CN114990129B

CN114990129B - 表达αPDL1:Fc融合蛋白的间充质干细胞的制备及应用

Info

Publication number: CN114990129B
Application number: CN202210511384.8A
Authority: CN
Inventors: 刘拥军; 刘广洋; 李欣; 米一; 王荷蕊; 苗丽
Original assignee: Beijing Beilai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Beilai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-11
Filing date: 2022-05-11
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2042-05-11
Also published as: CN114990129A

Abstract

本发明提供了一种表达αPDL1:Fc融合蛋白的间充质干细胞的制备及应用，属于生物医药领域。本发明通过采用基因工程手段使间充质干细胞表达分泌型αPDL1:Fc类似物蛋白，特异性阻断PD‑1/PD‑L1结合，激活人体免疫细胞功能，从而达到肿瘤微环境正常化、逆转T细胞抑制并增强内源性抗肿瘤免疫的目的，为肿瘤等疾病的治疗提供了较为理想的新方法。

Description

表达αPDL1:Fc融合蛋白的间充质干细胞的制备及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种表达αPDL1:Fc融合蛋白的间充质干细胞的制备及应用。

背景技术

人体免疫系统能够避免感染和许多疾病，并预防癌症的发生，人体免疫系统具有识别自身物质和非自身物质的能力，能够对自身成分产生天然免疫耐受，清除异物，维持内环境的稳定。当正常细胞发生变化并开始失去控制时，癌症就会发生，由于癌细胞来源于正常细胞，与正常细胞难以区分，因此免疫系统识别癌细胞的能力微乎其微。当免疫系统错误地认为癌细胞是自身成分时，癌细胞可以避免受到免疫系统的攻击。肿瘤细胞的突变也会逐渐削弱对免疫系统的监控，激活免疫系统的肿瘤细胞被逐渐筛选出来，直到它们产生免疫系统无法识别的肿瘤分子，通过这种方式，肿瘤细胞成功逃脱了免疫系统的破坏，并有机会发展。更重要的是，因为癌细胞本身也可以释放出许多阻断免疫系统的物质，所以肿瘤免疫反应通常在肿瘤组织周围被选择性地抑制，这也解释了免疫治疗在许多患者中无效的原因：未能激活肿瘤组织周围的免疫反应，而不是无法系统地激活免疫反应。此外，炎症还可以促进肿瘤的发展。炎症可在肿瘤组织局部释放大量免疫抑制因子，通过多种途径抑制免疫系统。因此，即使免疫系统正常，肿瘤仍有可能发生。为了克服这一问题，研究人员一直在寻找方法帮助免疫系统增强其抗肿瘤免疫反应，并提高其抑制肿瘤的能力。

近年来，肿瘤免疫治疗发展迅速，利用免疫系统清除癌细胞，提高肿瘤细胞的免疫原性和效应细胞杀伤的敏感性，进而增强机体抗肿瘤免疫反应，该方法在许多人类恶性肿瘤中显示出显著的治疗效果，成为一种潜在的通用癌症治疗方案，免疫疗法在美国和其他国家已被批准为多种癌症的一线治疗策略，可以单独使用，也可以与其他癌症治疗方法联合使用。与其他癌症治疗相比，肿瘤免疫治疗已经变得更加精确、个性化、副作用更少，近年来已成为癌症治疗的一个重要发展方向，被誉为继手术、放疗、化疗之后的第四大癌症治疗技术。

PD-1(程序性死亡受体1)是CD28超家族成员之一，在抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病等方面具有重要作用，主要表达于肿瘤组织周围的T细胞、NK细胞和B细胞，其配体PD-L1也是重要的肿瘤治疗靶点。PD-L1(程序性死亡受体-配体1)是一种大小为40kDa的1型跨膜蛋白，广泛表达于免疫细胞、肿瘤细胞、上皮细胞和内皮细胞。在肿瘤微环境中，PD-L1表达于肿瘤细胞，与表达于T细胞的PD-1相互作用，并抑制T细胞的功能，肿瘤细胞进而发生逃逸无法被免疫细胞细胞识别，发生逃逸。PD-1/PD-L1免疫治疗可以抑制PD-1与PD-L1结合进而恢复T细胞的正常功能。

在正常的生理条件下，T细胞免疫选择性地清除病原体和异常细胞，但避免攻击正常细胞，这个过程称为免疫稳态。然而，在肿瘤微环境中，PD-1/PD-L1的结合可以逃避免疫监视。肿瘤细胞中过表达的PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)上的PD-1结合，通过磷酸化的SHP-2抑制TCR信号机联反应，T细胞的激活受到了抑制。PD-1与PD-L1的结合抑制T细胞的迁移、增殖和分泌细胞毒介质，并抑制了对肿瘤细胞的杀伤，抑制PD-1/PD-L1信号转导可以使异常的肿瘤微环境正常化，逆转T细胞抑制并增强内源性抗肿瘤免疫，到目前为止，PD-1/PD-L1已经对多种癌症有明显的治疗效果，例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、淋巴瘤等。

