以及诱导ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒性）、CDC（补体依赖的细胞毒性）等免疫效应的功能。轻链与重链通过CL、CH1区的二硫键相连；重链在CH1和CH2之间有一个易伸展弯曲的铰链区，一个抗体的两条重链之间通过铰链区的二硫键相连。抗体被木瓜蛋白酶消化后，可形成2个Fab段（fragment of antigen binding，抗原结合片段）和1个Fc段（fragment crystallizable，可结晶片段），其中Fab段包含了完整的轻链和重链的VH、CH1，Fc段包含了CH2、CH3。

人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。其中IgG1具有较强的诱导ADCC和CDC效应的能力和较长的血清半衰期，是抗体药最常见的抗体亚型，如Rituximab（抗CD20）、Trastuzumab（抗HER2）；IgG2、IgG4具有较弱的诱导ADCC和CDC效应的能力和较长的血清半衰期，可用于开发以信号阻断、调控或中和作用为主要作用机制的抗体药，如Nivolumab（抗PD-1）、Pembrolizumab（抗PD-1）。

为了实现同一个抗体分子能够靶向CD47、PD-L1两种不同抗原的目的，本发明对抗体结构进行了改造，通过基因工程技术构建了一种类似于抗体结构的不对称的融合蛋白（图2）。该融合蛋白由CD47结合部分和PD-L1结合部分组成，这两部分通过二硫键链接；其中CD47结合部分由对CD47高亲和力的SIRPα突变体（SIRPα-m）和抗体Fc段（主要是CH2、CH3区）连接而成，PD-L1结合部分由抗PD-L1抗体的一条重链和一条轻链通过二硫键链接而成。

为了保证两个部分正确配对、形成异源二聚体而非同源二聚体，本发明还在Fc段上设计了“杵臼结构”（Knob-in-Hole），即在PD-L1结合部分的Fc段上引入2个氨基酸突变(T366W、S354C)、形成突出的Knob的结构，CD47结合部分的Fc段引入4个氨基酸突变(Y349C、T366S、L368A、Y407V)、形成凹陷的Hole的结构，通过空间位阻效应防止同源配对（上述Fc段氨基酸突变位点使用Kabat的Eu编号系统，即Eu numbering scheme）。

融合蛋白中的SIRPα突变体能够以远高于内源性天然SIRPα蛋白的亲和力与CD47抗原结合，因此可阻断巨噬细胞表面的天然SIRPα与癌细胞表面CD47抗原的结合，解除癌细胞对巨噬细胞吞噬作用的抑制和逃避。

抗PD-L1抗体能够与癌细胞表面高表达的PD-L1以高亲和力结合，阻断癌细胞表面的PD-L1与活化的T细胞表面的PD-1结合，解除癌细胞对活化的T细胞的抑制和逃避。

并且由于PD-L1在癌细胞表面表达较高，抗PD-L1的靶向性更强，弥补了CD47特异性差、抗CD47治疗血液毒性严重的不足。

本发明的靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白既能在早期的天然性免疫中起到激活巨噬细胞吞噬肿瘤细胞、提高肿瘤抗原递呈的作用，又能在获得性免疫中起到促进肿瘤特异性T细胞活化和增殖的作用，同时还比单独的抗CD47药物具有更好的肿瘤细胞靶向性、更小的血液毒性，动物实验表明比单独使用抗PD-L1或抗CD47治疗具有更好的抗肿瘤疗效和血液安全性。

附图说明

图1 IgG型抗体的结构示意图；

图2 靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的结构示意图；

图3 靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的非还原SDS-PAGE电泳图；

图4 靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的还原SDS-PAGE电泳图；

图5 靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的体外T细胞激活实验结果；

图6 靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的体外肿瘤细胞吞噬实验结果；

图7 靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的血液毒性试验结果；

图8 靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的体内抑瘤实验结果。

具体实施方式

实施例1、靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的构建、表达

根据SEQ ID NO: 4（编码由SIRPα突变体与抗体Fc段连接而成的融合肽段，带有Y349C、T366S、L368A、Y407V突变形成的Hole结构）、SEQ ID NO: 5（编码抗PD-L1抗体轻链）、SEQ IDNO: 6（编码抗PD-L1抗体重链，带有T366W、S354C突变形成的Knob结构）的核苷酸序列，合成对应的DNA片段，分别插入pcDNA3.1载体中，构建成表达载体pcDNA3.1-SIRPα-m-Fc、pcDNA3.1-antiPDL1-L和pcDNA3.1-antiPDL1-H，共转染至CHO-dhfr-表达宿主细胞，用二氢叶酸还原酶抑制剂氨甲喋呤(MTX)加压筛选高表达克隆，将筛选得到的高表达克隆在DMEM/F-12K培养基（Thermofisher公司）中37℃、8%CO2条件下进行大量培养、诱导表达，培养2周后收集细胞培养液。

