CN101246160B - 在体外用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R结合的分子模型 - Google Patents
在体外用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R结合的分子模型 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101246160B CN101246160B CN2007100531424A CN200710053142A CN101246160B CN 101246160 B CN101246160 B CN 101246160B CN 2007100531424 A CN2007100531424 A CN 2007100531424A CN 200710053142 A CN200710053142 A CN 200710053142A CN 101246160 B CN101246160 B CN 101246160B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sil
- people
- hole
- pbst
- bath
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种人白细胞介素-6(interluekin-6，IL-6)在原核细胞中的表达和采用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R(solubleinterluekin-6 receptor，sIL-6R)特异结合的体外分子模型，及该分子模型在药物筛选中的应用方法。其特征是：经过原核表达的IL-6与其受体sIL-6R特异性结合形成具有生物学活性的IL-6/sIL-6R复合物。所述分子模型的优化条件为：包被IL-6R 1∶500；加入IL-61∶1000及IL-6抗体1∶2000。采用本发明建立的IL-6/sIL-6R结合的分子模型具有高通量的特性，利用该分子模型可以寻找有效阻断IL-6/sIL-6R生物活性的药物，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种人白细胞介素-6(interluekin-6，IL-6)在原核细胞中的表达和采用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R(solubleinterluekin-6 receptor，sIL-6R)特异结合的体外分子模型，及该分子模型在药物筛选中的应用方法。
背景技术
白细胞介素-6(interluekin-6，IL-6)是一种由淋巴类及非淋巴类细胞分泌产生的具有复杂生物学功能的细胞因子，如成纤维细胞、单核细胞、某些T细胞系等都可以产生。IL-6在机体的免疫应答调节、急性期应答反应和造血过程中均起着重要作用，是迄今发现的功能最为广泛的细胞因子之一。它可以促进多种细胞的增殖和分化，刺激T细胞增殖、促进T细胞产生IL-2及表达IL-2受体；诱导细胞毒T细胞和巨噬细胞的分化，特别是在诱导B细胞分化成能分泌抗体的浆细胞方面起重要的作用。
成熟的IL-6含有184个氨基酸残基，分子量为26KD的糖蛋白。人IL-6前体为212肽，包括一段28肽的信号肽，转录后修饰时有N糖基化、0糖基化和磷酸化。其中N端23个氨基酸残基对整个IL-6分子组成起稳定作用。IL-6分子中有4个半胱氨酸，形成两对二硫键(Cy544-Cys50和Cys83)，其活性要求Cys正确配对。IL-6由4个反平行排列的α螺旋和C端(171-181位氨基酸)受体结合点组成，其中第179个精氨酸残基对于和受体的结合非常重要。
IL-6通过与靶细胞表面的特异性受体结合而发挥其生物学作用。IL-6R系统由两条多肽链组成：α链即配体结合链，β链即信号传导链(gp130)，IL-6首先与α链低亲和力连接，然后复合物募集gp130形成具有信号传导功能的高亲和力复合物IL-6/IL-6Rα/gp130，gp130的胞浆区是信号传递的关键。只有破骨细胞及肝细胞等的细胞膜上存在α链受体，健康人血清中存在可溶性的IL-6Rα。gp130分布极其广泛，这是其具有广泛生物学功能的物质基础。
IL-6有多个方面的生物学活性，包括调节免疫应答、调节造血系统、调节神经内分泌系统及诱导炎症反应的急性期蛋白等。
IL-6具有调节肿瘤细胞生长的作用，促进杂交瘤、浆细胞瘤、骨髓瘤、结肠癌、Kaposi肉瘤等肿瘤细胞生长和转移。
