CN113321735A - 一种多功能融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种融合蛋白，其包含特异性结合PD‑L1的第一结合域，特异性结合CD47的第二结合域，以及与FcR结合的第三结合域，其中第一结合域与第二结合域通过接头连接。本发明还提供了包含所述融合蛋白的组合物及其用途。

Description

一种多功能融合蛋白
技术领域
本发明涉及多功能融合蛋白，特别是特异性结合PD-L1与CD47的多功能融合蛋白。
背景技术
PD-L1与PD-1
程序性死亡分子PD-1及其配体PD-L1是适应性免疫检查点抑制剂的靶点，正常情况下，组织表面的PD-L1与淋巴细胞表面的PD-1结合后，可以抑制淋巴细胞功能，诱导淋巴细胞的凋亡，从而在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病中发挥重要作用。研究表明多种肿瘤细胞表达PD-L1，可以与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1分子结合，抑制CD4和CD8T淋巴细胞的功能和细胞因子的释放，诱导淋巴细胞凋亡，从而导致肿瘤发生免疫逃逸。
目前已经有多个针对PD-L1/PD-1靶点药物的药物上市，对于肿瘤的治疗有了革命性的改变。但是这疗法的平均有效率仍在20％左右，且受到PD-L1表达水平的限制，临床仍然需要有效的其它肿瘤治疗药物，目前已把研究方向转向了另一个领域-先天免疫系统的药物开发。
CD47与SIRPα
巨噬细胞属于天然免疫系统，是抗肿瘤免疫的第一道防线，研究表明巨噬细胞广泛分布于肿瘤组织中，在肿瘤组织中的比例为20％-40％。表达在巨噬细胞表面的信号调节蛋白α(SIRPα)和在靶细胞表面的CD47结合形成的抗吞噬信号轴，是巨噬细胞免疫检查点重要的通路。研究表明多种肿瘤细胞(急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病乳腺癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、弥漫性大B细胞、淋巴瘤、结肠癌)等均高表达CD47，肿瘤细胞表面CD47与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α(SIRPα)结合后，传导“别吃我”信号，抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，其表达水平与肿瘤的侵袭能力、患者的预后密切相关。因而阻断CD47-SIRPα激活巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用成为新的抗肿瘤药物研究热点。
Fc与ADCC和ADCP
抗体的Fc段可以与免疫细胞表面表达的Fc受体(FcγRI，FcγRII，FcγRIII)、血液中的补体(C1q)和FcRn结合，从而激活免疫效应清除外来物等。而Fc段决定抗体的效应功能，包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，以及补体依赖的细胞毒性作用(CDC)。
ADCC，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)，是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等)表面的FcR结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞，是抗肿瘤的治疗性抗体药物发生作用的一种作用重要机制。
CN111763261A公开了一种能够特异性结合PD-L1和CD47的融合蛋白，虽然具有同时阻断PD-1/PD-L1和CD47/SIRPα的相互作用，但是并未报道融合蛋白的ADCC效应，也未考虑红细胞凝聚的现象。
PCT/CN2018/111745公开了一种同时与CD47和PD-L1结合的重组双功能融合蛋白，但是并未考虑红细胞凝聚的现象。
由于红细胞表面表达CD47分子，严重的贫血反应是靶向CD47抗体药物临床开发的主要障碍，因此，红细胞凝聚现象是药物研发过程中必须重视的一个问题。而目前尚未公开没有红细胞凝聚现象的、同时与CD47和PD-L1结合的融合蛋白。
本发明是首次公开同时具有阻断PD-1/PD-L1的相互作用、阻断CD47/SIRPα的相互作用、具有ADCC效应、具有ADCP效应、且未出现红细胞凝聚现象的PD-L1/SIRPα融合蛋白。
发明内容
本发明公开的多功能融合蛋白PD-L1/SIRPα是可以同时靶向适应性免疫系统PD-L1和天然免疫系统CD47的双功能协同融合蛋白。本发明融合蛋白结构具有抗PD-L1抗体，可以阻断PD-L1/PD1信号转导从而激活T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤。其SIRPα结构可以与CD47结合，激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。2个信号通路存在协同的放大作用，激活的巨噬细胞也可以将吞噬处理的肿瘤抗原进一步提呈给T细胞，进一步激活T细胞对肿瘤的杀伤，使得T细胞的反应更加持久。本发明融合蛋白具有正常的IgG1 Fc功能，其Fc可以与效应细胞(NK细胞，巨噬细胞)Fc受体或补体结合，介导对CD47和/或PD-L1阳性肿瘤细胞的ADCC、ADCP活性。
本发明提供了一种融合蛋白，其包含特异性结合PD-L1的第一结合域和特异性结合CD47的第二结合域，其所述第一结合域与第二结合域通过接头连接。
在可选的实施方案中，所述第一结合域为抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在可选的实施方案中，所述第二结合域为SIRPα信号调节蛋白的胞外Ig样结构域或其变体。
在可选的实施方案中，所述抗PD-L1抗体的至少一个互补位在重链或轻链的N端经接头与SIRPα信号调节蛋白的胞外Ig样结构域或其变体连接。
在可选的实施方案中，SIRPα信号调节蛋白的胞外Ig样结构域或其变体为SIRPαD1。
