CN113423425A

CN113423425A - 靶向外泌体的双特异性抗体

Info

Publication number: CN113423425A
Application number: CN201980081663.1A
Authority: CN
Inventors: M·K·罗宾逊; M·J·莫林
Original assignee: Yimi Rumei Co ltd
Current assignee: Yimi Rumei Co ltd
Priority date: 2018-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-09-21
Also published as: IL282355A; SG11202103812RA; WO2020081786A1; KR20210091714A; EP3866851A1; JP2022512734A; CA3116560A1; MX2021004036A; EP3866851A4; US20210347895A1; AU2019359877A1; BR112021007469A2

Abstract

本文所述的发明涉及双特异性抗体，其能够通过特异性结合第一外泌体相关蛋白和作为第二外泌体相关蛋白的程序性死亡配体‑1(“PD‑L1”)来选择性地靶向外泌体。这些双特异性抗体可以通过靶向抑制T细胞活化的肿瘤细胞来源的外泌体来破坏对免疫细胞的抗肿瘤活性的抑制。因此，本发明的双特异性抗体可用于治疗癌症的方法中。

Description

靶向外泌体的双特异性抗体

技术领域

本发明的领域涉及用于治疗癌症的基于抗体的疗法。

背景技术

人适应性免疫系统通过细胞(T细胞)和体液(B细胞)过程二者对抗原攻击作出应答。体液应答导致表达能够与抗原结合的表面结合免疫球蛋白(Ig)分子的B细胞的选择和克隆扩增。T细胞由未成熟的前体发育而来，所述未成熟的前体来源于骨髓，并且然后迁移到胸腺，在那里它们增殖并分化为成熟的T淋巴细胞。

体液应答的发展包括与克隆扩增一致发生的体细胞超突变(somatichypermutation)和类别转换的过程。这些过程一起导致分泌的抗体已经针对靶抗原进行了亲和力成熟，并包含属于四个一般类别(M、D、A、G或E)之一的恒定结构域。每一类抗体(IgM、IgD、IgA、IgG和IgE)以不同的方式与细胞免疫系统相互作用。已经针对靶抗原进行了亲和力成熟的抗体的标志可包括：1)相对于种系基因，核苷酸和随后的氨基酸的变化，2)对靶抗原的高结合亲和力，3)与其他蛋白质相比，对靶抗原的结合选择性。

众所周知，肿瘤患者可以引起针对肿瘤细胞抗原的免疫应答。这些抗原可能由于肿瘤内的遗传变化引起，其导致突变的蛋白质或导致其他方面正常的蛋白质对免疫系统的异常呈递。异常呈递可以通过包括但不限于以下的过程发生：新生蛋白质(neonatalprotein)的异位表达，细胞内蛋白质错误定位于细胞表面，或细胞裂解。导致蛋白质糖基化变化的酶的异常表达也可以导致产生被体液免疫系统识别的非自身抗原。

已经证明选择性结合疾病相关蛋白(包括与癌症相关的那些)的抗体以导致治疗功效的方式成功地调节其靶蛋白的功能。人免疫系统引起针对突变或其他方面异常的蛋白质的抗体应答的能力表明，患者的免疫应答可以包括能够识别和调节关键肿瘤驱动程序功能的抗体。就此而言，参与细胞膜运输的蛋白质表达的升高与肿瘤生长和肿瘤转移升高有关。

膜运输有助于调节许多各种细胞过程。细胞表面受体的内化是适当调节生长因子受体介导的信号传导的关键机制。通过网格蛋白包被囊泡的内化代表了癌症相关受体从细胞表面内化的一种途径。将这些受体装载到网格蛋白包被小窝(clathrin-coated pit)(CCP)中以随后在网格蛋白包被囊泡中内化是该途径的第一步。受体向CCP中的装载部分地取决于与衔接子分子(例如Epsin-1(EPN1))的相互作用。

EPN1是定位在细胞膜上的约60.3kDa的蛋白质。其包含PI(4,5)P2-、泛素-和网格蛋白/AP-2相互作用结构域。敲低EPN1内源表达的表达，使EPN1的突变形式过表达或用旨在阻断EPN1与其货物分子相互作用的试剂处理细胞，可以抑制已知的CCP依赖性货物的内化。这样的货物的实例是VEGFR和ERBB3。明显地，某些类型的癌肿瘤细胞释放装载EPN1的外泌体，并且可以通过阻断EPN1与其受体相互作用来阻止这样的细胞的生长。

初始的

成熟的T细胞离开胸腺并迁移到专门的淋巴器官，例如淋巴结、脾脏和扁桃体。如果初始T细胞接收到活化信号，其将经历多轮分裂以产生效应细胞群以及另一些恢复到静止期的细胞，其中其保持准备对随后暴露于活化信号的响应。

T细胞的活化通过两种信号的共刺激模型发生(图21)。用于T细胞活化的第一信号(primary signal)是T细胞表面的T细胞受体(TCR)与主要组织相容性复合体(“MHC”)蛋白中的抗原呈递细胞(APC)表面呈递的其同源抗原(Ag)结合。除了允许对外来抗原的应答之外，这种活化模式还允许自身与非自身的区分以及免疫耐受的实现。

第二活化信号通过存在于APC表面上的共刺激分子传导至T淋巴细胞。第一信号与第二信号强度之间的相互作用对于适当的T细胞活化是必需的。在抗原活化的情况下，缺乏共刺激可能导致T细胞耗竭(T cell exhaustion)或对外来抗原刺激的耐受。相比之下，通过TCR的强的第一信号传导可以克服共刺激的缺乏。

通过共刺激对T细胞的活化由负共刺激信号平衡。正与负共刺激信号之间的相互作用提供了在阻止耐受性的破坏和自身免疫的发展的同时针对外来抗原的免疫活化之间的适当平衡。

负责共刺激的分子具有治疗意义，因为通过那些分子进行信号传导的操纵可以增强或减弱T细胞应答。T细胞衰竭或无反应性(anergy)与T细胞表面上的程序性细胞死亡1(PD-1)的表达相关。程序性细胞死亡配体1(PD-L1)与其同源受体PD-1的结合降低了T细胞活化。已经证明用能够阻止PD-L1与PD-1结合的抗体拮抗PD-1/PD-L1途径增强了T细胞的活化并改善了肿瘤患者的临床结果。

存在于肿瘤来源的外泌体上的PD-L1代表了T细胞的有效负调节信号。外泌体是来源于多泡体(multivesciular body)并分泌到细胞外环境中的纳米尺寸(30-150nm)的膜囊泡。外泌体包含细胞来源的膜结合的受体和配体，以及细胞内成分，例如RNA和代谢物。已知肿瘤细胞产生能够远距离将肿瘤来源的成分转移到正常细胞中的外泌体。除其他外，肿瘤来源的外泌体与正常细胞的转化和转移性生态位(metastatic niche)的调节有关。

外泌体相关PD-L1水平的升高是晚期疾病的标志，并且可能与某些癌症(包括头颈癌、胃癌、黑素瘤和多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforma))中的临床结果负相关。破坏肿瘤中外泌体诱导的T细胞抑制代表了用于治疗癌症的治疗策略。出于该目的，本文描述了能够靶向外泌体PD-L1和另一种外泌体标志物的双特异性抗体，作为用于克服PD-L1诱导的免疫抑制和治疗多种癌症的有效药剂。更具体地，本文公开和示例了靶向PD-L1和EPN1的双特异性抗体。

发明内容

本文所述的发明涉及能够通过特异性结合第一外泌体相关蛋白和作为第二外泌体相关蛋白的程序性死亡配体-1(“PD-L1”)来同时靶向外泌体的双特异性抗体。这样的双特异性抗体能够通过靶向肿瘤细胞来源的外泌体来破坏对免疫细胞的抗肿瘤活性的抑制，所述外泌体包含抑制T细胞活化的配体，例如D-L1。因此，本发明的组合物和方法可用于治疗癌症。