许多研究表明IL-6是病理状态下调节骨吸收的重要因子，IL-6可与IL-3协同刺激粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)的增殖，促使CFU-GM中早期破骨细胞前体细胞的形成。另外IL-6在自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、结肠炎、系统性红斑狼疮的发生和发展中具有重要作用。
基因工程技术自20世纪70年代初产生后发展迅速，Tonouchi报道了在大肠杆菌中表达IL-6的基因工程方法。到目前为止，外源真核基因在原核细胞中的表达是人类了解最深入，实际应用最广泛的表达系统。80年代以前，以大肠杆菌为宿主，表达真核cDNA、细胞毒素及病毒抗原基因等，为人类获取大量有价值的多肽及蛋白质开辟了一条新的途径。
由于IL-6/sIL-6R在各种病理中具有重要的作用，因此寻找有效阻断IL-6/sIL-6R生物活性的药物，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种在体外用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R结合的高通量分子模型及该分子模型在拮抗剂筛选中的应用方法。
本发明的技术方案是这样实现的：其特征是经过原核表达的IL-6与其受体sIL-6R在体外特异性结合，模拟体内形成具有生物学活性的IL-6/sIL-6R/gP130，然后通过ELISA方法定量测定IL-6/sIL-6R的结合。
所述分子模型的优化条件为：包被IL-6R 1∶500；IL-6 1∶1000；IL-6抗体1∶2000。
所述的原核表达的IL-6是通过下述方法表达得到的：
(1)、用经过RT-PCR扩增的人IL-6 cDNA片段与原核表达载体pET28a(+)连接，转入宿主细胞，建立表达载体，见图1-1；
(2)、将正确构建的重组质粒转入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达和SDS-PAGE电泳，选取表达量最高的菌作为原始菌种保存备用；
(3)、将原始菌种进行培养和诱导表达，提取包涵体。所述的原核表达的sIL-6R是通过下述方法表达得到的：
(1)、用经过RT-PCR扩增的人sIL-6R片段与原核表达载体PET15b连接，转入宿主细胞，建立表达载体；
(2)、将构建好的重组质粒pET15b-sIL-6R转化到宿主菌BL21(DE3)中进行诱导表达和SDS-PAGE电泳，选取表达量最高的菌作为原始菌种保存备用；
(3)、将原始菌种进行培养和诱导，提取包涵体。
本发明分子模型的建立方法包括以下ELISA步骤：
(1)、用包被液稀释IL-6R至所需浓度1∶500，然后包被于96孔板内，100uL/孔，用透明胶封闭后放入4℃过夜；
(2)、0.05％吐温20-磷酸缓冲液(PBST)洗三次，再用1％牛血清白蛋白(BSA)封闭，300uL/孔，37℃，1小时；
(3)、用PBST洗三次，用1％BSA稀释IL-6至所设计的浓度梯度，100uL/孔，室温2小时；
(4)、用PBST洗三次，用1％BSA稀释IL-6抗体至所设计的浓度，100uL/孔，37℃，1小时；
(5)、用PBST洗三次，加酶标羊抗兔抗体，1∶10000稀释，100uL/孔，37℃，1小时。
(6)、四甲基联苯胺(TMB)显色，100uL/孔，10min；
(7)、终止反应，50uL/孔(2M H28O4)。
(8)、在酶标仪上用450nm波长读取吸光度值。
采用本发明建立的分子模型可以用于筛选能够阻断IL-6/sIL-6R结合的药物，它包括以下步骤：
(1)、用包被液稀释IL-6R至所需浓度1∶500，然后包被于96孔板内，100uL/孔，用透明胶封闭后放入4℃冰箱过夜；
(2)、PBST洗三次，再用1％BSA封闭300uL/孔，37℃，1小时；
(3)、用PBST洗三次，50uL/孔化合物(用1％BSA in PBS稀释至所需浓度)+50ul/孔IL-6(用1％BSA稀释至1∶500)；阳性对照：50uL/孔IL-6(用1％BSA稀释至1∶500)+50uL/孔1％BSA in PBS，阴性对照：100uL/孔1％BSA in PBS。室温2小时；
(4)、用PBST洗三次，用1％BSA稀释IL-6抗体1∶2000，100uL/ 孔，37℃，1小时；
(5)、用PBST洗三次，加酶标羊抗兔抗体，1∶10000稀释，100uL/孔，37℃，1小时；
(6)、TMB显色，100uL/孔，10分中；