实施例2、靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的纯化

采用OD280紫外吸收法测定实施例1收集的细胞培养液中蛋白含量为1.5mg/ml，pH值经测定为7.0。

采用深层过滤系统（Pall公司）对细胞培养液进行澄清过滤，先用孔径0.6-9μm的深层过滤器过滤去除细胞、细胞碎片及不溶性物质，然后用孔径0.1μm以下的深层过滤器去除微细颗粒，收集滤液。

对收集的滤液进行亲和层析纯化，采用GE公司的rProteinA Sepharose 4 FastFlow纯化介质和Avant 150蛋白纯化系统，按30mg蛋白/ml介质的剂量上样，结合缓冲液（Binding Buffer）为pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液（Elution Buffer）为pH3.5的25mM柠檬酸盐缓冲液，流速5ml/min，收集含有目标蛋白的洗脱液，酸性条件下过夜，然后调节pH至7.0，进行理化性质和生物学活性的检测和鉴定。

实施例3、靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定

在还原（二硫苏糖醇DTT）和非还原条件下，对纯化获得的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定，采用分离胶浓度为7.5%的聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量50μg蛋白，电泳结果见图3（非还原SDS-PAGE）、图4（还原SDS-PAGE），泳道1、2为靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的2个重复样品，电泳结果表明目标蛋白分子量约为110kD，纯度大于98%。

实施例4、对照品的制备与鉴定

根据SEQ ID NO: 9（编码由SIRPα突变体与抗体Fc段连接而成的融合肽段，并且不带“Hole”结构）、SEQ ID NO: 10（编码抗PD-L1抗体重链，并且不带“Knob”结构）的核苷酸序列，合成对应的DNA片段，分别插入pcDNA3.1载体中，构建成表达载体pcDNA3.1-SIRPα-m-Fc’和pcDNA3.1-antiPDL1-H’。

将pcDNA3.1-SIRPα-m-Fc’转染至CHO-dhfr-表达宿主细胞，筛选高表达细胞株，采用实施例1、2中的细胞培养和蛋白纯化方法制备对照品SIRPα-m-Fc融合蛋白。

将pcDNA3.1-antiPDL1-H’和实施例1中制备的pcDNA3.1-antiPDL1-L共转染CHO-dhfr-表达宿主细胞，筛选高表达细胞株，采用实施例1、2中的细胞培养和蛋白纯化方法制备对照品抗PD-L1抗体。

采用实施例3中的SDS-PAGE方法对制备的上述对照品进行分子量和纯度鉴定，结果表明SIRPα-m-Fc分子量约为80kD（二聚体形式），抗PD-L1抗体分子量约为150kD，二者纯化后的纯度均在95%以上。

实施例5、靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的解离常数测定

使用BIAcore 3000，将重组人CD47（购自Sigma-Aldrich公司，货号SRP6392）或重组人PD-L1（购自Sigma-Aldrich公司，货号SRP6434）化学偶联到目标通道Fc2，偶联量>1000RU。通道Fc1进行封闭处理，作为对照通道。对靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白和对照品SIRPα-m-Fc、抗PD-L1进行梯度浓度稀释，100、 50、 25、 12. 5、 6. 25 和3.125 nmol/L，测定对芯片表面偶联的CD47或PD-L1的结合曲线，并使用软件中的 Wizard 程序，记录信号Fc2-1 。以“1:1带有基线漂移的结合”为分析模块获得亲和力数据。测定结果表明，靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白对重组人CD47和重组人PD-L1的解离常数分别为4.5×10^-10M和3.1×10^-11M，而对照品SIRPα-m-Fc对人CD47的解离常数为4.3×10^-10M，对照品抗PD-L1对PD-L1的解离常数为3.2×10^-11M。

实施例6、靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的体外T细胞激活实验

将稀释的全血以150μL/孔的剂量铺96孔板，各孔中加入靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白及或对照品，对照品包括自行制备的SIRPα-m-Fc、抗PD-L1，以及阴性对照静注人免疫球蛋白（hIgG1，购自山东泰邦生物制品有限公司），受试样品及各对照品的终浓度为100nM，或加入同等体积的空白对照PBS（磷酸盐缓冲液），预孵育1小时，然后加入葡萄球菌肠毒素B（SEB）至终浓度1μg/mL，孵育3天后取细胞培养上清液，用ELISA测定其中IL-2含量，测定结果见图5，图中数据表明靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白（Bi-Fusion）能显著激活T细胞分泌IL-2的水平。