目前，美国食品和药物管理局(FDA)批准上市的PD-1治疗性单抗包括Nivolumab(Opdivo，2014年9月)、Pembrolizumab(Keytruda，2014年12月)和Cemiplimab(Libtayo，2018年9月)，已上市的PD-L1治疗性单抗包括Atezolizumab(Tecentriq，2014年9月)、Avelumab(Bavencio，2016年5月)和Duravulumab(Imfinzi，2017年5月)，用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、默克细胞癌、乳腺癌等。

专利CN112921003A公开了一种达PD-L1分子的间充质干细胞来源外泌体及其制备方法与应用，其利用间充质干细胞对机体的免疫调控功能及PD-1/PD-L1信号通路在免疫应答中的抑制作用，从而有效治疗免疫炎性疾病。专利CN111518757A公开了一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞、诱导试剂盒及应用，对胶原诱导的关节炎小鼠和CLP脓毒症模型小鼠均具有更好的治疗疗效，且未见副作用的发生，在自身免疫性疾病和炎性相关疾病的临床治疗中极具应用潜力。

这种治疗性单克隆抗体药物具有先进的抗癌功能，但是抗体的免疫原性、肿瘤靶点长期使用的耐受性以及单纯性阻断信号转导通路的长期效果等问题仍有待进一步研究，多数单抗很难实现对肿瘤细胞的长期有效抑制和杀伤作用。

基于此，亟需一种新的途径解决上述单抗的不足，用于制备抑制PD-1/PD-L1结合的药物。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种表达αPDL1:Fc融合蛋白基因修饰的间充质干细胞及其制备方法与应用。本发明通过采用基因工程手段使间充质干细胞表达分泌型αPDL1:Fc类似物蛋白，特异性阻断PD-1/PD-L1结合，从而抑制肿瘤细胞免疫逃逸，达到治疗肿瘤相关疾病的目的。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种αPDL1:Fc融合蛋白的编码核苷酸，所述的编码核苷酸包含编码抗PD-L1单链抗体的核苷酸。

具体地，所述的编码抗PD-L1单链抗体的核苷酸包含编码抗PD-L1单链抗体重链可变区VH的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、和编码抗PD-L1单链抗体轻链可变区VL的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

所述的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为：

GAAGTGCAGCTTGTAGAAAGCGGAGGAGGACTGGTTCAACCTGGGGGTAGCTTGCGACTGTCATGCGCCGCGAGCGGCTTTACTTTCAGTGATTCCTGGATACACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGTAAGGGTTTGGAATGGGTCGCTTGGATCTCTCCCTACGGTGGGAGCACTTATTATGCAGACTCCGTCAAAGGTAGATTTACAATCTCAGCAGACACGAGCAAAAACACAGCTTACTTGCAAATGAACTCACTCAGAGCGGAGGACACCGCAGTTTATTATTGTGCACGGAGACATTGGCCGGGCGGCTTCGATTACTGGGGACAAGGAACTCTCGTAACCGTAAGCAGTGCG；

所述的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为：

GACATCCAAATGACCCAGTCTCCCAGTTCTTTGTCAGCATCAGTTGGTGATCGAGTGACCATCACGTGTAGAGCTTCACAAGACGTTTCTACAGCAGTAGCATGGTACCAGCAAAAACCGGGGAAAGCGCCGAAACTCTTGATATATTCAGCATCATTCCTTTACAGCGGGGTTCCCTCTCGGTTCTCTGGATCCGGCTCAGGCACCGACTTTACGCTCACAATTTCCAGTTTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACGTATTACTGCCAGCAATATTTGTACCACCCTGCTACATTTGGGCAAGGGACTAAAGTCGAAATTAAGCGA；

所述的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为：

GAGGTACAGTTGGTCGAAAGCGGTGGGGGTCTTGTTCAACCCGGCGGTAGTCTTCGACTGTCGTGCGCGGCATCCGGTTTTACCTTTTCTGATAGCTGGATCCATTGGGTAAGACAAGCTCCTGGGAAAGGCCTTGAGTGGGTCGCCTGGATATCACCTTACGGTGGAAGCACCTATTATGCTGATTCAGTTAAAGGGCGCTTTACGATCTCCGCCGACACCTCGAAAAACACAGCTTACCTGCAAATGAACTCCCTACGTGCAGAAGATACCGCTGTCTACTACTGTGCACGACGCCATTGGCCTGGCGGATTCGATTATTGGGGTCAGGGGACACTTGTGACTGTCAGTTCCGCG；

所述的SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为：

GACATTCAGATGACCCAATCGCCTAGCTCACTTTCTGCGAGTGTGGGAGACAGGGTCACTATTACTTGCCGCGCCAGTCAGGATGTATCCACGGCTGTTGCTTGGTATCAACAGAAGCCAGGAAAAGCACCGAAGCTCTTAATCTATTCGGCGTCGTTCCTATATTCTGGGGTCCCGTCTCGTTTTAGTGGGTCTGGGTCCGGAACCGACTTCACACTTACAATTTCTTCCTTACAACCAGAAGATTTTGCTACATATTATTGCCAACAATACCTGTACCACCCCGCTACTTTCGGTCAAGGGACGAAAGTTGAAATAAAAAGA。