(7)、终止反应，50uL/孔(2M H2SO4)；
(8)、置酶标仪上测波长450nm下的吸光值；
(9)、用上述分子模型对药物进行筛选。
采用本发明建立的IL-6/sIL-6R结合的分子模型具有高通量的特性，利用该分子模型可以寻找有效阻断IL-6/sIL-6R生物活性的药物，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1-1为pET28a(+)-IL-6表达载体的构建图；
图1-2为琼脂糖凝胶电泳IL-6 RT-PCR鉴定结果图；M-1000bpMaker；1-IL-6 RT-PCR；
图1-3为重组质粒PET28a(+)-IL-6 NcoI和XhoI双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果图；M-1000bp Maker；1-重组质粒PET28a(+)-IL-6；
图1-4为重组质粒PET28a(+)-IL-6诱导表达后SDS-PAGE电泳图；M-Protein Maker；1-未加IPTG诱导表达菌；2-加IPTG诱导表达；
图2-1为重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图；M-Protein Maker；1-SDS-PAGE胶第1次洗脱；2-SDS-PAGE胶第2次洗脱；3-SDS-PAGE胶第3次洗脱；4-SDS-PAGE胶第4次洗脱；5-未加IPTG诱导表达菌；
图2-2为用IL-6 ELISA试剂盒鉴定和定量表达纯化的IL-6蛋白；
图3为ELISA测定IL-6抗体(兔血清)；
图4为PET15b-sIL-6R表达载体的构建图；
图4-1为琼脂糖凝胶电泳sIL-6R RT-PCR鉴定结果图；1-1kbMaker；2-RT-PCR；
图4-2为重组质粒PET15b-sIL-6R BamH I和Xho I双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果图；1-1kb Maker；2-重组质粒PET15b-sIL-6R；
图4-3为重组质粒PET15b-sIL-6R诱导表达后SDS-PAGE电泳图；1-Protein Maker；2-未加IPTG诱导表达菌；3、4-加IPTG诱导表达；
图4-4为重组pET15b-sIL-6R蛋白Western Blot检测图；1-未加 IPTG诱导表达菌；2、3-加IPTG诱导表达；
图5为IL-6/sIL-6R ELISA优化条件；
图6A为应用IL-6/sIL-6R ELISA分子模型对不同化合物的筛选
图6B-1为应用IL-6/sIL-6R ELISA分子模型对候选化合物的量效关系测定
图6B-2为应用IL-6/sIL-6R ELISA分子模型对候选化合物的量效关系测定
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：人IL-6原核表达质粒的构建及蛋白表达
用经过RT-PCR扩增的人IL-6 cDNA片段与载体pET28a(+)连接，转入宿主细胞，建立表达载体，见图1-1。
所用菌种DH5α、BL21(DE3)、载体PET28a(+)均为现有技术；
培养基按下述方法制备
LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加单蒸水至1000mL，用5M NaOH调pH至7.0，121℃灭菌20min
LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，Agarose 15g，加单蒸水至1000mL，用5M NaOH调pH至7.0，121℃灭菌20min
(1)、人淋巴细胞的分离与培养
无菌采取新鲜抗凝血，用D-Hank’s液等体积稀释，然后取无菌离心管，加入3mL淋巴细胞分离液，将稀释得血液用移液枪沿离心管壁小心加至淋巴细胞分离液的上层，此时上下两层界限明显。2500rpm离心20min，在上下液体的交界处可见一白膜层。用无菌毛细吸管吸取该白膜层于另一干净无菌的离心管中，加入D-Hank’s液后用毛细吸管轻轻吹打混匀。3000rpm离心15min，吸弃上清液，将细胞沉淀用D-Hank’s液洗3次，之后加入RMPI 1640完全培养液，轻轻吹打使细胞完全分散。从中取少量细胞悬液，用RMPI1640完全培养液做50倍稀释，加入一滴0.4％台盼兰染液，用白细胞计数器在显微镜下计数，此时活的淋巴细胞无色而死细胞被染成兰色。计数后，用RMPI1640完全培养液调至1×106细胞/mL，置于37℃ 5％CO2的培养箱内孵育4h，PHA(5μg/mL)诱导。在37℃，5％CO2条件下刺激诱导5天后收集细胞。
