JP4606739B2 - 新規抗ｉｇｆ−ｉｒ抗体およびその使用 - Google Patents

Description

発明の背景

本発明は、ヒトインスリン様増殖因子Ｉ受容体ＩＧＦ−ＩＲと特異的に結合することができ、および／またはそのＩＧＦ−ＩＲ受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる新規な抗体、特にマウス起源のモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体をコードするアミノ酸および核酸配列に関する。本発明はまた、ＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する癌またはその受容体の過剰発現に関連した病状の予防的および／または治療的処置に向けた薬剤としてのこれら抗体の使用、ならびにＩＧＦ−ＩＲ受容体の過剰発現に関連した疾患の診断のための方法またはキットに関する。本発明は、このような抗体を抗ＥＧＦＲ抗体および／または化合物および／または抗癌剤または毒素と結合した薬剤と組み合わせて含む製品および／または組成物、ならびに特定の癌の予防および／または治療のためのその使用に関する。

ＩＧＦ−ＩＲと呼ばれるインスリン様増殖因子Ｉ受容体はインスリン受容体ＩＲと７０％の相同性を有するチロシンキナーゼ活性をもった受容体である。ＩＧＦ−ＩＲは分子量約３５０，０００の糖タンパク質である。これはヘテロ四量体の受容体であり、ジスルフィド架橋によってハーフリンクしたその各々は細胞外α−サブユニットおよび膜貫通型β−サブユニットからなっている（図１を参照）。ＩＧＦ−ＩＲは極めて高いアフィニティー（Ｋｄ ＃１ ｎＭ)によってＩＧＦ ＩおよびＩＧＦ ＩＩと結合するが、インスリンとも同様に１００〜１０００分の１より小さいアフィニティーによって結合することができる 。逆に、ＩＧＦは１００倍低いアフィニティーによってしかインスリン受容体と結合しないが、ＩＲは極めて高いアフィニティーによってインスリンと結合する。相同性の低いゾーンがα−サブユニットおよびβ−サブユニットのＣ末端部分に位置するシステインに富む領域に関係しているが、ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼドメインとＩＲのチロシンキナーゼドメインとは極めて高い配列相同性を有している。α−サブユニットに見られる配列の違いはリガンドの結合ゾーンに存在するため、それがＩＧＦおよびインスリン各々に対するＩＧＦ−ＩＲおよびＩＲの相対アフィニティーの原点にある。β−サブユニットのＣ末端部分における違いは２つの受容体のシグナル伝達経路の相違をもたらす；ＩＧＦ−ＩＲは有糸分裂誘発作用、分化作用および抗アポトーシス作用を媒介するが、一方、ＩＲの活性化は主として代謝経路のレベルでの作用と関係している(Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332: F105-126頁, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253: 1-6頁, 1999)。

細胞質チロシンキナーゼタンパク質はリガンドの受容体の細胞外ドメインとの結合によって活性化される。キナーゼの活性化に伴ってＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＳｈｃおよびＧｒｂ１０をはじめとする異なる細胞内基質の刺激が生じる(Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., l25: 166-173頁, 1999)。ＩＧＦ−ＩＲの２つの主要な基質がＩＲＳおよびＳｈｃであり、これらは数多くの下流のエフェクターの活性化によってＩＧＦのこの受容体との結合に関連した大多数の増殖および分化作用を媒介する（図２）。従って、基質のアベイラビリティーがＩＧＦ−ＩＲの活性化に関連した最終的な生物学的作用を決定することがある。ＩＲＳ−１が優位を占める場合には、細胞は増殖し、変化する傾向がある。Ｓｈｃが優位を占める場合には、細胞は分化する傾向がある(Valentinis B. et al., J. Biol. Chem. 274: 12423-12430頁, 1999)。アポトーシスに対する防御作用に主として関わる経路はホスファチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＴ ３−キナーゼ）経路であると思われる(Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31: 80-89頁, 1999; Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125: 166-173頁, 1999)。

発癌におけるＩＧＦ系の役割はここ１０年で集中的な調査の対象となってきている。この関心によって、その有糸分裂誘発性および抗アポトーシス性に加えて、ＩＧＦ−ＩＲが形質転換された表現型の確立および維持に必要であると思われるという事実の発見につながった。実際には、幅広い種類の細胞において、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現または構成的活性化がウシ胎児血清不含培地での維持とは関係のなく、細胞の増殖を誘導し、ヌードマウスにおいて腫瘍の形成を誘導することが十分に確立された。過剰発現された遺伝子の幅広い種類の産物がかなり多くの増殖因子の受容体をはじめとする細胞を形質転換し得るため、このこと自体に独自性はない。しかしながら、ＩＧＦ−ＩＲが形質転換において果たす主要な役割をはっきりと示した非常に重要な発見が、ＩＧＦ−ＩＲをコードする遺伝子が不活性化されたＲ細胞がウシパピローマウイルスのＥ５タンパク質などの、一般に細胞を形質転換することができる異なる薬剤、ＥＧＦＲまたはＰＤＧＦＲの過剰発現、ＳＶ４０のＴ抗原、活性化したrasまたはこれらの２つの因子の組合せによる形質転換に全く不応であることの立証となった(Sell C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11217-11221頁, 1993; Sell C. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 3604-3612頁, 1994; Morrione A. J., Virol., 69: 5300-5303頁, 1955; Coppola D. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 4588-4595頁, 1994; DeAngelis T et al., J. Cell. Physiol., 164: 214-221頁, 1995)。

ＩＧＦ−ＩＲは幅広い種類の腫瘍および腫瘍系において発現され、ＩＧＦはＩＧＦ−ＩＲとの結合を介して腫瘍増殖を増幅する。ＩＧＦ−ＩＲの発癌における役割に有利なその他の議論は受容体に対して向けられたマウスモノクローナル抗体を使用またはＩＧＦ−ＩＲのネガティブドミナントを使用した研究から生まれる。実際には、ＩＧＦ−ＩＲに対して向けられたマウスモノクローナル抗体が数多くの細胞系の培養増殖および腫瘍細胞のin vivo増殖を阻害する(Arteaga C. et al., Cancer Res., 49: 6237-6241頁, 1989; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 196: 92-98頁, 1993; Zia F et al., J. Cell. Biol., 24: 269-275頁, 1996; Scotlandi K et al., Cancer Res., 58: 4127-4131頁, 1998)。また、Jiang et al.の研究(Oncogene, 18: 6071-6077頁, 1999)においてもＩＧＦ−ＩＲのネガティブドミナントが腫瘍増殖を阻害することができるということが示された。

本発明の目的は、ＩＧＦ−ＩＲを特異的かつ高いアフィニティーによって認識するマウスモノクローナル抗体、好ましくは、キメラ化抗体またはヒト化抗体を利用可能とすることである。この抗体はインスリンのＩＲ受容体とはほとんどまたは全く相互に作用しない。その結合によって、主としてＩＧＦＩ／ＩＧＦ−ＩＲおよびＩＧＦ２／ＩＧＦ−ＩＲ相互作用によって活性化されたシグナル変換経路との相互作用によってＩＧＦ−ＩＲを発現する腫瘍の増殖をin vitroで阻害することができる。この抗体は、in vivoにおいて、エストロゲン依存性乳房腫瘍および前立腺腫瘍をはじめとする、ＩＧＦ−ＩＲを発現するあらゆるタイプの腫瘍において活性であり得る。現在利用可能な抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体（ＭＡｂまたはＭＡＢと記載)の場合はそうではない。実際には、ＩＧＦ−ＩＲのドメインを指すαＩＲ３は、エストロゲン依存性乳房腫瘍（ＭＣＦ−７）の増殖を完全にin vitro阻害するが、in vivoの対応するモデルに対する効果はない(Arteaga C. et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423頁, 1989)。同様に、マウスモノクローナル１Ｈ７由来のｓｃＦｖ−Ｆｃ断片は乳房腫瘍ＭＣＦ−７に対して弱い活性しかないが、アンドロゲン非依存性前立腺腫瘍に対しては完全に不活性である(Li S. L. et al., Cancer Immunol. Immunother., 49: 243-252頁, 2000)。

発明者らは、驚くべきことに、キメラ抗体（Ｃ７Ｃ１０と呼ばれる）および各々、ｈ７Ｃ１０ヒト化型１およびｈ７Ｃ１０ヒト化型２と呼ばれる２種類のヒト化抗体、マウスモノクローナル抗体の誘導体７Ｃ１０が、ＩＧＦ−ＩＲを認識し、上記のあらゆる基準、すなわち、インスリンでの受容体の非認識、誘導されるＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２増殖のin vitro遮断、ならびに、骨肉腫および非小細胞肺腫瘍など、さらに、より詳しくはエストロゲン依存性乳房腫瘍ＭＣＦ−７およびアンドロゲン非依存性前立腺腫瘍ＤＵ−１４５であるＩＧＦ−ＩＲを発現する異なる腫瘍の増殖のin vivo阻害に対応することを立証した。また、驚くべきことに、抗体７Ｃ１０によるＭＣＦ−７細胞の腫瘍増殖のin vivo阻害の強度は、エストロゲン依存性乳房腫瘍の処置においての参照化合物の１つであるタモキシフェンで認められるものと同程度であるか、またはかなり上回るものでさえある。さらに、これらの抗体がＩＧＦ−ＩＲおよび受容体の第一の基質ＩＲＳ−１のβ鎖のチロシンのリン酸化を阻害することがわかった。さらに、これらの抗体が、一般的に、細胞の表面での受容体の迅速な再生を可能にする天然リガンドで認められることとは相違して、受容体の内在化およびその分解を引き起こすことも確立された。これらの抗体はそれらのペプチド性配列および核の配列、特に、ＩＧＦ−ＩＲに対するそれらの相補性（ＣＤＲ）を決定するそれらの領域の配列によって特徴づけることができた。

よって、第一の態様によれば、本発明は、ヒトインスリン様増殖因子Ｉ受容体と特異的に結合することができ、必要に応じて、好ましくはさらにＩＧＦ−ＩＲのリガンドＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２の自然結合を阻害することができ、および／または前記ＩＧＦ−ＩＲ受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる、単離された抗体またはその機能的断片であって、配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号２、４もしくは６の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列の少なくとも１つのＣＤＲから選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなるか、あるいは、配列番号８、１０および１２のアミノ酸配列のＣＤＲ、または配列番号８、１０および１２の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列の少なくとも１つのＣＤＲから選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる、単離された抗体またはその機能的断片に関する。

本明細書において、「結合すること(to bind)」と「結合すること(to attach)」とは同じ意味を有し、互換的に用いられる。

本明細書において、抗体化合物またはそれらの配列と結合するポリペプチド、ポリペプチド配列、ペプチドおよびタンパク質という用語は互換的に用いられる。

本発明が天然抗体に関するものではないこと、すなわち、それらはそれらの天然環境には存在しないが、それらは天然源からの精製によって単離し、または準備することができ、あるいは遺伝子組換えによって、または化学合成によって準備することができ、その結果、それらがさらに記載する非天然アミノ酸を含み得ることをここで理解しなければならない。

ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、Kabatらによって定義された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域（Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 第５版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991、および以降の版）を示すものである。３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。ＣＤＲという用語は、本明細書において、場合によっては、それが認識する抗原またはエピトープに対する抗体のアフィニティーによる結合を担う大多数のアミノ酸残基を含むこれらの領域の１つまたはいくつか、あるいはこれらの領域の全てを示すために用いられる。

本発明において、２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の「同一性の割合（パーセント）」とは、比較される２つの配列間の、最良アライメント（最適アライメント）において得られた同一ヌクレオチドの割合（パーセント）または同一アミノ酸残基の割合（パーセント）を示すものであり、この割合（パーセント）は純粋に統計的であり、２つの配列間の相違はランダムに、かつ、それらの全長にわたって分布している。２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の配列比較は、従来どおりに、それらを最善の方法でアラインした後にこれらの配列を比較することによって実施され、その比較はセグメントによってまたは「比較ウィンドウ」によって実施することができる。比較のための配列の最適アライメントは、手動に加え、Smith and Waterman (1981)の局所的相同性アルゴリズム[Ad. App. Math. 2: 482頁]によって、Neddleman and Wunsch (1970)の局所的相同性アルゴリズム[J. Mol. Biol. 48: 443頁]によって、Pearson and Lipman (1988)の類似検索方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444頁]によって、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、あるいはＢＬＡＳＴ ＮまたはＢＬＡＳＴ Ｐ比較ソフトウェアにより)を用いるコンピュータソフトウェアを用いて実施することができる。

２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の同一性の割合（パーセント）は最善の方法でアラインしたこれらの２つの配列を比較することにより決定されるが、その際、これらの２つの配列間の最適アライメントでは、比較する核酸配列またはアミノ酸配列が参照配列に対して付加または欠失を含んでなる場合がある。同一性の割合（パーセント）は、２つの配列間でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である同一位置の数を求め、この同一位置数を比較ウィンドウの全位置数で除し、これらの２つの配列間の同一性の割合（パーセント）を得るために得られた結果に１００を乗じて計算される。

例えば、サイト http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlで入手可能なＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250頁)を使用することが可能であり、このプログラムで使用するパラメーターはデフォルト(特に、パラメーターに関しては「オープンギャップペナルティ」：５、および「エクステンションギャップペナルティ」：２；選択されるマトリックスは、例えば、プログラムによって提示されるマトリックス「ＢＬＯＳＵＭ ６２」である）で与えられるものであり、比較する２つの配列間の同一性の割合（パーセント）はプログラムによって直接算出される。

参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有するアミノ酸配列には、参照配列に対して特定の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加、または置換、末端切断もしくは延長を有するものが好ましい。１以上の連続したまたは不連続なアミノ酸の置換の場合、置換されるアミノ酸が「等価な」アミノ酸に置き換えられる置換が好ましい。「等価なアミノ酸」とは、本明細書において、対応する抗体の生物活性を本質的に改変することなく、基本構造のアミノ酸の１つと置き換えることができる、後に、特に、実施例にて記載するようなアミノ酸を示すものである。

これらの等価なアミノ酸は、それらが置き換わるアミノ酸とのそれらの構造類似性、または実施が可能な異なる抗体間の生物活性の比較試験の結果のいずれかに応じて決めることができる。

一例として、対応する改変された抗体の生物活性に著しい変化をもたらすことなく、実施することができる置換の可能性を挙げる。例えば、ロイシンはバリンまたはイソロイシンに、アスパラギン酸はグルタミン酸に、グルタミンはアスパラギンに、アルギニンはリジンに、などと置き換えることができ、当然ながら、逆の置換も同じ条件下で考えられる。

本発明による抗体は、好ましくは、当業者には周知の標準的方法によって得ることができる特定のモノクローナル抗体、特に、マウス起源のモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である。

一般に、モノクローナル抗体またはその機能的断片、特に、マウス起源のものの製造については、特に、マニュアル"Antibodies"(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor NY, 726頁, 1988)に記載の技術またはKohler and Milstein(Nature, 256: 495-497頁, 1975)によって記載されたハイブリドーマからの製造技術を参照することができる。

本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、その本発明によるモノクローナル抗体が特異的に認識するエピトープを含むＩＧＦ−ＩＲ受容体またはその断片の１つに対する免疫がある動物細胞から得ることができる。そのＩＧＦ−ＩＲ受容体またはその断片の１つは、特に、ＩＧＦ−ＩＲ受容体をコードするｃＤＮＡ配列に含まれる核酸配列からの遺伝子組換えによる、またはＩＧＦ−ＩＲ受容体のペプチド配列に含まれるアミノ酸配列からのペプチド合成による一般的な方法によって作製することができる。

本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、その本発明によるモノクローナル抗体が特異的に認識するエピトープを含むＩＧＦ−ＩＲ受容体またはその断片の１つがその上に予め固定化されているアフィニティーカラムで精製することができる。より詳しくは、そのモノクローナル抗体を、Ａタンパク質および／またはＧタンパク質でのクロマトグラフィー、その後の、残留タンパク質混入物質、ならびにＤＮＡおよびＬＰＳを排除することを目的としたイオン交換クロマトグラフィーの実施または非実施、本質的にその後の、ダイマーまたはその他のマルチマーの存在に起因して起こり得る会合体を排除するためのセファロースゲルでの排除クロマトグラフィーの実施または非実施によって精製することができる。さらに好ましい方法では、これらの技術全てを同時にまたは連続的に用いることができる。

キメラ抗体またはヒト化抗体もまた、本発明の抗体に含まれる。

キメラ抗体とは、特定種の抗体由来の天然の可変（軽鎖および重鎖）領域をその特定種とは異種の種の抗体の軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせて含む抗体を示すものである。

本発明によるキメラタイプの抗体またはその断片は、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーター、ならびに本発明による非ヒト、特に、マウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列、およびヒト抗体の定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。このような組換え遺伝子によってコードされる本発明によるキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり、この抗体の特異性はマウスＤＮＡ由来の可変領域によって決定され、そのイソタイプはヒトＤＮＡ由来の定常領域によって決定される。キメラ抗体の製造方法については、例えば、文献、verhoeyn et al.(BicEssays, 8: 74頁, 1988)を参照することができる。

ヒト化抗体とは、非ヒト起源の抗体由来のＣＤＲ領域を含み、抗体分子の他の部分が１つの（またはいくつかの）ヒト抗体に由来する抗体を示すものである。さらに、骨格のセグメントの残基のいくつか（ＦＲと呼ばれる）が結合アフィニティーを維持するよう改変されていてもよい(Jones et al., Nature, 321: 522-525頁, 1986; verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536頁, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988)。

本発明によるヒト化抗体またはその断片は、当業者に公知の技術によって作製することができる（例えば、文献、Singer et al., J. Inmun. 150: 2844-2857頁, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142頁, 1992; またはBebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175頁, 1992に記載のものなど)。このような本発明によるヒト化抗体は、in vitroでの診断法、またはin vivoでの予防的および／または治療的処置での使用に好適である。

本発明による抗体の機能的断片とは、特に、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは単鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片またはダイアボディ、またはポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）のようなポリ（アルキレン）グリコールの付加などの化学修飾によって、またはリポソームへの組込みによって半減期を延長した断片（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）_２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化断片）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコール）といった抗体断片を示すものであり、その断片は配列番号２、４、６、８、１０または１２の配列の特徴的なＣＤＲの少なくとも１つを有し、特に、一般に、その由来となる抗体の部分活性、例えば、特に、ＩＧＦ−ＩＲ受容体を認識し、それと結合し、必要に応じて、ＩＧＦ−ＩＲ受容体の活性を阻害する能力さえ発揮し得る。

好ましくは、その機能的断片がそれらの由来となる抗体の重または軽可変鎖の部分配列から構成されるか、またはそれを含んでなり、その部分配列がその由来となる抗体と同じ結合特異性と十分なアフィニティー、好ましくは、ＩＧＦ−ＩＲ受容体に対して、その由来となる抗体のアフィニティーと少なくとも同等〜１／１００、より好ましくは、少なくとも１／１０のアフィニティーを保持するのに十分なものである。

このような機能的断片は、その由来となる抗体の配列の最低５個のアミノ酸、好ましくは、１０、１５、２５、５０および１００個の連続したアミノ酸を含む。

好ましくは、これらの機能的断片は、一般に、それらの由来となる抗体と同じ結合特異性を有するＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ'）、ｓｃＦｖ−Ｆｃタイプまたはダイアボディの断片である。本発明によれば、本発明による抗体断片は、上記のような抗体から、ペプシンまたはパパインのような酵素による消化などの方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断によって得ることができる。別法では、本発明に含まれる抗体断片を当業者にはまた周知の遺伝子組換え技術によって、あるいは、例えば、Applied Biosystemsなどの会社から提供されるものなどの自動ペプチド合成装置を用いたペプチド合成によって得ることができる。

より好ましくは、本発明は、遺伝子組換えによって、または化学合成によって得られた本発明による抗体またはその機能的断片、特に、キメラ抗体またはヒト化抗体を包含する。

好ましい実施態様によれば、本発明は、配列番号１２の配列、または配列番号１２の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％の同一性を有する配列の少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる、本発明による抗体またはその機能的断片に関する。

