DE69525971T3 - Verwendung eines pm-1 antikörpers oder eines mh 166 antikörpers zur verstärkung des anti-tumor-effektes von cisplatin oder carboplatin - Google Patents

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Description

  • Technischer Bereich
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Effektverstärker eines Antitumormittels, das einen Interleukin-6-Antagonisten beinhaltet und die Wirkung von Antitumormitteln bei der Tumorbehandlung unterstützt und verstärkt.
  • Hintergrund des Fachgebiets
  • Verschiedene Wirkstoffe wie alkylierende Agenzien, Stoffwechselantagonisten, Antitumor-Antibiotika und Platinverbindungen wurden in der Vergangenheit für die Chemotherapie menschlicher Tumoren verwendet. In dem Fall, in dem keine nennenswerte therapeutische Wirkung beobachtet wird, wenn diese Antitumormittel alleine verwendet werden, wurden therapeutische Verfahren entwickelt, in denen eine Vielzahl von Antitumormitteln nebeneinander verwendet werden (Frei, E. III, Cancer Res., 32, 2593–2607, 1992). Tumorzellen zeigen verschiedene Empfindlichkeiten auf Antitumormittel und es ist bekannt, dass bestimmte Zellen Resistenz gegen eine Therapie durch Antitumormittel zeigen (Magrath, I., New Directions in Cancer Treatment, 1989, Springer-Verlag). Es wird vermutet, dass der Erwerb einer Resistenz gegen die Therapie durch Tumorzellen beispielsweise durch das Auftreten von Multi-Drug-Resistenz (MDR) (Tsuruo, T. et al., Cancer Res. 42, 4730–4733, 1982), durch Reduktion der Zellaufnahme des Antitumormittels (Sherman, S. E. et al., Science, 230, 412, 1985), vermehrte DNA-Reparatur-Aktivität (Borch, R. F., Metabolism and Action of Anticancer Drugs, Powis, G. & Prough, R. Hrsg., Taylor & Francis, London, 1987, 163–193), oder durch Verstärkung der Inaktivierung des Antitumormittels in den Zellen (Teicher, B. A. et al., Cancer Res., 46, 4379, 1986) verursacht wird. In solchen Fällen gibt es viele Beispiele, bei denen die erwartete therapeutische Wirkung nur durch die Verabreichung von Antitumormittel nicht beobachtet wird.
  • Nierenzellkarzinom zeigt auf die Therapie mit Antitumormitteln wie Cisplatin, Adriamycin und Vinblastin Resistenz (Kakehi, Y. et al., J. Urol., 139, 862–864, 1988; Kanamaru, H. et al., J. Natl. Cancer Inst., 81, 844–847, 1989; Teicher, B. A. et al., Cancer Res., 47, 388–393, 1987). Platinverbindungen wie Cisplatin, die Antitumor-Wirkung besitzen, binden an DNA und hemmen die DNA-Synthese und die Zellteilung (Pinto, A. L. et al., Biochica et Biophysica Acta, 780, 167–180, 1985).
  • Die Expression von Glutathion-S-Transferase-π (GST-π), die Hemmung der Wirkung von Cisplatin, verursacht durch eine Zunahme der intrazellulären Mengen an Stoffen, die Sulfidryl-Gruppen enthalten, vermehrte DNA-Reparatur-Aktivitäten oder die Aktivierung von Onkogenen wie c-Myc werden bei der Therapieresistenz von Nierenzellkarzinom auf Cisplatin als beteiligt angesehen (Sklar, M. D. et al., Cancer Res., 51, 2118–2123, 1991; Mizutani, Y. et al., Cancer, in Druck, 1994; Nakagawa, K. et al., Japan J. Cancer Res., 79, 301–305, 1988).
  • Zusätzlich wird vermutet, dass Veränderungen der Membran-Permeabilität und der Transportfähigkeit in den Tumorzellen eine Abnahme der Cisplatin-Aufnahme innerhalb der Zellen verursachen, wobei sie die Resistenz gegen eine Therapie mit Cisplatin erhöhen (Richon, V. et al., Cancer Res., 47, 2056–2061, 1987; Waud, W. R. et al., Cancer Res., 47, 6549–6555, 1987). Es wird berichtet, dass Glutathion, ein Beispiel für einen Stoff, der Sulfidrylgruppen enthält und der in Säugerzellen in höchsten Mengen vorhanden ist, Cisplatin in Zellen inaktiviert, und es wurde gezeigt, dass bestimmte Arten von Tumoren höhere intrazelluläre Glutathion- und Metallthionein-Mengen enthalten (Hromas, R. A. et al., Cancer LETT., 34, 9–13, 1987; Taylor, D. M. et al., Eur. J. Cancer, 12, 249–254, 1976).
  • Glutathion ist ein Tripeptid-Thiol. Es spielt bei der Inaktivierung von DNA-bindenden Stoffen wie alkylierenden Agenzien und Cisplatin sowie bei der Reparatur von Zellschäden, die durch diese verursacht werden, eine wichtige Rolle. Eine der Wirkungen von GST-π ist, dass es die Inaktivierung von Antitumormitteln dadurch fördert, dass es eine Bindung von Antitumormitteln, wie den vorstehend beschriebenen, an Glutathionin verursacht.
  • Da Nierenzellkarzinom Interleukin-6 (IL-6) produziert und IL-6-Rezeptor (IL-6R) exprimiert, wurde vermutet, dass IL-6 irgendeine Rolle bei der Wachstumsaktivität von Nierenzellkarzinom spielt (Miki, S. et al, FEBS Lett., 250, 607–610, 1989; Takenawa, J. et al., J. Natl. Cancer Inst., 83, 1668–1672, 1991). Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Menge an IL-6 im Serum zunimmt, wenn die Prognose für die Behandlung von Patienten mit Nierenzellkarzinom schlecht ist (Blay, J. et al., Cancer Res., 52, 3317–3322, 1992; Tsukamoto, T. et al., J. Urol., 148, 1778–1782, 1992). Bis jetzt wurde jedoch eine eindeutige Korrelation zwischen IL-6 und der Resistenz von Nierenzellkarzinom gegen Therapie mit Antitumormitteln noch nicht gefunden und ist noch unbekannt.
  • IL-6 ist ein multifunktionales Cytokin, das als B-Zellen stimulierender Faktor-2 oder Interferon β2 bezeichnet wird. IL-6 wurde als Differenzierungsfaktor, der bei der Aktivierung von lymphoiden B-Zellen beteiligt ist, nachgewiesen (Hirano, T. et al., Nature, 324, 73–76, 1986). Später wurde eindeutig gezeigt, dass es ein multifunktionales Cytokin ist, das die Funktionen verschiedener Zellen beeinflusst (Akira, S. et al., Adv. in Immunology, 54, 1–78, 1993). IL-6 überträgt seine biologische Aktivität durch zwei Proteine, die auf Zellen vorhanden sind.
