MXPA04006980A

MXPA04006980A - Anticuerpos novedosos anti-receptor del factor de crecimiento i tipo insulina, y usos de los mismos.

Info

Publication number: MXPA04006980A
Application number: MXPA04006980A
Authority: MX
Inventors: Olivier Leger
Original assignee: Pf Medicament
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2003-01-20
Publication date: 2004-11-10
Also published as: WO2003059951A2; CA2473039A1; DE60312639D1; DK1461359T3; SI1461359T1; ZA200405402B; AU2003216748A1; JP4606739B2; BRPI0306973B8; JP2010233575A; WO2003059951A8; CA2473039C; ATE357460T1; EP1806364B1; EP1798242A2; EP1806364A3; CN100410275C; ES2427964T3; AU2009201674B2; EP1461359B1

Abstract

La invencion se refiere a anticuerpos novedosos capaces de unirse especificamente al receptor del factor de crecimiento I tipo insulina (IGF-FR) de humano, en particular anticuerpos monoclonales de murino, quimericos y humanizados, asi como las secuencias de aminoacidos y de acido nucleico que codifican para dichos anticuerpos; la invencion se refiere tambien al uso de dichos anticuerpos como medicamento para tratamientos profilacticos y/o terapeuticos de canceres, asi como metodos o equipo para el diagnostico de enfermedades relacionadas con la sobreexpresion del receptor IGF-IR; la invencion se refiere ademas a productos y/o composiciones que contienen dichos anticuerpos combinados con anticuerpos anti-EGFR, y/o compuestos y/o agentes anticancerosos o conjugados con toxinas, y a su uso para prevenir y/o tratar ciertos canceres.

Description

ANTICUERPOS NOVEDOSOS ANTI-RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO I TIPO INSULINA. Y USOS DE LOS MISMOS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a anticuerpos novedosos capaces de unirse específicamente al receptor del factor de crecimiento I tipo insulina IGF-IR de humano, y/o capaces de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor IGF-IR, especialmente anticuerpos monoclonales de murino, quiméricos y humanizados, así como las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico que codifican para estos anticuerpos. La invención comprende asimismo el uso de estos anticuerpos como un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cánceres que sobreexpresan al IGF-IR, o cualquier patología relacionada con la sobreexpresión de dicho receptor, así como en procedimientos o equipos para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la sobreexpresión del receptor IGF-IR. La invención comprende finalmente productos y/o composiciones que comprenden dichos anticuerpos en combinación con anticuerpos anti-EGFR, y/o compuestos y/o agentes anticancerosos o agentes conjugados con toxinas, y su uso para la prevención y/o el tratamiento de ciertos cánceres. El receptor del factor de crecimiento I tipo insulina denominado IGF-IR, es un receptor con actividad de tirosina cinasa que tiene 70% de homología con el receptor de insulina IR. El IGF-IR es una glucoproteina de peso molecular de aproximadamente 350,000. Es un receptor heterotetramérico del cual cada mitad - enlazada por puentes disulfuro -comprende una subunidad alfa extracelular y/o una subunidad beta de transmembrana (véase la figura 1 ). El IGF-IR se une a IGF I e IGF II con una afinidad muy alta (Kd #1 nM), pero es igualmente capaz de unirse a la insulina con una afinidad 100 a 1000 veces menor. A la inversa, el IR se une a la insulina con una afinidad muy alta, aunque los IGFs se unen sólo al receptor de insulina con una afinidad 100 veces menor. El dominio de tirosina cinasa del IGF-IR y del IR tiene una homología de secuencias muy alta, aunque las zonas de homología más débil se refieren respectivamente a la región rica en cisteína situada en la subunidad alfa y la parte C-terminal de la subunidad beta. Las diferencias de secuencia observadas en la subunidad alfa se sitúan en la zona de unión de los ligandos, y están por lo tanto en el origen de las afinidades relativas del IGF-IR y del IR para los IGFs e insulina, respectivamente. Las diferencias en la parte C-terminal de la subunidad beta resultan en una divergencia en las vías de señalización de los dos receptores; el IGF-IR mediando diferenciación mitogénica y efectos antiapoptosis, mientras que la activación del IR implica principalmente efectos a nivel de las vías metabólicas (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332: F105-126, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253: 1-6, 1999). Las proteínas tirosina cinasas citoplásmicas son activadas por la unión del ligando al dominio extracelular del receptor. La activación de las cimasas, a su vez, implica la estimulación de diferentes substratos intracelulares, incluyendo IRS-1 , IRS-2, Shc y Grb 10 (Peruzzi F. et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol., 125: 166-173, 1999). Los dos substratos principales del IGF-IR son IRS y Shc que median, mediante la activación de numerosos efectores hacia el extremo 3', la mayoría de los efectos de crecimiento y diferenciación relacionados con la unión de los IGFs a este receptor (figura 2). La disponibilidad de substratos puede determinar en consecuencia el efecto biológico final relacionado con la activación del IGF-IR. Cuando IRS-1 predomina, las células tienden a proliferar y a transformarse. Cuando Shc domina, las células tienden a diferenciarse (Valentinis B. et al., J. Biol. Chem. 274: 12423-12430, 1999). Parecer ser que la vía que interviene principalmente en los efectos de protección contra la apoptosis, es la vía de fosfatidil-inositol 3-cinasas (Pl 3-cinasas) (Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31 : 80-89, 1999; Peruzzi F. et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol., 125: 166-173, 1999). La función del sistema de IGF en carcinogénesis se ha vuelto el tema de investigación intensiva en los últimos diez años. Este interés siguió al descubrimiento del hecho de que además de sus propiedades mitogénicas y antiapoptosis, el IGF-IR parece requerirse para el establecimiento y el mantenimiento de fenotipo transformado. De hecho, se ha establecido bien que una sobreexpresión o una activación constitutiva del IGF-IR lleva, en una gran variedad de células, a un crecimiento de las células independiente del soporte en medios carentes de suero de ternera fetal, y a la formación de tumores en ratones desnudos. Esta no es en sí misma una propiedad única, puesto que una gran variedad de productos de genes sobreexpresados puede transformar células, incluyendo un buen número de receptores de factores de crecimiento. Sin embargo, el descubrimiento crucial que ha demostrado claramente la función importante desempeñada por el IGF-IR en la transformación, ha sido la demostración de que las células R, en las cuales el gen que codifica para el IGF-IR ha sido inactivado, son totalmente refractarias a la transformación por diferentes agentes que son usualmente capaces de transformar las células, tales como la proteína E5 del virus del papiloma de bovinos, una sobreexpresión del EGFR o del PDGFR, el antígeno T de SV 40, RAS activado, o la combinación de estos dos últimos factores (Sell C. et al., Proc. Nati. Acad. ScL, USA, 90: 1 1217-1 1221 , 1993; Sell C. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 3604-3612, 1994; Morrione A. J., Virol., 69: 5300-5303, 1995; Coppola D. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 4588-4595, 1994; DeAngelis T et al., J. Cell. Physiol., 164: 214-221 , 1995). El IGF-IR se expresa en una gran variedad de tumores y de líneas de tumores, y los IGFs amplifican el crecimiento del tumor mediante su unión al IGF-IR. Otros argumentos a favor de la función del IGF-IR en carcinogénesis, provienen de estudios que usan anticuerpos monoclonales de murino dirigidos contra el receptor, o el uso de dominantes negativos del IGF-IR. En efecto, los anticuerpos monoclonales de murino dirigidos contra el IGF-IR inhiben la proliferación de numerosas líneas de células en cultivo, y el crecimiento de células tumorales ¡n vivo (Arteaga C. et al., Cáncer Res., 49: 6237-6241 , 1989; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 196: 92-98, 1993; Zia F et al., J. Cell. Biol., 24: 269-275, 1996; Scotlandi K et al., Cáncer Res., 58: 4127-4131 , 1998). Asimismo, se ha mostrado en los trabajos de Jiang et al. (Oncogene, 18: 6071 -6077, 1999), que un dominante negativo del IGF-IR es capaz de inhibir la proliferación de tumores. El objetivo de la presente invención, es poder contar con un anticuerpo monoclonal de murino, de preferencia un anticuerpo quimerizado o humanizado, que reconocerá al IGF-IR específicamente y con gran afinidad. Este anticuerpo interactuará poco o en lo absoluto con el receptor IR en la insulina. Su unión será capaz de inhibir in vitro el crecimiento de tumores que expresan al IGF-IR, interactuando principalmente con las vías de transducción de señales activadas durante las interacciones IGF1/IGF-IR e IGF2/IGF-IR. Este anticuerpo será capaz de ser activo in vivo en todos los tipos de tumores que expresan al IGF-IR, incluyendo tumores de mama y de próstata dependientes de estrógeno, que no es el caso para los anticuerpos monoclonales anti-IGF-IR (escritos como Ab o MAB) disponibles actualmente. En efecto, alR3, que se refiere al dominio del IGF-IR, inhibe totalmente el crecimiento de tumores de mama dependiente de estrógeno (MCF-7) in vitro, pero carece de efecto sobre el modelo correspondiente in vivo (Arteaga C. et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989). De la misma forma, el fragmento scFv-Fc derivado del anticuerpo monoclonal de murino 1 H7, es sólo débilmente activo en el tumor de mama MCF-7, y totalmente inactivo sobre un tumor de próstata independiente de andrógenos (Li S. L. et al., Cáncer Immunol. Immunother., 49: 243-252, 2000).

En forma sorprendente, los inventores han demostrado un anticuerpo quimérico (denominado C7C10), y dos anticuerpos humanizados denominados respectivamente forma humanizada 1 de h7C10 y forma humanizada 2 de h7C10, derivados del anticuerpo monoclonal de murino 7C10, que reconoce al IGF-IR y que corresponde a todos los criterios enunciados anteriormente, es decir, a una falta de reconocimiento del receptor en la insulina, a un bloqueo in vitro de la proliferación inducida por IGF1 y/o IGF2 pero, en forma similar, a la inhibición in vivo del crecimiento de diferentes tumores que expresan al IGF-IR, entre los cuales están un osteosarcoma y un tumor pulmonar de células no pequeñas, pero en forma similar, y más particularmente, el tumor de mama MCF-7 dependiente de estrógeno, y un tumor de próstata DU-145 independiente de andrógenos. De la misma forma, y en forma sorprendente, la intensidad de inhibición del crecimiento de tumores de células MCF-7 in vivo por el anticuerpo 7C10 es comparable, o aún significativamente superior, a la observada con tamoxifeno, uno de los compuestos de referencia en el tratamiento de tumores de mama dependientes de estrógeno. Además, se ha mostrado que estos anticuerpos inhiben la fosforilación de la tirosina de la cadena beta del IGF-IR y de IRS1 , el primer substrato del receptor. Además, se ha establecido en forma similar que estos anticuerpos causan la incorporación de dicho receptor y su degradación contraria a lo que se observó usualmente con ligandos naturales que permiten la recirculación rápida del receptor sobre la superficie de las células. Se ha podido caracterizar estos anticuerpos por su secuencia peptídica y nucleica, especialmente por la secuencia de sus regiones que determinan su complementariedad (CDR) por el IGF-IR. De esta manera, de conformidad con una primera modalidad, una materia de la presente invención es un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos mencionados siendo capaz de unirse específicamente al receptor del factor de crecimiento I tipo insulina de humano y, si es necesario, de preferencia además capaz de inhibir la unión natural de los ligandos IGF1 y/o IGF2 del IGF-IR, y/o capaz de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor IGF-IR, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una región determinante de complementariedad CDR seleccionada de las CDRs de secuencia de aminoácidos SEQ ID Nos. 2, 4 ó 6, o por lo menos una CDR cuya secuencia tenga por lo menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID Nos. 2, 4 ó 6, o porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una CDR seleccionada de las CDRs de secuencia de aminoácidos SEQ ID Nos. 8, 10 y 12, o por lo menos una CDR cuya secuencia tiene por lo menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 8, 10 y 12. En la presente descripción, los términos polipéptidos, secuencias polipeptídicas, péptidos y proteínas unidos a compuestos de anticuerpos o a su secuencia, son recíprocos.

Debe entenderse aquí que la invención no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir, no están en su ambiente natural, pero se ha podido aislarlos u obtenerlos mediante purificación de fuentes naturales, o se han podido obtener también mediante recombinación genética, o mediante síntesis química, y pueden contener entonces aminoácidos no naturales como se describirá más adelante. Por región CDR o CDR, se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas, como es definido por Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a. ed., U. S. Departament of Health and Human Services, NIH, 1991 , y últimas ediciones). Existen 3 CDRs de cadena pesada y 3 CDRs de cadena ligera. El término CDR o CDRs se usa en la presente para indicar, de acuerdo al caso, una de estas regiones o varias regiones, o incluso el total de estas regiones, que contienen la mayoría de los residuos de aminoácido responsables de la unión por afinidad del anticuerpo al antígeno o el epítope al cual reconoce. Por "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos en el sentido de la presente invención, se pretende indicar un porcentaje de nucleótidos o de residuos de aminoácido idénticos entre las dos secuencias que se van a comparar, obtenido después de la mejor alineación (alineación óptima), este porcentaje siendo meramente estadístico, y las diferencias entre las dos secuencias siendo distribuidas aleatoriamente y sobre su longitud completa. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico, se llevan a cabo tradicionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineado en una forma óptima, dicha comparación siendo capaz de llevarse a cabo por segmento o por "ventana de comparación ". La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de manualmente, usando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981 ) [Ad. App. Math. 2: 482], mediante el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444), mediante programas de cómputo que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programas de genética Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl, o también mediante el programa de comparación BLAST N o BLAST P). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas en una forma óptima, y en la cual la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos que se va a comparar puede comprender adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para una alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas para las cuales el nucleótido o el residuo de aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado obtenido por 100, para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias. Por ejemplo, es posible usar el programa BLAST, "secuencias de BLAST 2" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250), disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html. los parámetros usados siendo dados por omisión (en particular para los parámetros "penalidad de espacio abierto": 5, y "penalidad de espacio de extensión": 2; la matriz elegida siendo, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias que se van a comparar siendo calculado directamente por el programa. En el caso de secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia, se prefieren aquellas que tienen, con respecto a la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, en particular una deleción, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, un truncamiento o un alargamiento. En el caso de una sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, se prefieren las sustituciones en las cuales los aminoácidos sustituidos son reemplazados por aminoácidos "equivalentes". La expresión "aminoácidos equivalentes" está dirigida aquí a indicar cualquier aminoácido capaz de ser sustituido con uno de los aminoácidos de estructura de base sin, no obstante, modificar esencialmente las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y tal como se definirán después, especialmente en los ejemplos.

Estos aminoácidos equivalentes pueden determinarse dependiendo de su homología estructural con los aminoácidos que reemplazan, o de los resultados de pruebas comparativas de actividad biológica entre los anticuerpos diferentes capaces de ser llevadas a cabo. A manera de ejemplo, se hace mención de las posibilidades de sustitución capaces de ser llevadas a cabo sin producir una modificación profunda de la actividad biológica del anticuerpo modificado correspondiente. De esta manera, es posible reemplazar leucina por valina o isoleucina, ácido aspártico por ácido glutámico, glutamina por asparagina, arginina por lisina, etc., las sustituciones inversas siendo naturalmente concebibles bajo las mismas condiciones. Los anticuerpos de conformidad con la presente invención son de preferencia anticuerpos monoclonales específicos, especialmente de murino, quiméricos o humanizados, los cuales pueden obtenerse de conformidad con métodos comunes bien conocidos por los expertos en la técnica. En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de murino, es posible referirse a técnicas que se describen en particular en el manual "Antibodies (Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 988), o a la técnica de preparación de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256: 495-497, 1985). Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la invención pueden obtenerse, por ejemplo, de una célula animal inmunizada contra el receptor IGF-IR, o uno de sus fragmentos que contenga al epítope reconocido específicamente por dichos anticuerpos monoclonales de conformidad con la invención. Dicho receptor IGF-IR, o uno de sus fragmentos indicados, puede producirse especialmente de conformidad con los métodos de trabajo usuales, mediante recombinación genética partiendo de una secuencia de ácido nucleico contenida en la secuencia de ADNc que codifica para el receptor IGF-IR, o mediante síntesis de péptidos partiendo de una secuencia de aminoácidos incluida en la secuencia de péptidos del receptor IGF-IR. Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la invención pueden purificarse, por ejemplo, sobre una columna de afinidad sobre la cual el receptor IGF-IR o uno de sus fragmentos que contiene al epítope reconocido específicamente por dichos anticuerpos monoclonales de conformidad con la invención, ha sido inmovilizado previamente. Más particularmente, dichos anticuerpos monoclonales pueden purificarse mediante cromatografía sobre proteína A y/o G, seguida o no seguida de cromatografía de intercambio iónico dirigida a eliminar los contaminantes de proteínas residuales, así como el ADN y el LPS, en sí misma seguida o no seguida de cromatografía de exclusión sobre gel de Sepharose, para eliminar los agregados potenciales debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. En una modalidad aún más preferida, el total de estas técnicas puede usarse simultáneamente o sucesivamente. Anticuerpos quiméricos o humanizados se incluyen asimismo en los anticuerpos de conformidad con la presente invención. Por anticuerpo quimérico, se pretende indicar un anticuerpo que contiene una región variable natural (cadena ligera y cadena pesada) derivada de un anticuerpo de una especie determinada, en combinación con las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga a dicha especie determinada. Los anticuerpos o sus fragmentos de tipo quimérico de conformidad con la invención, pueden prepararse usando las técnicas de recombinación genética. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico puede producirse clonando un ADN recombinante que contenga un promotor y una secuencia que codifique para la región variable de un anticuerpo monoclonal no humano, especialmente de murino, de conformidad con la invención, y una secuencia que codifique para la región constante del anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico de la invención codificado por dicho gen recombinante será, por ejemplo, una quimera de ratón-hombre, el carácter específico de este anticuerpo siendo determinado por la región variable derivada del ADN de murino, y su isotipo determinado por la región constante derivada del ADN humano. Para los métodos de preparación de anticuerpos quiméricos es posible, por ejemplo, referirse al documento Verhoeyn et al. (BioEssays, 8: 74, 1988). Por anticuerpo humanizado, se pretende indicar un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, las otras partes de la molécula de anticuerpo siendo derivadas de uno o varios anticuerpos humanos. Además, algunos de los residuos de los segmentos del esqueleto (denominados FR) pueden modificarse para conservar la afinidad de la unión (Jones et al., Nature, 321 : 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988). Los anticuerpos humanizados de conformidad con la invención o sus fragmentos, pueden prepararse mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia (tales como, por ejemplo, las descritas en los documentos Singer et al., J. Immun. 150: 2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; o Bebbington et al., Bio Technology, 10: 169-175, 1992). Dichos anticuerpos humanizados de conformidad con la invención se prefieren para su uso en métodos de diagnóstico in vitro, o en tratamiento profiláctico y/o terapéutico in vivo. Por fragmento funcional de un anticuerpo de conformidad con la invención, se pretende indicar en particular un fragmento de anticuerpo, tales como los fragmentos Fv, scFv (se para cadena sencilla), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc, o cuerpos completos, o cualquier fragmento de los cuales la vida media habría sido incrementada mediante modificación química, tal como la adición de poli(alquílen)glicol, tal como poli(etilen)glicol ("PEGilación") (fragmentos pegilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG) ("PEG" para poli(etilen)glicol), o por incorporación en un liposoma, dichos fragmentos teniendo por lo menos una de las CDRs características de secuencia SEQ ID No. 2, 4, 6, 8, 10 ó 12 de conformidad con la invención y, especialmente, porque es capaz de ejercer en forma general una actividad incluso parcial del anticuerpo del cual se deriva, tal como en particular la capacidad para reconocer, y de unirse, al receptor IGF-IR y, si es necesario, para inhibir la actividad del receptor IGF-IR. De preferencia, dichos fragmentos funcionales estarán constituidos o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del cual se derivan, dicha secuencia parcial siendo suficiente para retener el mismo carácter específico de unión que el anticuerpo del cual se deriva, y una afinidad suficiente, de preferencia por lo menos igual a 1/100, en una forma más preferida a por lo menos 1/10, de la del anticuerpo del cual se deriva, con respecto al receptor IGF-IR. Dicho fragmento funcional contendrá como mínimo 5 aminoácidos, de preferencia 10, 15, 25, 50 y 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del cual se deriva. De preferencia, estos fragmentos funcionales serán fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc o cuerpos completos, los cuales tienen en general el mismo carácter específico de unión que el anticuerpo del cual se derivan. De conformidad con la presente invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención pueden obtenerse partiendo de anticuerpos tales como los descritos anteriormente, mediante métodos tales como digestión por enzimas tales como pepsina o papaína, y/o mediante desdoblamiento de los puentes disulfuro mediante reducción química. En otra modalidad, los fragmentos de anticuerpos abarcados en la presente invención pueden obtenerse mediante técnicas de recombinación genética asimismo bien conocidas por los expertos en la materia, o también mediante síntesis de péptidos mediante, por ejemplo, sintetizadores automáticos de péptidos, tales como los provistos por la compañía Applied Biosystems, etc. En una modalidad más preferida, la invención comprende los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, de conformidad con la presente invención, especialmente anticuerpos quiméricos o humanizados, obtenidos mediante recombinación genética o mediante síntesis química. En una modalidad preferida, una materia de la invención es un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una CDR de secuencia SEQ ID No. 12, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 12. Entre las seis secuencias de CDR cortas, la tercera CDR de la cadena pesada (CDRH3) tiene la mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad, esencialmente debida a los mecanismos de disposición de los genes que darán lugar a la misma). Puede ser tan corta como 2 aminoácidos, aunque el tamaño más largo conocido es 26. Funcionalmente, la CDRH3 desempeña una función en parte en la determinación del carácter específico del anticuerpo (Segal et al., PNAS, 71 : 4298-4302, 1974; Amit et al., Science, 233: 747-753, 1986; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature, 342: 877-883, 1989; Catón et al., J. Immunol., 144: 1965-1968, 1990; Sharon et al., PNAS, 87: 4814-4817, 1990; Sharon et al., J. Immunol., 144: 4863-4869, 1990; Kabat et al., J. Immunol., 147: 1709-1719, 1991 ). Se sabe que sólo un bajo porcentaje de los aminoácidos de las CDRs favorece la construcción de un sitio de unión al anticuerpo, pero estos residuos deben mantenerse en una conformación tridimensional muy específica. En una modalidad más preferida, la presente invención se refiere a un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos dos de las CDRs, o las tres CDRs de secuencia SEQ ID Nos. 8, 10 y 12, o por lo menos dos de las tres CDRs o tres CDRs de secuencia que tenga respectivamente por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 8, 10 y 12. En una modalidad igualmente preferida, una materia de la invención es un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una CDR seleccionada de las CDRs de secuencia SEQ ID No. 2, 4 ó 6, o una CDR cuya secuencia tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 2, 4 ó 6. En una modalidad más preferida, una materia de la invención es un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos dos de las tres CDRs o las tres CDRs de secuencia SEQ ID Nos. 2, 4 y 6, o por lo menos dos de tres CDRs o tres CDRs de secuencia, que tenga respectivamente por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 2, 4 y 6. En una modalidad más preferida, el anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención, se caracteriza porque comprende una cadena pesada que comprende las tres CDRs de secuencia SEQ ID Nos. 8, 10 y 12, o tres CDRs de secuencia que tengan respectivamente por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 8, 10 y 12, y porque comprende además una cadena ligera que comprende las tres CDRs de secuencia SEQ ID Nos. 2, 4 y 6, o tres CDRs de secuencia que tengan respectivamente por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 2, 4 y 6. De conformidad con otro aspecto, una materia de la presente invención es un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, caracterizado porque no se une o no se une en una forma significativa, al receptor de insulina humana IR. En una modalidad preferida, dichos fragmentos funcionales de conformidad con la presente invención se seleccionarán de los fragmentos Fv, scFv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv-Fc o cuerpos completos, o cualquier fragmento funcional cuya vida media haya sido incrementada mediante una modificación química, especialmente mediante PEGilación, o por incorporación en un liposoma. De conformidad con otro aspecto, la invención se refiere a un hibridoma de murino capaz de secretar un anticuerpo monoclonal de conformidad con la presente invención, especialmente el hibridoma de murino tal como el depositado en el Centre National de Culture De Microorganisme (CNC , National Center of Microorganism Culture) (Instituto Pasteur, París, Francia) en septiembre 19, 200 , bajo el número 1-2717. El anticuerpo monoclonal denominado en la presente 7C10, o uno de sus fragmentos funcionales, caracterizado porque dicho anticuerpo es secretado por el hibridoma depositado en el CNCM en septiembre 19, 2001 bajo el número 1-2717 es, de hecho, parte de la presente invención. En una modalidad particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo de murino, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 54, o una secuencia que tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 54, y/o porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 69, o una secuencia que tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 69. De conformidad con un aspecto igualmente particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende además las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga al ratón, especialmente humano, y en una modalidad preferida, porque las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano, son respectivamente la región kappa y gamma-1 , gamma-2 o gamma-4. De conformidad con un aspecto igualmente particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera y/o una cadena pesada, en la cual los segmentos del esqueleto FR1 a FR4 (tales como los definidos más adelante en los ejemplos 12 y 13, en los cuadros 5 y 6) de dicha cadena ligera y/o cadena pesada, se derivan respectivamente de los segmentos del esqueleto FR1 a FR4 de cadena ligera y/o cadena pesada de anticuerpo humano. De conformidad con una modalidad preferida, el anticuerpo humanizado o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la presente invención, se caracteriza porque dicho anticuerpo humanizado comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 61 ó 65, o una secuencia que tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 61 ó 65, y/o porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 75, 79 u 83, o una secuencia que tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 75, 79 u 83. De preferencia, el anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, se caracteriza porque dicho anticuerpo humanizado comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 65, y porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 79 u 83, de preferencia SEQ ID No. 83. De conformidad con un aspecto novedoso, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se selecciona de los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica para un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención; b) un ácido nucleico complementario o un ácido nucleico tal como se define en el inciso a); y c) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de gran severidad, con por lo menos una de las CDRs de secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 1 , 3, 5, 7, 9 u 1 1 , o con una secuencia que tenga por lo menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 1 , 3, 5, 7, 9 u 1 1.