双特异性抗体的第一外泌体相关靶标可以是例如四次穿膜蛋白(Tetraspanin)跨膜家族蛋白质、肿瘤易感基因101(“TSG101”)、主要组织相容性复合体(MHC)II类分子、程序性细胞死亡6相互作用蛋白(“PDCD6IP”)、热休克蛋白、细胞骨架蛋白、膜联蛋白或膜转运蛋白。因此，根据本发明的双特异性抗体的第一结合部分可以例如特异性结合Epsin-1(“EPN1”)、CD9、CD10、CD26、CD37、CD45/ICAM-1、CD63、CD69、CD81、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、筏蛋白-1(Flotillin-1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(Glypican-1)、HER2、HER3、HSP70、HSP90和NKCC2。

根据本发明的双特异性抗体的第二结合部分可以来源于任何PD-L1-特异性抗体，包括PD-L1-特异性抗体的VH和VL链，所述抗体例如但不限于阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)或BMS 936559。

附图说明

图1是B7家族的T细胞共刺激分子的图示；

图2显示了通过流式细胞术测定的外泌体与抗CD63包被的珠的剂量依赖性结合。用荧光标记的抗CD63抗体检测与抗CD63珠结合的外泌体；

图3显示了当通过流式细胞术评估结合时，通过吸附而被捕获在乳胶珠上的外泌体与抗EPN1抗体IMM20059具有反应性。相比之下，IMM20059不与BSA包被的珠结合；

图4显示了利用Attune^TMNxT仪器(生命科技公司(Life Technologies))通过流式细胞术观察到的IMM20059与完整A549肺癌细胞系结合的浓度依赖性结合曲线。用荧光团标记的抗人第二抗体检测IMM20059与完整细胞的结合；

图5显示了利用Attune^TMNxT仪器(生命科技公司)通过流式细胞术观察到的IMM20059与完整Huh7肝癌细胞结合的浓度依赖性结合曲线。用荧光团标记的抗人第二抗体(Abs)检测IMM20059与完整细胞的结合；

图6显示了定量斑点印迹结果，其描述了相对于其同源物EPN2，IMM20059对EPN1的选择性。通过针对浓度增加的重组EPN1或EPN2的斑点印迹来分析IMM20059的结合；

图7显示了流式细胞术分析，表明IMM20059与鼠EPN1抗原交叉反应。进行了鼠NIH3T3和人MFE296细胞系细胞的表面和细胞内染色。在两种细胞系的库中观察到IMM20059的细胞表面和细胞内结合。已知与小鼠和人EPN1二者交叉反应的市售抗EPN1抗体类似地与NIH3T3和MFE296细胞结合。但是，在两个细胞库中，市售抗体无法与细胞表面的EPN1相互作用；

图8是两种单特异性IgG抗体和由分离自两种不同IgG抗体中的每一种的可变结构域产生的双特异性抗体的卡通表示；

图9是卡通表示，表明双特异性抗EPN1/抗PDL1抗体将与包含两种标志物的外泌体结合；

图10显示了斑点印迹结果，表明双特异性抗体内抗PD-L1可变结构域的位置影响抗体与PD-L1结合的能力，但不影响与EPN1结合的能力；

图11显示了利用Attune^TMNxT仪器(生命科技公司)通过流式细胞术观察到的Ate/PR045-2H11:L抗EPN1/抗PD-L1双特异性抗体与完整A549肺癌细胞系的浓度依赖性结合曲线。用荧光团标记的抗人第二抗体检测IMM20059与完整细胞的结合。

具体实施方式

本文所述的发明涉及能够通过特异性结合第一和第二外泌体相关蛋白而同时靶向外泌体的双特异性抗体。更特别地，根据本发明的第二外泌体相关蛋白是程序性死亡配体-1(“PD-L1”)。因此，根据本发明的双特异性抗体具有特异性结合外泌体相关蛋白上的表位的第一抗原结合部分和特异性结合PD-L1上的表位的第二抗原结合部分。根据本发明的双特异性抗体可以通过靶向肿瘤细胞来源的外泌体来破坏对免疫细胞的抗肿瘤活性的抑制，其包含抑制T细胞活化的配体，例如PD-L1。因此，双特异性抗体可用于治疗受多种类型癌症影响的受试者。因此，本发明还包括作为癌症治疗方案的组分的组合物，所述组合物被配制用于施用和递送本发明的双特异性抗体至有此需要的受试者。

通常，外泌体是已知包含属于以下一个或多个组的蛋白质的囊泡：四次穿膜蛋白跨膜家族蛋白质，例如CD9、CD63和CD81；肿瘤易感基因101(“TSG101”)；主要组织相容性复合体(MHC)II类分子；程序性细胞死亡6相互作用蛋白(“PDCD6IP”)18、22、37、38、41；热休克蛋白(HSP60、HSP70和HSP90)；细胞骨架蛋白(肌动蛋白和微管蛋白)；膜联蛋白(调节膜中的细胞骨架变化和膜融合的蛋白质)；和膜转运蛋白。通常认为外泌体不包含内质网蛋白，例如钙结合蛋白和高尔基体蛋白或核蛋白。已知外泌体还可以包含蛋白质CD10、CD26、CD37、CD45/ICAM-1、CD63、CD69、CD81、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、筏蛋白-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、HER2、HER3或NKCC2。

基础抗体结构包含两条重(H)和两条轻(L)多肽链，每条多肽链均包含恒定区和可变区，并通过二硫键相互连接。在人中，有两种类型的免疫球蛋白轻链，称为lambda(“λ”)和kappa(“κ”)，以及五种主要的免疫球蛋白重链类别，也称为同种型，其决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、Ig、IgA和IgE。可变重(“V_H”)区与可变轻(“V_L”)区一起形成可变片段“Fv”，负责抗体与其抗原的特异性结合。全长重链还具有三个恒定结构域(CH1、CH2、CH3)。抗体(Abs)的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。

V_H和V_L区包含被三个称为互补决定区(“CDR”)的高变区中断的“框架”区。CDR主要负责与抗原表位的结合。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守，并用于在三维空间中定位和对齐CDR。每条链的三个CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依次编号，并且通常由特定CDR所在的链来标识。因此，重链CDR被命名为H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3；同样地，轻链CDR被命名为L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域的抗原结合片段称为Fab片段。F(ab)'₂片段包含两个Fab片段，并且可以通过在铰链区切割免疫球蛋白分子来产生。

双特异性抗体能够同时结合两个不同的表位。根据本发明的双特异性抗体可以是任何免疫球蛋白或免疫球蛋白衍生分子或容纳在同一分子内的分子复合体的形式。在多种实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的第一结合部分可以选自与外泌体相关蛋白上的表位结合的抗体，所述外泌体相关蛋白例如但不限于Epsin-1(“EPN1”)、CD9、CD10、CD26、CD37、CD45/ICAM-1、CD63、CD69、CD81、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、筏蛋白-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、HER2、HER3、HSP70、HSP90和NKCC2。例如，双特异性抗体可包含特异性结合人EPN1上的表位的第一抗原结合部分，例如国际专利申请号PCT/US19/54259中描述的结合部分，该文献通过引用并入本文。在多种实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的EPN1特异性第一结合部分可包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6中所示的可变重链，如SEQ ID NO:4或SEQID NO:8中所示的可变轻链。在另一些实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的第一抗原结合部分具有：(1)以下中的至少一种：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；(2)以下中的至少一种：(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR3。

根据本发明的双特异性抗体的第二结合部分可以来源于任何PD-L1-特异性抗体，包括PD-L1-特异性抗体的V_H和V_L链，所述抗体例如但不限于阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或BMS-936559。