  • Eines von ihnen ist IL-6R, ein Liganden bindendes Protein, das ein Molekulargewicht von etwa 80 kD hat und an das IL-6 bindet. Zusätzlich zu der zellbindenden Form, die dadurch auf der Zellmembran exprimiert wird, dass sie durch die Zellmembran durchtritt, ist er auch als löslicher IL-6R (sIL-6R) vorhanden, der hauptsächlich aus seiner extracellulären Region zusammengesetzt ist. Ein anderes Protein ist gp130, das ein Molekulargewicht von etwa 130 KD hat und welches bei der Signalübertragung der nicht-Liganden-Bindung beteiligt ist. IL-6 und IL-6R bilden einen IL-6/IL-6R-Komplex. Als Ergebnis der Bindung mit dem anderen gp130-Membranprotein wird die biologische Aktivität von IL-6 auf die Zelle übertragen (Taga, et al., J. Exp. Med., 196, 967, 1987).
  • Obwohl Platinverbindungen wie Cisplatin und Antitumormittel wie Mitomycin C bei Tumorzellen Apoptose induzieren, wurde berichtet, dass IL-6 durch Antitumormittel induzierte Apoptose hemmt (Kerr, J. et al., Cancer, 73, 2013–2026, 1994; Sachs, L. et al., Blood, 82, 15–21, 1993). Zusätzlich haben Antitumormittel wie Cisplatin und Mitomycin C dadurch, dass sie freie Radikale produzieren, eine cytotoxische Wirkung auf Tumorzellen (Oyanagi, Y. et al., Biochem. Pharmacol., 26, 473–476, 1997; Nakano, H. et al., Biochem. Biophys. Acta., 796, 285–293, 1984). Es ist jedoch bekannt, dass IL-6 die Expression von Manganase-Superoxid-Dismutase (MnSOD) fördert, welche den Abbau von freien Radikalen bewirkt, und IL-6-Antikörper die Expression dieser geförderten MnSOD hemmt (Ono, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 182, 1100–1107, 1992; Dougall, W. C. et al., Endocrinology, 129, 2376–2384, 1991).
  • Keiner dieser Berichte stellt jedoch fest, dass die Wirkung von Antitumormitteln durch eine Blockierung der biologischen Aktivität von IL-6 verstärkt wird. Außerdem gibt es keine Berichte des tatsächlichen Versuchs, einen IL-6-Antagonisten als Effektverstärker von Antitumormitteln zu verwenden.
  • Obwohl in der Vergangenheit Antitumormittel bei der Behandlung von Tumoren verwendet wurden, gab es, da große Dosen dieser Wirkstoffe gegenteilige Nebenwirkungen wie Übelkeit, Erbrechen, Störungen der Nieren- und Leberfunktion und Hemmung der Knochenmarksfunktion hervorrufen, Fälle, in welchen es gefährlich war, die Dosis an Antitumormittel zu verabreichen, die erforderlich ist, um adäquate Antitumorwirkung zu zeigen. Außerdem gibt es, da es Tumoren gibt, die eine Resistenz gegen eine Therapie zeigen, bei der eine Chemotherapie, die herkömmliche Antitumormittel verwendet, unwirksam ist, die Notwendigkeit eines Effektverstärkers, der die Empfindlichkeit dieser Tumoren auf Antitumormittel erhöht.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Antitumormittel-Effektverstärkers, der die Wirkung von Antitumormitteln unterstützt und verstärkt und der die Empfindlichkeit therapieresistenter Tumorzellen auf Antitumormittel erhöht. Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung eines IL-6-Antagonisten für die Herstellung eines Arzneimittels für die Steigerung der Wirkung von Cisplatin oder Carboplatin bei der Behandlung eines Tumors, wobei der IL-6-Antagonist der PM-1- oder MH166-Antikörper ist und wobei der Tumor ein Nierenzellkarzinom ist.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Als ein Ergebnis verschiedener Studien über die Wirkung von IL-6-Antagonisten auf Veränderungen der Empfindlichkeit von Tumorzellen auf Antitumormittel, fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung heraus, dass IL-6-Antagonisten wie IL-6-Antikörper oder IL-6R-Antikörper die Empfindlichkeit von Tumorzellen auf Antitumormittel erhöhen, dass eine therapeutische Wirkung mit geringeren Dosen an Antitumormitteln beobachtet wird und dass die therapeutische Wirkung bei gleichzeitiger Verwendung herkömmlicher Antitumormittel mit einem Effektverstärker auftritt, welcher einen IL-6-Antagonisten gegen Tumore, die eine Resistenz gegen eine Therapie zeigen, enthält.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich nämlich auf einen Antitumormittel-Effektverstärker, der einen IL-6-Antagonisten enthält. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines IL-6-Antagonisten für die Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung der Wirkung eines Antitumormittels.
  • Spezifische Beispiele von PM-1-Antikörpern sind humanisierte PM-1-Antikörper. Antitumormittel, die in Kombination mit IL-6-Antagonisten verwendet werden, sind Cisplatin und Carboplatin.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A und 1B zeigen die Cytotoxizität gegen die Nierenzellkarzinomlinie Caki-1 in Gegenwart von Cisplatin in einer Konzentration von 0, 0,1, 1 oder 10 μg/ml und IL-6-Antikörpern (1A) oder IL-6R-Antikörpern (1B). Die Rauten zeigen die Cytotoxizität (%) in Gegenwart von Cisplatin allein, Quadrate die in Gegenwart von Cisplatin und 0,1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern, Dreiecke jene in Gegenwart von Cisplatin und 1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und Kreise jene in Gegenwart von Cisplatin und 10 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern.
  • 2A und 2B zeigen die Cytotoxizität gegen die Nierenzellkarzinomlinie Caki-1 in Gegenwart von Mytomycin C in einer Konzentration von 0, 0,1, 1 oder 10 μg/ml und IL-6-Antikörpern (2A) oder IL-6R-Antikörpern (2B). Die Rauten zeigen die Cytotoxizität (%) in Gegenwart von Mitomycin C allein, Quadrate jene in Gegenwart von Mitomycin C und 0,1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern, Dreiecke jene in Gegenwart von Mitomycin C und 1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und Kreise jene in Gegenwart von Mitomycin C und 10 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern.
  • 3A und 3B zeigen die Cytotoxizität gegen die Nierenzellkarzinomlinie Caki-1/DDP in Gegenwart von Cisplatin in einer Konzentration von 0, 0,1, 1 oder 10 μg/ml und IL-6-Antikörpern (3A) oder IL-6R-Antikörpern (3B). Die Rauten zeigen die Cytotoxizität (%) in Gegenwart von Cisplatin allein, Quadrate die in Gegenwart von Cisplatin und 0,1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern, Dreiecke jene in Gegenwart von Cisplatin und 1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und Kreise jene in Gegenwart von Cisplatin und 10 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern.
  • 4A und 4B zeigen die Cytotoxizität gegen die Nierenzellkarzinomlinie ACHN in Gegenwart von Cisplatin in einer Konzentration von 0, 0,1, 1 oder 10 μg/ml und IL-6-Antikörpern (4A) oder IL-6R-Antikörpern (4B). Die Rauten zeigen die Cytotoxizität (%) in Gegenwart von Cisplatin allein, Quadrate die in Gegenwart von Cisplatin und 0,1 μμ/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern, Dreiecke jene in Gegenwart von Cisplatin und 1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und Kreise jene in Gegenwart von Cisplatin und 10 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern.