６つの短いＣＤＲ配列のうち、重鎖の３番目のＣＤＲ（ＣＤＲＨ３）は多様なサイズを有する（本質的にはそれをもたらす遺伝子の配列機構によって多様化）。知られている最長サイズは２６であるが、２アミノ酸ほど短いこともある。機能上、ＣＤＲＨ３は抗体の特異性決定において部分的に役割を果たす(Segal et al., PNAS, 71: 4298-4302,頁 1974; Amit et al., Science, 233: 747-753頁, 1986; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-917頁, 1987; Chothia et al., Nature, 342: 877-883頁, 1989; Caton et al., J. Immunol., 144: 1965-1968頁, 1990; Sharon et al., PNAS, 87: 4814-4817頁, 1990; Sharon et al., J. Immunol., 144: 4863-4869頁, 1990; Kabat et al., J. Immunol., 147: 1709-1719頁, 1991)。

抗体結合部位の構築にはＣＤＲの低い割合のアミノ酸しか貢献しないが、これらの残基が極めて特異的な立体配座に維持されなければならないことは知られている。

より好ましくは、本発明は、配列番号８、１０および１２の配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも２つもしくは３つのＣＤＲ、または各々が配列番号８、１０および１２の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも２つもしくは３つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる、本発明による抗体またはその機能的断片に関する。

同様に好ましい実施態様によれば、本発明は、配列番号２、４もしくは６の配列のＣＤＲ、または配列番号２、４もしくは６の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲから選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる、本発明による抗体またはその機能的断片に関する。

より好ましい実施態様によれば、本発明は、配列番号２、４および６の配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも２つもしくは３つのＣＤＲ、または各々が配列番号２、４および６の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも２つもしくは３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる、本発明による抗体またはその機能的断片に関する。

より好ましくは、本発明による抗体またはその機能的断片は、配列番号８、１０および１２の配列の３つのＣＤＲ、または各々が配列番号８、１０および１２の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなり、かつ、さらに、配列番号２、４および６の配列の３つのＣＤＲ、または各々が配列番号２、４および６の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる。

他の態様によれば、本発明は、ヒトインスリン受容体ＩＲと結合しないか、または有意に結合しないことを特徴とする、本発明の抗体またはその機能的断片に関する。

好ましくは、本発明による機能的断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ'断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片およびダイアボディから選択されるもの、またはペグ化断片などの化学修飾、特に、ペグ化によって、またはリポソームへの組込みによって半減期を延長させた機能的断片とされる。

他の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ、特に、２００１年９月１９日にCentre National de Culture De Microorganisme（ＣＮＣＭ, National Center of Microorganism Culture）（Institut Pasteur, Paris, France）に番号Ｉ−２７１７として寄託されているようなマウス起源のハイブリドーマに関する。

２００１年９月１９日にＣＮＣＭに番号Ｉ−２７１７として寄託されたハイブリドーマによって分泌される、本明細書において７Ｃ１０と呼ばれるモノクローナル抗体またはその機能的断片は、当然ながら本発明に包含される。

特定の実施態様によれば、本発明は、前記抗体が、配列番号５４のアミノ酸配列、もしくは配列番号５４の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる配列の軽鎖、または／および、配列番号６９のアミノ酸配列、もしくは配列番号６９の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる配列の重鎖を含んでなるものである、本発明によるマウス抗体またはその機能的断片に関する。

同様の特定の態様によれば、本発明は、前記抗体が、さらにマウスとは異種の種、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域を含んでなるものであり、好ましくは、ヒト抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域が、それぞれκ領域およびγ−１、γ−２またはγ-４領域である、本発明によるキメラ抗体またはその機能的断片に関する。

同様の特定の態様によれば、本発明は、前記抗体が、軽鎖および／または重鎖の骨格セグメントＦＲ１〜ＦＲ４（実施例１２および１３、表５および６にて以下で記載するようなもの）がそれぞれヒト抗体軽鎖および／または重鎖の骨格セグメントＦＲ１〜ＦＲ４に由来するものである軽鎖および／または重鎖を含んでなるものである、本発明によるヒト化抗体またはその機能的断片に関する。

好ましい実施態様によれば、本発明によるヒト化抗体またはその機能的断片において、前記ヒト化抗体は、配列番号６１もしくは６５のアミノ酸配列、または配列番号６１もしくは６５の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖、または／および、配列番号７５、７９もしくは８３のアミノ酸配列、または配列番号７５、７９もしくは８３の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖を含んでなるものとされる。

好ましくは、本発明によるヒト化抗体またはその機能的断片において、前記ヒト化抗体は、配列番号６５のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖、および配列番号７９または８３、好ましくは配列番号８３のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖を含んでなるものとされる。

新規の態様によれば、本発明は、以下の核酸：
（ａ）本発明による抗体またはその機能的断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ、
（ｂ）前記（ａ）に記載の核酸に相補的な核酸、および
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１の核酸配列、または配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１の配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列の少なくとも１つのＣＤＲと、高度ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも１８個のヌクレオチドからなる核酸
から選択される、単離された核酸に関する。

核酸、核配列または核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列とは、本発明においては区別せずに使用され、改変または非改変ヌクレオチドの正確な連鎖を示すものであり、核酸の断片または領域を定義することを可能にし、非天然ヌクレオチドを含むかまたは含まず、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡはもちろんのこと、そのＤＮＡの転写産物に相当することもある。

本発明が、それらの天然の染色体環境における、すなわち、自然な状態でのヌクレオチド配列に関するものではないこともここで理解しなければならない。本発明は、単離され、および／または精製された配列に関するものであり、すなわち、それらは直接的または間接的に、例えばコピーによって、選択されたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。よって、本明細書において、それは、例えば、宿主細胞を用いた遺伝子組換えによって得られる、または化学合成によって得られる単離核酸もまた示すものである。

好適な配列との最適なアライメントにおいて少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性の割合（パーセント）を有する核配列とは、参照核配列に対して特定の改変、例えば、特に、欠失、末端切断、延長、キメラ融合および／または置換、特に、点置換を有する核配列を示すものである。好ましくは、それは、それに含まれる配列が、遺伝子コードの縮重に関連する参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列、または参照配列と、好ましくは、高ストリンジェンシー条件下、特に、以下に記載するような条件下で特異的にハイブリダイズすることができる相補配列に関する。

高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、温度条件およびイオン強度条件によって相補的ＤＮＡの２断片間でのハイブリダイゼーションの維持を可能にするようにそれらを選択することを示す。例として、上記のポリヌクレオチド断片を定義することを目的としたハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェンシー条件は、以下のものが有利である。

ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは２工程で実施される：(１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％のホルムアミド、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５％の硫酸デキストランおよび１％のサケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ７．５）中、４２℃にて３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブのサイズに応じた温度（すなわち、プローブサイズ＞１００ヌクレオチドの場合には４２℃）にて２０時間の実際のハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳで２０℃にて２０分の２回洗浄、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２０℃にて２０分の１回洗浄。最終洗浄は、プローブサイズ＞１００ヌクレオチドの場合、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで６０℃にて３０分間実施する。より大きなサイズまたはより小さなサイズのオリゴヌクレオチドの場合には、当業者ならば、規定サイズのポリヌクレオチドの上記高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を、Sambrookらの教示(1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 第２版 Cold Spring Harbor)に従って適合させることができる。

本発明はまた、本発明による核酸を含んでなるベクターに関する。

本発明は、特に、本発明によるヌクレオチド配列を含むクローニングベクターおよび／または発現ベクターに関する。

本発明によるベクターは、好ましくは、所定の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能にするエレメントを含む。そのため、ベクターは、プロモーター、翻訳開始および終結シグナル、ならびに転写調節の好適な領域を含む必要がある。それは安定した形で宿主細胞中に維持されなければならず、所望により、翻訳されたタンパク質の分泌を指示する特定のシグナルを有していてもよい。これらの様々なエレメントは、用いる宿主細胞に応じて当業者により選択され、最適化される。この目的のために、本発明によるヌクレオチド配列は、選択された宿主の自己複製ベクターに挿入してもよいし、または選択された宿主の組換え型ベクターとしてもよい。

このようなベクターは、当業者によって現在使用される方法によって作製され、得られたクローンはリポフェクチン、エレクトロポレーション、熱衝撃、または化学的手法などの標準的方法によって好適な宿主に導入することができる。

本発明によるベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは宿主細胞を形質転換して本発明によるヌクレオチド配列をクローニングする、または発現させるのに有用である。

本発明はまた、本発明によるベクターによって形質転換された、またはこれを含んでなる宿主細胞を包含する。

宿主細胞は、原核生物または真核生物系、例えば、細菌細胞から選択することができるが、同様に酵母細胞または動物細胞、特に、哺乳類細胞から選択することもできる。また、昆虫細胞または植物細胞を使用することもできる。

本発明はまた、本発明に従って形質転換された少なくとも１つの細胞を含んでなる、ヒトを除く動物に関する。

他の態様によれば、本発明は、以下の工程：
（ａ）本発明による宿主細胞を、培地および好適な培養条件において培養する工程、および
（ｂ）このようにして産生した抗体またはその機能的断片を、培養培地または培養した前記細胞から回収する工程
を含んでなる、本発明による抗体またはその機能的断片の製造方法に関する。

本発明による形質転換細胞は、本発明による組換えポリペプチドの製造方法に使用することができる。本発明によるベクターおよび／または本発明によるベクターによって形質転換された細胞を使用する、組換え型の本発明によるポリペプチドの製造方法は、それ自体が本発明に包含される。好ましくは、本発明によるベクターによって形質転換された細胞を、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、組換えペプチドを回収する。

上述のように、宿主細胞は原核生物または真核生物系から選択することができる。特に、このような原核生物または真核生物系での分泌を促進する本発明によるヌクレオチド配列を同定することができるため、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌されるよう意図された組換えタンパク質の作製に有利に用いることができる。実際には、目的のこれらの組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞内部よりもむしろ細胞培養物の上清に存在することによって容易になる。

また、化学合成によっても本発明によるポリペプチドを作製することができる。このような製造方法もまた、本発明の１つの態様である。当業者ならば、化学合成の方法、例えば、固相を使用する技術（特に、Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 第２版, (1984)を参照）または部分固相を用いる、断片の縮合による、または溶液中での古典的な合成による技術は理解している。化学合成によって得られた、対応する非天然アミノ酸を含み得るポリペプチドもまた、本発明に包含される。

本発明による方法によって得ることができる抗体またはその機能的断片もまた、本発明に包含される。

第二の実施態様によれば、本発明はさらに、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合することができ、および／またはそのＥＧＦＲ受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができるものである、上述の本発明による抗体またはその機能的断片に関する。

一般に、増殖因子は正常細胞の増殖および分化の調節に関与する小タンパク質である。また、これらの増殖因子のいくつかは、細胞形質転換の開始および維持において重要な役割を果たし、オートクライン因子またはパラクライン因子として機能することができる。これは、特に、上述のＩＧＦ１に加えて、特に、腫瘍表現型の発現、腫瘍の進行および転移の発生に関与すると思われる上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）にもあてはまる。

ＥＧＦおよびＩＧＦ１は、本明細書においてＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲと呼ばれるそれぞれの受容体を介してその作用を発揮する。２つの事例において、このことは数多くの癌でその過剰発現が報告されているチロシンキナーゼ活性を有する膜受容体に関係している。しかしながら、これら２つの受容体の相互作用が解明されておらず、これに関して種々のチームによって実施された研究において、これら２つの受容体の連携に関して矛盾する結果が得られていることに留意する必要がある。

前立腺腫瘍細胞で実施された研究では、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（本明細書において「ＭＡＢ」または「ＭＡｂ」と呼ばれる）によるオートクリンループＥＧＦ/ＥＧＦＲの中断が、ＤＵ１４５細胞のＩＧＦ１に対する応答の完全喪失によって明示されることを示している(Connolly J. M. and Rose D, P., Prostate, Apr. 24 (4): 167-75頁, 1994; Putz T. et al., Cancer Res., Jan. 1, 59 (1): 227-33頁, 1999)。これらの結果からは、ＥＧＦに対する受容体の遮断が２つの受容体（ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲ）の活性化によって生じる形質転換シグナルの完全阻害を得るのに十分なものであることが示唆される。一方、他の研究(Pietrzkowski et al., Cell Growth Differ, Apr., 3 (4):199-205頁, 1992; Coppola et al., Mol Cell Biol., Jul., 14 (7): 4588-95頁, 1994)では、ＩＧＦ−ＩＲは、その作用を媒介する役割としては、機能的ＥＧＦＲの存在を必要としないが、ＥＧＦＲの過剰発現はその有糸分裂誘発性および形質転換能を発揮するのに機能的ＩＧＦ−ＩＲの存在を必要とすることが示された。この２つ目の一連の研究は、２つの受容体に同時に作用することを目的として選択的にＩＧＦ−ＩＲを遮断する傾向がある方法とより同調している。

驚くべきことに、発明者らは初めて、ＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲ受容体との結合およびＥＧＦのＥＧＦＲ受容体との結合の同時阻害によって、これら２つの受容体を発現する腫瘍を有するヌードマウスにおけるin vivo腫瘍増殖に対して得られるこれら２つの作用の有意な相乗効果が可能となることを立証した。この作用の相乗効果を説明することができるより有望な仮説の１つは、２つの増殖因子ＥＧＦおよびＩＧＦ１（および／またはＩＧＦ２）自身が、正常細胞の腫瘍特性を有する細胞への形質転換において、および／または特定の腫瘍、特に、２つの受容体ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲを過剰発現し、および／またはこれら２つの受容体、特に、これらの受容体のチロシンキナーゼ活性のレベルにて介在する変換シグナルの過剰活性化を有する腫瘍に関する腫瘍細胞の成長および／または増殖において相乗効果を発揮するというものである。

この実施態様の好ましい態様によれば、本発明は、ＥＧＦのＥＧＦＲとの結合を特異的に阻害し、および／またはそのＥＧＦＲ受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害する第二のモチーフを含んでなる二重特異性抗体からなるものである、上述のような抗体に関する。

「第二のモチーフ」という用語は、上記の、特に、ＥＧＦＲと特異的に結合することができる断片、特に、抗ＥＧＦＲ抗体の可変鎖のＣＤＲ領域、またはこの特異的な結合を行うのに十分な長さのこのＣＤＲ領域の断片の１つ、あるいは抗ＥＧＦＲ抗体のいくつかのＣＤＲ領域を含んでなるアミノ酸の配列を示すものである。

二重特異性または二価性抗体は、同じ分子内に２つの異なる可変領域を併せ持つ第二世代のモノクローナル抗体である(Hollinger and Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419頁)。それらの用途は、新しいエフェクター機能を補充し、または腫瘍細胞表面のいくつかの分子をターゲッティングするそれらの能力から、診断分野および治療分野の両方において実証されている。これらの抗体は、化学的手法(Glennie MJ et al. 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375頁; Repp R. et al. 1995 J. Hemat. 377-382頁)または体細胞法(Staerz U. D. and Bevan M. J. 1986 PNAS 83, 1453-1457頁; Suresh M. R. et al. 1986 Method Enzymol. 121: 210-228頁)によるだけでなく、選択的に、ヘテロ二量化の強化を可能にし、それによって求められている抗体の精製方法を容易にする遺伝子工学技術(Merchand et al. 1998 Nature Biotech. 16: 677-681頁)によっても得ることができる。

これらの二重特異性抗体は、完全ＩｇＧとして、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ'ＰＥＧとして、またはダイアボディとして、あるいは二重特異性ｓｃＦｖとしてだけでなく、ターゲッティングされた各抗原に対する２つの結合部位が存在する四価二重特異性抗体(Park et al. 2000 Mol. Immunol. 37 (18): 1123-30頁)または上述のようなその断片としても構築することができる。

二重特異性抗体の製造および投与は、２種類の特異的な抗体の製造よりも負担が少ないという事実からの経済上の利点に加え、このような二重特異性抗体の使用は処置の毒性を軽減するという利点も有している。これは、二重特異性抗体の使用が循環抗体総量の低減を可能にし、結果として、起こり得る毒性を軽減させていることによるものである。

本発明の好ましい実施態様によれば、二重特異性抗体は、二価または四価抗体である。

実際問題として、四価二重特異性抗体の使用への関心は、それが二価抗体と比較して、各標的、本発明においてはＩＧＦ−ＩＲおよびＥＧＦＲのそれぞれに対する２つの結合部位が存在することから、より大きなアビディティを有することである。

上記の抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の機能的断片の選択と同様に、第二のモチーフは、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片およびダイアボディから選択され、またはペグ化断片、例えば、Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）_２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧなどの、半減期を延長した形態とされる。本発明のさらに好ましい態様によれば、第二の抗ＥＧＦＲモチーフは、マウスモノクローナル抗体２２５、そのマウス−ヒトキメラ誘導体Ｃ２２５、またはこの抗体２２５由来のヒト化抗体に由来するものである。

さらに他の態様によれば、本発明は、薬剤としての、本発明による抗体またはその機能的断片、好ましくは、上記のようなヒト化抗体に関する。以下の説明における抗体は、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体、ならびに二重特異性抗ＩＧＦ−ＩＲ/ＥＧＦＲ抗体として理解しなければならない。

本発明はまた、有効成分として、好ましくは賦形剤および／または医薬上許容されるビヒクルと混合した、本発明による抗体またはその機能的断片からなる化合物を含んでなる医薬組成物に関する。

さらに他の実施態様によれば、本発明はまた、ＥＧＦのヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）との結合を特異的に阻害することができ、および／またはそのＥＧＦＲ受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる化合物から選択される第二の化合物を含んでなる、上述の医薬組成物に関する。

本発明の好ましい態様では、第二の化合物は、ＥＧＦのＥＧＦＲとの結合を競合によって阻害することができる単離された抗ＥＧＦＲ抗体またはその機能的断片から選択される。より詳しくは、抗ＥＧＦＲ抗体は、モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体、キメラ抗ＥＧＦＲ抗体もしくはヒト化抗ＥＧＦＲ抗体、またはその機能的断片から選択される。さらに詳しくは、抗ＥＧＦＲ抗体の機能的断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ'断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片もしくはダイアボディから選択され、またはペグ化断片などの半減期を延長した断片とされる。前記抗体は、さらに好ましくは、マウスモノクローナル抗体２２５、そのマウス−ヒトキメラ誘導体Ｃ２２５（ＩＭＣ−Ｃ２２５とも呼ばれる）、またはこの抗体２２５由来のヒト化抗体からなる。

本発明の他の実施態様によれば、同時使用、個別使用または逐次使用を目的とした組合せ製品として、細胞傷害性薬剤／細胞増殖抑制剤、ならびに／またはＩＧＦ−Ｉに対する受容体および／もしくはＥＧＦに対する受容体のそれぞれのチロシンキナーゼ活性の阻害剤をさらに含んでなる、上記のような組成物が提供される。

「同時使用」とは、本発明による組成物の２種類の化合物の単一および同一医薬形態での投与と解釈される。

「個別使用」とは、本発明による組成物の２種類の化合物の異なる医薬形態での同時投与と解釈される。
「逐次使用」とは、本発明による組成物の２種類の化合物の各々が異なる医薬形態での連続的な投与と解釈される。

一般に、本発明による組成物は癌の治療効果をかなり高める。言い換えれば、本発明による抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の治療効果は、意外にも、細胞傷害性薬剤の投与によって増強される。本発明による組成物によって生まれるもう１つの重要なそれに続く利点は、副次的効果、特に、細胞傷害性薬剤の効果が現れる危険性、を回避する、または減少させることを可能にするより低い有効用量の有効成分の使用の可能性に関係する。

さらに、本発明によるこの組成物は、期待される治療効果がより迅速に達成されることを可能にする。

特に好ましい実施態様では、本発明による組合せ製品としての組成物において、細胞傷害性薬剤／細胞増殖抑制剤は、ＤＮＡと相互作用する薬剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼＩもしくはＩＩ阻害剤、または紡錘体形成阻害剤もしくは安定化剤、あるいは化学療法に用いることができる薬剤から選択されるものとされる。このような細胞傷害性薬剤／細胞増殖抑制剤は、上記種類の細胞傷害性薬剤のそれぞれに関しては、例えば、ＶＩＤＡＬの２００１年版、癌腫学および血液学コラム「細胞傷害性物質」の一部としてある化合物をテーマにした頁に挙げられており、本書に関して引用したこれらの細胞傷害性化合物は好ましい細胞傷害性薬剤として本明細書にて挙げている。