考虑到对双特异性抗体的前述描述，根据本发明的双特异性抗体的一个实施方案可以具有：EPN1-特异性第一结合部分，其具有基于SEQ ID NO:9的重链CDR1，基于SEQ IDNO:10的重链CDR2，和基于SEQ ID NO:11的重链CDR3，基于SEQ ID NO:12的轻链CDR1，基于SEQ ID NO:13的轻链CDR2，和基于SEQ ID NO:14的轻链CDR3；以及PD-L1-特异性第二结合部分，其具有来源于PD-L1-特异性抗体的重链和轻链CDR。因此，根据本发明的双特异性抗体的另一个实施方案可以具有：EPN1-特异性第一结合部分，其具有基于SEQ ID NO:9的重链CDR1，基于SEQ ID NO:10的重链CDR2，和基于SEQ ID NO:11的重链CDR3，基于SEQ ID NO:12的轻链CDR1，基于SEQ ID NO:13的轻链CDR2，和基于SEQ ID NO:14的轻链CDR3；以及PD-L1特异性第二结合部分，其具有基于SEQ ID NO:17的重链CDR1，基于SEQ ID NO:18的重链CDR2，和基于SEQ ID NO:19的重链CDR3，基于SEQ ID NO:20的轻链CDR1，基于SEQ ID NO:21的轻链CDR2，和基于SEQ ID NO:22的轻链CDR3。

双特异性抗CD-63/抗PD-L1抗体是能够选择性地靶向PD-L1阳性外泌体库的双特异性抗体的另一个实施方案。抗CD-63/抗PD-L1双特异性抗体的实施方案包括但不限于这样的抗体：其具有抗CD-63抗体的可变结构域或可变结构域中存在的CDR(SEQ ID NO:44和45)，以及以下抗PD-L1抗体之一的可变结构域或可变结构域中存在的CDR：阿特珠单抗(SEQID NO:15和16)；阿维鲁单抗(SEQ ID NO:23和24)；德瓦鲁单抗(SEQ ID NO:25和26)；或BMS-936559(SEQ ID NO:27和28)。一个优选实施方案是抗CD-63/抗PD-L1双特异性抗体，其包含改造成DVD-Ig格式的抗CD-63抗体(SEQ ID NO:44和45)和阿特珠单抗的V_H和V_L结构域。使用针对抗EPN-1/抗PD-L1双特异性抗体定义的接头和方向，抗CD-63和阿特珠单抗可变结构域的四种不同构型是可能的。

双特异性抗HER2/抗PD-L1抗体是能够选择性地靶向PD-L1阳性外泌体库的双特异性抗体的另一个实施方案。抗HER2/抗PD-L1双特异性抗体的实施方案包括但不限于这样的抗体：其具有抗HER2抗体曲妥珠单抗的可变结构域或可变结构域中存在的CDR(SEQ ID NO:46和47)，以及以下抗PD-L1抗体之一的可变结构域或可变结构域中存在的CDR：阿特珠单抗(SEQ ID NO:15和16)；阿维鲁单抗(SEQ ID NO:23和24)；德瓦鲁单抗(SEQ ID NO:25和26)；或BMS-936559(SEQ ID NO:27和28)。一个优选实施方案是抗HER2/抗PD-L1双特异性抗体，其包含改造成DVD-Ig格式的抗HER2抗体(SEQ ID NO:46和47)和阿特珠单抗的V_H和V_L结构域。使用针对抗EPN-1/抗PD-L1双特异性抗体定义的接头和方向，抗HER2和阿特珠单抗可变结构域的四种不同构型是可能的。

双特异性抗EpCAM/抗PD-L1抗体是能够选择性地靶向PD-L1阳性外泌体库的双特异性抗体的另一个实施方案。抗EpCAM/抗PD-L1双特异性的实施方案具有抗EpCAM抗体奥妥珠单抗(oportuzumab)的可变结构域或可变结构域中存在的CDR(SEQ ID NO:48和49)，以及以下抗PD-L1抗体之一的可变结构域或可变结构域中存在的CDR：阿特珠单抗(SEQ ID NO:15和16)；阿维鲁单抗(SEQ ID NO:23和24)；德瓦鲁单抗(SEQ ID NO:25和26)；或BMS-936559(SEQ ID NO:27和28)。一个优选实施方案是抗EpCAM/抗PD-L1双特异性抗体，其包含改造成DVD-Ig格式的抗EpCAM抗体(SEQ ID NO:48和49)和阿特珠单抗的V_H和V_L结构域。使用针对抗EPN-1/抗PD-L1双特异性抗体定义的接头和方向，抗EpCAM和阿特珠单抗可变结构域的四种不同构型是可能的。

双特异性抗HER3/抗PD-L1抗体是能够选择性地靶向PD-L1阳性外泌体库的双特异性抗体的另一个实施方案。抗HER3/抗PD-L1双特异性的实施方案具有抗HER3抗体的可变结构域或可变结构域中存在的CDR(SEQ ID NO:50和51)，以及以下抗PD-L1抗体之一的可变结构域或可变结构域中存在的CDR：阿特珠单抗(SEQ ID NO:15和16)；阿维鲁单抗(SEQ IDNO:23和24)；德瓦鲁单抗(SEQ ID NO:25和26)；或BMS-936559(SEQ ID NO:27和28)。一个优选实施方案是抗HER3/抗PD-L1双特异性抗体，其包含改造成DVD-Ig格式的抗HER3抗体(SEQID NO:50和51)和阿特珠单抗的V_H和V_L结构域。使用针对抗EPN-1/抗PD-L1双特异性抗体定义的接头和方向，抗HER3和阿特珠单抗可变结构域的四种不同构型是可能的。

根据本发明的双特异性抗体是完全人或人源化的单克隆抗体。换言之，根据本发明的双特异性抗体可以包含来源于一种或多种人免疫球蛋白的框架区和CDR。实际上，框架区可以来源于一种人抗体，并且被改造以包含来自不同人抗体的CDR。例如，根据本发明的抗体可以具有：i)来源于对外泌体蛋白质靶标具有特异性的人抗体的一个或多个CDR；ii)来源于对PD-L1具有特异性的人抗体一个或多个CDR；以及来源于另一种人类抗体的框架区。

根据本发明的双特异性抗体可以是抗体片段变体。例如，根据本发明的双特异性抗体的片段变体包括二价F(ab)'₂片段、二价单链Fv蛋白(“bi-scFv”)和二价二硫键稳定的Fv蛋白(“bi-dsFv”)。F(ab')₂片段是两个Fab'片段的二聚体，Fab'片段可以通过用酶胃蛋白酶处理完整抗体而不进行随后还原而获得，因此Fab'单体通过两个二硫键保持在一起。单链("sc")抗体例如bi-scFv片段是遗传改造分子，其包含第一抗体的重链和轻链的V_L和V_H区，以及第二抗体的重链和轻链的V_L和V_H区，它们全部通过一个或多个合适的多肽接头连接，以产生遗传融合的单链分子。根据本发明的双特异性抗体也可以是两种不同的scFV抗体的二聚体。双特异性抗体的其他实例包括串联scFv(taFv或scFv2)、双抗体、dAb2NHH2、隆突-入-穴衍生物(knob-into-hole derivative)、SEED-lgG、异源Fc-scFv、Fab-scFv、scFvJun/Fos、Fab'-Jun/Fos、三抗体、DNL-F(ab)3、scFv3-CHI/CL、Fab-scFv2、IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-lgG、scFv2-Fc、F(ab')2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fe、scFv2-H/L、DVD-lg、串联双抗体("TandAb")、scFv-dhlx-scFv、dAb2-lgG、dAb-lgG、dAb-Fc-dAb。

本领域技术人员将认识到可以产生双特异性抗体的保守变体。这样的保守变体将保留V_H和V_L区之间正确折叠和稳定所必需的关键氨基酸残基，并且将保留残基的电荷特征以保持分子的低pI和低毒性。可以在V_H和V_L区中进行氨基酸替换(例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个氨基酸替换)以提高产率。提供功能上相似的氨基酸的保守氨基酸替换表是本领域普通技术人员公知的。以下六组氨基酸是被认为彼此保守替换的氨基酸的实例：i)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；ii)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；iii)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；iv)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；v)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；以及vi)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。