在可选的实施方案中，所述抗PD-L1抗体包含两条重链和两条轻链，抗体重链或其片段包含SEQ ID NO：2所示的HCDR1、SEQ ID NO：3所示的HCDR2和SEQ ID NO：4所示的HCDR3，抗体轻链或其片段包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQID NO：8所示的LCDR3。
在可选的实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链具有与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链具有与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在可选的实施方案中，其中抗PD-L1抗体的重链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
在可选的实施方案中，其中抗PD-L1抗体的轻链具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
在可选的实施方案中，所述SIRPαD1的序列为SEQ ID NO：9。
在可选的实施方案中，所述接头的序列为SEQ ID NO：10。
在可选的实施方案中，所述融合蛋白还包含与FcR结合的第三结合域。
在可选的实施方案中，所述第三结合域能够结合位于B淋巴细胞、滤泡树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞或肥大细胞表面的FcR。
在可选的实施方案中，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区。
在可选的实施方案中，所述重链恒定区包含IgG，优选为IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4，更优选为IgG1。
本发明还提供了免疫缀合物，其包含上述任一项所述的融合蛋白。
本发明还提供了一个或多个分离的核酸分子，其编码上述任一项所述的融合蛋白或者上述所述的免疫缀合物。
本发明还提供了一个或多个载体，其包含上述所述的核酸分子。
本发明还提供了组合物，其包含上述任一项所述的融合蛋白，上述所述的免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了细胞，其包含上述任一项所述的融合蛋白，上述所述的免疫缀合物，上述所述的核酸分子，或上述所述的载体。
本发明还提供了制备上述任一项所述的融合蛋白的方法，其包括在使得所述融合蛋白能够表达的条件下培养上述所述的细胞。
本发明还提供了上述任一项所述的融合蛋白，上述所述的免疫缀合物，上述所述的核酸分子，上述所述的载体，上述所述的组合物，或上述所述的细胞在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗肿瘤。
在可选的实施方案中，其中所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。
在可选的实施方案中，其中所述实体瘤和非实体瘤包括多发性骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、神经胶质瘤、生殖细胞瘤、肉瘤、见皮瘤、胎盘瘤、脑癌、骨癌、皮肤癌、鼻咽癌、肺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和睾丸癌、上额窦瘤、下咽癌、嗅母细胞瘤、舌癌、牙龈癌、壶腹癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、阴茎癌、输卵管癌、眼睑癌、视母细胞瘤。
因此，本发明涉及以下技术方案：
1.一种融合蛋白，其包含特异性结合PD-L1的第一结合域和特异性结合CD47的第二结合域，其特征在于，所述第一结合域与第二结合域通过接头连接。
2.如方案1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一结合域为抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
3.如方案2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二结合域为SIRPα信号调节蛋白的胞外Ig样结构域或其变体。
4.如方案3所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体的至少一个互补位在重链或轻链的N端经接头与SIRPα信号调节蛋白的胞外Ig样结构域或其变体连接。
5.如方案3所述的融合蛋白，其特征在于，其中SIRPα信号调节蛋白的胞外Ig样结构域或其变体为SIRPαD1。
6.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体包含两条重链和两条轻链，抗体重链或其片段包含SEQ ID NO：2所示的HCDR1、SEQ ID NO：3所示的HCDR2和SEQ ID NO：4所示的HCDR3，抗体轻链或其片段包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
7.如方案6所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体的重链具有与SEQ IDNO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链具有与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
8.如方案6所述的融合蛋白，其中抗PD-L1抗体的重链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
9.如方案6所述的融合蛋白，其中抗PD-L1抗体的轻链具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
10.如方案5所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRPαD1的序列为SEQ ID NO：9。
