DE60312639T2

DE60312639T2 - Antikörper gegen igf-ir und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE60312639T2
Application number: DE60312639T
Authority: DE
Inventors: Liliane Goetsch; Nathalie Corvaia; Olivier Leger
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2003-01-20
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2023-01-21
Also published as: CN1620468A; DE60312639D1; SI1461359T1; MXPA04006980A; BR0306973A; WO2003059951A8; JP4606739B2; CA2473039C; EP1461359A2; BRPI0306973B8; JP2010233575A; DK1461359T3; HK1078590A1; AU2003216748A1; AU2009201674A1; EP1806364B1; EP1798242A3; AU2009201674B2; BRPI0306973B1; JP2005536181A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue Antikörper, die in der Lage sind, sich spezifisch an den humanen Rezeptor des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors I IGF-IR zu binden, und/oder in der Lage sind, spezifisch die Tyrosinkinase-Aktivität dieses Rezeptors IGF-IR zu inhibieren, insbesondere monoklonale Antikörper von Mäuse-Herkunft, chimäre und humanisierte Antikörper wie auch die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen, die diese Antikörper kodieren. Die Erfindung umfasst gleichfalls die Verwendung von diesen Antikörpern als Arzneimittel für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung von Krebserkrankungen, bei welchen eine Überexpression des IGF-IR auftritt, oder von einer jeglichen Pathologie, die mit der Überexpression dieses Rezeptors verbunden ist, wie auch in Verfahren oder Kits zur Diagnose von Erkrankungen, die mit der Überexpression des Rezeptors IGF-IR verbunden sind.
Der Rezeptor des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors I, der als IGF-IR bezeichnet wird („IGF-IR" für „Insuline-like Growth Factor-I Receptor") ist ein Rezeptor mit Tyrosinkinase-Aktivität, welcher 70% Homologie zu dem Insulinrezeptor IR („IR" für „Insuline Receptor") umfasst. IGF-IR ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 350000. Dies ist ein heterotetramerer Rezeptor, bei dem jede Hälfte – die durch Disulfidbrücken verbunden ist – aus einer extrazellulären α-Untereinheit und einer transmembranen β-Untereinheit besteht (siehe 1). Der IGF-IR bindet IGF I und IGF II mit einer sehr hohen Affinität (Kd # 1 nM), ist aber gleichfalls in der Lage, sich an Insulin mit einer 100- bis 1000-fach geringeren Affinität zu binden. Im Gegensatz dazu bindet der IR Insulin mit einer sehr hohen Affinität, wohingegen die IGFs sich an den Insulinrezeptor lediglich mit einer 100-fach geringeren Affinität binden. Die Tyrosinkinase-Domäne des IGF-IR und des IR weisen eine sehr hohe Sequenzhomologie auf, wohingegen die Abschnitte von geringerer Homologie die auf der α-Untereinheit gelegene Cystein-reiche Region bzw. den C-terminalen Abschnitt der β-Untereinheit betreffen. Die in der α-Untereinheit beobachteten Sequenzunterschiede befinden sich in dem Bindungsabschnitt der Liganden und sind folglich die Ursache für die relativen Affinitäten des IGF-IR und des IR für die IGFs bzw. Insulin. Die Unterschiede in dem C-terminalen Abschnitt der β-Untereinheit führen zu einer Divergenz in den Signalwegen der beiden Rezeptoren, wobei der IGF-IR mitogene Effekte, Differenzierungs- und Anti-Apoptose-Effekte vermittelt, wohingegen die Aktivierung des IR hauptsächlich Wirkungen im Bereich der Stoffwechselwege zur Folge hat (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332:F105-126, 1997; Baserga, R., Exp. Cell. Res., 253:1-6, 1999).
Die zytoplasmatischen Tyrosinkinase-Proteine werden durch die Bindung des Liganden an die extrazelluläre Domäne des Rezeptors aktiviert. Die Aktivierung der Kinasen hat ihrerseits die Stimulation von verschiedenen intrazellulären Substraten, welche IRS-1, IRS-2, Shc und Grb 10 umfassen, zur Folge (Peruzzi, F., et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999). Die beiden hauptsächlichen Substrate des IGF-IR sind IRS und Shc, die durch die Akti vierung von zahlreichen nachgeschaltet wirksam werdenden Effektoren die Hauptmenge der Vermehrungs- und Differenzierungswirkungen, die mit der Bindung der IGFs an diesen Rezeptor verbunden sind, vermitteln (2). Die Verfügbarkeit von Substraten kann folglich die endgültige biologische Wirkung, die mit der Aktivierung des IGF-IR verbunden ist, diktieren. Wenn IRS-1 vorherrscht, neigen die Zellen dazu, zu proliferieren und sich zu transformieren. Wenn Shc dominiert, neigen die Zellen dazu, sich zu differenzieren (Valentinis, B., et al., J. Biol. Chem., 274:12423-12430, 1999). Es scheint, dass der Weg, der für die Schutzwirkungen gegen die Apoptose hauptsächlich in Frage kommt, der Weg der Phosphatidylinositol-3-kinasen (PI 3-Kinasen) ist (Prisco, M., et al., Horm. Metab. Res., 31:80-89, 1999; Peruzzi, F., et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999).
Die Rolle des IGF-Systems bei der Kanzerogenese ist in den letzten zehn Jahren zum Gegenstand von intensiven Untersuchungen geworden. Dieses Interesse folgte der Entdeckung der Tatsache, dass zusätzlich zu seinen mitogenen und anti-apoptotischen Eigenschaften der IGF-IR für die Etablierung und Aufrechterhaltung eines transformierten Phänotyps erforderlich zu sein scheint. Tatsächlich ist aufgeklärt worden, dass eine Überexpression oder eine konstitutive Aktivierung des IGF-IR bei einer großen Vielzahl von Zellen zu einer von einem Träger unabhängigen Vermehrung der Zellen in Medien, die frei von fötalem Kälberserum sind, und zu der Bildung von Tumoren bei der Nacktmaus führt. Dies ist an sich keine einzigartige Eigenschaft, denn eine große Vielzahl von überexprimierten Genprodukten kann Zellen transformieren, einschließlich einer beträchtlichen Anzahl von Rezeptoren von Wachstumsfaktoren. Die entscheidende Entdeckung, die die durch den IGF-IR bei der Transformation gespielte Hauptrolle klar nachgewiesen hat, war aber der Nachweis gewesen, dass die R-Zellen, in denen das den IGF-IR kodierende Gen inaktiviert worden ist, hinsichtlich der Transformation durch verschiedene Agentien, die gewöhnlich in der Lage sind, die Zellen zu transformieren, wie das Protein E5 des Rinder-Papillomavirus, eine Überexpression des EGFR oder des PDGFR, das T-Antigen von SV40, aktiviertes ras oder die Kombination von diesen beiden letzteren Faktoren, vollständig unempfindlich (refraktär) sind (Sell, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11217-11221, 1993; Sell, C., et al., Mol. Cell. Biol., 14:3604-3612, 1994; Morrione, A.J., Virol., 69:5300-5303, 1995; Coppola, D., et al., Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595, 1994; DeAngelis, T., et al., J. Cell. Physiol., 164:214-221, 1995).
Der IGF-IR wird in einer großen Vielzahl von Tumoren und Tumorlinien exprimiert und die IGFs verstärken das Tumorwachstum über deren Bindung an den IGF-IR. Andere Argumente zu Gunsten der Rolle des IGF-IR bei der Kanzerogenese stammen aus Untersuchungen, welche monoklonale Mäuse-Antikörper, die gegen den Rezeptor oder negative Dominanten des IGF-IR gerichtet sind, einsetzen. Tatsächlich inhibieren monoklonale Mäuse-Antikörper, die gegen den IGF-IR gerichtet sind, die Proliferation von zahlreichen Zelllinien in Kultur und die Vermehrung von Tumorzellen in vivo (Arteaga, C., et al., Cancer Res., 49:6237-6241, 1989; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 196:92-98, 1993; Zia, F., et al. J. Cell. Biol., 24:269-275, 1996), Scotlandi, K. et al. Cancer Res., 58:4127-4131, 1998). Es ist gleichfalls in den Arbeiten von Jiang et al. (Oncogene, 18:6071-6077, 1999) gezeigt worden, dass eine negative Dominante des IGF-IR in der Lage ist, die Tumorproliferation zu inhibieren.
Die Erfindung hat zum Gegenstand, über einen monoklonalen Mäuse-Antikörper, vorzugsweise einen in Chimärform vorliegenden oder humanisierten Antikörper verfügen zu können, der spezifisch und mit einer hohen Affinität den IGF-IR erkennen wird. Dieser Antikörper wird nicht oder wenig mit dem Insulinrezeptor IR interagieren. Seine Bindung wird in vitro das Wachstum der Tumore, die den IGF-IR exprimieren, inhibieren, indem er hauptsächlich mit den Signaltransduktionswegen, die während IGF1/IGF-IR- und IGF2/IGF-IR-Wechselwirkungen aktiviert werden, interagiert. Dieser Antikörper wird in vivo gegenüber allen Arten von Tumoren, die den IGF-IR exprimieren, einschließlich der Östrogen-abhängigen Brusttumore und der Prostatatumore, aktiv sein, was bei den monoklonalen anti-IGF-IR-Antikörpern (bezeichnet als MAk oder MAK), die gegenwärtig verfügbar sind, nicht der Fall ist. Tatsächlich inhibiert der αIR3, der auf dem Gebiet des IGF-lR die Referenz bildet, das Wachstum von Östrogen-abhängigen Brusttumoren (MCF-7) in vitro vollständig, ist aber in dem entsprechenden in vivo-Modell ohne Wirkung (Artega, C., et al., J. Clin. Invest. 84:1418-1423, 1989). Ebenso ist das scFv-Fc-Fragment, welches von dem monoklonalen Maus-Antikörper 1H7 abgeleitet ist, gegenüber dem Brusttumor MCF-7 lediglich schwach aktiv und gegenüber einem Androgen-unabhängigen Prostatatumor vollständig inaktiv (Li, S.L., et al., Cancer Immunol. Immunther., 49:243-252, 2000).
Überraschenderweise haben die Erfinder einen chimären Antikörper (bezeichnet als C7C10) und zwei humanisierte Antikörper, die als h7C10 humanisierte Form 1 und h7C10 humanisierte Form 2 bezeichnet werden, die von dem monoklonalen Maus-Antikörper 7C10 abgeleitet worden sind, nachgewiesen, die den IGF-IR erkennen und allen vorstehend aufgeführten Kriterien entsprechen, d.h. einer Nicht-Erkennung des Insulinrezeptors, einer in vitro-Blockierung der IGF1- und/oder IGF2-induzierten Proliferation, aber gleichfalls der in vivo-Inhibition des Wachstums von verschiedenen Tumoren, die den IGF-IR exprimieren, unter diesen ein Osteosarkom und ein nicht-kleinzelliger Lungentumor, aber gleichfalls und insbesondere der Östrogen-abhängige Brusttumor MCF-7 und ein Androgen-unabhängiger Tumor der Prostata DU-145. Ebenso und überraschend ist die Intensität der Inhibition der tumoralen Vermehrung der MCF-7-Zellen in vivo durch den 7C10-Antikörper vergleichbar, ja sogar signifikant höher als jene, die mit Tamoxifen, einer der Referenzverbindungen bei der Behandlung der Östrogen-abhängigen Brusttumore, beobachtet wird. Außerdem ist gezeigt worden, dass diese Antikörper die Phosphorylierung des Tyrosins der β-Kette des IGF-IR und des IRS1, des erstrangigen Substrats des Rezeptors, inhibieren. Außerdem ist gleichfalls ermittelt worden, dass diese Antikörper die Internalisierung des Rezeptors und seinen Abbau hervorrufen im Gegen satz dazu, was gewöhnlich mit den natürlichen Liganden, die die schnelle Rezyklierung des Rezeptors an die Oberfläche der Zellen erlauben, beobachtet wird. Diese Antikörper konnten durch ihre Peptid- und Nukleotidsequenz charakterisiert werden, insbesondere durch die Sequenz von deren Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDR) für den IGF-IR.
So hat gemäß einer ersten Ausführungsform die Erfindung einen isolierten Antikörper oder ein von dessen funktionalen Fragmenten zum Gegenstand, wobei der Antikörper oder das eine der Fragmente in der Lage ist, sich spezifisch an den humanen Rezeptor des Insulinähnlichen Wachstumsfaktors I IGF-IR zu binden, dadurch gekennzeichnet, dass er bzw. es eine leichte Kette, welche die drei CDRs mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 2, 4 und 6 umfasst, umfasst und dass er bzw. es eine schwere Kette, welche die drei CDRs mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 8, 10 und 12 umfasst, umfasst.
In der vorliegenden Beschreibung haben die Begriffe „sich binden" oder „sich anheften" die gleiche Bedeutung und sind gegeneinander austauschbar.
In der vorliegenden Beschreibung sind die Begriffe Polypeptide, Polypeptidsequenzen, Peptide und Proteine, die mit den Antikörperverbindungen oder deren Sequenz in Verbindung gebracht werden, gegeneinander austauschbar.
Es muss sich hier verstehen, dass die Erfindung nicht die Antikörper in natürlicher Form betrifft, d.h. dass sie nicht in ihrer natürlichen Umgebung herangezogen werden, sondern dass man sie hat isolieren können oder dass es möglich war, sie durch Reinigung ausgehend von natürlichen Quellen zu erhalten oder sie ebenso durch genetische Rekombination oder durch chemische Synthese zu erhalten, und dass sie dann nicht-natürliche Aminosäuren, wie weiter unten beschrieben werden wird, umfassen können.
Mit CDR-Region oder CDR sollen die hypervariablen Regionen der schweren und leichten Ketten der Immunglobuline bezeichnet werden, wie von Kabat et al. definiert (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5. Aufl., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, und spätere Auflagen). Es existieren 3 CDRs der schweren Kette und 3 CDRs der leichten Kette. Der Begriff CDR oder CDRs wird hier eingesetzt, um je nach Fall eine von diesen Regionen oder mehrere, ja sogar die Gesamtheit von diesen Regionen, die die Hauptmenge der Aminosäurereste, die für die Bindung durch Affinität des Antikörpers für das Antigen oder das Epitop, das er erkennt, verantwortlich sind, enthalten, zu bezeichnen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind vorzugsweise spezifische monoklonale Antikörper, vorzugsweise von Mäuse-Herkunft, chimäre oder humanisierte Antikörper, die gemäß den Standardmethoden, die den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, erhalten werden können.
Allgemein kann man für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern oder von deren funktionalen Fragmenten, insbesondere von Mäuse-Herkunft, auf die Techniken, die insbesondere in dem Handbuch „Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Hiarbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, S. 726, 1988) beschrieben werden, oder auf die Herstellungstechnik ausgehend von Hybridomen, die von Kohler und Milstein (Nature, 256:495-497, 1975) beschrieben worden ist, verweisen.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können beispielsweise ausgehend von Zellen eines Tiers, das gegen den Rezeptor IGF-IR oder eines von dessen Fragmenten, welche das spezifisch durch die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erkannte Epitop umfassen, immunisiert worden ist, erhalten werden. Der Rezeptor IGF-IR oder eines von dessen Fragmenten wird insbesondere hergestellt werden können gemäß den üblichen Vorgehensweisen, durch genetische Rekombination ausgehend von einer Nukleinsäuresequenz, die in der cDNA-Sequenz, welche den IGF-IR-Rezeptor kodiert, enthalten ist, oder durch Peptidsynthese ausgehend von einer Aminosäuresequenz, welche in der Peptidsequenz des IGF-IR-Rezeptors enthalten ist.
Die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung werden beispielsweise gereinigt werden können an einer Affinitätssäule, an welcher vorab der IGF-IR-Rezeptor oder eines von dessen Fragmenten, welche das spezifisch durch die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erkannte Epitop umfassen, immobilisiert worden ist. Insbesondere werden die monoklonalen Antikörper hergestellt werden können durch Chromatographie an Protein A und/oder G, gefolgt oder nicht gefolgt von einer Chromatographie durch Ionenaustausch, welche darauf abzielt, die restlichen Protein-artigen Verunreinigungen wie auch die DNA und die LPS zu entfernen, ihrerseits gefolgt oder nicht gefolgt von einer Sepharose-Gelausschlusschromatographie, um die potentiellen Aggregate, die auf das Vorhandensein von Dimeren oder anderen Multimeren zurückzuführen sind, zu entfernen. Noch mehr bevorzugt kann die Gesamtheit von diesen Techniken gleichzeitig oder nacheinander eingesetzt werden.
Von den erfindungsgemäßen Antikörpern werden gleichfalls die chimären oder humanisierten Antikörper umfasst.
Mit chimärer Antikörper soll ein Antikörper bezeichnet werden, der eine natürliche variable Region (leichte Kette und schwere Kette), die von einem Antikörper einer gegebenen Spezies abgeleitet worden ist, in Kombination mit den konstanten Regionen aus leichter Kette und schwerer Kette von einem Antikörper einer zu der gegebenen Spezies heterologen Spezies enthält.
Die Antikörper oder deren Fragmente vom chimären Typ gemäß der Erfindung können hergestellt werden, indem die genetischen Rekombinationstechniken eingesetzt werden. Beispielsweise könnte der chimäre Antikörper hergestellt werden, indem eine rekombinante DNA kloniert wird, welche einen Promotor und eine die variable Region eines nicht-humanen, insbesondere von der Maus stammenden monoklonalen Antikörpers gemäß der Erfindung kodierende Sequenz und eine die konstante Region eines humanen Antikörpers kodierende Sequenz umfasst. Ein chimärer Antikörper der Erfindung, der durch ein solches rekombinantes Gen ko diert wird, wird beispielsweise ein Maus-Mensch-Chimär sein, wobei die Spezifität dieses Antikörpers durch die variable Region, welche von der Mäuse-DNA abgeleitet ist, bestimmt wird und sein Isotyp durch die von der humanen DNA abgeleitete konstante Region bestimmt wird. Hinsichtlich der Methoden zur Herstellung von chimären Antikörpern könnte man beispielsweise auf das Dokument Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988) verweisen.
Mit humanisierte Antikörper soll ein Antikörper bezeichnet werden, der CDR-Regionen enthält, die von einem Antikörper von nicht-humanem Ursprung abgeleitet sind, wobei die anderen Abschnitte des Antikörpermoleküls von einem (oder mehreren) humanen Antikörper(n) abgeleitet sind. Außerdem können bestimmte der Reste der Segmente des Gerüsts (bezeichnet als FR) modifiziert werden, um die Bindungsaffinität zu bewahren (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).
Die erfindungsgemäßen humanisierten Antikörper oder deren Fragmente können hergestellt werden durch Techniken, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind (wie beispielsweise jene, die in den Dokumenten Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; oder Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992, beschrieben werden). Solche humanisierten Antikörper gemäß der Erfindung sind für deren Verwendung in in vitro-Diagnoseverfahren oder Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung in vivo bevorzugt.
Mit funktionales Fragment eines erfindungsgemäßen Antikörpers soll insbesondere ein Antikörperfragment, wie Fv-, scFv-(sc für Einzelkette), Fab-, F(ab')₂-, Fab'-, scFv-Fc-Fragmente oder Diabodies, oder ein jegliches Fragment, dessen Halbwertszeit durch chemische Modifikation, wie die Hinzufügung von Poly(alkylen)glycol, wie Poly(ethylen)glycol („PEGylierung") (wobei pegylierte Fragmente als Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, (Fab')₂-PEG oder Fab'-PEG bezeichnet werden) („PEG" für Poly(ethylen)glycol), oder durch Inkorporieren in ein Liposom erhöht worden sein könnte, bezeichnet werden, wobei diese Fragmente die drei CDRs mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2, 4 und 6 und die drei CDRs mit der Sequenz SEQ ID Nr. 8, 10 und 12, die gemäß der Erfindung charakteristisch sind, aufweisen und insbesondere dass es in der Lage ist, allgemein eine sogar partielle Aktivität des Antikörpers, von dem es abstammt, auszuüben, wie insbesondere die Fähigkeit, den Rezeptor IGF-IR zu erkennen und sich an diesen zu binden und gegebenenfalls die Aktivität des Rezeptors IGF-IR zu inhibieren.
Die funktionalen Fragmente werden vorzugsweise gebildet aus oder umfassen eine partielle Sequenz der variablen schweren oder leichten Kette des Antikörpers, von dem sie abgeleitet sind, wobei diese partielle Sequenz ausreichend ist, um die gleiche Bindungsspezifität wie der Antikörper, von dem sie stammt, und eine ausreichende Affinität, vorzugsweise wenigstens 1/100, noch mehr bevorzugt wenigstens 1/10 von jener des Antikörpers, von dem sie stammt, gegenüber dem Rezeptor IGF-IR beizubehalten.
Ein solches funktionales Fragment wird mindestens 5 Aminosäuren, vorzugsweise 10, 15, 25, 50 und 100 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Sequenz des Antikörpers, von dem es abstammt, umfassen.
Diese funktionsfähigen Fragmente werden vorzugsweise Fragmente vom Typ Fv, scFv, Fab, F(ab')₂, F(ab'), scFv-Fc oder Diabodies, die im Allgemeinen die gleiche Bindungsspezifität wie der Antikörper, von dem sie abstammen, aufweisen, sein. Die Antikörperfragmente der Erfindung können ausgehend von Antikörpern, wie zuvor beschrieben, durch Methoden, wie durch den Verdau durch Enzyme, wie Pepsin oder Papain, und/oder durch Spaltung der Disulfidbrücken durch chemische Reduktion, erhalten werden. Auf andere Weise können die Antikörperfragmente, die von der Erfindung umfasst werden, durch genetische Rekombinationstechniken, die den Fachleuten auf diesem Gebiet gleichfalls wohlbekannt sind, oder ferner durch Peptidsynthese mittels beispielsweise automatischen Synthetisiergeräten von Peptiden, wie jenen, die von der Firma Applied Biosystems geliefert werden, u.s.w., erhalten werden.
Mehr bevorzugt sind die Antikörper oder deren funktionale Fragmente gemäß der Erfindung chimäre oder humanisierte Antikörper. Sie können durch genetische Rekombination oder durch chemische Synthese erhalten werden.
Unter den sechs kurzen CDR-Sequenzen weist die dritte CDR der schweren Kette (CDRH3) eine größere Größenvariabilität (große Diversität im Wesentlichen aufgrund der Umlagerungsmechanismen der Gene, die diese erzeugen) auf. Sie kann lediglich 2 Aminosäuren kurz sein, wohingegen die längste bekannte Größe 26 ist. Funktional gesehen spielt die CDRH3 eine besondere Rolle bei der Bestimmung der Spezifität des Antikörpers (Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974; Amit et al., Science, 233:747-753, 1986; Chotia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987; Chotia et al., Nature, 342:877-883; 1989; Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990; Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990; Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990; Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991).
Es ist bekannt, dass nur ein geringer Prozentsatz der Aminosäuren der CDRs zu der Konstruktion der Bindungsstelle des Antikörpers beiträgt, aber diese Reste müssen in einer sehr spezifischen dreidimensionalen Konformation gehalten werden.
Unter einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Mäuse-Hybridom, welches in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung zu sekretieren, insbesondere das Hybridom von Mäuse-Herkunft, wie es bei dem Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, Frankreich) am 19. September 2001 unter der Nummer 1-2717 hinterlegt worden ist.
Der monoklonale Antikörper, der hier als 7C10 bezeichnet wird, oder eines von seinen funktionalen Fragmenten, der bzw. das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Antikörper durch das bei der CNCM am 19. September 2001 unter der Nummer 1-2717 hinterlegte Hybridom sekretiert wird, bildet selbstverständlich einen Teil der Erfindung.
In einer besonderen Ausführungsweise bezieht sich die Erfindung auf einen Mäuse-Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine leichte Kette mit einer Sequenz, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 54 umfasst, umfasst und dass er eine schwere Kette mit einer Sequenz, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 69 umfasst, umfasst.
Unter einem gleichfalls besonderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf einen chimären Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper außerdem die konstanten Regionen der leichten Kette und der schweren Kette, welche von einem Antikörper von einer zu der Maus heterologen Spezies, insbesondere dem Menschen, abgeleitet sind, umfasst und vorzugsweise dass die konstanten Regionen der leichten Kette und der schweren Kette, die von einem humanen Antikörper abgeleitet sind, die Region kappa bzw. gamma-1, gamma-2 oder gamma-4 sind.
Unter einem gleichfalls besonderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf einen humanisieren Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine leichte Kette und/oder eine schwere Kette umfasst, in welchen die Gerüstsegmente FR1 bis FR4 (wie nachfolgend in den Beispielen 12 und 13, in den Tabellen 5 und 6 definiert) der leichten Kette und/oder der schweren Kette jeweils von Gerüstsegmenten FR1 bis FR4 der leichten Kette und/oder der schweren Kette von humanen Antikörpern abgeleitet sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise ist der humanisierte Antikörper oder das eine von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass der humanisierte Antikörper eine leichte Kette, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 61 oder 65 umfasst, umfasst und dass er eine schwere Kette, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 75, 79 oder 83 umfasst, umfasst.
Vorzugsweise ist der humanisierte Antikörper oder das eine von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass der humanisierte Antikörper eine leichte Kette, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 65 umfasst, umfasst und dass er eine schwere Kette mit einer Sequenz, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 79 oder 83, vorzugsweise SEQ ID Nr. 83 umfasst, umfasst.
Unter einem neuen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine isolierte Nukleinsäure, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie unter den folgenden Nukleinsäuren ausgewählt wird:

a) einer Nukleinsäure, DNA oder RNA, welche einen Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung kodiert;
b) einer Nukleinsäure, die zu einer Nukleinsäure, wie sie unter a) definiert wird, komplementär ist; und
c) einer Nukleinsäure mit wenigstens 18 Nukleotiden, welche in der Lage ist, unter Bedingungen hoher Stringenz mit wenigstens einer der CDRs mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 zu hybridisieren.

Mit Nukleinsäure, Nukleinsäuresequenz oder Nukleinsäure, Polynukleotid, Oligonukleotid, Polynukleotidsequenz, Nukleotidsequenz, Begriffen, die in der vorliegenden Beschreibung unterschiedslos verwendet werden, soll eine präzise Aneinanderreihung von modifizierten oder nicht-modifizierten Nukleotiden, welche erlaubt, ein Fragment oder eine Region einer Nukleinsäure, welche(s) nicht-natürliche Nukleotide umfasst oder nicht, zu definieren, und welche gleichermaßen einer doppelsträngigen DNA, einer einzelsträngigen DNA wie auch Transkriptionsprodukten der DNAs entsprechen kann, bezeichnet werden.
Es muss sich hier ebenfalls verstehen, dass die Erfindung nicht die Nukleotidsequenzen in ihrer natürlichen chromosomalen Umgebung, d.h. im natürlichen Zustand betrifft. Es handelt sich um Sequenzen, die isoliert und/oder gereinigt worden sind, d.h. sie wurden direkt oder indirekt, beispielsweise durch Kopie, entnommen, wobei ihre Umgebung wenigstens teilweise modifiziert worden ist. Es sollen so hier gleichfalls die isolierten Nukleinsäuren, die durch genetische Rekombination mittels beispielsweise Wirtszellen erhalten worden sind oder durch chemische Synthese erhalten worden sind, bezeichnet werden.
Eine Hybridisierung unter Bedingungen hoher Stringenz bezeichnet, dass die Temperatur- und Ionenstärke-Bedingungen derart ausgewählt werden, dass sie die Aufrechterhaltung der Hybridisierung zwischen zwei komplementären DNA-Fragmenten erlauben. Zur Veranschaulichung sind Bedingungen hoher Stringenz des Hybridisierungsschritts zu dem Zweck, die vorstehend beschriebenen Polynukleotidfragmente zu definieren, vorteilhafterweise die Folgenden.
Die DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung wird in zwei Schritten ausgeführt: (1) Vorhybridisierung bei 42°C während 3 h in Phosphatpuffer (20 mM, pH 7,5), enthaltend 5 × SSC (wobei 1 × SSC einer Lösung von 0,15 M NaCl + 0,015 M Natriumcitrat entspricht), 50% Formamid, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 10 × Denhardt's, 5% Dextransulfat und 1% Lachssperma-DNA; (2) Hybridisierung im eigentlichen Sinne während 20 h bei einer von der Größe der Sonde abhängigen Temperatur (d.h.: 42°C für eine Sonde mit einer Größe > 100 Nukleotide), gefolgt von 2 Wäschen von 20 min bei 20°C in 2 × SSC + 2% SDS, 1 Wäsche von 20 min bei 20°C in 0,1 × SSC + 0,1% SDS. Das letzte Waschen wird in 0,1 × SSC + 0,1% SDS während 30 min bei 60°C für eine Sonde mit einer Größe > 100 Nukleotide ausgeführt. Die oben für ein Polynukleotid von definierter Größe beschriebenen Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz können durch den Fachmann auf diesem Gebiet für Oligonukleotide von größerer oder geringerer Größe angepasst werden gemäß der Lehre von Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor).
Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf einen Vektor, welcher eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung umfasst.
Die Erfindung zielt insbesondere ab auf die Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren, die eine Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung enthalten.
Die erfindungsgemäßen Vektoren umfassen vorzugsweise Elemente, die die Expression und/oder die Sekretion der Nukleotidsequenzen in einer bestimmten Wirtszelle erlauben. Der Vektor muss dann einen Promotor, Translationsinitiations- und -terminationssignale wie auch geeignete Transkriptionsregulationsregionen umfassen. Er muss in der Wirtszelle stabil aufrechterhalten werden können und kann gegebenenfalls besondere Signale aufweisen, die die Sekretion des translatierten Proteins spezifizieren. Diese unterschiedlichen Elemente werden durch den Fachmann auf diesem Gebiet abhängig von dem verwendeten zellulären Wirt ausgewählt und optimiert. Zu diesem Zweck können die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen in bezogen auf den gewählten Wirt autonome Replikationsvektoren inseriert werden oder in Bezug auf den ausgewählten Wirt integrative Vektoren sein.
Solche Vektoren werden durch Methoden, die durch den Fachmann auf diesem Gebiet geläufig eingesetzt werden, hergestellt und die resultierenden Klone können in einen geeigneten Wirt durch Standardmethoden, wie die Lipofektion, die Elektroporation, den Wärmeschock, oder chemische Methoden eingeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Vektoren sind beispielsweise Vektoren von Plasmid-Herkunft oder viraler Herkunft. Sie sind nützlich, um Wirtszellen zu transformieren, um die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen zu klonieren oder zu exprimieren.
Die Erfindung umfasst gleichfalls die Wirtszellen, die einen erfindungsgemäßen Vektor umfassen.
Die Wirtszelle kann unter prokaryotischen oder eukaryotischen Systemen, beispielsweise den Bakterienzellen, aber gleichfalls den Hefezellen oder den tierischen Zellen, insbesondere den Säugetierzellen, ausgewählt werden. Man kann gleichfalls Insektenzellen oder Pflanzenzellen verwenden.
Unter einem anderen Aspekt hat die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder von einem von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung zum Gegenstand, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) die Kultivierung einer erfindungsgemäßen Wirtszelle in einem Kulturmedium und unter Kulturbedingungen, die geeignet sind; und
b) die Gewinnung der so hergestellten Antikörper oder des hergestellten einen von dessen funktionalen Fragmenten ausgehend von dem Kulturmedium oder den kultivierten Zellen.

Die gemäß der Erfindung transformierten Zellen sind in Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Polypeptiden gemäß der Erfindung einsetzbar. Die Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß der Erfindung in rekombinanter Form, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einen Vektor und/oder eine durch einen Vektor transformierte Zelle gemäß der Erfindung einsetzen, werden ihrerseits von der Erfindung mit umfasst. Man kultiviert vorzugsweise eine durch einen Vektor gemäß der Erfindung transformierte Zelle unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids erlauben, und man gewinnt das rekombinante Polypeptid.
Wie bereits gesagt, kann der zelluläre Wirt ausgewählt werden unter prokaryotischen oder eukaryotischen Systemen. Insbesondere ist es möglich, Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung zu identifizieren, die die Sekretion in einem solchen prokaryotischen oder eukaryotischen System vereinfachen. Ein erfindungsgemäßer Vektor, welcher eine solche Sequenz trägt, kann folglich in vorteilhafter Weise für die Herstellung von rekombinanten Proteinen, die dazu bestimmt sind, sekretiert zu werden, eingesetzt werden. Tatsächlich wird die Reinigung dieser rekombinanten Proteine von Interesse durch die Tatsache vereinfacht werden, dass sie in dem Überstand der Zellkultur anstelle im Inneren der Wirtszellen vorhanden sind.
Man kann die erfindungsgemäßen Polypeptide gleichfalls durch chemische Synthese herstellen. Ein solches Herstellungsverfahren ist gleichfalls ein Gegenstand der Erfindung. Der Fachmann auf diesem Gebiet kennt die chemischen Syntheseverfahren, beispielsweise die Techniken, die feste Phasen einsetzen (siehe insbesondere Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, III., 2. Aufl. (1984)), oder Techniken, die partielle feste Phasen einsetzen, durch Kondensation von Fragmenten oder durch klassische Synthese in Lösung. Die Polypeptide, die durch chemische Synthese erhalten werden und entsprechende nicht-natürliche Aminosäuren umfassen können, werden gleichfalls von der Erfindung mit umfasst.
Die Antikörper oder das eine von dessen funktionalen Fragmenten, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten werden können, werden von der Erfindung gleichfalls mit umfasst.
Unter noch einem anderen Aspekt hat die Erfindung einen Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung als Arzneimittel, vorzugsweise einen humanisierten Antikörper, wie vorstehend definiert, zum Gegenstand. Unter Antikörper muss man für die folgende Beschreibung ebenso einen anti-IGF-IR-Antikörper wie auch einen bispezifischen anti-IGF-IR/EGFR-Antikörper verstehen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche als Wirkstoff eine Verbindung bestehend aus einem Antikörper oder einem von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung umfasst, wozu vorzugsweise ein Träger und/oder eine pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanz hinzugesetzt worden ist.
Die Erfindung umfasst außerdem die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung für die Herstellung eines Arzneimittels.
Insbesondere wird die Verwendung eines Antikörpers oder von einem von dessen funktionalen Fragmenten und/oder von einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Arzneimit tels, das für die Verhütung oder für die Behandlung einer Erkrankung, die durch eine Überexpression und/oder eine abnormale Aktivierung des IGF-IR-Rezeptors induziert wird und/oder mit einer Hyperaktivierung des durch die Wechselwirkung des IGF-1 oder IGF-2 mit IGF-IR vermittelten Signalweiterleitungswegs verbunden ist, bestimmt ist, beschrieben.
Die Verabreichung des Arzneimittels induziert vorzugsweise keine oder wenig Nebenwirkungen, die verbunden sind mit einer Inhibition des Insulinrezeptors IR, d.h. mit einer Inhibition der Wechselwirkung des IR-Rezeptors mit seinen natürlichen Liganden aufgrund der Anwesenheit des Arzneimittels, insbesondere durch eine kompetitive Inhibition, die mit der Bindung des Arzneimittels an den IR verbunden ist.
Die Erfindung beschreibt die Verwendung eines Antikörpers oder von einem von dessen funktionalen Fragmenten, vorzugsweise humanisiert, und/oder einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels, das dafür bestimmt ist, die Transformation von normalen Zellen zu Zellen mit tumoralem Charakter, vorzugsweise die IGF-, insbesondere IGF1- und/oder IGF2-abhängige Transformation zu inhibieren.
Die Erfindung beschreibt die Verwendung eines Antikörpers oder von einem von dessen funktionalen Fragmenten, vorzugsweise humanisiert, und/oder von einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels, das dafür bestimmt ist, die Vermehrung und/oder die Proliferation von Tumorzellen, vorzugsweise die IGF-, insbesondere IGF1- und/oder IGF2-abhängige Vermehrung und/oder Proliferation zu inhibieren.
Allgemein hat die Erfindung die Verwendung eines Antikörpers oder von einem von dessen funktionalen Fragmenten, vorzugsweise humanisiert, und/oder einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels, das für die Verhütung oder für die Behandlung von Krebs bestimmt ist, zum Gegenstand. Es werden bevorzugt die Krebserkrankungen, bei welchen eine Expression des IGF-IR stattfindet und/oder bei welchen eine Hyperaktivierung des durch die Wechselwirkung von IGF1 oder IGF2 mit IGF-IR vermittelten Signaltransduktionsweges vorliegt, wie beispielsweise die Überexpression von IRS1, beschrieben.
Es wird hier gleichfalls die Verwendung eines Antikörpers oder von einem von dessen funktionalen Fragmenten, vorzugsweise humanisiert, und/oder von einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels, das für die Verhütung oder für die Behandlung von Psoriasis, einer Psoriasis, bei welcher die epidermale Hyperproliferation mit der Expression oder der Überexpression des IGF-IR und/oder mit der Hyperaktivierung des durch die Wechselwirkung des IGF-IR mit seinen natürlichen Liganden vermittelten Signaltransduktionswegs verbunden sein kann, (Wraight, C.J., et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18(5):521-526. Reversal of epidermal hyperproliferation in psoriasis by insulin-like growth factor I receptor antisense oligonucleotides), bestimmt ist, beschrieben.
Unter den Krebserkrankungen, die verhütet und/oder behandelt werden können, werden der Prostatakrebs, die Osteosarcome, der Lungenkrebs, der Brustkrebs bevorzugt. Man kann gleichfalls die Krebserkrankung des Endometriums oder die Krebserkrankung des Colons oder eine jegliche andere Krebsform, bei welcher eine Überexpression des IGF-IR stattfindet, aufführen.
Unter noch einem anderen Aspekt hat die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose, bevorzugt in vitro, von Erkrankungen, die mit einer Überexpression oder einer Unterexpression, vorzugsweise einer Überexpression des Rezeptors IGF-IR verbunden sind, ausgehend von einer biologischen Probe, bei welcher man ein abnormales Vorhandensein von IGF-IR-Rezeptor vermutet, zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man die biologische Probe mit einem Antikörper oder einem von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung in Kontakt bringt, wobei der Antikörper gegebenenfalls markiert sein kann.
Die Erkrankungen, die mit einer Überexpression des Rezeptors IGF-IR verbunden sind, sind bei diesem Diagnoseverfahren vorzugsweise Krebserkrankungen.
Der Antikörper oder das eine von dessen funktionalen Fragmenten kann in Form eines Immunkonjugats oder eines markierten Antikörpers vorliegen, um ein detektierbares und/oder quantifizierbares Signal zu erhalten.
Die markierten Antikörper gemäß der Erfindung oder deren funktionale Fragmente umfassen beispielsweise sogenannte immunkonjugierte Antikörper, die beispielsweise mit Enzymen, wie Peroxidase, alkalischer Phosphatase, α-D-Galactosidase, Glucoseoxidase, Glucoseamylase, Carboanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Malatdehydrogenase oder Glucose-6-phosphatdehydrogenase, oder mit einem Molekül, wie Biotin, Digoxigenin oder 5-Bromdesoxyuridin, konjugiert sein können. Mit den Antikörpern oder deren funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung können gleichfalls fluoreszierende Marker konjugiert sein und umfassen insbesondere Fluorescein und dessen Derivate, Fluorochrom, Rhodamin und dessen Derivate, GFP (GFP für „Green Fluorescent Protein"), Dansyl, Umbelliferon u.s.w. Bei solchen Konjugaten können die Antikörper der Erfindung oder deren funktionale Fragmente durch Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden. Sie können mit den Enzymen oder mit den fluoreszierenden Markern direkt oder durch das Zwischenglied einer Spacer-Gruppe oder einer Verbindungsgruppe, wie ein Polyaldehyd, wie Glutaraldeyhd, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DPTA), oder in Gegenwart von Kopplungsmitteln, wie jenen, die vorstehend für die therapeutischen Konjugate aufgeführt worden sind, gekoppelt werden. Die Konjugate, die Marker vom Typ Fluorescein umfassen, können durch Umsetzung mit einem Isothiocyanat hergestellt werden.
Andere Konjugate können gleichfalls chemolumineszierende Marker, wie Luminol und die Dioxetane, biolumineszierende Marker, wie Luciferase und Luciferin, oder ferner radioaktive Marker, wie Iod¹²³, Iod¹²⁵, Iod¹²⁶, Iod¹³³, Brom⁷⁷, Technetium^99m, Indium¹¹¹, Indium^113m, Gallium⁶⁷, Gallium⁶⁸, Ruthenium⁹⁵, Ruthenium⁹⁷, Ruthenium¹⁰³, Ruthenium¹⁰⁵, Quecksilber¹⁰⁷, Quecksilber²⁰ ³, Rhenium^99m, Rhenium¹⁰¹, Rhenium¹⁰⁵, Scandium⁴⁷, Tellur^121m, Tellur^122m, Tellur^125m, Thulium¹⁶⁵, Thulium¹⁶⁷, Thulium¹⁶⁸, Fluor^l8, Yttrium¹⁹⁹, Iod¹³¹, umfassen. Die Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, welche existieren, um die therapeutischen radioaktiven Isotope an die Antikörper entweder direkt oder über ein chelatbildendes Mittel, wie EDTA, DPTA, die vorstehend aufgeführt worden sind, zu koppeln, können für die radioaktiven Elemente, die in der Diagnostik einsetzbar sind, eingesetzt werden. Man kann hier gleichfalls die Markierung mit Na[I¹²⁵] durch die Chloramin T-Methode [Hunter, W.M., und Greenwood, F.C. (1962), Nature 194:495] oder ferner mit Technetium^99m durch die Technik von Crockford und Koll. (U.S.-Patent 4,424,200) oder angeheftet über DTPA, wie von Hnatowich beschrieben (U.S.-Patent 4,479,930), aufführen.
So können die Antikörper oder deren funktionale Fragmente gemäß der Erfindung in einem Verfahren für den Nachweis und/oder die Quantifizierung einer Überexpression oder einer Unterexpression, vorzugsweise einer Überexpression des Rezeptors IGF-IR und/oder EGFR in einer biologischen Probe eingesetzt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) das Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Antikörper oder einem von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung; und
b) das Nachweisen des gegebenenfalls gebildeten IGF-IR/Antikörper- und/oder EGFR/Antikörper-Komplexes.