根据本发明的双特异性抗体还可以包含“带标签的(tagged)”免疫球蛋白CH3结构域，以促进针对内源抗体背景的生物学检测。更特别地，带标签的CH3结构域是已被引入人IgG来源的CH3结构域的AB、EF或CD结构环中的一个或多个中的异源抗体表位。优选将CH3标签引入IgG1亚类抗体的结构背景中，根据本发明也可使用其他人IgG亚类，包括IgG2、IgG3和IgG4。带表位标签(Epitope-tagged)的CH3结构域(也称为“CH3骨架”)可以引入到具有一般为免疫球蛋白Fc部分的形式的重链恒定区的本发明任何抗体中。CH3骨架标签的实例以及用于将其引入抗体中的方法公开在PCT专利申请号PCT/US19/32780中。用于检测带表位标签的CH3骨架的抗体在本文中通常称为“检测抗体(detector antibody)”。

根据本发明的双特异性抗体的治疗功效与其对靶抗原的结合亲和力相关。结合亲和力可以通过Frankel等人,Mol.Immunol.,16:101-106,1979描述的Scatchard方法的修改来计算。或者，可以通过抗体与其抗原的解离速率来测量结合亲和力。多种方法可用于测量结合亲和力，包括例如表面等离子共振(SPR)、竞争放射免疫测定、ELISA和流式细胞术。

“特异性结合”抗原的抗体是以高亲和力结合抗原并且不会显著结合其他不相关抗原的抗体。抗体与其抗原的高亲和力结合是通过抗体的一个或多个CDR与抗原靶标的表位(也称为抗原决定簇)的结合相互作用来介导的。表位是分子上具有抗原性的特定化学基团或肽序列，这意味着其能够引发特异性免疫应答。被根据本发明的抗体特异性结合的表位可以例如包含在由一种或多种类型的癌症的细胞表达的蛋白质内。通常，如果其解离常数值(“K_D”)为50nM或更小，则抗体表现出“高亲和力结合”。因此，如果抗体与至少一个结合靶标之间的K_D为50nM、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、9nM或更小、8nM或更小、7nM或更小、6nM或更小、5nM或更小、4nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小，则根据本发明的双特异性抗体对于其外泌体蛋白质或PD-L1结合靶标表现出高亲和力结合。

根据本发明的双特异性抗体的高亲和力结合可以关于其与表达PD-L1的细胞的结合来描述。更特别地，如果其半数最大有效浓度(EC₅₀)值为10nM或更小、9nM或更小、8nM或更小、7nM或更小、6nM或更小、5nM或更小、4nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小，则根据本发明的抗体表现出与表达PD-L1的细胞的高亲和力结合。类似地，除了以高亲和力结合PD-L1外，同一抗体也可以以高亲和力结合不同的外泌体相关蛋白，例如与TSG101、CD9、CD10、CD26、CD37、CD45/ICAM-1、CD63、CD69、CD81、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、筏蛋白-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、HER2、HER3、HSP70、HSP90或NKCC2结合。在多种变体中，例如，根据本发明的双特异性抗体表现出以下EC₅₀：(i)与表达EPN1的外泌体或细胞的EC₅₀为10nM或更小、9nM或更小、8nM或更小、7nM或更小、6nM或更小、5nM或更小、4nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小；并且与表达PD-L1的外泌体或细胞的EC₅₀为10nM或更小、9nM或更小、8nM或更小、7nM或更小、6nM或更小、5nM或更小、4nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小。

如上所述，根据本发明的双特异性抗体可用于预防、治疗或改善受试者中的疾病的方法中。更具体地，根据本发明的双特异性抗体可用于预防、治疗或改善癌症。“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况已经开始发展后改善其症状或体征的治疗性干预，例如减轻肿瘤负荷或减少转移灶的数量或尺寸。“改善”是指降低疾病(例如癌症)的体征或症状的数量或严重性。根据本发明的双特异性抗体的量提供症状的主观缓解或如临床医生或其他合格专业人员所指出的客观可识别的改善。用于预防、治疗或改善癌症的方法可能需要向受试者施用包含有效量的根据本发明的双特异性抗体的组合物，以通过靶向肿瘤细胞来源的外泌体来通过破坏对免疫细胞的抗肿瘤活性的抑制来抑制肿瘤的生长或转移。所述外泌体包含：i)PD-L1，其为抗肿瘤诱导的T细胞活化的抑制剂；以及ii)可能也或可能不抑制T细胞活化的一种其他的外泌体蛋白质。因此，施用的双特异性抗体会接触肿瘤细胞来源的外泌体(即处于与外泌体直接物理缔合)，其中双特异性抗体可以结合其至少一个外泌体靶标，以阻止PD-L1充当T细胞活化的抑制剂。在多种实施方案中，根据本发明的双特异性抗体阻止PD-L1介导的细胞信号传导，否则其将传递抑制信号，所述信号降低淋巴结中抗原特异性T细胞的增殖，同时降低调节性T细胞(抗炎、抑制性T细胞)的凋亡。

施用于有此需要的受试者的根据本发明的双特异性抗体被配制成组合物。更特别地，双特异性抗体可以被配制用于全身施用或局部施用，例如肿瘤内施用。例如，根据本发明的双特异性抗体可以被配制用于肠胃外施用，例如静脉内施用。所述组合物可以以单位剂型制备，以用于向受试者施用。施用的量和时间由临床医生决定以实现期望的结果。根据本发明的双特异性抗体的施用还可以伴随其他抗癌剂或治疗性治疗(例如肿瘤的手术切除)的施用。任何合适的抗癌剂可以与本文公开的双特异性抗体组合施用。示例性的抗癌剂包括但不限于化学治疗剂，例如有丝分裂抑制剂、烷基化剂、抗代谢物、嵌入抗生素(intercalating antibiotic)、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物反应调节剂、抗激素(例如抗雄激素)和抗血管生成剂。其他抗癌治疗包括放射治疗和其他特异性靶向癌细胞的抗体。

用于施用的组合物可以包含溶解在药学上可接受的载体(例如水性载体)中的双特异性抗体的溶液。通常，载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖溶液或甘油作为载剂。对于固体组合物，例如散剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式，常规的无毒固体载体可包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物还可包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。前述载体溶液是无菌的并且通常不含不希望的物质，并且可以通过常规的、公知的灭菌技术进行灭菌。所述组合物可根据需要包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂，以及毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。这些制剂中抗体的浓度可以在很大范围内变化，并且将主要根据所选择的特定施用方式和受试者的需要基于流体体积、粘度、体重等来选择。

用于施用根据本发明的双特异性抗体组合物的选项包括但不限于通过缓慢输注施用或通过静脉内推送或推注施用。在施用之前，根据本发明的双特异性抗体组合物可以以冻干形式提供，并在施用前在无菌溶液中再水合至期望浓度。然后可以例如将双特异性抗体溶液添加到含有0.9％氯化钠(USP)的输液袋中，并且在一些情况下以0.5至20mg/kg体重的剂量施用。在施用根据本发明的抗体组合物的一个实施例中，施用较高的负载剂量，随后以较低的水平施用维持剂量。例如，可以经过约90分钟的时间输注4mg/kg的初始负载剂量，如果之前的剂量良好耐受，则然后每周经过30分钟输注2mg/kg的维持剂量，持续4至8周。

根据本发明的双特异性抗体组合物也可以是控释制剂。控释肠胃外制剂例如可以制成植入物或油性注射剂。包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒在内的微粒系统也可用于递送根据本发明的双特异性抗体组合物。如本文所指的微胶囊包含根据本发明的双特异性抗体作为中心核心组分。在微球中，根据本发明的抗体分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球和微胶囊通常分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。