实施例7、靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的体外促吞噬作用实验

将2×10⁶小鼠肿瘤细胞（CT26，ATCC编号CRL-2638）与2000μL 5μM CSFE（2-羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯，一种活体荧光染料）溶液37℃避光孵育20min，然后加入10mL完全培养基孵育5min，以去除溶液中未结合的CSFE。离心收集标记好的肿瘤细胞并重悬于完全培养基中，制成浓度为1×10⁶/mL的肿瘤细胞悬液。

在24孔板中每孔加入1mL浓度为5×10⁴ cell/mL的小鼠巨噬细胞RAW264.7（ATCCTIB-71）悬液，待巨噬细胞贴壁后，弃去孔板中培养基，再加入无血清培养基孵育2小时，然后每孔中后加入CFSE标记好的肿瘤细胞2×10⁵个，同时加入终浓度为100nM的靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白或对照品SIRPα-m-Fc、抗PD-L1、静注人免疫球蛋白（hIgG1）或同样体积的空白对照PBS，37℃孵育2h，然后将巨噬细胞洗2次，用倒置显微镜拍照观察，以每100个巨噬细胞吞噬有CFSE阳性细胞百分比为吞噬指数（Phagocytosis Index），测定结果见图6，图中数据表明靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白（Bi-Fusion）能显著促进巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。

实施例8、靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的血液毒性实验

分别向6-8周龄健康的Balb/C小鼠尾静脉注射靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白20mg/kg或对照品（SIRPα-m-Fc融合蛋白15mg/kg、抗PD-L1抗体27mg/kg、静注人免疫球蛋白27mg/kg、或PBS 0.2ml），给药24小时后，经眼眶取血500ul至EP管中，加入1%肝素钠10ul防止血液凝结，分析小鼠血液中血红细胞（Red Blood cells）、血红蛋白（Hemoglobin）等指标，分析结果见图7，图中数据表明靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白（Bi-Fusion）对小鼠血红细胞和血红蛋白的影响非常小，血液毒性显著低于SIRPα-m-Fc融合蛋白。

实施例9、靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白的小鼠体内抑瘤实验

对6-8周龄的Balb/C小鼠皮下接种CT26肿瘤细胞5×10^5个，在接种后第1、4、7、11、14、17、21天尾静脉注射靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白20mg/kg或对照品（SIRPα-m-Fc融合蛋白15mg/kg、抗PD-L1抗体27mg/kg、静注人免疫球蛋白27mg/kg、或PBS 0.2ml），每周两次观察小鼠测量肿瘤大小，结果见图8，图中数据表明靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白（Bi-Fusion）在小鼠体内对肿瘤细胞的抑制效果显著好于单独使用抗PD-L1或SIRPα-m-Fc融合蛋白。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海张江生物技术有限公司

<120> 一种靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 350

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 双功能融合蛋白的CD47结合部分的氨基酸序列

<400> 1

Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

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Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro

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Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu

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Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

115 120 125

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

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Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

180 185 190

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

195 200 205

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210 215 220

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

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260 265 270

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<223> 双功能融合蛋白的PD-L1结合部分的重链氨基酸序列

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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 4

<211> 1053

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 双功能融合蛋白的CD47结合部分的核苷酸编码序列

<400> 4

gaagaagaac tgcagatcat ccagccggac aaatctgttt ctgttgcggc gggtgaatct 60

gcgatcctgc actgcaccat cacctctctg ttcccggttg gtccgatcca gtggttccgt 120

ggtgcgggtc cggcgcgtgt tctgatctac aaccagcgtc agggtccgtt cccgcgtgtt 180

accaccgttt ctgaaaccac caaacgtgaa aacatggact tctctatctc tatctctaac 240

atcaccccgg cggacgcggg cacctactac tgcatcaaat tccgtaaagg ttctccggac 300

accgaattta aatctggtgc gggcaccgaa ctgtctgttc gtgcgaaacc gtctgagccc 360

aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 420

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 480

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 540

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 600

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 660

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 720

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 780

ctgaccaaga accaggtcag cctgtcctgc gccgtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 840

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 900

ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 960

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1020

cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa tga 1053

<210> 5

<211> 645

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 双功能融合蛋白的PD-L1结合部分的轻链核苷酸编码序列

<400> 5

gatatacaga tgacccagag cccatcttct ctcagcgcat ctgtgggcga ccgtgtcacc 60

atcacttgtc gtgccagtca ggacgtctcc actgccgtcg cctggtacca acagaagcct 120

gggaaggcgc caaaactgtt aatctactcc gctagttttc tctacagcgg tgtgccatcc 180

aggttcagcg gttctgggtc gggcacagat tttaccctga ccatcagctc tctccagcct 240

gaggacttcg ctacctacta ttgtcagcag tacttgtacc accctgctac cttcggccag 300

gggacaaagg tggagatcaa gcgcacagtc gctgcccctt ccgtgttcat ttttcctccc 360

tctgacgagc agctaaagag cggtaccgct tcagtcgtgt gtttactgaa caacttttac 420

cctcgggaag ccaaggtcca gtggaaggtt gacaacgcac tccagtccgg caattcgcag 480

gagtctgtta ccgagcaaga ctccaaggac agcacatact ccctttcatc aactttgacg 540

ttgtctaagg ctgactacga gaagcataaa gtgtatgctt gcgaggtgac acatcagggc 600

ctgagttccc cagttaccaa atcattcaat cggggggaat gctga 645

<210> 6

<211> 1347

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 双功能融合蛋白的PD-L1结合部分的重链核苷酸编码序列