11.如方案3所述的融合蛋白，其特征在于，所述接头的序列为SEQ ID NO：10。
12.如方案1-11中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含与FcR结合的第三结合域。
13.如方案12所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区。
14.如方案13所述的融合蛋白，其特征在于，所述重链恒定区包含IgG，优选为IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。
15.免疫缀合物，其包含方案1-14中任一项所述的融合蛋白。
16.一个或多个分离的核酸分子，其编码根据方案1-14中任一项所述的融合蛋白或者根据方案15所述的免疫缀合物。
17.一个或多个载体，其包含方案16所述的核酸分子。
18.组合物，其包含根据方案1-14中任一项所述的融合蛋白，根据方案15所述的免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的赋形剂。
19.细胞，其包含方案1-14中任一项所述的融合蛋白，方案15所述的免疫缀合物，方案16所述的核酸分子，或方案17所述的载体。
20.制备根据方案1-14中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括在使得所述融合蛋白能够表达的条件下培养根据方案19所述的细胞。
21.方案1-14中任一项所述的融合蛋白，方案15所述的免疫缀合物，方案16所述的核酸分子，方案17所述的载体，方案18所述的组合物，或方案19所述的细胞在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗肿瘤。
22根据方案21所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。
23.根据方案22所述的用途，其中所述实体瘤和非实体瘤包括多发性骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、神经胶质瘤、生殖细胞瘤、肉瘤、见皮瘤、胎盘瘤、脑癌、骨癌、皮肤癌、鼻咽癌、肺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和睾丸癌、上额窦瘤、下咽癌、嗅母细胞瘤、舌癌、牙龈癌、壶腹癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、阴茎癌、输卵管癌、眼睑癌、视母细胞瘤。
有益效果
本发明公开的多功能融合蛋白PD-L1/SIRPα能够阻断PD-1/PD-L1信号，抑制T细胞的凋亡，激活T细胞分泌细胞因子；能够阻断CD47/SIRPα信号，抑制巨噬细胞的凋亡，激活巨噬细胞吞噬肿瘤细胞；能够发挥ADCC活性，特异性杀伤肿瘤细胞；而且并未出现红细胞凝聚现象。
术语
在本说明书中，术语“抗体”是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成而制备的免疫球蛋白。抗体可从天然存在该抗体的血浆或血清等的天然资源、或者产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中、动物免疫血清中、噬菌体文库筛选进行重建得到分离。备选地，可通过使用基因重组等的技术部分或完全地合成。优选的抗体包括，例如，免疫球蛋白的同种型或这些同种型的亚类的抗体。已知人免疫球蛋白包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类别(同种型)。在这些同种型中，本发明的抗体可以包括IgGl、IgG2、IgG3和/或IgG4。
在本说明书中，术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用，本文中所使用的部分抗体由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成，或者只有轻链恒定区(CL)。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的多肽片段，例如全长抗体的多肽片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(如技术来自Ablynx)、结构域抗体(如技术来自Domantis)、和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，而与修饰(例如磷酸化或糖基化)无关。术语多肽包括蛋白质及其片段。多肽可以是“外源的”，意指它们是“异源的”，即是所利用的宿主细胞外来的，例如由细菌细胞产生的人多肽。本文将多肽公开为氨基酸残基序列。那些序列按氨基末端到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列以三字母或单字母代码命名，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。本文所述抗体中氨基酸位置的编号(例如Fc区的氨基酸残基)和目标区域(例如CDR)，使用Kabat系统。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，Clustal W，Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。
术语“融合蛋白”指由两个或更多个蛋白或多肽融合得到的蛋白。融合蛋白可通过重组DNA技术人工制备。例如，编码所述两个或更多个蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此连接而成形成融合基因或融合的核酸分子，该融合基因或融合的核酸分子可编码所述融合蛋白。所述融合基因的翻译可以产生单一多肽，其可以具有融合前的所述两个或更多个蛋白多多肽中至少一个、或者每一个的性质。