特に好ましい実施態様では、本発明による組合せ製品としての組成物において、細胞傷害性薬剤は、同時使用を目的とした抗体と化学的に結合しているものとされる。

特に好ましい実施態様では、本発明による組成物において、細胞傷害性薬剤／細胞増殖抑制剤は、紡錘体形成阻害剤または安定化剤、好ましくはビノレルビンおよび／またはビンフルニンおよび／またはビンクリスチンから選択されるものとされる。

細胞傷害性薬剤と本発明による抗体との結合を容易にするためには、特に、結合する２種類の化合物間にポリ（エチレン）グリコールのようなポリ（アルキレン）グリコールあるいはアミノ酸などのスペーサー分子を導入することができるし、または、もう１つの実施態様では、本発明による抗体と反応することができる官能基を導入した細胞傷害性薬剤の有効な誘導体を用いることができる。これらの結合技術は当業者には周知であり、本明細書では取り上げていない。

もう１つの好ましい実施態様では、ＩＧＦ−Ｉに対する受容体および／またはＥＧＦに対する受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤は、誘導天然薬剤、ジアニリノフタルイミド、ピラゾロ−またはピロロピリドピリミジンあるいはキナジリンからなる群から選択される。このような阻害剤は当業者には周知であり、文献(Ciardiello F., Drugs 2000, Suppl. 1, 25-32頁)にて記載されている。

ＥＧＦＲのその他の阻害剤としては、限定されるものではないが、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体Ｃ２２５および２２Ｍａｂ(ImClone Systems Incorporated)、ＡＢＸ−ＥＧＦ(Abgenix/Cell Genesys)、ＥＭＤ−７２００(Merck KgaA)または化合物ＺＤ−１８３４、ＺＤ−１８３８およびＺＤ−１８３９(AstraZeneca)、ＰＫＩ−１６６(Novartis)、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６(Novartis)、ＰＴＫ ７８７(Novartis)、ＣＰ ７０１(Cephalon)、レフルノマイド(Pharmacia/Sugen)、ＣＩ−１０３３(Warner-Lambert Parke-Davis)、ＣＩ−１０３３／ＰＤ １８３、８０５(Warner-Lambert Parke-Davis)、ＣＬ−３８７、７８５(Wyeth-Ayerst)、ＢＢＲ−１６１１(Boehringer Mannheim GmbH/Roche)、ナアミジナＡ(Bristol-Myers Squibb)、ＲＣ−３９４０−ＩＩ(Pharmacia)、ＢＩＢＸ−１３８２(Boehringer Ingelheim)、ＯＬＸ−１０３(Merck & Co)、ＶＲＣＴＣ−３１０(Ventech Research)、ＥＧＦ融合毒素(Seragen Inc.)、ＤＡＢ−３８９(Seragen/Lilgand)、ＺＭ−２５２８０８(Imperial Cancer Research Fund)、ＲＧ−５０８６４(INSERM)、ＬＦＭ−Ａ１２(Parker Hughes Cancer Center)、ＷＨＩ−Ｐ９７(Parker Hughes Cancer Center)、ＧＷ−２８２９７４(Glaxo)、ＫＴ−８３９１(Kyowa Hakko)または「ＥＧＦＲワクチン」(York Medical/Centro de Immunologia Molecular)が挙げられる。

本発明のさらにもう１つの実施態様によれば、上記のような組成物はまた、さらに、癌、特に、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体および受容体ＩＧＦ−ＩＲおよび／またはＥＧＦＲを過剰発現する癌、例えば、特に、乳癌、の予防および治療に向けた同時使用、個別使用または逐次使用を目的とした組合せ製品として、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の細胞外ドメインに対する他の抗体化合物を含んでなっていてもよい。

抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体を本発明による抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体と組み合わせることでの予想外の利益の妥当性を示す、特に、Albanell et at.(J. of the National Cancer Institute, 93 (24): 1830-1831頁, 2001)およびLu et al.(J. of the National Cancer Institute, 93 (24): 1852-1857頁, 2001)の出版物を参照のこと。

特に、本発明による組成物の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、トラスツズマブ（Trastuzumab）と呼ばれる（ヘルセプチンとも呼ばれる）抗体である。

本発明は、もう１つの態様において、抗体またはその機能的断片の少なくとも１つが細胞毒素および／または放射性元素と結合していることを特徴とする組成物に関する。

好ましくは、毒素または放射性元素は、ＩＧＦ−ＩＲ受容体および／またはＥＧＦＲ受容体を発現する細胞の少なくとも１つの細胞活性を阻害することができるものとされ、より好ましくは、その細胞の成長または増殖を抑制し、特に、その細胞を完全に不活性化することができるものとされる。

また、好ましくは、毒素は、腸内細菌毒素、特に、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素Ａとされる。

好ましくは、治療に使用する抗体と結合する放射性元素（または放射性同位元素）は、γ線を放つ放射性同位元素とされ、好ましくは、ヨウ素１３１、イットリウム９０、金１９９、パラジウム１００、銅６７、ビスマス２１７およびアンチモン２１１とされる。βおよびα線を放つ放射性同位元素もまた治療に用いることができる。

本発明による少なくとも１つの抗体またはその機能的断片と結合した毒素または放射性元素とは、毒素または放射性元素が少なくとも１つの抗体と、特に、結合分子を導入してまたはしない２つの化合物の共有結合によって結合可能であることを示すものである。

化学的（共有的）、静電的または非共有的に複合体の成分の全てまたは一部の結合を可能にする薬剤のうち、特に、ベンゾキノン、カルボジイミド、より詳しくは、ＥＤＣ（塩酸１−エチル−３−［３−ジメチル−アミノプロピル］−カルボジイミド）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチル チオ−アセテート（ＳＡＴＡ）、紫外線（Ｕ．Ｖ．）と反応する１以上のフェニルアジド基を有する架橋剤、好ましくは、Ｎ−［−４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）−ピロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミド−イル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）が挙げられる。

特に、放射性元素の結合のもう１つの形式が二価イオンキレート化剤の使用にある。

これらのキレート化合物のうち、金属、特に、放射性金属の結合用に開発されたＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）から生じるキレート化合物またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）から生じるキレート化合物、および免疫グロブリンを挙げることができる。例えば、ＤＴＰＡおよびその誘導体が炭素鎖にある異なる基と置き換わり、リガンド金属複合体の安定性および剛性を高めることができる(Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); 米国特許第４ ８３１ １７５号)。

例えば、長い間、医薬品において、生物学においては遊離形としてまたは金属イオンとの複合体のいずれかとして広く用いられてきたジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびその誘導体は、金属イオンと安定したキレート化合物を形成し、治療目的または診断目的のタンパク質、例えば、癌治療における放射免疫複合体の開発用の抗体と結合する(Meases et al. (1984); Gansow et al. (1990)という注目すべき特徴を備えている。

また、好ましくは、本発明の複合体を形成する少なくとも１つの抗体がその機能的断片、特に、そのＦｃ部分の切断された断片、例えば、ｓｃＦｖ断片から選択される。

本発明はさらに、薬剤の製造のための、本発明による組成物の使用を包含する。

より詳しくは、もう１つの実施態様によれば、本発明は、ＩＧＦ−ＩＲ受容体および／もしくはＥＧＦＲ受容体の過剰発現および／もしくは異常な活性化によって引き起こされる病気、ならびに／または１−ＩＧＦ１もしくはＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲとの相互作用および／もしくはＥＧＦのＥＧＦＲおよび／もしくはＨＥＲ２／ｎｅｕとの相互作用が介在するシグナル変換経路の過反応に関連した病気の予防または治療に向けた薬剤の製造のための、抗体またはその機能的断片および／または組成物の使用に関する。

好ましくは、本発明による使用において、薬剤の投与は、インスリン受容体（ＩＲ）の阻害、すなわち、薬剤が存在することによる、特に、薬剤のＩＲとの結合に関連した競合的阻害によるＩＲ受容体のその天然リガンドとの相互作用の阻害に関連した副次的効果を引き起こさない、またはわずかしか引き起こさない。

本発明はさらに、正常細胞の、腫瘍特性を有する細胞、好ましくは、ＩＧＦ依存性細胞、特に、ＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２依存性細胞、および／またはＥＧＦ依存性細胞、および／またはＨＥＲ２/ｎｅｕ依存性細胞への形質転換を阻害することを目的とした薬剤の製造のための、本発明による抗体またはその機能的断片、好ましくは、ヒト化されたもの、および／または組成物の使用を包含する。

本発明はまた、腫瘍細胞、好ましくは、ＩＧＦ依存性細胞、特に、ＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２依存性細胞、および／またはＥＧＦ依存性細胞、および／またはエストロゲン依存性細胞、および／またはＨＥＲ２／ｎｅｕ依存性細胞の成長および／または増殖を阻害することを目的とした薬剤の製造のための、本発明による抗体またはその機能的断片、好ましくは、ヒト化されたもの、および／または組成物の使用に関する。

一般に、本発明は、癌、好ましくは、ＩＧＦ−ＩＲおよび／またはＥＧＦＲを発現する癌および／または、好ましくは、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲとの相互作用、例えば、ＩＲＳ１の過剰発現など、および／またはＥＧＦのＥＧＦＲとの相互作用が介在するシグナル変換経路の過反応を示す癌、の予防または治療に向けた薬剤の製造のための、本発明による抗体またはその機能的断片、好ましくは、ヒト化されたもの、および／または組成物の使用に関する。

本発明はまた、乾癬、その上皮細胞の過剰増殖がＩＧＦ−ＩＲおよび／またはＥＧＦＲの発現または過剰発現および／またはＩＧＦ−ＩＲのその天然リガンドとの相互作用および／またはＥＦＧＲのその天然リガンドとの相互作用が介在するシグナル変換経路の過反応と関連している可能性がある乾癬(Wraight C. J. et al. Nat. Biotechnol., 2000, 18 (5): 521-526頁. 乾癬における上皮細胞の過剰増殖のインスリン様増殖因子Ｉ受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドによる逆転)の予防または治療に向けた薬剤の製造のための、本発明による抗体またはその機能的断片、好ましくは、ヒト化されたもの、および／または組成物の使用に関する。

予防および／または治療することができる癌としては、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌または結腸癌、あるいはＩＧＦ−ＩＲを過剰発現するその他の癌が好ましい。

さらにもう１つの態様によれば、本発明は、ＩＧＦ−ＩＲ受容体および／またはＥＧＦＲ受容体の異常な存在が疑われる生物学的サンプルから、ＩＧＦ−ＩＲ受容体および／またはＥＧＦＲ受容体の過剰発現または過少発現、好ましくは過剰発現に関連した病気を、好ましくはin vitroにて診断する方法であって、生物学的サンプルを、必要に応じて標識することが可能である本発明による抗体またはその機能的断片と接触させることを特徴とする方法に関する。

好ましくは、その診断方法において、ＩＧＦ−ＩＲ受容体および／またはＥＧＦＲ受容体の過剰発現に関連した病気は、癌である。

抗体またはその機能的断片が検出可能なおよび／または定量可能なシグナルを得るためには、免疫複合体または標識抗体として存在してもよい。

本発明の標識された抗体またはその機能的断片としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼまたはグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素と結合するか、またはビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジンなどの分子が結合する免疫複合体と呼ばれる抗体などが挙げられる。また、蛍光標識を本発明の抗体またはその機能的断片と結合してもよく、それらとしては、特に、フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミンおよびその誘導体、ＧＦＰ(ＧＦＰは「緑色蛍光タンパク質」)、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。このような複合体では、本発明の抗体またはその機能的断片を当業者には公知の方法によって作製することができる。それらは直接、またはスペーサー基またはグルタルアルデヒドのようなポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）などの結合基を介して、または治療用複合体についての上記のものなどのカップリング剤の存在下にて、酵素または蛍光標識と結合させることができる。フルオレセインタイプの標識を有する複合体はイソチオシアネートとの反応によって作製することができる。

また、その他の複合体としては、ルミノールおよびジオキセタン類などの化学発光標識、ルシフェラーゼおよびルシフェリンなどの生物発光標識、あるいはヨウ素^１２３、ヨウ素^１２５、ヨウ素^１２６、ヨウ素^１３３、臭素^７７、テクネチウム^９９ｍ、インジウム^１１１、インジウム^１１３ｍ、ガリウム^６７、ガリウム^６８、ルテニウム^９５、ルテニウム^９７、ルテニウム^１０３、ルテニウム^１０５、水銀^１０７、水銀^２０３、レニウム^９９ｍ、レニウム^１０１、レニウム^１０５、スカンジウム^４７、テルル^１２１ｍ、テルル^１２２ｍ、テルル^１２５ｍ、ツリウム^１６５、ツリウム^１６７、ツリウム^１６８、フッ素^１８、イットリウム^１９９、ヨウ素^１３１などの放射性標識が挙げられる。治療用放射性同位元素の、直接または上記のＥＤＴＡ、ＤＴＰＡなどのキレート剤による抗体との結合についての、存在する当業者に公知の方法を、診断に用いることができる放射性元素に用いてよい。また、クロラミンＴ法[Hunter W. M. and Greenwood F. C. (1962) Nature 194: 495頁]によるＮａ［Ｉ１２５］での標識あるいはCrockford et al.（米国特許第４ ４２４ ２００号）の技術によってまたはHnatowich（米国特許第４ ４７９ ９３０号）によって記載されるようなＤＴＰＡにより結合されるテクネチウム９９ｍでの標識もまた挙げることができる。

例えば、本発明による抗体またはその機能的断片は、生物学的サンプルのＩＧＦ−ＩＲ受容体および／またはＥＧＦＲ受容体の過剰発現または過少発現、好ましくは、過剰発現の検出方法および／もしくは定量方法に使用することができ、その方法は以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを、本発明による抗体またはその機能的断片と接触させる工程、および
（ｂ）形成される可能性のあるＩＧＦ−ＩＲおよび／またはＥＧＦＲ／抗体複合体を実証する工程
を含んでなる。

特定の実施態様では、本発明による抗体またはその機能的断片を、ＩＧＦおよび／またはＥＧＦ依存性癌の予防的および／または治療的処置あるいは乾癬の予防的および／または治療的処置の効果をモニタリングするための、生物学的サンプルからのＩＧＦ−ＩＲ受容体および／またはＥＧＦＲ受容体の検出方法および／もしくは定量方法に使用することができる。

より一般的には、本発明による抗体またはその機能的断片は、ＩＧＦ−ＩＲ受容体および／またはＥＧＦＲ受容体の発現を定性的および／または定量的に観察する必要のある状況で有利に使用することができる。

好ましくは、生物学的サンプルは、血清などの体液、全血、細胞、組織サンプルまたはヒト起源の生検からなる。

このような検出および／または投与を実施するためには任意の手順または従来の試験を用いてもよい。上記の試験は競合試験またはサンドウィッチ試験、あるいは抗体−抗原タイプの免疫複合体の形成に依存した当業者に公知の試験であってよい。本発明の適用後に、抗体またはその機能的断片を固定化してもよいし、または標識してもよい。この固定は当業者に公知の数多くの支持体上で行うことができる。これらの支持体はとしては、特に、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、または自然のままの細胞または改変細胞が挙げられる。これらの支持体は可溶性でも不溶性でもよい。

一例として、好ましい方法は免疫蛍光検査、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術または等価物によるＥＬＩＳＡ技術での酵素抗体法である。

よって、本発明はまた、ＩＧＦ−ＩＲ受容体および／もしくはＥＧＦＲ受容体の過剰発現もしくは過少発現によって引き起こされる病気の診断方法、または生物学的サンプルのＩＧＦ−ＩＲ受容体および／もしくはＥＧＦＲ受容体の過剰発現もしくは過少発現、好ましくは、その受容体の過剰発現の検出方法および／もしくは定量方法を実施するのに必要なキットまたはセットであって、以下の要素：
（ａ）本発明による抗体またはその機能的断片、
（ｂ）所望により、 免疫学的反応に適した培地を形成するための試薬、
（ｃ）所望により、免疫学的反応によって生じるＩＧＦ−ＩＲ／抗体および／またはＥＧＦＲ／抗体複合体の実証を可能にする試薬
を含んでなる、キットまたはセットを包含する。

本発明はさらに、癌、特に、細胞傷害性薬剤または抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体が一般に処方される癌、特に、その癌の腫瘍細胞がＩＧＦ−ＩＲ受容体および／またはＥＧＦＲ受容体を発現または過剰発現する癌の予防または治療に向けた薬剤の製造のための、本発明による組合せ製品としての組成物の使用に関する。

本発明はまた、生物活性のある化合物の、ＩＧＦ−ＩＲ受容体および／またはＥＧＦＲ受容体を発現または過剰発現する細胞への特異的ターゲッティングを目的とする薬剤の製造のための、本発明による抗体の使用に関する。

本明細書において、生物活性のある化合物とは、細胞活性、特に、その成長、その増殖、転写または遺伝子翻訳を調節する、特に、阻害することができる化合物を示すものである。

本発明はまた、本発明による抗体またはその機能的断片、好ましくは、標識したもの、特に、放射性標識したものを含んでなるin vivo診断試薬、および、特に、ＩＧＦ−ＩＲ受容体および／またはＥＧＥＲ受容体の細胞による発現または過剰発現に関連した癌の検出を目的とした医学的画像化におけるその使用に関する。

本発明はまた、本発明による組合せ製品としての組成物または薬剤としての、抗ＩＧＦ−ＩＲおよび／またはＥＧＦＲ／毒素複合体または放射性元素に関する。

好ましくは、本発明による組合せ製品としての組成物または複合体は、賦形剤および／または医薬上許容されるビヒクルと混合される。

本明細書において、医薬上許容されるビヒクルとは、二次反応を誘発しない、例えば、活性化合物の投与を容易にし、そのライフスパンおよび／または体内でのその効果を長期化し、溶液中のその溶解度を高め、あるいはその保持を改善することを可能にする、医薬組成物の一部になる化合物または化合物の組合せを示すものである。これらの医薬上許容されるビヒクルは周知であり、選択された活性化合物の性質および投与の様式に応じて当業者が適合させる。

好ましくは、これらの化合物は全身経路によって、特に、静脈内経路によって、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下経路によって、または経口経路によって投与される。より好ましくは、本発明の抗体を含んでなる組成物を逐次的に数回投与する。

その投与の様式、用量および最適な医薬形態は患者に適合させる、治療の確立において一般に考慮する基準、例えば、患者の年齢または体重、患者の一般的な状態の重篤度、治療に対する耐性および言及した副次的効果など、に従って決定することができる。

本発明のその他の特徴および利点は、下記実施例および以下にその説明を示す図面の説明にて示している。

実施例１：マウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の作製および選抜
ＩＧＦ−ＩＲに対して特異的に向けられ、ＩＲを認識しないＭＡｂの作製を目的として、６スクリーニング工程を含んでなるプロトコールを構想した。

このプロトコールは：
マウスに組換えＩＧＦ−ＩＲで免疫性を与えて、ハイブリドーマを作製し、
培養物上清を免疫付与に役立つ組換えタンパク質についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、
ハイブリドーマ陽性の全ての上清をＭＣＦ−７腫瘍細胞表面で過剰発現される天然受容体についてＥＬＩＳＡにより試験し、
ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＲ各々を発現するバキュロウイルスに感染した昆虫細胞でのＩＧＦ−ＩＲおよびＩＲの認識差に関する２種類の最初のスクリーニングにてハイブリドーマ陽性の上清を評価し、
この工程で選抜された抗体がＭＣＦ−７細胞の誘導されたＩＧＦ１増殖をin vitroにて阻害できることを実証し、
腫瘍ＭＣＦ−７の増殖に対する影響という点から保持された候補のヌードマウスにおけるin vivo活性を保証する
ことにある。

これらの異なる工程および得られた結果の全てを以下の実施例１にて簡単に説明する。

免疫付与工程では、マウスに皮下経路により８μｇの組換えＩＧＦ−ＩＲを２回注射した。雌ラットの細胞のマウス骨髄腫Ｓｐ２０Ａｇ１４の細胞との融合３日前に、３μｇの組換え受容体の静脈注射によりマウスを刺激した。 融合１４日後、上清のハイブリドーマを組換えＩＧＦ−ＩＲにより感作されたプレートにおいてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。陽性であることが分かった上清のハイブリドーマを保持し、増幅した後に、産生した抗体もまた、天然ＩＧＦ−ＩＲを認識することができることを実証するためにＦＡＣＳｃａｎで試験した。これをを行うために、ＥＬＩＳＡにて選抜したハイブリドーマによって産生された培養上清各々とともにＩＧＦ−ＩＲを過剰発現するエストロゲン依存性乳房腫瘍由来のＭＣＦ−７細胞をインキュベートした。細胞表面の天然／ＭＡｂ受容体複合体は蛍光色素と結合した二次抗種(anti-species)抗体によって顕示された。図３Ａ〜３Ｃはハイブリドーマ７Ｃ１０の上清（図３Ｃ）で得られたヒストグラムタイプと細胞標識単独＋二次抗体の場合（図３Ａ）または対照のイソタイプを用いた標識の場合（図３Ｂ）との比較を示す。

