CN104928336B - 用于生产糖基化免疫球蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本文报道了用于生产免疫球蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：a)提供包含编码免疫球蛋白的核酸的真核细胞，b)在培养基中培养真核细胞，其中每时间单位培养基中可用的葡萄糖的量保持恒定，并限制在少于每时间单位培养基中细胞最大利用的量的80％，和c)从培养物中回收免疫球蛋白。

Description

用于生产糖基化免疫球蛋白的方法
本申请为2010年10月25日提交的、发明名称为“用于生产糖基化免疫球蛋白的方法”的PCT申请PCT/EP2010/066073的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2012年4月26日，申请号为201080048412.2。
本文报道在细胞中生产免疫球蛋白的领域的方法，从而可以基于培养条件修饰所生产的免疫球蛋白的糖基化模式。
发明背景
近年来免疫球蛋白的生产稳定增加并且在不久的将来，免疫球蛋白可能将成为多种疾病治疗可用的治疗法的最大组别。免疫球蛋白的影响源自其特异性，所述特异性包括其特异性的靶识别和结合功能以及与抗原/Fc受体结合的同时或之后特定效应的活化。
特异性的靶识别和结合由免疫球蛋白的可变区介导。产生效应的免疫球蛋白分子的其他部分是翻译后修饰，例如糖基化模式。翻译后修饰对免疫球蛋白的效力、稳定性、免疫原性潜力、结合等确实具有影响。在此，必须提及依赖于补体的细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和诱导凋亡。
已报道免疫球蛋白的糖基化模式，即附着的糖基结构的糖组成和数量对生物学性质具有强烈影响(参见例如Jefferis,R.,Biotechnol.Prog.21(2005)11-16)。由哺乳动物细胞生产的免疫球蛋白含有以质量计2-3％的碳水化合物(Taniguchi,T.等人，Biochem.24(1985)5551-5557)。例如，在G类免疫球蛋白(IgG)中，这等价于在小鼠来源的IgG中的2.3个寡糖残基(Mizuochi,T.等人，Arch.Biochem.Biophys.257(1987)387-394)和在人来源的IgG中的2.8个寡糖残基(Parekh,R.B.等人，Nature 316(1985)452-457)，其中一般地两个位于Fc区而剩余的位于可变区(Saba,J.A.等人，Anal.Biochem.305(2002)16-31)。
在G类免疫球蛋白的Fc区中，能够通过在297位的氨基酸残基的N-糖基化引入寡糖残基，所述氨基酸残基是天冬酰胺残基(被标注为Asn297)。Youings等人展示在15％至20％的多克隆IgG分子的Fab区中存在其他N-糖基化位点(Youings,A.等人，Biochem.J.,314(1996)621-630；还参见例如，Endo,T.等人，Mol.Immunol.32(1995)931-940)。由于非均一的(即不对称的)寡糖加工，存在具有不同糖基化模式的免疫球蛋白的多种同种型(Patel,T.P.等人，Biochem.J.285(1992)839-845；Ip,C.C.等人，Arch.Biochem.Biophys.308(1994)387-399；Lund,J.等人，Mol.Immunol.30(1993)741-748)。寡糖的结构和分布都同时是高度可重现的(即，非随机的)和位点特异性的(Dwek,R.A.等人，J.Anat.187(1995)279-292)。
免疫球蛋白的一些特征与Fc区的糖基化直接相关(参见例如Dwek,R.A.等人，J.Anat.187(1995)279-292；Lund,J.等人，J.Immunol.157(1996)4963-4969；Lund,J.,FASEB J.9(1995)115-119；Wright,A.和Morrison,S.L.,J.Immunol.160(1998)3393-3402)，例如热稳定性和溶解性(West,C.M.,Mol.Cell.Biochem.72(1986)3-20)、抗原性(Turco,S.J.,Arch.Biochem.Biophys.205(1980)330-339)、免疫原性(Bradshaw,J.P.等人，Biochim.Biophys.Acta 847(1985)344-351；Feizi,T.和Childs,R.A.,Biochem.J.245(1987)1-11；Schauer,R.,Adv.Exp.Med.Biol.228(1988)47-72)、清除率/循环半寿期(Ashwell,G.和Harford,J.,Ann.Rev.Biochem.51(1982)531-554；McFarlane,I.G.,Clin.Sci.64(1983)127-135；Baenziger,J.U.,Am.J.Path.121(1985)382-391；Chan,V.T.和Wolf,G.,Biochem.J.247(1987)53-62；Wright,A.等人，Glycobiology 10(2000)1347-1355；Rifai,A.等人，J.Exp.Med.191(2000)2171-2182；Zukier,L.S.等人，Cancer Res.58(1998)3905-3908)，和生物学比活性(Jefferis,R.和Lund,J.,in Antibody Engineering，Capra,J.D.编著，Chem.Immunol.Basel,Karger,65(1997)111-128)。
已研究了影响糖基化模式的因子，例如发酵基质中存在胎牛血清(Gawlitzek,M.等人，J.Biotechnol.42(2)(1995)117-131)、缓冲条件(Müthing,J.等人，Biotechnol.Bioeng.83(2003)321-334)、溶解氧浓度(Saba,J.A.等人，Anal.Biochem.305(2002)16-31；Kunkel,J.P.等人，J.Biotechnol.62(1998)55-71；Lin,A.A.等人，Biotechnol.Bioeng.42(1993)339-350)、寡糖的位置和构象以及宿主细胞类型和细胞生长状态(Hahn,T.J.和Goochee,C.F.,J.Biol.Chem.267(1992)23982-23987；Jenkins,N.等人，Nat.Biotechnol.14(1996)975-981)、细胞核苷酸-糖代谢(Hills,A.E.等人，Biotechnol.Bioeng.75(2001)239-251)、养分限制(Gawlitzek,M.等人，Biotechnol.Bioeng.46(1995)536-544；Hayter,P.M.等人，Biotechnol.Bioeng.39(1992)327-335)，特别地葡萄糖限制(Tachibana,H.等人，Cytotechnology 16(1994)151-157)，和胞外pH(Borys,M.C.等人，Bio/Technology 11(1993)720-724)。