进一步具体地，所述的编码抗PD-L1单链抗体的核苷酸还包含编码信号肽的SEQID NO:1所示的核苷酸序列、编码接头的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

具体地，所述的编码核苷酸还包含编码人免疫球蛋白IgG1的Fc片段的核苷酸，所述的编码IgG1的Fc片段的核苷酸为SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

进一步具体地，所述的编码核苷酸为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列。

具体地，所述的编码核苷酸编码αPDL1:Fc融合蛋白，所述的αPDL1:Fc融合蛋白包含抗PD-L1单链抗体和人免疫球蛋白IgG1的Fc片段。

进一步具体地，所述的抗PD-L1单链抗体包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的信号肽、SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的接头、SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的抗PD-L1单链抗体重链可变区VH、和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的抗PD-L1单链抗体轻链可变区VL。

进一步具体地，所述的人免疫球蛋白IgG1的Fc片段为SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

进一步具体地，所述的αPDL1:Fc融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

又一方面，本发明提供了一种包含上述编码核苷酸的载体。

具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。

又一方面，本发明提供了一种包含上述编码核苷酸或上述载体的宿主细胞。

具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞，优选为间充质干细胞。

具体地，所述的核苷酸或载体通过基因工程技术导入所述的宿主细胞。

进一步具体地，所述的基因工程技术包括但不限于病毒转染、脂质体转染、电转移、基因编辑或mRNA转染的技术，优选为采用慢病毒载体系统。

又一方面，本发明提供了生产上述αPDL1:Fc融合蛋白的方法，所述的方法包括在使得所述融合蛋白表达的情况下，培养上述宿主细胞。

又一方面，本发明提供了一种间充质干细胞，所述的间充质干细胞包含上述编码核苷酸或上述载体。

具体地，所述的间充质干细胞为骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织来源的间充质干细胞。

又一方面，本发明提供了一种上述间充质干细胞的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含上述αPDL1:Fc融合蛋白编码核苷酸序列的慢病毒表达载体；

(2)将步骤(1)得到的慢病毒表达载体感染宿主细胞，包装得到成熟慢病毒；

(3)收获步骤(2)得到的成熟慢病毒，感染间充质干细胞，筛选感染成功的细胞。

在本发明某些实施例中，首先利用慢病毒载体系统构建αPDL1:Fc融合蛋白的慢病毒表达质粒LV-αPDL1:Fc，其中，αPDL1:Fc是PD-L1单链抗体与IgG1的重链Fc片段组成的融合蛋白，αPDL1:Fc编码基因的3'-末端先后连接IRES序列和EGFP基因，形成αPDL1:Fc-I-EGPF序列，共同处于LV-EGFP慢病毒载体中CMV启动子的下游；其次，将LV-αPDL1:Fc质粒与慢病毒框架质粒pGag/Pol、pRev、Pvsv-g混合，通过LTX脂质体导入HEK293T细胞中完成基因转录后，慢病毒载体被成功包装并释放到HEK293T细胞培养基的上清中，然后收集含有重组慢病毒载体的上清液；最终，用收获的上清中的重组慢病毒感染间充质干细胞，24h后加入嘌呤霉素筛选得到感染成功的间充质干细胞。通过间充质干细胞核糖体表达αPDL1:Fc融合蛋白，并在IL-2信号肽的指导下分泌到细胞外，通过融合蛋白与PD-L1结合，阻断PD-1与PD-L1的结合，PD-1/PD-L1的信号通路被阻断，从而达到了抑制免疫逃逸的作用。

又一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含上述编码核苷酸、载体、宿主细胞和/或间充质干细胞。

具体地，所述的药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体。

进一步具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。

具体地，所述的药物组合物可以单独、依次或者同时与其他药物联合施用，联合施用的其他药物非限制性的选自青霉素、阿莫西林、苄青霉素、氨苄青霉素、阿奇霉素、红霉素、克拉霉素、头孢羟氨苄、头孢克肟、四环素、米诺环素、利福平、利福布汀、氨苯磺胺、氨基糖甙、杆菌肽、多粘菌素B、奥硝唑、视黄醇、视黄醛、异维甲酸、维胺酯、阿达帕、他扎罗汀、雌激素、孕激素、糖皮质激素、抗雄性激素、维生素D3类似物如卡泊三醇和他卡西醇、糖皮质激素类药物如泼尼松和甲泼尼松、他克莫司、吡美莫司、环孢素A、霉酚酸酯、白三烯B4抑制剂、IL-1抑制剂、IL-2抑制剂、IL-1β抑制剂，IL-6抑制剂、IL-8抑制剂、IL-12抑制剂、IL-23抑制剂、IL-17抑制剂、TNF抑制剂、GM-CSF抑制剂、CD19抑制剂、CD20抑制剂。联合治疗的方法还包括与光动力疗法、激光疗法、果酸疗法的联合施用。