Die Antikörper oder deren funktionale Fragmente gemäß der Erfindung könnten eingesetzt werden in einem Verfahren für den Nachweis und/oder die Quantifizierung des Rezeptors IGF-IR und/oder EGFR in einer biologischen Probe für das Verfolgen der Wirksamkeit einer prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung einer IGF-abhängigen Krebserkrankung oder ferner einer Psoriasis.
Allgemeiner können die Antikörper oder deren funktionale Fragmente, die hier beschrieben werden, in vorteilhafter Weise eingesetzt werden in einer jeglichen Situation, wo die Expression des Rezeptors IGF-IR qualitativ und/oder quantitativ beobachtet werden muss.
Die biologische Probe besteht vorzugsweise aus einem biologischen Fluid, wie Serum, Vollblut, Zellen, einer Gewebeprobe oder Biopsien von humaner Herkunft.
Es kann eine jegliche Vorgehensweise oder ein jeglicher klassischer Test ausgeführt werden, um eine solche Detektion und/oder quantitative Bestimmung auszuführen. Der Test kann ein auf Kompetition basierender Test oder ein Sandwich-Test oder ein jeglicher Test, der dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, welcher von der Bildung eines Immunkomplexes vom Antikörper-Antigen-Typ abhängig ist, sein. Entsprechend den Anwendungen gemäß der Erfindung kann der Antikörper oder das eine von dessen funktionalen Fragmenten immobilisiert oder markiert sein. Diese Immobilisierung kann an zahlreiche Träger, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, ausgeführt werden. Diese Träger können insbesondere Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon oder natürliche oder modifizierte Cellulosen umfassen. Diese Träger können entweder löslich oder unlöslich sein.
Als Beispiel setzt ein bevorzugtes Verfahren immunenzymatische Verfahren gemäß der ELISA-Technik, auf Immunfluoreszenz basierende Verfahren oder radioimmunologische Verfahren (RIA) oder äquivalente Verfahren ein.
So umfasst die Erfindung gleichfalls die Kits oder Zusammenstellungen für das Ausführen eines Diagnoseverfahrens für Erkrankungen, die durch eine Überexpression oder Unterexpression des IGF-IR-Rezeptors induziert werden, oder für das Ausführen eines Verfahrens zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung einer Überexpression oder einer Unterexpression des IGF-IR-Rezeptors in einer biologischen Probe, vorzugsweise einer Überexpression des Rezeptors, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass der Kit oder die Zusammenstellung die folgenden Bestandteile umfasst:

a) einen Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten gemäß der Erfindung;
b) gegebenenfalls die Reagenzien für die Bildung des für die immunologische Reaktion geeigneten Mediums;
c) gegebenenfalls die Reagenzien, welche den Nachweis der durch die immunologische Reaktion erzeugten IGF-IR/Antikörper-Komplexe erlauben.

Die Erfindung beschreibt gleichfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers für die Herstellung eines Arzneimittels, welches für das spezifische Dirigieren (Targeting) einer biologisch aktiven Verbindung in Richtung von Zellen, welche den Rezeptor IGF-IR exprimieren oder überexprimieren, bestimmt ist.
Mit biologisch aktiver Verbindung soll hier eine jegliche Verbindung bezeichnet werden, welche in der Lage ist, die zelluläre Aktivität, insbesondere deren Vermehrung, deren Proliferation, die Gentranskription oder die Gentranslation zu modulieren, insbesondere zu inhibieren.
Die Erfindung beschreibt auch ein in vivo-Diagnosereagens, welches einen Antikörper gemäß der Erfindung oder eines von dessen funktionalen Fragmenten, vorzugsweise markiert, insbesondere radioaktiv markiert, umfasst, und seine Verwendung bei der medizinischen Bildgebung, insbesondere für die Detektion einer Krebserkrankung, die mit der Expression oder der Überexpression des Rezeptors IGF-IR durch eine Zelle verbunden ist.
In der Beschreibung soll mit pharmazeutisch annehmbarer Träger oder Hilfsstoff eine Verbindung oder eine Kombination von Verbindungen bezeichnet werden, die in eine pharmazeutische Zusammensetzung Eingang findet, wobei sie keine Nebenwirkungen hervorruft, und die beispielsweise die Vereinfachung der Verabreichung der aktiven Verbindung(en), die Erhöhung von deren Wirksamkeitsdauer und/oder von deren Wirksamkeit im Organismus, die Erhöhung von deren Löslichkeit in Lösung oder ferner die Verbesserung von deren Aufbewahrung erlaubt. Diese pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoffe sind wohlbekannt und werden durch den Fachmann auf diesem Gebiet abhängig von der Natur und der Verabreichungsweise des oder der ausgewählten aktiven Verbindung(en) angepasst werden.
Diese Verbindungen werden vorzugsweise auf systemischem Wege, insbesondere auf intravenösem Wege, auf intramuskulärem, intradermalem, intraperitonealem oder subkutanem Wege, oder auf oralem Wege verabreicht. Mehr bevorzugt wird die Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen Antikörper umfasst, in mehreren Wiederholungen zeitlich gestaffelt verabreicht werden.
Deren optimale Verabreichungsweisen, Posologien und galenische Formen können gemäß den Kriterien, die allgemein bei der Ausarbeitung einer für einen Patienten angepassten Behandlung berücksichtigt werden, wie beispielsweise des Alters oder des Körpergewichts des Patienten, dem Ernst von seinem Allgemeinzustand, der Toleranz gegenüber der Behandlung und den festgestellten Nebenwirkungen, bestimmt werden.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der Folge der Beschreibung ersichtlich mittels der Beispiele und der Figuren, deren Legenden nachfolgend aufgeführt werden.
LEGENDEN DER FIGUREN
1: Schematische Darstellung des IGF-IR.
2: Schema der durch den IGF-IR während der Bindung der IGFs vermittelten Signaltransduktion.
3A, 3B und 3C: Erkennung des auf der Oberfläche der MCF-7-Zellen exprimierten nativen IGF-IR durch den monoklonalen Antikörper 7C10.
Für dieses Experiment werden die MCF-7-Zellen mit dem Antikörper 7C10 oder mit einem negativen Kontrollantikörper inkubiert, dann mit Hilfe eines fluoreszierenden sekundären Antikörpers gegen die Spezies detektiert. Die Markierung wird mittels eines FACS abgelesen. Das erste Histogramm (3A) entspricht den MCF-7-Zellen allein. In dem zweiten Histogramm (3B) entspricht die nicht grau unterlegte Kurve der nicht-spezifischen Markierung durch eine Mäuse-Antikörper-Isotypkontrolle. In dem dritten Histogramm (3C) zeigt die nicht grau unterlegte Kurve die Erkennung des IGF-IR durch den MAK 7C10.
4A, 4B und 4C: Markierung von Sf9-Insektenzellen, welche den IGF-IR bzw. den IR exprimieren.
Die 4A zeigt die Markierung von nicht-transfizierten Zellen allein (1) oder markiert mit kommerziellen monoklonalen Vergleichsantikörpern, welche den IGF-IR (2) bzw. den IR (3) erkennen. In der 4B sind Sf9-Zellen, die allein den IGF-IR exprimieren, mit αIR3 (2) oder anti-IR (3) markiert, wobei der Peak (1) die Zellen allein repräsentiert. In 4C sind Sf9-Zellen, die allein den IR exprimieren, mit einem anti-IR (3) oder αIR3 (2) markiert, wobei der Peak (1) die Zellen allein repräsentiert.
5: Inhibitor-Wirkung des Antikörpers 7C10 auf die durch IGF-I induzierte Proliferation von MCF-7-Zellen.
Die MCF-7-Zellen werden in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von IGF1 in Gegenwart oder in Abwesenheit der zu testenden MAK inkubiert. Die zelluläre Proliferation wird ausgewertet durch Verfolgen des Einbaus von ³H-Thymidin. Der kommerzielle Antikörper αIR3 wird als Positivkontrolle des Experiments eingesetzt. 7G3 ist ein Maus-anti-IGF-IR-IgG1 ohne Aktivität auf die Proliferation und wird als Isotypkontrolle eingesetzt.
6A, 6B und 6C:

– 6A: in vivo-Wirkung des monoklonalen Antikörpers 7C10 auf das Wachstum von bei der Nacktmaus etablierten MCF-7-Tumoren;
– 6B und 6C: Figuren, welche jeweils aus den Veröffentlichungen von Arteaga et al. (J. Clin. Invest., 84, 1418-1423, 1989) und von Li et al. (Cancer Immunol. Immunother., 49, 243-252) stammen und hinsichtlich der 6B die Wirkung von αIR3 aus der Maus (welches gleichfalls als αIR3 bezeichnet wird) und hinsichtlich der 6C die Wirkung eines rekombinanten scFv-Fc, welcher von dem Antikörper 1H7 abgeleitet ist, auf das Tumorwachstum zeigen.

7: Vergleichende Untersuchung der Wirkung des MAk 7C10 und von Tamoxifen auf das in vivo-Wachstum des MCF-7-Tumors.
8A, 8B und 8C: Untersuchung der Antitumoraktivität des Mäuse-Antikörpers 7C10 in unterschiedlichen Fremdtransplantat-Modellen von Tumorzellen in vivo.
Die 8A zeigt die Ergebnisse, die mittels eines SK-ES-1-Osteosarkom-Modells erhalten worden sind, die 8B betrifft einen Androgen-unabhängigen Prostatatumor DU-145 und die 8C ein nicht-kleinzelliges A549-Lungentumor-Modell. In diesen drei Modellen erfolgte die Behandlung zweimal pro Woche i.p. in einer Menge von 250 µg/Dosis/Maus. Die 7G3-EC2- und 9G4-Kurven entsprechen jeweils drei IgG1 von der Maus, die als Isotypkontrollen des Experiments in jedem der Modelle eingesetzt worden sind.
9: Untersuchung der Antitumor-Wirkung des MAk 7C10 verglichen mit Navelbin (Vinorelbin) wie auch der Synergie der beiden Verbindungen hinsichtlich der in vivo-Vermehrung der Linie A549.
10: Vergleichende Aktivität der MAk αIR3, 7C10 und 1H7 auf die durch IGF-2 induzierte Proliferation von MCF-7-Zellen.
11: Vergleich des MAk 7C10 aus der Maus und des chimären MAk C7C10 hinsichtlich der Inhibition der IGF1-Proliferation von MCF-7-Zellen in vitro. Der Antikörper 9G4 ist ein IgG1 aus der Maus, der als Isotypkontrolle des Experiments eingesetzt wird.
12: Vergleichende Wirkung der MAk 7C10 und h7C10 (humanisiert 1, hier als 7H2HM bezeichnet) auf das in vitro-Modell der IGF1-induzierten Proliferation von MCF-7-Zellen.
13: Wirkung der MAk 7C10 und h7C10 (humanisiert 1, hier als 7H2HM bezeichnet) auf die durch IGF1 induzierte Signaltransduktion. Die erste Reihe von Flecken (Spots) entspricht der Detektion der Phosphorylierung der β-Kette, immunpräzipitiert ausgehend von Zellen, die in Gegenwart von IGF1 allein oder von IGF1 unter Zugabe von verschiedenen zu testenden Antikörpern inkubiert worden sind, durch einen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper. Der 9G4 und der hlgG1 sind jeweils die Isotypkontrollen der Formen 7C10 und h7C10 (gleichfalls als 7H2HM bezeichnet). Die zweite Reihe von Flecken (Spots) entspricht der Detektion der β-Kette und zeigt, dass die in die Gesamtheit der Vertiefungen eingebrachte Menge perfekt äquivalent ist.
14: Sequenz der cDNA (SEQ ID Nr. 48), von deren Komplementärstrang (SEQ ID Nr. 50) und ihrer Translation in Aminosäuren (SEQ ID Nr. 49) des PCR-Fragments, welches ausgehend von dem Mäuse-Hybridom 7C10 mit den Primern MKV-1 und MKC amplifiziert worden ist und welches das 3'-Ende des Leader-Peptids und 7C10 VL kodiert.
15: Sequenz der cDNA (SEQ ID Nr. 51), von deren Komplementärstrang (SEQ ID Nr. 53) und ihrer Translation in Aminosäuren (SEQ ID Nr. 52) des PCR-Fragments, welches ausgehend von dem Mäuse-Hybridom 7C10 mit den Primerpaaren MHV-12 und MHC-1 oder MHV-8 und MHC-1 amplifiziert worden ist und welches das 3'-Ende des Leader-Peptids und 7C10 VH kodiert.
16: Erkennung des IGF-1-Rezeptors durch den chimären Antikörper 7C10, welcher gleichfalls als C7C10 bezeichnet wird (Kulturüberstand von transfizierten cos7-Zellen).
17: Vergleich der Aminosäuresequenz von 7C10 VL von der Maus (SEQ ID Nr. 54) mit jenen von anderen Antikörpern von der Maus, welche die höchste Sequenzhomologie aufweisen.
Die Nummerierung der Aminosäuren ist jene von Kabat et al. (1991). Die Reste in den Gerüstregionen („framework"-Regionen) (außer CDRs), die sich zwischen 7C10 VL und der Kabat-Untergruppe II von der Maus (SEQ ID Nr. 57) unterscheiden, sind unterstrichen. Ein Punkt gibt an, dass der Rest an jener Position bezogen auf die Sequenz von 7C10 VL identisch ist. DRB1-4.3 (SEQ ID Nr. 55) repräsentiert die Sequenz der leichten Kette eines anti-human MHC CLASS II B-Chain-Antikörpers von der Maus (Aufnahmenummer in die Datenbank von Kabat ist N011794). C94-5B11'CL (SEQ ID Nr. 56) repräsentiert die Sequenz der leichten Kette eines Antikörpers von der Maus (Aufnahmenummer in die Datenbank von Kabat ist P019314).
18: Vergleich der Aminosäuresequenzen von 7C10 VL von der Maus (SEQ ID Nr. 54) mit jenen von humanen leichten Ketten, welche aus der humanen Untergruppe II von Kabat stammen (SEQ ID Nr. 60) und die höchste Sequenzhomologie aufweisen.
Die Aminosäuresequenzen sind basierend auf Homologie gegenseitig ausgerichtet und werden mit jener von 7C10 VL von der Maus verglichen. Ein Punkt zeigt an, dass der Rest an dieser Position verglichen mit der Sequenz von 7C10 VL identisch ist. GM607 (SEQ ID Nr. 58) repräsentiert die Sequenz der leichten kappa-Kette, die von der humanen lymphoblastoiden Linie GM607 sekretiert wird (Klobeck et al., Nucleic Acids Res., 12:6995-7006, 1984a, und Klobeck et al., Nature, 309:73-76, 1984b, die Aufnahmenummer in der Kabat-Datenbank ist N011606). DPK15/A19 (SEQ ID Nr. 59) repräsentiert die Sequenz der humanen Keimbahn V kappa II.
19: Vergleich der Aminosäuresequenzen der variablen Regionen der leichten Ketten (VL) von 7C10 von der Maus (SEQ ID Nr. 54), des humanen Antikörpers GM 607 (SEQ ID Nr. 58) und der zwei Versionen humanisiert 1 und 2 von 7C10 (SEQ ID Nr. 61 und 65).
Die Aminosäuresequenzen sind basierend auf Homologie gegenseitig ausgerichtet und werden mit jenen von 7C10 VL von der Maus verglichen. Ein Punkt gibt an, dass der Rest an dieser Position verglichen mit der Sequenz von 7C10 VL identisch ist. GM607 repräsentiert die Sequenz der leichten kappa-Kette, die von der humanen lymphoblastoiden Linie GM607 sekretiert wird (Klobeck et al., 1984a und 1984b, Aufnahmenummer in der Kabat-Datenbank: N011606).
20: Sequenz der cDNA (SEQ ID Nr. 62), von deren Komplementärstrang (SEQ ID Nr. 64) und ihrer Translation in Aminosäuren (SEQ ID Nr. 63) des durch de novo-Zusammenbau konstruierten Gens, welches das Leader-Peptid und die humanisierte Version 1 von 7C10 VL kodiert.
21: Sequenz der cDNA (SEQ ID Nr. 66), von deren Komplementärstrang (SEQ ID Nr. 68) und ihrer Translation in Aminosäuren (SEQ ID Nr. 67) des durch de novo-Zusammenbau konstruierten Gens, welches das Leader-Peptid und die humanisierte Version 2 von 7C10 VL kodiert.
22: Vergleich der Aminosäuresequenzen von 7C10 VH von der Maus (SEQ ID Nr. 69) mit jenen von humanen schweren Ketten von der Maus, welche aus der Untergruppe I(A) von der Maus von Kabat stammen und die höchste Sequenzhomologie aufweisen.
Die Nummerierung der Aminosäuren ist jene von Kabat et al. (1991). Die Reste in den Gerüstregionen („framework"-Regionen) (außer CDRs), die sich zwischen 7C10 VH und der Kabat-Untergruppe I(A) von der Maus (SEQ ID Nr. 71) unterscheiden, sind unterstrichen. Ein Punkt gibt an, dass der Rest an dieser Position bezogen auf die Sequenz von 7C10 VH von der Maus identisch ist. AN03'CL (SEQ ID Nr. 70) repräsentiert die Sequenz der schweren Kette eines Mäuse-Antikörpers (Aufnahmenummer in der Kabat-Datenbank: P001289).
23: Vergleich der Aminosäuresequenzen von 7C10 VH von der Maus (SEQ ID Nr. 69) mit jenen von humanen schweren Ketten, die aus der humanen Untergruppe II von Kabat stammen (SEQ ID Nr. 72) und die höchste Sequenzhomologie aufweisen.
Die unterstrichenen Reste bilden einen Teil der kanonischen Strukturen, die von Chotia et al. (1989) definiert worden sind. Ein Punkt gibt an, dass der Rest an dieser Position bezogen auf die Sequenz von 7C10 VH von der Maus identisch ist. Humanes VH FUR1'CL (SEQ ID Nr. 73) repräsentiert die Sequenz der schweren Kette eines humanen anti-Lamin B-lgM/K-Antikörpers von autoimmuner Herkunft (Mariette et al., Arthritis und Rheumatism, 36:1315-1324, 1993; Aufnahmenummer bei Kabat: N020619). „Human Keimbahn" (SEQ ID Nr. 74) re präsentiert die Sequenz der humanen Keimbahn 4.22 VH IV (Sanz et al., EMBO J. 8:3741-3748, 1989).
24: Vergleich der Aminosäuresequenzen der variablen Regionen der schweren Ketten (VH) von 7C10 von der Maus (SEQ ID Nr. 69) und der drei durch CDR-Grafting humanisierten Versionen VH humanisiert 1, 2 und 3 (SEQ ID Nr. 75, 79 bzw. 83).
Die Nummerierung der Reste entspricht jener von Kabat. Die Sequenzen sind bezogen auf Homologie gegeneinander ausgerichtet und werden mit jener von 7C10 VH von der Maus verglichen. Ein Punkt gibt an, dass der Rest an dieser Position bezogen auf die Sequenz von 7C10 VH von der Maus identisch ist.
25: Sequenz der cDNA (SEQ ID Nr. 76), von deren Komplementärstrang (SEQ ID Nr. 78) und von deren Translation in Aminosäuren (SEQ ID Nr. 77) des durch de novo-Zusammenbau konstruierten Gens, welches das Leader-Peptid und die humanisierte Version 1 von 7C10 VH kodiert.
26: Sequenz der cDNA (SEQ ID Nr. 80), von deren Komplementärstrang (SEQ ID Nr. 82) und von deren Translation in Aminosäuren (SEQ ID Nr. 81) des durch de novo-Zusammenbau konstruierten Gens, welches das Leader-Peptid und die humanisierte Version 2 von 7C10 VH kodiert.
27: Sequenz der cDNA (SEQ ID Nr. 84), von deren Komplementärstrang (SEQ ID Nr. 86) und von deren Translation in Aminosäuren (SEQ ID Nr. 85) des durch de novo-Zusammenbau konstruierten Gens, welches das Leader-Peptid und die humanisierte Version 3 von 7C10 VH kodiert.
28: Vergleich der Erkennungsaktivität des IGF-1-Rezeptors durch den chimären Antikörper 7C10 (bezeichnet als „C7C10") und seine humanisierte Version 1 (7C10 hum 1) im ELISA.
29: Einfluss der humanisierten Versionen 1 und 2 der leichten Kette des Antikörpers 7C10 auf die Erkennungsaktivität des IGF-1-Rezeptors im ELISA.
30: Vergleich der Erkennungsaktivität des IGF-1-Rezeptors durch den chimären Antikörper 7C10 und drei humanisierte Versionen der schweren Kette (7C10 hum 1, 2 und 3) in Kombination mit 7C10 VL humanisiert 2 im ELISA.
31: Antitumor-Aktivität des Antikörpers 7C10 in einem orthotopischen A549-Modell.
32A, 32B, 32C und 32D: Untersuchung der ADCC, beobachtet auf der Ebene von A549- und MCF-7-Zellen, die 4 Stunden in Gegenwart des Antikörpers 7H2HM kultiviert worden sind (32C bzw. 32D). Der Antikörper h4D5 wird parallel dazu als positive Vergleichsprobe des Experiments für die A549- und MCF-7-Zellen eingesetzt (32A bzw. 32B).
33A, 33B und 33C: Wirkung der Antikörper 7C10 und 7H2HM auf den Zellzyklus der MCF-7-Zellen.
Die 33A repräsentiert den Anteil von MCF-7-Zellen in G0/G1-, S- und G2/M-Phase in Abwesenheit von IGF1, ausgedrückt als signifikanter Prozentsatz von gesamten beobachteten MCF-7-Zellen.
Die 33B repräsentiert den Anteil von MCF-7-Zellen in G0/G1-, S- und G2/M-Phase in Gegenwart von IGF1, ausgedrückt als Prozentsatz von gesamten beobachteten MCF-7-Zellen.
Die 33C repräsentiert den Anteil von MCF-7-Zellen in S-Phase
und G2/M-Phase (☐) ausgedrückt als Prozentsatz von gesamten beobachteten MCF-7-Zellen in Gegenwart der in der Figur angegebenen Verbindungen, verglichen mit einer als Kontrolle dienenden Vergleichsprobe in Abwesenheit von IGF1 („0").
34A und 34B: Verglichene Wirkung der Antikörper 7C10 und 7H2HM auf die Vermehrung der A549-Zellen in vitro (34A) und auf die Vermehrung der MCF-7-Zellen in vivo (34B).
35A und 35B: Untersuchung der Synergie des Antikörpers 7H2HM kombiniert mit Navelbin (NA) an dem A549-Modell in vivo, verglichen mit den als Kontrolle dienenden Vergleichsproben. Die 35A repräsentiert die Entwicklung des Volumens des implantierten Tumors in Funktion von der ausgeführten Behandlung ausgehend von dem Beginn der Behandlung und über etwa 50 Tage (35A). Die 35B repräsentiert im Besonderen die für diese verglichene Entwicklung nach ungefähr 48 Tagen erhaltenen Ergebnisse. In dieser Figur wurden die mit dem Antikörper 7C10 erhaltenen Ergebnisse zum Vergleich mit aufgenommen (die Sternchen (*) entsprechen dem Vergleich Kontrollgruppe/Gruppe (7C10 + Na) oder Kontrollgruppe/Gruppe (7H2HM + Na) in einem t-Test).
36: Untersuchung der Wirkung der Antikörper 7C10 und 7H2HM auf die Apoptose.
Diese Figur repräsentiert die Verstärkung der Wirkung von Doxorubicin durch die Antikörper 7C10 und 7H2HM (Doxorubicin 2 µg/ml).
37A bis 37D: Nachweis des Vorhandenseins des EGFR und des IGF-IR auf der Oberfläche von A549-Zellen durch eine Markierung mittels FACS.
38: Wirkung einer gemeinsamen Verabreichung der MAK 7C10 und 225 auf das in vivo-Wachstum des A549-Tumors.
39: Wirkung einer gemeinsamen Verabreichung der MAK 7C10 und 225 auf das Überleben von Mäusen, denen orthotopisch A549-Zellen implantiert worden sind.
40A und 40B: Nachweis der Inhibition der Tyrosinphosphorylierung der beta-Kette des IGF-IR und des IRS-12 durch die MAK 7C10 und 7H2HM.
41: Nachweis der Induktion der Internalisierung des IGF-IR durch die MAK 7C10 und 7H2HM.
42A bis 42C: Nachweis des Abbaus des IGF-IR durch die MAK 7C10 und 7H2HM.
Beispiel 1. Erzeugung und Selektion des monoklonalen Mäuse-Antikörpers (MAk).
Mit dem Ziel, MAk zu erzeugen, die spezifisch gegen den IGF-IR gerichtet sind und den IR nicht erkennen, wurde ein Protokoll, welches 6 Screening-Schritte umfasst, herangezogen.
Es bestand daraus:

– Mäuse mit dem rekombinanten IGF-IR zu immunisieren, um Hybridome zu erzeugen,
– die Kulturüberstände durch ELISA auf das rekombinante Protein, welches zur Immunisierung gedient hat, zu screenen,
– alle im ELISA positiven Überstände von Hybridomen auf den nativen Rezeptor, der auf der Oberfläche von MCF-7-Tumorzellen überexprimiert wird, zu testen,
– die Überstände von in den beiden ersten Screenings positiven Hybridomen in Hinblick auf eine differenzielle Erkennung des IGF-IR und des IR an Insektenzellen, die mit Baculoviren, die den IGF-IR bzw. den IR exprimieren, infiziert sind, auszuwerten,
– zu verifizieren, dass die in diesem Schritt ausgewählten Antikörper in der Lage waren, in vitro die durch IGF1 induzierte Proliferation von MCF-7-Zellen zu inhibieren,
– sich in vivo von der Aktivität des zurückbehaltenen Kandidaten bezogen auf den Ein fluss auf das Wachstum des MCF-7-Tumors bei der Nacktmaus zu überzeugen.

Die Gesamtheit dieser unterschiedlichen Schritte und der erhaltenen Ergebnisse wird nachfolgend in dem Beispiel 1 kurz beschrieben.
Für den Immunisierungsschritt wurden Mäusen zweimal subkutan 8 µg rekombinantes IGF-IR injiziert. Drei Tage vor der Fusion der Rattenzellen mit Mäuse-Myelomzellen Sp2OAg14 wurden die Mäuse durch eine intravenöse Injektion von 3 µg des rekombinanten Rezeptors stimuliert. Vierzehn Tage nach der Fusion wurden die Überstände von Hybridomen durch ELISA an durch rekombinanten IGF-IR sensibilisierten Plättchen gescreent. Die Hybridome, deren Überstände als positiv ermittelt wurden, wurden aufbewahrt und amplifiziert, bevor sie mittels des FACScan getestet wurden, um zu verifizieren, dass die produzierten Antikörper gleichfalls in der Lage waren, den nativen IGF-IR zu erkennen. Dafür wurden MCF-7-Zellen, die von einem Östrogen-abhängigen und den IGF-IR überexprimierenden Brusttumor stammten, mit jedem der Kulturüberstände, die durch die mittels ELISA ausgewählten Hybridome produziert werden, inkubiert. Die nativer Rezeptor/MAk-Komplexe an der Oberfläche der Zelle wurden durch einen mit einem Fluorochrom gekoppelten sekundären anti-Spezies-Antikörper detektiert. Die 3A bis 3C zeigen einen Histogrammtyp, welcher mit dem Überstand des Hybridoms 7C10 erhalten wird (3C), verglichen mit einer Markierung Zellen allein + se kundärer Antikörper (3A) oder mit einer Markierung, welche eine Isotypkontrolle einsetzt (3B).
In diesem Selektionsstadium wurden nur die Hybridome, die MAk sekretieren, die zugleich den rekombinanten Rezeptor und den nativen Rezeptor erkennen, ausgewählt und kloniert. Die durch diese Hybridome sekretierten MAk wurden produziert, dann gereinigt, bevor sie mittels des FACScan gemäß der oben beschriebenen Methode an Sf9-Insektenzellen, welche den IGF-IR oder den IR exprimieren, getestet wurden, um die Hybridome zu eliminieren, welche die beiden Rezeptoren gleichzeitig erkennen. Die 4A zeigt eine vollständige Überlagerung der Histogramme 1, 2, 3, welche jeweils den nicht-infizierten Zellen + sekundäre Antikörper (1), den nicht-infizierten, durch αIR3 markierten Zellen + sekundäre Antikörper (2) bzw. den nicht-infizierten, durch einen anti-IR-Antikörper markierten Zellen + sekundäre Antikörper (3) entsprechen. Dieses erste Ergebnis zeigt gut die Abwesenheit von IGF-IR und IR, die auf der Oberfläche dieser nicht-infizierten Insektenzellen detektierbar sein könnten. Die 4B zeigt eine Markierung von infizierten Zellen durch ein den IGF-IR exprimierendes Baculovirus. In dieser zweiten Figur markiert der αIR3, der als positive Vergleichsprobe eingesetzt wird, wie erwartet, gut die Zellen (Peak 2), wohingegen der anti-IR (Peak 3) sich mit dem Peak von Zellen allein überlagert. Schließlich wird in 4C gezeigt, dass der anti-IR, wie erwartet, gut die Sf9-Zellen, die den IR exprimieren, markiert (Peak 3), aber unerwartet scheint der αIR3, der in der Literatur als spezifisch für den IGF-IR beschrieben wird, gleichfalls den IR zu erkennen (Peak 2).
Die in diesem dritten Screeningsystem erhaltenen Ergebnisse werden in der Tabelle 1 zusammengefasst und zeigen die Erzeugung eines MAk: des 7C10, welcher die Kriterien einer Erkennung des IGF-IR und einer Nicht-Erkennung des IR erfüllt. Die Isotypisierung des MAk 7C10 hat gezeigt, dass es sich um einen IgG1 handelt.
TABELLE 1: Verglichene Reaktivität des MAk 7C10 an Sf9-Insektenzellen, welche den IGF-IR oder den IR exprimieren.
Die beiden letzteren Screenings, die für die Selektion des MAk vorgesehen wurden, bestanden darin, zu verifizieren, dass dieser Letztere gut in der Lage war, die durch IGF-1 in vitro und in vivo bei der Zelllinie MCF-7 induzierte Zellproliferation zu hemmen.
Für die in vitro-Selektion wurden die MCF-7-Zellen angeimpft, es wurde ihnen fötales Kälberserum entzogen, dann wurden sie in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von IGF-1 (von 1 bis 50 ng/ml) in Gegenwart oder in Abwesenheit des zu testenden Antikörpers 7C10, welcher in einer Endkonzentration von 10 µg/ml hinzugesetzt wurde, inkubiert. In diesem Experiment wurde der kommerzielle MAk αIR3 als positive Vergleichsprobe und der MAk 7G3 (welcher parallel zu 7C10 isoliert worden war und welcher den nativen Rezeptor schwach erkennt (MFI im FACS von 50 verglichen mit 200 für den MAK 7C10)) als Isotypkontrolle zugesetzt. Die Zellproliferation wird abgeschätzt, indem im β-Zähler der Einbau von tritiummarkiertem Thymidin durch die Zellen verfolgt wird. Die Ergebnisse sind als Proliferationsindex ausgedrückt. Die in der 5 aufgeführten Daten zeigen, dass IGF1 in der Lage ist, auf dosisabhängige Weise die Proliferation der MCF-7-Zellen zu stimulieren. Der als Positivkontrolle eingesetzte MAk αIR3 hemmt die durch IGF-1 induzierte Proliferation der MCF-7-Zellen vollständig. Auf die gleiche Weise ist der MAk 7C10 in der Lage, die durch IGF-1 induzierte Vermehrung der MCF-7-Zellen signifikant zu hemmen. Schließlich erweist sich der MAk 7G3, der als Isotypkontrolle eingesetzt wurde, wie erwartet, als ohne Wirkung auf die Tumorzellvermehrung der MCF-7-Zellen in vitro.
Die in vivo-Selektion erfolgte in einem etablierten Tumormodell. Dafür erhielten Nacktmäuse ein subkutanes Östrogen-Implantat mit langsamer Freisetzung, welches für die Etablierung des Tumors in einem Mäuse-Modell unabdingbar ist. Vierundzwanzig Stunden nach der Implantation der Östrogene werden 5 × 10⁶ MCF-7-Zellen subkutan in die rechte Flanke der Maus transplantiert. Fünf Tage nach dieser Zelltransplantation sind die Tumore messbar und es werden zufällig Gruppen von 6 Mäusen gebildet. Die Behandlung der Mäuse erfolgt zweimal wöchentlich während 5 bis 6 Wochen mit einer Dosis von 250 µg/Dosis/Maus. In der Kontrollgruppe werden die Mäuse auf die gleiche Weise, aber mit einer Mäuse-Isotypkontrolle behandelt. Die in der 6A aufgeführten Ergebnisse zeigen eine sehr signifikante Hemmung des induzierten Tumorwachstums durch den Antikörper 7C10. Diese Aktivität ist besonders unerwartet, wenn man auf die verfügbaren Daten verweist, die den αIR3 betreffen, der stets als Referenz auf dem Gebiet des IGF1-Rezeptors verwendet wird und dafür bekannt ist, keinerlei Aktivität in vivo auf das Wachstum von Östrogen-abhängigen Tumoren zu haben (siehe 6B). Ebenso ist verglichen mit den Ergebnissen, die mit dem von dem Mäuse-MAk 1H7 abgeleiteten rekombinanten scFv-Fc-Antikörper erhalten werden (siehe 6C), der MAk 7C10 viel wirksamer bei der in vivo-Hemmung der Vermehrung der MCF-7-Zellen.
Beispiel 2. Vergleich der Wirkung des 7C10 und von Tamoxifen auf das in vivo-Wachstum des MCF-7-Tumors
Um die Wirkkraft der Behandlung durch den Antikörper 7C10 im Rahmen des Östrogenabhängigen Brustkrebs zu bestimmen, wurde der 7C10 mit Tamoxifen verglichen, einer Verbindung, die üblicherweise für die Behandlung des Mammakarzinoms im Rahmen der entwickelten Formen mit lokaler Progression und/oder von metastatischen Formen und im Rahmen der Prävention von Rezidiven eingesetzt wird (siehe VIDAL 2000, Seiten 1975-1976).
Bei den Hormon-abhängigen Brustkrebs-Formen existiert eine signifikante Korrelation zwischen der Expression der Östrogenrezeptoren (ER) und von jener des IGF-IR (Surmacz, E., et al., Breast Cancer Res. Treat., Feb., 47(3):255-267, 1998). Außerdem scheint es, dass die Östrogene (E2) synergistisch mit IGF1 (manchmal bezeichnet als IGF-I oder IGFI) wirken, um die Zellproliferation zu stimulieren. Es ist tatsächlich gezeigt worden, dass eine Behandlung mit E2 den mRNA-Spiegel des IGF-IR wie auch das Expressionsniveau des Proteins etwa 10-fach erhöhte (Lee, A.V., et al., Mol. Endocrinol., Mai, 13(5):787-796, 1999). Diese Erhöhung kommt durch eine signifikante Erhöhung der Phosphorylierung des IGF-IR zum Ausdruck. Außerdem stimulieren die E2 die Expression des IRS-1 („IRS-1" für „Insulin Receptor Substrat-1"), welches das Phosphorylierte der Substrate des IGF-IR darstellt, signifikant.
Tamoxifen wird seit mehreren Jahren in großem Umfang in der Hormontherapie für die Behandlung von Patienten, die an E2-abhängigen Brustkrebserkrankungen leiden, vewendet (Forbes, J.F., Semin. Oncol., Feb., 24 (1.Suppl.1):S1-5-S1-19, 1997). Dieses Molekül tritt in Wettbewerb mit dem Östradiol und hemmt die Bindung von jenem an seinen Rezeptor (Jordan, V.C., Breast Cancer Res. Treat., 31(1):41-52, 1994). Es ist außerdem gezeigt worden, dass Tamoxifen in der Lage ist, die IGF-IR-abhängige Proliferation zu hemmen, indem die Expression des Rezeptors und seine Phosphorylierung gehemmt werden (Guvakova, M.A., et al., Cancer Res., 1. Juli, 57(13):2606-2610, 1997). Die Gesamtheit dieser Daten scheint darauf hinzuweisen, dass der IGF-IR ein wichtiger Mediator der durch die E2/ER-Wechselwirkung induzierten Proliferation ist.
Die Langzeit-Verwendung von Tamoxifen ist mit einer signifikanten Erhöhung des Risikos einer Krebserkrankung des Endometriums (Fisher et al., J. of National Cancer Institute, 86, 7:527-537, 1994; VIDAL 2000, 1975-1976) und eines kollateralen Rezidivs des E2-unabhängigen Brustkrebses (Li, C.I., et al., J. Natl. Cancer Inst., 4. Juli, 93(13):1008-1013, 2001) verbunden. In diesem Kontext erfolgte ein Vergleich der Antitumorwirkung des Antikörpers 7C10 und von Tamoxifen an dem MCF-7-Modell in vivo, um den Teil der Aktivität zu bestimmen, der bei der ER-vermittelten Proliferation mit dem IGF-IR verbunden ist. Dafür wurden 7·10⁶ MCF-7-Zellen sk (subkutan) Nacktmäusen implantiert, 24 h danach erfolgte die Implantation eines Östradiol-Körnchens mit länger andauernder Freisetzung (0,72 mg/Tablette, freigesetzt über 60 Tage), welches für die Etablierung eines jeglichen E2-abhängigen humanen Tumors bei dieser Tierspezies unabdingbar ist, bei eben diesen Mäusen. Fünf Tage nach dieser Implantation werden die Tumore gemessen und Gruppen von 6 Mäusen gebildet. Diese Gruppen werden jeweils mit 1) dem Antikörper 7C10, injiziert ip (interperitoneal) in einer Menge von 250 µg/Maus, zweimal wöchentlich, 2) 10 µg Tamoxifen, aufgenommen in PBS, enthaltend 3% Hydroxypropylcellulose (HPC), ip oder 3) dem Lösemittel, in welchem das Tamoxifen aufgenommen worden ist (Hydroxypropylcellulose), behandelt. Das Tamoxifen wird täglich während 4 Wochen mit Ausnahme des Wochenendes verabreicht. Die mit dem MAK 7C10 behandelten Mäuse erhalten gleichfalls täglich eine Injektion von PBS mit 3% HPC. Es war vorab eine Untersuchung ausgeführt worden, um zu verifizieren, dass das Lösemittel allein ohne Einfluss auf das Tumorwachstum ist.
Die in der 7 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass der MAK 7C10 in der Lage ist, das Wachstum des Tumors MCF-7 in vivo signifikant zu hemmen (die Sternchen (*) entsprechen dem Vergleich Kontrollgruppe/Gruppe 7C10 in einem t-Test). Überraschenderweise scheint der Antikörper 7C10 signifikant wirksamer zu sein als Tamoxifen hinsichtlich der Hemmung des Tumorwachstums (die Kreise (°) entsprechen dem Vergleich Tamoxifen-Gruppe/Gruppe 7C10 in einem t-Test), was nahe legt, dass diese Art einer Behandlung durch MAK die Behandlung durch Tamoxifen ersetzen könnte.
Beispiel 3: Nachweis der Antitumoraktivität des MAk 7C10 in vivo bei humanen Tumoren unterschiedlicher Herkunft
a) Aktivität des Antikörpers 7C10 in vivo in drei Tumormodellen
Um die Aktivität des Antikörpers 7C10 bei anderen Tumoren, welche den IGF1-Rezeptor exprimieren, zu generalisieren, wurde der 7C10-Antikörper in vivo in einem Modell des Androgen-unabhängigen Prostatatumors DU145 (gleichfalls als DU-145 bezeichnet), in einem Osteosarkom-Modell SKES-1 und in einem nicht-kleinzelligen Lungentumor-Modell A549 getestet. Das Protokoll ist vergleichbar mit jenem, das oben für MCF-7 beschrieben worden ist, und die in den 8A bis 8C aufgeführten Ergebnisse zeigen eine signifikante Aktivität von diesem MAK bei den drei Tumormodellen. Die in dem Prostatatumor-Modell beobachtete Aktivität ist ganz besonders hervorzuheben, da der Einzelketten-scFv des MAK 1H7 in einem Modell eines Androgen-unabhängigen Prostatatumors ohne Aktivität ist (Li et al., 2000).
b) Aktivität des Antikörpers 7C10 in vivo in einem orthotopischen A549-Modell.
Die klassischen Fremdtransplantat-Modelle, wie oben beschrieben, erlauben nicht die Untersuchung der Drogen hinsichtlich der Dissemination von Metastasen. Tatsächlich bleiben die sk (subkutan) implantierten Tumore an dem Injektionsort lokalisiert und spiegeln folglich die Situation beim Menschen nicht wirklich wieder. Um unseren Antikörper in einem Modell, das der Realität näher kommt, auszuwerten, wurden die A549-Zellen in einer intrapleuralen Lage implantiert. Dieses gut beschriebene Modell (Clin. Cancer Res., Jan. 2000, 6(1):297-304) erlaubt, eine Dissemination von Metastasen, die jener, die beim Menschen beobachtet wird, nahekommt, mit mediastinalen, pulmonalen, kardialen und vertebralen Metastasen zu beobachten. Bei der Untersuchung, die ausgeführt wurde, wurden 10⁶ A549-Zellen weiblichen Nacktmäusen intrapleural injiziert. 7 Tage nach der Implantation wurden die Mäuse in 2 Gruppen von 22 aufgeteilt. Eine dieser Gruppen erhielt eine Anfangsdosis von 500 µg/Maus und wurde dann zweimal wöchentlich mit einer Menge von 250 µg 7C10/Dosis behandelt. Die zweite Gruppe wurde gemäß dem gleichen Schema mit der Isotypkontrolle 9G4 behandelt. Die 31 zeigt eine signifikante Verlängerung des Überlebens bei den mit dem MAK 7C10 behandelten Mäusen, was anzeigt, dass dieser Antikörper in der Lage ist, eine Wirkung auf die Dissemination von Metastasen auszuüben.
Beispiel 4. Vergleich des MAk 7C10 mit Navelbin in vivo; Wirkung einer Coverabreichung der beiden Behandlungen
Navelbin ist eine bei der Chemotherapie eingesetzte Verbindung, die bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und bei metastasierendem Brustkrebs indiziert ist. Die vergleichende Untersuchung des 7C10 und von Navelbin und die etwaige Synergie zwischen den beiden Produkten wurde an dem A549-Tumormodell untersucht. Für diese Untersuchung wurden 5·10⁶ A549-Zellen subkutan in die rechte Flanke der Maus transplantiert. Fünf Tage nach der Zelltransplantation sind die Tumore messbar und die Behandlungen mit dem MAk und/oder Navelbin werden begonnen. Die MAk-Dosis beträgt stets 250 µg/Dosis/Maus zweimal wöchentlich, intraperitoneal verabreicht. Bezüglich des Navelbin wird dieses in der von der Maus maximalen vertragenen Dosis, nämlich 10 mg/kg, intraperitoneal verabreicht. Für diese Behandlung erfolgen drei Injektionen im Abstand von 7 Tagen. Während den Coverabreichungen werden die beiden Produkte vor der Injektion gemischt.
Die in der 9 aufgeführten Ergebnisse zeigen überraschenderweise, dass in diesem Modell der Antikörper 7C10 ebenso aktiv ist wie die klassische Behandlung mit Navelbin. Es wird gleichfalls eine sehr signifikante Synergie der beiden Produkte beobachtet mit fünf Mäusen von sieben, die am Tag 72 keine messbaren Tumore aufweisen.
Beispiel 5. Untersuchung der in vitro-Inhibition des IGF-2-induzierten Wachstums von MCF-7-Tumoren
Wie zuvor angesprochen, wird der IGF-IR durch zahlreiche Tumore überexprimiert, es ist aber andererseits beschrieben worden, dass bei einem guten Teil der Krebserkrankungen insbesondere der Brust und des Kolons das Proliferationssignal diesem Rezeptor über IGF2 (manchmal bezeichnet als IGF-II oder IGFII)) gegeben wird. Es ist folglich wesentlich, sicherzustellen, dass der MAk 7C10 gleichfalls in der Lage ist, das IGF2-induzierte Wachstum hinsichtlich des MCF-7-Tumors in vitro zu hemmen. Dafür wurden Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät, ihnen wurde fötales Kälberserum entzogen und sie wurden durch die Zugabe von 200 ng IGF2 pro endgültigem ml Medium in Gegenwart und in Abwesenheit der zu testenden MAk, die in einer Konzentration von 10 µg/ml zugesetzt wurden, stimuliert. Die in der 10 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass IGF2 wie IGF1 die Vermehrung der MCF-7-Zellen signifikant stimuliert. Die Zugabe einer Isotypkontrolle, von 9G4, bleibt ohne Wirkung auf diese Stimulation. Wie bereits von De Léon et al. beschrieben (Growth Factors, 6:327-334, 1992), wurde während der Zugabe des MAk αIR3 keinerlei Wirkung beobachtet. Im Gegenzug inhibiert der 7C10 die durch IGF2 induzierte Vermehrung vollständig. Seine Aktivität ist signifikant höher als jene des 1H7.
Beispiel 6: Biologische Aktivität der chimären 7C10-Antikörper (C7C10) und humanisierten 7C10-Antikörper (h7C10)
a) Vergleich 7C10/C7C10 und 7C10/h7C10 in dem MCF-7-Modell in vitro
Die gereinigte chimäre Form des MAk 7C10 und die gereinigte humanisierte Form 1 (hier bezeichnet als 7H2HM) wurden in vitro in dem MCF-7-Modell getestet, wie oben beschrieben. Die in den 11 bzw. 12 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass diese beiden Formen ihre Eigenschaften, das IGF1-induzierte Wachstum des MCF-7-Tumors zu hemmen, perfekt bewahrt haben.
b) Verglichene Wirkung der MAk 7C10 und h7C10 auf die durch die Bindung von IGF1 an seinen Rezeptor induzierte Signaltransduktion.
Die Aktivität der Hemmung der IGF1-induzierten Vermehrung in vitro bei der Linie MCF-7 müsste die Manifestation einer Hemmung der durch IGF1 vermittelten Signaltransduktion während der Bindung des MAk 7C10 an den Rezeptor sein. Um diese Hypothese zu verifizieren, wurden MCF-7-Zellen mit oder ohne IGF1 in Gegenwart oder in Abwesenheit der zu testenden Antikörper inkubiert. Nach einer kurzen Inkubationszeit wurden die Zellen lysiert, die β-Kette immunpräzipitiert und die Phosphorylierung dieser Untereinheit mit Hilfe eines Anti-Phosphotyrosinkinase-Antikörpers abgeschätzt. Die in der 13 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass die Bindung des 7C10 oder des h7C10 signifikant die Phosphorylierung der β-Untereinheit des IGF-IR hemmen im Gegensatz zu einem irrelevanten Antikörper von der Maus (9G4) oder einem irrelevanten humanen Antikörper (in dem Schema als IgG1 bezeichnet).
c) Beteiligung des Antikörpers 7H2HM an den ADCC-Mechanismen
Die oben in dem Abschnitt b) beschriebene Inhibition der Signaltransduktion ist der hauptsächliche Wirkmechanismus, der an der biologischen Aktivität der Antikörper 7C10 und 7H2HM beteiligt ist. Es ist indessen wahrscheinlich, dass während seiner Verabreichung an den Menschen der Antikörper 7H2HM, von IgG1-Isotyp, in der Lage ist, eine Zelllyse durch einen Mechanismus vom ADCC-Typ („Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity"; Antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität) zu induzieren. Um diese Hypothese zu verifizieren, wurden NK (Natural Killer)-Zellen, welche aus dem peripheren Blut von humanen Spendern stammten, mit A549- oder MCF-7-Zellen, die vorab 4 Stunden mit 10 µg 7H2HM-Antikörper pro 5.10⁵ Zellen inkubiert und mit ⁵¹Cr (50 µg) markiert worden waren, kontaktiert. In diesem Experiment wird Herceptin (in den 32A und 32B als h 4D5 bezeichnet) als positive Vergleichsprobe des Experiments eingesetzt. Die 32A bis 32D zeigen, dass, wie erwartet, Herceptin eine signifikante ADCC bei den beiden A549- und MCF-7-Zellen induziert (siehe die 32A bzw. 32B). Der 7H2HM ist gleichfalls in der Lage, eine ADCC bei den A549-Zellen zu induzieren (siehe 32C), aber dieses Phänomen ist bei den MCF-7-Zellen weniger bedeutend (siehe 32D).
d) Wirkung der Antikörper 7C10 und 7H2HM auf den Zellzyklus
Die Inhibition der in vitro an der Linie MCF-7 beobachteten Zellvermehrung müsste in einer Wirkung auf den Zellzyklus zum Ausdruck kommen. Um diese Frage zu beantworten, wurden 4·10⁵ Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät. 24 h nach der Aussaat wurde das Kälberserum entzogen und IGF1 zugesetzt in Gegenwart oder in Abwesenheit der zu untersuchenden Antikörper. Nach 24 h Inkubation wurden die Zellen für die Untersuchung des Zellzyklus gewonnen. Die 33B zeigt die Wirkung des IGF1 auf den Eintritt in den Zyklus und die Vermehrung der MCF-7-Zellen, dies verglichen mit dem Eintritt in den Zyklus und die Vermehrung der MCF-7-Zellen in Abwesenheit von IGF1 (siehe 33A). Nach Zugabe des Wachstumsfaktors wird eine signifikante Verringerung der G0/G1-Phase (von 88,2% auf 56,3%) zu Gunsten der S-Phase (von 7,8% auf 31%) und der G2/M-Phase (von 4% auf 12,7%) beobachtet. Während der Zugabe der Antikörper 7C10 und 7H2HM (siehe 33C) wird eine signifikante Inhibition des Eintritts in den Zyklus beobachtet. Es ist festzuhalten, dass der Mäuse- Antikörper und sein humanisiertes Homolog eine vergleichbare Aktivität auf den Zellzyklus haben. αIR3, der als positive Vergleichsprobe zugesetzt worden ist, scheint in diesem Test geringfügig weniger aktiv als der 7C10 und der 7H2HM zu sein. Der als Isotypkontrolle eingesetzte Antikörper 9G4 ist ohne Wirkung auf den Zellzyklus.
e) Verglichene Aktivität der Antikörper 7C10 und 7H2HM in dem A549-Modell in vivo
Um die Aktivität des humanisierten Antikörpers 7H2HM in vivo zu bestätigen, wurde dieser Letztere mit dem 7C10 in dem nicht-kleinzelligen Lungentumor-Modell A549 verglichen. Dieses Experiment wurde genau, wie oben beschrieben, ausgeführt mit der Ausnahme der Antikörperdosis, die 125 µg/Dosis zweimal wöchentlich anstelle von 250 µg/Dosis zweimal wöchentlich beträgt und dies aufgrund der Tatsache fehlender Verfügbarkeit von großen Mengen von 7H2HM. Der Antikörper 9G4 wurde als Isotypkontrolle für den 7C10 eingesetzt und ein irrelevantes humanes Immunglobulin von IgG1-Isotyp (nachfolgend als HIgG1 bezeichnet) wurde als Kontrolle für den humanisierten Antikörper 7H2HM eingesetzt.
Die 34A zeigt, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen den 9G4- und HIgG1-Kontrollkurven gibt. Wie erwartet, wird eine signifikante Inhibition des Tumorwachstums mit dem Mäuse-Antikörper 7C10 beobachtet. Bezüglich des humanisierten Antikörpers 7H2HM ist die beobachtete Aktivität exakt von der gleichen Intensität wie jene, die mit dessen Gegenstück aus der Maus beobachtet wird. Hinzugefügt zu den weiter oben in vitro beschriebenen Daten zeigen diese Daten an, dass die Humanisierung die Eigenschaften des erzeugten Antikörpers nicht modifiziert hat. Andererseits scheint in den Fremdtransplantat-Modellen bei der Maus die Aktivität des humanisierten Antikörpers vollständig mit einem Mechanismus einer Inhibition der Signaltransduktion verbunden zu sein. Wenn tatsächlich zu einem Teil ADCC bei der Hemmung des Tumorwachstums bei der Nacktmaus im Spiel war, müsste ein Unterschied zwischen der Aktivität der Mäuse- und humanisierten Antikörper beobachtet werden.
Ein in vivo-Experiment wurde gleichfalls an dem MCF-7-Brusttumormodell ausgeführt und zeigt, dass, wie erwartet, der Antikörper 7H2HM perfekt vergleichbar ist mit dem Mäuse-Antikörper 7C10 hinsichtlich der Inhibition des Wachstums dieses Tumors in vivo (34B).
f) Nachweis einer Synergie zwischen dem 7H2HM und Navelbin
Das in dem Beispiel 4 beschriebene Protokoll wurde wiederholt mit dem Ziel, die mit dem 7C10 erhaltenen Ergebnisse mit seinem humanisierten Homolog: dem Antikörper 7H2HM, zu reproduzieren.