术语“宿主细胞”指已经或者能够用核酸序列转化并从而表达所选的目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论该后代与原来的亲本细胞在形态或基因组成上是否相同，只要后代存在所选目的基因即可。常用的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，诸如油/水乳液或水/油乳液，和各种类型的润湿剂。
术语“SIRPαD1”为SIRPα的膜外端第一个区域Domain 1。
术语FcR是指能够结合多功能融合蛋白中抗体或抗原结合片段的Fc端的受体。
附图说明
图1为本发明融合蛋白的结构示意图。
图2为本发明融合蛋白与CD47的结合活性。
图3为本发明融合蛋白与PD-L1的结合活性。
图4为本发明融合蛋白对Raji细胞的ADCC效应。
图5为本发明融合蛋白对HCC827细胞的ADCC效应。
图6为本发明融合蛋白刺激T细胞激活释放细胞因子IFN-γ。
图7为本发明融合蛋白刺激T细胞激活释放细胞因子IL-2。
图8为本发明融合蛋白对巨噬细胞的激活实验。
图9为本发明融合蛋白对Jurkat-CSR的细胞凋亡抑制。
图10为本发明融合蛋白对Jurkat-CPR的细胞凋亡抑制。
图11为本发明融合蛋白的ADCP效应示意图。
图12为本发明融合蛋白对红细胞的凝集结果示意图。
图13a-图13c为小鼠的肿瘤体积曲线图，其中图13a为对照小鼠的肿瘤体积曲线图，图13b为小鼠使用本发明融合蛋白后的肿瘤体积曲线图，图13c为小鼠使用SIRPα和抗PD-L1抗体后的肿瘤体积曲线图。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。在本发明的说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1本发明融合蛋白的构建与表达
该实施例描述示例性多功能融合蛋白PD-L1/SIRPα的构建和表达。本发明融合蛋白为对称结构，包含两条重链和两条轻链，其结构示例图如图1所示。
本发明融合蛋白的轻链和重链氨基酸序列信息选自自研的PD-L1靶点单抗序列信息，分析获得该序列的可变区和恒定区信息。将SIRPα序列通过接头连接至抗PD-L1抗体的重链氨基酸序列的N端。根据需要，调整所述多功能融合蛋白氨基酸序列的Fc为其他IgG类型，由此得到目标多功能融合蛋白PD-L1/SIRPα的氨基酸/核苷酸序列：
重链氨基酸序列为SEQ ID NO:11，重链核苷酸序列为SEQ ID NO:12；
轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:13，轻链核苷酸序列为SEQ ID NO:14。
利用分子克隆技术，将融合蛋白片段插入PCDNA3.1载体中，构建成哺乳动物细胞表达质粒，利用脂质体转染方式，导入宿主细胞株CHO细胞，利用细胞fed-batch获得发酵上清液，取发酵液上清进行亲和层析、离子交换层析等一系列步骤的纯化，最终纯化得到构建的本发明融合蛋白。
实施例2本发明融合蛋白与CD47的结合活性
将人CD47稀释到0.5μg/mL，包被到96孔酶标板中，100μL/孔，4℃过夜。PBST洗涤后，用3％脱脂奶粉封闭，300μL/孔，37℃孵育1h。
将参比品和供试品用3％脱脂奶粉稀释为10μg/mL，以此为初始浓度进行3倍稀释，共稀释11个梯度，另设1个空白孔，只加稀释液。100μL/孔，37℃孵育1h。PBST洗涤后，加酶标二抗：用3％脱脂奶粉将Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab’)2Fragment GoatAnti-Human IgG按1：50000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。PBST洗涤6次。加入TMB显色液，100μL/孔，并用铝箔纸包好，37℃避光显色8min。加入终止液1M HCl终止显色反应，100μL/孔。在酶标仪上450nm处读数，结果如图2所示。
由图2可知，本发明融合蛋白与CD47有较好的结合活性。
实施例3本发明融合蛋白与PD-L1的结合活性
将人PD-L1蛋白稀释为0.5μg/ml，包被到96孔酶标板中，100μL/孔，4℃过夜。PBST洗涤后，用3％脱脂奶粉封闭，300μL/孔，37℃孵育1h。PBST洗涤后，将参比品和供试品用3％脱脂奶粉稀释为10μg/ml，以此为初始浓度进行3倍稀释，共稀释11个梯度，另设1个空白孔，只加稀释液。100μL/孔，37℃孵育1h。PBST洗涤后，加酶标二抗：用3％脱脂奶粉将Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab’)2Fragment Goat Anti-Human IgG按1：50000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板机洗涤6次。加入TMB显色液，100μL/孔，并用铝箔纸包好，37℃避光显色8min。加入终止液1M HCl终止显色反应，100μL/孔。在酶标仪上450nm处读数，结果如图3所示。
由图3可知，本发明融合蛋白与PD-L1有较好的结合活性。
实施例4本发明融合蛋白的ADCC效应
HCC827细胞、Raji-PDL1细胞以2×104个，50μL/孔均匀铺于96孔U型细胞培养板。随后，加入6×104个FcR-TANK(NK)细胞，50μL/孔。不同浓度的本发明融合蛋白、SIRPα-Fc蛋白、抗PD-L1单抗、SIRPα-Fc蛋白和抗PD-L1单抗蛋白(联合使用)及IgG1抗体进行系列稀释后，100μL/孔加入细胞板，同时设靶细胞最大裂解孔(M)、靶细胞自发释放孔(ST)、效应细胞自发释放孔(SE)、体积补偿孔(BV)和培养基补偿孔(BM)，离心(250g，4分钟)后，于恒温CO2培养箱中培养4小时。采用LDH试剂盒，于490nm测定各孔的吸光值，将靶细胞最大裂解孔(M)扣除体积补偿孔(BV)本底，其它各孔扣除培养基补偿孔(BM)，计算细胞死亡率(％)。
Figure BDA0003074650270000111
Raji-PDL1细胞的实验结果如图4所示，EC50如表1所示。
表1
Figure BDA0003074650270000112