選抜のこの工程にて、ＭＡｂを分泌し、同時に、組換え受容体および天然受容体を認識するハイブリドーマだけを選抜し、クローニングした。これらのハイブリドーマによって分泌されるＭＡｂを産生させ、次いで、精製した後に、同時に２種類の受容体を認識するハイブリドーマを排除するために、上記の方法に従って、ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＲを発現するＳｆ９昆虫細胞にてＦＡＣＳｃａｎで試験した。図４Ａは非感染細胞＋二次抗体（１）、αＩＲ３で標識した非感染細胞＋二次抗体（２）および抗ＩＲ抗体で標識した非感染細胞＋二次抗体(３)各々に対応するヒストグラム１、２、３を完全再編したものを示す。この最初の結果はこれらの非感染昆虫細胞の表面において検出可能なＩＧＦ−ＩＲおよびＩＲが存在しないことを十分に示している。図４ＢはＩＧＦ−ＩＲを発現するバキュロウイルスに感染した細胞の標識を示す。この２番目の図では、正の対照として用いたαＩＲ３が、予想どおりに細胞を十分に標識付けしている（ピーク２）が、一方、抗ＩＲは細胞単独のピークに重なっている（ピーク３）。最後に、図４Ｃでは、抗ＩＲは予想どおりにＩＲを発現するＳｆ９細胞を十分に標識付けしている（ピーク３）が、意外なことに、文献にて、ＩＧＦ−ＩＲに対して特異的であると記載されるαＩＲ３もまたＩＲを認識すると考えられる（ピーク２）ことが示される。

この３番目のスクリーニング系で得られた結果を表１にまとめ、ＩＧＦ−ＩＲの認識およびＩＲの非認識の基準を満たすＭＡｂ：７Ｃ１０の製造を示す。ＭＡｂ ７Ｃ１０のイソタイプ割り出しからそれがＩｇＧ１を含むことが分かった。

ＭＡｂの選抜に提供された最後の２つのスクリーニングは、後者のものが細胞系ＭＣＦ−７においてＩＧＦ−１によって誘導されるin vitroおよびin vivo細胞増殖をかなり阻害することができることを実証することにあった。

in vitro選抜では、ＭＣＦ−７細胞を接種し、ウシ胎児血清を除いた後、漸増濃度のＩＧＦ−１（１〜５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、最終濃度１０μｇ／ｍｌまで添加する調べる７Ｃ１０抗体の存在または不在下でインキュベートした。この試験では、αＩＲ３ ＭＡｂ市販品を正の対照として用い、７Ｇ３ ＭＡｂ(７Ｃ１０と同時に単離され、天然受容体を弱く認識する（ＦＡＣＳでのＭＦＩはＭＡｂ ７Ｃ１０の２００に対して５０））を対照のイソタイプとして用いる。細胞増殖をβカウンターにて、細胞によるトリチウム化したチミジンの取り込みにより推定する。結果を増殖指数として表す。図５にて示されたデータからは、ＩＧＦ１は用量依存的にＭＣＦ−７細胞の増殖を刺激することができることが分かる。正の対照として用いたＭＡｂ αＩＲ３はＩＧＦ−１によって誘導されるＭＣＦ−７細胞の増殖を完全に阻害する。同様に、ＭＡｂ ７Ｃ１０はＩＧＦ−１によって誘導されるＭＣＦ−７細胞の増殖を有意に阻害する。最後に、イソタイプ対照として用いるＭＡｂ ７Ｇ３は、予想どおりにＭＣＦ−７細胞のin vitro腫瘍細胞増殖に対する影響なくうまくいく。

確立された腫瘍モデルにてin vivo選抜を実施した。これを行うために、ヌードマウスはマウスモデルにおける腫瘍の調査に不可欠な徐放性エストロゲン皮下埋め込みを受けた。エストロゲンの埋め込み２４時間後、５．１０６ＭＣＦ−７細胞をマウスの右側皮下に移植する。この細胞移植５日後、腫瘍は測定可能であり、６マウス群をランダムに形成する。週２回、５〜６週間、２５０μｇ／１回用量／マウスの用量にてマウスの処置を行った。対照群では、マウス対照イソタイプと同様にマウスを処置する。図６Ａにて示された結果からは、抗体７Ｃ１０によって誘導される腫瘍増殖の極めて有意な阻害が示される。通常ＩＧＦ１に対する受容体のドメインの参照としても用いられ、エストロゲン依存性腫瘍の増殖に対してin vivoでの活性を有さないことで知られているαＩＲ３に関して入手可能なデータを参照する場合、この活性はとりわけ予想外のことである（図６Ｂを参照）。同様に、マウスＭＡｂ １Ｈ７由来の組換え抗体ｓｃＦｖ−Ｆｃで得られた結果（図６Ｃを参照）と比較すると、ＭＡｂ ７Ｃ１０はＭＣＦ−７細胞の増殖のin vivo阻害においてはるかに有効である。

実施例２：腫瘍ＭＣＦ−７のin vivo増殖に対する７Ｃ１０およびタモキシフェンの効果の比較
エストロゲン依存性乳癌に関する抗体７Ｃ１０による処置の有効性を決定する目的として、７Ｃ１０を乳癌の治療に現在用いられているタモキシフェン化合物と局部進行および／または転移性進行の発展および再発の予防に関して比較した(VIDAL 2000, 1975-1976頁参照)。

ホルモン依存性乳癌では、エストロゲンに対する受容体（ＥＲ）の発現およびＩＧＦ−ＩＲの発現間に重大な関連が存在する(Surmacz E. et al., Breast Cancer Res. Treat., Feb., 47 (3): 255-267頁, 1998)。さらに、エストロゲン（Ｅ２）はＩＧＦ１（ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦＩと記載している場合もある）と相乗作用して細胞増殖を刺激すると思われる。Ｅ２による処置によってＩＧＦ−ＩＲのｍＲＮＡレベル、ならびにタンパク質の発現レベルが約１０倍高まることが実際に示されている(Lee A. V. et al., Mol. Endocrinol., May, 13 (5): 787-796頁, 1999)。この高まりではＩＧＦ−ＩＲのリン酸化の有意な増加が認められる。さらに、Ｅ２はリン酸化されるＩＧＦ−ＩＲの基質の１つであるＩＲＳ−１（「ＩＲＳ−１」は「インスリン受容体基質−１」）の発現を有意に刺激する。

タモキシフェンはＥ２依存性乳癌を患う患者に向けたホルモン療法に長年の間広く用いられてきた(Forbes J. F., Semin. Oncol., Feb., 24 (1st Suppl. 1): S1-5-S1-19, 1997)。この分子はエストラジオールと競合して、これのその受容体との結合を阻害する(Jordan V. C., Breast Cancer Res. Treat., 31 (1): 41-52頁, 1994)。タモキシフェンが受容体の発現およびそのリン酸化を阻害することによりＩＧＦ−ＩＲ依存性増殖を阻害することができることがさらに実証された(Guvakova M. A. et al., Cancer Res., July 1, 57 (13): 2606-2610頁, 1997)。これらのデータは総じて、ＩＧＦ−ＩＲがＥ２／ＥＲ相互作用によって誘導される増殖の重要なメディエーターであることを示しているように思われる。

タモキシフェンの長期使用は子宮内膜癌(Fisher et al., J. of National Cancer Institute, 86, 7: 527-537頁, 1994; VIDAL 2000, 1975-1976)およびＥ２非依存性乳癌の付帯再発(Li C. I. et al., J. Natl. Cancer Inst., July 4, 93 (13): 1008-1013頁, 2001)の危険性の著しい増加と関連している。これに関連して、ＭＣＦ−７モデルで抗体７Ｃ１０およびタモキシフェンのin vivo抗腫瘍効果の比較を実施し、媒介するＥＲ増殖におけるＩＧＦ−ＩＲと関連した活性の一部を決定した。これを行うために、ヌードマウスでの、この動物種におけるＥ２依存性ヒト腫瘍の確立に不可欠な持続性放出型エストラジオール粒子（０．７２ｍｇ／錠剤、６０日間作用）の埋め込み２４時間後、７．１０６ＭＣＦ−７細胞をこれらの同じマウスのｓｃ（皮下に）移植した。この移植の５日後、腫瘍は測定可能であり、６マウス群を形成する。これらの群を各々、１）２５０μｇ／マウスの用量にて、週２回、ｉｐ（腹腔内）注射される７Ｃ１０抗体により、２）３％のヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含有するＰＢＳに含まれた１０μｇのタモキシフェンによりｉｐにて、または３）タモキシフェンが溶けた溶媒（ヒドロキシプロピルセルロース）により処置する。タモキシフェンを週末を除いて毎日、４週間投与する。ＭＡｂ ７Ｃ１０により処置したマウスはまた、毎日、３％ＨＰＣを含有するＰＢＳの注射も受ける。溶媒単独では腫瘍増殖に対する影響がないことを実証するために、予め試験を行った。

図７にて示された結果からは、ＭＡｂ ７Ｃ１０が腫瘍ＭＣＦ−７の増殖を有意にin vivo阻害することができることが分かる（アスタリスク（＊）はｔ検定における比較対照群／７Ｃ１０群に相当する）。驚くべきことに、抗体７Ｃ１０は腫瘍増殖の阻害に関してタモキシフェンよりも有意に効果があると思われ（サークル（°）はｔ検定における比較タモキシフェン群／７Ｃ１０群に相当する）、タモキシフェンでの処置の代わりにＭＡｂによるこの種の処置を用いてもよいことが示唆される。

実施例３：異なる起源のヒト腫瘍に対するＭＡｂ ７Ｃ１０のin vivoにおける抗腫瘍活性の実証
ａ）３種類の腫瘍モデルにおける抗体７Ｃ１０のin vivo活性
ＩＧＦ１に対する受容体を発現するその他の腫瘍に対する７Ｃ１０抗体の活性を一般化するために、アンドロゲン非依存性前立腺腫瘍モデルＤＵ１４５（ＤＵ−１４５とも記載）、ＳＫＥＳ−１骨肉腫モデルおよび非小細胞肺腫瘍モデルＡ５４９において７Ｃ１０をin vivoで試験した。プロトコールはＭＣＦ−７に関し以上で記載したものと同様であり、図８Ａ〜８Ｃにて示された結果からは、３種類の腫瘍モデルにおいてのこのＭＡＢの有意な活性が示される。ＭＡＢ １Ｈ７の単鎖ｓｃＦｖはアンドロゲン非依存性前立腺腫瘍モデルにおいて活性がないため、前立腺腫瘍モデルにて観察された活性は極めて特に注目すべきである(Li et al., 2000)

ｂ）同所移植モデルＡ５４９における抗体７Ｃ１０のin vivo活性
上記の従来の異種移植片モデルでは転移性播種についての薬剤の試験ができない。実際に、ｓ．ｃ．（皮下に）移植した腫瘍は注入した位置に限局された状態のままであるため、実際にはヒトの場合の状況を反映していない。我々の抗体を現実に近いモデルにて評価するために、Ａ５４９細胞を胸腔内位置に移植した。このモデルは十分に記載されており(Clin. Cancer Res. 2000 Jan; 6 (1): 297-304頁)、縦隔、肺、心臓および脊椎転移について、ヒトで観察されるものに近い転移性播種の観察がなされる。実施した試験では、１０６ Ａ５４９細胞を雌ヌードマウスに胸腔内注射した。移植７日後、マウスを２２匹からなる２群に分けた。これらの群の一方は５００μｇ／マウスの抗原投与を受けた後、週２回、２５０μｇの７Ｃ１０／１回用量の割合で処置した。もう１つの群は対照イソタイプ９Ｇ４と同じスキームによって処置した。図３１はＭＡＢ ７Ｃ１０により処置したマウスにおいて生存の有意な延長を示し、このことからこの抗体が転移性播種においてある作用を有し得ることが分かる。

実施例４：in vivoにおけるＭＡｂ ７Ｃ１０のナベルビンとの比較；２種類の処置の併用効果
ナベルビンは非小細胞肺癌および転移性乳癌に適応とされる化学療法用化合物である。７Ｃ１０およびナベルビンの比較試験、ならびに２種類の製品間で起こり得る相乗効果を腫瘍モデルＡ５４９にて試験した。この試験では、５．１０６Ａ５４９細胞ををマウスの右側皮下に移植する。細胞移植５日後、腫瘍は測定可能であり、ＭＡｂおよび／またはナベルビンによる処置を開始する。抗体は常に２５０μｇ／１回用量／マウス、週２回、腹腔内にて投与する。ナベルビンに関しては、マウスの最大許容量または１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内にて投与する。この処置では、７日おきに３回の注入を行う。同時投与では、注入前に２種類の製品を混合する。

図９にて示された結果からは、驚くべきことに、このモデルにおいて、抗体７Ｃ１０がナベルビンでの従来の処置と同じくらい有効であることが分かる。２種類の製品の極めて有意な相乗効果もまた、７２日で測定可能な腫瘍を有する７マウスのうちの５マウスにて観察される。

実施例５：ＭＣＦ−７腫瘍のＩＧＦ２誘導性増殖のin vitro阻害の試験
上記のように、ＩＧＦ−ＩＲは数多くの腫瘍によって過剰発現されるが、さらに乳癌および結腸癌の大部分において、特に、増殖シグナルがＩＧＦ−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦＩＩと記載している場合もある）を介してこの受容体に送られることも記載されてきた。そのため、ＭＡｂ ７Ｃ１０がまた確実にin vitroにてＭＣＦ−７腫瘍で誘導されるＩＧＦ２増殖を阻害し得ることも必要である。これを行うために、細胞を９６−ウェルプレートに接種し、ウシ胎児血清を除き、１０μｇ／ｍｌの濃度にて添加する調べるＭＡｂの存在および不在下で最終濃度の培地ｍｌ当たり２００ｎｇのＩＧＦ２を添加して刺激した。図１０にて示された結果からは、ＩＧＦ２がＩＧＦ１と同様に、ＭＣＦ−７細胞の増殖を有意に刺激することが分かる。対照のイソタイプ、９Ｇ４を添加した場合は依然この刺激への影響はない。De Leon et al.(Growth Factors, 6: 327-334頁, 1992)によってすでに記載されているように、ＭＡｂ αＩＲ３の添加によって認められた影響はない。一方、７Ｃ１０はＩＧＦ２によって誘導される増殖を完全に阻害する。その活性は１Ｈ７のものよりも有意に優れている。

実施例６：キメラ７Ｃ１０（Ｃ７Ｃ１０）抗体およびヒト化（ｈ７Ｃ１０）抗体の生物活性
ａ）in vitroにおけるＭＣＦ−７モデルでの７Ｃ１０／Ｃ７Ｃ１０および７Ｃ１０／ｈ７Ｃ１０の比較
上記のように、ＭＣＦ−７モデルにおいてキメラ型のＭＡｂ ７Ｃ１０および精製ヒト化型１（本明細書においては７Ｈ２ＨＭと記載）をin vitroにて試験した。図１１および１２各々にて示された結果からは、これら２種類のものがＭＣＦ−７腫瘍のＩＧＦ１誘導性増殖を阻害するというそれらの特性を完全に保持していることが分かる。

ｂ）ＩＧＦ１のその受容体との結合によって誘導されるシグナルの変換に対するＭＡｂ ７Ｃ１０および７Ｃ１０の比較効果
系統ＭＣＦ−７においてin vitroにて誘導されたＩＧＦ１増殖の阻害活性はＭＡｂ７Ｃ１０のその受容体との結合時にＩＧＦ１が介在するシグナルの変換の阻害の翻訳のはずである。この仮説を実証するために、ＭＣＦ−７細胞を調べる抗体の存在またはの不在下、ＩＧＦ１を加えてまたは加えずにインキュベートした。短時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、β鎖を免疫沈降させ、このサブユニットのリン酸化を抗ホスホチロシンキナーゼ抗体を用いて推定した。図１３にて示された結果からは、無関係のマウス抗体（９Ｇ４）またはヒト抗体（スキームではＩｇＧ１と記載）とは異なり、７Ｃ１０またはｈ７Ｃ１０の結合によってＩＧＦ−ＩＲのβサブユニットのリン酸化を有意に阻害することが分かる。

ｃ）７Ｈ２ＨＭ抗体のＡＤＣＣ機構への関与
パラグラフｂ）での上記のシグナル変換の阻害は抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭの生物活性に関与する作用の重要な機構である。しかしながら、ヒトへの投与ではイソタイプＩｇＧ１の抗体７Ｈ２ＨＭがＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害作用）タイプの機構によって細胞溶解を誘導し得るであろうと考えられる。この点を実証するために、ヒトドナーの末梢血由来のＮＫ（ナチュラルキラー）細胞を５．１０５細胞当たり１０μｇの７Ｈ２ＨＭ抗体とともに４時間、予めインキュベートしたＡ５４９細胞またはＭＣＦ−７細胞の存在下に置き、５１Ｃｒ（５０μｇ）で標識する。この試験では、ヘルセプチン（図３２Ａおよび３２Ｂではｈ４Ｄ５と記載）を試験の正の対照として用いる。図３２Ａ〜３２Ｄからは、予想どおりにヘルセプチンが２種類の細胞Ａ５４９およびＭＣＦ−７において有意なＡＤＣＣを誘導すること（各々図３２Ａおよび３２Ｂを参照）が分かる。７Ｈ２ＨＭもまた、Ａ５４９細胞においてＡＤＣＣを誘導することができる（図３２Ｃを参照）が、ＭＣＦ７細胞におけるこの現象の大きさは小さいものである（図３２Ｄを参照）。

ｄ）抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭの細胞周期に対する効果
系統ＭＣＦ−７においてin vitroにて観察される細胞増殖の阻害は細胞周期に対する効果により明らかになるはずである。この事柄に答えるために、４．１０５細胞を６−ウェルプレートに接種する。接種２４時間後、ウシ血清を除き、調べる抗体の存在または不在下でＩＧＦ１を添加する。２４時間のインキュベーション後、細胞周期の試験用に細胞を回収する。図３３ＢはＩＧＦ１の不在下でのＭＣＦ−７細胞の周期および増殖の開始（図３３Ａを参照）と比較した、ＩＧＦ１のＭＣＦ−７細胞の周期および増殖の開始に対する効果を示している。増殖因子の添加後、Ｇ０／Ｇ１期（８８．２％〜５６．３％）の有意な減少〜 Ｓ期（７．８％〜３１％）およびＧ２／Ｍ期（４％〜１２．７％）のその恩恵が観察される。抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭの添加により（図３３Ｃを参照）、周期開始の有意な阻害が認められる。マウス抗体およびそのヒト化相同体が細胞周期に対して同程度の活性を有するということも注意すべきである。正の対照として取り入れたαＩＲ３は、この試験において７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭよりも少し活性が低いと思われる。対照のイソタイプとして用いた抗体９Ｇ４には細胞周期に及ぼす効果はない。

ｅ）iモデルＡ５４９における抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭのn vivo比較活性
ヒト化抗体７Ｈ２ＨＭのin vivo活性を確認するため、後者を非小細胞肺腫瘍モデルＡ５４９において７Ｃ１０と比較した。この試験は、抗体量が２５０μｇ／１回用量、週２回の代わりに１２５μｇ／１回用量、週２回であること、および大量の７Ｈ２ＨＭが入手不可能であるという事実を除いて、上記のとおり正確に実施した。抗体９Ｇ４を７Ｃ１０に対するイソタイプの対照として用い、イソタイプの無関係のヒト免疫グロブリンＩｇＧ１（以下ではＨＩｇＧ１と呼ばれる）をヒト化抗体７Ｈ２ＨＭに対する対照として用いた。