又一方面，本发明提供了上述编码核苷酸、载体、宿主细胞和/或间充质干细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物、试剂盒和/或医疗装置中的应用。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

(1)本发明所得到的经基因修饰的间充质干细胞能够共表达人αPDL1:Fc融合蛋白，利用间充质干细胞对肿瘤部位的靶向作用及损伤部位的修复能力，通过基因修饰的方法，使间充质干细胞特异表达αPDL1:Fc融合蛋白至肿瘤部位而发挥作用。通过PD-1/PD-L1阻断实验，可以确定基因修饰后的间充质干细胞表达的人αPDL1:Fc融合蛋白可以显著阻断PD-1与其配体PD-L1的结合。因此，所述经修饰的间充质干细胞表达的人αPDL1:Fc融合蛋白，能够特异性阻断PD-1/PD-L1信号通路，激活人体免疫细胞功能，从而达到肿瘤微环境正常化、逆转T细胞抑制并增强内源性抗肿瘤免疫的目的。

(2)现有的PD-1/PD-L1阻断性抗体药物在人体内半衰期短，单一疗程内需要反复多次大剂量注射，从而增加了治疗成本和药物毒副作用的发生。体外实验显示，基因修饰的间充质干细胞可在体外培养时持续分泌人αPDL1:Fc融合蛋白至上清液中，且该αPDL1:Fc融合蛋白具有阻断PD-1与其配体PD-L1结合的能力，因此当使用本申请所述的人αPDL1:Fc融合蛋白基因修饰的间充质干细胞治疗肿瘤等疾病时，单次注射细胞后即可在病人体内持续分泌融合蛋白，达到持续阻断PD-1与其配体PD-L1结合的目的，治疗效果更为持久、稳定，治疗成本和毒副作用更低。同时，间充质干细胞具有较好的免疫调节能力和组织损伤修复能力，因此该发明为肿瘤等疾病的治疗提供了较为理想的新方法。

附图说明

图1为LV-αPDL1:Fc质粒信息示意图。

图2为实施例4流式细胞法检测EGFP表达结果图。

图3为融合蛋白IgG1蛋白表达检测结果图。

图4为间充质干细胞分泌αPDL1抗体含量检测结果图。

图5为抗PD-1抗体对PD-1/PD-L1结合抑制的标准曲线图

图6为间充质干细胞对PD-1/PD-L1的结合抑制检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学用语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有的其他技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968,IUPAC-IUB委员会)中所述。

与重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)、酶促反应和纯化技术结合使用的示例性技术是本领域已知的。许多这样的技术和程序描述于，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，以及其他许多地方。

本发明所述的“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

本发明所述的“宿主细胞”是可用于表达核酸，例如本发明的核酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如，大肠杆菌(E.coli)，或其可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。

本发明所述的“间充质干细胞”(MSCs)来源于发育早期中胚层，具有多种细胞功能，包括受损组织的修复及再生、参与机体免疫调节、促进血管新生、炎症部位归巢和靶向作用以及抑制肿瘤生长。与成人组织相比，从脐带等组织中分离出的MSCs具有更好的体外生长潜力和更高的再生能力，MSC被定义为具有一些共同的基本特性，如体外可塑性粘附，表面标志CD73、CD90和CD105的表达以及体外成骨、成脂、成软骨的分化能力。除了这些典型的MSCs特征之外，脐带来源的MSCs可以产生和释放更多的转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮因子-α(VEGF-α)和表皮生长因子(EGF)。

肿瘤微环境中如成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、促炎因子白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的大量分泌有助于MSCs聚集于肿瘤部位，而免疫细胞与肿瘤间质内的MSCs的相互作用可以激活MSCs的免疫调节能力。MSCs可以分泌多种免疫调节剂，如一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的代谢产物等，与诱导免疫耐受和T细胞Th1向Th2免疫应答的转变有关。此外，MSCs可以通过PD-1激活凋亡机制以及与相应配体PD-L1和PD-L2的相互作用来抑制效应器T细胞的增殖。处理对调节性T细胞的免疫抑制和抗炎作用外，MSCs还参与转化巨噬细胞的过程。

除了与肿瘤间质中不同类型的细胞作用外，MSCs还可以直接或间接与癌细胞相互作用，基于MSCs可以向肿瘤部位归巢的特性，MSCs被认为是输送抗肿瘤药物的理想候选者，是一种潜在的临床方法。

在本发明某些实施例中，高表达αPDL1:Fc融合蛋白的间充质干细胞具有向肿瘤组织归巢的同时在肿瘤组织周围高表达αPDL1:Fc，抑制PD-1/PD-L1信号转导，恢复T细胞的免疫功能的作用。

本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键链接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA、IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可以分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL或LCVR)和重链可变区(VH或HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

术语“互补决定区”(CDR)指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本发明中使用“Kabat编号规则”(参见Kabat等(1991))确定CDR的氨基酸序列边界。

术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体对预先确定的抗原表位的结合。通常，抗体以约小于10^-8M，例如约小于10^-9M、10^-10M、10^-11M或更小的亲和力(KD)结合。其中，“KD”指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。