根据本发明的双特异性抗体组合物也可以包装到用于治疗受试者中的癌症的试剂盒中。这样的试剂盒包含本文公开的任何组合物。试剂盒还可包含用于每种药物组合物以及其他包含的试剂(例如缓冲剂、平衡盐溶液)的合适的储存容器，例如安瓿、小瓶和管，以用于将组合物施用于受试者。组合物和其他试剂可以以任何方便的形式存在于试剂盒中，例如以溶液或粉末形式。试剂盒可进一步包含使用组合物的说明书。试剂盒可进一步包含包装容器，所述包装容器可具有一个或多个用于容纳药物组合物和其他试剂的分区。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，可以使用两种免疫球蛋白重链/轻链对的共表达重组生产双特异性抗体。参见例如Milstein等人(1983)Nature 305:537-39。或者，可以使用化学连接来制备双特异性抗体。参见，例如，Brennan等人(1985)Science 229:81。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见，例如Bolliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-48，Gruber等人(1994)J.Immunol.152:5368。因此，可以通过在培养的活细胞中表达编码其氨基酸序列的核酸序列来产生根据本发明的双特异性抗体。根据本发明的“分离的”双特异性抗体是已经从其他生物组分环境(例如细胞、蛋白质和细胞器)中基本上分离或纯化的抗体。例如，如果双特异性抗体被纯化至以下程度，则其为分离的：i)通过Lowry方法测定的蛋白质的按重量计大于95％、96％、97％、98％或99％，以及替代地，大于按重量计99％；ii)足以通过使用旋转杯测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；iii)在还原或非还原条件下，通过使用考马斯蓝或银染的SDS-PAGE为均质。分离的抗体也可以是在重组细胞中原位的根据本发明的抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分已经不存在。但是，通常来说，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

通过用根据本发明的抗体的合适核苷酸编码序列转化或转染细胞，多种宿主表达载体系统可用于表达根据本发明的双特异性抗体。宿主表达细胞的实例包括但不限于：细菌，例如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)，其可以用包含在重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体中的双特异性抗体编码序列转染；酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces)和毕赤酵母(Pichia)，用包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转化；昆虫细胞系统，用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体例如杆状病毒感染；植物细胞系统，用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体例如花椰菜花叶病毒(“CaMV”)或烟草花叶病毒(“TMV”)感染；以及哺乳动物细胞系统，例如但不限于COS、中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞、ExpiCHO、幼仓鼠肾(“BHK”)细胞、HEK293、Expi293、3T3、NSO细胞，其具有包含来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子或延伸因子1α启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒的晚期启动子和牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体。例如，与引入了小鼠和大鼠延伸因子1α启动子以分别表达重链和轻链片段的双重启动子载体组合的哺乳动物细胞(例如人胚肾293(HEK293)，或其衍生物例如Expi293)是用于根据本发明的抗体的有效表达系统，其可以根据用于表达的抗体分子的预期用途来有利地选择。

当要生产大量根据本发明的双特异性抗体以产生抗体的药物组合物时，可能需要指导表达高水平的易于纯化的融合蛋白产物的载体。这样的载体包括但不限于：pUR278载体(Ruther等人EMBO J.2:1791(1983))，其中抗体编码序列可以单独地与lac Z编码区在框内连接到载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985)，以及Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989))；用于将本发明的抗体与谷胱甘肽S-转移酶(“GST”)融合的pGEX载体。根据本发明的抗体与多肽标签的GST融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附并结合到基质谷胱甘肽-琼脂糖珠上然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。相反，pGEX载体被设计成包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物(根据本发明的抗体)可以从GST部分释放。

还可以选择调节编码根据本发明的抗体的插入序列的表达或根据需要对基因产物进行修饰和加工的宿主表达细胞系统。例如，修饰(包括糖基化)和加工(例如蛋白质产物的切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。实际上，不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。为此，可以使用真核宿主细胞，其具有适当的细胞机器以用于初级转录物的适当加工以及根据本发明的基因产物的糖基化和磷酸化。

实施例

以下实施例描述了靶向外泌体的双特异性抗体的设计和表征。

实施例1.外泌体包含可以作为抗体靶标的膜结合蛋白。来源于正常组织和肿瘤组织的细胞可以产生通过不同的生物学过程得到的至少两种类型的细胞外囊泡(EV)：外泌体和核外颗粒体(ectosome)。已认识到了EV在细胞通讯中起重要作用。EV的特征在于一系列不同的蛋白质成分，包括插入囊泡脂质双层中的蛋白质。已知存在于外泌体膜中的蛋白质可分为功能类别，包括但不限于四次穿膜蛋白、热休克蛋白、膜转运蛋白、细胞表面受体和脂质结合分子。包含那些功能类别的公认蛋白质包括但不限于TSG101、CD9、CD10、CD26、CD37、CD45/ICAM-1、CD63、CD69、CD81、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、筏蛋白-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、HER2、HER3、HSP70、HSP90、NKCC2和PD-L1。存在于外泌体表面的蛋白质(例如CD63)可以通过对这些表面分子具有特异性的抗体来检测。图2证明来源于22Rv1前列腺癌细胞的外泌体可以通过与抗CD63包被的珠相互作用以剂量依赖性的方式分离。与外泌体相关的跨膜蛋白的组成可取决于外泌体来源的细胞类型。外泌体的批量制剂可以与乳胶珠缀合，并通过流式细胞术用抗CD63抗体检测(图3)。批量外泌体包被的珠也与抗EPN1抗体IMM20059反应。IMM20059染色取决于珠表面上存在的外泌体；BSA包被的珠无法与IMM20059相互作用。数据表明，EPN1存在于至少一部分外泌体的表面上。

实施例2.IMM20059是与EPN1结合的抗体。通过使分离自头颈癌患者淋巴结的人B细胞与B56T融合伴侣融合来产生人杂交瘤PR045-2H11。基本上如USPTO#EP2242836“Methodof making hybrid cells that express useful antibodies”中所描述的通过电融合进行人B细胞与B56T的融合。通过分离自产生PR045-2H11的杂交瘤系细胞的RNA的RT-PCR扩增并对所得抗体cDNA进行测序反应来产生编码PR045-2H11的可变重链(V_H)和可变轻链(V_L)结构域的核苷酸序列。SEQ ID NO:1对应于分离自的杂交瘤的PR045-2H11的V_H并且SEQ IDNO:3对应于V_L。由于RT-PCR策略，这些序列缺少对应于可变结构域框架1的最5'部分的区域。基于与已知种系基因序列的同源性来预测IGHV和IGKL基因的分配，并将其用作V_H和V_L序列的真正5'末端的替代物。IMM20059是包含PR045-2H11 V_H和V_L结构域的重组表达的人IgG1抗体。使用对应于IGHV3-48*02的框架1的5'末端的种系序列产生IMM20059 V_H(SEQ ID NO:5)的表达片段。使用对应于IGKV3-11*01的框架1的5'末端的种系序列产生PR045-2H11 V_L(SEQ ID NO:7)的全长表达片段。合成具有额外5'和3'延伸的对应于SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:7的片段，以促进Gibson式克隆到双重启动子IgG1表达载体中。由V_H和V_L片段编码的相应蛋白质序列分别在SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中定义。V_H和V_L结构域的编码区具有体细胞超突变的特征，与种系序列的分别相差15和14个核苷酸。

使用制造商推荐的条件，通过瞬时转染到Expi293细胞中来重组表达IMM20059。通过蛋白A/G亲和色谱法从条件培养基中纯化重组抗体，将缓冲液更换为PBS，并通过流式细胞术分析活性。IMM20059显示出与原始PR045-2H11杂交瘤细胞产生的抗体一致的结合活性。如图4和5所示，当通过流式细胞术分析时，IMM20059显示出与A549肺腺癌和Huh7肝细胞癌细胞系表面的可饱和结合。IMM20059分别以0.9和1.3μg/mL的EC50与A549和Huh7结合。这些值对应于6-9nM的EC50值。

与其同源物EPN2相比，IMM20059以剂量依赖性方式选择性结合重组EPN1(图6)。在反相蛋白测定(RPPA)中，与EPN3相比，IMM20059还显示出对EPN1的选择性。还通过表面等离子共振进一步确定了与重组EPN1相互作用的强度(表1)。在抗人Fc传感器表面上捕获IMM20059或同种型对照以产生结合和对照表面。使重组EPN1一式三份地以递增的浓度流过表面。将双减数据(Double-subtracted data)拟合于1:1结合模型。如表1所示，IMM20059表现出与EPN1的可重复结合，平均K_D为950+/-10pM。