Por ácido nucleico, secuencia nucleica o de ácido nucleico, polinucleótido, oligonucleótido, secuencia de polinucleótidos, secuencia de nucleótidos, términos que se usarán indistintamente en la presente invención, se pretende indicar un enlace preciso de nucleótidos, los cuales son modificados o no modificados, permitiendo que un fragmento o una región de un ácido nucleico sea definida, conteniendo o no conteniendo nucleótidos no naturales, y siendo capaces de corresponder también a un ADN de doble cadena, un ADN de cadena sencilla, respecto a los productos de transcripción de dichas moléculas de ADN. Debe entenderse también aquí que la presente invención no se refiere a la secuencia de nucleótidos en su ambiente cromosómico natural, es decir, en el estado natural. Se refiere a secuencias que han sido aisladas y/o purificadas, es decir, que se han seleccionado directamente o indirectamente, por ejemplo, mediante copia, su ambiente habiendo siendo modificado por lo menos parcialmente. De esta manera, se pretende asimismo indicar aquí los ácidos nucleicos aislados obtenidos mediante recombinación genética mediante, por ejemplo, células hospederas, u obtenidos mediante síntesis química. Por secuencias nucleicas que tienen un porcentaje de identidad de por lo menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98%, después de alineación óptima con una secuencia preferida, se pretende indicar las secuencias nucleicas que tienen, con respecto a la secuencia nucleica de referencia, ciertas modificaciones tales como, en particular, una deleción, un truncamiento, un alargamiento, una fusión quimérica y/o una sustitución, especialmente sustitución de punto. Se refiere de preferencia a secuencias en las cuales las secuencias codifican para las mismas secuencias de aminoácidos que la secuencia de referencia, ésta estando relacionada con la degeneración del código genético, o secuencias complementarias que sean capaces de hibridar específicamente con las secuencias de referencia, de preferencia bajo condiciones de alta severidad, especialmente tal como se define más adelante. Una hibridación bajo condiciones de alta severidad, significa que las condiciones de temperatura y las condiciones de intensidad iónica se seleccionan de tal forma que permiten el mantenimiento de la hibridación entre dos fragmentos de ADN complementario. A manera de ilustración, condiciones de alta severidad del paso de hibridación para los propósitos de definir los fragmentos de polinucleótidos descritos anteriormente, son en forma ventajosa las siguientes: La hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos pasos: (1 ) prehibridación a 42°C durante 3 horas en regulador de pH de fosfato (20 mM, pH 7.5), conteniendo 5 x SSC (1 x SSC corresponde a una solución de NaCI a 0.15 M + citrato de sodio a 0.015 M), 50% de formamida, 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 10 x de solución de Denhardt, 5% de sulfato de dextrán y 1 % de ADN de esperma de salmón; (2) hibridación real durante 20 horas a una temperatura dependiente del tamaño de la sonda (es decir: 42°C, para un tamaño de sonda > 100 nucleótidos), seguida de 2 lavados de 20 minutos a 20°C en 2 x SSC + 2% de SDS, 1 lavado de 20 minutos a 20°C en 0.1 x SSC + 0.1% de SDS. El último lavado se lleva a cabo en 0.1 x SSC + 0.1 % de SDS durante 30 minutos a 60°C, para un tamaño de sonda > 100 nucleótidos. Las condiciones de hibridación de alta severidad descritas anteriormente para un polinucleótido de tamaño definido, pueden ser adaptadas por los expertos en la técnica para oligonucleótidos de tamaño más grande o más pequeño, de acuerdo a las enseñanzas de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2a. ed. Cold Spring Harbor). La invención se refiere asimismo a un vector que comprende un ácido nucleico de conformidad con la presente invención. La invención está dirigida especialmente a vectores de clonación y/o expresión que contengan una secuencia de nucleótidos de conformidad con la invención. Los vectores de conformidad con la invención contienen de preferencia elementos que permiten la expresión y/o la secreción de las secuencias de nucleótidos en una célula hospedera determinada. El vector debe contener por lo tanto un promotor, señales de inicio y término de la traducción, así como regiones adecuadas de regulación de la transcripción. Debe ser capaz de poderse mantener en una manera estable en la célula hospedera, y puede tener opcionalmente señales particulares que especifiquen la secreción de la proteína traducida. Estos elementos diferentes son seleccionados y optimizados por los expertos en la técnica como una función de la célula hospedera usada. Para este efecto, las secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención pueden insertarse en vectores de replicación autónoma en el hospedero elegido, o pueden ser vectores integrativos del hospedero elegido. Dichos vectores se preparan mediante métodos usados comúnmente por los expertos en la técnica, y los clones resultantes pueden introducirse en el hospedero adecuado mediante métodos comunes, tales como lipofección, electroporación, choque térmico o métodos químicos. Los vectores de conformidad con la invención son, por ejemplo, vectores de plásmidos o virales. Son útiles para transformar células hospederas para clonar o expresar las secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención. La invención comprende asimismo las células hospederas transformadas por un vector de conformidad con la invención, o que comprenden al mismo. La célula hospedera puede seleccionarse de sistemas procarióticos o eucarióticos, por ejemplo, células bacterianas, pero asimismo células de levadura o células animales, en particular células de mamífero. Es asimismo posible usar células de insecto o células vegetales. La invención se refiere asimismo a animales, salvo el hombre, que comprendan por lo menos una célula transformada de conformidad con la invención. De conformidad con otro aspecto, una materia de la invención es un procedimiento para la producción de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) cultivo en un medio y condiciones de cultivo adecuadas, de una célula hospedera de conformidad con la invención; y b) la recuperación de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, producidos de esta manera partiendo del medio de cultivo o dichas células cultivadas. Las células transformadas de conformidad con la invención pueden usarse en procedimientos para la preparación de polipéptidos recombinantes de conformidad con la invención. Los procedimientos para la preparación de un polipéptido de conformidad con la invención en una forma recombinante, caracterizado porque usan un vector y/o una célula transformada por un vector de conformidad con la invención, son por sí mismos abarcados en la presente invención. De preferencia, una célula transformada mediante un vector de conformidad con la invención, se cultiva bajo condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido, y dicho péptido recombinante es recuperado. Como se ha dicho, la célula hospedera puede seleccionarse de sistemas procarióticos o eucarióticos. En particular, es posible identificar secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención, facilitando la secreción en dicho sistema procariótico o eucariótico. Un vector de conformidad con la invención que posea dicha secuencia, puede usarse por lo tanto en forma ventajosa para la producción de proteínas recombinantes, destinadas a ser secretadas. En efecto, la purificación de estas proteínas recombinantes de interés será facilitada por el hecho de que están presentes en el sobrenadante del cultivo de células, más que en el interior de las células hospederas. Es asimismo posible preparar los polipéptidos de conformidad con la invención mediante síntesis química. Dicho procedimiento de preparación es asimismo una materia de la invención. El experto en la técnica conoce los procedimientos de síntesis química, por ejemplo, las técnicas que usan fases sólidas (véase especialmente Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 1 1 1 , 2a. ed., (1984)), o técnicas que usan fases sólidas parciales, mediante condensación de fragmentos o mediante una síntesis clásica en solución. Los polipéptidos obtenidos mediante síntesis química, y que son capaces de contener aminoácidos no naturales correspondientes, son asimismo abarcados en la invención. Los anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, capaces de ser obtenidos mediante un procedimiento de conformidad con la invención, son asimismo abarcados en la presente invención. De conformidad con una segunda modalidad, la presente invención se refiere a un anticuerpo de conformidad con la invención, tal como se describió anteriormente, caracterizado porque es, además, capaz de unirse específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR de humano, y/o capaz de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor EGFR. En forma general, los factores de crecimiento son pequeñas proteínas que intervienen en la regulación de la proliferación y de la diferenciación de células normales. Algunos de estos factores de crecimiento desempeñan asimismo una función importante en el inicio y el mantenimiento de la transformación celular, siendo capaces de funcionar como factores autocrinos o paracrinos. Este es especialmente el caso, además del IGF1 descrito anteriormente, para el factor de crecimiento epidérmico EGF, el cual parece intervenir particularmente en la aparición del fenotipo del tumor, la progresión de tumores y la generación de metástasis. EGF e IGF1 ejercen su acción a través del intermediario de su receptor respectivo denominado aquí EGFR e IGF-IR. Se refiere en los dos casos a receptores de membrana con actividad de tirosina cinasa, cuya sobreexpresión se describe en numerosos cánceres. Sin embargo, debe observarse que la interacción de estos dos receptores no está claramente establecida, y que los estudios llevados a cabo por varios grupos a este respecto, dan resultados contradictorios respecto a la colaboración de estos dos receptores. Los estudios llevados a cabo en células de tumor de próstata, muestran que la interrupción de la asa autocrina EGF/EGFR por un anticuerpo monoclonal anti-EGFR (llamado aquí "MAB" o "MAb"), se manifiesta por una pérdida completa de la respuesta de las células DU145 al IGF1 (Connolly J. M. y Rose D. P., Prostate, abr. 24(4): 167-75, 1994; Putz T. et al., Cáncer Res., ene. 1 , 59(1 ): 227-33, 1999). Estos resultados sugerirían que un bloqueo del receptor por el EGF sería suficiente para lograr una inhibición total de las señales de transformación generadas por la activación de los dos receptores (EGFR e IGF-IR). Por otra parte, otros estudios (Pietrzkowski et al., Cell Growth Differ, abr., 3(4): 199-205, 1992; Coppola et al., Mol Cell Biol., jul., 14(7): 4588-95, 1994) han mostrado que una sobreexpresión del EGFR necesita la presencia de un IGF-IR funcional para ejercer su potencial mitogénico y transformante, aunque el IGF-IR no necesita, por su parte, la presencia del EGFR funcional para mediar su acción. Esta segunda serie de estudios estaría más de acuerdo con una estrategia que tiende preferiblemente a bloquear el IGF-IR con el propósito de afectar simultáneamente a los dos receptores. En forma sorprendente, los inventores han demostrado, en primer término, que una coinhibición de la unión del IGF1 y/o el IGF2 al receptor IGF-IR, y de la unión del EGF al receptor EGFR, permite que se obtenga una sinergia de acción significativa de estas dos acciones contra el crecimiento del tumor in vivo en ratones desnudos que poseen un tumor que expresa estos dos receptores. Una de las hipótesis más probables que es capaz de explicar esta sinergia de acción, es que los dos factores de crecimiento EGF e IGF1 (y/o IGF2) actúan por sí mismos en sinergia en la transformación de células normales a células con carácter tumoral, y/o en el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales para ciertos tumores, especialmente para aquellas que sobreexpresan los dos receptores EGFR e IGF-IR, y/o que tienen una sobreactivación de la señal de transducción mediada por estos dos receptores, en particular al nivel de la actividad de tirosina cinasa de estos receptores. De conformidad con un aspecto preferido de esta modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo tal como se describió anteriormente, caracterizado porque consiste de un anticuerpo biespecífico que comprende un segundo motivo que inhibe específicamente la unión del EGF al EGFR, y/o que inhibe específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor EGFR. El término "segundo motivo" tuvo el propósito de indicar anteriormente en especial una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento capaz de unirse específicamente al EGFR, en particular una región CDR de una cadena variable de un anticuerpo anti-EGFR, o uno de los fragmentos de esta región CDR de longitud suficiente para ejercer esta unión específica, o también varias regiones CDR de un anticuerpo anti-EGFR. Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales forman una segunda generación de anticuerpos monoclonales en los cuales dos regiones variables diferentes se combinan en la misma molécula (Hollinger y Bohlen 1999 Cáncer and metástasis rev. 18: 41 1 -419). Su uso se ha demostrado en el campo de diagnóstico y en el campo de terapia debido a su capacidad para reclutar nuevas funciones efectoras, o para dirigir varias moléculas sobre la superficie de células tumorales. Estos anticuerpos pueden obtenerse mediante métodos químicos (Glennie M J et al. 1987 J. Immunol. 139, 2367- 2375; Repp R. et al. 1995 J. Hemat. 377-382), o métodos somáticos (Staerz U. D. y Bevan M. J. 1986 PNAS 83, 1453-1457; Suresh M. R. et al. 1986 Method Enzymol. 121 : 210-228), pero asimismo y de preferencia mediante técnicas de ingeniería genética que permiten forzar la heterodimerización, y de esta manera facilitar el procedimiento de purificación del anticuerpo buscado (Merchand et al. 1998 Nature Biotech. 16: 677-681 ). Estos anticuerpos biespecíficos pueden construirse como IgG completa, un Fab'2 biespecífico, como Fab'PEG o como cuerpos completos, o también como scFv biespecífico, pero asimismo como un anticuerpo biespecífico tetravalente, o dos sitios de unión están presentes para cada antígeno dirigido (Park et al. 2000 Mol. Immunol. 37 (18): 1123-30) o sus fragmentos, como se describió anteriormente. Además de una ventaja económica debida al hecho de que la producción y la administración de un anticuerpo biespecífico son menos onerosas que la producción de dos anticuerpos específicos, el uso de dichos anticuerpos biespecíficos tiene la ventaja de reducir la toxicidad del tratamiento. Esto es porque el uso de un anticuerpo biespecífico permite que se reduzca la cantidad total de anticuerpos circulantes y, en consecuencia, la toxicidad posible. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo bivalente o tetravalente. En la práctica, el interés por usar un anticuerpo biespecífico tetravalente, es que tiene una mayor avidez en comparación con un anticuerpo bivalente a causa de la presencia de dos sitios de unión para cada objetivo, respectivamente, IGF-IR y EGFR, en la presente invención. En una forma similar a la selección de los fragmentos funcionales del anticuerpo anti-IGF-IR descrito anteriormente, dicho segundo motivo se selecciona de los fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc y los cuerpos completos, o cualquier forma cuya vida media habría sido incrementada, como los fragmentos pegilados tales como Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG. De conformidad con un aspecto aún más preferido de la invención, dicho segundo motivo anti-EGFR se deriva del anticuerpo monoclonal 225 de ratón, su derivado quimérico C225 de ratón-hombre, o un anticuerpo humanizado derivado de este anticuerpo 225. De conformidad con otro aspecto, una materia de la invención es un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, como un medicamento, de preferencia un anticuerpo humanizado tal como se definió anteriormente. El término anticuerpo, para el resto de la presente descripción, debe entenderse como un anticuerpo anti-IGF-IR, así como un anticuerpo anti-IGF-IR/EGFR biespecífico. La invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica que comprende por medio del principio activo, un compuesto que consiste de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención, de preferencia mezclado con un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. De conformidad con otra modalidad, la presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica tal como se describió anteriormente, que comprende un segundo compuesto seleccionado de los compuestos capaces de inhibir específicamente la unión del EGF al receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR de humano, y/o capaz de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor EGFR. En un aspecto preferido de la invención, dicho segundo compuesto se selecciona de los anticuerpos anti-EGFR aislados, o sus fragmentos funcionales, capaces de inhibir por competencia la unión del EGF al EGFR. Más particularmente, dicho anticuerpo anti-EGFR se selecciona de los anticuerpos anti-EGFR monoclonales, quiméricos o humanizados, o sus fragmentos funcionales. Aun más particularmente, dichos fragmentos funcionales del anticuerpo anti-EGFR se seleccionan de los fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o cuerpos completos, o cualquier fragmento cuya vida media habría sido incrementada, como fragmentos pegilados. Dicho anticuerpo puede consistir, en una forma aún más preferida, del anticuerpo monoclonal 225 de ratón, su derivado quimérico C225 de ratón-hombre (denominado también I C-C225), o un anticuerpo humanizado derivado de este anticuerpo 225. Otra modalidad complementaria de la invención, consiste en una composición tal como se describió anteriormente que comprende, además, como un producto de combinación para uso simultáneo, separado o secuencial, un agente citotóxico/citostático y/o un inhibidor de la actividad de tirosina cinasa, respectivamente, de los receptores para IGF-I y/o para EGF.