通过在例如NS0骨髓瘤细胞中重组表达免疫球蛋白，已经观察到了增加的寡聚甘露糖结构以及截短的寡糖结构(Ip,C.C.等人，Arch.Biochem.Biophys.308(1994)387-399；Robinson,D.K.等人，Biotechnol.Bioeng.44(1994)727-735)。在葡萄糖饥饿的条件下，已经观察到CHO细胞、鼠3T3细胞、大鼠肝细胞瘤细胞、大鼠肾细胞和鼠骨髓瘤细胞中的糖基化变化，例如较小的前体寡糖的附着或完全缺少寡糖部分(Rearick,J.I.等人，J.Biol.Chem.256(1981)6255-6261；Davidson,S.K.和Hunt,L.A.,J.Gen.Virol.66(1985)1457-1468；Gershman,H.和Robbins,P.W.,J.Biol.Chem.256(1981)7774-7780；Baumann,H.和Jahreis,G.P.,J.Biol.Chem.258(1983)3942-3949；Strube,K.-H.等人，J.Biol.Chem.263(1988)3762-3771；Stark,N.J.和Heath,E.C.,Arch.Biochem.Biophys.192(1979)599-609)。Wong,D.C.F.等人，Biotechnol.Bioeng.89(2005)164-177报道了基于低谷氨酰胺/葡萄糖浓度的策略。
日本专利申请JP 62-258252报道了哺乳动物细胞的灌注培养物，而US 5,443,968报道了用于分泌蛋白质的细胞的补料-分批培养方法。在WO98/41611中，报道了使细胞适应特征是低乳酸生产的代谢状态的有效的细胞培养方法。WO 2004/048556中报道了为了生产物质而培养细胞的方法。Elbein,A.D.,Ann.Rev.Biochem.56(1987)497-534报道了当在缺少葡萄糖的条件下孵育时，哺乳动物细胞将含有甘露糖-5的结构而非含有甘露糖-9的结构转移到蛋白质。Takuma,S.等人，在Biotechnol.Bioeng.97(2007)1479-1488中报道了在葡萄糖限制的过程中，pCO2的依赖性对CHO细胞生长、代谢和IgG生产的影响。
概述
已发现基于培养方法中向细胞提供的葡萄糖的量，能够修改由真核细胞生产的多肽的糖基化模式中甘露糖-5糖基结构的量。通过降低可用的葡萄糖的量，例如通过将DGL值从1.0变为更小的值(例如0.8、0.6、0.5、0.4或0.2)，能够获得糖基化模式中甘露糖-5糖基结构量的改变。DGL值或每时间单位可用的葡萄糖的量必须分别保持恒定和处于每时间单位确定的降低的值。
本文报道的第一个方面是在真核细胞中生产多肽(在一个实施方案中是免疫球蛋白)的方法，所述方法包括下列步骤：
a)提供包含编码多肽的核酸的真核细胞，
b)在这样的条件下培养细胞，其中葡萄糖限制度(DGL)保持恒定且其中DGL少于0.8，和
c)从培养物中回收多肽，
其中，具有甘露糖-5糖基结构的多肽级分是包含具有甘露糖-5糖基结构的多肽的量、多肽G(0)同种型的量、多肽G(1)同种型的量和多肽G(2)同种型的量的总和的10％或更少。
在一个实施方案中，DGL在从0.8至0.2的范围内保持恒定。在其他实施方案中，DGL在从0.6至0.4的范围内保持恒定。在另一个实施方案中，具有甘露糖-5糖基结构的多肽级分是包含具有甘露糖-5糖基结构的多肽、多肽G(0)同种型、多肽G(1)同种型和多肽G(2)同种型的总和的8％或更少。仍然在另一个实施方案中，多肽是免疫球蛋白，在一个实施方案中是G或E类的免疫球蛋白。
本文报道的另一个方面是生产免疫球蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：
a)提供包含编码免疫球蛋白的核酸的哺乳动物细胞，
b)在培养基中培养细胞，其中，每时间单位培养基中可用的葡萄糖的量保持恒定，并限制为少于每时间单位培养基中细胞最大能够利用的量的80％，和
c)从细胞或培养基中回收免疫球蛋白。
在一个实施方案中，每时间单位培养基中可用的葡萄糖的量保持恒定，并限制为从80％至20％的范围内的值。在其他实施方案中，范围是从60％至40％。在另一个实施方案中，培养基中的细胞是培养基中的活细胞。
在本文报道的方面的一个实施方案中，真核细胞选自CHO细胞、NS0细胞、HEK细胞、BHK细胞、杂交瘤细胞、
Figure BDA0000755289720000051
细胞、昆虫细胞或Sp2/0细胞。在一个实施方案中，真核细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在本文报道的方面的另一个实施方案中，培养处在从约pH7.0至约pH 7.2的范围内的pH值下。
仍然在本文报道的方面的另一个实施方案中，培养是连续或补料-分批培养。在另一个实施方案中，方法可包括纯化多肽的最终步骤。仍然在另一个实施方案中，培养细胞6至20天，或6至15天。在其他实施方案中，培养细胞6至8天。
本文报道的另一个方面是包含免疫球蛋白的组合物，其中组合物已经由本文报道的方法制备。
在一个实施方案中，免疫球蛋白是抗IL-6R抗体。在其他实施方案中，抗IL-6R抗体包括Tocilizumab。在另一个实施方案中，附着于抗IL-6R抗体的甘露糖-5糖基结构是8％或更少。仍然在其他实施方案中，甘露糖-5糖基结构是6％或更少。在另一个实施方案中，甘露糖-5糖基结构是4％或更少。在其他实施方案中，附着于抗IL-6R抗体的G(0)糖基结构是在从40％至46％的范围内且附着于抗IL-6R抗体的G(2)糖基结构是在从9％至11％的范围内。
详细说明
本文报道了生产免疫球蛋白的方法，包括下列步骤：
a)以小于0.8的恒定DGL(即，每时间单位可用的葡萄糖的量是恒定的，并且是每时间单位细胞最大能够利用的葡萄糖的量的80％或更少)在培养基中培养包含编码免疫球蛋白的核酸的哺乳动物细胞，和
b)从细胞或培养基中回收免疫球蛋白。
使用本文报道的方法能够获得免疫球蛋白，其中具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的量取决于调整的DGL值，且其中量是具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的、和免疫球蛋白G(0)同种型的、免疫球蛋白G(1)同种型的和免疫球蛋白G(2)同种型的量的总和的级分。在一个实施方案中，DGL是从0.8至0.2。在此实施方案中级分是10％或更少。在另一个实施方案中，DGL是从0.6至0.4。在此实施方案中级分是6％或更少。使用本文报道的方法能够获得免疫球蛋白，其中具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的级分是包含具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的量、免疫球蛋白G(0)同种型的量、免疫球蛋白G(1)同种型的量和免疫球蛋白G(2)同种型的量的总和的10％或更少。在另一个实施方案中，级分是-在液相层析方法中测定的面积-％级分。在一个实施方案中，DGL维持在从0.8至0.2的范围内。在另一个实施方案中，DGL维持在从0.6至0.2的范围内。仍然在另一个实施方案中，DGL维持在从0.6至0.4的范围内。在一个实施方案中，基于至少五次培养测定的，每时间单位细胞最大能够利用的葡萄糖的量是在全部化合物都过量可用的培养中(即没有化合物限制细胞的生长)利用的葡萄糖的平均量。在一个实施方案中，级分是在培养的第七天测定的。