  • 5A und 5B zeigen die Cytotoxizität gegen die Nierenzellkarzinomlinie A704 in Gegenwart von Cisplatin in einer Konzentration von 0, 0,1, 1 oder 10 μg/ml und IL-6-Antikörpern (5A) oder IL-6R-Antikörpern (5B). Die Rauten zeigen die Cytotoxizität (%) in Gegenwart von Cisplatin allein, Quadrate die in Gegenwart von Cisplatin und 0,1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern, Dreiecke jene in Gegenwart von Cisplatin und 1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und Kreise jene in Gegenwart von Cisplatin und 10 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern.
  • 6A und 6B zeigen die Cytotoxizität gegen frische Nierenzellkarzinome, die von Patient 1 erhalten wurden, in Gegenwart von Cisplatin in einer Konzentration von 0, 0,1, 1 oder 10 μg/ml und IL-6-Antikörpern (6A) oder IL-6R-Antikörpern (6B). Die Rauten zeigen die Cytotoxizität (%) in Gegenwart von Cisplatin allein, Quadrate die in Gegenwart von Cisplatin und 0,1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern, Dreiecke jene in Gegenwart von Cisplatin und 1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und Kreise jene in Gegenwart von Cisplatin und 10 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern.
  • 7A und 7B zeigen die Cytotoxizität gegen frische Nierenzellkarzinome, die von Patient 2 erhalten wurden, in Gegenwart von Cisplatin in einer Konzentration von 0, 0,1, 1 oder 10 μg/ml und IL-6-Antikörpern (7A) oder IL-6R-Antikörpern (7B). Die Rauten zeigen die Cytotoxizität (%) in Gegenwart von Cisplatin allein, Quadrate die in Gegenwart von Cisplatin und 0,1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern, Dreiecke jene in Gegenwart von Cisplatin und 1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und Kreise jene in Gegenwart von Cisplatin und 10 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern.
  • 8A und 8B zeigen die Cytotoxizität gegen frische Nierenzellkarzinome, die von Patient 3 erhalten wurden, in Gegenwart von Cisplatin in einer Konzentration von 0, 0,1, 1 oder 10 μg/ml und IL-6-Antikörpern (8A) oder IL-6R-Antikörpern (8B). Die Rauten zeigen die Cytotoxizität (%) in Gegenwart von Cisplatin allein, Quadrate die in Gegenwart von Cisplatin und 0,1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern, Dreiecke jene in Gegenwart von Cisplatin und 1 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und Kreise jene in Gegenwart von Cisplatin und 10 μg/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern.
  • 9A und 9B zeigen die Cytotoxizität gegen die Nierenzellkarzinomlinie Caki-1 in Gegenwart von Carboplatin in einer Konzentration von 0, 1, 10 oder 100 μg/ml und IL-6-Antikörpern (9A) oder IL-6R-Antikörpern (9B). Die Rauten zeigen die Cytotoxizität (%) in Gegenwart von Carboplatin allein, Quadrate die in Gegenwart von Carboplatin und 0,1 μm/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern, Dreiecke jene in Gegenwart von Carboplatin und 1 μm/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und Kreise jene in Gegenwart von Carboplatin und 10 μm/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern.
  • A in 10 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse des Northern-Blot-Verfahrens der gesamten RNA von Caki-1 unter Verwendung einer GST-π-mRNA-Sonde zeigt, um die Expression von GST-π-mRNA in der Nierenzellkarzinomlinie Caki-1 zu untersuchen, welche mit einem Kulturmedium (Kontrolle), Cisplatin zu 10 μm/ml oder IL-6-Antikörpern beziehungsweise IL-6R-Antikörpern zu 10 μm/ml behandelt wurde. Bahn 1 zeigt Caki-1, welches nur mit Kulturmedium behandelt wurde, Bahn 2 jenes, welches mit Cisplatin behandelt wurde, Bahn 3 jenes, welches mit IL-6-Antikörper behandelt wurde und Bahn 4 jenes, welches mit IL-6R-Antikörper behandelt wurde. B in 10 ist ein Diagramm eines mit Ethidiumbromid gefärbten Gels, welches für das Northern-Blot-Verfahren verwendet wurde. Das Diagramm zeigt, dass RNA in jeder Bahn vorhanden ist.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Der Antitumormittel-Effektverstärker der vorliegenden Erfindung, der einen IL-6-Antagonisten umfasst, verstärkt die Antitumorwirkung dadurch, dass er während der Behandlung der Tumore in Kombination mit Antitumormitteln verwendet wird. Zusätzlich macht er es möglich, dass die benötigte Dosis des Antitumormittels verringert wird, da er die Wirkung hat, dass er die Empfindlichkeit von therapieresistenten Tumoren auf Antitumormittel erhöht, für welche mit herkömmlicher Chemotherapie keine therapeutische Wirkung beobachtet wird.
  • Antitumormittel, für die antitumorale Eigenschaften durch den Effektverstärker der vorliegenden Erfindung verstärkt werden, sind chemotherapeutische Wirkstoffe, die tumortherapeutische Wirkung haben und die Entwicklung und das Wachstum der Tumorzellen dadurch hemmen, dass sie auf Tumorzellen wirken. Diese chemotherapeutischen Wirkstoffe sind Platinverbindungen, ausgewählt aus Cisplatin und Carboplatin.
  • Platinverbindungen besitzen ein Platinatom, das mit anderen Atomen Komplexe bildet. Diese Verbindungen zeigen durch Binden an DNA, Hemmung der DNA-Synthese von Tumorzellen und Hemmung der Teilung von Tumorzellen antitumorale Wirkungen. Bekannte Beispiele für Platinverbindungen, die antitumorale Wirkungen haben und die bis jetzt verwendet wurden, umfassen Cisplatin (Cis-diamindichlorplatin (II), das die nachstehend gezeigte Strukurformel hat):
    Figure 00080001
  • Carboplatin (Cis-diamin(1,1-cyclobutandicarboxylat)-Platin (II), das die nachstehend gezeigte Strukturformel hat:
    Figure 00080002
  • Diese Antitumormittel können unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können Platinverbindungen oral oder parenteral und bevorzugt als Injektionsformulierung gegebenenfalls durch Mischen mit einem pharmazeutischen Träger und einem Excipienten verwendet werden. Zur Herstellung einer Injektionsformulierung kann es mit destilliertem Wasser, einer Salzlösung wie Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, einer Glucoselösung oder physiologischer Kochsalzlösung vermischt werden. Die Menge an Antitumormittel in diesen Formulierungen ist vorzugsweise eine Dosiseinheit, die für die Verwendung gemäß dem Alter, den Symptomen usw. der Patienten praktisch ist. Zum Beispiel werden bei der Verwendung zur Tumorbehandlung bei einem Erwachsenen täglich 10 bis 2000 mg/m2 (Körperoberflächenbereich), entsprechend der Dosis fortlaufend 5 Tage verabreicht, oder es kann ein Erholungszeitraum von 1 bis 4 Wochen zwischen den Anwendungen gewährt werden.