図３４Ａからは、９Ｇ４およびＨＩｇＧ１対照曲線間に有意差がないことが分かる。予想どおりに、マウス抗体７Ｃ１０において腫瘍増殖の有意な阻害が認められる。ヒト化抗体７Ｈ２ＨＭに関しては、認められた活性がそのマウス対照物において認められるものと厳密に同じ強さのものである。このデータはin vitroでの上記の観察結果に加えて、ヒト化によって作製された抗体の特性が改変されないことを示している。また、マウスの異種移植片モデルでは、ヒト化抗体の活性がシグナルの変換の阻害機構に完全に関連していると思われる。実際には、ＡＤＣＣがヌードマウスにおける腫瘍増殖の阻害に影響を及ぼしている場合には、マウス抗体およびヒト化抗体の活性間に差が認められるであろう。

また、in vivo試験をＭＣＦ−７乳房腫瘍モデルにおいて実施し、この試験により、予想どおりに、抗体７Ｈ２ＨＭがこの腫瘍の増殖のin vivo阻害に関し、マウス抗体７Ｃ１０と完全に同程度であることが示される（図３４Ｂ）。

ｆ）７Ｈ２ＨＭおよびナベルビン間の相乗効果の実証
７Ｃ１０で得られた結果の再現を目的として、そのヒト化相同体：抗体７Ｈ２ＨＭについて実施例４に記載のプロトコールを繰り返した。
図３５Ａおよび３５Ｂにて示された結果からは、７Ｃ１０の場合と同様に、ヒト化抗体７Ｈ２ＨＭおよびナベルビン間の有意な相乗効果が示されることが分かる。

ｇ）in vitroにおけるＭＣＦ−７細胞のアポトーシスに対する抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭの効果
上記のように、ＩＧＦ−ＩＲが細胞表面で過剰発現される場合にはこれによってアポトーシスからの保護を与えることができる。さらに、これらの実施例において、抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭが化学療法の活性化合物を増強することができることも示された。抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭのアポトーシス誘導能を調べ、化学療法に関するそれらの相乗効果の可能性を一部説明するために、ＭＣＦ−７細胞においてドキソルビシン、この細胞系のアポトーシスをin vitroにて誘導することが知られている薬剤の存在または不在下で試験を行った。これらの試験では、ＭＣＦ−７細胞を２．１０４／ｃｍ２にてペトリ皿に接種し、フェノールレッド不含の１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補給したＲＰＭＩで２４時間培養する。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＣＳを含まない培地での培養を再開する。それらには抗体を１０μｇ／ｍｌにて添加する前に３７℃にて１０分の適応時間が考慮される。さらに３７℃にて１０分後、組換えＩＧＦ−Ｉ(Sigma)を培養培地に最終濃度５０ｎｇ／ｍｌまで添加する。細胞を再び３７℃にて１時間放置して、抗体およびＩＧＦ−Ｉの結合を可能にする。最後に、ドキソルビシン(Sigma)を培養培地に２μｇ／ｍｌにて添加し、細胞を３７℃にて２４時間インキュベートする。

同様に、ナベルビンを１０μｇ／ｍｌの濃度にて用いて試験を実施した。
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ(２０分間、４℃）およびＤＡＰＩ（２μｇ／ｍｌ）で標識した後、フローサイトメトリー解析により細胞の生存の解析を行う。検討する死細胞の割合（パーセント）は標識された集団アネキシン＋Ｉ／ＤＡＰＩ＋である。抗体５Ｃ２を対照のイソタイプとして用いる。

図３６にて示された結果からは、ドキソルビシンがＭＣＦ−７細胞の８％でアポトーシスを誘導することが分かる。抗体７Ｃ１０およびドキソルビシンを併用して細胞を処置すると、細胞死の有意な増加が認められる。同じ効果が抗体７Ｈ２ＨＭでも示される。抗体をナベルビンと組み合わせた場合も同様の結果が認められた。

実施例７：モノクローナル抗体（ＭＡｂ）７Ｃ１０重鎖および軽鎖の可変領域をコードする遺伝子のクローニング戦略
ＴＲＩ ＲＥＡＧＥＮＴ(商標)（供給業者によって与えられた使用説明書に従う、SIGMA,. T9424）を用いて１０７細胞の抗体７Ｃ１０を分泌するハイブリドーマからトータルＲＮＡを抽出した。Amersham-Pharmaciaの「第１鎖ｃＤＮＡ合成」キット（#27-9621-01、供給業者によって与えられた使用説明書に従う）を用いて第１ｃＤＮＡ鎖を合成した。２鎖の反応にはキットに含まれるオリゴヌクレオチドＮｏｔ Ｉ−ｄ（Ｔ）１８を準備した。

このようにして得られたｃＤＮＡ：ｍＲＮＡハイブッドをＭＡｂ ７Ｃ１０の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子のＰＣＲによる増幅に用いた。ＰＣＲはマウス免疫グロブリンの重鎖および軽（κ）鎖に特異的なオリゴヌクレオチドの組合せを用いて実施した。５’末端に相当するプライマーはシグナルペプチドに相当する領域でハイブリダイズする（重鎖に関しては表２、軽鎖に関しては表３）。データバンクで見つけられる多数のマウス抗体配列からこれらのプライマーをまとめた(Jones S. T. et al., Bio/Technology 9: 88-89頁, 1991)。３’末端に相当するプライマーは重鎖（Ｖ−Ｃジャンクションからさほど離れていないサブクラスＩｇＧ１のＣＨ１ドメイン、ＭＨＣ−１プライマー 表４）および軽鎖（Ｖ−Ｃジャンクションからさほど離れていないκドメイン、ＭＫＣプライマー 表４）の定常領域でハイブリダイズする。

実施例８：マウスハイブリドーマ７Ｃ１０からクローニングした免疫グロブリンの配列
上記の増幅戦略に従って、「ｐＧＥＭ(登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙベクター系」(Promega)を用いて重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域に相当するＰＣＲ産物をクローニングした。７Ｃ１０ ＶＬの場合、ＭＫＣプライマーをＭＫＶ１およびＭＫＶ２プライマーと組み合わせてＰＣＲ産物を得た。７Ｃ１０ ＶＨの場合、ＭＨＣ−１プライマーをＭＨＶ８およびＭＨＶ１２プライマーと組み合わせてＰＣＲ産物を得た。ｐＧｅｍ−Ｔ ｅａｓｙベクターでクローニングしたＰＣＲ産物の詳細な配列決定では、軽鎖の場合、２つの異なる配列が示され、重鎖の場合、１つの独自の配列が示された。

ａ）オリゴＭＫＶ１から単離された可変領域
得られたＤＮＡ配列は機能的Ｉｇの可変領域の特徴を示している。そのため、この新規な配列が７Ｃ１０ ＶＬをコードするものであると考えられる。７Ｃ１０ ＶＬをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ（配列番号４８および５０）およびアミノ酸（配列番号４９）配列を図１４に示す。

ｂ）オリゴＭＫＶ２から単離された可変領域
この軽鎖をコードする遺伝子は、７Ｃ１０ ハイブリドーマの作製に用いたマウス骨髄腫Ｓｐ２／Ｏａｇ１４がその一部である最初のＭＯＰＣ−２１腫瘍由来の標準的な融合相手の全てに存在する異常なｍＲＮＡ転写物由来のものである。この配列はＶおよびＪ遺伝子間の異常な組換え（リーディングフレームの変化に関連する４ヌクレオチド塩基の欠失）および２３位にある一定のシステインのチロシンへの変化を含んでいる。これらの変化は、この軽鎖がメッセンジャーＲＮＡに転写されるにもかかわらず機能しないことを示唆する。この擬似軽鎖のＤＮＡ配列は示していない。

ｃ）オリゴＭＨＶ８およびＭＨＶ１２から単離された可変領域
これら２つのオリゴで得られたＤＮＡ配列は同一であり、オリゴ自身によってコードされる配列とは区別される。この配列はモノクローナル抗体７Ｃ１０のものであると考えられる機能的重鎖をコードする新規の配列である。７Ｃ１０ ＶＨをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ（配列番号５１および５３）およびアミノ酸（配列番号５２）配列を図１５に示す。

実施例９：キメラマウス−ヒト遺伝子の構築
ヒト定常領域κおよびγ−１各々と連結されるマウス７Ｃ１０領域ＶＬおよびＶＨを有するようにキメラ抗体７Ｃ１０を構築した。哺乳類細胞における発現用ベクターへのそれらのクローニングが可能となるよう７Ｃ１０ ＶＬおよびＶＨをコードするＤＮＡにフランキングする配列の５’および３’末端を改変するためにオリゴを用いた。これらのベクターは強力なプロモーターＨＣＭＶを用いてキメラ抗体７Ｃ１０の重鎖および軽鎖を効率的に転写する。また、これらのベクターは、ＤＮＡの効率的な複製を、結果として、ｃｏｓ細胞におけるタンパク質の一時的発現として可能にするＳＶ４０の複製起点も含んでいる。

実施例１０：キメラ抗体７Ｃ１０のＩＧＦ−１受容体の発現および認識活性の評価
キメラ７Ｃ１０抗体をコードするＤＮＡを含む２種類のプラスミドをｃｏｓ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５１）にトランスフェクトし、組換え抗体の一時的発現を調べた。７２時間のインキュベーション後、培養培地を取り出し、細胞残屑を除去するために遠心分離し、ヒトＩｇＧ１の産生（実施例１６を参照）およびＩＧＦ−１に対する受容体の認識（実施例１７を参照）についてＥＬＩＳＡ技術により解析した。

ヒトＩｇＧ１／κ濃度の測定に関するＥＬＩＳＡ試験からは、ｃｏｓ−７細胞におけるキメラ抗体７Ｃ１０の発現が多数の抗体で認められる値と同程度である３００〜５００ｎｇ／ｍｍ間であることが分かった。

ＩＧＦ−１に対する受容体の認識に関するＥＬＩＳＡ試験からは、キメラ抗体がそれを特異的かつ優れた相対アビディティにて認識することが分かった（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃを参照）。このことによって７Ｃ１０抗体の適したＶＨおよびＶＬが確認されたという有効な証拠が提供される。さらに、このキメラ型の７Ｃ１０はヒト化型のアフィニティーの評価において必須のツールであると思われる。

実施例１１：マウス抗体７Ｃ１０の可変領域の分子モデリング
「ＣＤＲ移植」によるヒト化方法を手助けし、改良するために、マウス抗体７Ｃ１０のＶＬおよびＶＨ領域の分子モデルを構築した。モデルは重鎖１ＡＹ１および軽鎖２ＰＣＰの結晶構造に基づく。

実施例１２：抗体７Ｃ１０の軽鎖可変領域（７Ｃ１０ ＶＬ）のＣＤＲ移植によるヒト化方法
ａ）７Ｃ１０ ＶＬのアミノ酸配列の全ての既知マウスＶＬ配列との比較
ＣＤＲ移植によるヒト化の予備工程として、７Ｃ１０ ＶＬのアミノ酸配列をまず、Kabatのデータバンク（インターネットアドレス：ftp://ftp.ebi.ac,uk/pub/database/kabat/fasta_format/, データの最終更新日 1999年)に存在する全てのマウスＶＬ配列と比較した。このことによって、７Ｃ１０ ＶＬがKabat et al.(In Sequences of proteins of immunological interest（第５版）, NIH publication No.91-3242,, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 1991)によって定義されたκ軽鎖のサブグループＩＩに属することが確認された。最大９５％に及ぶ配列同一性を有するマウスのモノクローナル抗体ＶＬ領域が確認された（ＤＲＢ１−４．３（配列番号５５）：９５％およびＣ９４−５Ｂ１１'ＣＬ（配列番号５６）：９５％、図１７を参照）。７Ｃ１０ ＶＬ配列の通常の残基から同定を試みるために、７Ｃ１０ ＶＬのアミノ酸配列（配列番号５４）をKabatによって定義されたマウスκ鎖のサブグループＩＩのコンセンサス配列（配列番号５７）とアラインした（図１７を参照）。

Kabatの位置番号３では、Kabatに従ってκ軽鎖のサブグループＩＩに通常存在するバリン（Ｖ）（７１％）がロイシン（Ｌ）に置き換えられている。この位置のロイシンは、例えば、ＤＲＢ１−４．３およびＣ９４−５Ｂ１１'ＣＬにおいて認められ、珍しくはない。分子モデルによれば、この残基が特定の役割を果たすとは考えられない。そのため、ヒト化型におけるこの残基の保存は考えない。

Kabatの位置番号７では、Kabatに従ってκ軽鎖のサブグループＩＩに通常存在するトレオニン（Ｔ）（６６％）がイソロイシン（Ｉ）に置き換えられている。この位置のイソロイシンは、全ての既知マウスＶＬ配列では１５倍認められ、ヒトＶＬ配列では全く認められないため、比較的珍しい。分子モデルによれば、この残基（１７）は分子の表面の方に向いているが、ＣＤＲとは接触しない（最も近いＣＤＲの残基がKabatの位置番号４２のアルギニンである）ことが分かる。さらに、この残基１７が直接抗原と接触するとはほとんど考えられない。そのため、いずれにしても最初はヒト化型におけるこの残基の保存は考えない。

Kabatの位置番号７７では、Kabatに従ってκ軽鎖のサブグループＩＩに通常存在するアルギニン（Ｒ）（９５．５％）がセリン（Ｓ）に置き換えられている。この位置のセリンは、珍しくはない。

ｂ）７Ｃ１０ ＶＬのアミノ酸配列の全ての既知ヒトＶＬ配列との比較
「ＣＤＲ移植」の最良のヒト候補を同定するために、７Ｃ１０ ＶＬと可能な限り最高の相同性を有するヒト起源のκ ＶＬ領域を求めた。この目的を達するために、マウスκ ７Ｃ１０ ＶＬのアミノ酸配列をKabatのデータバンクに存在する全てのヒトκ ＶＬ配列と比較した。マウス７Ｃ１０ ＶＬはKabat et al.(1991)によって定義されたサブグループＩＩのヒトκ ＶＬ領域と最高の配列相同性を有した。ヒト起源のモノクローナル抗体のＶＨ領域は可変領域を構成する１１２個のアミノ酸全てに対して最大７５．９％に及ぶ配列同一性を有する（ＧＭ６０７（配列番号５８）、図１８を参照）ことが確認された。７６％の配列同一性を有するヒト起源の生殖細胞系統、ＤＰＫ１５／Ａ１９（配列番号５９）（図１８を参照）もまた同定された、ＧＭ６０７(Klobeck et al., 1984)。それゆえ、ＧＭ６０７をマウス７Ｃ１０ ＶＬのＣＤＲを受け入れることができるヒト配列（Kabatの定義に従う）として選択した。ＧＭ６０７配列のヒトサブグループＩＩのコンセンサス配列のもの（配列番号６０）との比較（図１８）によっては、フレームワーク領域（Ｒｃｈ）内の特定の残基は同定できず、その事実によってＧＭ６０７がＣＤＲ移植の優れた候補であることが示される。

ｃ）ヒト化型の７Ｃ１０ ＶＬ
ヒト化方法の次の工程は、マウス７Ｃ１０ ＶＬのＣＤＲの選択したヒト軽鎖、ＧＭ６０７(Klobeck et al., 1964)のフレームワーク領域（Ｒｃｈ）との結合にあった。方法のこの工程において、分子の３次元構造の維持（ＣＤＲの正規構造(canonical structure)、ＶＨ／ＶＬインターフェイス、など）または抗原との結合においてある役割を果たし得るように保持されるマウス残基の選択には７Ｃ１０のマウスＦｖ領域の分子モデルが特に有用である。Ｒｃｈにおいて、マウス（７Ｃ１０ ＶＬ）およびヒト（ＧＭ６０７）アミノ酸間の違いを綿密に調べた（表５を参照）。さらに、必要に応じて、同定されたマウス配列７Ｃ１０ ＶＬの特定の残基（実施例１２．ａを参照）を検討した。

７Ｃ１０ ＶＬの「ＣＤＲ移植」によってヒト化した最初の型、ヒト１では、ＧＭ６０７のフレームワーク領域（Ｒｃｈ）内に１つの変化がなし遂げられている。この変化はＲｃｈ１に位置する残基２（Kabatの命名）に関係する。この残基は、実際には、７Ｃ１０ ＶＬのＣＤＲ１の正規構造構成の一部になるため、その適したコンホメーションにおいてこのループを維持するのに重要である。そのため、マウス７Ｃ１０ ＶＬ配列のこの位置に存在するバリンはヒト化型のこの同じ位置に維持されている（アミノ酸配列（配列番号６１）に関しては表５および図１９を、ＤＮＡ配列（配列番号６２および６４）およびペプチドシグナルを含んでなるアミノ酸配列（配列番号６３）に関しては図２０を参照）。

７Ｃ１０ ＶＬの「ＣＤＲ移植」によってヒト化した２番目の型、ヒト２では、ヒト軽鎖ＧＭ６０７のＲｃｈ内に受けた変化はない。そのため、Ｒｃｈの全ての残基が、マウス７Ｃ１０ ＶＬに存在するバリンをヒト軽鎖ＧＭ６０７のこの同じ位置に見られるイソロイシンに置き換えるために変異させた残基２をはじめとするヒト起源のものである（アミノ酸配列（配列番号６５）に関しては表５および図１９を、ＤＮＡ配列（配列番号６６および６８）およびペプチドシグナルを含んでなるアミノ酸配列（配列番号６７）に関しては図２１を参照）。そのため、このヒト型２はＲｃｈの全ての残基がヒト起源の軽鎖、ＧＭ６０７のものであることから、完全にヒト化されている（当然ながら、ＣＤＲ自体とは区別される）。

説明：１列目（Kabat）はKabat et al. (1991)によるアミノ酸残基の位置を示し；２列目（＃）は通常の配列でのアミノ酸残基の位置を示し；３列目（ＦＲまたはＣＤＲ）は骨格のセグメント（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）およびＣＤＲセグメント（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）（「ＣＤＲ」は「相補性決定領域」）を容易に確認するために作成し、３つのＣＤＲが４つのＦＲを隔てている；４列目（マウス軽鎖 ７Ｃ１０）はマウス抗体７Ｃ１０のＶＬ領域のアミノ酸配列（配列番号５４）を示し；５列目（ヒト生殖細胞系統ＤＰＫ１５／Ａ１９）は生殖細胞系統のκ ＩＩ ヒトＶ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５９）を示し；６列目（ＧＭ６０７）はヒト抗体ＧＭ６０７のＶＬ領域のアミノ酸配列（配列番号５８）を示し；７および８列目（再構築したヒト７Ｃ１０ １および２）はヒト化１および２抗体７Ｃ１０ ＶＬのアミノ酸配列（各々、配列番号６１および６５）を示す。「＊」はChothia et al. (Nature, 342, 877-883頁, 1989)によって定義されるようなＣＤＲループの正規構造の一部を示す。

実施例１３：抗体７Ｃ１０の重鎖可変領域（７Ｃ１０ ＶＨ）のＣＤＲ移植によるヒト化方法
ａ）７Ｃ１０ ＶＨのアミノ酸配列の全ての既知マウスＶＨ配列との比較
ＣＤＲ移植によるヒト化の予備工程として、７Ｃ１０ ＶＨのアミノ酸配列をまず、Kabatデータバンク（インターネットアドレス：ftp://ftp.ebi.ac,uk/pub/database/kabat/fasta_format/, データの最終更新日 1999年)に存在する全てのマウスＶＨ配列と比較した。このことによって、７Ｃ１０ ＶＨがKabat et al.(1991)によって定義された重鎖のサブグループＩ（Ａ）に属することが確認された。最大９０．５％に及ぶ配列同一性を有するマウスのモノクローナル抗体ＶＨ領域が確認された（ＡＮ０３’ＣＬ（配列番号７０）、図２２を参照）。７Ｃ１０ ＶＨ配列の通常の残基から同定を試みるために、我々は７Ｃ１０ ＶＨのアミノ酸配列（配列番号６９）をKabatによって定義されたマウス重鎖のサブグループＩ（Ａ）のコンセンサス配列（配列番号７１）とアラインした（図２２を参照）。

残基１７（Kabatの番号付け）、サブグループＩ（Ａ）のコンセンサス配列ではＴｈｒ、７Ｃ１０ ＶＨではＳｅｒ、は定常領域との結合では分子の表面に位置する。この残基は重要であるとは考えられない。