Se entiende que la expresión "uso simultáneo" significa la administración de los dos compuestos de la composición de conformidad con la invención, en una forma farmacéutica individual e idéntica. Se entiende que la expresión "uso separado" significa la administración, al mismo tiempo, de los dos compuestos de la composición de conformidad con la invención, en formas farmacéuticas distintas. Se entiende que la expresión "uso secuencial" significa la administración sucesiva de los dos compuestos de la composición de conformidad con la invención, cada uno en una forma farmacéutica distinta. En una forma general, la composición de conformidad con la invención aumenta considerablemente la eficacia del tratamiento de cáncer. En otras palabras, el efecto terapéutico del anticuerpo anti-IGF-IR de conformidad con la invención es potenciado en una forma inesperada por la administración de un agente citotóxico. Otra ventaja subsecuente importante producida por una composición de conformidad con la invención, se refiere a la posibilidad de usar dosis eficaces menores de principio activo, que permitan que se eviten los riesgos de aparición de efectos secundarios o que se reduzcan, en particular, los efectos del agente citotóxico. Además, esta composición de conformidad con la invención permitiría que se logre más rápidamente el efecto terapéutico esperado. En una modalidad particularmente preferida, dicha composición como un producto de combinación de conformidad con la invención, se caracteriza porque dicho agente citotóxico/citostático se selecciona de los agentes que interactúan con el ADN, los antimetabolitos, los inhibidores de topoisomerasa I o II, o también el inhibidor del huso o agentes estabilizadores o también cualquier agente capaz de ser usado en quimioterapia. Dichos agentes citotóxicos/citostáticos, para cada una de las clases de agentes citotóxicos mencionados anteriormente se citan, por ejemplo, en la edición 2001 de VIDAL, en la página dedicada a los compuestos anexos a la columna de "citotóxicos" de cancerología y hematología, y estos compuestos citotóxicos citados con relación a este documento, se citan aquí como agentes citotóxicos preferidos. En una modalidad particularmente preferida, dicha composición como un producto de combinación de conformidad con la presente invención, se caracteriza porque dicho agente citotóxico se acopla químicamente a dicho anticuerpo para uso simultáneo. En una modalidad particularmente preferida, dicha composición de conformidad con la invención se caracteriza porque dicho agente citotóxico/citostático se selecciona del inhibidor del huso o agentes estabilizadores, de preferencia vinorelbina y/o vinflunina y/o vincristina. Para facilitar el acoplamiento entre dicho agente citotóxico y dicho anticuerpo de conformidad con la invención, es especialmente posible introducir moléculas separadoras entre los dos compuestos que se van a acoplar, como es el caso de poli(alquilen)glicoles tales como polietilenglicol, o también aminoácidos o, en otra modalidad, usar derivados activos de dichos agentes citotóxicos en los cuales se habrían introducido funciones capaces de reaccionar con dicho anticuerpo de conformidad con la invención. Estas técnicas de acoplamiento son bien conocidas por los expertos en la técnica, y no se describirán en detalle en la presente descripción. En otra modalidad preferida, dicho inhibidor de la actividad de tirosina cinasa de los receptores para IGF-I y/o para EGF, se selecciona del grupo que consiste de agentes naturales derivados, dianilinoftalimidas, pirazolo- o pirrolo-piridopirimidinas, o también quinazilinas. Dichos agentes inhibidores son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se describen en la literatura (Ciardiello F., Drugs 2000, Supl. 1 , 25-32). Otros inhibidores de EGFR pueden consistir, sin limitación alguna, de los anticuerpos monoclonales anti-EGFR C225 y 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), o los compuestos ZD-1834, ZD-1838 y ZD- 839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner-Lambert Parke-Davis), CI-1033/PD 183, 805 (Warner-Lambert Parke-Davis), CL-387, 785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidina A (Bristol-Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusión a EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cáncer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cáncer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cáncer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko), o la "vacuna de EGFR" (York Medical/Centro de Immunologia Molecular). De conformidad con otra modalidad de la invención, la composición tal como se describió anteriormente, puede comprender asimismo otro compuesto de anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular del receptor HER2/neu, como un producto de combinación para uso simultáneo, separado o secuencial, destinado para la prevención y para el tratamiento de cáncer, especialmente los cánceres que sobreexpresan dicho receptor HER2/neu, y el receptor IGF-IR y/o EGFR, tal como especialmente cáncer de mama. Puede hacerse referencia especialmente a las publicaciones de Albanell et al. (J. of the National Cáncer Institute, 93(24): 1830-1831 , 2001 ) y de Lu et al. (J. of the National Cáncer Institute, 93(24): 1852-1857, 2001 ), que justifican el interés inesperado en combinar un anticuerpo anti-HER2/neu con un anticuerpo anti-IGF-IR de conformidad con la presente invención. En una forma particular, dicho anticuerpo anti-HER2/neu de la composición de conformidad con la invención, es el anticuerpo denominado Trastuzumab (denominado también Herceptin). La invención se refiere, en otro aspecto, a una composición caracterizada porque por lo menos uno de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, se conjuga con una toxina celular y/o un radioelemento. De preferencia, dicha toxina o dicho radioelemento es capaz de inhibir por lo menos una actividad celular de células que expresan al receptor IGF-IR y/o EGFR, en una forma más preferida capaz de prevenir el crecimiento o la proliferación de dicha célula, especialmente de inactivar totalmente dicha célula. De preferencia también, dicha toxina es una toxina enterobacteriana, especialmente exotoxina A de Pseudomonas. Los radioelementos (o radioisótopos), de preferencia conjugados con los anticuerpos usados para la terapia, son radioisótopos que emiten rayos gamma, y de preferencia yodo131, itrio90, oro199, paladio100, cobre67, bismuto217 y antimonio211. Los radioisótopos que emiten rayos beta y gamma, pueden usarse asimismo para la terapia. Por toxina o radioelemento conjugado con por lo menos un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, se pretende indicar cualquier medio que permita que dicha toxina o dicho radioelemento se una a dicho anticuerpo (por lo menos uno), especialmente mediante acoplamiento covalente entre los dos compuestos, con o sin introducción de una molécula de enlace. Entre los agentes que permiten la unión en una forma química (covalente), electrostática o no covalente de todos los componentes del conjugado, o parte de los mismos, puede hacerse mención particularmente de benzoquinona, carbodiimida, y más particularmente EDC (clorhidrato de 1 -etil-3-[3-dimetil-aminopropil]-carbodiimida), dimaleimida, ácido ditiobis-nitrobenzoico (DTNB), tioacetato de N-succinimidil S-acetilo (SATA), los agentes de unión que tienen uno o más grupos fenilazida reaccionando con los ultravioletas (U.V.), y de preferencia N-[4-(azidosalicilamino)butil]-3'-(2'-piridilt¡o)-propionamida (APDP), 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) y 6-h¡drazino-nicotinamida (HYNIC). Otra forma de acoplamiento, especialmente para los radioelementos, puede consistir en el uso de un quelante de iones bifuncional. Entre estos quelatos, es posible mencionar los quelatos derivados de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) o de DTPA (ácido dietilendiaminopentaacético), los cuales se han desarrollado para unir metales, especialmente metales radiactivos, e inmunoglobulinas. De esta manera, el DTPA y sus derivados pueden sustituirse por diferentes grupos en la cadena de carbonos, para aumentar la estabilidad y la rigidez del complejo de ligando-metal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991 ); Gansow (1991 ); patente de E.U.A. No. 4,831 ,175). Por ejemplo, el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y sus derivados, los cuales se han usado ampliamente en medicina y en biología por largo tiempo en su forma libre, o en forma de un complejo con un ión metálico, tienen la característica notable de formar quelatos estables con iones metálicos, y de ser acoplados con proteínas de interés terapéutico o de diagnóstico, tales como anticuerpos para el desarrollo de radioinmunoconjugados en terapia del cáncer (Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990)). Asimismo de preferencia, dicho anticuerpo (por lo menos uno) que forma dicho conjugado de conformidad con la invención, se selecciona de sus fragmentos funcionales, especialmente los fragmentos amputados de su componente Fe, tales como los fragmentos scFv. La presente invención comprende además el uso de la composición de conformidad con la invención, para la preparación de un medicamento. Más particularmente, de conformidad con otra modalidad, la invención se refiere al uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, y/o de una composición, para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de una enfermedad inducida por una sobreexpresion y/o una activación anormal del receptor IGF-IR y/o EGFR, y/o relacionada con una hiperactivación de la vía de transducción de la señal mediada por la interacción del IGF1 o IGF2 con IGF-IR y/o de EGF con EGFR y/o HER2/neu. De preferencia, dicho uso de conformidad con la invención se caracteriza porque la administración de dicho medicamento no induce o induce sólo ligeramente, efectos secundarios relacionados con la inhibición del receptor de insulina IR, es decir, inhibición de la interacción del receptor IR con sus ligandos naturales debido a la presencia de dicho medicamento, especialmente mediante una inhibición competitiva relacionada con la unión de dicho medicamento al IR. La presente invención comprende además el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de preferencia humanizado, y/o de una composición de conformidad con la invención, para la preparación de un medicamento destinado para inhibir la transformación de células normales en células con carácter tumoral, de preferencia células dependientes del IGF, especialmente células dependientes del IGF1 y/o el IGF2, y/o células dependientes del EGF y/o dependientes de HER2/neu. La presente invención se refiere asimismo al uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de preferencia humanizado, y/o de una composición de conformidad con la invención, para la preparación de un medicamento destinado para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales, de preferencia células dependientes del IGF, especialmente células dependientes del IGF1- y/o el IGF2 y/o células dependientes del EGF y/o células dependientes de estrógeno y/o células dependientes de HER2/neu. En una forma general, una materia de la presente invención es el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de preferencia humanizados, y/o de una composición de conformidad con la invención, para la preparación de un medicamento destinado para la prevención y/o para el tratamiento de cáncer, de preferencia expresando el IGF-IR y/o el EGFR, y/o de cáncer que tiene de preferencia una hiperactivación de la vía de transducción de la señal mediada por la interacción del IGF1 o el IGF2 con el IGF-IR tal como, por ejemplo, la sobreexpresión de IRS1 y/o del EGF con el EGFR. La materia de la presente invención es asimismo el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de preferencia humanizado, y/o de una composición de conformidad con la invención, para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de psoriasis, psoriasis cuya hiperproliferación epidérmica puede relacionarse con la expresión o la sobreexpresión del IGF-IR y/o el EGFR, y/o con la hiperactivación de la vía de transducción de la señal mediada por la interacción del IGF-IR con sus ligandos naturales (Wraight C. J. et al. Nat. Biotechnol., 2000, 18(5): 521 -526. Reversal of epidermal hyperproliferation ¡n psoriasis by insulin-like growth factor I receptor antisense oligonucleotides), y/o del EGFR con sus ligandos naturales. Entre los cánceres que pueden prevenirse y/o tratarse, se prefieren cáncer de próstata, osteosarcomas, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer endometrial o cáncer de colon, o cualquier otro cáncer que sobreexprese al IGF-IR. De conformidad con otro aspecto, una materia de la presente invención es un método de diagnóstico, de preferencia in vitro, de enfermedades relacionadas con una sobreexpresión o una subexpresión, de preferencia una sobreexpresión, del receptor IGF-IR y/o EGFR, partiendo de una muestra biológica en la cual se sospeche la presencia anormal del receptor IGF-IR y/o EGFR, caracterizado porque dicha muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, siendo posible que dicho anticuerpo sea, si es necesario, marcado. De— preferencia,— dichas— enfermedades- -relacionadas - -con— la- sobreexpresíón del receptor IGF-IR y/o EGFR en dicho método de diagnóstico, serán cánceres. Dicho anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, puede estar presente en forma de un inmunoconjugado o de un anticuerpo marcado para obtener una señal detectable y/o cuantificable. Los anticuerpos marcados de conformidad con la invención, o sus fragmentos funcionales incluyen, por ejemplo, anticuerpos denominados inmunoconjugados que pueden conjugarse, por ejemplo, con enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina, a-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa o glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, o mediante una molécula tal como biotina, digoxigenina, o 5-bromodesoxiuridina. Pueden conjugarse asimismo marcas fluorescentes con los anticuerpos o con sus fragmentos funcionales de conformidad con la invención, e incluyen especialmente fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, rodamina y sus derivados, GFP (GFP para "proteína fluorescente verde"), dansilo, umbeliferona, etc. En dichos conjugados, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos funcionales pueden prepararse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Pueden acoplarse a las enzimas o a las marcas fluorescentes directamente o mediante el intermediario de un grupo separador o de un grupo de enlace tal como un polialdehído, tal como glutaraldehído, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA), o en presencia de agentes de acoplamiento tales como los mencionados anteriormente para los conjugados terapéuticos. Los conjugados que contienen marcas de tipo fiuoresceína, pueden prepararse mediante reacción con un isotiocianato. Otros conjugados pueden incluir asimismo marcas quimioluminiscentes tales como luminol y los dioxetanos, marcas bioluminiscentes tales como luciferasa y luciferina, o también marcas radiactivas tales como yodo123, yodo125, yodo126, yodo133, bromo77, tecnecio99m, indio111, indio113"1, galio67, galio68, rutenio95, rutenio97, rutenio103, rutenio105, mercurio107, mercurio203, renio99m, renio 0 , renio105, escandio47, telurio121"1, telurio122"1, telurio125"1, tulio 65, tulio167, tulio168, flúor18, itrio199 e yodo131. Los métodos conocidos por los expertos en la técnica que existen para el acoplamiento de los radioisótopos terapéuticos a los anticuerpos directamente o mediante un agente quelante tal como EDTA o DTPA mencionados anteriormente, pueden usarse para los radioelementos que pueden usarse en diagnóstico. Es asimismo posible mencionar marcación con Na [I125] mediante el método de cloramina T [Hunter W. M. y Greenwood F. C. (1962) Nature 194: 495], o también con tecnecio99"1 mediante la técnica de Crockford et al. (patente de E.U.A. 4,424,200), o unidos mediante DTPA como es descrito por Hnatowich (patente de E.U.A. 4,479,930). De esta manera, los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, pueden usarse en un procedimiento para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una subexpresión, de preferencia una sobreexpresión, del receptor IGF-IR y/o EGFR en una muestra biológica, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) la puesta en contacto de la muestra biológica con un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención; y b) la demostración del complejo IGF-IR y/o EGFR/anticuerpo formado posiblemente. En una modalidad particular, los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, pueden usarse en un procedimiento para la detección y/o la cuantificación del receptor IGF-IR y/o EGFR en una muestra biológica, para el monitoreo de la eficacia de un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cáncer dependiente del IGF y/o el EGFR, o también de psoriasis. Más generalmente, los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención, pueden usarse en forma ventajosa en cualquier situación en donde la expresión de receptor IGF-IR y/o EGFR debe observarse en una forma cualitativa y/o cuantitativa. De preferencia, la muestra biológica se forma usando un fluido biológico, tal como suero, sangre entera, células, una muestra de tejido o biopsias de origen humano. Cualquier procedimiento o prueba convencional puede usarse para llevar a cabo dicha detección y/o dosificación. Dicha prueba puede ser una prueba de competencia o en sandwich, o cualquier prueba conocida por los expertos en la técnica que dependa de la formación de un complejo inmune de tipo anticuerpo-antígeno. Siguiendo las aplicaciones de conformidad con la invención, el anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales puede ser inmovilizado o marcado. Esta inmovilización puede llevarse a cabo sobre numerosos soportes conocidos por los expertos en la técnica. Estos soportes pueden incluir especialmente vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrán, nylon, o células naturales o modificadas. Estos soportes pueden ser solubles o insolubles. A manera de ejemplo, un método preferido usa procedimientos ¡nmunoenzimáticos de conformidad con la técnica de ELISA, mediante inmunofluorescencia, o técnica de radioinmunoensayo (RIA), o su equivalente. De esta manera, la presente invención comprende asimismo los equipos o juegos necesarios para llevar a cabo un método de diagnóstico de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una subexpresión del receptor IGF-IR y/o EGFR, o para llevar a cabo un procedimiento para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una subexpresión del receptor IGF-IR y/o EGFR en una muestra biológica, de preferencia una sobreexpresión de dicho receptor, caracterizado porque dicho equipo o juego comprende los siguientes elementos: a) un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la invención; b) opcionalmente, los reactivos para la formación del medio favorable para la reacción inmunológica; c) opcionalmente, los reactivos que permitan la demostración de los complejos de IGF-IR y/o EGFR/anticuerpo producidos mediante la reacción inmunológica. La invención se refiere además al uso de una composición como un producto de combinación de conformidad con la invención, para la preparación de un medicamento destinado para la prevención y/o para el tratamiento de cáncer, especialmente cánceres para los cuales dicho agente citotóxico o dicho anticuerpo anti-HER2/neu se prescribe en general y, especialmente, para cuyos cánceres las células tumorales expresan o sobreexpresan el receptor IGF-IR y/o EGFR. Una materia de la invención es asimismo el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención, para la preparación de un medicamento destinado para la elección de objetivo específico de un compuesto biológicamente activo a células que expresan o sobreexpresan el receptor IGF-IR y/o EGFR. Se pretende indicar aquí por compuesto biológicamente activo cualquier compuesto capaz de modular, especialmente de inhibir, la actividad celular, en particular su crecimiento, su proliferación, transcripción o traducción de genes. Una materia de la invención es también un reactivo de diagnóstico in vivo que comprende un anticuerpo de conformidad con la invención, o uno de sus fragmentos funcionales, de preferencia marcados, especialmente radiomarcados, y su uso en formación de imágenes médicas, en particular para la detección de cáncer relacionado con la expresión o la sobreexpresión, por una célula, de receptor IGF-IR y/o EGFR. La invención se refiere asimismo a una composición como un producto de combinación o a un anticuerpo anti-IGF-IR y/o conjugado de EGFR/toxina o radioelemento, de conformidad con la invención, como un medicamento. De preferencia, dicha composición como un producto de combinación o dicho conjugado de conformidad con la invención, se mezclará con un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. En la presente descripción, se pretende que la expresión vehículo farmacéuticamente aceptable indique un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica no provocando reacciones secundarías, y que permita, por ejemplo, facilitar la administración de los compuestos activos, un incremento en su vida y/o en su eficacia en el cuerpo, un incremento en su solubilidad en solución, o también una mejora en su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos, y serán adaptados por los expertos en la técnica como una función de la naturaleza y/o el modo de administración de los compuestos activos elegidos. De preferencia, estos compuestos se administrarán mediante la vía sistémica, en particular mediante la vía intravenosa, mediante la vía intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o mediante la vía oral. En una forma más preferida, la composición que comprende los anticuerpos de conformidad con la invención se administrará varias veces, en forma secuencial. Sus modos de administración, dosificaciones y formas farmacéuticas óptimas, pueden determinarse de acuerdo a los criterios considerados en general en el establecimiento de un tratamiento adaptado para un paciente tales como, por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la seriedad de su condición general, la tolerancia al tratamiento, y los efectos secundarios observados. Otras características y ventajas de la invención aparecen en la continuación de la descripción con los ejemplos y las figuras cuyas leyendas se representan a continuación: BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1 : Representación esquemática del IGF-IR. Figura 2: Esquema de la transducción de señales mediada por el IGF-IR durante la unión de IGFs. Figuras 3A, 3B y 3C: Reconocimiento del IGF-IR nativo expresado sobre la superficie de células MCF-7 por el anticuerpo monoclonal 7C10. Para este experimento, las células MCF-7 se incuban con el anticuerpo 7C10, o con un anticuerpo de control negativo, y se recuperan entonces con ayuda de un anticuerpo secundario anti-especie fluorescente. La marcación se lee en un FACS. El primer histograma (figura 3A) corresponde a las células MCF-7 solas. En el segundo histograma (figura 3B), la curva no sombreada corresponde a la marcación no específica por un anticuerpo de murino de isotipo control. En el tercer histograma (figura 3C), la curva no sombreada muestra el reconocimiento del IGF-IR por el MAB 7C10. Figuras 4A, 4B y 4C: Marcación de células de insecto Sf9 que expresan respectivamente al IGF-IR o IR. La figura 4A muestra la marcación de células no transfectadas solas (1 ), o células marcadas con anticuerpos monoclonales comerciales control, que reconocen respectivamente al IGF-IR (2) o IR (3). En la figura 4B, las células Sf9 que expresan únicamente al IGF-IR, se marcan con alR3 (2) o anti-IR (3), el valor máximo (1 ) representando las células individuales. En la figura 4C, las células Sf9 que expresan únicamente al IR, se marcan con un anti-IR (3) o alR3 (2), el valor máximo (1 ) representando las células individuales. Figura 5: Efecto inhibidor del anticuerpo 7C10 sobre la proliferación de células MCF-7 inducida por el IGF-1. Las células MCF-7 se incuban en presencia de concentraciones crecientes del IGF1 en presencia o en ausencia del MAB que se va a poner a prueba. La proliferación celular se evalúa siguiendo la incorporación de 3H-timidina (timidina tritiada). El anticuerpo comercial oclR3 se usa como un control positivo del experimento. 7G3 es una lgG1 anti-IGF-IR de murino sin actividad sobre la proliferación, y usada como un isotipo control. - figura 6A: Efecto in vivo del anticuerpo monoclonal 7C10 sobre el crecimiento de tumores MCF-7 establecidos en ratones desnudos; - figuras 6B y 6C: Figuras, respectivamente, de publicaciones de Arteaga et al. (J. Clin. Invest., 84, 1418-1423, 1989) y de Li et al. (Cáncer Immunol. Immunother., 49, 243-252), y mostrando para la figura 6B el efecto de alR3 de murino (descrito asimismo como alR3), y para la figura 6C, el efecto de un scFv-Fc recombinante derivado del anticuerpo 1 H7 sobre el crecimiento del tumor. Figura 7: Estudio comparativo del efecto del MAb 7C10 y del tamoxifeno sobre el crecimiento in vivo del tumor MCF-7. Figuras 8A, 8B y 8C: Estudio de la actividad antitumoral del anticuerpo de murino 7C10 en diferentes modelos de xenoinjerto de células tumorales in vivo. La figura 8A muestra los resultados obtenidos en un modelo de osteosarcoma SK-ES-1 , la figura 8B se refiere a un tumor de próstata DU-145 independiente de andrógenos, y la figura 8C se refiere a un modelo de tumor pulmonar A549 de células no pequeñas. En estos tres modelos, el tratamiento se llevó a cabo dos veces por semana i.p. a un régimen de 250 µg/dosis ratón. Las curvas 7G3, EC2 y 9G4 corresponden, respectivamente, a tres lgG1 de murino usadas como un isotipo control del experimento en cada uno de los modelos. Figura 9: Estudio del efecto antitumoral del MAb 7C10 en comparación _co.n_navel.bjj3a- (viaor-elbina),_así como-la ^sinergia-de-los dos- compuestos sobre el crecimiento in vivo de la línea A549. Figura 10: Actividad comparativa del MAb alR3, 7C10 y 1 H7 sobre la proliferación de células MCF-7 inducida por el IGF-2. Figura 1 1 : Comparación del 7C10 de murino y el MAb C7C10 quimérico para la inhibición de la proliferación de células MCF-7 inducida por el IGF1 in vitro. El anticuerpo 9G4 es una lgG1 de murino usada como un isotipo control del experimento. Figura 12: Efecto comparativo del MAb 7C10 y h7C10 (humanizado 1 , descrito aquí como 7H2HM) sobre el modelo in vitro de la proliferación de células MCF-7 inducida por el IGF1. Figura 13: Efecto del MAb 7C10 y h7C10 (humanizado 1 , descrito aquí como 7H2HM) sobre la transducción de la señal inducida por el IGF1 . La primera línea de puntos corresponde a la revelación, mediante un anticuerpo antifosfotirosina, de la fosforilación de la cadena beta inmunoprecipitada de las células incubadas en presencia del IGF1 solo, o del IGF1 mezclado con varios anticuerpos que se van a poner a prueba. 9G4 y hlgG1 son, respectivamente, los ¡sotipos control de las formas 7C10 y h7C10 (escritas asimismo como 7H2HM). La segunda línea de puntos corresponde a las revelación de la cadena beta, y muestra que la cantidad depositada en todas las cavidades es perfectamente equivalente. Figura 14: Secuencia del ADNc (SEQ ID No. 48), de su cadena complementaria (SEQ ID No. 50), y su traducción en aminoácidos (SEQ ID No. 49), del fragmento de PCR amplificado a_partir .deLhibridoma de-ratón 7C10 con los iniciadores MKV-1 y MKC, y que codifica para el extremo 3' del péptido guía y 7C10 VL Figura 15: Secuencia del ADNc (SEQ ID No. 51 ), de su cadena complementaria (SEQ ID No. 53), y su traducción en aminoácidos (SEQ ID No. 52), del fragmento de PCR amplificado a partir del hibridoma de ratón 7C10 con los iniciadores MHV-12 y MHC-1 , o MHV-8 y MHC-1 , y que codifica para el extremo 3' del péptido guía y 7C10 VH. Figura 16: Reconocimiento del receptor IGF-1 por el anticuerpo quimérico 7C10, denominado asimismo como C7C10 (sobrenadante del cultivo de células COS7 transfectadas). Figura 17: Comparación de la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL de ratón (SEQ ID No. 54), con células de otros anticuerpos de ratón que tienen la homología de secuencias más grande. La numeración de los aminoácidos, es la de Kabat et al. (1991 ). Los residuos en las regiones de la estructura (CDRs exteriores) que difieren entre 7C10 VL y el subgrupo II de ratón de Kabat (SEQ ID No. 57), están subrayados. Un punto indica que el residuo es idéntico en esta posición, en comparación con la secuencia de 7C10 VL. DRB1 -4.3 (SEQ ID No. 55) representa la secuencia de la cadena ligera de una cadena B clase II del MHC de anticuerpo de ratón anti-humano (el número de acceso en el banco de datos de Kabat es N011794). C94-5B1 1 L (SEQ ID No. 56) representa la secuencia de la cadena ligera de un anticuerpo de ratón (el número de acceso en el banco de datos de Kabat es P019314).

Figura 18: Comparación de las secuencias de aminoácidos de 7C10 VL de ratón (SEQ ID No. 54), con células de las cadenas ligeras de humano que pertenecen al subgrupo II de humano de Kabat (SEQ ID No. 60), y teniendo la homología de secuencias más grande. Las secuencias de aminoácidos están alineadas, y se comparan con las del 7C10 VL de ratón. Un punto indica que el residuo es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VL. GM607 (SEQ ID No. 58) representa la secuencia de la cadena ligera kappa secretada por la línea linfoblastoide GM607 de humano (Klobeck et al., Nucleic Acids Res., 12: 6995-7006, 1984a, y Klobeck et al.. Nature, 309: 73-76, 1984b; el número de acceso en el banco de datos de Kabat es N01 1606). DPK15/A19 (SEQ ID No. 59) representa la secuencia de la línea germinal V kappa II de humano. Figura 19: Comparación de las secuencias de aminoácidos de regiones variables de las cadenas ligeras (VL) de 7C10 de ratón (SEQ ID No. 54), de anticuerpo GM 607 de humano (SEQ ID No. 58), y de dos versiones de 7C10 1 y 2 humanizados (SEQ ID Nos. 61 y 65). Las secuencias de aminoácidos están alineadas, y se comparan con las de 7C10 VL de ratón. Un punto indica que el residuo es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VL. GM607 representa la secuencia de la cadena ligera kappa secretada por la línea linfoblastoide GM607 de humano (Klobeck et al., 1984a y 1984b; el número de acceso en la base de datos de Kabat es N01 1606). Figura 20: Secuencia de ADNc (SEQ ID No. 62), su cadena complementaria (SEQ ID No. 64) y su traducción en aminoácidos (SEQ ID No. 63), del gen construido mediante ensamble de novo que codifica para el péptido guía y la versión humanizada 1 de 7C10 VL. Figura 21 : Secuencia de ADNc (SEQ ID No. 66), su cadena complementaria (SEQ ID No. 68) y su traducción en aminoácidos (SEQ ID No. 67), del gen construido mediante ensamble de novo que codifica para el péptido guía y la versión humanizada 2 de 7C10 VL. Figura 22: Comparación de las secuencias de aminoácidos de 7C10 VH de ratón (SEQ ID No. 69) con las de las cadenas pesadas de ratón-humano que pertenecen al subgrupo l(A) de ratón de Kabat, y que tienen la homología de secuencias más grande. La numeración de los aminoácidos, es la de Kabat et al. (1991 ). Los residuos en las regiones de la estructura (CDRs exteriores) que difieren entre 7C10 VH y el subgrupo l(A) de ratón de Kabat (SEQ ID No. 71 ), están subrayados. Un punto indica que el residuo es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VH de ratón. AN03 L (SEQ ID No. 70) representa la secuencia de la cadena pesada de un anticuerpo de ratón (el número de acceso en la base de datos de Kabat es P001289). Figura 23: Comparación de las secuencias de aminoácidos de 7C10 VH de ratón (SEQ ID No. 69) con las de las cadenas pesadas de humano que pertenecen al subgrupo II de humano de Kabat (SEQ ID No. 72), y teniendo la homología de secuencias más grande. Los residuos subrayados forman parte de las estructuras canónicas definidas por Chothia et al. (1989). Un punto indica que el residuo es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VH de ratón. VH FURI'CL de humano (SEQ ID No. 73) representa la secuencia de la cadena pesada de un anticuerpo anti-lamina B de humano IgM/K de origen autoinmune (Mariette et al., Arthritis and Rheumatism, 36: 1315-1324, 1993; número de acceso en Kabat: N020619). La línea germinal de humano (SEQ ID No. 74) representa la secuencia de la línea germinal de humano 4.22 VH IV (Sanz et al., E BO. J. 8: 3741 -3748, 1989). Figura 24: Comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas (VH) de 7C10 de ratón (SEQ ID No. 69), y de las tres versiones humanizadas, mediante injerto de CDR, VH humanizada 1 , 2 y 3 (respectivamente, SEQ ID Nos. 75, 79 y 83). La numeración de los residuos corresponde a la de Kabat. Las secuencias están alineadas, y se comparan con las de 7C10 VH de ratón. Un punto indica que el residuo es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VH de ratón. Figura 25: Secuencia de ADNc (SEQ ID No. 76), su cadena complementaria (SEQ ID No. 78) y su traducción en aminoácidos (SEQ ID No. 77), del gen construido mediante ensamble de novo que codifica para el péptido guía y la versión humanizada 1 de 7C10 VH. Figura 26: Secuencia de ADNc (SEQ ID No. 80), su cadena complementaria (SEQ ID No. 82) y su traducción en aminoácidos (SEQ ID No. 81 ), del gen construido mediante ensamble de novo que codifica para el péptido guía y la versión humanizada 2 de 7C10 VH. Figura 27: Secuencia de ADNc (SEQ ID No. 84), su cadena complementaria (SEQ ID No. 86) y su traducción en aminoácidos (SEQ ID No. 85), del gen construido mediante ensamble de novo que codifica para el péptido guía y la versión humanizada 3 de 7C10 VH. Figura 28: Comparación de la actividad de reconocimiento del receptor IGF-1 por el anticuerpo quimérico 7C10 (denominado "C7C10") y su versión humanizada 1 (7C10 hum 1 ) en ELISA. Figura 29: Influencia sobre la actividad de reconocimiento del receptor IGF-1 de las versiones humanizadas 1 y 2 de la cadena ligera del anticuerpo 7C10 en ELISA. Figura 30: Comparación de la actividad de reconocimiento del receptor IGF-1 por el anticuerpo quimérico 7C10 y tres versiones humanizadas de la cadena pesada (7C10 hum 1 , 2 y 3) en combinación con 7C10 VL 2 humanizado en ELISA. Figura 31 : Actividad antitumoral del anticuerpo 7C10 en un modelo ortópico A549. Figuras 32A, 32B, 32C y 32D: Estudio de la ADCC observada al nivel de células A549 y MCF-7 cultivadas durante 4 horas en presencia del anticuerpo 7H2HM (respectivamente, figuras 32C y 32D). El anticuerpo h4D5 se usa en paralelo como un control positivo del experimento para las células A549 y MCF-7 (respectivamente, figuras 32A y 32B).

Figuras 33A, 33B y 33C: Efectos de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM sobre el ciclo celular de las células MCF-7. La figura 33A representa la proporción de células MCF-7 en la fase G0/G1 , S y G2/M en ausencia del IGF1 , expresada como un porcentaje significativo del total de células MCF-7 observadas. La figura 33B representa la proporción de células MCF-7 en la fase G0/G1 , S y G2/M en presencia del IGF1 , expresada como un porcentaje del total de células MCF-7 observadas. La figura 33C representa la proporción de células MCF-7 en la fase S ( ) y G2/M ( ), expresada como un porcentaje del total de células MCF-7 observadas, en presencia de los compuestos indicados en la figura, en comparación con una muestra control en ausencia del IGF1 ("0"). Figuras 34A y 34B: Efecto comparativo de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM sobre el crecimiento de células A549 in vitro (figura 34A) y sobre el crecimiento de células MCF-7 in vivo (figura 34B). Figuras 35A y 35B: Estudio de la sinergia del anticuerpo 7H2HM combinado con navelbina (NA) sobre el modelo A549 in vivo, en comparación con las muestras control. La figura 35A representa el desarrollo del volumen del tumor implantado como una función del tratamiento llevado a cabo partiendo del comienzo del tratamiento y durante aproximadamente 50 días (figura 35A). La figura 35B representa, en una forma particular, los resultados obtenidos para este desarrollo comparado en aproximadamente 48 días. En esta figura, los resultados obtenidos con el anticuerpo 7C10 se han introducido a manera de comparación (los asteriscos (*) corresponden al grupo control de comparación/grupo (7C10 + Na) o grupo control/grupo (7H2HM + Na) en una prueba t). Figura 36: Estudio del efecto de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM sobre la apoptosis. Esta figura representa la potenciación del efecto de la doxorrubicina por los anticuerpos 7C10 y 7H2HM (doxorrubicina, 2 µglp^\). Figuras 37A a 37D: Demostración mediante marcación en FACS, de la presencia del EGFR y del IGF-IR sobre la superficie de células A549. Figura 38: Efecto de una coadministración del MAB 7C10 y 225 sobre el crecimiento ¡n vivo del tumor A549. Figura 39: Efecto de una coadministración del MAB 7C10 y 225 sobre la supervivencia de ratones implantados ortópicamente con células A549. Figuras 40A y 40B: Demostración de la inhibición de la fosforilación de tirosina de la cadena beta del IGF-IR y de IRS-1 por el MAB 7C10 y 7H2HM. Figura 41 : Demostración de la inducción de la incorporación del IGF-IR por el MAB 7C10 y 7H2HM. Figuras 42A a 42C: Demostración de la degradación del IGF-IR por el MAB 7C10 y 7H2HM.

EJEMPLO 1 Generación y selección del anticuerpo monoclonal (MAb) de murino Con el propósito de generar MAbs dirigidos específicamente contra el IGF-IR, y no reconociendo al IR, se concibió un protocolo que comprendiera 6 etapas de selección: Consistía de: inmunización de ratones con IGF-IR recombinante, para generar hibridomas, selección de los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA sobre la proteína recombinante que sirvió para la inmunización, puesta a prueba de todos los sobrenadantes de hibridomas positivos mediante ELISA sobre el receptor nativo sobreexpresado sobre la superficie de células tumorales MCF-7, evaluación de los sobrenadantes de hibridomas positivos en las dos primeras selecciones en términos de reconocimiento diferencial del IGF-IR y del IR sobre células de insecto infectadas con baculovirus que expresan respectivamente al IGF-IR o al IR, verificación de que los anticuerpos seleccionados en esta etapa fueran capaces de inhibir in vitro la proliferación de las células MCF-7 inducida por el IGF1 , garantía de la actividad in vivo, en ratones desnudos, del candidato retenido en términos de impacto sobre el crecimiento del tumor MCF-7. Todos estos resultados y etapas diferentes obtenidos, se describirán brevemente a continuación en el ejemplo 1. Para la etapa de inmunización, se inyectó a los ratones dos veces, mediante la vía subcutánea, con 8 µ9 del IGF-IR recombinante. Tres días antes de la fusión de las células de la rata hembra con las células del mieloma de murino Sp20Ag14, se estimuló a los ratones mediante una inyección intravenosa de 3 µg del receptor recombinante. Catorce días después de la fusión, los sobrenadantes de hibridomas se seleccionaron mediante ELISA, sobre placas sensibilizadas por el IGF-IR recombinante. Los hibridomas cuyo sobrenadante se encontró era positivo, se conservaron y amplificaron antes de ser puestos a prueba sobre el FACScan para verificar que los anticuerpos producidos fueran asimismo capaces de reconocer al IGF-IR nativo. Para hacer esto, se incubaron células MCF-7 de un tumor de mama dependiente de estrógeno que sobreexpresara al IGF-IR, con cada uno de los sobrenadantes de cultivo producidos por los hibridomas seleccionados en ELISA. Los complejos del receptor nativo/MAb sobre la superficie de la célula, fueron revelados por un anticuerpo anti-especie secundario acoplado a un fluorocromo. Las figuras 3A a 3C muestran un tipo de histograma obtenido con el sobrenadante del hibridoma 7C10 (figura 3C) comparado con una marcación de células solas + anticuerpo secundario (figura 3A), o con una marcación usando un isotipo control (figura 3B). En esta etapa de la selección, sólo los hibridomas qufi-sejcmtan.