  • Tumorzellen, in welchen auf Grund des Effektverstärkers der vorliegenden Erfindung antitumorale Wirkungen beobachtet werden, sind Tumoren, die IL-6R haben und die Wachstum bei der und/oder Resistenz gegen die durch IL-6 bereitgestellte(n) Therapie als einem ihrer physiologisch aktiven Stoffe zeigen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Tumor Nierenzellkarzinom (Miki, S. et al., FEBS Letter, 250, 607–610, 1989).
  • Der IL-6-Antagonist, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein IL-6-Antikörper oder ein IL-6R-Antikörper.
  • Es gibt keine besondere Begrenzung hinsichtlich der Tierart der Zellen, die monoclonale Antikörper herstellen, vorausgesetzt, sie sind von einem Säuger und sie können von menschlichen Antikörpern und nicht-menschlichen Säugerantikörpern hergeleitet werden. Monoclonale Antikörper, die vom Kaninchen oder einem Nager abstammen, sind als monoclonale Antikörper nicht-menschlichen Ursprungs von einem Säuger auf Grund der Leichtigkeit der Herstellung bevorzugt. Obwohl es hinsichtlich der Nager-Antikörper keine besonderen Beschränkungen gibt, umfassen bevorzugte Beispiele Maus-, Ratten- und Hamsterantikörper.
  • Der IL-6-Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist der MH166-Antikörper (Matsuda, et al., Eur. J. Immunol., 18, 951–956, 1988). Der IL-6R-Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist der PM-1-Antikörper (Hirata, et al., J. Immunol., 143, 2900–2906, 1989).
  • Von diesen Antikörpern sind IL-6R-Antikörper besonders bevorzugt, wie eben der vorstehend erwähnte PM-1-Antikörper.
  • Monoclonale Antikörper können hauptsächlich unter Verwendung von bekannten Verfahren hergestellt werden. Unter Verwendung von IL-6 oder IL-6R als sensibilisierendes Agens wird nämlich ein Wirt in Übereinstimmung mit einem routinemäßigen Immunsierungsverfahren immunisiert, die entstehenden immunisierten Zellen werden durch routinemäßige Zellfusion mit bekannten Ausgangszellen fusioniert, und dann wird eine monoclonale Antikörper-produzierende Zelle durch routinemäßige Durchmusterungs-Verfahren selektiert.
  • Genauer gesagt kann das folgende Verfahren durchgeführt werden, um monoclonale Antikörper herzustellen. Zum Beispiel ist ein Antigen menschlichen Ursprungs für das vorstehend erwähnte sensibilisierende Antigen zu bevorzugen, und im Falle von menschlichem IL-6 wird Antigen durch Verwenden der Gensequenz von menschlichem IL-6, offenbart in Hirano et al., Nature 324, 73, 1986, gewonnen. Nach Inserieren der Gensequenz von menschlichem IL-6 in ein bekanntes Expressionsvektorsystem und der Transformation von geeigneten Wirtszellen, wird das Zielprotein IL-6 von den Wirtszellen oder dem Kulturüberstand gereinigt und das gereinigte IL-6-Protein kann dann als sensibilisierendes Antigen verwendet werden.
  • Im Fall von menschlichem IL-6R kann IL-6R-Protein erhalten werden, indem einem Verfahren, ähnlich jenem des vorstehend erwähnten menschlichen IL-6, unter Verwendung der Gensequenz, die in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. EP325474 offenbart wird, gefolgt wird. Es gibt zwei Typen von IL-6R, nämlich den, der auf der Zellmembran exprimiert wird, und einen löslichen Typ, der von der Zellmembran freigesetzt wird (sIL-6R) (Yakusawa, et al., J. Biochem., 108, 673–676, 1990). sIL-6R wird hauptsächlich aus der extrazellulären Region von IL-6R, die an die Zellmembran gebunden ist, zusammengesetzt und unterscheidet sich von membrangebundenem IL-6R insofern, als ihm eine permeierende Region der Zellmembran beziehungsweise eine permeierende Region der Zellmembran und eine intrazelluläre Region fehlt.
  • Obwohl es keine besonderen Begrenzungen gibt, werden Säuger, die mit sensibilisierendem Antigen immunisiert sind, hinsichtlich ihrer Kompatibilität mit den Ausgangszellen, die bei der Zellfusion verwendet werden, bevorzugt selektiert, und gewöhnlich werden Mäuse, Hamster und Kaninchen verwendet.
  • Die Immunisierung eines Tieres mit einem sensibilisierenden Antigen wird in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren durchgeführt. Als typisches Beispiel wird die Immunisierung durch intraperitoneale oder subcutane Injektion eines sensibilisierenden Antigens in ein Tier durchgeführt. Genauer gesagt wird nach Verdünnung und Suspension des sensibilisierenden Antigens in einer geeigneten Menge phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder physiologischer Kochsalzlösung die entstehende Suspension mit einer geeigneten Menge eines herkömmlichen Adjuvans, wie komplettes Freundsches Adjuvans, wie gewünscht, vermischt, gefolgt von Emulgieren. Die Emulsion wird dann alle 4 bis 21 Tage in mehreren Dosen bevorzugt an den Säuger verabreicht. Zusätzlich kann während der Immunisierung mit sensibilisierendem Antigen auch ein geeigneter Träger verwendet werden.
  • Demnach werden die immunisierten Zellen nach Immunisierung des Säugers und dem Nachweis, dass sich die gewünschte Antikörpermenge im Serum entwickelt hat, aus dem Säuger gewonnen und bei der Zellfusion verwendet. Ein besonders bevorzugtes Beispiel für immunisierte Zellen sind Milzzellen. Verschiedene bekannte Zelllinien werden bevorzugt als Säuger-Myelomzellen verwendet, welche als Ausgangszellen dienen und mit den vorstehend erwähnten immunisierten Zellen fusioniert werden, wobei Beispiele dafür P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol., 123, 1548, 1978), p3-U1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1–7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol., 6, 511–519, 1976), MPC-11 (Cell, 8, 405–415, 1976), SP2/0 (Nature, 276, 269–270, 1978), F0 (J. Immunol. Meth., 35, 1–21, 1980), S194 (J. Exp. Med., 148, 313–323, 1978) und R210 (Nature, 277, 131–133, 1979) umfassen.
  • Die Zellfusion der vorstehend erwähnten immunisierten Zellen und Myelomzellen kann grundsätzlich in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren ausgeübt werden, wobei ein Beispiel dafür das Verfahren von Milstein, et al. (Milstein, et al., Methods Enzymol., 73, 3–46, 1981) darstellt.
  • Genauer gesagt wird die vorstehend erwähnte Zellfusion zum Beispiel in einer gewöhnlichen Nährstoff-Kulturflüssigkeit in Gegenwart eines Zellfusions-Promotors durchgeführt. Beispiele für Fusionspromotoren, die verwendet werden, umfassen Polyethylenglycol (PEG) und Sendai-Virus (HVJ). Darüber hinaus kann auch eine Fusionshilfe wie Dimethylsulfoxid zugesetzt werden, um die Effizienz der Fusion, wie gewünscht, zu erhöhen.