由图4和表1可知，本发明融合蛋白通过与Raji-PDL1细胞表面的PD-L1结合，Fc起到的ADCC效应功能显著优于抗PD-L1单抗、SIRPα-Fc蛋白和抗PD-L1单抗蛋白联合使用、SIRPα-Fc蛋白及IgG1。
HCC827细胞的实验结果如图5所示，EC50如表2所示。
表2
Figure BDA0003074650270000113
由图5和表2可知，本发明融合蛋白通过与HCC827细胞表面的PD-L1结合，Fc起到的ADCC效应功能显著优于抗PD-L1单抗、SIRPα-Fc蛋白和抗PD-L1单抗蛋白联合使用、SIRPα-Fc蛋白及IgG1。
实施例5本发明融合蛋白对T细胞的激活实验
通过CD4+T细胞分离试剂盒从健康人外周血中分离获取CD4+T细胞，使用相应完全培养基于37℃、5％CO2培养箱中进行培养。通过单核细胞分离试剂盒从健康人外周血中分离单核细胞后，诱导获取树突细胞。并通过FACS检测分化诱导成熟的树突状细胞表面标志物CD1a，CD83，CD86，HLA-DR，CD40和单核细胞表面标志物CD14鉴定树突细胞，收集效应细胞(CD4+T细胞)，400xg离心10min，弃上清后用1640完全培养基重悬；用1640完全培养基梯度稀释抗体供试品和对照品，制备抗体工作液；将效应细胞接种于96孔板，再加入抗体工作液，400x g离心10min收集刺激细胞(树突状细胞)，向相应的孔板中加入刺激细胞，并混匀将孔板放置恒温CO2培养箱中孵育3天，取细胞上清分别检测上清中IFN-γ和IL-2的含量，结果如图6和图7所示。
由结果可知，本发明融合蛋白介导抗原呈递细胞激活T细胞并分泌IFN-γ和IL-2，而SIRPα-Fc蛋白不能介导抗原呈递细胞激活T细胞，不能刺激T细胞分泌IFN-γ和IL-2。
实施例6本发明融合蛋白对巨噬细胞的激活实验
40只食蟹猴随机分成4组，每组雌雄各5只，约为3到4岁；雄性动物体重范围2.5至3.5千克，雌性动物体重范围2.3至2.7千克。通过静脉输注给药5次，在每次给药后1-4h和24h检测其MIP-1α和MIP-1β含量，用于巨噬细胞激活的研究，实验结果如图8所示。
由结果可知，无论是低剂量组、中剂量组，还是高剂量组，本发明的融合蛋白都对巨噬细胞有很好的激活效果，而溶媒对照组对巨噬细胞没有激活作用。
实施例7本发明融合蛋白逆转T细胞的凋亡实验
CD47结合端阻断活性实验
CD47-Fc蛋白溶液以50μL/孔加入样品孔及阴性对照孔，随后将稀释好的本发明融合蛋白、SIRPα-Fc蛋白及IgG1抗体用排枪每孔50μL加入样品孔，样品2倍稀释至173.4nM后均5倍稀释，共8个浓度梯度。加样完毕后，将96孔细胞培养板放置于恒温CO2培养箱中孵育45min。通过稀释液调整Jurkat-CSR细胞的密度为5×105个/ml，待CD47蛋白与抗体孵育后，以100μL/孔加入96孔细胞培养板中的样品孔、阴性对照孔和阳性对照孔(阳性对照指只含有细胞的对照孔)，而空白对照孔、阳性对照孔及阴性对照孔补加同等体积的稀释液，置于恒温CO2培养箱中孵育24h。然后加入CCK-8显色液，20μL/孔，将96孔细胞培养板放置于CO2培养箱中继续孵育4h。使用酶标仪，在波长450nm下测定吸光度，记录测定结果。
对实验数据按照如下公式进行计算：
Figure BDA0003074650270000132
实验结果如图9所示，本发明融合蛋白能有效阻断CD47/SIRPα信号通路，抑制CD47蛋白对Jurkat-CSR细胞的活化诱导死亡作用，且较SIRPα-Fc融合蛋白的阻断活性没有明显差异。
PDL1结合端阻断活性实验
Raji-PDL1细胞以每孔1×104个细胞铺于96孔板。50μl/孔加入稀释好的本发明融合蛋白、抗PD-L1单抗、IgG1抗体，3倍稀释，共8个浓度梯度。于恒温CO2培养箱中孵育45min。随后，以每孔3×104个加入Jurkat-CPR细胞，100μL/孔。同时设置空白对照组(200μlRPMI1640完全培养基)，Raji-PDL1对照组(150μL RPMI1640完全培养基+50μl Raji-PDL1)，Jurkat-CPR对照组(100μL RPMI1640完全培养基+100μL Jurkat-CPR)，阴性对照组(50Μl1640完全培养基+50μL Raji-PDL1+100μl Jurkat-CPR)。加样完毕后，再将96孔细胞培养板置于恒温CO2培养箱中孵育24h，然后加入CCK-8显色液，20μL/孔，将96孔细胞培养板放置于CO2培养箱中继续孵育4h。使用酶标仪，在波长450nm下测定吸光度，记录测定结果。
对实验数据按照如下公式进行计算：
Figure BDA0003074650270000131
实验结果如图10所示，本发明融合蛋白抑制Raji-PDL1细胞对Jurkat-CPR细胞的活化诱导死亡作用较抗PD-L1单抗的抑制作用更强。
实施例8本发明融合蛋白的ADCP效应
Ana-1细胞以1×106/mL，每孔100μL铺于96孔板于恒温CO2培养箱过夜培养。HL-60由IMDM培养基清洗一次后调整细胞密度为1×106/mL，加入2μM的CFSE于培养箱对细胞染色30min。染色后IMDM培养基重悬，将细胞密度调整为3×106/mL。将稀释好的本发明融合蛋白、SIRPα-Fc蛋白、IgG1抗体2倍梯度稀释12个浓度，HL-60细胞与100μL上述稀释好的样品混合，随后，Ana-1细胞将上清吸尽。加入上述处理的HL-60细胞与样品混合物200μL，于培养箱孵育2小时。每孔200μL PBS清洗96孔板洗涤5次。洗涤结束后，每孔加入200μLPBS，反复吹打将Ana-1细胞吹打下来。流式检测，分析Ana-1细胞绿色荧光强度，结果如图11所示。
本发明融合蛋白能显著诱导Ana-1细胞对HL-60细胞的吞噬作用，且吞噬作用强于SIRPα-Fc蛋白。
实施例9本发明融合蛋白对红细胞的溶血实验
采集新鲜血液，混匀后放入15mL离心管中，加3mL全血，低速2000-4000rpm离心15-30分钟，使红细胞沉降在管底部，吸弃上层杂质、上清等。
取50-100μL最下层红细胞加到1.5mL离心管中，再加200μl PBS缓冲液；低速2000-4000rpm离心5-10分钟，清洗。
吸取最下层清洗后红细胞，按体积比1％，加适量PBS缓冲液，颠倒混匀，重悬为1％(v/v)的红细胞悬液。吸取最下层清洗后红细胞100μL，按体积加900μL PBS缓冲液，颠倒混匀，重悬为1％(v/v)的红细胞悬液。