残基２７（Kabatの番号付け）、サブグループＩ（Ａ）のコンセンサス配列ではＡｓｐ、７Ｃ１０ ＶＨではＴｙｒ、はＣＤＲ１の標準残基である。この位置のＴｙｒは珍しくなく、その適したコンホメーションにおいてＣＤＲ１を維持するのに重要であるといえる。

残基８４（Kabatの番号付け）、サブグループＩ（Ａ）のコンセンサス配列ではＴｈｒ、７Ｃ１０ ＶＨではＡｓｎ。ＡｓｎはマウスＶＨでは９３倍、ヒトＶＨでは３倍認められた。分子モデルによれば、これはパラトープから遠く離れた表面残基である。

アミノ酸の番号付けはKabat et al. (1991)のものである。７Ｃ１０ ＶＨおよびKabat マウスサブグループＩ（Ａ）（配列番号５７）間で異なるフレームワーク領域（ＣＤＲとは区別される）内の残基に下線を付けている。ＡＮ０３’ＣＬは represents マウス抗体重鎖の配列（Kabatデータバンクでのアクセス番号はＰ００１２８９である）を表す。

ｂ）７Ｃ１０ ＶＨのアミノ酸配列の全ての既知ヒトＶＨ配列との比較
「ＣＤＲ移植」の最良のヒト候補を同定するために、７Ｃ１０ ＶＨと可能な限り最高の相同性を有するヒト起源のＶＨ領域を求めた。この目的を達するために、マウス７Ｃ１０ ＶＨのアミノ酸配列をKabatのデータバンクに存在する全てのヒトＶＨ配列と比較した。マウス７Ｃ１０ ＶＨはKabat et al.(1991)によって定義されたサブグループＩＩのヒトＶＨ領域と最高の配列相同性を有した。ヒト起源のモノクローナル抗体のＶＨ領域は可変遺伝子によってコードされた（すなわち、ＣＤＲ３および領域Ｊとは区別される）９８個のアミノ酸全てに対して最大６７．３％に及ぶ配列同一性を有する（ヒトＶＨ ＦＵＲ１’ＣＬ（配列番号７３）、図２３を参照）ことが確認された。６８．４％の配列同一性を有するヒト起源の生殖細胞系統、４．２２ ＶＨ ＩＶ(Sanz et al., 1989)もまたＶＨ

ＦＵＲ１’ＣＬに対するものと同じ基準に従って同定された（ヒト生殖細胞（配列番号７４）、図２３を参照）。４．２２ ＶＨ ＩＶおよびＶＨ ＦＵＲ１’ＣＬの配列のヒトサブグループＩＩのコンセンサス配列のもの（ヒト Kabat ｓｇ ＩＩ（配列番号７２）、図２３および表６を参照）との比較によって、４．２２ ＶＨ ＩＶではフレームワーク領域（Ｒｃｈ）内の非定型残基は同定できなかったが、ＶＨ ＦＵＲ１’ＣＬによってコードされた配列では２つの非定型残基(Kabatの命名によれば、各々、８１および８２Ａ位のＧｌｎおよびＡｒｇ）の存在が同定されたことから、ＶＨ ＦＵＲ１’ＣＬよりもむしろ、生殖細胞系統４．２２ ＶＨ ＩＶによってコードされた配列をマウス７Ｃ１０ ＶＨのＣＤＲを受け入れることができるヒト配列（Kabatの定義に従う）として選択した。

ｃ）ヒト化型の７Ｃ１０ ＶＨ
ヒト化方法の次の工程は、マウス７Ｃ１０ ＶＨのＣＤＲのヒト生殖細胞系統４．２２ ＶＨ ＩＶ(Sanz et al., 1989)のフレームワーク領域（Ｒｃｈ）との結合にあった。方法のこの工程において、分子の３次元構造の維持（ＣＤＲの正規構造、ＶＨ／ＶＬインターフェイス、など）または抗原（パラトープに属する）との結合においてある役割を果たし得るように保持されるマウス残基の選択には７Ｃ１０のマウスＦｖ領域の分子モデルが特に有用である。Ｒｃｈにおいて、マウス（７Ｃ１０ ＶＨ）およびヒト（４．２２ ＶＨ ＩＶ）アミノ酸間の違いを綿密に調べた（表６を参照）。さらに、必要に応じて、同定されたマウス７Ｃ１０ ＶＨ配列の特定の残基（実施例８．ａを参照）を検討した。

７Ｃ１０ ＶＨの「ＣＤＲ移植」によってヒト化した最初の型、ヒト１では、４．２２ ＶＨ ＩＶのフレームワーク領域（Ｒｃｈ）内に４つの変化がなし遂げられている（アミノ酸配列（配列番号７５)に関しては表６、図２４を、ＤＮＡ配列（配列番号７６および７８）およびペプチドシグナルを含んでなるアミノ酸配列（配列番号７７）に関しては図２５を参照）。これら４つの変化は以下の残基に関係する：
・Ｒｃｈ１に位置する残基３０（Kabatの命名）。この残基は、実際には、（Chothia et al., 1989によって定義されるように）７Ｃ１０ ＶＨのＣＤＲ１の構造構成の一部になるため、その正確なコンホメーションにおいてこのループを維持するのに重要である。そのため、マウス配列７Ｃ１０ ＶＨのこの位置に存在するＴｈｒはヒト化型のこの同じ位置に維持されている。

・Ｒｃｈ２に位置する残基４８（Kabatの命名）。この残基は、分子モデルによれば、後者に直接接触しないが、ＣＤＲに近く、それらの最終的なコンホメーションに影響を及ぼすこともある。そのため、マウス配列７Ｃ１０ ＶＨのこの位置に存在するメチオニンはヒト化型１のこの同じ位置に維持されている。

・Ｒｃｈ３に位置する残基６７（Kabatの命名）。この残基はＣＤＲに近く、分子モデルによれば、ＣＤＲ２のリジン６０（Kabatの命名）と接触することもある。そのため、マウス配列７Ｃ１０ ＶＨのこの位置に存在するイソロイシンはヒト化型１のこの同じ位置に維持されている。

・Ｒｃｈ３に位置する残基７１（Kabatの命名）。この残基はＣＤＲ２の正規構造構成の一部になるため、その正確なコンホメーションにおいてこのループを維持するのに重要である。そのため、マウス配列７Ｃ１０ ＶＨのこの位置に存在するアルギニンはヒト化型１のこの同じ位置に維持されている。

７Ｃ１０ ＶＨの「ＣＤＲ移植」によってヒト化した２番目の型、ヒト２では、４．２２ ＶＨ ＩＶのフレームワーク領域（Ｒｃｈ）内に２つの変化がなし遂げられている。これら２つの変化はヒト化型１ですでに説明した残基３０および７１（Kabatの命名）に関係する（アミノ酸配列（配列番号７９）に関しては表６および図２４を、ＤＮＡ配列（配列番号８０および８２）およびペプチドシグナルを含んでなるアミノ酸配列（配列番号８１）に関しては図２６を参照）。

７Ｃ１０ ＶＨの「ＣＤＲ移植」によってヒト化した３番目の型、ヒト３では、４．２２ ＶＨ ＩＶのＲｃｈ内に受けた変化はない。そのため、Ｒｃｈの全ての残基が、残基３０、４８、６７および７１（Kabatの命名）をはじめとする維持されたヒト起源のものである（アミノ酸配列（配列番号８３）に関しては表６および図２４を、ＤＮＡ配列（配列番号８４および８６）およびペプチドシグナルを含んでなるアミノ酸配列（配列番号８５）に関しては図２７を参照）。そのため、このヒト型３はＲｃｈの全ての残基が生殖細胞系統、４．２２ ＶＨ ＩＶのＶＨ遺伝子によってコードされたものであることから、完全にヒト化されている（当然ながら、Kabatによって定義されたＣＤＲ自体とは区別される）。

説明：１列目（Kabat）はKabat et al. (1991)によるアミノ酸残基の位置を示し；２列目（ＦＲまたはＣＤＲ）は骨格のセグメント（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）およびＣＤＲセグメント（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を容易に確認するために作成し、３つのＣＤＲが４つのＦＲを隔てている；３列目（マウス重鎖 ７Ｃ１０）はマウス抗体７Ｃ１０のＶＨ領域のアミノ酸配列（配列番号６９）を示し；４列目（生殖細胞系統４．２２ ＶＨ ＩＶ）は遺伝子４．２２ ＶＨ ＩＶ(Sanz et al., 1989)のアミノ酸配列（配列番号７４）を示し；５列目（ヒトＦＵＲ１’ＣＬ ＶＨ、kabatのアクセス番号Ｎ０２０６１９）はアミノ酸配列（配列番号７３）を示し［欠文］ＩｇＭＫ ヒト起源の抗ラミンＢ(Mariette et al., 1993)；６、７および８列目（再構築したヒト７Ｃ１０ １、２および３）は型１（配列番号７５）、２（配列番号７９）および３（配列番号８３）各々の再構築ヒト７Ｃ１０のＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。「＊」はChothia et al. (1989)によって定義されるようなＣＤＲループの正規構造の一部を示す。

実施例１４：オリゴヌクレオチドのアセンブリによるヒト化型１の７Ｃ１０ ＶＬおよびＶＨをコードする遺伝子の構築
ａ）原理
ヒト化可変領域をコードする遺伝子（リーダーペプチド＋可変領域 ＶＨの場合はＶＤＪまたはＶＫの場合はＶＪ）をストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ上での固相アセンブリによって合成した。ヒト化７Ｃ１０ ＶＨ（４４５塩基対）およびヒト化７Ｃ１０ ＶＬ（４３３塩基対）をコードする遺伝子を、２配列に存在し、遺伝子のほぼ中間に（ＶＬおよびＶＨ各々に対する遺伝子の５’末端に対して２００および２４５ヌクレオチドに）位置するＫｐｎＩ制限部位の存在によって２つのＤＮＡ断片を融合することによって構築した。一緒に融合される２断片自身が、それらが延長中にオーバーラップするように２つずつ（一方のオリゴが５０％の相同性を有するセンス、もう一方がアンチセンス）ハイブリダイズされたリン酸化オリゴヌクレオチド（約３０〜３５量体）を用いることにあるアセンブリ技術により構成される。５’位置でビオチン化した最初のオリゴヌクレオチドを磁気ビーズと結合した後、リン酸化オリゴヌクレオチド対を１つずつ添加する。酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって隣り合って並んだリン酸化オリゴヌクレオチド間のホスホジエステル結合が形成される。

このようにde novo合成した遺伝子は（選択した発現ベクターと適合する制限酵素での消化により）直接クローニングすることができるし、またはＰＣＲにより増幅して酵素消化による指向性クローニングへの準備としてより多くの材料を得ることができる。このようにde novoアセンブリによって構築された遺伝子の配列はＤＮＡの自動配列決定により確認する。

ｂ）de novoアセンブリ技術の試験プロトコール
５’位置でリン酸化されるか、または５’位置でビオチン化された、１００μＭ濃度に調整済みのオリゴヌクレオチドをMWG Biotechに注文した（ヒト化７Ｃ１０ ＶＬの構築の場合には表７の使用オリゴヌクレオチドの配列を、ヒト化 ７Ｃ１０ ＶＨの構築の場合には表８のものを参照）。表９に記載のスキームに従って、オリゴヌクレオチドを対にハイブリダイズした（等モル混合物、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー中センスオリゴおよアンチセンスオリゴ各々５００ｐｍｏｌを９５℃に５分間加熱した後、ベンチで周囲温度まで冷却する)。

第一のビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ(Dynabeads M-280 ストレプトアビジン, Dynal product No.112-05)と結合させる。このために、１５ｍＭ ＮａＣｌ溶液中５００ｐｍｏＬのビオチン化オリゴヌクレオチドを、予め１００μｌのＴＥ １Ｘバッファー（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ １００Ｘバッファー：１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ ８、０．１Ｍ ＥＤＴＡ, Sigma T-9285）で２回洗浄した、５０μｌのデカントしたビーズ（マグネットホルダーを使用）に添加する。３７℃で１５分間のインキュベーションの後、ビーズを洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ ７．６、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ ＮａＣｌ)で２回洗浄し、次いで、ハイブリダイズしたオリゴ−ヌクレオチド対を１つずつ添加する。オリゴヌクレオチド対を再添加するたびに、混合物を９５℃に５分間加熱した後、ベンチで周囲温度まで冷却する。一度、周囲温度に到達したら、２μｌの１０Ｕ/μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(Biolabs)を添加し、混合物を３７℃で２０分間インキュベートする。次いで、ビーズを洗浄し（洗浄バッファー）た後、以下のオリゴヌクレオチド対を連続して添加する。

最後の非対合オリゴ（アンチセンス）を以下の様式でアセンブリする。５μｌのオリゴ（５００ｐｍｏｌ）および４３μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼバッファーをデカントしたビーズに添加した後、混合物を９５℃に５分間加熱し、ベンチで周囲温度まで冷却する。一度、周囲温度に到達したら、２μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物を３７℃で２０分間インキュベートする。次いで、ビーズを洗浄バッファーで２回、次ぎに、ＴＥ １Ｘバッファーで２回洗浄する。

その後、ビーズはde novoアセンブリした遺伝子のクローニングおよび配列決定を行うまで４℃にて保存してもよい。

実施例１５：特異的突然変異誘発によるヒト化型２の７Ｃ１０ ＶＬおよび７Ｃ１０ ＶＨならびにヒト化型３の７Ｃ１０ ＶＨをコードする遺伝子の構築
ヒト化型１の残基４８および６７（Kabatの命名に従う）の特異的突然変異誘発によって、ヒト化型２の７Ｃ１０ ＶＨを得た。この特異的突然変異誘発はStratageneの系ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発（キット #200518）を製造業者が記載するプロトコールに従って用いて実施した。構築は２工程で実施し、まず、型１の残基４８をプライマー対、７Ｃ１０Ｈヒト化１ＱＣＭ４８センスおよびアンチセンス（表１０を参照）を用いて変異させ、続いて、残基４８で変異させたこの型自身をプライマー対、７Ｃ１０Ｈヒト化１ＱＣＩ６７センスおよびアンチセンス（表１０を参照）を用いて残基６７で変異させた。

同様に、系ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）を用いたヒト化型２の残基３０および７１（Kabatの命名に従う）の部位特異的変異によって、ヒト化型３の７Ｃ１０ ＶＨを得た。この構築は２工程で実施する。まず、型２の残基３０をプライマー対、７Ｃ１０Ｈヒト化ＱＣＴ３０センスおよびアンチセンス（表１０を参照）を用いて変異させた。続いて、残基３０で変異させたこの型自身をプライマー対、７Ｃ１０Ｈヒト化１Ｖ６７ＱＣＲ７１センスおよびアンチセンス（表１０を参照）を用いて残基７１で変異させた。

系ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）を用いたヒト化型１の残基２（Kabatの命名に従う）の部位特異的変異によって、ヒト化型２の７Ｃ１０ ＶＬを得た。型１の残基２をプライマー対、７Ｃ１０Ｌヒト化１ＱＣＶ２センスおよびアンチセンス（表１０を参照）を用いて変異させた。

実施例１６：エレクトロポレーションによるｃｏｓ７細胞のトランスフェクション
キメラまたはヒト化型抗体７Ｃ１０の重鎖および軽鎖を有する哺乳類発現ベクターを、ｃｏｓ７細胞において、組換え抗体７Ｃ１０の一時的発現について試験した。BioRad instrument(Gene Pulsar)を用いたエレクトロポレーションによってＤＮＡをｃｏｓ細胞に導入した。ＤＮＡ（各ベクター１０μｇ)は０．８ｍｌアリコートのｃｏｓ細胞にＰＢＳバッファー１ｍｌ当たり１×１０７細胞の濃度にて添加する（Ｃａ++およびＭｇ++なし）。パルス １９００ボルトおよび電気容量 ２５μＦを供給した。次いで、トランスフェクトしたｃｏｓ細胞を８ｍｌの５％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地に添加し、３７℃で７２時間インキュベートする。次いで、上清を回収し、細胞残屑を除去するために遠心分離し、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ１／ヒトκタイプの組換え抗体７Ｃ１０のその濃度の大きさについて試験する。

実施例１７：ｃｏｓ形質転換体の上清に存在する組換え抗体ＩｇＧ１／ヒトκの濃度を測定するためのＥＬＩＳＡ法
ｃｏｓ７細胞における一時的発現によって生じた上清をＩｇＧ１／ヒトκタイプの７Ｃ１０抗体の存在について試験した。ＩｇＧ１／ヒトκ免疫グロブリンの検出を目的として、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート(Maxisorb, Nunc)をヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（γ Ｆｃ断片に対して特異的, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., #109-005-098）でコーティングした。ｃｏｓ細胞の上清を連続希釈し、コーティングしたウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートし、洗浄した後に、ペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒト軽κ鎖ポリクローナル抗体（ＨＲＰ, Sigma, A-7164）を添加した。３７℃で４５分間インキュベートし、洗浄した後に、ＴＭＢ基質（KPL #50-76-04）を添加した。１０分間のインキュベーションの後に、１Ｍ硫酸の添加により反応を停止させ、４５０ｎｍにて光学密度を読み取った。既知濃度の精製ヒトＩｇＧ１／ヒトκ免疫グロブリン(Sigma, 1-3889)を標準参照抗体として用いた。

実施例１８：ヒトＩｇＧ１／κタイプの７Ｃ１０組換え抗体のＩＧＦ−１に対する受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）に関する認識活性を測定するためのＥＬＩＳＡ法
ｃｏｓ７培養物上清をＥＬＩＳＡ法によりＩＧＦ−１ Ｒを認識するそれらの能力について試験した。９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート(Dynex Immulon 2HB)を４℃にて一晩のインキュベーションにより、０．３１ｎｇ／μｌのＩＧＦ−１ Ｒ（ヒトインスリン様増殖因子Ｉ可溶性受容体, R & D Systems, #391-GR）を含有するＰＢＳ溶液、各ウェル当たり１００μｌでコーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでの洗浄後、プレートを０．５％ゼラチン溶液を含有するＰＢＳ溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートして飽和させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、調べるｃｏｓ上清のサンプルを予め０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで連続希釈し、それをプレートに添加した。３７℃で１時間インキュベートし、続いて、３回洗浄した（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）後、ペルオキシダーゼと結合した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃ断片に対して特異的）（ＨＲＰ, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., #109-035-098）を添加した（０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳにて１／５０００に希釈）。３７℃で４５分間インキュベートし、３回洗浄した（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）後に、ＴＭＢ基質(KPL #50-76-04)を添加した。１０分間のインキュベーションの後に、１Ｍ硫酸の添加により反応を停止させ、４５０ｎｍにて光学密度を読み取った。

実施例１９：「ＣＤＲ移植」による異なる型のヒト化７Ｃ１０抗体によるＩＧＦ１−Ｒの認識活性の測定
まず、我々はＩＧＦ−１受容体に対するヒト化型１の７Ｃ１０の重鎖および軽鎖の認識活性をキメラ型と比較した。図２８は、前もって、ＥＬＩＳＡによりそのＩｇＧ１／ヒトκ濃度を測定した（実施例１７を参照）ｃｏｓ７細胞の上清のＩＧＦ−１Ｒの認識に関するＥＬＩＳＡ試験の結果を示す（実施例１８を参照）。調べた４種類の組換え抗体の滴定曲線は完全に重なり、このことから、ＩＧＦ−ＩＲに対するそれらの相対アフィニティーが極めて類似していることが分かる。それゆえ、このことから、ヒト化軽鎖１（フレームワーク領域内に存在する１マウス残基）とヒト化重鎖１（フレームワーク領域内に存在する４マウス残基）を組み合わせて構成されたヒト化型１の７Ｃ１が、ＩＧＦ−１受容体を特異的に認識し、キメラ抗体（マウス可変領域）のものと極めて類似したアフィニティーを有するという結論に達する。

続いて、我々はＩＧＦ−ＩＲの認識に及ぼす７Ｃ１０のヒト化軽鎖の残基２（Kabatの命名に従う）の影響（ヒト化型１対ヒト化型２、図１９を参照）を調べた。図２９は、前もって、ＥＬＩＳＡによりそのＩｇＧ１／ヒトκ濃度を測定した（実施例１７を参照）ｃｏｓ７細胞の上清のＩＧＦ−ＩＲの認識に関するＥＬＩＳＡ試験の結果を示す（実施例１８を参照）。２種類のヒト化型１および２の軽鎖を連続的にヒト化７Ｃ１０ ＶＨ １と組み合わせた。２種類の組合せの滴定曲線を重ね合わることによって、ヒト化型１の１つのバリンからヒト化型２のイソロイシンへと変化した軽鎖残基２の変異により、ＩＧＦ１受容体の認識の相対アフィニティーに及ぼす影響が明らかにないことが分かる。よって、ヒト化型２の７Ｃ１０軽鎖はマウス残基（ＣＤＲとは区別される）が全く保存されない１つの型を形成する。完全にヒト化されたこの型は、７Ｃ１０ ＶＬの好ましい型の典型である。