Die in den 35A und 35B aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass wie in dem Falle des 7C10 eine signifikante Synergie zwischen dem humanisierten Antikörper 7H2HM und Navelbin nachgewiesen wird.
g) Wirkung der Antikörper 7C10 und 7H2HM auf die Apoptose von MCF-7-Zellen in vitro
Wie vorstehend angegeben, ist der IGF-IR in der Lage, einen Schutz gegen die Apoptose zu verleihen, wenn er auf der Oberfläche der Zellen überexprimiert wird. Außerdem ist in diesen Beispielen gezeigt worden, dass die Antikörper 7C10 und 7H2HM in der Lage waren, die Wirkung einer im Rahmen einer Chemotherapie aktiven Verbindung zu verstärken. Um das Vermögen der Antikörper 7C10 und 7H2HM, Apoptose zu induzieren, zu testen und deren Synergiepotential im Rahmen einer Chemotherapie zum Teil zu erklären, wurden Experimente an den MCF-7-Zellen in Gegenwart oder in Abwesenheit von Doxorubicin, einem Arzneimittel, welches dafür bekannt ist, die Apoptose von dieser Zelllinie in vitro zu induzieren, ausgeführt. In diesen Experimenten werden die MCF-7-Zellen in einer Menge von 2·10⁴/cm² in einer Petrischale angeimpft und 24 h in RPMI ohne Phenolrot, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), kultiviert. Die Zellen werden dann zweimal mit PBS gewaschen und erneut in Medium mit 0% FCS kultiviert. Man gewährt eine Adaptierungszeit von 10 min bei 37°C vor der Zugabe der Antikörper in einer Konzentration von 10 µg/ml. Nach 10 weiteren Minuten bei 37°C setzt man zu dem Kulturmedium rekombinantes IGF-I (Sigma) in einer Endkonzentration von 50 ng/ml zu. Die Zellen werden erneut bei 37°C eine Stunde stehengelassen, um die Bindung der Antikörper und des IGF-I zu erlauben. Schließlich wird Doxorubicin (Sigma) zu dem Kulturmedium in einer Konzentration von 2 µg/ml zugesetzt und die Zellen werden 24 h bei 37°C inkubiert.
Die Experimente wurden gleichfalls mit Navelbin in einer Konzentration von 10 µg/ml ausgeführt.
Die Analyse der Zelllebensfähigkeit erfolgt durch Analyse im Durchflusszytometer nach Markierung mit Annexin V-FITC (20 min, 4°C) und DAPI (2 µg/ml). Der in Betracht gezogene Prozentsatz von toten Zellen ist die Population Annexin-markiert +/DAPI +. Der Antikörper 5C2 wird als Isotypkontrolle eingesetzt.
Die in der 36 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass das Doxorubicin eine Apoptose bei 8% der MCF-7-Zellen induziert. Wenn die Zellen mit dem Antikörper 7C10 und Doxorubicin gemeinsam behandelt werden, wird eine signifikante Erhöhung des Zelltods beobachtet. Eine gleiche Wirkung zeigt sich mit dem Antikörper 7H2HM. Die gleiche Art von Ergebnissen wurde beobachtet, wenn der Antikörper mit Navelbin kombiniert wird.
Beispiel 7. Klonierungsstrategie der Gene, die die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des monoklonalen Antikörpers (MAk) 7C10 kodieren
Die Gesamt-RNA wurde aus 10⁷ Zellen von Hybridomen, welche den Antikörper 7C10 sekretieren, unter Verwendung des TRI REAGENT^TM (gemäß den durch den Lieferanten, SIGMA, T9424, gegebenen Anweisungen) extrahiert. Der erste cDNA-Strang wurde synthetisiert mit Hilfe des Kits „First strand cDNA synthesis" von Amersham-Pharmacia (#27-9261-01, gemäß den durch den Lieferanten gegebenen Anweisungen). Für die beiden Ketten wurde die Reaktion mit dem Oligonukleotid Not I-d(T)18, das in dem Kit enthalten ist, geprimt.
Das so erhaltene cDNA:mRNA-Hybrid wurde für die Amplifizierung der Gene, welche die schweren und leichten Ketten des MAk 7C10 kodieren, eingesetzt. Die PCR wurden ausgeführt, indem eine Kombination von für die schweren und leichten (kappa-) Ketten der Maus- Immunglobuline spezifischen Oligonukleotiden verwendet wurde. Die Primer, welche den 5'-Enden entsprachen, hybridisieren in der Region, welche den Signalpeptiden entspricht (Tabelle 2 für schwere Ketten, Tabelle 3 für leichte Ketten). Diese Primer wurden ausgehend von einer großen Anzahl von Sequenzen von Maus-Antikörpern, die in den Datenbanken gefunden werden, zusammengestellt (Jones, S.T., et al., Bio/Technology 9:88-89, 1991). Die Primer, die den 3'-Enden entsprechen, hybridisieren in den konstanten Regionen der schweren Ketten (CH1-Domäne der Unterklasse IgG1, nicht weit von der V-C-Verbindungsregion, Primer MHC-1 Tabelle 4) und leichten Ketten (Kappa-Domäne nicht weit von der V-C-Verbindungsregion, Primer MKC Tabelle 4).
TABELLE 2: Oligonukleotid-Primer für die 5'-Region der variablen Domänen der schweren Ketten von Immunglobulinen von der Maus (MHV) („MHV" für „Mouse Heavy Variable")
TABELLE 3: Oligonukleotid-Primer für die 5'-Region der variablen Domänen der kappa-Ketten (leichten Ketten) von Immunglobulinen von der Maus (MKV) („MKV" für „Moose Kappa Variable")
TABELLE 4: Oligonukleotid-Primer für die 3'-Enden der Gene V_H und V_L von der Maus
Beispiel 8: Sequenzen der ausgehend von dem Mäuse-Hybridom 7C10 klonierten Immunglobuline
Indem der oben beschriebenen Amplifizierungsstrategie gefolgt wurde, wurden PCR-Produkte, welche den variablen Regionen der schweren (VH) und leichten Ketten (VL) entspra chen, unter Verwendung des „pGEM^®-T Easy Vector Systems" (Promega) kloniert. Für 7C10 VL wurden PCR-Produkte mit dem Primer MKC in Kombination mit den Primern MKV1 und MKV2 erhalten. Für 7C10 VH wurden PCR-Produkte mit dem Primer MHC-1 in Kombination mit den Primern MHV8 und MHV12 erhalten. Eine vertiefte Sequenzierung der in die Vektoren pGEM-T easy klonierten PCR-Produkte hat zwei unterschiedliche Sequenzen für die leichte Kette und eine einzige Sequenz für die schwere Kette enthüllt.
a) Ausgehend von dem Oligo MKV1 isolierte variable Region
Die erhaltene DNA-Sequenz ist charakteristisch für eine variable Region eines funktionalen Ig. Es wird folglich angenommen, dass diese neue Sequenz jene ist, die 7C10 VL kodiert. Die DNA-Sequenzen (SEQ ID Nr. 48 und 50) und Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr. 49) der 7C10 VL kodierenden cDNA sind in der 14 aufgeführt.
b) Ausgehend von dem Oligo MKV2 isolierte variable Region
Das Gen, welches diese leichte Kette kodiert, stammt von einem aberranten mRNA-Transkript, das in allen Standard-Fusionspartnern, die von dem ursprünglichen MOPC-21-Tumor, zu welchem das Mäuse-Myelom Sp2/Oag14 gehört, das verwendet wurde, um das Hybridom 7C10 zu erzeugen, abstammen, vorhanden ist. Diese Sequenz umfasst eine aberrante Rekombination zwischen den Genen V und J (Deletion von vier Nukleotidbasen, was eine Veränderung des Leserasters zur Folge hat) und eine Mutation des unveränderlichen Cysteins an Position 23 zu Tyrosin. Diese Veränderungen legen nahe, dass diese leichte Kette nicht funktionsfähig ist, obgleich sie in mRNA transkribiert wird. Die DNA-Sequenz von dieser leichten Pseudokette ist nicht gezeigt.
c) Ausgehend von den Oligos MHV8 und MHV12 isolierte variable Region
Die DNA-Sequenzen, die mit diesen beiden Oligos erhalten werden, sind identisch abgesehen von der Sequenz, die durch das Oligo selbst kodiert wird. Diese Sequenz ist eine neue Sequenz, die eine funktionsfähige schwere Kette kodiert, von der angenommen wird, dass sie jene des monoklonalen Antikörpers 7C10 ist. Die DNA-Sequenzen (SEQ ID Nr. 51 und 53) und Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr. 52) der cDNA, die 7C10 VH kodiert, sind in der 15 angegeben.
Beispiel 9. Konstruktion der chimären Maus-Mensch-Gene
Der chimäre Antikörper 7C10 wurde derart konstruiert, dass er die Regionen 7C10 VL und VH von der Maus verknüpft mit den konstanten humanren Regionen kappa bzw. gamma-1 aufwies. Es wurden Oligos eingesetzt, um die 5'- und 3'-Enden der Sequenzen, die die 7C10 VL und VH kodierenden DNA-Sequenzen flankieren, zu modifizieren, um deren Klonierung in Vektoren für eine Expression in Säugetierzellen zu erlauben. Diese Vektoren setzen den starken HCMV-Promotor ein, um die schweren und leichten Ketten des chimären Antikörpers 7C10 wirksam zu transkribieren. Andererseits enthalten diese Vektoren gleichfalls den Replikati onsstartpunkt von SV40, welcher eine wirksame Replikation der DNA und folglich eine vorübergehende Expression der Proteine in cos-Zellen erlaubt.
Beispiel 10. Expression und Auswertung der Erkennungsaktivität des chimären Antikörpers 7C10 bezüglich des IGF-1-Rezeptors
Die beiden Plasmide, welche die DNA enthalten, welche den chimären Antikörper 7C10 kodiert, wurden durch Cotransfektion in cos-7-Zellen (ATCC-Nr. CRL-1651) eingeschleust, um die vorübergehende Expression des rekombinanten Antikörpers zu untersuchen. Nach 72 h Inkubation wurde das Kulturmedium entnommen, zentrifugiert, um die Zellrückstände zu eliminieren und durch die ELISA-Technik hinsichtlich der Produktion von humanem IgG1 (siehe Beispiel 16) und der Erkennung des IGF-1-Rezeptors analysiert (siehe Beispiel 17).
Die ELISA-Tests zur Messung der Konzentrationen von humanen IgG1/Kappa haben gezeigt, dass die Expression des chimären Antikörpers 7C10 in den cos7-Zellen zwischen 300 und 500 ng/ml lag, was vergleichbar ist mit den Werten, die mit der Hauptanzahl der Antikörper erhalten werden.
Die ELISA-Tests der Erkennung des IGF-1-Rezeptors zeigen, dass der chimäre Antikörper diesen spezifisch und mit einer guten relativen Avidität erkennt (siehe 3A, 3B und 3C). Dies liefert den funktionalen Beweis dafür, dass die richtigen VH und VL des Antikörpers 7C10 identifiziert worden sind. Außerdem erweist sich diese chimäre Form von 7C10 als ein unverzichtbares Werkzeug für die Auswertung der Affinität der humanisierten Formen.
Beispiel 11. Molekulare Modellierung der variablen Regionen des Mäuse-Antikörpers 7010
Um das Humanisierungsverfahren durch „CDR-Grafting" zu unterstützen und zu verfeinern, wurde ein molekulares Modell der VL- und VH-Regionen des Mäuse-Antikörpers 7C10 konstruiert. Das Modell basiert auf der kristallographisch ermittelten Struktur der schweren Ketten 1AY1 und der leichten Kette 2PCP.
Beispiel 12. Humanisierungsverfahren durch CDR-Grafting der variablen Region der leichten Kette des Antikörpers 7C10 (7C10 VL)
a) Vergleich der Aminosäuresequenz von 7C10 VL mit allen bekannten VL-Sequenzen von der Maus
Als einleitender Schritt für die Humanisierung durch CDR-Grafting wurde die Aminosäuresequenz von 7C10 VL in einem ersten Schritt mit allen VL-Sequenzen von der Maus, die in der Kabat-Datenbank vorhanden sind (Internet-Adresse:
ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta_format/, letzte Aktualisierung der Daten von 1999) verglichen. Es wurde so identifiziert, dass 7C10 VL zu der Untergruppe II der leichten Kappa-Ketten, wie von Kabat et al. definiert (in: Sequences of proteins of immunological interest (5. Aufl.), NIH publication Nr. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 1991), gehört. Es wurden VL-Regionen von monoklonalen Antikörpern von der Maus mit einer Sequenzidentität, die bis zu 95% gehen kann, identifiziert (DRB1-4.3 (SEQ ID Nr. 55): 95% und C94-5B11'CL (SEQ ID Nr. 56): 95%, siehe 17). Um zu versuchen, die Reste außerhalb der Übereinstimmungen in der Sequenz von 7C10 VL zu identifizieren, wurde die Aminosäuresequenz von 7C10 VL (SEQ ID Nr. 54) basierend auf Homologie ausgerichtet gegenüber der Consensussequenz der Untergruppe II der kappa-Ketten von der Maus (SEQ ID Nr. 57), wie von Kabat definiert (siehe 17).
An der Kabat-Position Nummer 3 ist das Valin (V), das normalerweise in der Untergruppe II der leichten Kappa-Ketten gemäß Kabat vorhanden ist (71%), durch ein Leucin (L) ersetzt. Ein Leucin an dieser Position ist nicht selten, denn man findet dieses beispielsweise in DRB1-4.3 und C94-5B11'CL. Nach dem molekularen Modell scheint dieser Rest keine besondere Rolle zu spielen. Folglich wird die Konservierung dieses Rests in der humanisierten Form nicht ins Auge gefasst werden.
An der Kabat-Position Nummer 7 ist das Threonin (T), das normalerweise in der Untergruppe II der leichten Kappa-Ketten gemäß Kabat vorhanden ist (66%), durch ein Isoleucin (I) ersetzt. Ein Isoleucin an dieser Position ist relativ selten, denn es wurde unter allen bekannten VL-Sequenzen von der Maus lediglich 15 Mal gefunden und niemals unter den humanen VL-Sequenzen. Das molekulare Modell zeigt, dass dieser Rest (17) in Richtung der Oberfläche des Moleküls weist, aber die CDRs nicht kontaktiert (der nächstliegende Rest einer CDR wäre das Arginin an der Kabat-Position Nummer 42). Außerdem scheint es wenig wahrscheinlich, dass dieser Rest 17 direkt das Antigen kontaktiert. Folglich wird die Konservierung dieses Rests in der humanisierten Form zumindest zunächst nicht ins Auge gefasst werden.
An der Kabat-Position Nummer 77 ist das Arginin (R), welches normalerweise in der Untergruppe II der leichten Kappa-Ketten gemäß Kabat vorhanden ist (95,5%), ersetzt durch ein Serin (S). Ein Serin an dieser Position ist nicht selten.
b) Vergleich der Aminosäuresequenz von 7C10 VL mit allen bekannten humanen VL-Sequenzen
Um den besten humanen Kandidaten für das „CDR-Grafting" zu identifizieren, wurde die VL-Kappa-Region von humaner Herkunft mit der höchstmöglichen Homologie zu 7C10 VL gesucht. Zu diesem Zweck wurde die Aminosäuresequenz von 7C10 VL kappa von der Maus mit allen humanen VL-kappa-Sequenzen, die in der Kabat-Datenbank vorhanden sind, verglichen. 7C10 VL von der Maus wies die höchste Sequenzhomologie zu den humanen VL-kappa-Regionen der Untergruppe II, wie von Kabat et al. (1991) definiert, auf. Es wurden VH-Regionen von monoklonalen Antikörpern humaner Herkunft mit einer Sequenzidentität, die bis zu 75,9% geht (GM607 (SEQ ID Nr. 58), siehe 18) in der Gesamtheit von 112 Aminosäuren, welche die variable Region bilden, identifiziert. Eine Keimbahn humaner Herkunft, DPK15/A19 (SEQ ID Nr. 59), mit einer Sequenzidentität von 76% (siehe 18) wurde ebenfalls identifiziert. GM607 (Klobeck et al., 1984). GM607 wird folglich als humane Empfängersequenz der CDRs (gemäß der Definition von Kabat) von 7C10 VL von der Maus ausgewählt. Bei Vergleich der Sequenzen von GM607 mit jener der Consensussequenz der humanen Untergruppe II (SEQ ID Nr. 60) (18) konnte kein besonderer Rest in den Gerüstregionen (Rch) identifiziert werden, was ebenso anzeigt, dass GM607 ein guter Kandidat für das CDR-Grafting wäre.
c) Humanisierte Versionen von 7C10 VL
Der folgende Schritt in dem Humanisierungsverfahren besteht darin, die CDRs von 7C10 VL von der Maus mit den Gerüstregionen (Rch) der ausgewählten leichten humanen Kette, GM607 (Klobeck et al., 1984), zu verknüpfen. In diesem Stadium des Verfahrens ist das molekulare Modell der Fv-Regionen von 7C10 von der Maus besonders nützlich bei der Wahl der zu konservierenden Reste von der Maus, denn diese können eine Rolle entweder bei der Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur des Moleküls (kanonische Struktur der CDRs, Grenzfläche VH/VL u.s.w.) oder bei der Bindung des Antigens spielen. Bei den Rch wurde jeder Unterschied zwischen den Aminosäuren von der Maus (7C10 VL) und den humanen Aminosäuren (GM607) gewissenhaft untersucht (siehe Tabelle 5). Außerdem wurden die für die Sequenz 7C10 VL von der Maus besonderen Reste, die identifiziert worden waren (siehe Beispiel 12.a)), berücksichtigt, wenn dies erforderlich war.
Bei der ersten durch „CDR-Grafting" humanisierten Version von 7C10 VL, human 1, wurde eine einzige Veränderung in den Gerüstregionen (Rch) von GM607 vorgenommen. Diese Veränderung betrifft den in Rch 1 befindlichen Rest 2 (Kabat-Nomenklatur). Dieser Rest gehört tatsächlich zu der Zusammensetzung der kanonischen Struktur der CDR1 von 7C10 VL und könnte folglich kritisch sein für die Aufrechterhaltung dieser Schleife in ihrer korrekten Konformation. Das an dieser Position in der Sequenz 7C10 VL von der Maus vorhandene Valin ist folglich an eben dieser Position in der humanisierten Form konserviert (siehe Tabelle 5 und 19 für die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 61) und die 20 für die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 62 und 64) und die Aminosäuresequenz, welche das Signalpeptid umfasst (SEQ ID Nr. 63).
In der zweiten durch „CDR-Grafting" humanisierten Version von 7C10 VL, human 2, wurde keinerlei Veränderung in den Rchs der leichten humanen GM 607-Kette vorgenommen. Alle Reste der Rchs sind folglich humaner Herkunft einschließlich des Rests 2, der folglich mutiert worden ist, um das in 7C10 VL von der Maus vorhandene Valin durch ein Isoleucin, das an eben dieser Position in der leichten humanen GM 607-Kette gefunden wird, zu ersetzen (siehe Tabelle 5 und die 19 für die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 65) und die 21 für die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 66 und 68) und die das Signalpeptid umfassende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 67)). Diese humane Form 2 ist folglich vollständig humanisiert (außer selbst verständlich den CDRs selbst), denn alle Reste der Rchs sind jene der leichten Kette humaner Herkunft, GM 607.
TABELLE 5. Auf Homologie basierende gegenseitige Ausrichtung (Alignment) der Aminosäuresequenzen, die zu der Gestaltung der umgestalteten humanen 7C10 V_L-Regionen geführt haben
Legende: Die erste Spalte (Kabat) gibt die Position des Aminosäurerests nach Kabat et al. (1991) an; die zweite Spalte (#) gibt die Position des Aminosäurerests in der regulären Sequenz an; die dritte Spalte (FR oder CDR) wurde erstellt, um leicht die Abschnitte des Gerüsts (FR1, FR2, FR3 und FR4) und die CDR-Abschnitte (CDR1, CDR2 und CDR3) („CDR" für „complementary determining region"), wobei die drei CDRs die vier FRs voneinander trennen, zu identifizieren; die vierte Spalte (Leichte Kette von 7C10 von der Maus) repräsentiert die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 54) der V_L-Region des Mäuse-Antikörpers 7C10; die fünfte Spalte (Huma ne Keimbahn DPK15/A19) repräsentiert die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 59) der leichten humanen Kette V kappa II der Keimbahn; die sechste Spalte (GM 607) repräsentiert die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 58) der V_L-Region des humanen Antikörpers GM 607; die siebte und achte Spalte (umgestalteter 7C10 L human 1 und 2) repräsentieren die Aminosäuresequenzen der 7C10 VL-Antikörper humanisiert 1 und 2 (SEQ ID Nr. 61 bzw. 65). "*" gibt die Abschnitte der kanonischen Struktur der CDR-Schleife, wie durch Chotia et al. definiert (Nature, 342, 877-883, 1989), an.
Beispiel 13. Humanisierungsverfahren durch CDR-Grafting der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers 7C10 (7C10 VH)
a) Vergleich der Aminosäuresequenz von 7C10 VH mit allen bekannten VH-Sequenzen von der Maus
Als einleitender Schritt für die Humanisierung durch CDR-Grafting wurde die Aminosäuresequenz von 7C10 VH zunächst mit allen VH-Sequenzen von der Maus, die in der Kabat-Datenbank (Internet-Adresse: ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta_format/, letzte Aktualisierung der Daten von 1999) vorhanden sind, verglichen. Es wurde so identifiziert, dass 7C10 VH zu der Untergruppe I(A) der schweren Ketten, wie von Kabat et al. (1991) definiert, gehört. Es wurden VH-Regionen von monoklonalen Antikörpern von der Maus mit einer Sequenzidentität, die bis zu 90,5% geht, identifiziert (AN03'CL (SEQ ID Nr. 70), siehe 22). Um zu versuchen, die nicht übereinstimmenden Reste in der Sequenz von 7C10 VH zu identifizieren, haben wir die Aminosäuresequenz von 7C10 VH (SEQ ID Nr. 69) anhand von Homologie gegenüber der Consensussequenz (SEQ ID Nr. 71) der Untergruppe I(A) der schweren Ketten von der Maus, wie von Kabat definiert, ausgerichtet (Alignment) (siehe 22).
Der Rest 17 (Kabat-Nummerierung), Thr für die Consensussequenz der Untergruppe I(A) und Ser in 7C10 VH, befindet sich an der Oberfläche des Moleküls angrenzend an die Grenzfläche zu der konstanten Region. Dieser Rest scheint nicht wichtig zu sein.
Der Rest 27 (Kabat-Nummerierung), Asp für die Consensussequenz der Untergruppe (IA) und Tyr in 7C10 VH ist ein kanonischer Rest für die CDR1. Tyr ist an dieser Position nicht selten und ist wahrscheinlich kritisch für die Aufrechterhaltung der CDR1 in ihrer korrekten Konformation.
Der Rest 84 (Kabat-Nummerierung), Thr für die Consensussequenz der Untergruppe I(A) und Asn in 7C10 VH. Asn wurde in VH von der Maus dreiundneunzig Mal und dreimal in der humanen VH gefunden. Gemäß dem molekularen Modell ist dies ein vom Paratop entfernt liegender Oberflächenrest.
Die Nummerierung der Aminosäuren ist jene von Kabat et al. (1991). Die Reste in den Gerüstregionen (außer CDRs), die zwischen 7C10 VH und der Kabat-Untergruppe I(A) von der Maus unterschiedlich sind, sind unterstrichen. AN03'CL repräsentiert die Sequenz der schweren Kette eines Mäuse-Antikörpers (Aufnahmenummer in der Kabat-Datenbank ist P001289).
b) Vergleich der Aminosäuresequenz von 7C10 VH mit allen bekannten humanen VH-Sequenzen
Um den besten humanen Kandidaten für das „CDR-Grafting" zu identifizieren, wurde die VH-Region von humaner Herkunft mit der höchstmöglichen Homologie zu 7C10 VH gesucht. Zu diesem Zweck wurde die Aminosäuresequenz von 7C10 VH von der Maus mit allen humanen VH-Sequenzen, die in der Kabat-Datenbank vorhanden sind, verglichen. 7C10 VH von der Maus wies die höchste Sequenzhomologie zu den humanen VH-Regionen der Untergruppe II, wie von Kabat et al. (1991) definiert, auf. Es wurden VH-Regionen von monoklonalen Antikörpern humaner Herkunft mit einer Sequenzidentität, die bis zu 67,3% geht (humanes VH FUR1'CL (SEQ ID Nr. 73, siehe 23)) über die Gesamtheit von 98 Aminosäuren, welche durch das variable Gen kodiert werden (d.h. außer der CDR3 und der Region J), identifiziert. Eine Keimbahn humaner Herkunft, 4.22 VH IV (Sanz et al. 1989) mit einer Sequenzidentität von 68,4% gemäß den gleichen Kriterien wie für VH FUR1'CL wurde ebenfalls identifiziert (human Keimbahn (SEQ ID Nr. 74), siehe 23). Die durch die Keimbahn 4.22 VH IV kodierte Sequenz wurde als humane Empfängersequenz der CDRs (gemäß der Definition von Kabat) von 7C10 VH von der Maus ausgewählt anstelle von VH FUR1'CL, da bei Vergleich der Sequenzen von 4.22 VH IV und VH FUR1'CL mit jener der Consensussequenz der humanen Untergruppe II (human Kabat sg II (SEQ ID Nr. 72), siehe 23 und Tabelle 6) keinerlei atypischer Rest in den Gerüstregionen (Rch) für 4.22 VH IV identifiziert werden konnte, wohingegen das Vorhandensein von zwei atypischen Resten (Gln und Arg an den Positionen 81 bzw. 82A gemäß der Nomenklatur von Kabat) in der durch VH FUR1'CL kodierten Sequenz identifiziert wurde.
c) Humanisierte Versionen von 7C10 VH
Der folgende Schritt in dem Humanisierungsverfahren besteht darin, die CDRs von 7C10 VH von der Maus mit den Gerüstregionen (Rch) der humanen Keimbahn 4.22 VH IV (Sanz et al., 1989) zu verknüpfen. In diesem Stadium des Verfahrens ist das molekulare Modell der Mäuse-Fv-Regionen von 7C10 besonders nützlich bei der Wahl der zu konservierenden Reste von der Maus, denn diese können eine Rolle entweder bei der Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur des Moleküls (kanonische Struktur der CDRs, Grenzfläche VH/VL u.s.w.) oder bei der Bindung an das Antigen (Zugehörigkeit zum Paratop) spielen. Bei den Rch wurde jeder Unterschied zwischen den Aminosäuren von der Maus (7C10 VH) und den humanen Aminosäuren (4.22 VH IV) gewissenhaft untersucht (siehe Tabelle 6). Außerdem wurden die für die Sequenz 7C10 VH von der Maus besonderen Reste, die identifiziert worden waren (siehe Beispiel 8.a)), berücksichtigt, wenn dies erforderlich war.
Bei der ersten durch „CDR-Grafting" humanisierten Version von 7C10 VH, humanisiert 1, wurden vier Veränderungen in den Gerüstregionen (Rch) von 4.22 VH IV vorgenommen (siehe Tabelle 6, 24 für die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 75) und die 25 für die DNA- Sequenz (SEQ ID Nr. 76 und 78) und die Aminosäuresequenz, welche das Signalpeptid umfasst (SEQ ID Nr. 77)). Diese vier Veränderungen betreffen:

• Den Rest 30 (Kabat-Nomenklatur), der in Rch1 gelegen ist. Dieser Rest gehört tatsächlich zu der strukturellen Zusammensetzung der CDR1 von 7C10 VH (wie von Chotia et al., 1989, definiert) und könnte folglich kritisch für die Aufrechterhaltung dieser Schleife in ihrer korrekten Konformation sein. Das an dieser Position in der Sequenz 7C10 VH von der Maus vorhandene Thr wird folglich in der humanisierten Form an eben dieser Position beibehalten.
• Den Rest 48 (Kabat-Nomenklatur), der in Rch2 gelegen ist. Dieser Rest liegt nahe bei den CDRs, obgleich er gemäß dem molekularen Modell nicht in direktem Kontakt mit diesen Letzteren steht, und könnte einen Einfluss auf deren Feinkonformation haben. Das an dieser Position in der Sequenz 7C10 VH von der Maus vorhandene Methionin wird folglich in der humanisierten Form 1 an eben dieser Position beibehalten.
• Den Rest 67 (Kabat-Nomenklatur), der in Rch3 gelegen ist. Dieser Rest liegt nahe bei den CDRs und könnte gemäß dem molekularen Modell das Lysin 60 (Kabat-Nomenklatur) in der CDR 2 kontaktieren. Das an dieser Position in der Sequenz 7C10 VH von der Maus vorhandene Isoleucin wird folglich in der humanisierten Form 1 an dieser Position beibehalten.
• Den Rest 71 (Kabat-Nomenklatur), der in Rch3 gelegen ist. Dieser Rest gehört zu der kanonischen Struktur der CDR 2 und müsste folglich kritisch sein, um diese Schleife in ihrer korrekten Konformation zu halten. Das an dieser Position in der Sequenz 7C10 VH von der Maus vorhandene Arginin wird folglich in der humanisierten Form 1 an dieser Position beibehalten.