表1.在25℃下为IMM20059/EPN1确定的结合参数

测试	k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)	k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>)	K<sub>D</sub>(pM)
				第1次	7.3(2)e5	7.05(7)e-l	960(20)
第2次	7.87(7)e5	7.36(7)e-4	940(10)
				第3次	7.6(l)e5	7.21(8)e-4	950(10)
平均值	7.6[3]e5	7.2[2]e-4	950[10]

圆括号中的数字是在各个测试中确定的拟合的最后几位的误差。方括号中的数字是在三个测试之间确定的实验误差。

IMM20059与EPN-1阳性鼠细胞的表面结合。如图7所示，IMM20059与鼠NIH-3T3细胞中存在的抗原的细胞表面和细胞内库二者结合。还观察到了针对人细胞系MFE296的这种结合模式。市售抗鼠EPN1抗体不能识别EPN1的细胞表面库。

实施例3.抗EPN-1/抗PD-L1双特异性抗体的设计。双特异性抗体是能够与两种独特靶抗原结合的抗体，其可以通过将来自两种单特异性抗体的可变结构域组合到一个抗体样分子中来产生。文献中已经描述了多种双特异性抗体结构(Brinkman,U.和Kontermann,R.mAbs,9:182-212；2017)。双特异性抗体结构的一个实施方案是双可变结构域-Ig(DVD-Ig)。图8是两种单特异性抗体和由两种单特异性抗体产生的DVD-Ig格式双特异性抗体的卡通表示。与表达仅一种靶标的那些相比，双特异性抗体能够改善对表达两种靶抗原的细胞并且延伸至外泌体的靶向选择性(Robinson等人BR J Cancer 99:1415-1425；2008)。图9是与仅能够靶向EPN-1或PD-L1的单特异性抗体相比，能够与EPN1和PD-L1二者结合的双特异性抗体的外泌体靶向的卡通表示。

文献中描述了许多抗PD-L1抗体。其包括但不限于阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559。与肿瘤细胞定位的PD-L1相比，可以开发出能够共靶向外泌体PD-L1和第二外泌体标志物的双特异性抗体以选择性地靶向外泌体PD-L1。可以在PD-L1双特异性中靶向的外泌体标志物包括但不限于CD9、CD10、CD26、CD37、CD45/ICAM-1、CD63、CD69、CD81、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、筏蛋白-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、HER2、HER3、HSP70、HSP90、NKCC2和EPN-1。双特异性抗EPN-1/抗PD-L1抗体代表一个可能的实施方案。一个优选的实施方案是这样的抗EPN-1/抗PD-L1双特异性：其包含IMM20059的可变结构域或可变结构域中存在的CDR，以及以下抗PD-L1抗体之一的可变结构域或可变结构域中存在的CDR：阿特珠单抗(SEQ ID NO:15和16)、阿维鲁单抗(SEQ ID NO:23和24)、德瓦鲁单抗(SEQ ID NO:25和26)、或BMS-936559(SEQ ID NO:27和28)。一个优选的实施方案是包含改造成DVD-Ig格式的IMM20059和阿特珠单抗的V_H和V_L结构域的抗EPN-1/抗PD-L1双特异性抗体。设计了IMM20059和阿特珠单抗可变结构域的四种不同构型。V_H结构域通过肽接头ASTKGPSVFPLAP(SEQ IDNO:29)以IMM20059-L-阿特珠单抗(SEQ ID NO:33)方向和阿特珠单抗-L-IMM20059(SEQ IDNO:39)二者连接。将IMM20059和阿特珠单抗的V_L结构域利用两种不同的接头并且均为N末端到C末端的顺序融合成单个多肽。“L”接头包含氨基酸序列TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:30)，而“S”接头包含氨基酸序列TVAAP(SEQ ID NO：31)。SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:41代表包含“L”接头的构建体，分别为IMM20059-L-阿特珠单抗和阿特珠单抗-L-IMM20059的顺序。SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:43对应于通过“S”接头序列连接的双特异性构建体。

实施例4.抗EPN1/抗PD-L1 DVD-IgG双特异性抗体的结合活性。通过蛋白A亲和色谱法，从已经用编码双特异性抗体的重链和轻链的质粒瞬时转染的HEK293哺乳动物细胞系衍生物的条件培养基中纯化了四种抗EPN1/抗PD-L1双特异性抗体。包含四种双特异性抗体的可变重结构域和可变轻结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:33和35，SEQ ID NO:33和37，SEQ ID NO:39和41，以及SEQ D NOS:39和43。对纯化的抗体进行斑点印迹分析，以确定其是否具有与重组EPN1和重组PD-L1二者结合的能力。将纯化的重组蛋白在如图10中所示的三个剂量水平下产生斑点，并且用四种抗EPN1/抗PD-L1双特异性抗体进行探测。单特异性IMM20059/PR045-2H11和阿特珠单抗分别作为与EPN1和PD-L1结合的阳性对照。对登革热病毒外壳蛋白具有特异性的抗体用作阴性对照。所有四种双特异性抗体都以与IMM20059相似的水平与EPN1结合。与PD-L1的结合要求抗PD-L1可变结构域存在于在DVD-IgG的N末端(Ate/PR045-2H11:S和Ate/PR045-2H11:L)。其位于抗EPN1可变结构域的C末端(PR045-2H11/Ate:S和PR045-2H11/Ate:L)降低了在斑点印迹形式中与PD-L1结合的能力。可变轻构建体中接头的长度不影响结合。包含对应于SEQ ID NO:37和39的可变轻结构域的抗体在斑点印迹形式中相等地结合重组PD-L1。

当通过流式细胞术分析时，包含由SEQ ID NO:33和39定义的可变结构域的双特异性抗体结合到A549细胞的表面，已知所述细胞在细胞表面上表达EPN1和PD-L1二者。双特异性抗体与细胞表面的结合表现出剂量依赖性的结合曲线，EC50为约0.3微克/mL(图11)。

序列表

SEQ ID NO:1-V_H PR045-2H11核苷酸序列

SEQ ID NO:2-V_H PR045-2H11氨基酸序列

SEQ ID NO:3-V_L PR045-2H11核苷酸序列

SEQ ID NO:4-V_L PR045-2H11氨基酸序列

SEQ ID NO:5-IMM20059 V_H结构域核苷酸序列

SEQ ID NO:6-IMM20059 V_H结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:7-IMM20059 V_L结构域核苷酸序列

SEQ ID NO:8-IMM20059 V_L结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:9-IMM20059 H-CDR1

SEQ ID NO:10-IMM20059 H-CDR2

SEQ ID NO:11-IMM20059 H-CDR3

SEQ ID NO:12-IMM20059 L-CDR1

SEQ ID NO:13-IMM20059 L-CDR2

SEQ ID NO:14-IMM20059 L-CDR3

SEQ ID NO:15-阿特珠单抗V_H结构域

SEQ ID NO:16-阿特珠单抗V_L结构域

SEQ ID NO:17-阿特珠单抗H-CDR1

SEQ ID NO:18-阿特珠单抗H-CDR2

SEQ ID NO:19-阿特珠单抗H-CDR3

SEQ ID NO:20-阿特珠单抗L-CDR1

SEQ ID NO:21-阿特珠单抗L-CDR2

SEQ ID NO:22-阿特珠单抗L-CDR3

SEQ ID NO:23-阿维鲁单抗V_H结构域

SEQ ID NO:24-阿维鲁单抗V_L结构域

SEQ ID NO:25-德瓦鲁单抗V_H结构域

SEQ ID NO:26-德瓦鲁单抗V_L结构域

SEQ ID NO:27-BMS-936559V_H结构域

SEQ ID NO:28-BMS-936559V_L结构域

SEQ ID NO:29-V_H“L”接头

SEQ ID NO:30-V_L“L”接头

SEQ ID NO:31-V_L“S”接头

SEQ ID NO:32-IMM20059-L-ATE双特异性V_H结构域核苷酸序列

SEQ ID NO:33-IMM20059-L-ATE双特异性V_H结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:34-IMM20059-L-ATE双特异性V_L结构域核苷酸序列