MAbs al mismo tiempo que reconocen al receptor recombinante y el receptor nativo, fueron seleccionados y clonados. El MAb secretado por estos hibridomas se obtuvo y se purificó entonces antes de ser puesto a prueba sobre el FACScan, de acuerdo al método descrito anteriormente, sobre células de insecto Sf9 que expresan al IGF-IR o al IR, para eliminar los hibridomas al mismo tiempo que reconocen a los dos receptores. La figura 4A , muestra una recuperación total de los histogramas 1 , 2, y 3 que corresponden, respectivamente, a las células no infectadas + anticuerpos secundarios (1 ), a las células no infectadas marcadas por alR3 + anticuerpos secundarios (2), y a las células no infectadas marcadas por un anticuerpo anti-IR + anticuerpos secundarios (3). Este primer resultado muestra bien la ausencia del IGF-IR y el IR detectable sobre la superficie de estas células de insecto no infectadas. La figura 4B muestra una marcación de células infectadas por un baculovirus que expresa al IGF-IR. En esta segunda figura, el alR3, usado como control positivo, marca bien, como era de esperarse, a las células (valor máximo 2), mientras que el anti-IR (valor máximo 3) se sobrepone sobre el valor máximo de células individuales. Por último, en la figura 4C, se muestra que el anti-IR marca bien, como era de esperarse, a las células Sf9 que expresan al IR (valor máximo 3), pero en forma inesperada, el alR3 descrito en la literatura como específico para el IGF-IR parece asimismo reconocer al IR (valor máximo 2). Los resultados obtenidos en este tercer sistema de selección se resumen en el cuadro 1 , y-muestra -la-generación-de— un MAb÷-7-G40, satisfaciendo los criterios de reconocimiento del IGF-IR, y de falta reconocimiento del IR. La isotipificación del MAb 7C10, ha mostrado que incluye una lgG1.

CUADRO 1 Reactividad comparativa del MAb 7C10 sobre células de insecto Sf9 que expresan al IGF-IR o al IR Las dos últimas selecciones provistas por la selección del MAb, consistieron en verificar que la última fuera capaz de inhibir la proliferación celular inducida por el IGF-1 in vitro e in vivo sobre la línea de células MCF-7. Para la selección in vitro, las células MCF-7 fueron inoculadas, privadas de suero de ternera fetal, e incubadas entonces en presencia de concentraciones crecientes de IGF-1 (de 1 a 50 ng/ml) en presencia o en ausencia del anticuerpo 7C10 que se va a poner a prueba añadido a una concentración final de 10 µg/ml. En este experimento, el MAb alR3 comercial se introdujo como un control positivo, y el MAb 7G3 (aislado en paralelo al 7C10, y que reconoce débilmente al receptor nativo (MFI en el FACS de 50 en comparación con 200 para el MAb 7C10)) como un isotipo control. La proliferación celular se calcula siguiendo, en el contador beta, la incorporación de timidina tritiada por las células. Los resultados se expresan como un índice proliferativo. Los datos presentados en la figura 5 muestran que el IGF1 es capaz de estimular en una forma dependiente de la dosis, la proliferación de las células MCF-7. El MAb lR3, usado como control positivo, inhibe completamente la proliferación de las células MCF-7 inducida por el IGF-1. Del mismo modo, el MAb 7C10 inhibe significativamente el crecimiento de las células MCF-7 inducido por el IGF-1. Por último, el MAb 7G3 usado como un isotipo control resulta, como era de esperarse, sin efecto alguno sobre el crecimiento de células tumorales in vitro en las células MCF-7. La selección in vivo se llevó a cabo en un modelo de tumor establecido. Para hacer esto, ratones desnudos recibieron un implante subcutáneo de estrógeno de liberación lenta, indispensable para la absorción del tumor en un modelo de murino. Veinticuatro horas después de la implantación de los estrógenos, se injertan subcutáneamente 5.106 células MCF-7 sobre el flanco derecho del ratón. Cinco días después de este injerto de células, los tumores se miden, y se forman al azar lotes de 6 ratones. El tratamiento de los ratones se lleva a cabo dos veces por semana, durante 5 a B^ejmaims^-j-Ua-dosis-jcIfi-^^ se tratan de la misma forma con un isotipo control de murino. Los resultados presentados en la figura 6A muestran una inhibición muy significativa del crecimiento del tumor inducida por el anticuerpo 7C10. Esta actividad es particularmente inesperada si se hace referencia a los datos disponibles respecto a alR3, usado siempre como una referencia en el dominio del receptor para el IGF1 , y conocido por carecer de actividad in vivo sobre el crecimiento de tumores dependiente de estrógeno (véase la figura 6B). De la misma forma, en comparación con los resultados obtenidos con el anticuerpo recombinante scFv-Fc derivado del MAb 1 H7 de murino (véase la figura 6C), el MAb 7C10 es mucho más eficaz en la inhibición in vivo del crecimiento de las células MCF-7.

EJEMPLO 2 Comparación del efecto de 7C10 y del tamoxifeno sobre el crecimiento in vivo del tumor MCF-7 Con el propósito de determinar la eficacia del tratamiento mediante el anticuerpo 7C10 en el contexto del cáncer de mama dependiente de estrógeno, se comparó a 7C10 con el compuesto tamoxifeno usado comúnmente para el tratamiento de carcinoma de mama en el contexto de formas desarrolladas con progresión local y/o metastásica, y en el contexto de la prevención de recidivas (véase VIDAL 2000, págs. 1975-1976). En cánceres de mama dependientes de hormonas, existe una correlación significativa entre la expresión de los receptores para estrógenos (ER) y la del IGF-IR (Surmacz E. et al., Breast Cáncer Res. Treat., feb 47(3): 255-267, 1998). Además, parece ser que los estrógenos (E2) actúan en sinergia con el IGF1 (escrito a veces como IGF-I o IGFI), para estimular la proliferación celular. En efecto, se ha mostrado que un tratamiento con E2 incrementa aproximadamente 10 veces el nivel del ARN mensajero del IGF-IR, así como el nivel de expresión de la proteína (Lee A.V. et al., Mol. Endocrinol., may 13 (5): 787-796, 1999). Este incremento se manifiesta por un incremento significativo en la fosforilación del IGF-IR. Además, E2 estimula significativamente la expresión del IRS-1 ("IRS-1 " para "substrato receptor de insulina-1 "), que es uno de los substratos del IGF-IR fosforilado. El tamoxifeno se ha usado ampliamente por muchos años en terapia hormonal para el tratamiento de pacientes que sufren de cánceres de mama dependientes de E2 (Forbes J. F., Semin. Oncol., feb 24 (1er. Supl. 1 ): S1 -5-S1 -19, 1997). Esta molécula entra en competencia con el estradiol, e inhibe la unión de éste a su receptor (Jordán V.C., Breast Cáncer Res. Treat., 31 (1 ): 41 -52, 1994). Además, se ha demostrado que el tamoxifeno es capaz de inhibir la proliferación dependiente del IGF-IR, inhibiendo la expresión del receptor y su fosforilación (Guvakova M. A. et al., Cáncer Res., julio 1 , 57(13): 2606-2610, 1997). Estos datos como un todo parecen indicar que el IGF-IR es un mediador importante de la proliferación inducida por la interacción E2/ER. El uso de tamoxifeno a largo plazo se asocia con un incremento significativo en el riesgo de cáncer endometrial (Fisher et al., J. of National Cáncer Institute, 86, 7: 527-537, 1994; VIDAL 2000, 1975-1976), y de recidiva colateral de cáncer de mama independiente de E2 (Li C. I. et al., J. Nati. Cáncer Inst. julio 4, 93(13): 1008-1013, 2001 ). En este contexto, se ha hecho una comparación del efecto antitumoral in vivo del anticuerpo 7C10 y del tamoxifeno en el modelo de MCF-7, para determinar la parte de la actividad relacionada con el IGF-IR en la proliferación mediada por ER. Para hacer esto, se implantaron 7.106 células MCF-7 se (subcutáneamente) en ratones desnudos, 24 horas después de la implantación, en estos mismos ratones, de 64.79 mg de estradiol con liberación prolongada (0.72 mg/tableta liberada durante 60 días), indispensable para el establecimiento de cualquier tumor humano dependiente de E2 en esta especie animal. Cinco días después de esta implantación, los tumores se miden, y se forman grupos de 6 ratones. Estos grupos se tratan respectivamente con 1 ) el anticuerpo 7C10 inyectado ip (¡ntraperitonealmente) a un régimen de 250 µg ratón, dos veces por semana, 2) 10 g de tamoxifeno administrado en PBS que contiene 3% de hidroxipropilcelulosa (HPC) ip, o 3) el solvente en el cual el tamoxifeno se absorbe (hidroxipropilcelulosa). El tamoxifeno se administra diariamente durante 4 semanas, salvo el fin de semana. Los ratones tratados con el MAb 7C10 reciben asimismo diariamente una inyección de PBS con HPC a 3%. Se llevó a cabo previamente un estudio para verificar que el solvente solo carece de efecto sobre el crecimiento del tumor. Los resultados presentados en la figura 7 muestran que el MAb 7C4-0-es^apaz-deJnhib¡r_^ig vivo (los asteriscos (*) corresponden al grupo control de comparación/grupo de 7C10 en una prueba t). En forma sorprendente, el anticuerpo 7C10 parece ser significativamente más eficaz que el tamoxifeno para la inhibición del crecimiento del tumor (los círculos (°) corresponden a la comparación del grupo de tamoxifeno/grupo de 7C10 en una prueba t), sugiriendo que este tipo de tratamiento mediante MAb podría sustituir al tratamiento con tamoxifeno.

EJEMPLO 3 Demostración de la actividad antitumoral del MAb 7C10 in vivo sobre tumores humanos de diferentes orígenes a) Actividad in vivo del anticuerpo 7C10 en tres modelos de tumor Para generalizar la actividad del anticuerpo 7C10 hacia otros tumores que expresan al receptor para IGF1 , se puso a prueba 7C10 in vivo en un modelo de tumor de próstata DU145 independiente de andrógenos (escrito asimismo como DU-145), en un modelo de osteosarcoma SKES-1 y en un modelo de tumor pulmonar de células no pequeñas A549. El protocolo es comparable al descrito anteriormente para MCF-7, y los resultados presentados en las figuras 8A a 8C muestran una actividad significativa de este MAb en los tres modelos de tumor. La actividad observada en el modelo de tumor de próstata se observará muy particularmente a pesar de que la cadena sencilla scFv del MAb H7 carece de actividad en un modelo de tumor de próstata independiente de andrógenos (Li et al., 2000). b) Actividad in vivo del anticuerpo 7C10 en un modelo ortópico de A549 Los modelos de xenoinjerto convencionales descritos anteriormente, no permiten el estudio de fármacos sobre la diseminación metastásica. En efecto, los tumores implantados s.c. (subcutáneamente) continúan siendo localizados a la vista de la inyección, y no son por lo tanto realmente una reflexión de la situación en el hombre. Para evaluar el anticuerpo en cuestión de los autores en un modelo más cercano a la realidad, se implantaron las células A549 en un sitio intrapleural. Este modelo, el cual está bien descrito (Clin. Cáncer. Res. 2000 ene; 6(1 ): 297-304), permite observar una diseminación metastásica cercana a la observada en el hombre, con metástasis mediastinal, pulmonar, cardiaca y vertebral. En el estudio que se llevó a cabo, se inyectaron intraneuralmente 106 células A549 en ratones desnudos hembras. Siete días después de la implantación, se dividió a los ratones en dos lotes de 22. Uno de estos lotes recibió una dosis de desafío de 500 µ? Gß???, y se trató entonces dos veces por semana a un régimen de 250 µg de 7C10/dosis. El segundo lote se trató de acuerdo al mismo esquema con el isotipo control 9G4. La figura 31 muestra una extensión de supervivencia significativa en los ratones tratados con el MAB 7C10, indicando que este anticuerpo es capaz de tener una acción sobre la diseminación metastásica.

EJEMPLO 4 Comparación del MAb 7C10 con navelbina ín vivo: efecto de una coadministración de los dos tratamientos La navelbina es un compuesto de quimioterapia indicado en cáncer pulmonar de células no pequeñas y en cáncer de mama metastásico. Se hizo un estudio comparativo de 7C10 y de navelbina, y se estudió la sinergia posible entre los dos productos sobre el modelo de tumor A549. Para este estudio, se insertaron subcutáneamente 5.106 células A549 en el flanco derecho del ratón. Cinco días después del injerto de células, se miden los tumores, y se inician los tratamientos con MAb y/o navelbina. La dosis de MAb es siempre de 250 µ9^?5?8/G8???, dos veces por semana, intraperitonealmente. Respecto a la navelbina, se administrará a la dosis máxima tolerada por el ratón o 10 mg/kg, intraperitonealmente. Para este tratamiento, se aplicarán tres inyecciones a intervalos de 7 días. Durante las coadministraciones, los dos productos se mezclan antes de la inyección. Los resultados presentados en la figura 9, muestran en una forma sorprendente que, en este modelo, el anticuerpo 7C10 es tan efectivo como el tratamiento convencional con navelbina. Una sinergia muy significativa de los dos productos se observa asimismo con cinco de siete ratones que no tienen tumores mensurables en el día 72.

EJEMPLO 5 Estudio de la inhibición in vitro del crecimiento de los tumores MCF-7 inducido por el IGF2 Como se indicó anteriormente, el IGF-IR es sobreexpresado por numerosos tumores, pero se ha descrito además que en una buena parte de los cánceres de mama y de colon especialmente, la señal de proliferación se da para este receptor mediante el IGF2 (escrito a veces como IGF-I I o IGFI I). Por lo tanto, es esencial asegurarse de que el MAb 7C10 sea capaz asimismo de inhibir el crecimiento del tumor MCF-7 in vitro inducido por el IGF2. Para hacer esto, se inocularon células en placas de 96 cavidades, carentes de suero de ternera fetal, y se estimularon mediante la adición de 200 ng de IGF2 por mi, concentración final de medio, en presencia y en ausencia del MAb que se va a poner a prueba introducido a una concentración de 10 µg/ml. Los resultados presentados en la figura 10, muestran que el IGF2, al igual que el IGF1 , estimula significativamente el crecimiento de células MCF-7. La adición de un isotipo control, 9G4, continúa careciendo de efecto sobre esta estimulación. Como es descrito por De Léon et al. (Growth Factors, 6: 327-334, 1992), no se observa efecto alguno durante la adición del MAb lR3. Por otra parte, 7C10 inhibe totalmente el crecimiento inducido por el IGF2. Su actividad es significativamente mejor que la de 1 H7.

EJEMPLO 6 Actividad biológica de los anticuerpos 7C10 quiméricos (C7C10) y 7C10 humanizados (h7C10) a) Comparación de 7C107C7C10 v 7C10/h7C10 en el modelo de MCF-7 in vitro Se pusieron a prueba in vitro la forma quimérica del MAb 7C10 y la forma humanizada 1 purificada (escrita aquí como 7H2HM) en el modelo de MCF-7 como se describió anteriormente. Los resultados presentados respectivamente en las figuras 1 1 y 12, muestran que estas dos formas tienen perfectamente preservadas sus propiedades para inhibir el crecimiento del tumor MCF-7 inducido por el IGF-1. b) Efecto comparativo del MAb 7C10 v h7C10 sobre la transducción de la señal inducida por la unión del IGF1 a su receptor La actividad de la inhibición del crecimiento inducido in vitro por el IGF1 sobre la línea MCF-7, sería necesaria para la traducción de una inhibición de la transducción de la señal mediada por el IGF1 durante la unión del MAb 7C10 al receptor. Para verificar esta hipótesis, se incubaron células MCF-7 con o sin IGF1 , en presencia o en ausencia de los anticuerpos que se van a poner a prueba. Después de un tiempo de incubación breve, las células fueron lisadas, la cadena beta fue inmunoprecipitada, y se calculó la fosforilación de esta subunidad usando un anticuerpo de antifosfotirosina cinasa. Los resultados presentados en la figura 13, muestran que la unión del 7C10 o del h7C10 inhibe significativamente la fosforilación de la subunidad beta del IGF-IR, opuestamente a un anticuerpo irrelevante de murino (9G4) o humano (escrito como lgG1 en el esquema). c) Intervención del anticuerpo 7H2H en los mecanismos de ADCC La inhibición de la transducción de la señal descrita anteriormente en el párrafo b), es el mecanismo de acción principal que interviene en la actividad biológica de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM. Sin embargo, es probable que durante su administración en el hombre, el anticuerpo 7H2HM, de isotipo lgG1 , sea capaz de inducir lisis celular mediante un mecanismo de tipo ADCC (citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo). Para verificar este punto, se ponen células NK (células asesinas naturales) provenientes de la sangre periférica de donadores humanos, en presencia de células A549 o MCF-7 incubadas previamente durante 4 horas con 10 µg de anticuerpo 7H2HM por 5.105 células, y marcadas con 51Cr (50 µg). En este experimento, se usa herceptina (escrita como h4D5 en las figuras 32A y 32B), como un control positivo del experimento. Las figuras 32A a 32D muestran que, como era de esperarse, la herceptina induce una ADCC significativa sobre las células A549 y MCF-7 (véase, respectivamente, las figuras 32A y 32B). 7H2HM es asimismo capaz de inducir una ADCC sobre as_j luJa J^49_(yéas£^ menor sobre las células MCF-7 (véase la figura 32D). d) Efectos de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM sobre el ciclo celular La inhibición del crecimiento celular observado in vitro sobre la línea MCF-7, debe manifestarse mediante un efecto sobre el ciclo celular. Para responder a esta cuestión, se inoculan 4.105 células en placas de 6 cavidades. 24 horas después de la inoculación, se remueve el suero de ternera, y se añade IGF1 en presencia o en ausencia de los anticuerpos que se van a poner a prueba. Después de incubación durante 24 horas, las células se recuperan del estudio del ciclo celular. La figura 33B demuestra el efecto del IGF1 sobre la entrada en el ciclo y el crecimiento de las células MCF-7, en comparación con la entrada en el ciclo y el crecimiento de las células MCF-7 en ausencia del IGF1 (véase la figura 33A). Después de la adición del factor de crecimiento, se observa una disminución significativa en la fase G0/G1 (de 88.2% a 56.3%) para el beneficio de las fases S (de 7.8% a 31 %) y G2/M (de 4% a 12.7%). Durante la adición de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM (véase la figura 33C), se observa una inhibición significativa de la entrada en el ciclo. Se observará que el anticuerpo de murino y su homólogo humanizado tienen una actividad comparable sobre el ciclo celular. El alR3, introducido como control positivo, parece ser ligeramente menos activo que el 7C10 y 7H2HM en esta prueba. El anticuerpo 9G4 usado como isotipo control, carece de efecto sobre el ciclo celular. e) Actividad comparativa in vivo de los anticuerpos 7C10 v 7H2HM sobre el modelo A549 Para confirmar la actividad del anticuerpo humanizado 7H2HM in vivo, el último se comparó con 7C10 en el modelo de tumor pulmonar de células no pequeñas A549. Este experimento se llevó a cabo exactamente como se describió anteriormente, salvo por la dosis de anticuerpo que es de 125 µ?^?e?e dos veces por semana en lugar de 250 µ9^05?3 dos veces por semana, y por el hecho de la falta de disponibilidad de mayores cantidades de 7H2HM. El anticuerpo 9G4 se usó como isotipo control para 7C10, y una inmunoglobulina humana irrelevante de isotipo lgG1 (denominada más adelante como HlgG1 ), se usó como control para el anticuerpo humanizado 7H2HM. La figura 34A muestra que no existen diferencias significativas entre las curvas control de 9G4 y HlgG1 . Como era de esperarse, se observa una inhibición significativa del crecimiento del tumor con el anticuerpo de murino 7C10. Respecto al anticuerpo humanizado 7H2HM, la actividad observada es de exactamente la misma intensidad que la observada con su contraparte de murino. Estos datos, además de las observaciones descritas anteriormente in vitro, indican que la humanización no ha modificado las propiedades del anticuerpo generado. Por otra parte, en los modelos de xenoinjerto en el ratón, la actividad del anticuerpo humanizado parece estar relacionada integralmente con un mecanismo de inhibición de la transducción de la señal. En efecto, si jjjna_ .parte de_ADCC estaba en j.u_ego_eji la Jnhjbjción_ del crecimiento del tumor en el ratón desnudo, tendría que observarse una diferencia entre la actividad de los anticuerpos de murino y humanizados. Asimismo, se llevó a cabo un experimento in vivo en el modelo de tumor de mama MCF-7 y muestra que, como era de esperarse, el anticuerpo 7H2HM es perfectamente comparable con el anticuerpo de murino 7C10 para la inhibición del crecimiento de este tumor in vivo (figura 34B). f ) Demostración de una sinergia entre 7H2HM y navelbina El protocolo descrito en el ejemplo 4 se repitió con el propósito de reproducir los resultados obtenidos con 7C10 con su homólogo humanizado: el anticuerpo 7H2HM. Los resultados presentados en las figuras 35A y 35B muestran que, como en el caso de 7C10, se demuestra una sinergia significativa entre el anticuerpo humanizado 7H2HM y navelbina. g) Efecto de los anticuerpos 7C10 v 7H2HM sobre la apoptosis de células MCF-7 in vitro Como se indicó anteriormente, el IGF-IR es capaz de conferir protección contra la apoptosis cuando es sobreexpresado sobre la superficie de las células. Además, se ha demostrado en estos ejemplos que los anticuerpos 7C10 y 7H2H fueron capaces de potenciar un compuesto activo en quimioterapia. Para poner a prueba la potencia de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM para inducir apoptosis, y para explicar en parte su potencial de sinergia con la quimioterapia, se realizaron experimentos en las células MCF- 7 en presencia o en ausencia de doxorrubicina, un medicamento conocido por inducir apoptosis de esta línea de células in vitro. En estos experimentos, las células MCF-7 se inoculan a 2.104/cm2 en cajas de Petri, y se cultivan durante 24 horas en RPMI sin rojo de fenol complementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS). Las células se lavan entonces dos veces con PBS, y se ponen de nuevo en cultivo en medio con FCS a 0%. Se les permite un tiempo de adaptación de 10 minutos a 37°C antes de la adición de los anticuerpos a 0 µ?/???. Después de otros 10 minutos a 37°C, se añade al medio de cultivo IGF-I recombinante (Sigma), hasta una concentración final de 50 ng/ml. Las células se dejan de nuevo a 37°C durante 1 hora, para permitir la unión de los anticuerpos y del IGF-I. Por último, se añade la doxorrubicina (Sigma) al medio de cultivo a 2 µg/ml) y las células se incuban durante 24 horas a 37°C. Asimismo, los experimentos se han llevado a cabo con navelbina a una concentración de 10 µg/ml. El análisis de la viabilidad celular se lleva a cabo mediante análisis de citometría de flujo después de marcación con la anexina V-FITC (20 minutos, 4°C) y DAPI (2 µ?/?t??). El porcentaje de células muertas consideradas, es la población marcada con anexina +/DAPI +. Se usa el anticuerpo 5C2 como un isotipo control. Los resultados representados en la figura 36, muestran que la doxorrubicina induce apoptosis en 8% de las células MCF-7. Cuando las eélulas-se-tr-aten-eonjuntamente-eon-el anticuerpo 7G-†0-y-la doxorrubicina se — observa un incremento significativo en la muerte celular. Se muestra el mismo efecto con el anticuerpo 7H2HM. El mismo tipo de resultados se observó cuando el anticuerpo se combina con navelbina.

EJEMPLO 7 Estrategia de clonación de genes que codifican para las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal (MAb) 7C10 Se extrajo el ARN total de 107 células de hibridomas que secretan el anticuerpo 7C10 usando el TRI REAGENT™ (de acuerdo a las instrucciones dadas por el proveedor, SIGMA, T9424). Se sintetizó la primera cadena de ADNc usando el equipo de "síntesis de la primera cadena de ADNc" de Amersham-Pharmacia (#27-9621-01 , de acuerdo a las instrucciones dadas por el proveedor). Para las dos cadenas, la reacción fue cebada con el oligonucleótido Not l-d(T) 8, incluido en el equipo. El híbrido de ADNc: ARN mensajero obtenido de esta manera, se usó para la amplificación, mediante PCR, de los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera del MAb 7C10. La PCR se llevó a cabo usando una combinación de oligonucleótidos específicos para las cadenas pesada y ligera (kappa) de inmunoglobulinas de ratón. Los iniciadores que corresponden a los extremos 5' hibridan en la región que corresponde a los péptidos de señal (cuadro 2 para cadenas pesadas, cuadro 3 para cadenas ligeras). Estos iniciadores se compilaron de un gran número de secuencias de anticuerpos de ratón encontradas en los bancos de datos (Jones S. T. et al., Bio/Technology 9: 88-89, 1991 ). Los iniciadores que corresponden a los extremos 3' hibridan en las regiones constantes de las cadenas pesadas (dominio CH1 de la subclase de lgG1 , no lejos de la unión V-C, iniciador MHC-1 , cuadro 4) y cadenas ligeras (dominio kappa no lejos de la unión V-C, iniciador MKC, cuadro 4).