对于执行本发明有用的本领域技术人员已知的方法和技术描述于例如Ausubel,F.M.(编著)，Current Protocols in Molecular Biology，卷I至III(1997),Wiley和Sons；Sambrook,J.等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；Glover,N.D.(编著)，DNACloning:A Practical Approach，卷I至II(1985)；Freshney,R.I.(编著)，Animal CellCulture(1986)；Miller,J.H.和Calos,M.P.(编著)，Gene Transfer Vectors forMammalian Cells,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1987)；Watson,J.D.等人，Recombinant DNA，第二版，N.Y.,W.H.Freeman and Co(1992)；Winnacker,E.L.,From Genes to Clones,N.Y.,VCH Publishers(1987)；Celis,J.(编著)，Cell Biology，第二版，Academic Press(1998)；Freshney,R.I.,Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Techniques，第二版，Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
使用重组DNA技术使得能够生产多肽的多种衍生物。例如能够通过取代、改变或交换于单个或若干个氨基酸位置修饰此类衍生物。例如能够通过定向诱变的手段进行衍生化。本领域技术人员能够容易地进行此类变化(Sambrook,J.等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA(2001)；Hames,B.D.和Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization-a practicalapproach(1985)IRL Press,Oxford,England)。
术语“核酸”表示天然存在或部分或完全非天然存在的编码多肽的核酸分子。核酸可以是由分离的或通过化学手段合成的DNA片段的累积。能够将核酸整合到另一个核酸中，例如在表达质粒或真核细胞的基因组/染色体中。术语“质粒”包括穿梭和表达质粒。一般地，质粒还将包含原核增殖单位，所述原核增殖单位包含分别用于原核细胞中质粒的复制和选择的复制起点(例如，ColE1复制起点)和可选择标志物(例如，氨苄青霉素或四环素抗性基因)。对于本领域技术人员而言，将氨基酸序列(例如，多肽的)转化为编码各自的氨基酸序列的对应的核酸的程序和方法是普遍已知的。因此，核酸由以单个核苷酸组成的其核酸序列并且同样地由由此编码的多肽的氨基酸序列表征。
术语“表达盒”表示含有对于至少含有的结构基因在细胞内/从细胞中表达必须的和分泌任选的元件(例如启动子、多聚腺苷酸位点，和3’-和5’-非翻译区)的核酸，。
术语“基因”表示例如染色体或质粒上的区段，所述区段是多肽的表达必需的。除编码区外，基因包含其他功能元件，包括启动子、内含子和一个或多个转录终止子。“结构基因”表示不含信号序列的基因的编码区。
术语“表达”表示细胞内结构基因的转录和翻译。能够基于细胞内存在的相应mRNA的量测定细胞内的结构基因的转录水平。例如，能够通过PCR或通过Northern杂交定量从选定的核酸转录的mRNA(参见例如，Sambrook等人(见上文))。能够通过多种方法【例如通过ELISA，通过测定多肽的生物学活性，或者通过采用使用识别和结合多肽的抗体的不依赖于此类活性的方法(例如Western印迹或放射性免疫测定)(参见例如，Sambrook等人(见上文))】定量由核酸编码的多肽，。
术语“细胞”表示已导入编码多肽的核酸的细胞，所述多肽在一种实施方案中是异源多肽。术语“细胞”包括用于质粒/载体增殖的原核细胞，以及用于结构基因表达的真核细胞。在一个实施方案中，用于表达免疫球蛋白的真核细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，哺乳动物细胞选自CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、BHK细胞、
Figure BDA0000755289720000081
细胞和杂交瘤细胞。此外真核细胞能够选自昆虫细胞，例如蠋细胞(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、sf细胞)、果蝇细胞(黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster))、蚊细胞(埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(Ades albopictus))和蚕细胞(家蚕(Bombyx Mori))等。
术语“多肽”表示通过肽键连接的氨基酸残基的多聚物，不论是天然生产还是合成生产的。少于约20个氨基酸残基的多肽可称为“肽”。多于100个氨基酸残基的多肽或者包含一个以上多肽的共价和非共价聚合物可称为“蛋白质”。多肽可包含非氨基酸的组分，例如碳水化合物基团。非氨基酸的组分可以被生产多肽的细胞添加到多肽上，并可随细胞类型而改变。本文以N至C末端方向根据它们的氨基酸序列定义多肽。其添加物，例如碳水化合物基团，一般不进行说明，但仍然可能存在。
术语“异源DNA”或“异源多肽”表示在给定细胞内天然不存在的DNA分子或多肽，或DNA分子的群体或多肽群体。对特定细胞异源的DNA分子可含有源自细胞的种类的DNA(即内源DNA)，只要DNA与非宿主DNA(即，外源DNA)组合。例如，认为含有与细胞的DNA区段(例如，包含启动子的)有效连接的非细胞DNA区段(例如编码多肽的)的DNA分子是异源的DNA分子。同样的，异源DNA分子能够包含与外源启动子有效连接的内源结构基因。由异源DNA分子编码的多肽是“异源”多肽。
术语“表达质粒”表示包含至少一个编码待表达的多肽的结构基因的核酸。一般地，表达质粒包含原核质粒增殖单元(包括复制起点和选择标志物(例如用于大肠杆菌的))，真核选择标志物，一个或多个用于表达目标结构基因的表达盒，所述表达盒每个依次包含启动子、至少一个结构基因，和包括多聚腺苷酸信号的转录终止子。基因表达通常处于启动子的控制下，并且此类结构基因是待与启动子“有效连接”的。相似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子是有效连接的。