所有待测样品，用PBS缓冲液均先稀释到8000nM；再按3倍比例，用PBS缓冲液梯度稀释。共计12个稀释度。PBS缓冲液作为阴性对照。
凝血板中，先加1％(v/v)的人红细胞悬液，50μL/孔。再由低浓度向高浓度，加梯度稀释的样品溶液，50μL/孔。混合物中，待测样品为起始浓度4000nM的梯度稀释液(浓度范围为4000nM至0.023nM)，红细胞悬液为0.5％(v/v)。室温、静置，1-2小时内观察红细胞凝集情况，拍照记录，结果如图12所示。
其中hB6H12为嵌合抗体，B6H12(抗CD47抗体Fab)可变区序列来源于NCBI数据库(PDB:5TZU_H/PDB:5TZU_L)，融合人源IgG1-Fc，CHO细胞表达。
由结果可知，样品为hB6H12-Fc时，出现严重的红细胞凝集现象；样品为抗PD-L1抗体或IgG1时，出现轻微的红细胞凝集现象；样品为本发明融合蛋白时，未出现红细胞凝集现象。
实施例10本发明融合蛋白的体内药效学实验
采用SCID小鼠建立了人B细胞淋巴瘤Raji-PDL1异种移植瘤模型。实验设计了抗PD-L1单抗、本发明融合蛋白不同剂量组、抗PD-L1单抗与SIRPα-Fc融合蛋白等摩尔联合给药组。所有药物均ip给药，每周给药一次，共给药四周。实验结果如图13a-13c所示。
实验数据表明，相比较于PBS对照组，所有给药组均具有肿瘤抑制作用，在所有组别之中，本发明融合蛋白的肿瘤抑制效果最佳，优于抗PD-L1单抗和抗PD-L1单抗与SIRPα-Fc融合蛋白联合给药组。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
序列表
<110> 盛禾（中国）生物制药有限公司
<120> 一种多功能融合蛋白
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly His Ser Ile Thr Asn Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp Gln Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His His Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Asn Ser Arg Ile Ser Phe Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Asp Lys Ser Val Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Phe Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
115 120 125
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
130 135 140
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145 150 155 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
165 170 175
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
180 185 190
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
195 200 205
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
210 215 220
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
245 250 255
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
260 265 270
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
275 280 285
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
290 295 300
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
305 310 315 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
325 330 335
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asn Gly Tyr Ser Trp Gln
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Ile His His Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Asn Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Ser Asp Lys Ser Val Asp His
1 5
<210> 5
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Val Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Ala Ser Ile Arg Ala Ser
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Gln Tyr Tyr Ile
1 5
<210> 9
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Pro Val Val Ser Gly Pro
115 120
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 11