  • Das Verhältnis der verwendeten immunisierten Zellen zu Myelomzellen liegt vorzugsweise bei zum Beispiel 1 bis 10 Mal mehr immunisierten Zellen als Myelomzellen. Als Kulturflüssigkeit, welche für die vorstehend erwähnte Zellfusion verwendet wird, können RPMI 1640-Kulturmedium, MEM-Kulturmedium oder andere herkömmliche Kulturmedien, die bei dieser Art von Zellkultur verwendet werden, verwendet werden. Darüber hinaus können diese Kulturmedien in Kombination mit einem Serumzusatz, wie fötalem Kälberserum (FCS) verwendet werden.
  • Für die Zellfusion werden vorgeschriebene Mengen der vorstehend erwähnten immunisierten Zellen und Myelomzellen im vorstehend erwähnten Kulturmedium gut vermischt, gefolgt von Zusetzen einer PEG-Lösung, wie einer PEG-Lösung mit einem mittleren Molekulargewicht von 1000 bis 6000, welches zuvor auf etwa 37°C angewärmt wurde, normalerweise in einer Konzentration von 30 bis 60% (Gew./Vol.), und Vermischen, um die fusionierten Zielzellen (Hybridom) zu erzeugen. Danach können die Zellfusionsmittel etc., die für das Hybridomwachstum ungeeignet sind, durch Wiederholen eines Verfahrens, das aus aufeinanderfolgendem Zusetzen eines geeigneten Kulturmediums, Zentrifugieren und Entfernen des Überstands besteht, entfernt werden.
  • Das Hybridom wird durch Züchtung in einem herkömmlichen selektiven Kulturmedium wie HAT-Kulturmedium (Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält) selektiert. Die Züchtung im HAT-Kulturmedium wird normalerweise über mehrere Tage bis mehrere Wochen hinweg fortgesetzt, um ausreichend Zeit zu gewähren, damit andere Zellen als die Hybridom-Zielzellen (nicht-fusionierte Zellen) absterben. Danach wird ein herkömmliches, begrenztes Verdünnungsverfahren durchgeführt, gefolgt von einer Durchmusterung und Einzel-Clonierung von Hybridom, welches den Ziel-Antikörper produziert.
  • Derart hergestelltes Hybridom, welches monoclonale Antikörper produziert, kann in einem herkömmlichen Kulturmedium als Unterkultur gezüchtet werden und lange Zeit in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
  • Um monoclonale Antikörper vom Hybridom zu erhalten, wird das Hybridom in Übereinstimmung mit Routineverfahren gezüchtet und in Form von Kulturüberstand erhalten. Alternativ wird das Hybridom durch Verabreichen an einen Säuger, mit dem es Kompatibilität besitzt, und durch Erhalten des monoclonalen Antikörpers in seiner Aszitesflüssigkeit gezüchtet. Das erste Verfahren eignet sich, um hochreine Antikörper zu erhalten, wohingegen sich das letztere Verfahren zur Herstellung von Antikörpern in großem Umfang eignet.
  • Außerdem können monoclonale Antikörper nicht nur von einem Hybridom erhalten werden, das durch Fusionierung von Antikörper-produzierenden Zellen erzeugt wurde, welche durch Immunisierung mit Antigen erhalten wurden, sondern es kann auch monoclonaler Antikörper verwendet werden, welcher unter Verwendung rekombinanter Gentechnologie durch Clonierung eines Antikörpergens, dessen Einschließen in einen geeigneten Vektor und Einführen des Vektors in eine bekannte Zelllinie wie COS oder CHO (vgl., zum Beispiel Vandamme, A-M. et al., Eur. J. Biochem., 192, 767–775, 1990) hergestellt wird.
  • Darüber hinaus kann monoclonaler Antikörper, der durch das vorstehend erwähnte Verfahren hergestellt wurde, unter Verwendung von routinemäßigen Reinigungsmethoden wie Aussalzen, Gelfiltration oder Affinitätschromatographie auf hohe Reinheit gereinigt werden.
  • Auf diese Weise hergestellte monoclonale Antikörper sind in der Lage, Antigen durch immunologische Routinemethoden wie Radio-Immuntest (RIA), Enzym-Immuntest (EIA, ELISA) sowie Immunfluoreszenzanalyse mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit zu erkennen.
  • Der monoclonale Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht auf monoclonale Antikörper, welche durch ein Hybridom produziert werden, begrenzt. Monoclonale Antikörper, welche künstlich zum Zweck der Verringerung der Heteroantigenität gegen Menschen etc. verändert wurden, werden stärker bevorzugt. Zum Beispiel können chimäre Antikörper, die aus der variablen Region eines anderen monoclonalen Säuger-Antikörpers als dem menschlichen monoclonalen Antikörper, zum Beispiel monoclonalem Maus-Antikörper, und der konstanten Region von menschlichem Antikörper zusammengesetzt sind, verwendet werden. Dieser Typ von chimärem Antikörper kann unter Verwendung von bekannten Herstellungsverfahren für chimäre Antikörper und insbesondere rekombinanter Gentechnologie hergestellt werden.
  • Darüber hinaus können ebenfalls umgeformte menschliche Antikörper in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bei diesem Antikörpertyp wird die komplementaritätsbestimmende Region von nicht-menschlichem Säuger-Antikörper wie Maus-Antikörper durch bekannte, allgemeine Gen-Rekombinationsverfahren an die komplementaritätsbestimmende Region von menschlichem Antikörper angeheftet. Ein umgeformter menschlicher Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, kann unter Verwendung dieses bekannten Verfahrens erhalten werden, wobei der umgeformte PM-1-Antikörper ein bevorzugtes Beispiel dafür ist (vgl., zum Beispiel Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO92/19759 ).
  • Des Weiteren können die Aminosäuren der Gerüst(FR)-Region der variablen Region eines Antikörpers derart substituiert werden, dass die komplementaritätsbestimmende Region des umgeformten menschlichen Antikörpers eine geeignete Antikörperbindungsstelle bildet (Sato, et al., Cancer Res., 53, 1–6, 1993). Darüber hinaus kann ein Gen, das Antikörperfragmente codiert, wie F(ab')2, Fab, Fv, einkettiges Fv (scFv), das Fv der H-Kette und der L-Kette mit einem geeigneten Verbindungsstück verbindet, konstruiert werden, und das Antikörperfragment kann dann in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden und zum vorstehend erwähnten Zweck verwendet werden, vorausgesetzt, es bindet mit Antigen und hemmt die IL-6-Aktivität (vgl., zum Beispiel, Bird, et al., TIBTECH, 9, 132–137, 1991).
  • Ein scFv wird durch Verbinden der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette eines Antikörpers zusammengesetzt. Bei diesem scFv werden die V-Region der H-Kette und die V-Region der L-Kette durch ein Verbindungsstück und zwar vorzugsweise durch ein Peptid-Verbindungsstück miteinander verbunden (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879–5883, 1988). Die V-Region der H-Kette und die V-Region der L-Kette beim scFv können von jedem der vorstehend erwähnten Antikörper abgeleitet werden. Diese V-Regionen werden vorzugsweise mit einem Peptid-Verbindungsstück verbunden. Beispiele für Peptid-Verbindungsstücke, welche verwendet werden, umfassen jedes einkettige Peptid, das 12 bis 19 Aminosäurereste umfasst.