术语“分离的多肽”表示基本没有相连的细胞成分(例如不与多肽共价相连的碳水化合物、脂类或其他蛋白质或非蛋白质杂质)的多肽。一般地，在某些实施方案中，分离的多肽的制备物含有高度纯化形式的多肽，即，至少约80％纯，至少约90％纯，至少约95％纯，大于95％纯，或大于99％纯。显示特定蛋白质制备物含有分离的多肽的一种方式是通过制备物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和凝胶的考马斯亮蓝染色后的单条带的外观。然而，术语“分离的”并不排除以备选的物理形式(例如二体)或备选地糖基化或衍生化形式存在相同多肽。
一般将免疫球蛋白分为五个不同类：IgA(A类免疫球蛋白)、IgD、IgE、IgG和IgM。在这些类别之间，免疫球蛋白的整体结构和/或氨基酸序列不同，但具有相同的构造块。完整的免疫球蛋白由两对多肽链组成，每对包含免疫球蛋白轻多肽链(简称：轻链)和免疫球蛋白重多肽链(简称：重链)。链依次包含可变区和恒定区。在轻链中，两个区都由一个结构域组成，而在重链中，可变区由一个结构域组成而恒定区包含最多5个结构域(按N至C末端的方向)：CH1-结构域、任选的铰链区结构域、CH2-结构域、CH3-结构域和任选的CH4-结构域。免疫球蛋白能够被分解为Fab和Fc区。完整的轻链、重链可变结构域和CH1-结构域被称为Fab区(片段抗原结合区)。Fc区包含CH2-、CH3-以及任选地CH4-结构域。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”表示由一个或多个多肽组成的蛋白质。编码免疫球蛋白的基因包括不同的恒定区基因以及大量的免疫球蛋白可变区基因。在一个实施方案中，术语“免疫球蛋白”包含单克隆抗体及其片段，例如分离的重链，或重链恒定区，以及至少包含免疫球蛋白重链CH2-结构域的融合多肽。在本文报道的方法的一个实施方案中，免疫球蛋白是完整的免疫球蛋白，在另一个实施方案中，免疫球蛋白是完整免疫球蛋白的Fc区。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。
术语“免疫球蛋白片段”表示至少包含免疫球蛋白δ、ε或α重链的CH2-结构域，和/或免疫球蛋白ε或δ重链的CH3-结构域的多肽。还涵盖了其衍生物和变体，其中CH2-或CH3-结构域中的N-糖基化基序Asn-Xaa-Ser/Thr没有改变。
术语“免疫球蛋白缀合物”表示与非免疫球蛋白多肽融合的、至少包含免疫球蛋白δ、ε或α重链的CH2-结构域，和/或免疫球蛋白ε或δ重链的CH3-结构域的多肽。其中CH2-或CH3-结构域中的N-糖基化基序Asn-Xaa-Ser/Thr没有改变。
附着于免疫球蛋白重链的CH2-结构域的Asn297(IgG、IgE)或Asn263(IgA)和/或CH3-结构域的Asn394、Asn445或Asn496(IgE、IgD)的寡糖具有二分支结构(Mizuochi,T.等人，Arch.Biochem.Biophys.257(1987)387-394)，即它们由在末端GlcNAc残基具有任选的Fuc(α1-6)连接的核心结构
Man(α1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc→Asn
组成。两条外臂与核心结构的末端甘露糖连接，所述核心结构具有通式：
Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-6)→Man，和
Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)→Man，
其中，末端的半乳糖残基是任选的(Man＝甘露糖、GlcNAc＝N-乙酰葡萄糖、Gal＝半乳糖、Fuc＝果糖)。
表1：免疫球蛋白的糖基化位点
免疫球蛋白类 能够附着糖基结构的残基
IgG Asn 297
IgE Asn 255、Asn 297、Asn 361、Asn 371、Asn 394
IgA Asn 263、Asn 459
IgD Asn 445、Asn 496
IgM Asn 395
术语“免疫球蛋白G(0)同种型的量、免疫球蛋白G(1)同种型的量，和免疫球蛋白G(2)同种型的量”表示与免疫球蛋白的天冬酰胺(Asn)N-连接的不同的、异源的、二分支寡糖的量的总和。G(2)同种型在寡糖结构的每条外臂上具有末端半乳糖残基，G(1)同种型只在(α1-6)或(α1-3)连接的外臂上具有半乳糖残基，而G(0)同种型在两条外臂上都没有半乳糖残基。
术语“甘露糖-5糖基结构”表示与多肽的Asn残基连接的寡甘露糖结构，包含或由5个甘露糖残基和两个N-乙酰葡萄糖核心残基组成，形成三分支结构。
本文报道的一个方面是生产免疫球蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：
a)在培养基中培养包含编码免疫球蛋白的一种或多种核酸的真核细胞，优选哺乳动物细胞，其中，培养基中每时间单位可利用的葡萄糖的量保持恒定，且限制在少于每时间单位内培养的真核细胞最大可利用的量的80％的值，和
b)从细胞或培养基中回收免疫球蛋白并从而生产免疫球蛋白。
使用该方法获得最多包含10％的具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的免疫球蛋白。10％是基于具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的量、免疫球蛋白G(0)同种型的量、免疫球蛋白G(1)同种型的量，和免疫球蛋白G(2)同种型的量的总和计算的。
术语“葡萄糖限制度”及其缩写“DGL”在本文中可互换使用，表示培养中单个细胞当前的比葡萄糖消耗速率与单个细胞或相同种的单个细胞已知的最大比葡萄糖消耗速率的比例。葡萄糖限制度定义为
Figure BDA0000755289720000121
其中，qGlc＝单个细胞当前的比葡萄糖消耗速率；
qGlc最大＝该单个细胞或相同种的单个细胞已知的最大比葡萄糖消耗速率。
DGL能够在DGL维持和1之间变化，而DGL维持(<1且>0)表示完全的生长限制且1表示无限制或完全葡萄糖过量。
将糖基结构导入多肽(例如免疫球蛋白)是翻译后修饰。由于各细胞糖基化过程的不完全性，所获得的每个表达的多肽都具有包含不同糖基结构的糖基化模式。因而，多肽是以包含相同多肽(即，具有相同的氨基酸序列)的不同糖基化形式的组合物的形式，从表达它的细胞获得的。各个糖基结构的总和表示为糖基化模式，包含例如具有完全缺失糖基结构，不同地加工的糖基结构和/或不同组成的糖基结构的多肽。
一种糖基结构是甘露糖-5糖基结构(也称为高甘露糖、Man5、M5或寡甘露糖)。已报道，重组生产的具有甘露糖-5糖基结构的多肽的级分随延长的培养时间或在葡萄糖饥饿条件下增加(Robinson,D.K.等人，Biotechnol.Bioeng.44(1994)727-735；Elbein,A.D.,Ann.Rev.Biochem.56(1987)497-534)。