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Pro Val Val Ser Gly Pro Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln
130 135 140
Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Cys Thr Val Thr Gly His Ser Ile Thr Asn Gly Tyr Ser Trp Gln Trp
165 170 175
Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile His
180 185 190
His Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Asn Ser Arg Ile Ser
195 200 205
Phe Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser
210 215 220
Val Thr Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Asp
225 230 235 240
Lys Ser Val Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Phe Ser
245 250 255
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
260 265 270
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
275 280 285
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
290 295 300
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
305 310 315 320
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
325 330 335
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
340 345 350
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
355 360 365
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
370 375 380
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
385 390 395 400
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
405 410 415
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
420 425 430
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
435 440 445
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
450 455 460
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
465 470 475 480
Pro Gly Lys
<210> 12
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggaggagc tgcaggtaat ccaacctgac aaatccgtgt cagtcgctgc cggcgagtcc 60
gcaatattgc actgtaccgt gacctccctg atccccgttg ggcctataca gtggtttcgg 120
ggggccggac cagcacgcga actgatctat aaccagaagg agggccattt cccccgggtg 180
acgaccgtga gtgaatccac caaaagagag aacatggact tttcaatctc tatctcaaat 240
atcacccccg ccgacgccgg cacatattat tgcgtgaagt ttagaaaggg atcacccgac 300
accgagttta agagtggcgc cgggaccgag ctgtcagttc gggctaagcc atctccagtg 360
gtaagtggcc ctggtggtgg gggctctgga gggggaggct caggcggtgg agggagtgac 420
gtgcaactcc aggagtccgg gccagatctg gtgaaaccat cccagtcctt gagtctgact 480
tgcacagtga cagggcacag cattacaaat ggatattcct ggcagtggat cagacagttt 540
cccgggaaca aactggagtg gatgggctac atacaccatt caggtgatac gaaatatacc 600
ccttcactta attctcgcat cagttttaca cgcgatacct ctaagaatca attctttctg 660
cagcttaact ctgtcactaa cgaggatacg gctacttact actgtgcacg cggctctgac 720
aagtctgtcg accattgggg acaagggact agtgtgacag tcttcagcga caagacgcat 780
acatgtcctc cctgtccagc tccggagctt ctcggaggac catcagtatt cttgttcccc 840
cccaagccaa aggacactct gatgataagt cgcacgcctg aagtcacttg cgtcgtagtg 900