术语“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，其为生理学上相容的。在一个实施方案中，载体适合胃肠外施用。可选地，载体可以适合于静脉内、腹膜内、肌肉内或舌下施用。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和无菌粉末以用于临时制备无菌注射溶液或分散液。对于药学上的活性物质使用此类介质和试剂在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或试剂与该活性化合物不相容，否则涵盖其在本发明的药物组合物中的使用。

在某些实施例中，本发明所述的αPDL1:Fc融合蛋白可通过培养包含所述的核酸分子或载体的宿主细胞或包含编码所述αPDL1:Fc融合蛋白的核苷酸序列的基因修饰细胞得到。

实施例1.体外构建αPDL1:Fc慢病毒表达质粒

利用第四代慢病毒载体系统LV-EGFP(购自OriGene公司)构建αPDL1:Fc融合蛋白的慢病毒表达质粒，并以LV-EGFP空质粒作为对照。

其中，αPDL1:Fc是抗PD-L1单链抗体与IgG1的重链Fc片段组成的融合蛋白(SEQ IDNO:15)，长度为500个氨基酸残基，分子量为60kD。所述的抗PD-L1单链抗体包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的信号肽、SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的接头、SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的抗PD-L1单链抗体重链可变区VH、和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的抗PD-L1单链抗体轻链可变区VL；所述的人免疫球蛋白IgG1的Fc片段为SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

αPDL1:Fc融合蛋白编码基因(SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列)包括抗PD-L1单链抗体的核苷酸序列和编码IgG1重链Fc片段的核苷酸序列，其中，所述的编码抗PD-L1单链抗体的核苷酸包含编码信号肽的核苷酸SEQ ID NO:1所示的序列、编码接头的核苷酸SEQ ID NO:2所示的序列、编码抗PD-L1单链抗体重链可变区VH的SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列、和编码抗PD-L1单链抗体轻链可变区VL的SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列；所述的编码IgG1的Fc片段的核苷酸为SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

αPDL1:Fc融合蛋白编码基因(SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列)的3'-末端先后连接IRES序列和EGFP基因，形成αPDL1-OS1:Fc-I-EGFP或αPDL1-OS2:Fc-I-EGFP序列，共同处于CMV启动子下游(示意图见图1)。

具体地，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的编码抗PD-L1单链抗体重链可变区VH的核苷酸序列由SEQ ID NO:16所示的WT序列优化得到，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的编码抗PD-L1单链抗体轻链可变区VL的核苷酸序列由SEQ ID NO:17所示的WT序列优化得到。同时，利用所述的WT序列构建αPDL1-WT:Fc-I-EGFP序列(该序列编码抗PD-L1单链抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:16所示的WT序列，编码抗PD-L1单链抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:17所示的WT序列，其余序列与αPDL1-OS1:Fc-I-EGFP或αPDL1-OS2:Fc-I-EGFP序列相同)。

按照上述基因结构，利用常规的基因工程手段将目的基因片段插入LV-EGFP质粒的相应位点，得到慢病毒表达质粒LV-αPDL1-OS1:Fc、LV-αPDL1-OS2:Fc和LV-αPDL1-WT:Fc。

实施例2.病毒制备及收获

将实施例1制备的LV-αPDL1-OS1:Fc、LV-αPDL1-OS2:Fc或LV-αPDL1-WT:Fc质粒分别与慢病毒框架质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G，通过LTX脂质体转染到HEK293T细胞中，成功包装的重组慢病毒载体释放到HEK293T细胞培养上清液中，收获含有重组慢病毒载体的细胞培养上清液。同时制备对照LV-EGFP病毒。

实施例3.基因修饰间充质干细胞的制备

将实施例2制备的含有包装病毒的HEK293T细胞培养上清液收集，加入已培养且融合度达70-80％的间充质干细胞，经37℃、CO₂培养24h后，将完成病毒感染的间充质干细胞培养上清弃去并更换含嘌呤霉素的新鲜培养基继续培养，48h后即可筛选出得到成功感染的间充质干细胞EGFP-MSC、αPDL1-OS1:Fc-MSC、αPDL1-OS2:Fc-MSC、αPDL1-WT:Fc-MSC。

实施例4.流式细胞法检测基因修饰干细胞表达绿色荧光蛋白

将实施例3获得的细胞按1×10^4/cm²培养至T25细胞培养瓶，24h后通过流式细胞法检测间充质干细胞绿色荧光通道信号(结果见图2)，发现LV-EGFP、LV-αPDL1-OS1:Fc、LV-αPDL1-OS2:Fc及LV-αPDL1-WT:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞均绿色荧光通道信号阳性率均超过85％，而正常间充质干细胞(hUC-MSC)在绿色荧光通道没有信号。表明LV-EGPF、LV-αPDL1-OS1:Fc、LV-αPDL1-OS2:Fc及LV-αPDL1-WT:Fc慢病毒均可成功感染间充质干细胞。