  • DNA, die scFv codiert, wird durch Verwendung von DNA, welche die H-Kette oder die V-Region der H-Kette des vorstehend erwähnten Antikörpers codiert, und von DNA, welche die L-Kette oder die V-Region der L-Kette codiert, als Matrizen durch Amplifikation des DNA-Abschnitts ihrer Sequenzen, der die gewünschte Aminosäuresequenz codiert, unter Verwendung eines Primer-Paars, das beide seiner Enden definiert, und durch Kombination mit einem Primer-Paar, das die DNA definiert, die sowohl den Abschnitt für das Peptid-Verbindungsstück als auch beide Enden codiert, um an die H-Kette und die L-Kette zu binden, erhalten.
  • Zusätzlich kann, nachdem eine DNA, die scFv codiert, hergestellt wurde, in Übereinstimmung mit Routineverfahren ein Expressionsvektor, der sie enthält und eine Wirtszelle, die durch den Expressionsvektor transformiert wurde, gewonnen werden. Zusätzlich kann unter Verwendung dieser Wirtszelle scFv in Übereinstimmung mit Routineverfahren gewonnen werden. Da scFv eine größere Fähigkeit besitzt, in Gewebe zu wandern als Antikörpermoleküle, wird erwartet, dass es als Stoff zu verwenden ist, der ähnliche Funktionen hat wie umgeformte menschliche Antikörper.
  • Der Antitumormittel-Effektverstärker, der den IL-6-Antagonisten der vorliegenden Erfindung umfasst, kann bei der Behandlung jeglicher Tumoren, die IL-6R aufweisen, da sie bei der Verwendung von IL-6 als einer ihrer physiologisch aktiven Stoffe wachsen und/oder eine Resistenz gegen eine Therapie zeigen, wirkungsvoll genutzt werden, vorausgesetzt er blockiert die IL-6-Signalübertragung und unterstützt und verstärkt die Wirkung des Antitumormittels.
  • Der Antitumormittel-Effektverstärker, der den IL-6-Antagonisten der vorliegenden Erfindung umfasst, kann systemisch oder lokal und vorzugsweise parenteral, zum Beispiel durch intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion, intraperitoneale Injektion oder subcutane Injektion verabreicht werden. Darüber hinaus kann er in Form eines Arzneimittels oder eines Kits mit mindestens einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel verwendet werden.
  • Die Dosis des Antitumormittel-Effektverstärkers, der den IL-6-Antagonisten der vorliegenden Erfindung umfasst, variiert beim Menschen je nach Verfassung und Alter des Patienten beziehungsweise je nach Anwendungsmethode. Es ist jedoch nötig, eine geeignete Dosis zu wählen. Zum Beispiel kann im Fall von IL-6R-Antikörpern eine geteilte Dosis von vier Anwendungen oder weniger in einem Bereich von etwa 1 bis 1000 mg/Patient gewählt werden. Zusätzlich kann er auch in einer Dosis von 1 bis 10 mg/kg/Woche verabreicht werden. Der Antitumormittel-Effektverstärker, der den IL-6-Antagonisten der vorliegenden Erfindung umfasst, ist jedoch nicht auf diese Dosen beschränkt.
  • Der Antitumormittel-Effektverstärker, der den IL-6-Antagonisten der vorliegenden Erfindung umfasst, kann in Übereinstimmung mit Routineverfahren (Remington's Pharmaceutical Science, letzte Ausgabe, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.) hergestellt werden. Zum Beispiel können Herstellungen für Injektionen durch Lösung von gereinigtem IL-6-Antagonisten in einem Lösungsmittel wie physiologischer Kochsalzlösung, Puffer- oder Glucoselösung und Zusetzen eines Mittels zur Verhinderung der Adsorption wie Tween80, Gelatine oder menschlichem Serumalbumin (HSA) hergestellt werden. Alternativ kann es zur Rekonstitution vor der Verwendung auch durch Gefriertrocknen hergestellt werden. Beispiele für Vehikel, die zum Gefriertrocknen verwendet werden können, umfassen Zucker-Alkohole und Zucker wie Mannit und Glucose.
  • Beispiele
  • Obwohl Nachstehendes unter Verwendung von Beispielen, Referenzbeispielen und Experimenten eine detaillierte Erklärung der vorliegenden Erfindung bereitstellt, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese beschränkt.
  • Beispiel 1. Wirkung von IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern auf die Empfindlichkeit von Tumorzellen für Antitumormittel
  • Es wurde die Wirkung von IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern auf die Empfindlichkeit von Tumorzellen für verschiedene Antitumormittel untersucht. (1) Herstellung von menschlichem Nierenzellkarzinom
  • Die menschliche Nierenzellkarzinomlinie Caki-1, der Cisplatin-resistente Stamm Caki-1/DDP, eine Unterlinie von Caki-1, das menschliche Nierenzellkarzinom ACHN und das menschliche Nierenzellkarzinom A704 (Giard, D. J. et al., J. Natl. Cancer Inst., 51, 1417–1423, 1973) wurden so gezüchtet, dass sie in RPMI 1640-Kulturmedium, welches 25 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 100 U/ml Penicillin, 100 μm/ml Streptomycin und 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) (alle hergestellt durch Gibco) (bezeichnet als vollständiges Kulturmedium) in Plastikschalen eine einzellige Schicht bildeten.
  • Auf der anderen Seite wurden frische Tumorzellen von Nierenzellkarzinompatienten gemäß dem Verfahren von Mizutani, Y. et al., (Cancer, 69, 537–545, 1992) gewonnen. Während chirurgischer Eingriffe wurde bei drei Nierenzellkarzinompatienten Tumorgewebe vom Nierenzellkarzinom gewonnen. Nach der Bestätigung durch histologische Klassifikation, dass das Gewebe Nierenzellkarzinom ist, wurde das Tumorgewebe durch 3 mg/ml Collagenase (Sigma Chemical Co.) fein zerteilt, um eine Tumorzellensuspension herzustellen. Nach dreimaligem Waschen mit RPMI 1640-Kulturmedium wurde die Zellsuspension über einen nicht-kontinuierlichen Gradienten, der sich aus je 2 ml 100%igem, 80%igem und 50%igem Ficol-Hypaque in 15 ml-Maßröhrchen aus Plastik zusammensetzte, geschichtet, gefolgt von 30 minütiger Zentrifugation bei 400 × g. Die lymphocytenreiche Monocytenschicht, die in der vorstehend erwähnten 100%igen Schicht enthalten war, wurde entfernt, und Tumorzellen sowie Mesothelzellen wurden aus der 80%igen Schicht gewonnen.
  • Um die Kontaminierung durch andere Zellen zu vermeiden, wurde die Zellsuspension, die reich an Tumorzellen war, über einen nicht-kontinuierlichen Gradienten geschichtet, der sich aus je 3 ml 25%igem, 15%igem und 10%igem Percoll in vollständigem Kulturmedium zusammensetzte, welcher sich in 15 ml-Plastikröhrchen befand, gefolgt von einer 7-minütigen Zentrifugation bei 25 × g und Raumtemperatur. Nach Waschen der erhaltenen Tumorzellen und Suspension in vollständigem Kulturmedium wurde die Gegenwart von Tumorzellen durch Trypan-Blaufärbung bestätigt. Die auf diese Weise hergestellten Tumorzellen wurden im folgenden Versuch verwendet.