In der zweiten durch „CDR-Grafting" humanisierten Version von 7C10 VH, humanisiert 2, wurden zwei Veränderungen in den Gerüstregionen (Rch) von 4.22 VH IV vorgenommen. Diese beiden Veränderungen betreffen die Reste 30 und 71 (Kabat-Nomenklatur), die bereits bei der humanisierten Form 1 beschrieben worden sind (siehe Tabelle 6, 24 für die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 79) und die 26 für die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 80 und 82) und die Aminosäuresequenz, welche das Signalpeptid umfasst (SEQ ID Nr. 81)).
In der dritten durch „CDR-Grafting" humanisierten Form von 7C10 VH, humanisiert 3, wurde keinerlei Veränderung in den Gerüstregionen (Rch) von 4.22 VH IV vorgenommen. Alle Reste der Rchs sind folglich humanen Ursprungs einschließlich der Reste 30, 48, 67 und 71 (Kabat-Nomenklatur), die bewahrt wurden (siehe Tabelle 6, 24 für die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 83) und die 27 für die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 84 und 86) und die Aminosäuresequenz, die das Signalpeptid umfasst (SEQ ID Nr. 85)). Diese humanisierte Form 3 ist folglich vollständig humanisiert (ausgenommen selbstverständlich die CDRs selbst, wie von Kabat definiert), denn alle Reste der Rchs sind jene, die durch das Gen VH der Keimbahn 4.22 VH IV kodiert werden.
Beispiel 14. Konstruktion der Gene, welche die humanisierten Versionen 1 von 7C10 VL und VH kodieren, durch Zusammenfügen (Assembly) von Oligonukleotiden
a) Prinzip
Die Gene (Leaderpeptid + variable Regionen VDJ für VH oder VJ für VK), welche die humanisierten variablen Regionen kodieren, wurden durch an einer festen Phase erfolgenden Zusammenbau an mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen synthetisiert. Die Gene, welche humanisierten 7C10 VH (445 Basenpaare) und humanisierten 7C10 VL (433 Basenpaare) kodieren, werden konstruiert, indem zwei DNA-Fragmente dank des Vorhandenseins einer KpnI-Restriktionsstelle, welche in den beiden Sequenzen vorhanden ist und in etwa in der Mitte des Gens gelegen ist (bei 200 bzw. 245 Nukleotiden bezogen auf das 5'-Ende des Gens für VL bzw. VH), fusioniert werden. Die beiden Fragmente, die miteinander fusioniert werden, werden ihrerseits durch eine Zusammenfügungs (Assembly)-Technik zusammengefügt, die darin besteht, phosphorylierte Oligonukleotide (ungefähr 30-35-mer) einzusetzen, von denen jeweils zwei (ein Sinn-Oligo und das Andere ein Antisinn-Oligo mit einer Homologie von etwa 50%) derart hybridisiert werden, dass sie sich während der Verlängerung überlappen. Ein erstes 5' biotinyliertes Oligonukleotid wird an die magnetischen Kügelchen angeheftet, dann werden die Paare von phosphorylierten Oligonukleotiden eines nach dem anderen angefügt. Die Phosphodiester-Bindung zwischen den nebeneinander liegenden phosphorylierten Oligonukleotiden wird durch das Enzym T4-DNA-Ligase gebildet.
Die so de novo synthetisierten Gene können direkt kloniert werden (durch Verdau mit Restriktionsenzymen, die mit dem gewählten Expressionsvektor verträglich sind) oder durch PCR amplifiziert werden, um mehr Material im Vorfeld der gerichteten Klonierung durch enzymatischen Verdau zu erhalten. Die Sequenz des so durch de novo-Zusammenbau konstruierten Gens wird dann durch automatische Sequenzierung der DNA verifiziert.
b) Versuchsprotokoll der de novo-Zusammenfügungs (Assembly)-Technik
5' phosphorylierte oder 5' biotinylierte Oligonukleotide, deren Konzentration auf 100 µM eingestellt worden ist, wurden bei MWG Biotech bestellt (siehe die Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide in der Tabelle 7 für die Konstruktion von humanisiertem 7C10 VL und in der Tabelle 8 für die Konstruktion von humanisiertem 7C10 VH). Die Oligonukleotide sind paarweise hybridisiert worden (eine äquimolare Mischung, 500 pmol, eines Sinn-Oligos und eines Antisinn-Oligos in dem T4-DNA-Ligase-Puffer wird bei 95°C 5 min erwärmt, dann lässt man sie auf dem Labortisch bis auf Umgebungstemperatur abkühlen) gemäß einem in der Tabelle 9 beschriebenen Schema.
Das erste biotinylierte Oligonukleotid wird an mit Streptavidin beschichtete magnetische Kügelchen (Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal-Produkt Nr. 112-05) gebunden. Dafür setzt man zu 50 µl dekantierten Kügelchen (Verwendung eines magnetischen Trägers), die vorab zweimal mit 100 μl 1X TE-Puffer (100X Tris-EDTA-Puffer: 1 M Tris-HCl, pH 8, 0,1 M EDTA, Sigma T-9285) gewaschen worden sind, 500 pmol biotinyliertes Oligonukleotid in einer 15 mM NaCl-Lösung zu. Nach einer Inkubation bei 37°C während 15 min werden die Kügelchen zweimal mit dem Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM EDTA und 50 mM NaCl) gewaschen und die Paare von hybridisierten Oligonukleotiden werden dann nacheinander zugesetzt. Nach jeder Zugabe eines Paars von Oligonukleotiden erwärmt man 5 min bei 95°C, dann lässt man auf dem Labortisch bis auf Umgebungstemperatur abkühlen. Ist einmal Umgebungstemperatur erreicht, setzt man 2 µl T4-DNA-Ligase mit einer Konzentration von 10 U/µl (Biolabs) zu und man inkubiert 20 min bei 37°C. Die Kügelchen werden dann gewaschen (Waschpuffer) und die folgenden Paare von Oligonukleotiden werden dann sogleich zugesetzt.
Das letzte nicht gepaarte Oligo (Antisinn) wird auf die folgende Weise zusammengebaut. 5 µl Oligo (500 pmol) und 43 µl T4-DNA-Ligasepuffer werden zu den dekantierten Kügelchen hinzugegeben, dann erwärmt man die Mischung 5 min auf 95°C und man lässt sie auf dem Labortisch bis auf Umgebungstemperatur abkühlen. Ist einmal Umgebungstemperatur erreicht, setzt man 2 μl T4-DNA-Ligase zu und man inkubiert bei 37°C 20 min. Die Kügelchen werden dann zweimal mit dem Waschpuffer, dann zweimal mit dem 1X TE-Puffer gewaschen.

Die Kügelchen können dann bei 4°C aufbewahrt werden, bevor man die Klonierung und Sequenzierung des de novo zusammengebauten Gens vornimmt. TABELLE 7: DNA-Sequenz der Oligonukleotide, die für die Konstruktion von 7C10 VL humanisiert 1 durch de novo-Zusammenbau eingesetzt wurden

TABELLE 8: DNA-Sequenz der Oligonukleotide, die für die Konstruktion von 7C10 VH humanisiert 1 durch de novo-Zusammenbau eingesetzt wurden

TABELLE 9: Paarungsprotokoll der Oligonukteotide für den de novo-Zusammenbau der Gene, welche die humanisierten Formen von 7C10 VH und VL kodieren

De novo-Zusammenbau des Fragments	De novo-Zusammenbau des Fragments
MluI-KpnI von 7C10 VL humanisiert 1	KpnI-BamHI von 7C10 VL humanisiert 1
Biotinyliertes Leader-Oligo MluI 7C10 VL	Biotinyliertes Oligo 7C10L KpnI
Paar von Oligo 1 und 7	Paar von Oligo 13 und 20
Paar von Oligo 2 und 8	Paar von Oligo 14 und 21
Paar von Oligo 3 und 9	Paar von Oligo 15 und 22
Paar von Oligo 4 und 10	Paar von Oligo 16 und 23
Paar von Oligo 5 und 11	Paar von Oligo 17 und 24
Paar von Oligo 6 und 12	Paar von Oligo 18 und 25
Antisinn-Oligo 7C10 VL KpnI	Paar von Oligo 19 und 26
	Antisinn-Oligo 7C10 L BamHI
De novo-Zusammenbau des Fragments	De novo-Zusammenbau des Fragments
MluI-KpnI von 7C10 VH humanisiert 1	KpnI-BamHI von 7C10 VH humanisiert 1
Biotinyliertes Leader-Oligo MluI 7C10 VH	Biotinyliertes Oligo 7C10 H KpnI
Paar von Oligo 1 und 8	Paar von Oligo 15 und 21
Paar von Oligo 2 und 9	Paar von Oligo 16 und 22
Paar von Oligo 3 und 10	Paar von Oligo 17 und 23
Paar von Oligo 4 und 11	Paar von Oligo 18 und 24
Paar von Oligo 5 und 12	Paar von Oligo 19 und 25

Paar von Oligo 6 und 13	Paar von Oligo 20 und 26
Paar von Oligo 7 und 14	Antisinn-Oligo 7C10 VH BamHI
Antisinn-Oligo 7C10 VH KpnI