完全ヒト化型の７Ｃ１０軽鎖（ヒト化型２、上記参照）を３種類のヒト化型の７Ｃ１０重鎖と組み合わせて試験した。図３０は、前もって、ＥＬＩＳＡによりそのＩｇＧ１／ヒトκ濃度を測定した（実施例１７を参照）ｃｏｓ７細胞の上清のＩＧＦ−１Ｒの認識に関するＥＬＩＳＡ試験の結果を示す（実施例１８を参照）。滴定曲線は極めて類似しており、キメラ抗体の参照曲線と実質的に重なり、このことから、３種類のヒト化型１、２および３の７Ｃ１０ ＶＨがヒト化７Ｃ１０ ＶＬ ２と組み合わせた場合にはＩＧＦ−ＩＲに対して同一の相対アフィニティーを与えることが分かる。しかしながら、同時に行ったその他のＥＬＩＳＡ試験（結果は示さない）では、残基７１（Kabatの命名）のアルギニン（マウス）からバリン（ヒト）への点変異には対応する抗体のＩＧＦ−１Ｒに対するアフィニティーの少しの低下を伴うことを明らかにしているが、ヒト化７Ｃ１０ ＶＨ ２がＩＧＦ−１Ｒに対してヒト化７Ｃ１０ ＶＨ １と同じ相対アフィニティーを有すると考えるに値する。よって、このヒト化型２はそれだけが２つのマウスアミノ酸（残基３０および７１、図２４を参照）を有することから型１に対して好ましい。マウス残基（ＣＤＲとは区別される）を全く含まないヒト化型３もまたそれだけがアフィニティーの最小限の低下しか生じないと思われることから好ましい。

要するに、本発明の抗体７Ｃ１０の２種類のヒト化型が特に好ましいと思われる。 ヒト化７Ｃ１０ ＶＨ ２（２つの保存されたマウス残基）とヒト化７Ｃ１０ ＶＬ ２（マウス残基が全く保存されない）との組合せによって構成された型およびヒト化７Ｃ１０ ＶＨ ３（マウス残基が全く保存されない）とヒト化７Ｃ１０ ＶＬ ２（マウス残基が全く保存されない）との組合せによって構成されたもう１つの型。この最後の型は、重鎖および軽鎖に同時に存在するマウス残基がないことから、最終的なヒト化型を構成している。

実施例２０：Ａ５４９細胞の表面におけるＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲの発現
ＩＧＦ−ＩＲおよびＥＧＦＲ各々に対して向けられた２種類のＭＡＢの同時投与によって得られた作用の相乗効果を、Ａ５４９細胞（肺癌細胞系）の皮下注射（ｓ．ｃ．）によって確立された非小細胞肺腫瘍を有するヌードマウスにて調べた。

まず、これをマウスに注入する前のＡ５４９細胞の表面における２つの受容体 ＩＧＦ−ＩＲおよびＥＧＦＲを確認するために、これらの細胞のＦＡＣＳでの読み取りのために標識化をマウス７Ｃ１０抗ＩＧＦ−ＩＲ ＭＡＢ（図３７Ｂ）およびマウス２２５抗ＥＧＦＲ ＭＡＢ（図３７Ｄ)各々で行った。これを行うために、細胞を４℃で３０分間、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）ＰＢＳ溶液で飽和させ、洗浄した後、目的のＭＡＢとともに４℃で３０分間インキュベートした。新たに３回洗浄した後、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）と結合した二次抗種抗体を添加する。３０分間のインキュベーションの後、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別装置）での読み取りを５２０ｎｍにて（励起 ４８８ｎｍ）行う。

図３７Ａ〜３７Ｄにて示された結果からは、Ａ５４９細胞がそれらの表面にＥＧＦおよびＩＧＦ１に対する受容体を同程度の数有していることが分かる。その２つについての各受容体の分布に関しては集団は均一である。イソタイプの対照（図３７Ｃ）を使用することによって標識の特異性を確認する。これらの結果は２種類のＩＧＦ−ＩＲ受容体およびＥＧＦＲ受容体に対する作用の相乗効果の試験用およびこれら２つの受容体の連携の試験用モデルとしてのＡ５４９細胞の使用の正当性を実証するものである。

実施例２１：抗腫瘍処置におけるin vivoにてヌードマウスに同時投与した抗ＩＧＦ−ＩＲ ＭＡＢおよび抗ＥＧＦＲ ＭＡＢの作用の相乗効果
この試験のため、ヌードマウスに５．１０６ Ａ５４９細胞をｓ．ｃ．移植する。細胞移植５日後、腫瘍を測定し、腫瘍体積に関しての均質なマウス群を形成する。この群から、６マウス群をランダムに形成する。これらのマウスを、腹腔内にて（ｉ．ｐ．）、週２回、ＭＡＢ ７Ｃ１０および２２５各々により個別に２５０μｇ／マウスの用量にて、または２種類のＭＡＢの同時投与により処置する。ＭＡＢ ９Ｇ４を試験のイソタイプ対照として投与する。

図３８にて示された結果からは、単独投与した抗体７Ｃ１０および２２５各々によってin vivo腫瘍増殖の有意な減少を誘導することができることが分かる。調べた２種類のＭＡＢが腫瘍Ａ５４９の増殖に対して同等の活性を有することにも注目すべきである。文献に対して驚くべきことに、２種類のＭＡＢの同時投与において観察される有意な相乗効果（ｔ検定での各動態倍率においてｐ≦０．０１ ）によって、in vivoにおける腫瘍の最適増殖に２種類の受容体の連携があること、および、文献でのデータに反して、２つの軸のうちの一方の遮断ではもう１つのものが媒介する増殖を完全に阻害するには不十分であることが示唆される。

実施例２２：Ａ５４９細胞を同所移植したマウスに同時投与されたマウス抗体７Ｃ１０および２２５の抗腫瘍活性の試験
抗腫瘍活性の評価での同所移植モデルの使用は、腫瘍の転移性播種のプロセスに関して特定の利益を提供する。ＩＧＦ−ＩＲおよびＥＧＦＲ各々に対して向けられた抗体混合物の抗腫瘍活性を評価するために、１０６ Ａ５４９細胞（非小細胞肺癌）をヌードマウスの胸腔内に移植した。この種の腫瘍移植がもたらす影響はヒトで観察されるものと同様の転移性播種であり、動物の死を誘導するということも注意すべきである。図３９からは、抗体２２５および７Ｃ１０単独での投与によって観察する生存において同程度の有意な増加がなされることが分かる。驚くべきことに、これら２種類の抗体の同時投与によって動物の生存がかなり増加し、このことにより、この処置が腫瘍細胞の転移性播種に影響を及ぼし得ることが示唆される。

実施例２３：７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭがＩＧＦ−ＩＲおよびＩＲＳ−Ｉのβ鎖のチロシンのリン酸化を阻害する
ＭＣＦ７細胞を５．１０４細胞／ｃｍ２（７５ｃｍ２プレート, COSTAR）にてフェノールレッド不含の、５ｍＭのグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（各々、１００Ｕ／１００μｇ／ｍｌ）および１０％のウシ胎児血清と合せた２０ｍｌのＲＰＭＩで２４時間培養する。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をフェノールレッド不含の、ウシ胎児血清を除き、５ｍＭのグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、０．５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Sigma A-8022）および５μｇ／ｍｌのトランスフェリン（Sigma T8158）と合せた培地（ＲＰＭＩ）で１２時間インキュベートした。

活性化では、細胞をまず、遮断抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で２分間インキュベートした後、ＩＧＦ−Ｉ（Sigma 13769、５０ｎｇ／ｍｌ）をさらに２分間添加した。インキュベーション培地を吸引して反応を停止させ、プレートを氷上に置いた。プロテアーゼ阻害剤（５０ｍｌ当たり１錠剤, Boehringer Ref.: 1697 498）、およびホスファターゼ阻害剤（Calbiochem Ref.: 524625 (1/100))と合せた０．５ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）の添加により細胞を可溶化した。細胞をこすり落とし、懸濁物を回収し、攪拌装置に４℃で１．５時間置いた。この溶液を１２，０００ｒｐｍにて１０分間（４℃）遠心分離し、ＢＣＡによって上清のタンパク質濃度を定量した。

免疫沈降では、細胞溶解物のタンパク質の５００μｇを抗ＩＧＦ−ＩＲ(Santa cruz Ref.: sc-713)と混合し、攪拌装置にて４℃で１．５時間インキュベートした。プロテインＡ−アガロース(Boehringer Ref.: 1 134 515)を添加して免疫沈降物を回収し、攪拌装置にて４℃で一晩中インキュベートした。ＩＲＳ−１の免疫沈降では、アガロースビーズ(Santa cruz Ref.: 559Ac)と結合した抗ＩＲＳ−１抗体を用いた。アガロースビーズを１ｍｌの溶解バッファーで２回、洗浄バッファー１（プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤と合せた５０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５；５００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０；０．０５％デオキシコール酸ナトリウム(Boehringer 1 332 597)）で２回、洗浄バッファー２（プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤１／１００と合せた５０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０；０．０５％デオキシコール酸ナトリウム(Boehringer 1 332 597)）で１回洗浄した。免疫沈降物をＬａｅｍｍｌｉバッファーに再懸濁し、１００℃に５分間加熱した。ポリアクリルアミドＳＤＳゲル（８％Ｎｏｖｅｘ ＥＣ６０１５）での電気泳動により上清を解析した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、その後にＨＲＰと結合した抗ホスホチロシン抗体(upstate Biotechnology 4G10)またはＩＧＦ−ＩＲまたは抗ＩＲＳ−１(Santa Cruz Ref.: sc 8038) のβ抗鎖のいずれか、続いてＨＲＰと結合した抗ウサギ抗体での免疫ブロットを続けた。この影響は化学発光(Amersham RPN 2209)、その後のKodak Ｘ-マットＡＲフィルムでのオートラジオグラフィーによって明らかになった。

図４０Ａは、刺激していないＭＣＦ７細胞（０）またはＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）単独（０＋ＩＧＦ−Ｉ）で刺激したか、またはモノクローナルまたはヒト化抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体（１０μｇ／ｍｌ）７Ｃ１０、１Ｈ７、７Ｈ２ＨＭと組み合わせて刺激したＭＣＦ７細胞を示す。抗体９Ｇ４またはｈＩｇＧ１は試験の負の対照として用いたイソタイプＩｇＧ１のマウスまたはヒト免疫グロブリンである。ＩＧＦ−ＩＲのβ鎖を免疫沈降し、リン酸化抗チロシン抗体を用いてブロットした。得られた結果からは、モノクローナルまたはヒト化抗ＩＧ−ＩＲ ７Ｃ１０、１Ｈ７および７Ｈ２ＨＭ抗体がＩＧＦ−ＩＲのβ鎖のチロシンのリン酸化を阻害することが分かる。

図４０Ｂは、刺激していないＭＣＦ７細胞（０）またはＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）単独（０＋ＩＧＦ−Ｉ）で刺激したか、またはモノクローナルまたはヒト化抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体（１０μｇ／ｍｌ）７Ｃ１０、１Ｈ７、７Ｈ２ＨＭと組み合わせて刺激したＭＣＦ７細胞を示す。上記のように、抗体９Ｇ４またはｈＩｇＧ１は試験の負の対照として用いたイソタイプＩｇＧ１のマウスまたはヒト免疫グロブリンである。ＩＲＳ−１を免疫沈降し、リン酸化抗チロシン抗体を用いてブロットした。得られた結果からは、モノクローナル抗体７Ｃ１０、７Ｈ２ＨＭおよび１Ｈ７がＩＲＳ−１のチロシンのリン酸化を阻害することが分かる。

実施例２４：７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭがＩＧＦ−ＩＲの内在化を誘導する
ＭＣＦ７細胞およびＡ５４９細胞を１０％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中１．１０７細胞／ｍｌに懸濁した。１．１０６細胞を１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体（７Ｃ１０、７Ｇ３、９Ｇ４）または２０μｇ／ｍｌの７Ｈ２ＨＭとともに３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をビオチン化抗ＩＧＦ−ＩＲ（モノクローナル抗体１２Ｂ１）で４℃で３０分間標識し、最後にストレプトアビジン−４８８ ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）の複合体とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を残屑の除去後、ＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアによるＦＡＣＳｃａｎ(Becton-Dickinson,. Enembogegem, Belgium)により解析した。

図４１は、着色のないＡ５４９細胞（第一のピーク）、７Ｃ１０または７Ｈ２ＨＭとともにインキュベートしたＡ５４９細胞（第二のピーク）および無関係のマウスまたはラットのＩｇＧ１とともにインキュベートしたＡ５４９細胞（第３のピーク）を示している。細胞を予め７Ｃ１０または７Ｈ２ＨＭとともにインキュベートした場合に細胞によるＩＧＦ−ＩＲの表面発現の２単位の低下が見られる。

実施例２５：７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭがＩＧＦ−ＩＲの分解を誘導する
ＭＣＦ−７細胞を１０．１０４細胞／ｃｍ２にて（７５ｃｍ２, Costar)１５ｍｌの完全培地で２４時間培養した。次ぎに、この培養物をＰＢＳで３回洗浄し、血清を除いた培地で１２時間インキュベートした。次ぎに、細胞を２５μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド単独とともに、または１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体７Ｃ１０、９Ｇ４、７Ｇ３もしくはＩＧＦ-I（５０ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。特定の試験では、モノクローナル抗体とのインキュベーションの前に、細胞をＭＧ−１３２（１０μＭ, Calbiochem 474791）により３７℃で１時間処置し、プロテアソーム活性を阻害した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、溶解バッファーの添加により可溶化した。２０μｇのタンパク質を８％ＳＤＳのポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により解析し、ニトロセルロース膜に移し、その後、さらに以上に記載のようなＩＧＦ−ＩＲのβ抗鎖免疫ブロットを続けた。

ＩＧＦ−ＩＲの完全性のウエスタンブロットによる解析（図４２Ａ）から、７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭは受容体の分解を誘導するが、天然リガンドは後者の分解を全くもたらさないことが分かる。イソタイプ対照として用いた無関係の抗体９Ｇ４では受容体の分解は認められない。図４２Ｂは、それに関連して、分解がプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２によって（インキュベーション時間 ２時間)阻害されることを実証している。