已发现能够基于培养过程中向细胞提供的葡萄糖的量修改真核细胞生产的多肽的糖基化模式中的甘露糖-5糖基结构的量。已发现，通过降低葡萄糖的量，即通过将DGL值从1.0改变为更小的值，例如0.8、0.6、0.5、0.4或0.2，能够获得糖基化模式中甘露糖-5糖基结构的量的修改。在一个实施方案中，DGL值以一定范围内的值(例如从0.8至0.2，或从0.6至0.4)保持恒定。换言之，能够在这样的条件下实施多肽(在一个实施方案中是免疫球蛋白)的生产，其中为了获得糖基化模式中具有确定量的甘露糖-5糖基结构的多肽，培养的细胞可获得受限制的葡萄糖量。已发现，用每时间单位细胞(在一个实施方案中是对数生长细胞)最大可利用的葡萄糖的量的80％或更少的每时间单位可利用的葡萄糖的量(即0.8或更低的DGL)的培养产生具有糖基化模式的多肽，其中与用1.0的DGL的培养相比甘露糖-5糖基结构的量是改变的。在一个实施方案中，细胞密度是活细胞密度。此外，所获得的多肽产量增加。
术语“每时间单位细胞最大可利用的葡萄糖的量”表示在没有任何养分限制的培养中，在对数生长期最佳生长条件下单个细胞每时间单位最多消耗或利用或代谢的葡萄糖的量。因而，可以通过测定在没有任何养分限制的培养中，在对数生长期最佳生长条件下细胞每时间单位代谢的葡萄糖的量，来测定每时间单位细胞最大利用的葡萄糖的量。进一步增加可利用的葡萄糖的量将不会再增加(即，改变)每时间单位细胞最大可利用的葡萄糖的量。该量定义了单个细胞的葡萄糖消耗的最大水平。这不表示遗传修饰的细胞类型不具有甚至更高的葡萄糖消耗的最大水平。备选地能够基于以前的培养和监控数据测定每时间单位细胞最大可利用的葡萄糖的量。
本文报道的方法执行特别简单，涉及最少的测量和控制工作，并特别经济。
在没有限制例如不充分的养分供应的条件下，培养的细胞以不经济的方式按最大速率生长和消耗养分。一种被消耗的培养基养分是葡萄糖，其被培养的细胞代谢从而产生能量以及细胞代谢的结构单元。过量葡萄糖存在时，细胞代谢以最大的葡萄糖转化率进行。例如能够从用或在相同的培养条件下(也将用于具有受限制的葡萄糖的培养中(即，用小于细胞能够利用的量的每时间单位可用的葡萄糖的量)培养的过量葡萄糖存在时对数生长细胞的葡萄糖消耗，来测定每时间单位细胞最大能够利用的葡萄糖量。可以通过在固定的时间范围开始和结束时测定细胞密度和葡萄糖浓度容易地计算此最大量。此值通常在从0.006至190mmol/小时/109细胞的范围内(Baker,K.N.等人，Biotechnol.Bioeng.73(2001)188-202；WO 98/41611；Müthing,J.等人，Biotechnol.Bioeng.83(2003)321-334；WO2004/048556)。在一个实施方案中，在pH 7.0的标准方法条件下，qGlc最大是约0.142mmol/小时/109细胞。
在一个实施方案中，本文报道的方法是在这样的条件下实施，其中每时间单位可用的葡萄糖的量保持恒定，并处于每时间单位细胞最大可利用的葡萄糖量的80％或更少(0.8≥DGL>0)，在一个实施方案中，可用的葡萄糖的量保持恒定并处于60％或更少(0.6≥DGL>0)，在另一个实施方案中，处于50％或更少(0.5≥DGL>0)，仍然在另一个实施方案中，处于约40％。术语“约”在本申请中用于表示值不是确切的值，其仅是范围的中间点，其中值能够变化至多10％，即，术语“约40％”表示从44％至36％的范围(DGL＝0.44-0.36)。
在一个实施方案中，培养使用在每时间单位细胞最大可利用的葡萄糖量的80％和10％之间的范围内(0.8≥DGL≥0.1)保持恒定的每时间单位可利用的葡萄糖的量。在另一个实施方案中，可用的葡萄糖的量在60％和10％之间的范围内(0.6≥DGL≥0.1)保持恒定。在其他实施方案中，可用的葡萄糖的量在50％和10％之间的范围内(0.5≥DGL≥0.1)保持恒定。在另一个实施方案中，可用的葡萄糖的量在45％和20％之间的范围内(0.45≥DGL≥0.2)保持恒定。在另一个实施方案中，可用的葡萄糖的量保持在80％和60％之间(0.8≥DGL≥0.6)。
在一个实施方案中，方法包括在DGL保持恒定且为约0.4的值的条件下培养细胞的步骤，而培养包括以1.0至0.5之间的DGL开始，降低DLG至约0.4的值，并且之后保持DGL恒定。在一个实施方案中，降低DGL是在100个小时的时间段内。术语“保持DGL恒定”及其语法等价形式表示在时间段内维持DGL值，即，DGL值的变化在值的10％以内(参见例如，图2)。
在生产后直接回收或在细胞分解后回收免疫球蛋白。在一个实施方案中，回收的免疫球蛋白是使用本领域技术人员已知的方法纯化的。不同的方法是良好确立的，并广泛用于蛋白质纯化，例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(例如，阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合型交换)、嗜硫吸附(例如，β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳香族吸附层析(例如，使用苯基-琼脂糖、aza-arenophilic树脂或m-氨基苯硼酸)、金属螯合亲和层析(例如，使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、尺寸排阻层析和电泳方法(例如，凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
例如，免疫球蛋白的纯化方法一般包括多步骤的层析部分。在第一个步骤中，通过亲和层析(例如用蛋白A或G)分离非免疫球蛋白的多肽和免疫球蛋白级分。之后，能够实施例如离子交换层析，来分离单个免疫球蛋白类别，并去除从第一柱上共同洗脱的痕量蛋白A。最后使用层析步骤以分离免疫球蛋白单体和同一类别的多聚体和片段。
一般的层析方法及其用途是本领域技术人员已知的。参见例如Heftmann,E.(编著)，Chromatography，第5版，Part A:Fundamentals and Techniques,Elsevier SciencePublishing Company,New York,(1992)；Deyl,Z.(编著)，Advanced Chromatographic andElectromigration Methods in Biosciences,Elsevier Science BV,Amsterdam,TheNetherlands,(1998)；Poole,C.F.和Poole,S.K.,Chromatography Today,ElsevierScience Publishing Company,New York(1991)；Scopes,R.K.,Protein Purification:Principles and Practice(1982)；Sambrook,J.等人(编著)，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2001)；或Ausubel,F.M.等人(编著)，Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.,New York(1990)。