Beispiel 15: Konstruktion der Gene, welche die Versionen humanisiert 2 von 7C10 VL und 7C10 VH und 3 von 7C10 VH kodieren, durch zielgerichtete Mutagenese
Die Version humanisiert 2 von 7C10 VH wurde durch zielgerichtete Mutation der Reste 48 und 67 (gemäß der Kabat-Nomenklatur) der Version 1 erhalten. Diese zielgerichtete Mutagenese wurde mit Hilfe des Systems QuikChange^TM Site-directed mutagenesis von Stratagene (Kit Nr. 200518) gemäß dem von dem Hersteller beschriebenen Protokoll ausgeführt. Die Konstruktion erfolgt auf zwei Mal: zunächst wurde der Rest 48 in der Version 1 mit Hilfe des Primerpaares 7C10Hhumanisé1QCM48 sens und -antisens (siehe Tabelle 10) mutiert und in einem zweiten Schritt wurde diese an Rest 48 mutierte Version ihrerseits am Rest 67 mit Hilfe des Primerpaares 7C10Hhumanisé1QCI167 sens und -antisens (siehe Tabelle 10) mutiert.
Die Version humanisiert 3 von 7C10 VH wurde durch zielgerichtete Mutation der Reste 30 und 71 (gemäß der Kabat-Nomenklatur) der Version 2 unter gleichfalls erfolgender Verwendung des QuikChange^TM-Systems erhalten. Diese Konstruktion erfolgt auf zwei Mal. Zunächst wurde der Rest 30 in der Version 2 mit Hilfe der Primer 7C10Hhumanisé1QCT30 sens und -antisens (siehe Tabelle 10) mutiert. In einem zweiten Schritt wurde diese an Rest 30 mutierte Version ihrerseits am Rest 71 unter Verwendung des Primerpaares 7C10Hhumanisé1V67QCR71 sens und -antisens (siehe Tabelle 10) mutiert.
Die Version humanisiert 2 von 7C10 VL wurde durch zielgerichtete Mutation des Rests 2 (gemäß der Kabat-Nomenklatur) der Version 1 unter Verwendung des QuikChange^TM-Systems erhalten. Der Rest 2 in der Version 1 wurde unter Verwendung des Primerpaares 7C10L humanisé1QCV2 sens und -antisens (siehe Tabelle 10) mutiert.
TABELLE 10: Liste der Oligonukleotide, die für die zielgerichtete Mutagenese durch das QuikChange^TM-System vom Stratagene eingesetzt wurden
Beispiel 16: Transfektion von cos7-Zellen durch Elektroporation
Die Säugetier-Expressionsvektoren, welche die chimären oder humanisierten Versionen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers 7C10 enthalten, wurden an cos7-Zellen hinsichtlich der vorübergehenden Expression der rekombinanten 7C10-Antikörper getestet. Die DNA wurde in die cos-Zellen durch Elektroporation mit Hilfe eines Biorad-Instruments (Gene Pulsar) eingeführt. Die DNA (10 µg von jedem Vektor) wird zu Aliquots von 0,8 ml cos-Zellen mit einer Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen pro ml in PBS-Puffer (ohne Ca++ und Mg++) hinzugesetzt. Es wurde ein Puls von 1900 Volt und einer Kapazität von 25 µF abgegeben. Die transfizierten cos-Zellen werden dann zu 8 ml DMEM-Medium, enthaltend 5% Kälberserum, hinzugegeben und 72 h bei 37°C inkubiert. Der Überstand wird dann gewonnen, zentrifugiert, um die Zellrückstände zu beseitigen, und durch ELISA für das Messen von seiner Konzentration an rekombinantem 7C10-Antikörper vom humanen IgG1/Kappa-Typ getestet.
Beispiel 17: ELISA-Methode zum Messen der Konzentrationen an rekombinanten humanen IgG1/Kappa-Antikörpern, die in dem Überstand der cos-Transfektanten vorhanden sind.
Die durch vorübergehende Expression in cos7-Zellen erzeugten Überstände wurden hinsichtlich der Anwesenheit von 7C10-Antikörper vom humanen IgG1/Kappa-Typ getestet. Für den Nachweis des humanen IgG1/Kappa-Immunglobulins wurden ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Maxisorb, Nunc) mit einem polyklonalen Ziege-anti humanes IgG-Antikörper (spezifisch für das Fc gamma-Fragment, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., Nr. 109-005-098) beschichtet. Die Überstände von cos-Zellen wurden reihenverdünnt und zu den beschichteten Vertiefungen hinzugesetzt. Nach einer Inkubation von einer Stunde bei 37°C und Waschen wurde ein mit Peroxidase (HRP, Sigma, A-7164) konjugierter polyklonaler Ziege-anti-leichte humane Kappa-Kette-Antikörper zugesetzt. Nach 45 min Inkubation bei 37°C und Waschen wurde das Substrat TMB (KPL Nr. 50-76-04) zugesetzt. Nach 10 min Inkubation wurde die Reaktion durch die Zugabe von 1 M Schwefelsäure gestoppt und die optische Dichte bei 450 nm abgelesen. Als Referenzstandard-Antikörper wurde ein gereinigtes humanes IgG1/Kappa-Immunglobulin (Sigma, I-3889) von bekannter Konzentration eingesetzt.
Beispiel 18. ELISA-Methode zur Bestimmung der Erkennungsaktivität der rekombinanten 7C10-Antikörper vom Typ humane IgG1/Kappa gegenüber dem IGF-1-Rezeptor (IGF-IR)
Die cos7-Kulturüberstände wurden auf ihre Fähigkeit, den IGF-1-R zu erkennen, durch eine ELISA-Methode getestet. ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Dynex Immulon 2HB) wurden mit 100 µl pro Vertiefung einer PBS-Lösung, enthaltend 0,31 ng/µl IGF-1-R (Human Insulinlike Growth Factor I soluble Receptor, R & D Systems, Nr. 391-GR), durch Inkubation für eine Nacht bei 4°C beschichtet. Nach Waschen mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20, wurden die Platten durch die Zugabe einer PBS-Lösung, welche 0,5% Gelatine enthielt, und Inkubation bei 37°C während 1 h gesättigt. Nach 3 Wäschen mit PBS wurden die zu testenden Proben von cos-Überständen, die vorab in PBS, enthaltend 0,1% Gelatine und 0,05% Tween 20, reihenverdünnt worden waren, zu den Platten hinzugesetzt. Nach einer Inkubation bei 37°C während 1 h, gefolgt von 3 Wäschen (PBS, enthaltend 0,05% Tween 20), wurde ein anti-humanes IgG-Antikörper (spezifisch für das Fc-Fragment), der mit Peroxidase konjugiert war (HRP, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., Nr. 109-035-098), zugesetzt (Verdünnung auf 1/5000 in PBS, enthaltend 0,1% Gelatine und 0,05% Tween 20). Nach 45 min Inkubation bei 37°C und 3 Wäschen (PBS, enthaltend 0,05% Tween 20) wurde das Substrat TMB (KPL, Nr. 50-76-04) zugesetzt. Nach 10 min Inkubation wurde die Reaktion durch die Zugabe von 1M Schwefelsäure gestoppt und die optische Dichte bei 450 nm abgelesen.
Beispiel 19. Bestimmung der Erkennungsaktivität des IGF1-R durch die verschiedenen Versionen von durch „CDR-Grafting" humanisiertem 7C10-Antikörper
Zunächst haben wir die Erkennungsaktivität der humanisierten Formen 1 der schweren und leichten Ketten von 7C10 gegenüber dem IGF-1-Rezeptor mit der chimären Form verglichen. Die 28 zeigt die Ergebnisse eines ELISA-Tests der Erkennung des IGF-1R (siehe Beispiel 18) ausgehend von Überständen von cos7-Zellen, deren Konzentration an humanen IgG1/Kappa vorab durch ELISA bestimmt worden war (siehe Beispiel 17). Die Titrationskurven der vier getesteten rekombinanten Antikörper überlappen perfekt, was anzeigt, dass ihre relativen Affinitäten für den IGF-IR sehr ähnlich sind. Man schließt folglich daraus, dass die humanisierte Form 1 von 7C10, welche aus der humanisierten leichten Kette 1 (1 einziger Rest von der Maus in den Gerüstregionen vorhanden) in Kombination mit der humanisierten schweren Kette 1 (4 Reste von der Maus in den Gerüstregionen vorhanden) besteht, spezifisch den IGF-1-Rezeptor und mit einer sehr ähnlichen Affinität zu jener des chimären Antikörpers (variable Regionen von der Maus) erkennt.
Als zweites haben wir den Einfluss des Rests 2 (gemäß der Kabat-Nomenklatur) der humanisierten leichten Kette von 7C10 (humanisierte Version 1 gegenüber der humanisierten Version 2, siehe 19) auf die Erkennung des IGF-IR untersucht. Die 29 zeigt die Ergebnisse des ELISA-Erkennungstests des IGF-IR (siehe Beispiel 18) ausgehend von Überständen von cos7-Zellen, deren Konzentration an humanem IgG1/Kappa vorab durch ELISA bestimmt worden war (siehe Beispiel 17). Die beiden humanisierten Versionen 1 und 2 der leichten Kette wurden nacheinander mit 7C10 VH, humanisiert 1, kombiniert. Die Titrationskurven der beiden Kombinationen überlagern sich, was anzeigt, dass die Mutation des Rests 2 der leichten Kette, der von einem Valin in der humanisierten Version 1 gegen ein Isoleucin in der humanisierten Form 2 ausgetauscht worden war, offensichtlich keinerlei Einfluss auf die relative Erkennungsaffinität des IGF1-Rezeptors hat. Die humanisierte Form 2 der leichten Kette von 7C10 stellt so eine Version dar, wo keinerlei Rest von der Maus (außer den CDRs) konserviert worden ist. Diese vollständig humanisierte Version stellt die bevorzugte Version von 7C10 VL dar.
Die vollständig humanisierte Version der leichten 7C10-Kette (humanisierte Version 2, siehe oben) wurde in Kombination mit den drei humanisierten Versionen der schweren Kette von 7C10 getestet. Die 30 zeigt die Ergebnisse des ELISA-Erkennungstests des IGF-1R ausgehend von cos7-Zellüberständen, deren Konzentration an humanem IgG1/Kappa vorab durch ELISA bestimmt worden war (siehe Beispiel 17). Die Titrationskurven sind sehr ähnlich und überlagern sich praktisch mit der Referenzkurve, welche dem chimären Antikörper entspricht, was anzeigt, dass die drei humanisierten Versionen 1, 2 und 3 von 7C10 VH ein und die selbe relative Affinität für den IGF-1R ergeben, wenn sie mit 7C10VL humanisiert 2 kombiniert werden. Andere ELISA-Tests, die parallel ausgeführt wurden (Ergebnisse nicht gezeigt), haben gleichwohl enthüllt, dass eine Punktmutation des Rests 71 (Kabat-Nomenklatur) eines Arginins (Maus) zu einem Valin (human) einen geringen Affinitätsverlust des entsprechenden Antikörpers gegen den IGF-1R zur Folge hat. Es ist also vernünftig, anzunehmen, dass 7C10 VH humanisiert 2 die gleiche relative Affinität für den IGF-1R wie 7C10 VH humanisiert 1 hat. Diese humanisierte Form 2 wird folglich gegenüber der Form 1 bevorzugt sein, denn sie umfasst lediglich zwei Aminosäuren von der Maus (Reste 30 und 71, siehe 24). Die humanisierte Form 3, die keinerlei Rest von der Maus mehr umfasst (außer den CDRs) wird ihrerseits auch bevorzugt sein, den sie scheint lediglich einen minimalen Affinitätsverlust zur Folge zu haben.
Als Schlussfolgerung erweist sich, dass zwei humanisierte Formen des Antikörpers 7C10 gemäß der Erfindung besonders bevorzugt sind: eine Form, die aus der Kombination von 7C10 VH humanisiert 2 (2 Reste von der Maus konserviert) mit 7C10 VL humanisiert 2 (keinerlei Rest von der Maus konserviert) besteht, und eine andere Form, die aus der Kombination von 7C10 VH humanisiert 3 (keinerlei Rest von der Maus konserviert) mit 7C10 VL humanisiert 2 (keinerlei Rest von der Maus konserviert) besteht. Diese letztere Form stellt die ultimative humanisierte Version dar, denn es ist keinerlei Rest von der Maus zugleich in der schweren und der leichten Kette vorhanden.
Beispiel 20. Expression des EGFR und des IGF-IR auf der Oberfläche der A549-Zellen
Es wurde die Wirkungssynergie, die durch die Coverabreichung von zwei MAK, die gegen den IGF-IR bzw. den EGFR gerichtet sind, erhalten wird, bei Nacktmäusen, welche einen nicht-kleinzelligen Lungentumor tragen, der durch subkutane (s.k.) Injektion von A549-Zellen (Lungenkarzinom-Zelllinie) etabliert worden ist, untersucht.
Zunächst und um das Vorhandensein der beiden Rezeptoren IGF-IR und EGFR auf der Oberfläche der A549-Zelle sicherzustellen, bevor jene der Maus injiziert wird, wurde eine Markierung von diesen Zellen für eine FACS-Ablesung mit dem Mäuse-anti-IGF-IR-MAK 7C10 (37B) bzw. dem Mäuse-anti-EGFR-MAK 225 vorgenommen (37D). Dafür wurden die Zellen 30 min bei 4°C mit einer PBS-Lösung mit 10% SVF (fötales Kälberserum) gesättigt, gewaschen, dann 30 min bei 4°C mit dem MAK von Interesse inkubiert. Nach 3 neuerlichen Wäschen wird der sekundäre, mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) gekoppelte anti-Spezies-Antikörper zugesetzt. Nach 30 min Inkubation erfolgt das Ablesen im FACS („Fluorescence Activated Cells Sorter") bei 520 nm (Anregung 488 nm).
Die in den 37A bis 37D aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass die A549-Zellen auf ihrer Oberfläche eine vergleichbare Anzahl von Rezeptoren für EGF und für IGF1 aufweisen. In den beiden Fällen ist die Population homogen bezogen auf die Verteilung von jedem der Rezeptoren. Die Spezifität der Markierung wird durch die Verwendung einer Isotypkontrolle bestätigt (37C). Diese Ergebnisse validieren die Verwendung der A549-Zelle als Modell für die Untersuchung einer Wirkungssynergie an zwei Rezeptoren IGF-IR und EGFR und für die Untersuchung einer Kollaboration dieser beiden Rezeptoren.
Beispiel 21. Wirkungssynergie eines anti-IGF-IR-MAK und eines anti-EGFR-MAK, die in vivo coverabreicht werden, bei der Nacktmaus im Rahmen einer Antitumorbehandlung.
Für diese Untersuchung wurden Nacktmäusen 5·10⁶ A549-Zellen transplantiert. Fünf Tage nach der Zelltransplantation werden die Tumore gemessen und es wird eine in Hinblick auf das Tumorvolumen homogene Gruppe von Mäusen gebildet. Ausgehend von dieser Gruppe werden zufällig Gruppen von 6 Mäusen gebildet. Diese Mäuse werden intraperitoneal (i.p.) zweimal wöchentlich mit jedem der MAK 7C10 und 225 individuell in einer Dosis von 250 µg/Maus oder mit den beiden MAK in Coverabreichung behandelt. Der MAK 9G4 wird als Isotypkontrolle des Experiments verabreicht.
Die in der 38 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass jeder der Antikörper 7C10 und 225, die allein verabreicht werden, in der Lage ist, eine signifikante Verringerung des Tumorwachstums in vivo zu induzieren. Man kann anmerken, dass die beiden getesteten MAK eine vergleichbare Aktivität auf das Wachstum des A549-Tumors haben. Überraschenderweise wird bezogen auf die Literatur eine signifikante Synergie während der gleichzeitigen Verabreichung der beiden MAK (p < oder = 0,01 zu jedem der Zeitpunkte der Kinetik in einem t-Test) beobachtet, was nahe legt, dass eine Kollaboration der beiden Rezeptoren für das optimale Wachstum eines Tumors in vivo existiert und dass im Gegensatz zu den Daten der Literatur das Blockieren von einer der beiden Achsen nicht ausreicht, um das durch die zweite vermittelte Wachstum vollständig zu hemmen.
Beispiel 22. Untersuchung der Antitumor-Aktivität der gemeinsam verabreichten Mäuse-Antikörper 7C10 und 225 bei Mäusen, denen A549-Zellen orthotopisch implantiert worden sind.
Die Verwendung von orthotopischen Modellen für die Auswertung der Antitumor-Aktivität weist einen besonderen Vorteil in Bezug auf den Prozess der Metastasenverbreitung eines Tumors auf. Um die Antitumor-Aktivität einer Mischung von Antikörpern, die gegen den IGF-IR bzw. den EGFR gerichtet sind, auszuwerten, wurden 10⁶ A549-Zellen (nicht-kleinzelliger Lungenkrebs) in die Pleurahöhle von Nacktmäusen implantiert. Es ist anzumerken, dass diese Art einer Tumorimplantation eine Metastasenverbreitung ähnlich zu jener, die beim Menschen beobachtet wird, zur Folge hat und zum Tode der Tiere führt. Die 39 zeigt, dass die Verabreichung der Antikörper 225 und 7C10 allein erlaubt, eine vergleichbare und signifikante Verlängerung des Überlebens zu beobachten. Überraschenderweise erhöht die gemeinsame Verabreichung (Coverabreichung) dieser beiden Antikörper das Überleben der Tiere beträchtlich, was nahe legt, dass diese Behandlung einen Einfluss auf die Metastasenverbreitung der Tumorzellen hat.
Beispiel 23. 7C10 und 7H2HM hemmen die Phosphorylierung des Tyrosins der β-Kette des IGF-IR und des IRS-1
MCF7-Zellen werden in einer Konzentration von 5·10⁴ Zellen/cm² (Schalen von 75 cm², COSTAR) in 20 ml RPMI ohne Phenolrot und mit Zusatz von 5 mM Glutamin, Penicillin/Streptomycin (jeweils 100 E/100 µg/ml) und 10% fötalem Kälberserum 24 h kultiviert. Nach drei Wäschen mit PBS wurden die Zellen 12 h in Medium (RPMI) ohne Phenolrot, welches kein fötales Kälberserum mehr enthielt und zu welchem 5 mM Glutamin, Penicillin/Streptomycin, Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 0,5 µg/ml (Sigma A-8022) und Transferrin in einer Konzentration von 5 µg/ml (Sigma T8158) zugesetzt waren, inkubiert.
Für die Aktivierung wurden die Zellen zuallererst bei 37°C 2 min mit blockierenden Antikörpern (10 µg/ml) inkubiert, dann wurde IGF-I (Sigma 13769, 50 ng/ml) für zwei zusätzliche Minuten zugesetzt. Die Reaktion wurde durch Absaugen des Inkubationsmediums gestoppt und die Schalen wurden auf Eis gesetzt. Die Zellen wurden durch Zugabe von 0,5 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% Natriumdesoxycholat), zu welchem Proteaseinhibitoren (1 Tablette für 50 ml, Boehringer Ref.: 1697 498) und Phosphataseinhibitoren (Calbiochem Ref.: 524625 (1/100)) zugesetzt worden waren, solubilisiert. Die Zellen wurden abgeschabt und die Suspension wurde gewonnen und auf einen Schüttler bei 4°C während 1,5 h gesetzt. Die Lösungen wurden bei 12000 Upm 10 min (4°C) zentrifugiert und die Proteinkonzentrationen der Überstände wurden durch BCA quantifiziert.
500 µg Proteine des Zelllysats wurden mit dem anti-IGF-IR (Santa cruz Ref.: sc-713) für eine Immunpräzipitation gemischt und auf einem Schüttler bei 4°C 1,5 h inkubiert. Die Immunpräzipitate wurden durch Zugabe von Protein A-Agarose (Boehringer Ref.: 1 134 515) gewonnen und die ganze Nacht auf dem Schüttler bei 4°C inkubiert. Für die Immunpräzipitation von IRS-1 wurden mit Agarosekügelchen gekoppelte anti-IRS-1-Antikörper (Santa-cruz Ref.: 559Ac) eingesetzt. Die Agarosekügelchen wurden zweimal mit 1 ml Lysepuffer, zweimal mit einem Waschpuffer 1 (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 500 mM NaCl; 0,1% Nonindet P40; 0,05% Natriumdesoxycholat (Boehringer 1 332 597), zu welchem Proteaseinhibitoren und Phosphataseinhibitoren zugesetzt waren) und einmal mit einem Waschpuffer 2 (50 mM Tris-HCl; 0,1% Nonidet P40; 0,05% Natriumdesoxycholat (Boehringer Ref.: 1 332 597), zu welchem Proteaseinhibitoren und Phosphataseinhibitoren zugesetzt waren, 1/100), gewaschen. Die Immunpräzipitate wurden in Laemmli-Puffer resuspendiert, 5 min auf 100°C erwärmt. Die Überstände wurden durch Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel (8% Novex EC6015) analysiert. Die Proteine wurden auf eine Nitrocellulosemembran transferiert, gefolgt von entweder einem Immunoblot mit mit HRP konjugierten anti-Phosphotyrosin-Antikörpern (upstate Biotechnology 4G10) oder mit anti-β-Kette des IGF-IR-Antikörpern oder anti-IRS-1 (Santa Cruz Ref.: sc 8038), gefolgt von einem mit HRP konjugierten anti-Kaninchen-Antikörper. Die Bandenmuster wurden durch Chemolumineszenz (Amersham RPN 2209), gefolgt von einer Autoradiographie auf Kodak X-mat AR-Filmen, sichtbar gemacht.
Die 40A repräsentiert nicht-stimulierte (0) oder entweder mit IGF-1 (50 ng/ml) allein (0 + IGF – 1) oder kombiniert mit monoklonalen oder humanisierten anti-IGF-IR-Antikörpern (10 µg/ml) 7C10, 1H7, 7H2HM stimulierte MCF7-Zellen. Die Antikörper 9G4 oder hlgG1 sind murine oder humane Immunglobuline vom Isotyp IgG1, die als Negativkontrolle des Experiments eingesetzt wurden. Die β-Ketten des IGF-IR wurden mit anti-phosphoryliertes Tyrosin-Antikörpern immunpräzipitiert und geblottet. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die monoklonalen oder humanisierten anti-IGF-IR-Antikörper 7C10, 1H7 und 7H2HM die Phosphorylierung des Tyrosins der β-Kette des IGF-IR hemmen.
Die 40B repräsentiert nicht-stimulierte (0) oder entweder mit IGF-1 (50 ng/ml) allein (0 + IGF – 1) oder kombiniert mit monoklonalen oder humanisierten anti-IGF-IR-Antikörpern (10 µg/ml) 7C10, 1H7, 7H2HM stimulierte MCF-7-Zellen. Wie weiter oben beschrieben, sind die Antikörper 9G4 oder hlGG1 murine oder humane Immunglobuline vom Isotyp IgG1, die als Negativkontrolle des Experiments eingesetzt wurden. IRS-1 wurde mit anti-phosphoryliertes Tyrosin-Antikörpern immunpräzipitiert und geblottet. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die monoklonalen Antikörper 7C10, 7H2HM und 1H7 die Phosphorylierung des Tyrosins von IRS-1 hemmen.
Beispiel 24. 7C10 und 7H2HM induzieren die Internalisierung des IGF-IR
MCF7- und A549-Zellen wurden in einer Konzentration von 1·10⁷ Zellen/ml in PBS mit 10% fötalem Kälberserum (FACS-Puffer) suspendiert. 1·10⁶ Zellen wurden 30 min bei 37°C mit den monoklonalen Antikörpern in einer Konzentration von 10 µg/ml (7C10, 7G3, 9G4) oder von 20 µg/ml für 7H2HM inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen bei 4°C 30 min mit einem biotinylierten anti-IGF-IR (monoklonaler Antikörper 12B1) markiert und schließlich bei 4°C 30 min mit einem Streptavidin-488 alexa Fluor^®-Konjugat inkubiert. Die Zellen wurden durch FACScan (Becton-Dickinson, Erembodegem, Belgien) mit der Cellquest-Software nach Beseitigung der Zellrückstände analysiert.
Die 41 zeigt die A549-Zellen ohne Färbung (erster Peak), die mit 7C10 oder 7H2HM inkubierten A549-Zellen (zweiter Peak) und die mit einem irrelevanten Mäuse- oder Ratten-IgG1 inkubierten A549-Zellen (dritter Peak). Man beobachtet eine zweifache Verringerung der Oberflächenexpression des IGF-IR durch die Zellen, wenn die Zellen vorab mit 7C10 oder 7H2HM inkubiert wurden.
Beispiel 25. 7C10 und 7H2HM induzieren den Abbau des IGF-IR
MCF-7-Zellen wurden 24 h in einer Konzentration von 10·10⁴ Zellen/cm² (75 cm², Costar) in 15 ml vollständigem Medium kultiviert. Dann wurden die Kulturen dreimal mit PBS gewaschen und 12 h mit serumfreiem Medium inkubiert. Dann wurden die Zellen mit Cycloheximid in einer Konzentration von 25 µg/ml allein oder mit 10 µg/ml monoklonalem Antikörper 7C10, 9G4, 7G3 oder mit IGF-I (50 ng/ml) inkubiert. In bestimmten Experimenten wurden die Zellen vor der Inkubation mit den monoklonalen Antikörpern 1 h bei 37°C mit MG-132 (10 µM, Calbiochem 474791) behandelt, um die Aktivitäten des Proteasoms zu hemmen. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und durch Zugabe eines Lysepuffers solubilisiert. 20 µg Proteine wurden durch Elektrophorese auf einem 8%-SDS-Polyacrylamidgel analysiert und auf eine Nitrocellulosemembran transferiert, gefolgt von einem anti-β-Kette des IGF-IR-Immunoblot, wie weiter oben beschrieben.
Die Western-Blot-Analyse (42A) der Integrität des IGF-IR zeigt, dass 7C10 und 7H2HM den Abbau des Rezeptors induzieren, wohingegen der natürliche Ligand keinerlei Abbau dieses Letzteren zur Folge hat. Mit 9G4, einem irrelevanten Antikörper, der als Isotypkontrolle eingesetzt wird, wird keinerlei Abbau des Rezeptors beobachtet. Die 42B weist ihrerseits nach, dass der Abbau durch einen Proteasom-Inhibitor MG132 (Inkubationdauer 2 h) gehemmt wird.
Vergleichbare Ergebnisse wurden mit dem humanisierten Antikörper 7H2HM erhalten (42C).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierter Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten, wobei der Antikörper und das funktionale Fragment in der Lage sind, sich an den humanen Rezeptor des Insulinähnlichen Wachstumsfaktors I (IGF-IR) zu binden, dadurch gekennzeichnet: – dass der Antikörper eine schwere Kette, welche die drei CDRs mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 8, 10 und 12 umfasst, und eine leichte Kette, welche die drei CDRs mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 2, 4 und 6 umfasst, umfasst; und – dass das funktionale Fragment unter den Fv-, Fab-, (Fab')₂-, Fab'-, scFv-, scFv-Fc-Fragmenten und den Diabodies ausgewählt wird und dass das Fragment die drei CDRs mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 8, 10 und 12 und die drei CDRs mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 2, 4 und 6 umfasst.
Mäuse-Hybridom nach Anspruch 1, welches bei der CNCM, Institut Pasteur, Paris, am 19. September 2001 unter der Nr. I-2717 hinterlegt worden ist.
Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er durch das Hybridom nach Anspruch 2 sekretiert wird.
Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten nach einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine leichte Kette mit einer Sequenz, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 54 umfasst, umfasst und dass er eine schwere Kette mit einer Sequenz, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 69 umfasst, umfasst.
Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein chimärer Antikörper ist und außerdem die konstanten Regionen der leichten Kette und der schweren Kette, welche von einem Antikörper von einer zu der Maus heterologen Spezies abgeleitet sind, umfasst.
Chimärer Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Spezies der Mensch ist.
Chimärer Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die konstanten Regionen der leichten Kette und der schweren Kette, die von einem humanen Antikörper abgeleitet sind, die Region kappa bzw. gamma-1, gamma-2 oder gamma-4 sind.
Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist und eine leichte Kette und/oder eine schwere Kette umfasst, in welchen die Gerüstsegmente FR1 bis FR4 der leichten Kette und/oder der schweren Kette jeweils von Gerüstsegmenten FR1 bis FR4 der leichten Kette und/oder der schweren Kette eines humanen Antikörpers abgeleitet sind.
Humanisierter Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine leichte Kette, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 61 oder 65 umfasst, umfasst und dass er eine schwere Kette, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 75, 79 oder 83 umfasst, umfasst.
Humanisierter Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine leichte Kette, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 65 umfasst, umfasst und dass er eine schwere Kette mit einer Sequenz, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 83 umfasst, umfasst.
Isolierte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter den folgenden Nukleinsäuren ausgewählt wird: a) einer Nukleinsäure, DNA oder RNA, welche einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 10 kodiert; b) einer Nukleinsäure, die zu einer Nukleinsäure, wie sie unter a) definiert wird, komplementär ist; c) einer Nukleinsäure mit wenigstens 18 Nukleotiden, welche in der Lage ist, unter Bedingungen hoher Stringenz mit wenigstens einer der CDRs mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 zu hybridisieren.
Vektor, welcher eine Nukleinsäure nach Anspruch 11 umfasst.
Wirtszelle, welche einen Vektor nach Anspruch 12 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) die Kultivierung einer Zelle nach Anspruch 13 in einem Kulturmedium und unter Kulturbedingungen, die geeignet sind; und b) die Gewinnung der so hergestellten Antikörper ausgehend von dem Kulturmedium oder den kultivierten Zellen.
Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 10 als Arzneimittel.
Zusammensetzung, welche als Wirkstoff eine Verbindung bestehend aus einem Antikörper oder einem von dessen funktionalen Fragmenten nach einem der Ansprüche 1, 3 bis 10 und 15 umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 16 als Arzneimittel.
Verwendung eines Antikörpers oder von einem von dessen funktionalen Fragmenten nach einem der Ansprüche 1, 3 bis 10 und 15 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 und 17 für die Herstellung eines Arzneimittels, das für die Verhütung oder für die Behandlung von Krebs bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Krebs eine Krebserkrankung ist, die unter Prostatakrebs, den Osteosarcomen, Lungenkrebs und Brustkrebs ausgewählt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Krebs aus dem Androgen-unabhängigen Prostatakrebs besteht.
In vitro-Verfahren zur Diagnose von durch eine Überexpression oder eine Unterexpression des IGF-IR-Rezeptors induzierten Erkrankungen ausgehend von einer biologischen Probe, bei welcher man ein abnormales Vorhandensein des IGF-IR-Rezeptors vermutet, dadurch gekennzeichnet, dass man die biologische Probe mit einem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 und 3 bis 10 in Kontakt bringt, wobei der Antikörper gegebenenfalls markiert sein kann.
Kit oder Zusammenstellung für das Ausführen eines Diagnoseverfahrens für Erkrankungen, die durch eine Überexpression oder Unterexpression des IGF-IR-Rezeptors induziert werden, oder für das Ausführen eines Verfahrens zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung einer Überexpression oder einer Unterexpression des IGF-IR-Rezeptors in einer biologischen Probe, vorzugsweise einer Überexpression des Rezeptors, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit oder die Zusammenstellung die folgenden Bestandteile umfasst: a) einen Antikörper oder eines von dessen funktionalen Fragmenten nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 10; b) gegebenenfalls die Reagenzien für die Zusammensetzung des für die immunologische Reaktion geeigneten Mediums; c) gegebenenfalls die Reagenzien, welche den Nachweis der durch die immunologische Reaktion erzeugten IGF-IR/Antikörper-Komplexe erlauben.