SEQ ID NO:35-IMM20059-L-ATE双特异性V_L结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:36-2H11-S-ATE双特异性V_L结构域核苷酸序列

SEQ ID NO:37-2H11-S-ATE双特异性V_L结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:38-ATE-L-2H11双特异性V_H结构域核苷酸序列

SEQ ID NO:39-ATE-L-2H11双特异性V_H结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:40-ATE-L-2H11双特异性V_L结构域核苷酸序列

SEQ ID NO:41-ATE-L-2H11双特异性V_L结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:42-ATE-S-2H11双特异性V_L结构域核苷酸序列

SEQ ID NO:43-ATE-S-2H11双特异性V_L结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:44-抗CD-63抗体的V_H结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:45-抗CD-63抗体的V_L结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:46-抗HER2抗体的V_H结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:47-抗HER2抗体的V_L结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:48-抗EpCAM抗体的V_H结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:49-抗EpCAM抗体的V_L结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:50-抗HER3抗体的V_H结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:51-抗HER3抗体的V_L结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:52-抗EGFR抗体的V_H结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:53-抗EGFR抗体的V_L结构域氨基酸序列

序列表

<110> 伊米若梅有限公司

<120> 靶向外泌体的双特异性抗体

<130> 172.0003-WO00

<150> 67/746,862

<151> 2018-10-17

<160> 53

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 354

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagtatcca tagcctgaat tgggtccgcc 60

aggctccagg gaagggactg gagtgggttt cgtatattag tagtaacagt actaccatat 120

attacgcaga ctctgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaatgcc aaggactccc 180

tgtatctgca aatgaacagc ctcagagacg aggacacggc tgtatattac tgtgcgagag 240

actactactg tactggtggt acctgcttct ttcttcctga cctctggggc cggggagccc 300

tggtcaccgt ctcctcagcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgc 354

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile His Ser Leu Asn

1 5 10 15

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile

20 25 30

Ser Ser Asn Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

35 40 45

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Gln Met

50 55 60

Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp

65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Phe Phe Leu Pro Asp Leu Trp Gly

85 90 95

Arg Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Lys Gly Pro

100 105 110

Ser Val Phe Pro Leu Ala

115

<210> 3

<211> 299

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gaatatcagc aacttcttag cctggtacca 60

acacaaacct ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccatca gggccactgg 120

catcccagcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcagtctca ccatcagcag 180

cctggagcct gaagattttg cagtttattt ctgtcagcag cgttacaact ggctcacttt 240

cggcggaggg accaaggtag agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatct 299

<210> 4

<211> 99

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Asn Phe Leu

1 5 10 15

Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

20 25 30

Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

35 40 45

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

50 55 60

Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Tyr Asn Trp Leu Thr Phe

65 70 75 80

Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser

85 90 95

Val Phe Ile

<210> 5

<211> 407

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

acaggcgcgc actccgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt acagcctggg 60

gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagtatcca tagcctgaat 120

tgggtccgcc aggctccagg gaagggactg gagtgggttt cgtatattag tagtaacagt 180

actaccatat attacgcaga ctctgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaatgcc 240

aaggactccc tgtatctgca aatgaacagc ctcagagacg aggacacggc tgtatattac 300

tgtgcgagag actactactg tactggtggt acctgcttct ttcttcctga cctctggggc 360

cggggagccc tggtcaccgt ctcctcagcc tccaccaagg gcccatc 407

<210> 6

<211> 135

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile His

20 25 30

Ser Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Asn Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Tyr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Phe Phe Leu Pro Asp

100 105 110

Leu Trp Gly Arg Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

130 135

<210> 7

<211> 346

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

tcagatacct ccggagaaat tgtgttgaca cagtctccag ccaccctgtc tttgtctcca 60

ggggaaagag ccaccctctc ctgcagggcc agtcagaata tcagcaactt cttagcctgg 120

taccaacaca aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct atgatgcatc catcagggcc 180

actggcatcc cagccaggtt cagtggcagt gggtctggga cagacttcag tctcaccatc 240

agcagcctgg agcctgaaga ttttgcagtt tatttctgtc agcagcgtta caactggctc 300

actttcggcg gagggaccaa ggtagagatc aaacgaactg tggctg 346

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Asn Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Tyr Asn Trp Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Ser Ile His Ser Leu Asn

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Tyr Ile Ser Ser Asn Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Asp Tyr Tyr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Phe Phe Leu Pro Asp Leu

1 5 10 15

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Asn Phe Leu Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Gln Gln Arg Tyr Asn Trp Leu Thr

1 5

<210> 15

<211> 130

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala

130

<210> 16

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Ser Asp Ser Trp Ile His

1 5

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr

1 5

<210> 23

<211> 132

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala

130

<210> 24

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 25

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala

130

<210> 26

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

<210> 27

<211> 135

<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asp Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Lys Ala His Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Phe His Phe Val Ser Gly Ser Pro Phe Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135

<210> 28

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

<210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 29

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

1 5 10

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 30

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

1 5 10

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 31

Thr Val Ala Ala Pro

1 5

<210> 32

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 32

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt atccatagcc tgaattgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gactggagtg ggtttcgtat attagtagta acagtactac catatattac 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagga ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagcctcag agacgaggac acggctgtat attactgtgc gagagactac 300

tactgtactg gtggtacctg cttctttctt cctgacctct ggggccgggg agccctggtc 360

accgtctcct cagcgagcac aaaaggacca tctgtatttc cactcgcccc cgaagtacag 420

ctcgtagagt ccggaggagg cctggtccaa cctggtggtt cccttcgact gtcatgtgcc 480

gcgtctggct tcactttttc cgattcatgg atacactggg tgaggcaagc acctggcaaa 540

ggtttggaat gggtggcctg gatctcaccg tatgggggta gtacttatta tgcggattca 600

gtaaagggaa gatttaccat ttcagcggac acaagtaaaa ataccgccta tttgcagatg 660

aacagcctgc gagcggaaga cactgctgtc tattattgtg ctagacgcca ctggcctggt 720

ggttttgact actgggggca gggcactttg gtgaccgttt cctca 765

<210> 33

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile His

20 25 30

Ser Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Asn Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Tyr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Phe Phe Leu Pro Asp

100 105 110

Leu Trp Gly Arg Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly

180 185 190

Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

210 215 220

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly

225 230 235 240

Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

<210> 34

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 34

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gaatatcagc aacttcttag cctggtacca acacaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccatca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcagtctca ccatcagcag cctggagcct 240

gaagattttg cagtttattt ctgtcagcag cgttacaact ggctcacttt cggcggaggg 300

accaaggtag agatcaaacg aacagtagca gctccgtcag tttttatttt tcctccagat 360

attcagatga cccagtcccc gtcctctctc tccgctagtg taggtgatag agtgacaata 420

acatgccggg ccagccagga tgtatccacg gcggtcgcgt ggtaccagca gaaacctggg 480

aaagccccca aactgcttat ttatagcgcc agcttcttgt actcaggagt acctagcaga 540

tttagcggtt caggaagtgg gactgatttt acactcacta tatcttccct gcaaccggag 600

gattttgcaa catattattg tcaacaatat ctctaccatc ccgcgacatt cgggcagggc 660

acaaaagtag agatcaaacg a 681

<210> 35

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 35

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Asn Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Tyr Asn Trp Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

115 120 125

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

130 135 140

Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

145 150 155 160

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly

165 170 175

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

180 185 190

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

195 200 205

Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

210 215 220

Ile Lys Arg

225

<210> 36

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 36

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gaatatcagc aacttcttag cctggtacca acacaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccatca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcagtctca ccatcagcag cctggagcct 240

gaagattttg cagtttattt ctgtcagcag cgttacaact ggctcacttt cggcggaggg 300

accaaggtag agatcaaacg aacagtagca gctccggata ttcagatgac ccagtccccg 360

tcctctctct ccgctagtgt aggtgataga gtgacaataa catgccgggc cagccaggat 420

gtatccacgg cggtcgcgtg gtaccagcag aaacctggga aagcccccaa actgcttatt 480

tatagcgcca gcttcttgta ctcaggagta cctagcagat ttagcggttc aggaagtggg 540

actgatttta cactcactat atcttccctg caaccggagg attttgcaac atattattgt 600

caacaatatc tctaccatcc cgcgacattc gggcagggca caaaagtaga gatcaaacga 660

<210> 37

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 37

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Asn Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Tyr Asn Trp Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