CUADRO 2 Oliqonucleótidos iniciadores para la región 5' de los dominios variables de las cadenas pesadas de inmunoglobulina de ratón (MHV) ("MHV" para "variable pesada de ratón") t-ÍHV- 1 : D ' A7GAAA7GCAGC7GGG7CA7577C7T ÍSEQ I D NO . 13) MKV-2 : 5' A7GGGA7GGAGC7RTA7CA7S 7CT7 3' (SEQ ID NO . 14) MHV- 3: 5' A7GA GWTGTGGTTAAACTGGG77T7 {SEQ ID No. 15) MHV- 4 : C f J A G A.CTTTGG VTCAGCTTG?, 3 ' (SEQ ID No . 16) MHV- 5 : 5' A7GGAC7CCAGGC7CAA.TTTAG7TT7 (SEQ ID No. 17) MHV-6: 5' ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCT "i / ¡SEQ ID No . 18) MHV- 5' ATGGRATGGAGCKGGR7CT77H7CT7 (SEQ ID No. 19) HV-8 : 5' A7GAGAGTGCTGATTCTTTTGTG 3' (SEQ ID NO. 20) KHV-9: 5' ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGC7A7T ÍSEQ ID No. 21) HV- 10: 5' A7GGGCAGACT7ACA7TC7CA77CC7 (SEQ ID No. 22) MHV- 11 : A7GGA77T7GGGC7GA777T7777.-.7 7G 3' (SEQ ID No. 23) MHV- 12: 5' A7GATGGTGT7AAG7C77C7G7ACC7 3' ÍSEQ ID No. 24) CLAVE PARALAS BASES ¦a - t. / r Y=T J C W = & /T K — T ? C M = l /r " = G DE NUCLEOTIDOS: R ^7 ' ^ K-T / G , .. .. /c -- CUADRO 3 Oligonucleotidos iniciadores para la región 5' de los dominios variables de las cadenas kappa (ligeras) de inmunoglobulina de ratón (MKV) ("MKV" para "variable kappa de ratón") ;.¡KV-í : 5' ATGAGGTKCYYTGYTSAGY7Y — *— í"^ — — 3' ÍSEQ ID No. 31) MKV- 7 : ATGGGCWTCAAGATGGAGTCA (SEQ ID No. 32) MKV- 8 : 5' ATGTGGGGAYCTKTTTYCMM7 3' (SEQ ID No. 33) MKV- 5 : 5' ATGGTRTCCWCASCTCAGTTC :IT i' ¡SEQ ID Ho. 34) MKV- 10 : b' ATGTATATATGT7TGTTG7C7 ;~r~ ~ 3' (SEQ ID No. 25) MKV- 11 : 5' ATGGAAGCCCCAGCTCAC-:TI ZZC1Z 3' (SEQ ID No . 36) KV-12A: 5' ATGRAGT Yw'CAGACCCAGGTZ __v._ 3' ÍSEQ ID No. 37) MKV-12B: 5' ATGGAGACACATTCTCAGGTC - 1 3' (SEQ ID No. 38) MKV- 13 : 5' ATGGATTCACAGGCCCAC-j"T :G~?? 3 (SEQ ID No . 39) CLAVE RARA LAS BASES DE NUCLEOTOOS: R=A/G, Y=T7C, W=A/7, K=T/G,M=A/C,S=C/G.

CUADRO 4 Oligonucleotidos iniciadores para los extremos 3' de los genes de VM y Cadena ligera (MKC): 5 ACTGGATGGTGGGAAGATGG 3' (SEQ ID No.40) Región constante del dominio kappa de ratón: A D A A P T V S I F P P S S (SEQ ID No.41) GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA TCC AGT (SEQ ID No.42) II MI III I I I I I I I I I III (MKC) CC ATC TTC CCA CCA TCC AGT (SEQ ID No.43) 6adena-pesaria-( He^1 5'-CCAGTGGATAGACAGATG 3' (SEQ ID No. 44) Dominio CH1 de gamma-1 de ratón (subclase de lgG1 ): A K . T T P P S V Y P L (SEQ ID No. 46) GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG (SEQ ID No. 45) I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I (MHC-1 ) CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG (SEQ ID No. 47) EJEMPLO 8 Secuencias de inmunoglobulinas clonadas del hibridoma de ratón 7C10 Siguiendo la estrategia de amplificación descrita anteriormente, se clonaron productos de PCR que correspondían a las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL), usando los "sistemas de vector "pGME®-T Easy" (Promega). Para 7C10 VL, se obtuvieron productos de PCR con el iniciador MKC en combinación con los iniciadores MKV1 y MKV2. Para 7C10 VH, se obtuvieron productos de PCR con el iniciador MHC-1 en combinación con los iniciadores MHV8 y MHV12. Una secuenciación completa de los productos de PCR clonados en los vectores pGem-T easy, reveló dos secuencias diferentes para la cadena ligera, y una secuencia única para la cadena pesada. a) Región variable aislada del oliaonucleótido MKV1 La secuencia de ADN obtenida, es característica de una región variable de Ig funcional. Se presume por lo tanto que esta secuencia novedosa es la que codifica para 7C10 VL. Las secuencias de ADN (SEQ ID Nos. 48 y 50) y de aminoácidos (SEQ ID No. 49) del ADNc que codifica para 7C10 VL, se representan en la figura 14. b) Región variable aislada del oligonucleótido MKV2 El gen que codifica para esta cadena ligera, proviene de un transcrito de ARN mensajero aberrante que está presente en todos los miembros de fusión comunes derivados del tumor MOPC-21 original del cual forma parte el mieloma de ratón Sp2/Oag14, el cual se usó para producir el hibridoma 7C10. Esta secuencia contiene una recombinación aberrante entre los genes V y J (deleción de cuatro bases de nucleótidos que incluyen un cambio en el marco de lectura) y una mutación de la cisteína invariable en la posición 23 a tirosina. Estos cambios sugieren que esta cadena ligera sería no funcional, aunque no obstante transcrita a ARN mensajero. No se muestra la secuencia de ADN de esta pseudocadena ligera. c) Región variable aislada de los oligonucleótidos MHV8 y MHV12 Las secuencias de ADN obtenidas con estos oligonucleótidos son idénticas, además de la secuencia codificada por el oJjgonucleátido. mismo. Esta secuencia es una secuencia novedosa que codifica para una cadena pesada funcional que se presume es la del anticuerpo monoclonal 7C10. Las secuencias de ADN (SEQ ID Nos. 51 y 53) y de aminoácidos (SEQ ID No. 52) del ADNc que codifica para 7C10 VH, se representan en la figura 15.

EJEMPLO 9 Construcción de genes quiméricos de ratón-hombre Se construyó el anticuerpo quimérico 7C10 que tuviera las regiones VL y VH de 7C10 de ratón unidas a las regiones constantes kappa y gamma-1 de humano, respectivamente. Se usaron oligonucleótidos para modificar los extremos 5' y 3' de las secuencias que flanquean al ADN que codifica para 7C10 VL y VH, para permitir su clonación en vectores para expresión en células de mamífero. Estos vectores usan el promotor fuerte HCMV para transcribir efectivamente las cadenas pesada y ligera del anticuerpo quimérico 7C10. Por otra parte, estos vectores contienen asimismo el origen de replicación de SV40, que permite una replicación efectiva del ADN y, como consecuencia, como una expresión transitoria de las proteínas en células COS.

EJEMPLO 10 Expresión y evaluación de la actividad de reconocimiento del receptor IGF-1 del anticuerpo quimérico 7C10 Los dos plásmidos que contienen al ADN que codifica para el anticuerpo 7C10 quimérico, fueron cotransfectados en células COS-7 (número de ATCC CRL-1651 ), para estudiar la expresión transitoria del anticuerpo recombinante. Después de incubación durante 72 horas, el medio de cultivo se removió, se centrifugó para eliminar los restos de células, y se analizó mediante la técnica de ELISA para la producción de lgG1 de humano (véase el ejemplo 16) y el reconocimiento del receptor para el IGF-1 (véase el ejemplo 17). Las pruebas de ELISA para medir las concentraciones de lgG1/kappa de humano, mostraron que la expresión del anticuerpo quimérico 7C10 en las células COS-7, estaba entre 300 y 500 ng/mm, que es comparable a los valores obtenidos con la mayoría de los anticuerpos. Las pruebas de ELISA para el reconocimiento del receptor para IGF-1 , muestran que el anticuerpo quimérico lo reconoce específicamente, y con una buena avidez relativa (véase las figuras 3A, 3B y 3C). Esto provee la prueba funcional de que se ha identificado la buena VH y VL del anticuerpo 7C10. Además, esta forma quimérica de 7C10 parece ser una herramienta indispensable en la evaluación de la afinidad de las formas humanizadas.

EJEMPLO 11 Elaboración de modelos moleculares de las regiones variables del anticuerpo 7C10 de ratón Para facilitar y retinar el procedimiento de humanización mediante "injerto de CDR", se construyó un modelo molecular de las regiones VL y VH del anticuerpo 7C10 de ratón. Este modelo se basa en la estructura cristalográfica de la cadena pesada 1AY1 y de la cadena ligera 2 PCP.

EJEMPL0 12 Procedimiento de humanización, mediante injerto de CDR. de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 7C10 (7C10 VL) a) Comparación de la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL con todas las secuencias de VL conocidas de ratón Como un paso preliminar a la humanización mediante injerto de CDR, se comparó primero la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL con todas las secuencias de VL de ratón presentes en el banco de datos de Kabat (dirección en la Internet ftp://ftp.ebi.ac.uk pub/database/kabat fasta_format/: la última actualización de datos data de 1999). De esta manera, se ha identificado que 7C10 VL pertenece al subgrupo II de las cadenas ligeras kappa, definidas por Kabat et al. (en Sequences of proteins of ¡mmunological interest (5a. ed.), publicación de los NIH No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 1991 ). Se han identificado las regiones de VL de los anticuerpos monoclonales de ratón que tienen una identidad de secuencias que varía hasta 95% (DRB1 -4.3 (SEQ ID No. 55): 95%, y C94-5B1 1 L (SEQ ID No. 56): 95%, véase la figura 17). Para intentar identificar los residuos ordinarios en la secuencia de 7C10 VL, se alineó la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL (SEQ ID No. 54) con la secuencia consenso del subgrupo II de las cadenas kappa de ratón (SEQ ID No. 57), definida por Kabat (véase la figura 17). En la posición número 3 de Kabat, la valina (V) presente normalmente en el subgrupo II de las cadenas ligeras kappa de acuerdo a Kabat (71 %), es reemplazada por una leucina (L). Una leucina en esta posición no es rara, puesto que se encuentra, por ejemplo, en DRB1 -4.3 y C94-5B1 1 'CL. De acuerdo al modelo molecular, este residuo no parece desempeñar una función particular. En consecuencia, no se contemplará la conservación de este residuo en la forma humanizada. En la posición número 7 de Kabat, la treonina (T) presente normalmente en el subgrupo II de las cadenas ligeras kappa de acuerdo a Kabat (66%), es reemplazada por una isoleucina (I). Una isoleucina en esta posición es relativamente rara, puesto que sólo se encuentra 15 veces entre todas las secuencias de VL de ratón conocidas, y nunca entre las secuencias de VL de humano. El modelo molecular muestra que este residuo (17) señala haci a la supe rficie de la molécul a , pero no entra en contacto co n Ja sjC DRs_(_el residuo de una CDR que es el más cercano, sería la arginina en la posición número 42 de Kabat). Además, no parece muy probable que este residuo 7 entre en contacto directamente con el antígeno. En consecuencia, no se contemplará la conservación de este residuo en la forma humanizada, a cualquier régimen al principio. En la posición número 77 de Kabat, la arginina (R) presente normalmente en el subgrupo II de las cadenas ligeras kappa de acuerdo a Kabat (95.5%), es reemplazada por una serina (S). Una serina en esta posición, no es rara. b) Comparación de la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL con todas las secuencias de VL de humano conocidas Para identificar el mejor candidato de humano para el "injerto de CDR", se buscó la región de VL kappa de origen humano que tuviera la mayor homología posible con 7C10 VL. Para este fin, se comparó la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL kappa de ratón con todas las secuencias de VL kappa de humano presentes en la base de datos de Kabat. 7C10 VL de ratón tuvo la mayor homología de secuencias con las regiones de VL kappa de humano del subgrupo II, como es definido por Kabat et al. (1991 ). Se han identificado regiones de VH de anticuerpos monoclonales de origen humano que tienen una identidad de secuencias que varía hasta 75.9% (GM607 (SEQ ID No. 58), véase la figura 18), sobre el total de los 1 12 aminoácidos que forman la región varia ble. Se identificó también jjna Jinea_ger_m i n al_d£_origen- humano, DPK15/A19 (SEQ ID No. 59), que tiene una identidad de secuencias de 76% (véase la figura 18), GM607 (Klobeck et al., 1984). Por lo tanto, se seleccionó a GM607 como una secuencia de humano receptora de CDRs de acuerdo a la definición de Kabat de 7C10 VL de ratón. Mediante la comparación de las secuencias de GM607 con las de la secuencia consenso del subgrupo II de humano (SEQ ID No. 60) (figura 18), no pudo identificarse el residuo particular en las regiones de estructura (Rch), indicando por el mismo hecho que GM607 era un buen candidato para injertos de CDR. c) Versiones humanizadas de 7C10 VL La siguiente etapa en el procedimiento de humanización, consistió en unir las CDRs de 7C10 VL de ratón a las regiones de estructura (Rch) de la cadena ligera de humano seleccionada, GM607 (Klobeck et al., 1984). En esta etapa del procedimiento, el modelo molecular de las regiones Fv de 7C10 de ratón, es particularmente útil en la elección de los residuos de ratón que serán conservados por ser capaces de desempeñar una función en el mantenimiento de la estructura tridimensional de la molécula (estructura canónica de las CDRs, interfaz VH/VL, etc.), o en la unión al antígeno. En las Rchs, se examinó escrupulosamente cada diferencia entre los aminoácidos de ratón (7C10 VL) y de humano (GM607) (véase el cuadro 5). Además, los residuos particulares en la secuencia de 7C10 VL de ratón que se identificaron (véase el ejemplo 12.a) se tomaron en cuenta, si era necesario. - En la primera versión humanizada mediante "injerto de CDR" rip. 7C10 VL, humana 1 , se realizó un cambio individual en las regiones de estructura (Rch) de GM607. Este cambio se refiere al residuo 2 (nomenclatura de Kabat) situado en la Rch 1. Este residuo entra en efecto en la composición de la estructura canónica de la CDR 1 de 7C10 VL, y por lo tanto podría ser crítico para mantener esta asa en su conformación adecuada. La valina presente en esta posición en la secuencia de 7C10 VL de ratón, es de esta manera conservada en esta misma posición en la forma humanizada (véase el cuadro 5 y la figura 19 para la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 61 ), y la figura 20 para la secuencia de ADN (SEQ ID Nos. 62 y 64) y la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de señal (SEQ ID No. 63)). En la segunda versión humanizada mediante "injerto de CDR" de 7C10 VL, humana 2, no se ha hecho cambio alguno en las Rchs de la cadena ligera GM607 de humano. Todos los residuos de las Rchs son de esta manera de origen humano, incluyendo el residuo 2 que ha sido mutado por lo tanto para reemplazar la valina presente en 7C10 VL de ratón, por una ¡soleucina presente en esta misma posición en la cadena ligera GM607 de humano (véase el cuadro 5 y la figura 19 para secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 65), y la figura 21 para la secuencia de ADN (SEQ ID Nos. 66 y 68) y la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de señal (SEQ ID No. 67)). Esta forma 2 de humano es por lo tanto totalmente humanizada (aparte, de hecho, de las CDRs mismas), puesto que todos los residuos de las Rchs son los de la cadena ligera de origen humano, GM607.

CUADRO 5 Alineación de las secuencias de aminoácidos que llevan al diseño de las regiones de 7C10 de humano remodeladas Línea Cadena germinal 7C10 1 de 7C10 2 de FR o ligera de de GM Comen¬ Kabat # humano humano CDR ratón humano 607 tarios remodelada remodelada 7C 0 DPK15/A1 9 1 1 FR1 D D D D D L1 4(16) canónica 2 2 I V* r r V* G Zona de Vernier 3 3 I L V V V V Zona de 4 4 I M M M M M Vernier 5 5 I T T T T T 6 6 I Q Q Q Q Q 7 7 I I S S S S 8 8 I P P P P P 9 9 I L L L L L 10 10 I S S S S S 1 1 1 1 I L L L L L 12 12 I P P P P P 13 13 I V V V V V 14 14 I s T T T T 15 15 I L P P P P 16 16 I G G G G G 17 17 I D E E E E 18 18 I Q P P P P 19 19 I A A A A A 20 20 I S S S S S 21 21 I I I I I I 22 22 I S S S s s 23 23 FR1 C C c c c 24 24 CDR1 R R R R R 25 L1 4(16) 25 I S* S* S* S* S* canónica 26 26 I S S S S s 27 27 I Q Q Q Q Q 27A 28 I S S S S S 27B 29 I I* L* L* i* L1 4(16) i* canónica 27C 30 I V L L i I 27D 31 I H H H H H 27E 32 I S S S S S CUADRO 5 (Continuación) CUADRO 5 (Continuación) CUADRO 5 (Continuación) Leyenda: La primera columna (Kabat) indica la posición del residuo de aminoácido de acuerdo a Kabat et al. (1991 ); la segunda columna (#) indica la posición del residuo de aminoácido en la secuencia regular; la tercera columna (FR o CDR) se hizo para identificar fácilmente los segmentos del esqueleto (FR1 , FR2, FR3 y FR4) y los segmentos de CDR (CDR1 , CDR2 y CDR3) ("CDR" para "región determinante de complementariedad") con las tres CDRs separando los cuatro FRs; la cuarta columna (cadena ligera 7C10 de ratón) representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 54) de la región VL del anticuerpo 7C10 de ratón; la quinta columna (línea germinal DPK15/A19 de humano) representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 59) de la cadena ligera V kappa II de humano de la línea germinal; la sexta columna (GM607) representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 58) de la región VL del anticuerpo GM607 de humano; la séptima y octava columnas (7C10 1 y 2 de humano remodeladas) representan las secuencias de aminoácidos del anticuerpo 7C10 VL humanizado 1 y 2 (respectivamente, SEQ ID Nos. 61 y 65). "*" indica las partes de la estructura canñni.ca_deJa-asa- de CDR, tal como es definido por Chothia et al. (Nature. 342. 877-883. 1989).

EJEMPLO 13 Procedimiento de humanización, mediante injerto de CDR. de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 7C 0 (7C10 VH) a) Comparación de la secuencia de aminoácidos de 7C10 VH con todas las secuencias de VH de ratón conocidas Como una etapa preliminar en la humanización mediante injerto de CDR, se comparó primero la secuencia de aminoácidos de 7C10 VH con todas las secuencias de VH de ratón presentes en el banco de datos de Kabat (dirección en la Internet: ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta_format/; la última actualización de datos data de 1999). De esta manera, se ha identificado que 7C10 VH pertenece al subgrupo l(A) de las cadenas pesadas definidas por Kabat et al. (1991 ). Se identificaron regiones de VH de anticuerpos monoclonales de ratón que tienen una identidad de secuencias que varía hasta 90.5% (AN0'3 CL (SEQ ID No. 70), véase la figura 22). Para intentar identificar los residuos ordinarios en la secuencia de 7C10 VH, los autores alinearon la secuencia de aminoácidos de 7C10 VH (SEQ ID No. 69) con la secuencia consenso (SEQ ID No. 71 ) del subgrupo l(A) de las cadenas pesadas de ratón, como es definido por Kabat (véase la figura 22). Residuo 17 (numeración de Kabat), Thr para la secuencia consenso del subgrupo l(A) y Ser en 7C1Q VH,_s^Jo aliza_S j3ie-la_superficie de la molécula con respecto a la interfaz con la región constante. Este residuo no parece ser importante. Residuo 27 (numeración de Kabat), Asp para la secuencia consenso del subgrupo 1(A) y Tyr en 7C10 VH, es un residuo canónico para la CDR 1 . Tyr en esta posición no es rara, y es probablemente crítica para mantener la CDR 1 en su conformación adecuada. Residuo 84 (numeración de Kabat), Thr para la secuencia consenso del subgrupo l(A) y Asn en 7C10 VH. Se encontró Asn 93 veces en VH de ratón, y 3 veces en VH de humano. De acuerdo al modelo molecular, es un residuo de superficie remoto del parátopo. La numeración de los aminoácidos es la de Kabat et al. (1991 ). Los residuos en las regiones de estructura (aparte de las CDRs) que difieren entre 7C10 VH y el subgrupo l(A) de ratón de Kabat, está subrayados. AN03'CL representa la secuencia de la cadena pesada de un anticuerpo de ratón (el número de acceso en el banco de datos de Kabat, es P001289). b) Comparación de la secuencia de aminoácidos de 7C10 VH con todas las secuencias de VH de humano conocidas Para identificar el mejor candidato de humano para el "injerto de CDR", se buscó la región de VH de origen humano que tuviera la mayor homología posible con 7C10 VH. Para este fin, se comparó la secuencia de aminoácidos de 7C10 VH de ratón con todas las secuencias de VH de humano presentes en el banco de datos de Kabat. 7C10 VH de ratón tuvo la mayor homología de secuencias con las regiones de VH del subgrupo II de humano, como es definido por Kabat et al. (1991 ). Se identificaron regiones de VH de anticuerpos monoclonales de origen humano que tenían una identidad de secuencias que variaba hasta 67.3% (VH FURI'CL de humano (SEQ ID No. 73, véase la figura 23), sobre el total de los 98 aminoácidos codificados por el gen variable (es decir, aparte de la CDR3 y la región J). Se identificó también una línea germinal de origen humano, 4.22 VH IV (Sanz et al., 1989), que tenía una identidad de secuencias de 68.4%, de acuerdo a los mismos criterios para VH FURI 'CL (línea germinal de humano (SEQ ID No. 74), véase la figura 23). La secuencia codificada por la línea germinal 4.22 VH IV se seleccionó como una secuencia de humano receptora de las CDRs (de acuerdo a la definición de Kabat) de 7C10 VH de ratón, más que VH FURI 'CL, debido a que comparativamente, las secuencias de 4.22 VH IV y VH FURI 'CL con las de la secuencia consenso del subgrupo II de humano (sg II de humano de Kabat (SEQ ID No. 72), véase la figura 23 y el cuadro 6), no pudo identificarse residuo atípico alguno en las regiones de estructura (Rch) para 4.22 VH IV, aunque se identificó la presencia de dos residuos atípicos (Gln y Arg en las posiciones 81 y 82A de acuerdo a la nomenclatura de Kabat, respectivamente) en la secuencia codificada por VH FURI 'CL. c) Versiones humanizadas de 7C10 VH La siguiente etapa en el procedimiento de humanización, consistió en unir las CDRs de 7C10 VH de ratón a las regiones de estru_ctura_ (Rch) de la línea germinal 4.22 VH IV de humano (Sanz et al., 1989). En esta etapa del procedimiento, el modelo molecular de las regiones Fv de 7C10 de ratón, es particularmente útil en la elección de los residuos de ratón que serán conservados por ser capaces de desempeñar una función en el mantenimiento de la estructura tridimensional de la molécula (estructura canónica de las CDRs, interfaz VH/VL, etc.) o en la unión al antigeno (perteneciendo al parátopo). En las Rchs, se examinó escrupulosamente cada diferencia entre las secuencias de aminoácidos de ratón (7C10 VH) y de humano (4.22 VH IV) (véase el cuadro 6). Además, los residuos particulares en la secuencia de 7C10 VH de ratón que se habían identificado (véase el ejemplo 8.a), se tomaron en cuenta, si era necesario. En la primera versión de 7C10 VH humanizado mediante "injerto de CDR", humanizada 1 , se hicieron cuatro cambios en las regiones de estructura (Rch) de 4.22 VH IV (véase el cuadro 6, la figura 24 para la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 75), y la figura 25 para la secuencia de ADN (SEQ ID Nos. 76 y 78) y la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de señal (SEQ ID No. 77)). Estos cuatro cambios se refieren a: Residuo 30 (nomenclatura de Kabat) situado en Rch 1. Este residuo entra en efecto en la composición estructural de la CDR1 de 7C10 VH (como es definido por Chothia et al., 1989) y, por lo tanto, podría ser crítico para mantener esta asa en su conformación correcta. La Thr presente en esta posición en la secuencia de 7C10 VH de ratón, se conserva por lo tanto en esta misma posición en la forma humanizada.

Residuo 48 (nomenclatura de Kabat) situado en la Rch 2. Este residuo está cerca de las CDRs, aunque de acuerdo al modelo molecular, no está en contacto directo con las últimas, y podría influir sobre su conformación final. La metionina presente en esta posición en la secuencia de 7C10 VH de ratón, se conserva por lo tanto en esta misma posición en la forma humanizada 1 . Residuo 67 (nomenclatura de Kabat) situado en la Rch 3. Este residuo está cerca de las CDRs, y de acuerdo al modelo molecular, podría entrar en contacto con la lísina 60 (nomenclatura de Kabat) en la CDR 2. La isoleucina presente en esta posición en la secuencia de 7C10 VH de ratón, se conserva por lo tanto en esta posición en la forma humanizada 1 . Residuo 71 (nomenclatura de Kabat) situado en la Rch 3. Este residuo forma parte de la estructura canónica de la CDR2 y, por lo tanto, debe ser crítico para mantener esta asa en su conformación correcta. La arginina presente en esta posición en la secuencia de 7C10 VH de ratón, se conserva por lo tanto en esta posición en la forma humanizada . En la segunda versión de 7C10 VH humanizado mediante "injerto de CDR", humanizada 2, se realizaron dos cambios en las regiones de estructura (Rch) de 4.22 VH IV. Estos dos cambios se refieren a los residuos 30 y 71 (nomenclatura de Kabat), ya descritos en la forma humanizada 1 (véase cuadro 6, figura 24 para la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 79), y figura 26 para la secuencia de ADN (SEQ ID Nos. 80 y 82) y la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de señal (SEQ ID No. 81 )).

En la tercera forma de 7C10 VH humanizado mediante "injerto de CDR", humanizada 3, no se realizó cambio alguno en las regiones de estructura (Rch) de 4.22 VH IV. Todos los residuos de las Rchs son por lo tanto de origen humano, incluyendo los residuos 30, 48, 67 y 71 (nomenclatura de Kabat), que se han conservado (véase el cuadro 6, la figura 24 para la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 83) y figura 27 para la secuencia de ADN (SEQ ID Nos. 84 y 86), y la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de señal (SEQ ID No. 85)). Esta forma humanizada 3 es por lo tanto totalmente humanizada (aparte, de hecho, de las CDRs mismas como es definido por Kabat), puesto que todos los residuos de las Rchs, son los codificados por el gen de VH de la línea germinal 4.22 VH IV.