在一个实施方案中，回收的免疫球蛋白是由相对于群体的量的具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的量表征的，所述群体是具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白、免疫球蛋白G(0)同种型、免疫球蛋白G(1)同种型和免疫球蛋白G(2)同种型的量的总和。使用本文报道的方法，在一个实施方案中具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的量是群体的10％或更少，在另一个实施方案中是群体的8％或更少，并且在另一个实施方案中是群体的6％或更少。
在某些实施方案中，本文报道的方法可以作为连续培养、补料-分批培养或其组合实施，例如以补料-分批培养开始，之后转变为连续培养。此外，可以以不同的方式实施本文报道的方法。例如，在一个实施方案中，在用DGL值小于1.0的条件下，即，在例如可用的葡萄糖的量是每单位时间内培养的细胞最大可利用的葡萄糖的量的80％或更少的条件下培养之前，培养使用过量的葡萄糖，即，1.0的DGL值。在另一个实施方案中，用包含在标准培养基中的葡萄糖的量开始培养，例如在1和10g/l培养基之间，从而例如获得预定的细胞密度，如在一个实施方案中是105细胞/ml。在其他实施方案中，培养是开始于存在过量的葡萄糖的条件下，即，1.0的DGL，并且每时间单位添加葡萄糖的量，其为培养的细胞每时间单位最大可利用的葡萄糖的量的80％或更少。在另一个实施方案中，一旦培养基中存在的葡萄糖的量下降至或低于培养中预定的值，则开始补料。在后两种情况下，通过培养中的细胞的代谢降低培养物中可用的葡萄糖的量。
在一个实施方案中，在本文报道的方法中，每时间单位可利用的或添加的并且少于最大能够利用的葡萄糖的量的葡萄糖的量保持相同值，即，保持恒定。例如，如果可获得每时间单位最大能够利用的葡萄糖量的50％的量，则此量在实施受限制的葡萄糖补料的方法的所有单位时间中都是可用的。应指出此值是相对值。但是，由于在培养过程中活细胞密度改变(即，其在开始时增加，达到最大值，并之后再下降)，可用的葡萄糖的绝对量相应地改变，因为其是取决于绝对活细胞密度的相对值。由于相对值保持恒定(即，处于例如80％)而绝对参照值改变(即，例如增加的活细胞密度)，相对的绝对值也改变(即，增加值的80％也是增加的)。
术语“每时间单位”表示固定的时间范围，例如1分钟、1小时、6小时、12小时或24小时。在一个实施方案中，时间单位是12小时或24小时。术语“每时间单位可利用的葡萄糖的量”在本申请中用于表示1)在固定的时间范围开始时，培养的培养基中含有的葡萄糖的量和2)在时间单位期间添加的(即补料的)葡萄糖的量的总和。因而，向细胞培养基中(例如，培养容器中)添加一定量的葡萄糖，其将固定时间范围开始时培养基中的葡萄糖的量增加至预定量。该量的葡萄糖可以作为例如溶解在水中、溶解在缓冲液中、或溶解在养分基质中的固体来添加，而水和缓冲液将不含有葡萄糖。将添加的葡萄糖的量对应于将利用的葡萄糖的量减去培养容器的基质中存在的葡萄糖的量。添加葡萄糖的量过程能够按单次添加、按多次小的、相等的级分添加，或按在如前所述的时间单位期间连续添加来实施。
本文报道的方法适合任何种类的培养和任何培养规模。例如，在一个实施方案中，方法用于连续或补料-分批方法；在另一个实施方案中，培养体积是从100ml到至多50,000l，在另一个实施方案中，是从100l至10,000l。本文报道的方法对于生产含10％或更少，或8％或更少，或6％或更少的具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的免疫球蛋白是有用的。在一个实施方案中，免疫球蛋白是免疫球蛋白G或E。本文报道的方法包括真核细胞，其中细胞依次包含编码免疫球蛋白的重链或其片段的核酸以及编码免疫球蛋白的轻链或其片段的核酸。在一个实施方案中，真核细胞选自CHO细胞、NS0细胞、BHK细胞、杂交瘤细胞、
Figure BDA0000755289720000171
细胞、Sp2/0细胞、HEK细胞和昆虫细胞。
本领域技术人员熟知除葡萄糖量外的不同细胞最佳生长所需的培养基组合物和组分以及养分浓度，并可为细胞培养选择恰当的培养基(参见例如，Mather,J.P.等人，inEncyclopedia of Bioprocess Technology:Fermentation,Biocatalysis,andBioseparation,卷2(1999)777-785)。
在一个实施方案中，根据本文报道的方法，通过用在培养的某个时间点在培养容器中通常能够达到的活细胞密度乘以培养容器的体积和每时间单位对数生长的细胞最大能够利用的葡萄糖的量以及通过预计的DGL计算培养中细胞必须可用的葡萄糖的量。更详细地，根据在实际的时间点之前的培养中葡萄糖浓度的进程和培养中细胞密度的进程，预测葡萄糖浓度和细胞密度的未来进程。利用该预测，用下列公式计算达到预计的DGL应向培养中添加的葡萄糖的量：
(待添加的葡萄糖(pg葡萄糖/ml/h)＝
(当前的细胞密度(细胞/ml)x
(细胞的最大葡萄糖消耗速率(pg葡萄糖/细胞/h))x
(DGL值)-
培养容器中的培养基中存在的葡萄糖的量。
在一个实施方案中，培养的pH值是在pH 6.5和pH 7.8之间。在另一个实施方案中，pH值是在pH 6.9和pH 7.3之间。在其他实施方案中，pH值是在pH 7.0和pH 7.2之间。如实施例1所列出的，发现在恒定的补料方法中，相比7.2的pH值，受限制的葡萄糖补料与7.0的pH值组合能够将M5含量有效地调节至定义的值，即，低于8％。分别在7.0或7.2的pH值的补料-分批方法的培养中，发现使用DGL控制方法能够将M5含量调节至小于5.5％。已发现随着培养的pH值降低，能够阻止由于DGL值降低造成的M5量的增加。
在一个实施方案中，培养是在27℃和39℃之间的温度下实施的，在另一个实施方案中，是在35℃和37.5℃之间。
使用本文报道的方法，能够生产含有糖基结构的任何多肽，例如免疫球蛋白、干扰素、细胞因子、生长因子、激素、纤溶酶原激活物、促红细胞生成素等。
可以使用用于哺乳动物细胞培养的任何搅拌或振荡培养装置，实施本文报道的方法中的培养，例如发酵罐型培养装置、气升型培养装置、培养瓶型培养装置、旋转瓶型培养装置、微载体型培养装置、流化床型培养装置、中空纤维型培养装置、滚瓶型培养装置或填充床型培养装置。
在一个实施方案中，本文报道的方法实施至多达15天。在另一个实施方案中，培养6至15天。在一个实施方案中，免疫球蛋白是抗IL-6R抗体。
如例如EP 0 409 607、EP 0 628 639、US 5,670,373或US 5,795,965中报道的(以其整体引入作为参考)，用针对人白介素-6受体的抗体示例本文报道的方法，因为在本发明时，本实验室可获得足量的该抗体和表达该抗体的细胞系。而并非意在限制本发明的范围。
下列实施例和附图用于帮助理解本发明，实际的范围在所附权利要求中提出。应理解，能够在不脱离本发明实质的条件下对所述方法进行修饰。
附图说明
图1使用DGL控制的补料-分批模式中的活细胞密度(a)和细胞活力谱(b)；空心圆圈：8x105细胞/ml的初始细胞密度；实心三角：10x105细胞/ml的初始细胞密度；空心方块：12x105细胞/ml的初始细胞密度。