115 120 125

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

130 135 140

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

145 150 155 160

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

165 170 175

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

180 185 190

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

210 215 220

<210> 38

<211> 1243

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 38

gaagtacagc tcgtagagtc cggaggaggc ctggtccaac ctggtggttc ccttcgactg 60

tcatgtgccg cgtctggctt cactttttcc gattcatgga tacactgggt gaggcaagca 120

cctggcaaag gtttggaatg ggtggcctgg atctcaccgt atgggggtag tacttattat 180

gcggattcag taaagggaag atttaccatt tcagcggaca caagtaaaaa taccgcctat 240

ttgcagatga acagcctgcg agcggaagac actgctgtct attattgtgc tagacgccac 300

tggcctggtg gttttgacta ctgggggcag ggcactttgg tgaccgtttc ctcagccgcg 360

agcacaaaag gaccatctgt atttccactc gcccccgagg tgcagctggt ggagtctggg 420

ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg agaagtacag ctcgtagagt ccggaggagg 480

cctggtccaa cctggtggtt cccttcgact gtcatgtgcc gcgtctggct tcactttttc 540

cgattcatgg atacactggg tgaggcaagc acctggcaaa ggtttggaat gggtggcctg 600

gatctcaccg tatgggggta gtacttatta tgcggattca gtaaagggaa gatttaccat 660

ttcagcggac acaagtaaaa ataccgccta tttgcagatg aacagcctgc gagcggaaga 720

cactgctgtc tattattgtg ctagacgcca ctggcctggt ggttttgact actgggggca 780

gggcactttg gtgaccgttt cctcagccgc gagcacaaaa ggaccatctg tatttccact 840

cgcccccgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct 900

gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagtatc catagcctga attgggtccg 960

ccaggctcca gggaagggac tggagtgggt ttcgtatatt agtagtaaca gtactaccat 1020

atattacgca gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaaggactc 1080

cctgtatctg caaatgaaca gcctcagaga cgaggacacg gctgtatatt actgtgcgag 1140

agactactac tgtactggtg gtacctgctt ctttcttcct gacctctggg gccggggagc 1200

cctggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtc 1243

<210> 39

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 39

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ser Ile His Ser Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Asn Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr

180 185 190

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

195 200 205

Asp Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Phe

225 230 235 240

Phe Leu Pro Asp Leu Trp Gly Arg Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

260

<210> 40

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 40

gatattcaga tgacccagtc cccgtcctct ctctccgcta gtgtaggtga tagagtgaca 60

ataacatgcc gggccagcca ggatgtatcc acggcggtcg cgtggtacca gcagaaacct 120

gggaaagccc ccaaactgct tatttatagc gccagcttct tgtactcagg agtacctagc 180

agatttagcg gttcaggaag tgggactgat tttacactca ctatatcttc cctgcaaccg 240

gaggattttg caacatatta ttgtcaacaa tatctctacc atcccgcgac attcgggcag 300

ggcacaaaag tagagatcaa acgaaccgtc gccgcaccat cagtttttat ttttcctcca 360

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 420

ctctcctgca gggccagtca gaatatcagc aacttcttag cctggtacca acacaaacct 480

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccatca gggccactgg catcccagcc 540

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcagtctca ccatcagcag cctggagcct 600

gaagattttg cagtttattt ctgtcagcag cgttacaact ggctcacttt cggcggaggg 660

accaaggtag agatcaaacg a 681

<210> 41

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

115 120 125

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

130 135 140

Ala Ser Gln Asn Ile Ser Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro

145 150 155 160

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr

165 170 175

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser

180 185 190

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys

195 200 205

Gln Gln Arg Tyr Asn Trp Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

210 215 220

Ile Lys Arg

225

<210> 42

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 42

gatattcaga tgacccagtc cccgtcctct ctctccgcta gtgtaggtga tagagtgaca 60

ataacatgcc gggccagcca ggatgtatcc acggcggtcg cgtggtacca gcagaaacct 120

gggaaagccc ccaaactgct tatttatagc gccagcttct tgtactcagg agtacctagc 180

agatttagcg gttcaggaag tgggactgat tttacactca ctatatcttc cctgcaaccg 240

gaggattttg caacatatta ttgtcaacaa tatctctacc atcccgcgac attcgggcag 300

ggcacaaaag tagagatcaa acgaacagta gcagctccgg aaattgtgtt gacacagtct 360

ccagccaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcctgcag ggccagtcag 420

aatatcagca acttcttagc ctggtaccaa cacaaacctg gccaggctcc caggctcctc 480

atctatgatg catccatcag ggccactggc atcccagcca ggttcagtgg cagtgggtct 540

gggacagact tcagtctcac catcagcagc ctggagcctg aagattttgc agtttatttc 600

tgtcagcagc gttacaactg gctcactttc ggcggaggga ccaaggtaga gatcaaa 657

<210> 43

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 双特异性

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro

115 120 125

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Asn

130 135 140

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

145 150 155 160

Ile Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

165 170 175

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

180 185 190

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Tyr Asn Trp Leu

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

210 215

<210> 44

<211> 120

<212> PRT

<213> 智人

<400> 44

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Phe Asp Pro Asn Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Arg Thr Tyr Tyr Asp Ala Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 45

<211> 114

<212> PRT

<213> 智人

<400> 45

Asp Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

65 70 75 80

Thr Ile Ser Asn Ile Gln Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

85 90 95

Gln Ile Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg

<210> 46

<211> 132

<212> PRT

<213> 智人

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala

130

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 116

<212> PRT

<213> 智人

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人

<400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 50

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala

130

<210> 51

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人

<400> 51

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser His Ile Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 52

<211> 130

<212> PRT

<213> 智人

<400> 52

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu

130

<210> 53

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 53

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

Claims

1.一种双特异性抗体，其包含：

(A)对外泌体蛋白质具有特异性的第一抗原结合部分，以及

(B)对程序性细胞死亡配体1(PD-L1)具有特异性的第二抗原结合部分。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合部分包含：

(1)以下项中的至少一种：

(a)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链互补决定区(“CDR”)1；

(b)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR3；以及

(2)以下项中的至少一种：

(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR3。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合部分包含选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559的抗PD-L1抗体的V_H链或其片段和V_L链或其片段。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分特异性结合选自以下项的外泌体蛋白质：EPN1、CD9、CD10、CD26、CD37、CD45/ICAM-1、CD63、CD69、CD81、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、筏蛋白-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、HER2、HER3、HSP70、HSP90和NKCC2。

5.根据权利要求4所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分特异性结合人EPN1上的表位。

6.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分包含：

(1)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变重链或其片段；和

(2)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变轻链或其片段。

7.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分包含：

(1)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的可变重链或其片段；和

(2)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变轻链或其片段。

8.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分包含：

(1)以下项中的至少一种：

(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；和

(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；以及

(2)以下项中的至少一种：

(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR2，和

(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR3。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二第一抗原结合部分直接连接或通过接头连接。

10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述接头选自化学接头或多肽接头。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体选自：隆突-入-穴衍生物；SEED-IgG、DEKK突变Fc、DVD-Ig、异源Fc-scFv、IgG-scFv、scFv2-Fc、scDB-Fc。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体不包含Fc结构域，并且选自串联scFv、双抗体、Fab-scFv。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体是完全人抗体或人源化抗体。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。

15.一种试剂盒，其包含至少一种根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体和以下项中的至少一种：合适的储存容器、pH缓冲溶液和使用所述试剂盒的说明书。

16.一种用于治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述双特异性抗体通过靶向肿瘤细胞来源的外泌体来破坏对免疫细胞的抗肿瘤活性的抑制。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗肿瘤活性的抑制由CD8⁺抑制T细胞介导。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约0.5-20mg/kg的所述双特异性抗体。