CUADRO 6 (Continuación o Leyenda: La primera columna (Kabat) indica la posición del residuo de aminoácido de acuerdo a Kabat et al. (1991 ); la segunda columna (FR o CDR) se hizo para identificar fácilmente los segmentos del esqueleto (FR1 , FR2, FR3 y FR4) y los segmentos de CDR (CDR1 , CD2 y CDR3) con las tres CDFis separa ndo los cuatro FRs; la tercera columna (cadena pesada 7C10 de ratón) representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 69) de la región de VH c el anticu érpo 7C10 de ratón; la cuarta columna (línea germinal 4.22 VH IV) representa la secuencia de aminoácidos del gen de 4.22 VH IV (Sanz et al. , 1989) (SEQ ID No. 74); la quinta columna (FUR 1 CL VH de humano, número de acceso de Kabat N020619) representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 73) [espa dio en blanco] de antilamina-B de Ig K de origen humano ( ariette et al. , 1993); la sexta, séptima y octava columnas (7C10 1 , 2 y 3 de humano remod fiadas) representan, respectivamente, las secuencias de aminoácidos de la región VH de 7C10 de humano para las versiones remodeladas 1 (SEQ D No. 75j) , 2 (SEQ ID No. 79) y 3 (SEQ ID No. 83). "*" indica las partes de la estructura canónica de la asa de CDR, tal como es definido por Chothia et al. (1989) EJEMPLO 14 Construcción de los genes que codifican para las versiones humanizadas 1 de 7C10 VL y VH mediante ensamble de oligonucleótidos a) Principio Se sintetizaron los genes (péptido guía + regiones variables VDJ para VH o VJ para (VK) que codifican para las regiones variables humanizadas, mediante ensamble de fase sólida sobre perlas magnéticas revestidas con estreptavidina. Los genes que codifican para 7C10 VH humanizado (445 pares de bases) y 7C10 VL humanizado (433 pares de bases), se construyen fusionando dos fragmentos de ADN debido a la presencia de un sitio de restricción Kpnl presente en las dos secuencias, y situado casi a la mitad a lo largo del gen (a 200 y 245 nucleótidos con respecto al extremo 5' del gen para VL y VH, respectivamente). Los dos fragmentos que se fusionan entre sí se ensamblan por sí mismos mediante una técnica de ensamble que consiste en usar oligonucleótidos fosforilados (de aproximadamente 30 a 35 elementos) hibridados dos por dos (un oligonucleótido sentido y el otro antisentido, con una homología de aproximadamente 50%), de tal forma que se traslapen durante la elongación. Un primer oligonucleótido biotinilado en la posición 5' es unido a las perlas magnéticas, y entonces los pares de oligonucleótidos fosforilados se añaden uno por uno. El enlace fosfodiéster entre los oligonucleótidos fosforilados yuxtapuestos, es producido por la enzima ADN ligasa T4.

Los genes sintetizados de novo de esta manera pueden clonarse directamente (mediante digestión con enzimas de restricción compatibles con el vector de expresión seleccionado), o amplificarse mediante PCR para obtener más material como un preludio a la clonación direccional mediante digestión enzimática. La secuencia del gen construido de esta manera mediante ensamble de novo, se verifica entonces mediante secuenciación automática del ADN. b) Protocolo experimental de la técnica de ensamble de novo Oligonucleótidos fosforilados en la posición 5' o biotinilados en la posición 5', cuya concentración se ajustó a 100 µ?, fueron ordenados a partir de MWG Biotech (véase las secuencias de los oligonucleótidos usados en el cuadro 7 para la construcción de 7C10 VL humanizado, y el cuadro 8 para la construcción de 7C10 VH humanizado). Los oligonucleótidos fueron hibridados en pares (una mezcla equimolar, 500 pmoles, de un oligonucleótido sentido y de un oligonucleótido antisentido en el regulador de pH de ADN ligasa T4, se calienta a 95°C durante 5 minutos, y entonces se deja enfriando sobre la mesa de trabajo manual a temperatura ambiente), de acuerdo a un esquema descrito en el cuadro 9. El primer oligonucleótido biotinilado es adherido a perlas magnéticas revestidas con estreptavidina (estreptavidina Dynabeads M-280, producto No. 1 12-05 de Dynal). Para esto, se añaden 500 pmoles del oligonucleótido biotinilado en una solución de NaCI a 15 mM a 50 µ? de las perlas decantadas (se usa un portaimán) lavadas previamente dos veces con 100 µ? de 1X de regulador de pH de TE (100X de regulador de pH de Tris-EDTA: Tris-HCI a 1 M, pH 8, EDTA a 0.1 M, Sigma T-9285). Después de incubación a 37°C durante 5 minutos, las perlas se lavan dos veces con el regulador de pH de lavado (Tris-HCI a 10 mM, pH 7.6, EDTA a 10 mM y NaCI a 50 mM), y los pares de oligonucleótidos hibridados se añaden entonces uno por uno. En cada adición nueva de un par de oligonucleótidos, la mezcla se calienta a 95°C durante 5 minutos, y se deja entonces enfriando sobre la mesa de trabajo manual a temperatura ambiente. Una vez que se alcanza la temperatura ambiente, se añaden 2 µ? de 10 U/µ? de ADN ligasa T4 (Biolabs), y la mezcla se incuba durante 20 minutos a 37°C. Las perlas se lavan entonces (regulador de pH de lavado), y los siguientes pares de oligonucleótidos se añaden entonces en sucesión. El último oligonucleótido no apareado (antisentido) se ensambla de la siguiente forma: Se añaden 5 µ? de oligonucleótido (500 pmoles) y 43 µ? de regulador de pH de ADN ligasa T4 a las perlas decantadas, y entonces la mezcla se calienta a 95°C durante 5 minutos, y se deja enfriando sobre la mesa de trabajo manual a temperatura ambiente. Una vez que se alcanza la temperatura ambiente, se añaden 2 µ? de ADN ligasa T4, y la mezcla se incuba a 37°C durante 20 minutos. Las perlas se lavan entonces dos veces con regulador de pH de lavado, y entonces dos veces con 1X de regulador de pH de TE. Las -perlas -pueden— conservarse- entonces -a— 4°G~artes~de- proceder a la clonación y secuenciación del gen ensamblado de novo.

CUADRO 7 Secuencia de ADN de oligonucíeótidos usados para la construcción de 7C10 VL 1 humanizado mediante ensamble de novo MluI GUIA. BIOTINA S ' -G7CAGAACGCG7GCCG C (SEQ ID No. S7) ~>Q) C'Lrssh . ¡ sentido _.¦ ' - CC rGAAGTT T TTASGCiGn GT Cr (SEQ ID No S8) TClOLrash.2 sen ido 5* -GATGTTCtGGTTTCCTGCTTCCAG AGTGATG (SEQ ID No.89) VCIüí.r e?h .3 sen t ido 5 ' - T7G7CA7GA77CAG 7 CTCC.riC7CTCCCTGCCC (SKQ ID No.90) 7Cl0Lresh.4 sentido 5' -GTCACCCCTGGAGAG CGGCCTCCATCTCCTG (SEQ ID No.91) *'CJ OLrfcs Asentido 5 ' -CAGGTCTAGT AÜACCAXTATACATAGTAATG (SEQ DD No 92) ''CiOLrcsh esentido S ' -GAA¾CACC A.7rTG3."ATGGTACCTGCAGA (SEQ ID No.93) 7clOLresh 7antisentido 5· -GGCAACTTCATGGTGGCGGCACGCCTTCTGAC (SEQ ID No.94) *¡C10Lre3 Santisentido 5' -GAAACCAG/ACATCAGCACCAACAGCCTAACA (SEQ ID No.95) 7C.0l.rcsh santisentido 5' -CTGAGTCA7C.-.;A½7.-.TCACTGC7GGAAGCAG (SEQ ID No.96) ClCI-re3h -Oantisentído 5' -TCTCCÍ. -GGGTGACG GCAGGGAGAGTGGAGA (SEQ ID No.97) 7CIOLresh i lantisentido 5* -TCTGACTAG CCTGCAGGAGATGGAGGCCGGC (SEQ ID No.98) ?C1 Lresh I2ant i Sentido 5 ' -A_AATACGTGT7TCCA XACTATG7ACAATGC (SEQ ID No.99) 13sentido 5 ' - CAGGGC AG T C T 7C AC G CT CCTGA7CT AT ??? (SEQ ID No.100) C3 OLresn Usentido 5· -GTTTC7AAT 7GC"'T7M'GGGG*TCC!nGACAG (SEQ ID No.101) 7C1 OLresn iSsentído 5 ' -GTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTA (SEQ ID No.102) VClCLresh resentido 5* -"A.CTG?AAA7 AGCAGAG7GGAGGCTGAGGAT (SEQ ID No 103) "/ClOUresh nsentido 5* -G7TGGGGTT7 T7í.CTGCT7TCAAGG7TCACA (SEQ ?> No.104) ~C1 CLt-esN IPsentido 5 ' -7GTTCCGTGG ACCTTCGGCC AAGCCACCAAGG (SEQ ID Nn.105) 7C.0L.resh ISsentido 5' -7GGAAATCA.AACGTGAG7GGATCC7CTGCG (SEQ ID No.106) 1 i úLreah Kjinl ?.2V b ' -T í«CAGGTA-CATT3 (SEQ ?>? .107) 7C10Lresh pnlbiotina 5 ' -TGCAATC-7TACC7GCAGAAGC (SEQ ID No. IOS) 7Ci OLresh -"Oantisentído 5 ' - A6ACTGCCC jGC77CTGCAGGTACCAT7GCA (SEQ ID No 109) 7c:oL.resh 2iantisentido 5' -CGATTAGAAA:777ATAGA?CAGGAGCTCTGG (SEQ ID No.110) VCl ies Santisentido 5 · -TGCCACTGA.-.7CTGTCAGGGACCCCATAAAGC (SEQ ID No.111) 7C1 OLres 23antisentid0 5 ' -GAT7TTCAGT TAA_\ATCTGTGCCTGATCCAC (SEQ ID No.112) 7C10I.resí> 2<antisentíd0 5' -TA-AACCCC^A ATCr?CAGCCTC.CACTCTGCT (SEQ CD No.113) _7CT0L oslv JSaoE senTíao^ 5 T -TCCACGGAA.7ATGTGAACCTTGAAAGCAGTAA~ "(SEQID !ÓTTÍ )" 7C1 CLresh rfiantisentido S' -TTTGATTTC_:>.CCT7GGTCCCTTGGCCGAAC (SEQ ID No.115) 7Cl0l.resM Bamillantisentido 5' -CGCAGAGGATCCACTCACG (SEQ ID No.116) CUADRO 8 Secuencia de ADN de oligonucleotidos usados para la construcción de 7C10 VH 1 humanizado mediante ensamble de novo MluI GUIA.BIOTINA 5 * -GTCAGAACGCGTGCCGCC (SEQ ID No.117) 7 iOK:esh. Isentido 5 ' - A7A7ATGAAAG7G77GAG7C TG TTGTr.CCTCTTGA (SEQJDNo.118) 7C10Hresh.2sentido i ' -CAGCCATTCC7GG7ATCC7GTCTCA,GGTGCAGCT (SEQIDNo.119) 7C10Hresh. asentido 5 ' -TCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCyTCG (SEQIDNo.120) 7C10.4resh. «sentido 5' -GAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGT (SEQ ID No.121) IOHrcs . Ssentido ' -?ACTCCA7CACCGG7GG77A7TTA7GGA:\CTGG (SEQID O.122) 7c:0:iresh. esentido s ' - ATACGGCAGCCCCCAGGG.AAGGGACTGGAGTGG (SEQIDNO.123) TciOí'resh. Asentido : ' -ATGGG37A7ATCAGCTACGAC3G7ACCAATAAC (SEQI O.124) 7cioHres . eantisentido =' - TCAA A TTCATSGTGGCGGCA GCCTTCTGAC (SEQ ID No. 125) 7 lCHres . S-antísentido z' -ATACC.-r.G¾TGGCTGTCA¾GAGGTACAACAGAC (SEQ ED o. 126) 7ClüKresh.l0antisentido 5' -TGGGCCC AC7CCrGA.¾GCTGCACC?GAGACAGG (SEQIDNO.127) 7 i0Hres . i .antisentido 5/ -TGAG:- ACAGGG77.TCCG~AGGC?TCACCAGTCC (SEQ ID NO.128) :oHre5h . i:ant isentido 5' -CCACCC-GT ATGGAG7AACCAGAGACAGTGCAC.._ (SEQ ID No. !29) 7C10Hresh.13antisentido 5' -CC T3GGGGCTGC G7ATCCAGTTCCATAAA7AA (SEQ ID No.130) 7C10Hrcsr.1 íantisentido 3 ' -TAGCTCATAl A-CCCATCCACrC-AGTCC rT (SEQIDNo. 131) VclOHresn.KpniRSV V -G7TA77GG7ACCG7CG (SEQ ID No.132) 7c.r.Kr*sr..Kpnbiotina 5' -7ACGA GGTACC.¾A7AACTAC (SEQIDNo. 133) 7C10Hresh.15 sentido 5'-AAACCCTCCCTCAñ'3GATCG¾.-.TC¾CCA7ATC (SEQ ID No.134) 7 1 Hr OJ 6sent ido 5 * - A' GT~A CG r ¾AGAACCAGTTC7CCCTGA (SEQ ID No. 135) 7C!0 resh . l'sentido 5' -AGCTGAGC7C757GACCGC?GCGGACACTGCA (SEQI o.136) 7 ioij.-c.ih. Asentido 51 -c c-! ATTACTCIGCGAGATACGGTAGG^TCTT (SEQíDNo.137) 7c.0f:resh.i=>sentido 5' -C7TTC-ACTAC7G GGCCAGGGAACCC7GGTCA (SEQIDNo.138) 7 ,.0Kre3h. Asentido 5' -CCGTCTCCTCAGGTGAGTGGATCCrCTGCG (SEQIDNo.139) 7CiOHres .21antisentido 5' -ACG-AGGGTTTGTAGTTATTGGTACCGTCGT (SEQIDNo.140) "JCinHresh.22antisentido 5' -ACGTGTCACGTGATATGGTGATTCGATCCTTG (SEQIDNo.141) 7C.0Kresh.23antisentido S' -AGAGC7CAGCTTCAGCGAGAACTGG7TCT7SG (SEQI o.142) 7c:0Kresh.2«antisentidO f -CAG7AATACAC? CAG7GTCCGCAGCGGTCAC (SEQIDNo.143) 7cl0iu-e5n.2Santisentido 5' -AGTACTCAAAG?.AGACCCTAC:C TA7C7CGCA (SEQIDNo.144) 7C 0Hresh.26ant isentido £> ' -CTGAG AG ACG3TGACCAGGGTTCCC TGGCCCC (SEQIDNo.145) 7C}0Hre.sn.BamHlantisentido 5 ' -CC-CAGAGGATCCACrcAC (SEQIDNo.146) CUADRO 9 Protocolo de apareamiento de oligonucleótidos para el ensamble de novo de genes que codifican para las formas humanizadas de 7C10 VH y VL Ensamble de novo del Ensamble de novo del fragmento MIUI-Kpnl de 7C10 fragmento Kpnl-BamHI de 7C10 VL humanizado 1 VL humanizado 1 Oligonucleotido guía Oligonucleotido biotinilado 7C10 biotinilado MIUI 7C10 VL VL Kpnl Par de oligonucleótidos 1 y 7 Par de oligonucleótidos 13 y 20 Par de oligonucleótidos 2 y 8 Par de oligonucleótidos 14 y 21 Par de oligonucleótidos 3 y 9 Par de oligonucleótidos 15 y 22 Par de oligonucleótidos 4 y 10 Par de oligonucleótidos 16 y 23 Par de oligonucleótidos 5 y 1 1 Par de oligonucleótidos 17 y 24 Par de oligonucleótidos 6 y 12 Par de oligonucleótidos 18 y 25 Oligonucleotido antisentido Oligonucleotido antisentido 7C10 VL Kpnl 7C10 VL BamHI Ensamble de novo del Ensamble de novo del fragmento MIUI-Kpnl de 7C10 fragmento Kpnl-BamHI de 7C10 VL humanizado 1 VL humanizado 1 Oligonucleotido guía Oligonucleotido biotinilado 7C10 biotinilado MIUI 7C10 VH H Kpnl Par de oligonucleótidos 1 y 8 Par de oligonucleótidos 15 y 21 Par de oligonucleótidos 2 y 9 Par de oligonucleótidos 16 y 22 Par de oligonucleótidos 3 y 10 Par de oligonucleótidos 17 y 23 Par de oligonucleótidos 4 y 1 1 Par de oligonucleótidos 18 y 24 Par de oligonucleótidos 5 y 12 Par de oligonucleótidos 19 y 25 Par de oligonucleótidos 6 y 13 Par de oligonucleótidos 20 y 26 Par de oligonucleótidos 7 y 14 Oligonucleótido antisentido 7C10 VH BamHI Oligonucleotido antisentido 7C10 VH Kpnl EJEMPLO 15 Construcción de los genes que codifican para las versiones humanizadas 2 de 7C10 VL y 7C10 VH y 3 de 7C10 VH mediante mutagénesis dirigida Se obtuvo la versión humanizada 2 de 7C10 VH mediante mutagénesis dirigida de los residuos 48 y 67 (de acuerdo a la nomenclatura de Kabat) de la versión 1. Esta mutagénesis dirigida se llevó a cabo usando el sistema de mutagénesis dirigida a sitio QuickChange™ de Stratagene (equipo #200518) de acuerdo al protocolo descrito por el fabricante. La construcción se lleva a cabo en dos etapas, primero el residuo 48 en la versión 1 fue mutado usando el par de iniciadores 7C10humanizado1 QCM48 sentido y antisentido (véase el cuadro 10), y después esta versión fue mutada en el residuo 48 que fue por sí mismo mutado en el residuo 67 usando el par de iniciadores 7C10humanizado1 QCI67 sentido y antisentido (véase el cuadro 10). Se obtuvo la versión humanizada 3 de 7C10 VH mediante mutagénesis dirigida a sitio de los residuos 30 y 71 (de acuerdo a la nomenclatura de Kabat) de la versión 2, usando asimismo el sistema QuickChange™. Esta construcción se lleva a cabo en dos etapas. En la primera, el residuo 30 en la versión 2 fue mutado usando los iniciadores 7C10humanizadoQCT30 sentido y antisentido (véase el cuadro 10). Después, esta versión mutada en el residuo 30 fue mutada por sí misma en el residuo 71 usando el par de iniciadores 7C10humanizado1V67QCR71 sentido y antisentido (véase el cuadro 10). Se obtuvo la versión humanizada 2 de 7C10 VL mediante mutagénesis dirigida a sitio del residuo 2 (de acuerdo a la nomenclatura de Kabat) de la versión 1 , usando el sistema QuickChange™. El residuo 2 en la versión 1 fue mutado usando el par de iniciadores 7C10humanizado1 QCV2 sentido y antisentido (véase el cuadro 10).

CUADRO 10 Lista de los oligonucleótidos usados para la mutagénesis dirigida mediante el sistema QuickChange™ de Stratagene EJEMPLO 16 Transfección de las células COS7 mediante electroporación Se pusieron a prueba los vectores de expresión de mamífero que contienen las versiones quimérica o humanizada de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 7C10 en células COS7 para la expresión transitoria de los anticuerpos recombinantes 7C10. Se introdujo el ADN en las células COS mediante electroporación usando un instrumento de BioRad (Gene Pulsar). Se añade el ADN (10 µg de cada vector) a alícuotas de 0.8 mi de células COS a una concentración de 1 x 107 células por mi en regulador de pH de PBS (sin Ca++ y Mg++). Se suministró una pulsación de 1900 voltios y una capacidad de 25 µ?. Las células COS transfectadas se añaden entonces a 8 mi de medio DMEM que contiene 5% de suero de ternera, y se incuban a 37°C durante 72 horas. El sobrenadante se colecta entonces, se centrifuga para eliminar los restos de células, y se pone a prueba mediante ELISA para la medición de su concentración de anticuerpo recombinante 7C10 de tipo kappa lgG1/humano.

EJEMPLO 17 Método de ELISA para medir las concentraciones de anticuerpo recombinante kappa de lgG1/humano presente en el sobrenadante de los transfectantes de células COS Los sobrenadantes producidos mediante expresión transitoria en células COS7, se pusieron a prueba para la presencia de anticuerpo 7C10 de tipo kappa de lgG1 /humano. Para la detección de la inmunogiobulina kappa de lgG1/humano, se revistieron placas de ELISA de 96 cavidades (Maxisorb, Nunc) con un anticuerpo policlonal de IgG anti-humano de cabra (específico para el fragmento Fe gamma, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., #109-005-098). Los sobrenadantes de células COS se diluyeron en serie, y se añadieron a las cavidades revestidas. Después de incubación durante 1 hora a 37°C y lavado, se añadió un anticuerpo policlonal de cadena ligera kappa anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa (HRP, Sigma, A-7164). Después de incubación durante 45 minutos a 37°C y lavado, se añadió el substrato de TMB (KPL #50-76-04). Después de incubación durante 10 minutos, la reacción se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico a 1 M, y se leyó la densidad óptica a 450 nm. Se usó una inmunogiobulina kappa de lgG1/humano purificada de humano (Sigma, I-3889) de concentración conocida, como anticuerpo de referencia patrón.

EJEMPLO 18 Método de ELISA para determinar la actividad de reconocimiento de anticuerpos recombinantes 7C10 de tipo lgG1/kappa de humano sobre el receptor para IGF-1 (IGF-IR) Los sobrenadantes de cultivo de células COS7 se pusieron a prueba para su capacidad para reconocer el IGF-1 R mediante un método de ELISA. Se revistieron placas de ELISA de 96 cavidades (Dynex Immulon 2HB) con 100 µ? por cavidad de una solución de PBS que contenía 0.31 ng/µ? de IGF-1 R (receptor soluble del factor de crecimiento I tipo insulina de humano, R&D Systems, #391 -GR), mediante incubación durante una noche a 4°C. Después de lavado con PBS que contenía Tween 20 a 0.05%, las placas se saturaron mediante la adición de una solución de PBS que contenía solución de gelatina a 0.5%, y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Después de tres lavados con PBS, las muestras de sobrenadantes de células COS que se van a poner a prueba, diluidas previamente en serie en PBS que contenía gelatina a 0.1 % y Tween 20 a 0.05%, se añadieron a las placas. Después de incubación a 37°C durante 1 hora, seguida de tres lavados (PBS que contenía Tween 20 a 0.05%), se añadió un anticuerpo IgG anti-humano (específico para el fragmento Fe) conjugado con peroxidasa (HRP, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., #109-035-098) (dilución a 1/5000 en PBS que contenía gelatina a 0.1 % y Tween 20 a 0.05%). Después de incubación durante 45 minutos a 37°C y 3 lavados (PBS que contenía Tween 20 a 0.05%), se añadió el substrato de TMB (KPL #50-76-04). Después de incubación durante 10 minutos, la reacción se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico a 1 M, y se leyó la densidad óptica a 450 nm.

EJEMPLO 19 Determinación de la actividad de reconocimiento del IGF1 -R por diferentes versiones del anticuerpo 7C10 humanizado mediante "injerto de CDR" Al principio, los autores compararon la actividad de reconocimiento de formas humanizadas 1 de las cadenas pesada y ligera de 7C10 para el receptor IGF-1 , con respecto a la forma quimérica. La figura 28 muestra los resultados de una prueba de ELISA de reconocimiento del IGF-1 R (véase el ejemplo 18) de sobrenadantes de las células COS7, cuya concentración de kappa de lgG1/humano se había determinado previamente mediante ELISA (véase el ejemplo 17). Las curvas de titulación de los cuatro anticuerpos recombinantes puestos a prueba se traslapan perfectamente, indicando que sus afinidades relativas por el IGF-IR son muy similares. Se concluye por lo tanto a partir de esto, que la forma humanizada 1 de 7C10, formada de la cadena ligera humanizada 1 (un residuo individual de ratón presente en las regiones de estructura) en combinación con la cadena pesada humanizada 1 (4 residuos de ratón presentes en las regiones de estructura), reconoce específicamente al receptor IGF-1 , y tiene una afinidad muy similar a la del anticuerpo quimérico (regiones variables de ratón). Después, los autores observaron la influencia del residuo 2 (de acuerdo a la nomenclatura de Kabat) de la cadena ligera humanizada de 7C10 (versión humanizada 1 contra humanizada 2, véase la figura 19), sobre el reconocimiento del IGF-IR. La figura 29 muestra los resultados de la prueba de ELISA para reconocimiento del IGF-IR (véase el ejemplo 18) a partir de sobrenadantes de células COS7 cuya concentración de kappa de lgG1/humano se había determinado previamente mediante ELISA (véase el ejemplo 17). Las dos versiones humanizadas 1 y 2 de la cadena ligera, se habían combinado exitosamente con 7C10 VH 1 humanizado. Las curvas de titulación de las dos combinaciones están sobrepuestas, indicando que la mutación del residuo 2 de la cadena ligera, que ha sido cambiada de una valina en la versión humanizada 1 a una isoleucina en la forma humanizada 2, aparentemente no tiene influencia sobre la afinidad de reconocimiento relativa del receptor IGF1. La forma humanizada 2 de la cadena ligera de 7C10 forma de esta manera una versión en donde no se ha conservado residuo alguno de ratón (aparte de las CDRs). Esta versión, totalmente humanizada, representa la versión preferida de 7C10 VL. Se puso a prueba la versión totalmente humanizada de la cadena ligera de 7C10 (versión humanizada 2, véase anteriormente), en combinación con las tres versiones humanizadas de la cadena pesada de 7C10. La figura 30 muestra los resultados de la prueba de ELISA para reconocimiento del IGF-1 R de sobrenadantes de células COS7, cuya concentración de kappa de lgG1/humano se había determinado previamente mediante ELISA (véase el ejemplo 17). Las curvas de titulación son muy similares, y virtualmente se traslapan con la curva de referencia que corresponde al anticuerpo quimérico, indicando que las tres versiones humanizadas 1 , 2 y 3 de 7C10 VH dan una afinidad relativa idéntica para el IGF-1 R 2 cuando se combinan con 7C10 VL 2 humanizado. Otras pruebas de ELISA realizadas en paralelo (resultados no mostrados), han revelado sin embargo que una mutación puntual del residuo 71 (nomenclatura de Kabat) de una arginina (ratón) a una valina (humano), incluyó una pequeña pérdida de afinidad del anticuerpo correspondiente, por el IGF-1 R. De esta manera, es razonable pensar que el 7C10 VH 2 humanizado tiene la misma afinidad relativa por el IGF-1 R que el 7C10 VH 1 humanizado. Esta forma humanizada 2 se preferirá por lo tanto con respecto a la forma 1 , puesto que tiene sólo dos aminoácidos de ratón (residuos 30 y 71 , véase la figura 24). La forma humanizada 3, que no tiene residuo de ratón alguno (aparte de las CDRs), se preferirá también, puesto que sólo parece incluir una pérdida de afinidad mínima. En conclusión, parece ser que dos formas humanizadas del anticuerpo 7C10 de conformidad con la presente invención, se prefieren en particular: Una forma constituida por la combinación de 7C10 VH 2 humanizado (2 residuos conservados de ratón) con 7C10 VL 2 humanizado (sin residuo conservado de ratón), y otra forma constituida por la combinación de 7C10 VH 3 humanizado (sin residuo conservado de ratón) con 7C10 VL 2 humanizado (sin residuo conservado de ratón). Esta última forma constituye la última versión humanizada, puesto que ningún residuo de ratón está presente al mismo tiempo en las cadenas pesada y ligera.