<400> 6

gaagtacagc tggtcgagag tggcgggggg ttggtgcagc ccggagggtc cctgcggctg 60

agttgcgccg cctccgggtt taccttctcc gactcttgga ttcactgggt gcgacaggcc 120

cctgggaaag gtctcgaatg ggtggcttgg atcagcccct acggcggatc aacctattat 180

gctgattccg tgaaggggcg cttcaccata tctgccgaca ccagtaaaaa cacagcttac 240

ctccagatga actccctgag agcagaggat actgccgtct attattgtgc cagaaggcac 300

tggccgggcg gctttgatta ctgggggcag ggcaccctcg tgaccgtgtc atctgctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aagagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catgccggga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctcccgg taaatga 1347

<210> 7

<211> 350

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 对照品SIRPα-m-Fc融合蛋白的氨基酸序列

<400> 7

Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

115 120 125

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

165 170 175

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

180 185 190

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

195 200 205

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

210 215 220

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

225 230 235 240

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

245 250 255

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

260 265 270

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

275 280 285

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

290 295 300

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

305 310 315 320

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

325 330 335

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345 350

<210> 8

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 对照品抗PD-L1抗体的重链氨基酸序列

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 9

<211> 1053

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 对照品SIRPα-m-Fc融合蛋白的核苷酸编码序列

<400> 9

gaagaagaac tgcagatcat ccagccggac aaatctgttt ctgttgcggc gggtgaatct 60

gcgatcctgc actgcaccat cacctctctg ttcccggttg gtccgatcca gtggttccgt 120

ggtgcgggtc cggcgcgtgt tctgatctac aaccagcgtc agggtccgtt cccgcgtgtt 180

accaccgttt ctgaaaccac caaacgtgaa aacatggact tctctatctc tatctctaac 240

atcaccccgg cggacgcggg cacctactac tgcatcaaat tccgtaaagg ttctccggac 300

accgaattta aatctggtgc gggcaccgaa ctgtctgttc gtgcgaaacc gtctgagccc 360

aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 420

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 480

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 540

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 600

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 660

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 720

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 780

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 840

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 900

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 960

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1020

cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa tga 1053

<210> 10

<211> 1347

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 对照品抗PD-L1抗体的重链核苷酸编码序列

<400> 10

gaagtacagc tggtcgagag tggcgggggg ttggtgcagc ccggagggtc cctgcggctg 60

agttgcgccg cctccgggtt taccttctcc gactcttgga ttcactgggt gcgacaggcc 120

cctgggaaag gtctcgaatg ggtggcttgg atcagcccct acggcggatc aacctattat 180

gctgattccg tgaaggggcg cttcaccata tctgccgaca ccagtaaaaa cacagcttac 240

ctccagatga actccctgag agcagaggat actgccgtct attattgtgc cagaaggcac 300

tggccgggcg gctttgatta ctgggggcag ggcaccctcg tgaccgtgtc atctgctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aagagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctcccgg taaatga 1347

Claims

1.一种靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白，其特征在于，既能与CD47分子结合，也能与PD-L1分子结合。

2.权利要求1的融合蛋白，其特征在于，由二硫键链接的两个部分组成，其中一部分能与CD47结合，由SIRPα突变体和抗体的Fc段连接而成；另一部分能与PD-L1结合，由抗PD-L1抗体的轻链和重链通过二硫键链接而成。

3.权利要求2的融合蛋白，其特征在于，所述的抗体和抗体的Fc段为IgG型。

4.权利要求3的融合蛋白，其特征在于，所述的抗体和抗体的Fc段为IgG1亚型。

5.权利要求4的融合蛋白，其特征在于，CD47结合部分具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列；PD-L1结合部分的轻链具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，重链具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。

6.权利要求5的融合蛋白，其特征在于，CD47结合部分由SEQ ID NO: 4的核苷酸序列编码；PD-L1结合部分的轻链由SEQ ID NO:5 的核苷酸序列编码，重链由SEQ ID NO: 6的氨基酸序列编码。

7.权利要求1-6的融合蛋白在制造肿瘤防治药物上的应用。

8.权利要求1-6的融合蛋白在制造免疫调节药物上的应用。