实施例5.ELISA法检测IgG1的表达

采用invitrogen公司Human IgG1 ELISA Kit(BMS2092，Thermo)用于检测细胞培养上清中分泌的融合蛋白IgG1含量。该试剂盒采用人IgG1固相夹心ELISA(酶联免疫吸附测定)检测匹配抗体对之间结合的靶标量。IgG1特异性抗体已预先包被在酶标板中，然后将细胞上清液样品、标准品或对照加入这些孔中并与固定(捕获)抗体结合，通过添加二抗形成夹心结构，添加底物溶液与酶-抗体-靶标复合物反应以产生可测量的信号。该信号的强度与原始样本中存在的目标浓度成正比。

将实施例3获得的基因修饰间充质干细胞培养72小时后收获细胞上清，并将细胞培养上清加入IgG1 ELISA试剂盒，检测融合蛋白中IgG1蛋白含量，结果发现，LV-αPDL1-OS1:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞(αPDL1-OS1:Fc-MSC)高表达IgG1，且表达量高达2390.96±112.91ng/mL，LV-αPDL1-OS2:Fc(αPDL1-OS2:Fc-MSC)与LV-αPDL1-WT:Fc(αPDL1-WT:Fc-MSC)的IgG1表达量与LV-αPDL1-OS1:Fc相比没有显著差异(P>0.05)，而正常hUC-MSC及EGFP-MSC不表达IgG1(结果见图3)。

实施例6.αPD-L1抗体含量检测

采用ACRO Biosystems公司PD-1[Biotinylated]:PD-L1 Inhibitor ScreeningELISA Assay Pair试剂盒用于检测细胞上清中αPDL1抗体的含量。将实施例3获得的基因修饰间充质干细胞培养72h后收获细胞上清，参照试剂盒说明书，将细胞培养上清加入ELISA试剂盒，以抗PD-L1中和抗体(标准品)浓度为横坐标，OD450值为纵坐标，曲线拟合制作标准曲线，实验结果如图4所示，正常hUC-MSC及EGFP-MSC培养上清中未检测到PD-L1抗体，而αPDL1-OS1:Fc-MSC、αPDL1-OS2:Fc-MSC、αPDL1-WT:Fc-MSC的抗体含量为1.31±0.21μg/mL、1.06±0.32μg/mL、1.12±0.25μg/mL，三组之间无显著差异(P>0.05)。

实施例7.检测基因修饰间充质干细胞阻断PD-L1和PD-1结合的功能

采用ACRO Biosystems公司PD-1[Biotinylated]:PD-L1 Inhibitor ScreeningELISA Assay Pair试剂盒检测基因修饰干细胞阻断PD-1/PD-L1结合的能力。该试剂盒中的标准品为抗PD-1抗体，可以阻断PD-L1与生物素化的PD-1蛋白的结合，进而使OD450检测值降低，结果如图5所示，随着标准品抗PD-1抗体浓度升高，阻断PD-L1与生物素化的PD-1结合的能力增强，OD450值降低，因此，阻断PD-1/PD-L1结合的功能越高，阻断PD-L1/PD-1结合能力与标准品浓度之间成反比关系。将实施例3获得的基因修饰间充质干细胞培养72h后收获细胞上清，通过PD-1/PD-L1阻断试剂检测盒检测细胞上清中αPDL1抗体阻断PD-1/PD-L1结合的能力。

采用以下公式对PD-1/PD-L1结合抑制率计算：

结合抑制率(％)＝[OD450(空白孔)-OD450(样品孔)]/OD450(空白孔)*100％。

结果如图6所示，正常hUC-MSC及EGFP-MSC细胞无法阻断PD-1/PD-L1的结合，而αPDL1-OS1:Fc-MSC、αPDL1-OS2:Fc-MSC、αPDL1-WT:Fc-MSC细胞分泌的PDL1抗体融合蛋白均可以显著阻断PD-1/PD-L1的结合，结合抑制率分别为79.3±8.94％、57.8±8.54％和51.4±6.43％；与αPDL1-WT:Fc-MSC相比，αPDL1-OS1:Fc-MSC细胞对PD-1/PD-L1阻断能力增加了54.3％(P<0.01)(结果见图6)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京贝来生物科技有限公司