EJEMPLO 20 Expresión del EGFR y el IGF-IR sobre la superficie de células A549 Se estudió la sinergia de acción obtenida mediante la coadministración de dos MABs dirigidos respectivamente, contra el IGF-IR y el EGFR en ratones desnudos que poseen un tumor pulmonar de células no pequeñas establecido mediante inyección subcutánea (s.c.) de células A549 (línea de células de carcinoma pulmonar). Al principio, y para asegurar la presencia de los dos receptores IGF-IR y EGFR sobre la superficie de las células A549 antes de inyectar éstas en el ratón, se llevó a cabo marcación para lectura de FACS de estas células con, respectivamente, el AB anti-IGF-IR 7C10 de murino (figura 37B) y el MAB anti-EGFR 225 de murino (figura 37D). Para hacer esto, las células se saturaron durante 30 minutos a 4°C con una solución de PBS y FCS (suero de ternera fetal) a 10%, se lavaron, y se incubaron entonces durante 30 minutos a 4°C con el MAB de interés. Después de otros 3 lavados, se añadió el anticuerpo anti-especie secundario acoplado a FITC (isotiocianato de fluoresceína). Después de incubación durante 30 minutos, se hace la lectura en el FACS (distribuidor de células activado por fluorescencia) a 520 nm (excitación a 488 nm). Los resultados presentados en las figuras 37A a 37D, muestran que las células A549 tienen sobre su superficie un número comparable de receptores para EGF e IGF1 . En los dos casos, la población es homogénea con respecto a la distribución de cada uno de los receptores. El carácter específico de la marcación se confirma mediante el uso de un isotipo control (figura 37C). Estos resultados validan el uso de las células A549 como un modelo para el estudio de una sinergia de acción sobre dos receptores IGF-IR y EGFR, y para el estudio de una colaboración de estos dos receptores.

EJEMPLO 21 Sinergia de acción de un MAB anti-IGF-IR y de un MAB anti-EGFR coadministrados ¡n vivo, en el ratón desnudo en el contexto de un tratamiento antitumoral Para este estudio, se injertan s.c. 5.106 células A549 en ratones desnudos. Cinco días después del injerto de células, los tumores se miden, y se forma un lote homogéneo de ratones en términos de volumen del tumor. Partiendo de este lote, se generan al azar grupos de 6 ratones. Estos ratones se trataran intraperitonealmente (i.p.), dos veces por semana con cada uno de los MAB 7C10 y 225 individualmente a la dosis de 250 µg/ratón, o con los dos MAB en coadministración. El MAB 9G4 se administra como un isotipo control del experimento. Los resultados presentados en la figura 38 muestran que cada uno de los anticuerpos 7C10 y 225 administrados solos, es capaz de inducir una disminución significativa en el crecimiento del tumor in vivo. Puede observarse que los dos MAB puestos a prueba tienen una actividad comparable sobre el crecimiento del tumor A549. En forma sorprendente con respecto a la literatura, se observa una sinergia significativa durante la administración simultánea de los dos MAB (p < ó = 0.01 en cada uno de los tiempos de la cinética en una prueba t), sugiriendo que existe una colaboración de los dos receptores para el crecimiento óptimo de un tumor in vivo y que, contrariamente a los datos en la literatura, el bloqueo de uno de los dos ejes no basta para inhibir totalmente el crecimiento mediado por el segundo.

EJEMPLO 22 Estudio de la actividad antitumoral de los anticuerpos de murino 7C1Q y 225 coadministrados en ratones implantados ortópicamente con células A549 El uso de modelos ortópicos para la evaluación de la actividad antitumoral, presenta un interés particular con respecto al proceso de diseminación metastásica de un tumor. Para evaluar la actividad antitumoral de una mezcla de anticuerpos dirigida respectivamente contra el IGF-IR y el EGFR, se implantaron 106 células A549 (cáncer pulmonar de células no pequeñas) en la cavidad intrapleural de ratones desnudos. Se observará que la consecuencia de este tipo de implantación del tumor, es una diseminación metastásica similar a la observada en el hombre, y lleva a la muerte de los animales. La figura 39 muestra que la administración de los anticuerpos 225 y 7C10 solos, permite que se observe una ganancia comparable y significativa en la supervivencia. En forma sorprendente, la coadministración de estos dos anticuerpos aumenta en una forma considerable la supervivencia de los animales, sugiriendo que este tratamiento podría tener un impacto sobre la diseminación metastásica de las células tumorales.

EJEMPLO 23 7C10 y 7H2HM inhiben la fosforilación de la tirosina de la cadena beta del IGF-IR e IRS-I Se cultivan células MCF7 durante 24 horas a 5.104 células/cm2 (placas de 75 cm2, COSTAR) en 20 mi de RPMI sin rojo de fenol, mezclado con 5 mM de glutamina, penicilina/estreptomicina (respectivamente, 100 U/100 g ml) y 10% de suero de ternera fetal. Después de tres lavados en PBS, las células se incubaron durante 12 horas en medio (RPMI) sin rojo de fenol, carente de suero de ternera fetal, y se mezclaron con 5 mM de glutamina, penicilina/estreptomicina, albúmina de suero de bovino a 0.5 µ9/??? (Sigma A-8022) y transferrina a 5 µ9 ??? (Sigma T8158). Para la activación, las células se incubaron primero a 37°C durante 2 minutos con anticuerpos de bloqueo (10 µ9 ? ??), y entonces se añadió IGF-I (Sigma I3769, 50 ng/ml) por otros dos minutos. La reacción se detuvo mediante la aspiración del medio de incubación, y las placas se colocaron sobre hielo. Las células se solubilizaron mediante la adición de 0.5 mi de regulador de pH de tisis (Tris-HCI a 50 mM, pH 7.5, NaCI a 150 mM, Nonidet P40 a 1 %, desoxicolato de sodio a 0.5%), se mezclaron con inhibidores de proteasa (1 tableta por 50 mi, Boehringer, Ref.: 1697 498) e inhibidores de fosfatasa (Calbiochem, Ref.: 524625 (1/100)). Las células se removieron por raspadura, y la suspensión se recuperó y se colocó sobre un agitador a 4°C durante 1.5 horas. Las soluciones se centrifugaron a 12,000 rpm durante diez minutos (4°C), y las concentraciones de proteína de los sobrenadantes se cuantificaron mediante BCA. Se mezclaron 500 µg de proteínas del lisado de células con el anti-IGF-IR (Santa Cruz, Ref.: sc-713) para inmunoprecipitación, y se incubaron sobre el agitador a 4°C durante 1.5 horas. Los inmunoprecipitados se recuperaron mediante la adición de proteína A-agarosa (Boehringer, Ref.: 1 134 515), y se incubaron durante la noche sobre el agitador a 4°C. Para la inmunoprecipitación de IRS- , se usaron anticuerpos anti-IRS-1 acoplados a perlas de agarosa (Santa Cruz, Ref.: 559Ac). Las perlas de agarosa se lavaron dos veces con— 1 ml-de-regtilador-de- pH-de^lisis dos-veces on-un" regulador de pH de lavado 1 (Tris-HCI a 50 mM, pH 7.5; NaCI a 500 mM; Nonidet P40 a 0.1 %; desoxicolato de sodio a 0.05% (Boehringer 1 332 597)), se mezclaron con inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa, y una vez con un regulador de pH de lavado 2 (Tris-HCI a 50 mM; Nonidet P40 a 0.1 %; desoxicolato de sodio a 0.05% (Boehringer, Ref.: 1 332 597), y se mezclaron con inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa 1/100). Los inmunoprecipitados se resuspendieron en un regulador de pH de Laemmli, y se calentaron a 100°C durante 5 minutos. Los sobrenadantes se analizaron mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida-SDS (Novex EC60 5 a 8%). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, seguido de un ¡mmunoblot con anticuerpos anti-fosfotirosina conjugados con HRP (Upstate Biotechnology 4G10) o anti-cadena beta del IGF-IR o anti-IRS-1 (Santa Cruz, Ref.: se 8038), seguido de un anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP. Las impresiones se revelaron mediante quimioluminiscencia (Amersham, RPN 2209), seguida de autorradiografía sobre películas Kodak X-mat AR. La figura 40A representa células MCF7 no estimuladas (0) o estimuladas con IGF-1 (50 ng/ml) solo (0+IGF-1 ), o combinadas con anticuerpos anti-IGF-IR monoclonales o humanizados (10 µg/ml) 7C10, 1 H7, 7H2HM. Los anticuerpos 9G4 o hlgG1 son ¡nmunoglobulinas de murino o de humano de isotipo lgG1 usados como control negativo del experimento. Las cadenas beta del IGF-IR fueron inmunoprecipitadas y blotted (transferidas) con anticuerpos anti-tirosina fosforilados. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos 7C10, 1 H7 y 7H2HM anti-IGF-IR monoclonales o humanizados, inhiben la fosforilación de la tirosina de la cadena beta del IGF-IR. La figura 40B representa células MCF7 no estimuladas (0) o estimuladas con IGF-1 (50 ng/ml) solo (0+IGF-1 ), o combinadas con anticuerpos anti-IGF-IR monoclonales o humanizados (10 g/ml) 7C10, 1 H7, 7H2HM. Como se describió anteriormente, los anticuerpos 9G4 o hlgG1 son inmunoglobulinas de murino o de humano de isotipo lgG1 usados como control negativo del experimento. El IRS- fue inmunoprecipitado y blotted con anticuerpos anti-tirosina fosforilados. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos monoclonales 7C10, 7H2HM y 1 H7 inhiben la fosforilación de la tirosina del IRS-1.

EJEMPLO 24 7C10 y 7H2HM inducen la incorporación del IGF-IR Se suspendieron células MCF7 y A549 a 1.107 células/ml en PBS con 10% de suero de ternera fetal (regulador de pH para FACS). Se incubaron 1.106 células durante 30 minutos a 37°C con los anticuerpos monoclonales a 10 µg/ml (7C10, 7G3, 9G4) o a 20 µg/ml para 7H2HM. Después del lavado, las células se marcaron a 4°C durante 30 minutos con un anti-IGF-IR biotinilado (anticuerpo monoclonal 12B1 ), y se incubaron finalmente a 4°C durante 30 minutos con un conjugad jde_eslre_pla idina^4a8- Alexa Fluor . Las células se analizaron usando FACScan (Becton-Dickinson, Enembogegem, Bélgica) con el programa Cellquest después de la eliminación de los residuos. La figura 41 muestra las células A549 sin coloración (primer valor máximo), las células A549 incubadas con 7C10 o 7H2HM (segundo valor máximo) y las células A549 incubadas con una lgG1 irrelevante de ratón o rata (tercer valor máximo). Se observa una disminución doble de la expresión de superficie del IGF-IR por las células, cuando las células han sido incubadas previamente con 7C10 o 7H2HM.

EJEMPLO 25 7C10 y 7H2HM inducen la degradación del IGF-IR Se cultivaron células MCF-7 durante 24 horas a 10.104 células/cm2 (75 cm2, Costar) en 15 mi de medio completo. Después, los cultivos se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante 12 horas con medio carente de suero. Después, las células se incubaron con cicloheximida a 25 µg/ml sola, o con 10 µg/ml de anticuerpo monoclonal 7C10, 9G4, 7G3 o del IGF-I (10 ng/ml). En ciertos experimentos, antes de la incubación con los anticuerpos monoclonales, las células se trataron durante 1 hora a 37°C con MG-132 (10 µ?, Calbiochem 474791 ) para inhibir las actividades de proteasoma. Después de la incubación, las células se lavaron y se solubilizaron-mediante la-adición-de uo regulador-de-pH-de-lisis^Se analizar-on- 20 µ9 de proteínas mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida a 8% de SDS, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, seguido de un immunoblot anti-cadena beta del IGF-IR, tal como se describió anteriormente. El análisis mediante Western-blot (figura 42A) de la integridad del IGF-IR, muestra que 7C10 y 7H2HM inducen la degradación del receptor, mientras que el ligando natural no causa degradación alguna del último. No se observa degradación del receptor con el 9G4, un anticuerpo irrelevante usado como isotipo control. La figura 42B demuestra, y con respecto a la misma, que la degradación es inhibida por un inhibidor de proteasoma MG132 (periodo de incubación de 2 horas). Se obtuvieron resultados comparables con el anticuerpo humanizado 7H2HM (figura 42C).