同様の結果がヒト化抗体７Ｈ２ＨＭでも認められた（図４２Ｃ）。

ＩＧＦ−ＩＲの略図。 ＩＧＦの結合時にＩＧＦ−ＩＲが介在するシグナルの変換のスキーム。 モノクローナル抗体７Ｃ１０によってＭＣＦ−７細胞の表面で発現される天然ＩＧＦ−ＩＲの認識。この試験では、ＭＣＦ−７細胞を７Ｃ１０抗体または負の対照抗体とともにインキュベートした後、蛍光抗種二次抗体を用いて回収する。標識をＦＡＣＳで読み取る。１つ目のヒストグラム（図３Ａ）はＭＣＦ−７細胞単独の場合のものである。２つ目のヒストグラム（図３Ｂ）では、影のついていない曲線が対照イソタイプマウス抗体による非特異的標識に相当する。３つ目のヒストグラム（図３Ｃ）では、影のついていない曲線がＭＡＢ ７Ｃ１０によるＩＧＦ−ＩＲの認識を示す。 ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＲ各々を発現するＳｆ９昆虫細胞の標識。図４Ａは非トランスフェクト細胞単独（１）またはＩＧＦ−ＩＲ（２）またはＩＲ（３）各々を認識する対照のモノクローナル抗体市販品で標識した細胞の標識を示す。図４Ｂでは、ＩＧＦ−ＩＲを特異的に発現するＳｆ９細胞をαＩＲ３（２）または抗ＩＲ（３）で標識し、ピーク（１）は細胞単独のものである。図４Ｃでは、ＩＲを特異的に発現するＳｆ９細胞を抗ＩＲ（３）またはαＩＲ３（２）で標識し、ピーク（１） は細胞単独のものである。 ＩＧＦ−Ｉによって誘導されるＭＣＦ−７細胞の増殖に対する７Ｃ１０抗体の阻害効果。ＭＣＦ−７細胞を漸増濃度のＩＧＦ１の存在下、調べるＭＡＢの存在または不在下でインキュベートする。細胞増殖を３Ｈチミジンの取り込みにより評価する。抗体αＩＲ３市販品を試験の正の対照として用いる。７Ｇ３は増殖に対する活性のないマウス抗ＩＧＦ−ＩＲ ＩｇＧ１であり、対照のイソタイプとして用いる。 図６Ａは、ヌードマウスにおいて確立されたＭＣＦ−７腫瘍の増殖に対するモノクローナル抗体７Ｃ１０のin vivo効果を示す。図６Ｂおよび６Ｃは、各々、Arteaga et al.の出版物(J. Clin. Invest., 84, 1418-1423頁, 1989)およびLi et al.(Cancer Immunol. Immunother., 49, 243-252頁)からの図であり、図６ＢはマウスαＩＲ３（ＩＲ３とも記載）の腫瘍増殖に対する効果を示し、図６Ｃは１Ｈ７抗体由来の組換えｓｃＦｖ−Ｆｃの効果を示す。 腫瘍ＭＣＦ−７のin vivo増殖に対するＭＡｂ ７Ｃ１０の効果とタモキシフェンの効果の比較試験。 in vivo腫瘍細胞の異なる異種移植片モデルにおけるマウス抗体７Ｃ１０の抗腫瘍活性の試験。図８Ａは骨肉腫モデルＳＫ−ＥＳ−１で得られた結果を示し、図８Ｂはアンドロゲン非依存性前立腺腫瘍ＤＵ−１４５、図８Ｃは非小細胞肺腫瘍Ａ５４９モデルに関するものである。これら３種類のモデルでは、週２回、ｉ．ｐ．にて、２５０μｇ／１回用量／マウスの割合で処置を行った。曲線７Ｇ３、ＥＣ２および９Ｇ４は各々、各モデルの試験の対照のイソタイプとして用いた３種類のマウスＩｇＧ１に相当する。 ナベルビン（ビノレルビン）と比較したＭＡｂ ７Ｃ１０の抗腫瘍効果の試験、ならびに系統Ａ５４９のin vivo増殖に対する２種類の化合物の相乗効果。 ＭＣＦ−７細胞によって誘導されるＩＧＦ−２増殖に対するＭＡｂ αＩＲＳ３、７Ｃ１０および１Ｈ７の比較活性。 ＭＣＦ−７細胞のＩＧＦ１増殖のin vitro阻害についてのマウス７Ｃ１０およびキメラＣ７Ｃ１０ ＭＡｂの比較。抗体９Ｇ４は試験の対照のイソタイプとして用いたマウスＩｇＧ１である。 ＭＣＦ−７細胞のＩＧＦ１誘導性増殖のin vitroモデルに対する７Ｃ１０およびｈ７Ｃ１０ ＭＡｂ（ヒト化１、本明細書においては７Ｈ２ＨＭと記載）の比較効果。 ＩＧＦ１によって誘導されるシグナルの変換に対する７Ｃ１０およびｈ７Ｃ１０ ＭＡｂ（ヒト化１、本明細書においては７Ｈ２ＨＭと記載）の効果。１列目のスポットは抗ホスホチロシン抗体により、ＩＧＦ１単独の存在下、または調べる種々の抗体と組み合わせたＩＧＦ１の存在下でインキュベートした細胞の免疫沈降したβ鎖のリン酸化を示したものである。９Ｇ４およびｈＩｇＧ１は各々、７Ｃ１０およびｈ７Ｃ１０（７Ｈ２ＨＭとも記載）型の対照イソタイプである。２列目のスポットはβ鎖を示すものであり、ウェル全てに入れられた量が完全に等しいことを示している。 ｃＤＮＡ配列（配列番号４８）、その相補鎖配列（配列番号５０）およびアミノ酸へのその翻訳配列（配列番号４９）、プライマーＭＫＶ−１およびＭＫＣを用いてマウスハイブリドーマ７Ｃ１０から増幅したＰＣＲ断片配列、ならびに３’末端のリーダーペプチドおよび７Ｃ１０ ＶＬをコードする配列。 ｃＤＮＡ配列（配列番号５１）、その相補鎖配列（配列番号５３）およびアミノ酸へのその翻訳配列（配列番号５２）、プライマー ＭＨＶ−１２およびＭＨＣ−１、またはＭＨＶ−８およびＭＨＣ−１を用いてマウスハイブリドーマ７Ｃ１０から増幅したＰＣＲ断片配列、ならびに３’末端のリーダーペプチドおよび７Ｃ１０ ＶＨをコードする配列。 Ｃ７Ｃ１０とも呼ばれるキメラ抗体７Ｃ１０（ｃｏｓ７−トランスフェクト細胞培養物の上清）による１ＧＦ−１受容体の認識。 マウス７Ｃ１０ ＶＬのアミノ酸配列（配列番号５４）の最高の配列相同性を有するその他のマウス抗体の細胞との比較。アミノ酸の番号付けはKabat et al. (1991)のものである。７Ｃ１０ ＶＬおよびKabat マウスサブグループＩＩ（配列番号５７）間で異なるフレームワーク領域（ＣＤＲの外側）内の残基に下線を付けている。ドットは７Ｃ１０ ＶＬの配列と比較して、その位置では残基が同一であることを示す。ＤＲＢ１−４．３（配列番号５５）は抗ヒトマウス抗体ＭＨＣクラスＩＩ Ｂ鎖軽鎖の配列（Kabatデータバンクでのアクセス番号はＮ０１１７９４である）を表す。Ｃ９４−５Ｂ１１’ＣＬ（配列番号５６）はマウス抗体軽鎖の配列（Kabatデータバンクでのアクセス番号はＰ０１９３１４である）を表す。 マウス７Ｃ１０ ＶＬのアミノ酸配列（配列番号５４）のKabat ヒトサブグループＩＩ（配列番号６０）に属し、最高の配列相同性を有するヒト軽鎖の細胞との比較。アミノ酸配列をアラインし、マウス７Ｃ１０ ＶＬのものと比較する。ドットは７Ｃ１０ ＶＬの配列と比較して、その位置では残基が同一であることを示す。ＧＭ６０７（配列番号５８）はヒトリンパ芽球様細胞系統ＧＭ６０７によって分泌されるκ軽鎖の配列（Klobeck et al., Nucleic acids Res., 12: 6995-7006頁, 1984aおよびKlobeck et al., Nature, 309: 73-76頁, l984b、Kabatデータバンクでのアクセス番号はＮ０１１６０６である）を表す。ＤＰＫ１５／Ａ１９（配列番号５９）はヒトＶ生殖細胞系統κ ＩＩの配列を表す。 マウス７Ｃ１０（配列番号５４）、ヒト抗体ＧＭ６０７（配列番号５８）および２種類のヒト化７Ｃ１０ １および２（配列番号６１および６５）の軽鎖（ＶＬ）可変領域のアミノ酸配列の比較。アミノ酸配列をアラインし、マウス７Ｃ１０ ＶＬのものと比較する。ドットは７Ｃ１０ ＶＬの配列と比較して、その位置では残基が同一であることを示す。ＧＭ６０７はヒトリンパ芽球様細胞系統ＧＭ６０７によって分泌されるκ軽鎖の配列（Klobeck et al., 1984aおよびl984b、Kabatデータバンクでのアクセス番号：Ｎ０１１６０６）を表す。 リーダーペプチドおよびヒト化型１の７Ｃ１０ ＶＬのde novoアセンブリコーディングによって構築された遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号６２）、その相補鎖（配列番号６４）およびアミノ酸へのその翻訳（配列番号６３）。 リーダーペプチドおよびヒト化型２の７Ｃ１０ ＶＬのde novoアセンブリコーディングによって構築された遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号６６）、その相補鎖（配列番号６８）およびアミノ酸へのその翻訳（配列番号６７）。 マウス７Ｃ１０ ＶＨのアミノ酸配列（配列番号６９）のKabat マウスサブグループＩ（Ａ）に属し、最高の配列相同性を有するヒトマウス重鎖のものとの比較。アミノ酸の番号付けはKabat et al. (1991)のものである。７Ｃ１０ ＶＨおよびKabat マウスサブグループＩ（Ａ）（配列番号７１）間で異なるフレームワーク領域（ＣＤＲの外側）内の残基に下線を付けている。ドットはマウス７Ｃ１０ ＶＨの配列と比較して、その位置では残基が同一であることを示す。ＡＮ０３’ＣＬ（配列番号７０）はマウス抗体重鎖の配列（Kabatデータバンクでのアクセス番号：Ｐ００１２８９）を表す。 マウス７Ｃ１０ ＶＨのアミノ酸配列（配列番号６９）の Kabat ヒトサブグループ ＩＩ（配列番号７２）に属し、最高の配列相同性を有するヒト重鎖のものとの比較。下線を付けた残基はChothia et al. (1989)によって定義された正規構造の一部である。ドットはマウス７Ｃ１０ ＶＨ配列と比較して、その位置では残基が同一であることを示す。ヒトＶＨ ＦＵＲ１’ＣＬ（配列番号７３）は自己免疫性ヒト抗ラミンＢ抗体ＩｇＭ／Ｋの重鎖の配列(Mariette et al., Arthritis and Rheumatism, 36: 1315-1324頁, 1993; Kabatでのアクセス番号：Ｎ０２０６１）を表す。ヒト生殖細胞系列（配列番号７４）はヒト生殖細胞系統４．２２ ＶＨ ＩＶの配列(Sanz et al., EMBO. J. 8: 3741-3748頁, 1989)を表す。 マウス７Ｃ１０（配列番号６９）および３種類のＣＤＲ移植によるヒト化によるヒト化型ＶＨ１、２および３（各々、配列番号７５、７９および８３）の重鎖（ＶＨ）可変領域のアミノ酸配列の比較。残基の番号付けはKabatのものである。配列をアラインし、マウス７Ｃ１０ ＶＨのものと比較する。ドットはマウス７Ｃ１０ ＶＨの配列と比較して、その位置では残基が同一であることを示す。 リーダーペプチドおよびヒト化型１の７Ｃ１０ ＶＨのde novoアセンブリコーディングによって構築された遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号７６）、その相補鎖（配列番号７８）およびアミノ酸へのその翻訳（配列番号７７）。 リーダーペプチドおよびヒト化型２の７Ｃ１０ ＶＨのde novoアセンブリコーディングによって構築された遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号８０）、その相補鎖（配列番号８２）およびアミノ酸へのその翻訳（配列番号８１）。 リーダーペプチドおよびヒト化型３の７Ｃ１０ ＶＨのde novoアセンブリコーディングによって構築された遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号８４）、その相補鎖（配列番号８６）およびアミノ酸へのその翻訳（配列番号８５）。 ＥＬＩＳＡにおけるキメラ抗体７Ｃ１０（「Ｃ７Ｃ１０」と呼ばれる）およびそのヒト化型１（７Ｃ１０ ｈｕｍ１）によるＩＧＦ−１受容体の認識活性の比較。 ＥＬＩＳＡにおけるヒト化型１および２の７Ｃ１０抗体軽鎖のＩＧＦ−１受容体の認識活性に対する影響。 ＥＬＩＳＡにおけるキメラ抗体７Ｃ１０およびヒト化７Ｃ１０ ＶＬ ２と組み合わせた３種類のヒト化型の重鎖（７Ｃ１０ ｈｕｍ１、２および３）によるＩＧＦ−１受容体の認識活性の比較。 同所移植モデルＡ５４９における７Ｃ１０抗体の抗腫瘍活性。 抗体７Ｈ２ＨＭの存在下で４時間培養したＡ５４９およびＭＣＦ−７細胞レベルで観察されたＡＤＣＣの試験（各々、図３２Ｃおよび３２Ｄ）。細胞Ａ５４９およびＭＣＦ−７に対する試験の正の対照として抗体ｈ４Ｄ５を同時に用いる（各々、図３２Ａおよび３２Ｂ）。 ＭＣＦ−７細胞の細胞周期に対する抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭの効果。図３３ＡはＩＧＦ１の不在下でのＧ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期のＭＣＦ−７細胞の割合を示し、観察したＭＣＦ−７細胞全体に占める有意な割合を表す。図３３ＢはＩＧＦ１の存在下でのＧ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期のＭＣＦ−７細胞の割合を示し、観察したＭＣＦ−７細胞全体に占める割合を表す。図３３ＣはＩＧＦ１の不在下で対照サンプル（「０」）と比較した図に示す化合物の存在下でのＳ（黒四角）およびＧ２／Ｍ（白四角）期のＭＣＦ−７細胞の割合を示し、観察したＭＣＦ−７細胞全体に占める割合を表す。 Ａ５４９細胞のin vitro増殖（図３４Ａ）およびＭＣＦ−７細胞のin vivo増殖（図３４Ｂ）に対する抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭの比較効果。 in vivoモデルＡ５４９に対する、ナベルビン（ＮＡ）と組み合わせた抗体７Ｈ２ＨＭの対照サンプルと比較した相乗効果の試験。図３５Ａは処置の開始から約５０日かけて行った処置に応じた、移植した腫瘍の容積の拡大を示す（図３５Ａ）。図３５Ｂは、特に、約４８日にて比較したこの拡大について得られた結果を示す。この図では、抗体 ７Ｃ１０で得られた結果が比較として導入されている（アスタリスク（＊）はｔ検定における比較対照群／群（７Ｃ１０＋Ｎａ）または対照群／群（７Ｈ２１１Ｍ＋Ｎａ）に相当する）。 アポトーシスに対する抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭの効果の試験。この図は抗体７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭによるドキソルビシンの効果の増強を示す（ドキソルビシン ２μｇ／ｍｌ）。 ＦＡＣＳにおける標識によるＡ５４９細胞表面のＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲの存在の証明。 腫瘍Ａ５４９のin vivo増殖に対するＭＡＢ ７Ｃ１０および２２５の同時投与の効果。 Ａ５４９細胞を同所移植したマウスの生存に対するＭＡＢ ７Ｃ１０および２２５の同時投与の効果。 ＭＡＢ ７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭによるＩＧＦ−ＩＲβ鎖およびＩＲＳ−１β鎖のチロシンリン酸化の阻害の証明。 ＭＡＢ ７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭによるＩＧＦ−ＩＲの内在化誘導の証明。 ＭＡＢ ７Ｃ１０および７Ｈ２ＨＭによるＩＧＦ−ＩＲ分解の証明。

Claims (50)

1. ヒトインスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）と結合することができる、単離された抗体またはその機能的断片であって、
   配列番号２、４および６の配列の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる軽鎖、ならびに配列番号８、１０および１２の配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる、単離された抗体またはその機能的断片。
2. 機能的断片が、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ'断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片およびダイアボディから選択されるもの、またはそのペグ化物である、請求項１に記載の抗体またはその機能的断片。
3. ２００１年９月１９日にＣＮＣＭ（Institut Pasteur, Paris）に番号Ｉ−２７１７として寄託された、請求項１に記載の抗体を分泌することができる、マウスハイブリドーマ。
4. 請求項３に記載のハイブリドーマによって分泌される抗体またはその機能的断片。
5. 前記抗体が、配列番号５４のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖、および配列番号６９のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖を含んでなるものである、請求項１に記載の抗体またはその機能的断片。
6. 前記抗体がキメラ抗体であり、マウスとは異種の種の抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域をさらに含んでなるものである、請求項５に記載の抗体またはその機能的断片。
7. 異種の種がヒトである、請求項６に記載のキメラ抗体またはその機能的断片。
8. ヒト抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域が、それぞれκ領域およびγ−１、γ−２またはγ-４領域である、請求項６または７に記載のキメラ抗体またはその機能的断片。
9. 前記抗体がヒト化抗体であり、軽鎖および／または重鎖の骨格セグメントＦＲ１〜ＦＲ４が、それぞれヒト抗体軽鎖および／または重鎖の骨格セグメントＦＲ１〜ＦＲ４に由来するものである軽鎖および／または重鎖を含んでなるものである、請求項１に記載の抗体またはその機能的断片。
10. 前記抗体が、配列番号６１もしくは６５のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖、および配列番号７５、７９もしくは８３のアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含んでなるものである、請求項１に記載のヒト化抗体またはその機能的断片。
11. 前記抗体が、配列番号６５のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖、および配列番号７９または８３のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖を含んでなるものである、請求項９または１０に記載のヒト化抗体またはその機能的断片。
12. 前記抗体が、配列番号６５のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖、および配列番号８３のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖を含んでなるものである、請求項９または１０に記載のヒト化抗体またはその機能的断片。
13. 以下の核酸：
    （ａ）請求項１、２および４〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ、および
    （ｂ）前記（ａ）に記載の核酸に相補的な核酸、
    から選択される、単離された核酸。
14. 請求項１３に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
15. 請求項１４に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
16. 請求項１４に記載のベクターによって形質転換された少なくとも１つの細胞を含んでなる、ヒトを除くトランスジェニック動物。
17. 以下の工程：
    （ａ）請求項１５に記載の細胞を、培地および好適な培養条件において培養する工程、および
    （ｂ）このようにして産生した抗体またはその機能的断片を、培養培地または培養した前記細胞から回収する工程
    を含んでなる、請求項１、２および５〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片の製造方法。
18. さらに、ヒト上皮細胞増殖因子受容体と特異的に結合することができ、および／またはそのＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができるものであり、かつ、
    二重特異性抗体からなるものであり、かつ、ＥＧＦのヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）との結合を特異的に阻害し、および／またはそのＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害する、抗ＥＧＦＲ抗体に由来する第二のモチーフを含んでなるものである、
    請求項１に記載の抗体またはその機能的断片。
19. 二価または四価である、請求項１８に記載の抗体。
20. 第二のモチーフが、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’ＰＥＧ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片およびダイアボディから選択されるものである、請求項１８に記載の抗体。
21. 第二のモチーフが抗ＥＧＦＲモチーフであり、該抗ＥＧＦＲモチーフが、マウスモノクローナル抗体２２５、そのマウス−ヒトキメラ誘導体Ｃ２２５、またはこの抗体２２５由来のヒト化抗体に由来するものである、請求項１８または２０に記載の抗体。
22. 薬剤としての、請求項１、２、５〜１２および１８〜２１のいずれか一項に記載の、または請求項１７に記載の方法によって製造される、抗体またはその機能的断片。
23. 有効成分として、請求項１、２、５〜１２および１８〜２１のいずれか一項に記載の、または請求項１７に記載の方法によって製造される抗体またはその機能的断片からなる化合物を含んでなる、組成物。
24. ＥＧＦのヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）との結合を特異的に阻害することができ、および／またはそのＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる化合物から選択される第二の化合物を含んでなり、
    第二の化合物が、ＥＧＦのＥＧＦＲとの結合を競合によって阻害することができる単離された抗ＥＧＦＲ抗体またはその機能的断片から選択されるものである、請求項２３に記載の組成物。
25. 抗ＥＧＦＲ抗体が、モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体、キメラ抗ＥＧＦＲ抗体もしくはヒト化抗ＥＧＦＲ抗体、またはその機能的断片から選択されるものである、請求項２４に記載の組成物。
26. 抗ＥＧＦＲ抗体の機能的断片が、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ'断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片およびダイアボディから選択されるもの、またはそのペグ化物である、請求項２４または２５に記載の組成物。
27. 抗ＥＧＦＲ抗体が、マウスモノクローナル抗体２２５、そのマウス−ヒトキメラ誘導体Ｃ２２５、または前記抗体２２５由来のヒト化抗体である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
28. 同時使用、個別使用または逐次使用を目的とした組合せ製品として、細胞傷害性薬剤／細胞増殖抑制剤、ならびに／またはＩＧＦ−Ｉに対する受容体および／もしくはＥＧＦに対する受容体のそれぞれのチロシンキナーゼ活性の阻害剤をさらに含んでなる、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
29. 細胞傷害性薬剤／細胞増殖抑制剤が、ＤＮＡと相互作用する薬剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼＩもしくはＩＩ阻害剤、または紡錘体形成阻害剤もしくは安定化剤、あるいは化学療法に用いることができる薬剤から選択されるものである、請求項２８に記載の組成物。
30. 細胞傷害性薬剤／細胞増殖抑制剤が、同時使用を目的とした組成物の少なくとも１つのエレメントと化学的に結合しているものである、請求項２８または２９に記載の組成物。
31. 細胞傷害性薬剤／細胞増殖抑制剤が、紡錘体形成阻害剤および安定化剤から選択されるものである、請求項２９または３０に記載の組成物。
32. 細胞傷害性薬剤／細胞増殖抑制剤が、ビノレルビン、ビンフルニンおよびビンクリスチンから選択されるものである、請求項２９または３０に記載の組成物。
33. ＩＧＦ−Ｉに対する受容体および／またはＥＧＦに対する受容体のそれぞれのチロシンキナーゼ活性の阻害剤が、誘導天然薬剤、ジアニリノフタルイミド、ピラゾロ−もしくはピロロピリドピリミジンまたはキナジリンからなる群から選択されるものである、請求項２８に記載の組成物。
34. 癌の予防および治療に向けた同時使用、個別使用または逐次使用を目的とした組合せ製品として、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の細胞外ドメインに対する他の抗体化合物をさらに含んでなる、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
35. ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の細胞膜外ドメインに対する抗体が、トラスツズマブ、またはその機能的断片である、請求項３４に記載の組成物。
36. 抗体またはその機能的断片の少なくとも１つが、細胞毒素および／または放射性元素と結合しているものである、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
37. 薬剤としての、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
38. ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現および／もしくは異常な活性化に関連した病気、ならびに／またはＩＧＦ１もしくはＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲとの相互作用が介在するシグナル変換経路の過反応に関連した病気の予防または治療に向けた薬剤の製造のための、請求項１、２、５〜１２および１８〜２１のいずれか一項に記載の、または請求項１７に記載の方法によって製造される抗体もしくはその機能的断片、または請求項２３〜３７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
39. 腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害することを目的とした薬剤の製造のための、請求項３８に記載の使用。
40. 腫瘍ＩＧＦ依存性細胞の成長および／または増殖を阻害することを目的とした薬剤の製造のための、請求項３９に記載の使用。
41. 腫瘍ＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２依存性細胞の成長および／または増殖を阻害することを目的とした薬剤の製造のための、請求項４０に記載の使用。
42. 癌の予防および治療を目的とする薬剤の製造のための、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の使用。
43. 癌が、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌または結腸癌から選択される癌である、請求項４２に記載の使用。
44. 乾癬の予防および治療を目的とする薬剤の製造のための、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の使用。
45. ＩＧＦ−ＩＲの異常な存在が疑われる生物学的サンプルから、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現または過少発現によって引き起こされる病気をin vitroで検出する方法であって、
    前記生物学的サンプルを、請求項１、２、４〜１２および１８〜２１のいずれか一項に記載の、または請求項１７に記載の方法によって製造される抗体と接触させることを特徴とする、方法。
46. 前記抗体が標識されている、請求項４５に記載の方法。
47. ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現もしくは過少発現によって引き起こされる病気の診断方法、または生物学的サンプルのＩＧＦ−ＩＲの過剰発現もしくは過少発現の検出方法および／もしくは定量方法を実施するためのキットであって、請求項１、２、４〜１２および１８〜２１のいずれか一項に記載の、または請求項１７に記載の方法によって製造される抗体またはその機能的断片を含んでなる、キット。
48. ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現によって引き起こされる病気の診断方法、または生物学的サンプルのＩＧＦ−ＩＲの過剰発現の検出方法および／もしくは定量方法を実施するための、請求項４７に記載のキット。
49. 免疫学的反応に適した培地を形成するための試薬、および／または免疫学的反応によって生じるＩＧＦ−ＩＲ／抗体複合体の実証を可能にする試薬をさらに含んでなる、請求項４７または４８に記載のキット。
50. 生物活性のある化合物の、ＩＧＦ−ＩＲを発現または過剰発現する細胞への特異的ターゲッティングを目的とする薬剤の製造のための、請求項１、２、４〜１２および１８〜２１のいずれか一項に記載の、または請求項１７に記載の方法によって製造される抗体またはその機能的断片の使用。

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