<120> 表达αPDL1:Fc融合蛋白的间充质干细胞的制备及应用

<130> 20220411

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

atgcaggccc tggtgctact cctctgcatt ggagccctcc tcgggcacag cagctgc 57

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

ggaggtggcg gtagtggcgg cggtgggtcc ggcggagggg gatcaggcgg tggaggctcc 60

<210> 3

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

gaagtgcagc ttgtagaaag cggaggagga ctggttcaac ctgggggtag cttgcgactg 60

tcatgcgccg cgagcggctt tactttcagt gattcctgga tacactgggt gcgccaggcc 120

cccggtaagg gtttggaatg ggtcgcttgg atctctccct acggtgggag cacttattat 180

gcagactccg tcaaaggtag atttacaatc tcagcagaca cgagcaaaaa cacagcttac 240

ttgcaaatga actcactcag agcggaggac accgcagttt attattgtgc acggagacat 300

tggccgggcg gcttcgatta ctggggacaa ggaactctcg taaccgtaag cagtgcg 357

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

gacatccaaa tgacccagtc tcccagttct ttgtcagcat cagttggtga tcgagtgacc 60

atcacgtgta gagcttcaca agacgtttct acagcagtag catggtacca gcaaaaaccg 120

gggaaagcgc cgaaactctt gatatattca gcatcattcc tttacagcgg ggttccctct 180

cggttctctg gatccggctc aggcaccgac tttacgctca caatttccag tttgcagccg 240

gaagattttg cgacgtatta ctgccagcaa tatttgtacc accctgctac atttgggcaa 300

gggactaaag tcgaaattaa gcga 324

<210> 5

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

gaggtacagt tggtcgaaag cggtgggggt cttgttcaac ccggcggtag tcttcgactg 60

tcgtgcgcgg catccggttt taccttttct gatagctgga tccattgggt aagacaagct 120

cctgggaaag gccttgagtg ggtcgcctgg atatcacctt acggtggaag cacctattat 180

gctgattcag ttaaagggcg ctttacgatc tccgccgaca cctcgaaaaa cacagcttac 240

ctgcaaatga actccctacg tgcagaagat accgctgtct actactgtgc acgacgccat 300

tggcctggcg gattcgatta ttggggtcag gggacacttg tgactgtcag ttccgcg 357

<210> 6

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

gacattcaga tgacccaatc gcctagctca ctttctgcga gtgtgggaga cagggtcact 60

attacttgcc gcgccagtca ggatgtatcc acggctgttg cttggtatca acagaagcca 120

ggaaaagcac cgaagctctt aatctattcg gcgtcgttcc tatattctgg ggtcccgtct 180

cgttttagtg ggtctgggtc cggaaccgac ttcacactta caatttcttc cttacaacca 240

gaagattttg ctacatatta ttgccaacaa tacctgtacc accccgctac tttcggtcaa 300

gggacgaaag ttgaaataaa aaga 324

<210> 7

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa atga 684

<210> 8

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

atgcaggccc tggtgctact cctctgcatt ggagccctcc tcgggcacag cagctgcgaa 60

gtgcagcttg tagaaagcgg aggaggactg gttcaacctg ggggtagctt gcgactgtca 120

tgcgccgcga gcggctttac tttcagtgat tcctggatac actgggtgcg ccaggccccc 180

ggtaagggtt tggaatgggt cgcttggatc tctccctacg gtgggagcac ttattatgca 240

gactccgtca aaggtagatt tacaatctca gcagacacga gcaaaaacac agcttacttg 300

caaatgaact cactcagagc ggaggacacc gcagtttatt attgtgcacg gagacattgg 360

ccgggcggct tcgattactg gggacaagga actctcgtaa ccgtaagcag tgcgggaggt 420

ggcggtagtg gcggcggtgg gtccggcgga gggggatcag gcggtggagg ctccgacatc 480

caaatgaccc agtctcccag ttctttgtca gcatcagttg gtgatcgagt gaccatcacg 540

tgtagagctt cacaagacgt ttctacagca gtagcatggt accagcaaaa accggggaaa 600

gcgccgaaac tcttgatata ttcagcatca ttcctttaca gcggggttcc ctctcggttc 660

tctggatccg gctcaggcac cgactttacg ctcacaattt ccagtttgca gccggaagat 720

tttgcgacgt attactgcca gcaatatttg taccaccctg ctacatttgg gcaagggact 780

aaagtcgaaa ttaagcgaga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 840

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 900

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 960

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1080

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1140

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1200

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1260

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1320

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1380

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcacgaggc tctgcacaac 1440

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1482

<210> 9

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

atgcaggccc tggtgctact cctctgcatt ggagccctcc tcgggcacag cagctgcgag 60

gtacagttgg tcgaaagcgg tgggggtctt gttcaacccg gcggtagtct tcgactgtcg 120

tgcgcggcat ccggttttac cttttctgat agctggatcc attgggtaag acaagctcct 180

gggaaaggcc ttgagtgggt cgcctggata tcaccttacg gtggaagcac ctattatgct 240

gattcagtta aagggcgctt tacgatctcc gccgacacct cgaaaaacac agcttacctg 300

caaatgaact ccctacgtgc agaagatacc gctgtctact actgtgcacg acgccattgg 360

cctggcggat tcgattattg gggtcagggg acacttgtga ctgtcagttc cgcgggaggt 420

ggcggtagtg gcggcggtgg gtccggcgga gggggatcag gcggtggagg ctccgacatt 480

cagatgaccc aatcgcctag ctcactttct gcgagtgtgg gagacagggt cactattact 540

tgccgcgcca gtcaggatgt atccacggct gttgcttggt atcaacagaa gccaggaaaa 600

gcaccgaagc tcttaatcta ttcggcgtcg ttcctatatt ctggggtccc gtctcgtttt 660

agtgggtctg ggtccggaac cgacttcaca cttacaattt cttccttaca accagaagat 720

tttgctacat attattgcca acaatacctg taccaccccg ctactttcgg tcaagggacg 780

aaagttgaaa taaaaagaga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 840

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 900

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 960

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1080

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1140

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1200

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1260

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1320

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1380

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcacgaggc tctgcacaac 1440

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1482

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Cys Ile Gly Ala Leu Leu Gly His