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Pierre Fabre Médicament <120> Anticuerpos novedosos anti-receptor del factor de crecimiento I tipo insulina, y usos de los mismos <130> 345 317 - MX <1S0> PCT/FR 03/00 178 <151> 2003-01-20 <150> FR 02/00 S53 <151> 2002-01-18 <150> FR 02/00 654 <151> 2002-01-18 <150> FR 02/05 753 <151> 2002-05-07 <160> 156 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 48 <212 ADN <213> Mus musculus 220> <221> CDS <222> (1) .. (48) <400> 1 aga tct agt cag age att gta cat agt aat gga aac acc tat tta caá Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln 1 5 10 15 <210> 3 <211> 21 <212> ADN c213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) .. (21) <400> 3 aaa qtt tec aac cqa ctt tat 21 Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr 1 5 <210> 4 <¿ll> I <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr 1 5 <210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) .. (27) <400> 5 ttt caá ggt tea cat gtt ccg tgg acg 27 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp 1 5 <210 7 <211> 18 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS 222> (1) .. (18) c400> 7 ggt ggt tat tta tgg aac 18 Gly Gly Tyr Leu Trp Asn 1 5 210> 8 211> 6 212> PRT 213> Mus musculus <400> 8 Gly Gly Tyr Leu Trp Asn 1 5 <210> 9 -<211>-4~8 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS 222> (1) .. (48) <400> 9 tac ata age tac gac ggt acc aat aac tac aaa cea tct ctc aaa gat 48 Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT 213> Mus musculus <400> 10 Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp 1 5 10 15 <210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus 220> <221> CDS <222> (1) .. (24) 400> 11 tac ggt agg gtc ttc ttt gac tac Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr 1 5 210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr 210> 13 211> 26 212> ADN <213> Mus musculus <400> 13 atgaaatgca gctgggtcat sttctt 26 <210> 14 211 26 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 14 atgggatgga gctrtatcat sytcct 26 210> 15 211> 26 212> ADN 213> Mus musculus 400 15 tgaagwtgt ggttaaactg ggttct <210> 16 <211> 23 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 16 -|Q atgractttg ggytcagctt grt 23 <210> 17 <211> 26 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 17 atggactcca ggctcaattt agtttt 26 <210> 18 <211> 26 15 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 18 atggctgtcy trgsgctrct cttctg 26 <210> 19 <211> 26 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 19 0 atggratgga gckggrtctt tmtctt 26 <210> 20 <211> 23 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 20 atgaqaqtqc tqattctttt qtg 23_ <210> 21 <211> 26 <212> ADN <213> Mus musculus e400> 21 atggmttggg tgtggamctt gctatt <210> 22 <211> 26 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 22 atgggcagac ttacattctc attcct 210> 23 211> 28 212> ADN 213> Mus musculus <400> 23 atggattttg ggctgatttt ttttattg 210> 24 211> 26 212> ADN 213> Mus musculus 400> 24 atgatggtgt taagtcttct gtacct 210> 25 211> 29 212> ADN 213 Mus musculus <400> 25 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct <210> 26 <211> 29 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 26 atggagwcag acacactcct gytatgggt 210> 27 211> 23 212> ADN 213> Mus musculus <400> 27 -ai-ga.giig.tgc—Lear, t r.aggjb <210> 28 ¾211 26 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 28 atgaggrccc ctgctcagwt tyttgg <210> 29 <211> 29 <212> ADN <213> Mus musculus 400> 29 atggatttwc aggtgcagat twtcagctt 210> 30 211> 29 212> ADN 213> Mus musculus <400> 30 atggatttwc argtgcagat twtcagctt 210> 31 211> 26 212> ADN 213> Mus musculus c400> 31 atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrg 210> 32 <211> 23 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 32 atgggcwtca agatggagtc aca <210> 33 <211> 29 <212> ADN <213> Mus musculus <400 33 atgtggggay ctktttycmm tttttcaat <210> 34 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 34 casctcagtt cct <210> 35 <211> 26 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 35 atgtatatat gtttgttgtc tatttc 210> 36 211> 26 212> ADN 213> Mus musculus 400> 36 atggaagccc cagctcagct tctctt 26 <210 37 <211> 26 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 37 atgragtywc agacccaggt cttyrt 26 210> 38 211> 26 212> ADN 213> Mus musculus <:400> 38 atggagacac attctcaggt ctttgt 26 210> 39 c211> 26 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 39 atggattcac aggcccaggt tcttat <210> 40 <211> 20 212> ADN <213> Mus musculus <400> 40 actggatggt gggaagatgg 20 <210> 41 <211> 42 <212> ADN <213> Mus musculus <220> 221^-CDS <222> (1) · . (42) <400> 41 gct gat gct gca cea act gta tcc ate ctc cea cca tcc agt 42 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 42 <211s 14 <212> PRT <213> Mus musculus 400> 42 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 20 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 43 ccatcttccc accatccagt <210> 44 <211> 18 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 44 ccagtggata gacagatg 210> 45 211> 33 212> ADN 213> Mus musculus <220> c221> CDS <222> (1) .. (33) <400> 45 gcc aaa acg acá ccc cca tct gtc tat cca ctg 33 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu <210> 47 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 47 cccccatctg tctacccact <210> 48 <211> 438 <212 ADN <213> Mus musculus 220> 221> CDS 222> (28) .. (393) <400> 48 atgaagttgc ctgttaggct gttggtg ctg atg ttc tgg att cct gct tcc aga Leu Met Phe Trp lie Pro Ala Ser Arg 1 5 agt gat gtt ttg atg acc caá att cea etc tcc ctg cct gtc agt ctt 102 Ser Asp Val Leu Met Thr Gln lie Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 10 15 20 25 gga gat caá gee tcc ate tet tgc aga tet agt cag age att gta cat 150 Gly Asp Gln Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His 30 35 40 agt aat gga aac acc tat tta caá tgg tac ctg cag aaa cea ggt cag 198 Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 45 50 55 tet cea aag etc ctg ate tac aaa gtt tcc aac cga ctt tat ggg gtc 246 Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val 60 65 70 cea gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg acá gat ttc acá etc aag 294 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 75 80 85 ate age age gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caá 342 lie Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln 90 95 100 105 ggt tea cat gtt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ate 390 Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 110 115 120 aaa cgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc ccaccatcca gt 438 Lys <210> 49 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Leu Met Plie Trp lie Pro Ala S i Atg Sex s Vdl Leu Niel Thr~Glrr 1 5 10 15 lie Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser lie Ser 20 25 30 Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu 35 40 45 Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr 50 55 60 Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 65 70 75 80 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Ser Val Glu Ala Glu 85 90 95 Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr 100 105 110 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 115 120 <210> 50 <211> 438 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 50 tactccaacg gacaatccga caaccacgac tacaagacct aaggacgaag gtcttcacta 60 caaaactact gggtttaagg tgagagggac ggacagtcag aacctctagt tcggaggtag 120 agaacgtcta gatcagtctc gtaacatgta tcattacctt tgtggataaa tgttaccatg 180 gacgtctttg gtccagtcag aggtttcgag gactagatgt ttcaaaggtt ggctgaaata 240 ccccagggtc tgtccaagtc accgtcacct agtccctgtc taaagtgtga gttctagtcg 300 tcgcacctcc gactcctaga ccctcaaata atgacgaaag ttccaagtgt acaaggcacc 360 tgcaagccac ctccgtggtt cgacctttag tttgcccgac tacgacgtgg ttgacatagg 420 tagaagggtg gtaggtca 438 <210> 51 <211> 438 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (25) .. (405) <400> 51 atgatggtgt taagtcttct gtac ctc ttg acá gcc att cct ggt ate ctg 51 Leu Leu Thr Ala lie Pro Gly lie Leu 1 5 tet gat gta cag ctt cag gag tea gga cct ggc ctc gtg aaa cct tet 99 Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 10 15 20 25 cag tct ctg tct ctc acc tgc tct gtc acc ggc tac tcc atc acc ggt 147 -Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Sei Vdl Tht Gly Tyi Ser lie Tlu Gly 30 35 40 ggt tat tta tgg aac tgg atc cgg cag ttt cea gga aac aaa ctg gag 195 Gly Tyr Leu Trp Asn Trp lie Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu 45 50 55 tgg atg ggc tac ata age tac gac ggt acc aat aac tac aaa cea tct 243 Trp Met Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser 60 65 70 ctc aaa gat cga atc tcc atc act cgt gac acá tct aag aac cag ttt 291 Leu Lys Asp Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 75 80 85 ttc ctg aag ttg aat tct gtg act aat gaa gac acá gct acá tat tac 339 Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 90 95 100 105 tgt gca aga tac ggt agg gtc ttc ttt gac tac tgg ggc caá ggc acc 367 Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 110 115 120 act ctc acá gtc tcc tea gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctg 438 Thr Leu Thr Val Ser Ser 125 <210> 52 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Leu Leu Thr Ala lie Pro Gly lie Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu 1 5 10 15 Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys 20 25 30 Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp lie 35 40 45 Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr lie Ser Tyr 50 55 60 Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg lie Ser lie 65 70 75 80 Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val 85 90 95 Thr Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val 100 105 110 Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 53 211 438 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 53 tactaccaca attcagaaga catggacaac tgtcggtaag gaccatagga cagactacat 60 gtcgaagtcc tcagtcctgg accggagcac tttggaagag tcagagacag agagtggacg 120 agacagtggc cgatgaggta gtggccacca ataaatacct tgacctaggc cgtcaaaggt 180 cctttgtttg acctcaccta cccgatgtat tcgatgctgc catggttatt gatgtttggt 240 agagagtttc tagcttagag gtagtgagca ctgtgtagat tcttggtcaa aaaggacttc 300 aacttaagac actgattact tctgtgtcga tgtataatga cacgttctat gccatcccag 360 aagaaactga tgaccccggt tccgtggtga gagtgtcaga ggagtcggtt ttgctgtggg 420 ggtagacaga taggtgac 438 <210> 54 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 Asp Val Leu Met Thr Gln lie Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210? 55 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 5 5"5 GO Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gl 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Asp lie Lys 100 105 110 c210> 56 211> 112 <212> PRT •c213> Mus musculus <400> 56 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 55 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 57 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Asp Val Val Mee Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie __65 7S¡ 25 »n Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly ? 9D 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 58 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 <210 59 <211> 100 <212> PRT 213> Homo sapiens <400> 59 Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro xao- <210> 60 "^TTT^TTS ¦ <212> PRT <213> Homo sapiens c220> <221> VARIANTE <222> (35) .. (36) <223> Xaa = cualquier aminoácido <220> <221> VARIANTE <222> (39) <223> Xaa = cualquier aminoácido <220> <221> VARIANTE <222> (99) <223> Xaa = cualquier aminoácido <400> 60 Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Xaa Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 <210> 61 <211> 112 · <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie —6-5 *Q 7 8-e- Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 <210> 62 <211> 433 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (22) .. (414) <400> 62 gtcagaacgc gtgccgccac c atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu 1 5 10 atg ttc tgg ttt cct gct tcc age agt gat gtt gtg atg act cag tet 99 Met Phe Trp Phe Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser 15 20 25 cea etc tcc ctg ecc gtc acc cct gga gag ceg gee tcc ate tcc tgc 147 Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys 30 35 40 agg tet agt cag age att gta cat agt aat gga aac acc tat ttg caá 195 Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln 45 50 55 tgg tac ctg cag aag cea ggg cag tet cea cag etc ctg ate tat aaa 243 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys 60 65 70 gtt tet aat cgg ctt tat ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga 291 Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 75 80 85 90 tea ggc acá gat ttt acá ctg aaa ate age aga gtg gag gct gag gat 339 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 95 100 105 gtt ggg gtt tat tac tgc ttt caá ggt tea cat gtt ceg tgg acg ttc 387 Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe 110 - 115 120 ggc caá ggg acc aag gtg gaa ate aaa cgt gagtggatcc tctgcg 433 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 125 130 <210> 63 <211> 131 <212> P T <_213> Homo sapiens c400> 63 Met Lys Leu Pro Vctl Arg Leu Leu Vdl Leu Mel Phe Trp P e Pío Ala~ 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 115 120 125 Glu lie 130 <210> 64 <211> 433 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 64 cagtcttgcg cacggcggtg gtacttcaac ggacaatccg acaaccacga ctacaagacc 60 aaaggacgaa ggtcgtcact acaacactac tgagtcagag gtgagaggga cgggcagtgg 120 ggacctctcg gccggaggta gaggacgtcc agatcagtct cgtaacatgt atcattacct 180 ttgtggataa acgttaccat ggacgtcttc ggtcccgtca gaggtgtcga ggactagata 240 tttcaaagat tagccgaaat accccaggga ctgtccaagt caccgtcacc tagtccgtgt 300 ctaaaatgtg acttttagtc gtctcacctc cgactcctac aaccccaaat aatgacgaaa 360 gttccaagtg tacaaggcac ctgcaagccg gttccctggt tccaccttta gtttgcactc 420 acctaggaga cgc 433 <210> 65 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 01 igonucleót ido <400> 65 Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 33 4~ü ~5 Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 <210> 66 <211> 433 212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (22) .. (414) <400> 66 gtcagaacgc gtgccgccac c atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg 51 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu 1 5 10 atg ttc tgg ttt cct gct tcc age agt gat att gtg atg act cag tet 99 Met Phe Trp Phe Pro Ala Ser Ser Ser Asp lie Val Met Thr Gln Ser 15 20 25 cea etc tcc ctg ecc gtc acc cct gga gag ceg gee tcc ate tcc tgc 147 Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys 30 35 40 agg tet agt cag age att gta cat agt aat gga aac acc tat ttg caá 195 Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln 45 50 55 tgg tac ctg cag aag cea ggg cag tet cea cag etc ctg ate tat aaa 243 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys 60 65 70 gtt tet aat cgg ctt tat ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga 291 Val Ser Asn Arg Leu' Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 75 80 85 90 tea ggc acá gat ttt acá ctg aaa ate age aga gtg gag gct gag gat 339 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 95 100 105 gtt ggg gtt tat tac tgc ttt caá ggt tea cat gtt ceg tgg acg ttc 387 Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe 110 115 120 ggc caá ggg acc aag gtg gaa ate aaa cgt gagtggatcc tctgcg 433 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 125 13-0 <210> 67 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Phe Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 115 120 125 Glu lie Lys 130 <210> 68 <211> 433 <212> AD <213> Homo sapiens <400> 68 cagtcttgcg cacggcggtg gtacttcaac ggacaatccg acaaccacga ctacaagacc 60 aaaggacgaa ggtcgtcact acaacactac tgagtcagag gtgagaggga cgggcagtgg 120 ggacctctcg gccggaggta gaggacgtcc agatcagtct cgtaacatgt atcattacct 180 ttgtggataa acgttaccat ggacgtcttc ggtcccgtca gaggtgtcga ggactagata 240 tttcaaagat tagccgaaat accccaggga ctgtccaagt caccgtcacc tagtccgtgt 300 ctaaaatgtg acttttagtc gtctcacctc cgactcctac aaccccaaat aatgacgaaa 360 gttccaagtg tacaaggcac ctgcaagccg gttccctggt tccaccttta gtttgcactc 420 acctaggaga cgc 433 <210> 69 211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 69 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser He Thr Gly Gly 20 25 30 Tyr Leu Trp Asn Trp lie Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp X5 ¡TO T5 Met Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 118 <212> PRT <213 Mus musculus <400> 70 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr lie Asn Tyr Asp Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser lie Thr Ser Gly 20 25 3.Ü Tyr Trp Asn Asn Trp lie Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 3S 4~0 * Met Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 72 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens c400> 72 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ser Trp Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Arg lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Xaa Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Pro Gly Gly Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 3-5 4-? 4-5 lie Gly Ser Met Phe His Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Gln Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Asn Trp Phe Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 210> 74 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Ser lie Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 75 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr Gly Gly 20 25 30 Tyr Leu Trp Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Bt 55 6 Lys Asp Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 10O 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 76 <211> 445 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (22) .. (426) <i00> 76 gtcagaacgc gtgccgccac c atg aaa gtg ttg agt ctg ttg tac ctc ttg 51 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu 1 5 10 acá gcc att cct ggt ate ctg tet cag gtg cag ctt cag gag teg ggc 99 Thr Ala lie Pro Gly lie Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 15 20 25 cea gga ctg gtg aag cct teg gag acc ctg tec ctc acc tgc act gtc 147 Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 30 35 40 tet ggt tac tec ate acc ggt ggt tat tta tgg aac tgg ata cgg cag 195 Ser Gly Tyr Ser lie Thr Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp lie Arg Gln 45 50 55 ecc cea ggg aag gga ctg gag tgg atg ggg tat ate age tac gac ggt 243 Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly 60 65 70 acc aat aac tac aaa ecc tec ctc aag gat cga ate acc ata tea cgt 291 Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg lie Thr lie Ser Arg 75 80 85 90 gac acg tec aag aac cag ttc tec ctg aag ctg age tet gtg acc gct 339 Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 95 100 105 gcg gac act gca gtg tat tac tgt gcg aga tac ggt agg gtc ttc ttt 387 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe 110 115 120 gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca ggtgagtgga 436 tcctctgcg 445 <210> 77 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala lie Pro Gly lie 1 5 10 15 Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 35 40 45 Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Mee Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 78 <211> 445 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 78 cagtcttgcg cacggcggtg gtactttcac aaetcagaca acatggagaa ctgtcggtaa 60 ggaccatagg acagagtcca cgtcgaagtc ctcagcccgg gtcctgacca cttcggaagc 120 ctctgggaca gggagtggac gtgacagaga ccaatgaggt agtggccacc aataaatacc 180 ttgacctatg ccgtcggggg tcccttccct gacctcacct accccatata gtcgatgctg 240 ccatggttat tgatgtttgg gagggagttc etagettagt ggtatagtgc actgtgcagg 300 ttcttggtca agagggactt cgactcgaga cactggcgac gcctgtgacg tcacataatg 360 acacgctcta tgccatccca gaagaaactg atgaccccgg tcccttggga ccagtggcag 420 aggagtccac tcacctagga gaege 445 <210> 79 <211> 117 <212> PRT __21 >_ Homo_-sapieiis_ <400> 79 Gln Val Gln Leu Glu Glu Sei Gly Pío Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ty Ser He Thr Gly Gly 20 25 30 Tyr Leu Trp Asn Trp He Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr He Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 80 <211> 445 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (22) .. (426) <400> 80 gtcagaacgc gtgccgccac c atg aaa gtg ttg agt ctg ttg tac ctc ttg 51 Mee Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu 1 5 10 acá gee att ect ggt ate ctg tet cag gtg cag ctt cag gag tcg ggc 99 Thr Ala lie Pro Gly He Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 15 20 25 cea gga ctg gtg aag ect tcg gag acc ctg tec ctc acc tgc act gtc 147 Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 30 35 40 tet ggt tac tec ate acc ggt ggt tat tta tgg aac tgg ata cgg cag 195 Ser Gly Tyr Ser He Thr Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp He Arg Gln 45 50 55 ecc cea ggg aag gga ctg gag tgg ate ggg tat ate age tac gac ggt 243 Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He Gly Tyr He Ser Tyr Asp Gly 60 65 70 acc aat aac tac aaa ecc tec Ctc aag gat cga gtc acc ata tea cgt 291 Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg Val Thr He Ser Arg 75 80 8S 90 gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gct 339 "SspTlrr Ser Lys~~A¾irT31rrr~P1ie-~S¾rT^u^y¾-jnHu—S¾i~-SeTr~VHT-TlTr~rtH 95 100 105 gcg gac act gca gtg tat tac tgt gcg aga tac ggt agg gtc ttc ttt 387 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe 110 115 120 gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca ggtgagtgga 436 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 125 130 tcctctgcg 445 <210> 81 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala lie Pro Gly lie 1 5 10 15 Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 35 40 45 Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp Arg Val Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Le.u Val Thr Val Ser Ser 130 <c210> 82 <211> 445 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 82 cagtcttgcg cacggcggtg gtactttcac aactcagaca acatggagaa ctgtcggtaa 60 ggaccatagg acagagtcca cgtcgaagtc ctcagcccgg gtcctgacca cttcggaagc 120 ctctgggaca gggagtggac gtgacagaga ccaatgaggt agtcgccacc aataaatacc 180 ttgacctatg ccgtcggggg tcccttccct gacctcacct agcccatata gtcgatgctg 240 ccatggttat tgatgtttgg gagggagttc ctagctcagt ggtatagtgc actgtgcagg 300 ttcttggtca agagggactt cgactcgaga cactggcgac gcctgtgacg tcacataatg 360 acacgctcta tgccatccca gaagaaactg atgaccccgg tcccttggga ccagtggcag 420 aggagtccac tcacctagga gacgc 445 <210> 83 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Ser Gly Gly 20 25 30 Tyr Leu Trp Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 84 <211> 445 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (22) .. (426) <400> 84 gtcagaacgc gtgccgccac c atg aaa gtg ttg agt ctg ttg tac etc ttg 51 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu 1 5 10 acá gcc att cct ggt ate ctg tet cag gtg cag ctt cag gag teg ggc 99 Thr Ala lie Pro Gly lie Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 15 20 25 cea gga ctg gtg aag cct teg gag acc ctg tec etc acc tgc act gtc 147 Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 30 35 40 tet ggt tac tec ate age ggt ggt tat tta tgg aac tgg ata cgg cag 195 Ser Gly Tyr Ser lie Ser Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp lie Arg Gln 45 50 55 ccc cea ggg aag gga ctg gag tgg ate ggg tat ate age tac gac ggt 243 acc aat aac tac aaa ccc tcc ctc aag gat cga gtc acc ata tea gtg 291 Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg Val Thr lie Ser Val 75 80 85 90 gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg aag ctg age tet gtg acc gct 339 Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 95 100 105 gcg gac act gca gtg tat tac tgt gcg aga tac ggt agg gtc ttc ttt 387 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe 110 115 120 gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tea ggtgagtgga 436 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 125 120 tcctctgcg 445 <210> 85 <211> 135 <212:> P T <213> Homo sapiens <400> 85 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala lie Pro Gly lie 1 5 10 15 Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Ser 35 40 45 Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 86 <211> 445 <212> ADN e213> Homo sapiens 400> 86 c-tgtutrcgeg- cacggcggTg güact cac aactcagaca acatggagaa ctgtcggtaa 60 ggaccatagg acagagtcca cgtcgaagtc ctcagcccgg gtcctgacca cttcggaagc 120 ctctgggaca gggagtggac gtgacagaga ccaatgaggt agtcgccacc aataaatacc 180 ttgacctatg ccgtcggggg tcccttccct gacctcacct agcccatata gtcgatgctg 240 ccatggttat tgatgtttgg gagggagttc ctagctcagt ggtatagtca cctgtgcagg 300 ttcttggtca agagggactt cgactcgaga cactggcgac gcctgtgacg tcacataatg 360 acacgctcta tgccatccca gaagaaactg atgaccccgg tcccttggga ccagtggcag 420 aggagtccac tcacctagga gacgc 445 <210> 37 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 87 gtcagaacgc gtgccgcc <210> 88 <211 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223 Descripción de la secuencia artificial: 01 igonucleótido <400> 88 accatgaagt tgcctgttag gctgttggtg 32 <210> 89 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleó ido <400> 89 gatgttctgg tttcctgctt ccagcagtga tg 32 <210> 90 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido <400> 90 i-tg-tgargac.- -t_cagtctcca ctctccctgc -ce- 3-2- <210> 91 - 211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223 Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 91 gtcacccctg gagagccggc ctccatctcc tg <210> 92 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial 220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleó ido <400> 92 caggtctagt cagaccatta tacatagtaa tg <210> 93 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 93 gaaacaccta tttggaatgg tacctgcaga <210> 94 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial OI igonucleót ido <400> 94 ggcaacttca tggtggcggc acgcgttctg ac <210> 95 «211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleótido 400> 95 gaaaccagaa catcagca c ad agc Ldd ca <210> 96 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleó ido <400> 96 ctgagtcatc acaacatcac tgctggaagc ag <210> 97 <211> 32 <212> ADN 213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 97 tctccagggg tgacgggcag ggagagtgga ga <210=. 98 <211> 32 212 ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido e400> 98 tctgactaga cctgcaggag atggaggccg ge <210> 99 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 99 aaataggtgt ttccattact atgtacaatg c <210> 100 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ^tt"5> "Descripción de Id secuencia artificial: Oligonucleótido <400> 100 cagggcagtc tccacagctc ctgatctata aa 32 <210> 101 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 101 gtttctaatc ggctttatgg ggtccctgac ag <210> 102 <211> 32 <212> ADN <213 Secuencia artificial <220> 223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 102 gttcagtggc agtggatcag gcacagattt ta <210> 103 <211> 32 <212> ADN c213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 103 cactgaaaat cagcagagtg gaggctgagg at <210> 104 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> c223? Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 104 gttggggttt attactgctt tcaaggttca ca 32 <210> 105 -<211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 01 igonucleót ido <400> 105 tgttccgtgg acgttcggcc aagggaccaa gg 32 <210> 106 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucl eót ido <400> 106 tggaaatcaa acgtgagtgg atcctctgcg <210> 107 21i> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 01 igonucleó ido <400> 107 tctgcaggta ccattgc 17 <210> 108 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial OI igonucleót ido <400> 108 tgcaatggta cctgcagaag c <210> 109 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: OI igonucleót ido <400> 109 <210> 110 <211> 32 212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleótido <400 110 cgattagaaa ctttatagat caggagctgt gg 210> 111 211 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <4O0> 111 tgccactgaa cctgtcaggg accccataaa ge <210> 112 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleótido <400> 112 gattttcagt gtaaaatctg tgcctgatcc ac <210> 113 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 113 taaaccccaa catcctcagc ctccactctg ct <210> 114 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ^22 ^ Descripción la seuu ucid ai tifierra"]: Oligonucleótido <400> 114 tccacggaac atgtgaacct tgaaagcagt aa <210> 115 <211> 31 <212> ADN <c213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido c400> 115 tttgatttcc accttggtcc cttggccgaa c <210> 116 <211> 19 c212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 116 cgcagaggat ccactcacg <210> 117 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleó ido <400> 117 gtcagaacgc gtgccgcc <210> 118 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 118 accatgaaag tgttgagtct gttgtacctc ttga <210> 119 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 01 igonucleót ido <400> 119 cagccattcc tggtatcctg tctcaggtgc agct <210> 120 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 01 igonucleó ido <400> 120 tcaggagtcg ggcccaggac tggtgaagcc ttcg <210> 121 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 01 igonucleótido <400> 121 gagaccctgt ccctcacctg cactgtctct ggt <210> 122 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 01 igonucleótido <400> 122 tactccatca ccggtggtta tttatggaac tgg <210> 123 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Ol igonucleót ido <400> 123 a^^cgg^agc~^cccagggaa gggactggag cgg <210> 124 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 124 atggggtata tcagctacga cggtaccaat aac <210> 125 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleó ido <400> 125 tcaacacttt catggtggcg gcacgcgttc tgac <210> 126 <211> 34 ¦=212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 126 ataccaggaa tggctgtcaa gaggtacaac agac <210> 127 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 127 tgggcccgac tcctgaagct gcacctgaga cagg <210> 128 <211> 34 <212> ADN <213 Secuencia artificial c220> <223> DesxrrT^prWrrtfe-^ra^e rueTTCT^ 01 igonucleót ido <400> 128 tgagggacag ggtctccgaa ggcttcacca gtcc <210> 129 <211> 34 <212> ADN c213> Secuencia artificial <220 <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 129 ccaccggtga tggagtaacc agagacagtg cagg <210> 130 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleó ido <400 130 ccctgggggc tgccgtatcc agttccataa ataa <210> 131 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial 220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 131 tagctgatat accccatcca ctccagtccc tt <210> 132 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 132 gttattggta ccgtcg <210> 133 <211? 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 133 tacgacggta ccaataacta c <210> 134 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido e400> 134 aaaccctccc tcaaggatcg aatcaccata te <210> 135 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220 •=223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 135 acgtgacacg tccaagaacc agttctccct ga <210> 136 c211> 32 <212> ADN c213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 136 agctgagctc tgtgaccgct gcggacactg ca <210> 137 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 137 gtgtattact gtgcgagata cggtagggtc tt 2 210> 138 211> 32 212> ADN 213> Secuencia artificial 220> 223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido 400> 138 tttgactac tggggccagg gaaccctggt ca <210> 139 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial OI igonucleót ido <400> 139 ccgtctcctc aggtgagtgg atcctctgcg <210> 140 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 01 igonucleót ido >:400 140 agggagggtt tgtagttatt ggtaccgtcg 32 <210> 141 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 01 igonucleót ido <400> 141 acgtgtcacg tgatatggtg attcgatcct tg 32 <210> 142 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> 223 Descripción de—ira—s-ecuencia artificial Oligonucleótido <400> 142 agagctcagc ttcagggaga actggttctt gg <210> 143 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> 223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 143 cagtaataca ctgcagtgtc cgcagcggtc ac <210> 144 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial 220 <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 144 agtagtcaaa gaagacccta ccgtatctcg ca <210> 145 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 01 igonucleót ido <400> 145 ctgaggagac ggtgaccagg gttccctggc ccc <210> 146 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial Oligonucleótido <400> 146 cgcagaggat ccactcac <210 147 <211> 31 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 147 ctggttactc catcagcggt ggttatttat g 31 <210> 148 <211> 31 < 12 ADN <213> Homo sapiens <400> 148 cataaataac caccgctgat ggagtaacca g <210> 149 <211> 31 <212> ADN c213 Homo sapiens <400> 149 9ggactggag tggatcgggt atatcagcta c 31 <210> 150 <211> 31 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 150 gtagctgata tacccgatcc actccagtcc c 31 <210> 151 <211> 31 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 151 tccctcaagg atcgagtcac catatcacgt g 31 <210> 152 <211> 31 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 152 cacgtgatat ggtgactcga tccttgaggg a 31 <210> 153 c211> 39 <212> ADN c213> Homo sapiens <400> 153 gatcgagtca ccatatcagt ggacacgtcc aagaaccag 39_ <210> 154 ¦r2 t>—íh9 <212> ADN <213> Komo sapiens <400> 154 ctggttcttg gacgtgtcca ctgatatggt gactcgatc <210> 155 <211> 31 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 155 gcttccagca gtgatattgt gatgactcag t <210> 156 <211> 31 <212> ADN <213> Homo sapiens <400 156 actgagtcat cacaatatca ctgctggaag c

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos mencionados siendo capaz de unirse al receptor del factor de crecimiento I tipo insulina IGF-IR de humano y, si es necesario, inhibiendo la unión natural de sus ligandos IGF1 y/o IGF2, y/o siendo capaz de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor IGF-IR, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una región determinante de complementariedad CDR seleccionada de las CDRs de secuencia SEQ ID No. 2, 4 ó 6, o por lo menos una CDR cuya secuencia tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 2, 4 ó 6, o porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una CDR seleccionada de las CDRs de secuencia SEQ ID Nos. 8, 10 y 12, o por lo menos una CDR cuya secuencia tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 8, 10 y 12. 2.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una CDR de secuencia SEQ ID No. 12, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 12. 3.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos dos de las tres CDRs, o las tres CDRs de secuencia SEQ ID Nos. 8, 10 y 12, o por lo menos 5 dos de tres CDRs o tres CDRs de secuencia que tiene respectivamente por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 8, 10 y 12. 4. - El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además 0 porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una CDR seleccionada de las CDRs de secuencia SEQ ID No. 2, 4 ó 6, o una CDR cuya secuencia tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 2, 4 ó 6. 5. - El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de 5 conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos dos de las tres CDRs o las tres CDRs de secuencia SEQ ID Nos. 2, 4 y 6, o por lo menos dos de tres CDRs o tres CDRs de secuencia que tenga respectivamente por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia 0 SEQ ID No. 2, 4 y 6. 6. - El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además __ porque no se une en una forma significativa al receptor de insulina humana IR. 7.- El anticuerpo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque dicho fragmento funcional se selecciona de los fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', svFv, scFv-Fc y los cuerpos completos, o cualquier fragmento cuya vida media habría sido incrementada, tal como fragmentos pegilados. 8. - Un hibridoma de murino capaz de secretar un anticuerpo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 6. 9. - El hibridoma de murino de conformidad con la reivindicación 8, depositado en el CNC , Instituto Pasteur, París, en septiembre 19, 2001 , bajo el número 1-2717. 10. - Un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, caracterizado porque dicho anticuerpo es secretado por el hibridoma de conformidad con la reivindicación 9. 1 1. - El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 54, o una secuencia que tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 54, y/o porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 69, o una secuencia que tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 69. 12.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico y comprende además las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga al ratón. 13. - El anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha especie heteróloga es el hombre. 14. - El anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano, son respectivamente la región kappa y gamma-1 , gamma-2 o gamma-4. 15. - El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende una cadena ligera y/o una cadena pesada, en la cual los segmentos del esqueleto FR1 a FR4 de dicha cadena ligera y/o cadena pesada, se derivan respectivamente de los segmentos del esqueleto FR1 a FR4 de cadena ligera y/o cadena pesada de anticuerpo humano. 16. - El anticuerpo humanizado o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 61 ó 65, o una secuencia que tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 61 ó 65, y/o porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 75, 79 u 83, o una secuencia que tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 75, 79 u 83. 17. - El anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 65, y porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 79 u 83, de preferencia SEQ ID No. 83. 18. - Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se selecciona de los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica para un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7 y 10 a 17; b) un ácido nucleico complementario o un ácido nucleico tal como se define en el inciso a); y c) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de gran severidad, con por lo menos una de las CDRs de secuencia SEQ ID No. , 3, 5, 7, 9 u 1 1 , o con una secuencia que tenga por lo menos 80% de identidad, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 1 , 3, 5, 7, 9 u 1 1 . 19.- Un vector que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 18. 20.- Una célula hospedera que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 19. 21 .- Un animal transgénico, salvo el hombre, que comprende por lo menos una célula transformada por un vector de conformidad con la reivindicación 19. 22.- Un procedimiento para la producción de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7 y 10 a 17, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) cultivo en un medio y condiciones de cultivo adecuadas de una célula de conformidad con la reivindicación 20; y b) la recuperación de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, producidos de esta manera partiendo del medio de cultivo o dichas células cultivadas. 23.- Un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de obtenerse mediante un procedimiento de conformidad con la reivindicación 22. 24.- El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 10 a 17 y 23, caracterizado además porque es capaz además de unirse específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico de humano, y/o capaz de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor EGFR. 25.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque consiste de un anticuerpo biespecifico y porque comprende un segundo motivo que inhibe específicamente la unión del EGF al receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR de humano, y/o inhibe específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor EGFR. 26. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque es dívalente o tetravalente. 27. - El anticuerpo de conformidad con una de las reivindicaciones 25 ó 26, caracterizado además porque dicho segundo motivo se selecciona de los fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', Fab'PEG, svFv, scFv-Fc y los cuerpos completos, o cualquier forma cuya vida media habría sido incrementada. 28. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado además porque dicho segundo motivo de anti-EGFR se deriva del anticuerpo monoclonal 225 de ratón, su derivado quimérico C225 de ratón-hombre, o un anticuerpo humanizado derivado de este anticuerpo 225. 29. - El anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, 10 a 17 y 23 a 27, como un medicamento. 30. - Una composición que comprende, mediante el principio activo, un compuesto que consiste de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, 10 a 17 y 23 a 29. 31. - La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque comprende un segundo compuesto seleccionado de los compuestos capaces de inhibir específicamente la unión del EGF al receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR de humano, y/o capaz de inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor EGFR. 32. - La composición de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque dicho segundo compuesto se selecciona de los anticuerpos anti-EGFR aislados, o sus fragmentos funcionales, capaces de inhibir por competencia la unión del EGF al EGFR. 33. - La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque dicho anticuerpo anti-EGFR se selecciona de los anticuerpos anti-EGFR monoclonales, quiméricos o humanizados, o sus fragmentos funcionales. 34. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 ó 33, caracterizada además porque dichos fragmentos funcionales del anticuerpo anti-EGFR se seleccionan de los fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc y los cuerpos completos, o cualquier fragmento cuya vida media habría sido incrementada, tal como fragmentos pegilados. 35. - La composición de conformidad con una de las reivindi cacion es 32 a 34, caracterizada ademé s porque dicho anti cuerpo anti- EGFR es el anticuerpo monoclonal 225 de ratón, su derivado quimérico C225 de ratón-hombre, o un derivado de anticuerpo humanizado de este anticuerpo 225. 36.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 35, caracterizada además porque comprende además, como un producto de combinación para uso simultáneo, separado o secuencial, un agente citotóxico/citostático y/o un inhibidor de la actividad de tirosina cinasa, respectivamente, de los receptores para el IGF-I y/o para el EGF. 37.- La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque dicho agente citotóxico/citostático se selecciona de los agentes que interactúan con ADN, los antimetabolitos, los inhibidores de topoisomerasa I o II, o el inhibidor del huso o agentes estabilizadores, o también cualquier agente capaz de ser usado en quimioterapia. 38.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 36 ó 37, caracterizada además porque dicho agente citotóxico/citostático se acopla químicamente a por lo menos uno de los elementos de dicha composición para uso simultáneo. 39.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 37 ó 38, caracterizada además porque dicho agente citotóxico/citostático se selecciona del inhibidor del huso o agentes estabilizadores, de preferencia vinorelbina, vinflunina o vincristina. 40.- La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 36 a 39, caracterizada además porque dicho inhibidor de la actividad de tirosina cinasa respectivamente de los receptores para el IGF-I y/o para el EGF, se selecciona del grupo que consiste de agentes naturales derivados, dinilinoftalimidas, pirazolo- o pirrolo-piridopirimidinas, o también quinazilinas. 41. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 40, caracterizada además porque comprende, además, otro compuesto de anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular del receptor HER2/neu, como un producto de combinación para uso simultáneo, separado o secuencial destinado para la prevención y/o para el tratamiento de cáncer. 42. - La composición de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizada además porque dicho anticuerpo dirigido contra el dominio extramembrana del receptor HER2/neu es Trastuzumab, o uno de sus fragmentos funcionales. 43. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 42, caracterizada además porque por lo menos uno de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, se conjuga con una toxina de una célula y/o un radioelemento. 44. - La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 30 a 43, como un medicamento. 45.- El uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 7, 10 a 17 y 23 a 29 y/o de una composición como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 30 a 44, en la preparación de un medicamento destinado para la prevención y/o para el tratamiento de una enfermedad relacionada con una sobreexpresión y/o una activación anormal del receptor IGF-IR y/o EGFR, y/o relacionada con una hiperactivación de la vía de transducción de la señal mediada por la interacción del IGF1 o el IGF2 con el IGF-IR, y/o del EGF con el EGFR. 46.- El uso como se reclama en la reivindicación 45, en donde la administración de dicho medicamento no induce o sólo induce ligeramente efectos secundarios relacionados con la inhibición del receptor de insulina IR. 47. - El uso como se reclama en la reivindicación 45 ó 46, en la preparación de un medicamento destinado para inhibir la transformación de células normales en células con carácter tumoral, de preferencia células dependientes del IGF, especialmente células dependientes del IGF1 y/o el IGF2, y/o dependientes del EGF y/o dependientes de HER2/neu. 48. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47, en la preparación de un medicamento destinado para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales, de preferencia células dependientes del IGF, especialmente células dependientes del IGF1 y/o el IGF2 y/o dependientes del EGF y/o dependientes de 49.- El uso como se reclama en una de las reivindicaciones 45 a 48, en la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de cáncer. 50. - El uso como se reclama en la reivindicación 49, en donde dicho cáncer es un cáncer seleccionado de cáncer de próstata, osteosarcomas, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer endometrial o cáncer de colon. 51. - El uso como se reclama en una de las reivindicaciones 45 a 48, en la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento de psoriasis. 52. - Un método de diagnóstico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una subexpresión del receptor IGF-IR y/o EGFR, partiendo de una muestra biológica en la cual se sospecha la presencia anormal del receptor IGF-IR y/o EGFR, caracterizado porque dicha muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, 10 a 17 y 23 a 29, siendo posible que dicho anticuerpo sea, si es necesario, marcado. 53. - Un equipo o juego para llevar a cabo un método de diagnóstico de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una subexpresión del receptor IGF-IR y/o EGFR, o para llevar a cabo un procedimiento para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una subexpresión del receptor IGF-IR y/o EGFR en una muestra biológica, de preferencia una sobre expresió n de dicho recepto r, caracterizado porque dicho equipo o juego comprende los siguientes elementos: a) un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, 10 a 17 y 23 a 29; b) opcionalmente, los reactivos para la formación del medio favorable para la reacción inmunológica; c) opcionalmente, los reactivos que permitan la demostración de complejos de IGF-IR/anticuerpo y/o EGFR/anticuerpo producidos mediante la reacción inmunológica. 54.- El uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 7, 10 a 17 y 23 a 29, en la preparación de un medicamento destinado para la elección de un objetivo específico de un compuesto biológicamente activo a células que expresan o sobreexpresan al receptor IGF-IR y/o EGFR.