  • (2) Bestätigung der IL-6-Herstellung von Nierenzellkarzinom durch ELISA
  • Die Gegenwart von IL-6 im Kulturüberstand der Nierenzellkarzinomlinien Caki-1, Caki-1/DDP, ACHN, A704 und frischer Tumorzellen, die von Nierenzellkarzinompatienten (Nr. 1–3) stammten, wurde durch ELISA (enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung) untersucht.
  • 100 μl IL-6-Antikörper wurden ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen zugesetzt, um die ELISA-Platten durch Stehenlassen mindestens über Nacht mit IL-6-Antikörpern zu beschichten. Diese Platten wurden bis zum Zeitpunkt der Verwendung maximal 4 Wochen bei 4°C gelagert. Die mit IL-6-Antikörpern beschichteten Platten wurden dreimal gewaschen und 1 Stunde mit ELISA-PBS, welches 1% PBS (Rinderserumalbumin) enthielt, blockiert. Nach zweimaligem Waschen wurden jeder Vertiefung 100 μl des Tumorzellkulturüberstands beziehungsweise rekombinantes IL-6 von E. coli als Kontrolle zugesetzt (Yakusawa, et al., Biotechnol. Lett., 12, 419, 1990).
  • Die Platten wurden 1 Stunde inkubiert und dreimal gewaschen, gefolgt von Zusetzen von 100 μl polyclonalen anti-IL-6-Antikörpern zu jeder Vertiefung (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol., 18, 951–956, 1988). Die Platten wurden dann eine Stunde inkubiert, gefolgt von Zusetzen von alkalischer Phosphatase-gebundenem anti-Kaninchen-IgG von Ziegen zu jeder Vertiefung und Inkubieren für eine zusätzliche Stunde. Die Platten wurden gewaschen und mit alkalischer Phosphatase-Substrat (Sigma 104, Sigma Chemical Co.) inkubiert. Zwei Stunden später wurde die Absorption bei 405 nm mit einem ELISA-Lesegerät (Immunoreader, Japan Intermed., Co., Ltd.) gemessen. Gemäß diesen Ergebnissen zeigten alle Nierenzellkarzinome deutlich, dass sie IL-6 herstellten (vgl. Tabelle 1). Tabelle 1
    IL-6-Konzentration im Überstand
    RCC-Zellen IL-6-Konzentration (pg/ml; Mittel ± Standardabweichung
    Caki-1 1337 ± 35
    Caki-1/DDP 3900 ± 325
    A704 1290 ± 141
    ACHN 1282 ± 106
    Frische RCC-Zellen (Patient Nr. 1) 1236 ± 71
    Frische RCC-Zellen (Patient Nr. 2) 42 ± 4
    Frische RCC-Zellen (Patient Nr. 3) 2579 ± 219
  • (3) Wirkung von II-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern auf die Cytotoxizität von Antitumormitteln
  • Um die Wirkung von II-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern auf die Empfindlichkeit verschiedener Nierenzellkarzinome, nämlich Caki-1, Caki-1/DDP, ACHN, A704, sowie frischer Tumorzellen, die von Nierenzellkarzinompatienten (Nr. 1–3) stammten, gegen verschiedene Konzentrationen von Antitumormitteln, nämlich Cisplatin (Cis-diamindichlorplatin (II)), Mitomycin C (MMC), Adriamycin (ADR), Vinblastin (VBL) und 5-Fluoruracil (5-FU) zu untersuchen, wurde das MTT-Verfahren (Mizutani, Y. et al., Cancer, 73, 730–737, 1994) verwendet.
  • 100 μl der vorstehend erwähnten Nierenzellkarzinom-Tumorzellsuspensionen (2 × 104 Zellen) wurden einer Boden-Oberflächen-Mikrotiterplatte (Corning Glass Works, Corning) mit 96 Vertiefungen zugesetzt. Die Platte wurde bei 37°C in Gegenwart von 5% CO2 in feuchter Umgebung inkubiert, und die Tumorzellen wurden 24 Stunden lang gezüchtet. Der Zellkulturüberstand wurde abgesaugt, und die Tumorzellen wurden dreimal mit RPMI 1640-Kulturmedium gewaschen. 200 μl einer Lösung, die Antitumormittel oder Kontrolle in Form einer vollständigen Kulturlösung enthielt, wurden in Gegenwart von IL-6-Antikörpern (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. 18, 951–956, 1988) oder IL-6R-Antikörpern (Hirata, Y. et al., J. Immunol. 143, 2900–2906, 1989) jeder Vertiefung zugesetzt, gefolgt von Züchtung über 24 Stunden bei 37°C. 20 μl MTT-Lösung (5 mg/ml; Sigma Chemical Co.) wurden jeder Vertiefung zugesetzt, wonach die Züchtung 4 Stunden bei 37°C in Gegenwart von 5% CO2 in feuchter Umgebung fortgesetzt wurde. Das Kulturmedium wurde dann von jeder Vertiefung entfernt und durch Isopropanol, welches 0,05 N HCl (Sigma Chemical Co.) enthielt, ersetzt.
  • Die Absorption der Lösung wurde in jeder Vertiefung bei 540 nm mit einem Microkulturplatten-Lesegerät (Immunoreader, Japan Intermed. Co., Ltd.) gemessen. Die Cytotoxizitätsrate wurde mit der folgenden Formel errechnet. Cytotoxizität (%) = [1 – (Absorption der Versuchsgruppe/Absorption der Kontrollgruppe)] × 100.
  • Als ein Ergebnis nahm die durch Cisplatin (vgl. 1A und 1B) oder MMC (vgl. 2A und 2B) verursachte Cytotoxizität bei Caki-1-Zellen in Gegenwart von Antikörpern deutlich zu. In der Versuchsgruppe, bei der der Kontroll-Antikörper MOPC3 (J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 41, 1083, 1968) zugesetzt wurde, wurde keine Wirkung auf die Empfindlichkeit für Cisplatin oder MMC beobachtet. Im Vergleich mit dem Fall des Zusetzens von Antitumormittel alleine, lag die Menge des Antitumormittels, das benötigt wurde, um eine cytotoxische Wirkung auszulösen, die jener in Gegenwart von Antitumormittel und IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern äquivalent war, bei 1/10 bis 1/100. Auf der anderen Seite gab es hinsichtlich der Empfindlichkeit von Tumorzellen für Antitumormittel in Gegenwart von IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und ADR, VBL oder 5-FU keine Veränderung.
  • Die Resistenz von Caki-1/DDP-Zellen gegen Cisplatin wurde überwunden, wenn IL-6-Antikörper oder IL-6R-Antikörper zusammen mit dem Cisplatin vorhanden war (vgl. 3A und 3B). Die kombinierten Wirkungen von IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern und Cisplatin wurden auf ähnliche Weise für die anderen Nierenzellkarzinomlinien ACHN (vgl. 4A und 4B) und A704 (vgl. 5A und 5B) sowie auch für die frischen Tumorzellen, die von den drei Nierenzellkarzinompatienten (vgl. 6A, 6B, 7A, 7B, 8A und 8B) erhalten wurden, beobachtet.