gatgtgtctc acgaggatcc cgaggtgaag tttaactggt atgtcgacgg ggttgaggtg 960
cacaacgcca agactaagcc tcgcgaggaa cagtacaact ctacttacag agtcgttagt 1020
gtcttgacag tgcttcacca ggactggctg aacgggaagg aatataagtg caaggtgtca 1080
aacaaggctc tgccagcacc aatcgaaaaa actatctcta aagcaaaggg gcagcctaga 1140
gagcctcagg tgtataccct gccgccatcc cgcgacgagc tgaccaagaa tcaggtctcc 1200
ctcacgtgcc tggtgaaggg tttttatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggaaagcaac 1260
gggcaaccag agaacaatta taaaaccact cctcctgtgc ttgacagtga cggaagcttc 1320
ttcctctaca gtaagctgac cgtggacaag tccaggtggc aacagggaaa cgttttctcc 1380
tgttcagtga tgcatgaagc acttcataac cactatactc aaaagtccct gagcctgtct 1440
cccgggaaa 1449
<210> 13
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Val Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 14
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gacatcgtga tgtctcagag tccatcatca ctgacagtgt ccgtgggtga aaaggtagtt 60
atgaactgta agtctagtca gtcacttttg tatagcaata atcagaagaa ctaccttaca 120
tggtaccagc aaaagcctgg ccaatccccc aagcttctga tatattgggc ttctatcaga 180
gcctctggcg tgccagaccg gttcacgggc tccggctctg gcaccgattt cacattgacc 240
atttcctctg taaaagctga ggacctcgct gtgtactatt gtcagcagta ctacatttac 300
cctctcacat ttggtgctgg taccaaactg gagctgaagc gaaccgtggc cgcacctagc 360
gtgttcatct tccccccttc cgatgaacag ttgaaatctg gcacagcatc tgtggtgtgc 420
ctcttgaata acttctaccc ccgcgaagcc aaggtgcagt ggaaggtgga taatgccctc 480
cagagcggta acagtcagga gagtgtcacc gagcaagatt ctaaagatag cacgtactcc 540
ctctccagca ccctcacact gtccaaagca gactatgaaa aacacaaggt gtacgcctgc 600
gaagtcactc atcaaggcct gtccagtcct gttacaaagt ctttcaaccg gggcgagtgc 660

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其包含特异性结合PD-L1的第一结合域和特异性结合CD47的第二结合域，其特征在于，所述第一结合域与第二结合域通过接头连接。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一结合域为抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二结合域为SIRPα信号调节蛋白的胞外Ig样结构域或其变体。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体的至少一个互补位在重链或轻链的N端经接头与SIRPα信号调节蛋白的胞外Ig样结构域或其变体连接。
5.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，其中SIRPα信号调节蛋白的胞外Ig样结构域或其变体为SIRPαD1。
6.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体包含两条重链和两条轻链，抗体重链或其片段包含SEQ ID NO：2所示的HCDR1、SEQ ID NO：3所示的HCDR2和SEQID NO：4所示的HCDR3，抗体轻链或其片段包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体的重链具有与SEQ IDNO：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链具有与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的融合蛋白，其中抗PD-L1抗体的重链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
9.如权利要求6所述的融合蛋白，其中抗PD-L1抗体的轻链具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
10.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRPαD1的序列为SEQ ID NO：9。
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