1 5 10 15

Ser Ser Cys

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 12

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115

<210> 13

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 14

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 14

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 15

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 15

Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Cys Ile Gly Ala Leu Leu Gly His

1 5 10 15

Ser Ser Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile

145 150 155 160

Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser

195 200 205

Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

225 230 235 240

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Asp Lys Thr His Thr Cys

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

275 280 285

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

290 295 300

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

305 310 315 320

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

325 330 335

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

340 345 350

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

355 360 365

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

370 375 380

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

385 390 395 400

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

405 410 415

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

420 425 430

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

435 440 445

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

450 455 460

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

465 470 475 480

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485 490

<210> 16

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 16

gaagtacagc tggtcgagag tggcgggggg ttggtgcagc ccggagggtc cctgcggctg 60

agttgcgccg cctccgggtt taccttctcc gactcttgga ttcactgggt gcgacaggcc 120

cctgggaaag gtctcgaatg ggtggcttgg atcagcccct acggcggatc aacctattat 180

gctgattccg tgaaggggcg cttcaccata tctgccgaca ccagtaaaaa cacagcttac 240

ctccagatga actccctgag agcagaggat actgccgtct attattgtgc cagaaggcac 300

tggccgggcg gctttgatta ctgggggcag ggcaccctcg tgaccgtgtc atctgct 357

<210> 17

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 17

gatatacaga tgacccagag cccatcttct ctcagcgcat ctgtgggcga ccgtgtcacc 60

atcacttgtc gtgccagtca ggacgtctcc actgccgtcg cctggtacca acagaagcct 120

gggaaggcgc caaaactgtt aatctactcc gctagttttc tctacagcgg tgtgccatcc 180

aggttcagcg gttctgggtc gggcacagat tttaccctga ccatcagctc tctccagcct 240

gaggacttcg ctacctacta ttgtcagcag tacttgtacc accctgctac cttcggccag 300

gggacaaagg tggagatcaa gcgc 324

<210> 18

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 18

atgcaggccc tggtgctact cctctgcatt ggagccctcc tcgggcacag cagctgcgaa 60

gtacagctgg tcgagagtgg cggggggttg gtgcagcccg gagggtccct gcggctgagt 120

tgcgccgcct ccgggtttac cttctccgac tcttggattc actgggtgcg acaggcccct 180

gggaaaggtc tcgaatgggt ggcttggatc agcccctacg gcggatcaac ctattatgct 240

gattccgtga aggggcgctt caccatatct gccgacacca gtaaaaacac agcttacctc 300

cagatgaact ccctgagagc agaggatact gccgtctatt attgtgccag aaggcactgg 360

ccgggcggct ttgattactg ggggcagggc accctcgtga ccgtgtcatc tgctggaggt 420

ggcggtagtg gcggcggtgg gtccggcgga gggggatcag gcggtggagg ctccgatata 480

cagatgaccc agagcccatc ttctctcagc gcatctgtgg gcgaccgtgt caccatcact 540

tgtcgtgcca gtcaggacgt ctccactgcc gtcgcctggt accaacagaa gcctgggaag 600

gcgccaaaac tgttaatcta ctccgctagt tttctctaca gcggtgtgcc atccaggttc 660

agcggttctg ggtcgggcac agattttacc ctgaccatca gctctctcca gcctgaggac 720

ttcgctacct actattgtca gcagtacttg taccaccctg ctaccttcgg ccaggggaca 780

aaggtggaga tcaagcgcga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 840

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 900

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 960

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1080

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1140

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1200

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1260

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1320

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1380

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcacgaggc tctgcacaac 1440

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1482

Claims

1.一种αPDL1:Fc融合蛋白的编码核苷酸，其特征在于：所述的编码核苷酸为SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:9所示的序列。

2.根据权利要求1所述的编码核苷酸，其特征在于：

所述的编码核苷酸编码αPDL1:Fc融合蛋白，所述的αPDL1:Fc融合蛋白包含抗PD-L1单链抗体和人免疫球蛋白IgG1的Fc片段；

所述的抗PD-L1单链抗体包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的信号肽、SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的接头、SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的抗PD-L1单链抗体重链可变区VH、和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的抗PD-L1单链抗体轻链可变区VL；

所述的人免疫球蛋白IgG1的Fc片段为SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；

所述的αPDL1:Fc融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

3.一种包含权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸的载体。

4.一种包含权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸或权利要求3所述的载体的宿主细胞。

5.一种生产αPDL1:Fc融合蛋白的方法，其特征在于：所述的方法包括在使得所述的融合蛋白表达的情况下，培养权利要求4所述的宿主细胞。

6.一种间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞包含权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸或权利要求3所述的载体。

7.一种权利要求6所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸序列的慢病毒表达载体；

8.一种药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物包含权利要求1-2任一项所述的编码核苷酸、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞和/或权利要求6所述的间充质干细胞。