图2免疫球蛋白生产的补料-分批模式中的DGL的时程；圆圈：8x105细胞/ml的初始细胞密度；三角：10x105细胞/ml的初始细胞密度；方块：12x105细胞/ml的初始细胞密度。
图3在免疫球蛋白生产的补料-分批模式中基于DGL的补料谱；圆圈：8x105细胞/ml的初始细胞密度；三角：10x105细胞/ml的初始细胞密度；方块：12x105细胞/ml的初始细胞密度。
图4在DGL控制中补料-分批模式的免疫球蛋白生产谱；空心圆圈：8x105细胞/ml的初始细胞密度；实心三角：10x105细胞/ml的初始细胞密度；空心方块：12x105细胞/ml的初始细胞密度；实心小圆圈：恒定补料方法：FR＝0.02g葡萄糖/h(对照)
图5细胞的补料-分批培养中DGL的时程：菱形：单次补料每天补料；方块：双次补料每天补料；三角：单次补料谱补料；X：双次补料谱补料
实施例
材料和方法
细胞系：
示例性的CHO细胞系是包含编码根据EP 0 409 607和US 5,795,965的抗IL-6受体抗体的核酸的CHO细胞系，所述示例性的CHO细胞系中重组生产的免疫球蛋白的甘露糖-5糖基结构的量可以被修改。为了培养重组CHO细胞，能够使用任何培养基，只要能够实施根据本发明方法的葡萄糖补充。示例性的培养基是IMDM、DMEM或Ham’s F12基质或其组合，所述培养基已经被改造适合于本文报道的方法所采用的培养基组分与葡萄糖的质量比。也能从培养基中排除葡萄糖并将其分别添加到培养中。
培养：
在1l或2l发酵容器中培养表达抗IL-6R抗体的CHO细胞。补料培养基含有15至40g/l葡萄糖。能够用含有例如400g/l葡萄糖的单独的浓缩溶液补料葡萄糖。在从pH 7.0至pH7.2的范围内的pH值下实施培养。
测定糖基结构：
为了分析IgG糖基化模式，使用根据Kondo等人(Kondo,A.等人，Agric.Biol.Chem.54(1990)2169-2170)的方法。使用小规模的蛋白A柱，从培养基的离心的上清液中纯化IgG。使用N-糖苷酶F(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)释放并在还原末端用2-氨基吡啶标记纯化的IgG的寡糖。通过逆向层析(HPLC)分析被标记的寡糖。通过质谱和标准将每个峰分配给寡糖。
葡萄糖测定：
使用YSI 2700SELECTTM分析仪(YSI，Yellow Springs，OH,美国)，用根据生产商手册的方法测定葡萄糖浓度。
活细胞密度测定：
使用自动图像处理和分析系统(
Figure BDA0000755289720000201
Innovatis,德国)以及台盼蓝染料排出方法，测定活细胞密度。
实施例1：DGL控制和pH对抗体生产和甘露糖-5糖基结构(M5)含量的作用
使用生产人源化抗人IL-6受体的抗体(Tocilizumab，
Figure BDA0000755289720000202
)的CHO细胞株进行测试，所述抗体是根据日本未审查专利公开号99902/1996的参照实施例2中描述的方法，通过使用如国际专利申请公开号WO 92/19759(对应US 5,795,965、US 5,817,790和US 7,479,543)的实施例10中报道的人延伸因子Iα启动子制备的。
在恒定的绝对量补料方法中，观察到了pH控制对免疫球蛋白生产的作用。表2显示了在恒定补料模式中，pH控制对抗体寡糖生产和M5含量的作用。
表2：pH控制在恒定绝对量补料模式中的作用
Figure BDA0000755289720000211
在pH 7.0时，甘露糖-5糖基结构(M5)的量被调节为少于5.5％。由于细胞密度的改变，DGL值从0.80下降至0.21。另一方面，在pH 7.2时，M5的量在8.7％和25.2％之间波动，并且高于pH 7.0时的量。pH 7.2时的DGL值从0.73变化到0.25。此外，在此情况下，pH 7.2时免疫球蛋白产量大于120％(与pH 7.0时相比较的相对值)。在恒定的绝对量补料方法中较高的免疫球蛋白生产诱导多于8％的更高的M5含量。因此，在恒定的绝对量补料方法中，相比pH 7.2控制方法，使用pH 7.0控制能够将M5含量有效地调节至较低的值，即，低于8％。
DGL控制方法(＝恒定的相对量补料方法)也用于多种pH值下的补料-分批模式的免疫球蛋白生产，并且分析M5含量。表3显示了在第2-3天补料开始后DGL控制和pH对免疫球蛋白生产和M5含量的作用。
表3：DGL和pH控制在补料-分批模式中的作用
No. 第[天]的样品 pH设定点 DGL 相对抗体浓度[％] M5含量[％]
1 7 7.0 0.8 102.7 2.9
2 7 7.0 0.6 96.2 2.7
3 7 7.0 0.4 100.0 3.3
4 7 7.0 0.3 91.1 3.9
5 7 7.0 0.2 83.0 4.0
6 7 7.2 0.6 100.9 4.4
7 7 7.2 0.4 90.1 5.3
在pH 7.0时，在从0.2至0.8的DGL范围内应用DGL控制方法。其结果是，将M5含量调节在等于或小于4.0％。另一方面，在pH 7.2时，操纵DGL值在从0.4至0.6的范围内。此时，M5含量能够控制在小于5.5％。
实施例2：用不同的DGL值培养
用不同的DGL值实施包含编码抗IL-6R抗体的核酸的CHO细胞的培养。结果总结在下表4中。
表4：DGL控制值对免疫球蛋白生产和M5含量的作用
Figure BDA0000755289720000221
与恒定补料相比，显示DGL值为0.4至0.6的受控制的DGL策略具有降低的甘露糖-5含量。
实施例3：用不同的补料策略培养
用一种DGL值，但用不同的补料策略实施包含编码抗IL-6R抗体的核酸的CHO细胞的培养。结果总结在下表5中。
表5：补料策略对活力和活细胞密度的作用
Figure BDA0000755289720000231
在单次补料实验中，使用含有全部养分和葡萄糖的单次补料。在双次补料实验中，使用两次补料：第一次补料含有全部养分和15g/l的低浓度葡萄糖，而第二次补料含有高浓度葡萄糖。这些不同的补料实验以下述方式实施：在一个组中每天调整补料速率而在另一组中遵循基于较早培养中活细胞密度发展记录的预先确定的谱。由表5可见，活力和活细胞密度可比较地不依赖于使用的补料策略。
实施例4：补料-分批模式的免疫球蛋白生产的葡萄糖限制度(DGL)控制
如前所述，在无血清培养基中接种CHO细胞(8.0–12x105细胞/ml)。在37℃、98％相对湿度和10％CO2大气压中生长细胞。在补料-分批培养中，在从开始培养的第2或第3天，开始向主发酵罐中补料含有葡萄糖的补料培养基。根据美国专利申请公开号US 2006/0127975 A1，补料策略遵循控制葡萄糖限制度(DGL)的方法。DGL可定义为观察到的比葡萄糖消耗速率与这些细胞可自由利用葡萄糖时的已知的最大比葡萄糖消耗速率的比值(DGL＝Q(glc)/Q(glc)最大，其中Q(glc)＝当前观察到的比葡萄糖消耗速率；Q(glc)最大＝这些细胞最大已知的比葡萄糖消耗速率)。