  • Beispiel 2. Wirkung von IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern auf die Empfindlichkeit von Nierenzellkarzinom für Carboplatin
  • Die Cytotoxizität wurde, wenn IL-6-Antikörper oder IL-6R-Antikörper mit Carboplatin, welches in verschiedenen Konzentrationen hergestellt war, vorhanden waren, auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung der Nierenzellkarzinomlinie Caki-1 untersucht. Als ein Ergebnis war die Empfindlichkeit der Caki-1-Zellen für Carboplatin erhöht (vgl. 9A und 9B).
  • Beispiel 3. Wirkung von IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern auf die intrazelluläre Anhäufung von Antitumormitteln
  • Caki-1-Zellen wurden in Gegenwart der Kombination aus 10 μm/ml Cisplatin oder 100 μm/ml 5-FU oder Kulturmedium als Kontrolle und 10 μm/ml des Kontrollantikörpers MOPC3/C oder 10 μm/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern 24 Stunden gezüchtet.
  • Danach wurde das Kulturmedium entfernt, und die Zellen wurden dreimal mit RPMI 1640-Kulturflüssigkeit gewaschen. Die intrazelluläre Anhäufung von Cisplatin wurde durch flammenlose Atomabsorptionsspektrometrie (Daley-Tates, P. T. et al., Biochem. Pharmacol., 34, 2263–2369; Riley, C. M. et al., Analytical Biochem., 124, 167–179, 1982) gemessen. Ein Zeeman Z-8000 (Zeeman Z-8000-Spektrophotometer, Hitachi Co., Ltd.) wurde als Messinstrument verwendet. Zusätzlich wurde die intrazelluläre Anhäufung von 5-FU durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie (Marunaka, T. et al., J. Pharm. Sci., 69, 1296–1300, 1980) gemessen. Als Messinstrument wurde das JMS-D300-Massenspektrometer, das mit dem JGC-20KP-Gaschromatographen (JOEL) ausgerüstet war, verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass IL-6-Antikörper oder IL-6R-Antikörper innerhalb von Tumorzellen keinerlei Auswirkung auf die Anhäufung von Cisplatin und 5-FU haben. Tabelle 2
    Intrazelluläre Anhäufung von CDDP beziehungsweise 5-FU (ng/107 Zellen) Behandlung
    Wirkstoff Kontrolle (Kulturmedium) Kontroll-Ab Anti-IL-6-mAb Anti-IL-6R-mAb
    CDDP 0,28 ± 0,05 0,27 ± 0,02 0,26 ± 0,05 0,27 ± 0,02
    5-FU 1,48 ± 0,32 1,57 ± 0,45 1,50 ± 0,19 1,63 ± 0,31
  • Die Figuren in der Tabelle wurden aus den Daten errechnet, die in drei Versuchen (Mittel ± Standardabweichung) erhalten wurden.
  • Beispiel 4. Wirkung von Cisplatin, IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern auf die Expression von Glutathion S-Transferase-π (GST-π)
  • Caki-1-Zellen wurden vier Stunden mit Kontroll-Kulturmedium, 10 μm/ml Cisplatin oder 10 μm/ml IL-6-Antikörpern oder IL-6R-Antikörpern gezüchtet. Danach wurde die gesamte RNA der Zellen gemäß dem Verfahren von Mizutani, Y. et al., (Cancer, 73, 730–737, 1994), gefolgt von Elektrophorese in 1,2%igem Agarose-2.2 M HCHO-Gel in 1 × MOPS-Puffer, der 200 mM MOPS (3-[N-morpholin]propansulfonat), 50 mM Natriumacetat und 10 mM Natrium-EDTA enthielt, hergestellt, um 10 μm RNA pro Bahn zu erhalten. Danach wurde die RNA in 20 × SSC-Lösung, die 3 M NaCl und 0,3 M Natriumcitrat (pH-Wert 7,0) enthielt, auf eine Biodyne-A-Membran (Poll) transferiert. 50 bis 100 ng GST-π-DNA-Sonde (Nakagawa, K. et al., J. Biol. Chem., 265, 4296–4301, 1990) wurden durch Zufalls-Oligoprimer-Elongation unter Verwendung von 32P-dCTP (NEN) markiert. Die vorstehend erwähnte Nylonmembran, auf die die RNA transferiert wurde, wurde mit ultravioletter Strahlung vernetzt und mit der vorstehend erwähnten Sonde hybridisiert. Diese Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
  • Die Expression der GST-π-mRNA von Caki-1-Zellen wurde durch Cisplatin überhaupt nicht beeinträchtigt. Wurde jedoch IL-6-Antikörper oder IL-6R-Antikörper zugesetzt, so ging die GST-π-mRNA-Expression zurück. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde angenommen, dass der Rückgang des Expressionsausmaßes von GST-π-mRNA an der Zunahme der Empfindlichkeit von Nierenzellkarzinom für Cisplatin, die durch IL-6-Antikörper oder IL-6R-Antikörper verursacht wird, beteiligt ist.
  • Industrielle Verwendbarkeit
  • Die Empfindlichkeit von Tumorzellen für Antitumormittel wurde bei geringeren Dosen als ein Ergebnis der Kombination von IL-6-Antagonisten wie dem IL-6-Antikörper oder dem IL-6R-Antikörper mit Antitumormitteln beobachtet, wodurch bestätigt wird, dass durch IL-6-Antagonisten und Antitumormittel kombinierte Wirkungen gezeigt werden. Darüber hinaus wurde bewiesen, dass Tumorzellen, die auf die Therapie mit Antitumormitteln eine Resistenz zeigten, durch IL-6-Antagonisten, die ihre Empfindlichkeit für Antitumormittel verstärkten, behandelbar sind.
  • Zusätzlich ist der Antitumormittel-Effektverstärker, der einen IL-6-Antagonisten der vorliegenden Erfindung umfasst, in der Lage, die cytotoxische Wirkung von Antitumormitteln auf Gewebe dadurch zu reduzieren, dass er es ermöglicht, die benötigte Dosis des Antitumormittels zu verringern, wodurch ihm beträchtliche Bedeutung bei der Verwendung als Verstärker der Wirkung von Antitumormitteln verliehen wird.

Claims (4)

  1. Verwendung eines Interleukin-6(IL-6)-Antagonisten für die Herstellung eines Medikaments für die Steigerung der Wirkung von Cisplatin oder Carboplatin bei der Behandlung eines Tumors, wobei der IL-6-Antagonist der PM-1- oder MH166-Antikörper ist und wobei der Tumor ein Nierenzellkarzinom ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein PM-1-Antikörper ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Antikörper ein humanisierter PM-1-Antikörper ist.
  4. Verwendung eines IL-6-Antagonisten und eines Antitumormittels ausgewählt aus Cisplatin und Carboplatin für die Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung eines Tumors, wobei die Zusammensetzung im Hinblick auf die Wirkung des Antitumormittels alleine eine erhöhte antitumorale Wirkung hat, und wobei der IL-6-Antagonist der PM-1-Antikörper oder der MH166-Antikörper gegen den IL-6-Rezeptor ist, und wobei der Tumor ein Nierenzellkarzinom ist.
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