图1显示了培养的活细胞密度和细胞活力谱。在图2所示的多种细胞密度中，将DGL控制在0.4-0.5的值。依赖于那时的细胞密度，每天改变补料速率一次或两次。图3显示了补料-分批模式的基于DGL的补料谱。根据细胞密度，补料速率在0.8和1.6ml/h之间变化。用所应用的此补料对策，获得如图4所示的免疫球蛋白生产谱。如表6所示(补料速率为0.02g葡萄糖/h)，使用10x105细胞/ml和12x105细胞/ml的接种规模，免疫球蛋白生产几乎相同，并且多于在恒定补料方法中第七天免疫球蛋白生产的120％。尽管初始细胞密度有20％的差异，使用DGL控制方法获得几乎相等的免疫球蛋白效价是可能的。此外，当接种规模设定为8.0x105细胞/ml时，尽管补料起点的20个小时的延迟，第7天获得的免疫球蛋白多于110％(相对值)。在这些结果中，DGL控制方法能够在多种接种规模实现稳定的免疫球蛋白生产。
实施例5：DGL控制对甘露糖-5糖基结构和寡糖的半乳糖基化的作用
分析使用DGL控制的补料-分批培养所生产的免疫球蛋白的糖基化模式。表6显示，相比恒定补料方法(补料速率：0.02g葡萄糖/h)，从控制DGL的补料-分批培养获得的免疫球蛋白的寡糖分析的结果。在8.0x105细胞/ml的接种规模下，甘露糖-5糖基结构(M5)的含量是2.8％。在10x105细胞/ml和12x105细胞/ml的接种规模下，M5的含量分别是4.1％和3.8％。在全部培养条件下，DGL控制方法能够将M5的含量调节至少于5.0％。
同时，在每个条件下，分别将免疫球蛋白G(0)同种型和免疫球蛋白G(2)同种型控制在从40％至46％和从9.0％至11％的范围内。
表6：DGL控制值对免疫球蛋白生产和糖基化模式的作用
Figure BDA0000755289720000251

Claims (20)

1.用于生产免疫球蛋白的方法，所述方法包括：
a）在培养基中培养包含编码免疫球蛋白的核酸的真核细胞，其中培养基中单个细胞当前的比葡萄糖消耗速率与该种细胞的最大已知的比葡萄糖消耗速率的比例DGL保持在单一恒定值，其中比例范围从0.8至0.1，和
b）从培养物中回收免疫球蛋白；
其中所述培养是补料-分批培养，
其中所述真核细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞；
所述免疫球蛋白是抗-IL-6R抗体；
所述真核细胞的培养实施6至20天，
所述免疫球蛋白是IgG类免疫球蛋白；
pH值的范围是从pH6.9至7.3；且
具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的级分是包含具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的量、免疫球蛋白G(0)同种型的量、免疫球蛋白G(1)同种型的量和免疫球蛋白G(2)同种型的量的总和的10%或更少。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于比例是从0.8至0.2。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于比例是从0.6至0.4。
4.用于生产免疫球蛋白的方法，其包括：
a）在培养基中培养包含编码免疫球蛋白的核酸的真核细胞，其中每时间单位培养基中可用的葡萄糖的量保持恒定，并限制在单一恒定值，所述单一恒定值在每时间单位培养基中细胞最大能够利用的量的80%至10%之间，和
b）从培养物中回收免疫球蛋白；
其中所述培养是补料-分批培养，
其中所述真核细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞；
所述免疫球蛋白是抗-IL-6R抗体；
所述真核细胞的培养实施6至20天，
所述免疫球蛋白是IgG类免疫球蛋白；
pH的范围是从pH6.9至7.3；
且
其中具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的级分是包含具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的量、免疫球蛋白G(0)同种型的量、免疫球蛋白G(1)同种型的量和免疫球蛋白G(2)同种型的量的总和的10%或更少。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于恒定值少于80%且多于20%。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于培养是补料-分批培养，其中补料在培养的第2天或第3天开始。
7.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于DGL为0.8、0.6、0.5、0.4、0.3或0.2。
8.根据权利要求6的方法，其特征在于DGL为0.8、0.6、0.5、0.4、0.3或0.2。
9.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于培养在从pH 6.95至pH 7.05的pH值下或在从pH 7.15至pH 7.25的pH值下。
10.根据权利要求1-5和8中任一项的方法，其特征在于具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的级分是8%或更少，或者6%或更少，或者4%或更少。
11.根据权利要求6的方法，其特征在于具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的级分是8%或更少，或者6%或更少，或者4%或更少。
12.根据权利要求7的方法，其特征在于具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的级分是8%或更少，或者6%或更少，或者4%或更少。
13.根据权利要求9的方法，其特征在于具有甘露糖-5糖基结构的免疫球蛋白的级分是8%或更少，或者6%或更少，或者4%或更少。
14.根据权利要求1-5、8和11-13中任一项中的方法，其特征在于免疫球蛋白G(0)同种型的量是在从40%至46%的范围内且免疫球蛋白G(2)同种型的量是在从9%至11%的范围内。
15.根据权利要求6的方法，其特征在于免疫球蛋白G(0)同种型的量是在从40%至46%的范围内且免疫球蛋白G(2)同种型的量是在从9%至11%的范围内。
16.根据权利要求7的方法，其特征在于免疫球蛋白G(0)同种型的量是在从40%至46%的范围内且免疫球蛋白G(2)同种型的量是在从9%至11%的范围内。
17.根据权利要求9的方法，其特征在于免疫球蛋白G(0)同种型的量是在从40%至46%的范围内且免疫球蛋白G(2)同种型的量是在从9%至11%的范围内。
18.根据权利要求10的方法，其特征在于免疫球蛋白G(0)同种型的量是在从40%至46%的范围内且免疫球蛋白G(2)同种型的量是在从9%至11%的范围内。
19.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于宿主细胞的培养实施6至15天。
20.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于宿主细胞的培养实施6至8天。
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