(2)、总RNA的提取
淋巴细胞培养2天后，将培养的人淋巴细胞1000rpm离心收取，参照总RNA提取试剂盒的使用说明书：将培养的淋巴细胞上清液用吸管小心吸去，加入500μL Trizol Reagent，一起移入1.5mL DEPC处理的灭菌离心管中，轻微振荡混匀；室温下静止5min，加入200μL氯仿，用力颠倒离心管以混匀，高速离心10min，分开有机相和水相。小心取水相500μL到另一干净1.5mL离心管中，加入氯仿抽提1次。然后吸出上清入干净离心管中，加入0.1倍体积3M乙酸钠(pH5.2)和2倍体积无水乙醇，-70℃沉淀30min后，4℃，高速离心10min沉淀RNA。再加入250μL 75％乙醇，彻底混匀，再以7500rpm，低温离心5min。弃上清，室温放置干燥RNA，加20μL无RNase水溶解RNA，55-60℃孵育10min后，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-70℃保存备用(实验中所用的离心管和枪头均经DEPC处理)。
(3)、RT-PCR扩增目的片段
RT反应在0.5mL的PCR反应管中加入如下溶液及试剂进行反转录：
总RNA悬液 10μL
Oligo dT引物 1μL
混匀后85℃预变性5min，迅速置于冰浴5min，然后加入下列试剂：
5×MMLV缓冲液4μL
2.5mmol/L dNTP Mixture 1μL
Rnasin(50u/μL)0.5μL
反转录酶(MMLV RT)1μL
DEPC水2.5μL
混匀后简短离心，置37℃水浴中反应1h，之后95℃5min灭活反转录酶。
PCR扩增目的基因：在PCR反应管中加入下列溶液及试剂：
反转录(RT)产物2μL
10×PCR缓冲液5μL
2.5mmol/L dNTP Mixture 4μL
25mmol/L MgCl2 3μL
引物(50pmol/μL)2μL
Taq酶(1U/μL)1μL
H2O 33μL
混匀后置于PCR仪中，95℃预变性5min后，进行如下循环：94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s。30个循环之后，72℃延伸5min。扩增完成之后，取PCR产物5μL用1.0％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)电泳，观察结果(图1-2)。
(4)、PCR产物和PET28a(+)载体双酶切及酶切片段的纯化
IL-6 PCR产物和PET28a(+)载体酶切体系(50μL)：PET28a(+)/IL-6 PCR产物3μL、10×Buffer TangoTM 10μL、NcoI1.5μL、Xho I 1.5μL，ddH2O 34μL，37℃水浴1h。向酶切液中加10μL 6×凝胶加样缓冲液I，1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下含目标条带的片段，转移到1mL离心管中。用Gel Extracting.Kit(200)胶回收试剂盒纯化，向管中加700μL Binding Buffer，55℃-65℃热浴直至胶完全溶解，混匀，把液体加入柱子中，室温下，10000r/min离心1min，弃离心液；再加300μL Binding Buffer离心，弃离心液；用700μL SPW Wash Buffer洗两次，弃离心液，再空转1min，吸尽边缘上的残液，将柱置于一干净的1.5mLEP管中，加20μL ddH2O，静置1-2min，10000r/min离心1min，收集离心液，即为纯化回收的载体片段。取1μL该片段加1μL 6×凝胶加样缓冲液I，用1％琼脂糖凝胶电泳定量。
(5)、连接转化
20μL连接体系：PET28a(+)2μL，IL-6 PCR产物6μL、10×T4 Ligase Buffer 2μL、T4 ligase 1μL、ddH2O 9μL，16℃水浴过夜。取6μL连接产物加入感受态细胞DH5α中，冰浴30min后放入42℃的水中热休克90秒，冰置2min，加300μL LB(-)培养液，37℃，220r/min培养30min。将转化菌200μL涂含67μg/mL Kana的LB固体培养基上，37℃培养过夜。
(6)、重组质粒的提取及试剂盒纯化
取30μL为阳性菌的培养液于2mL含67μg/mL Kana的LB培养液，37℃，220r/min培养过夜；取1mL于1.5mL离心管中，12000r/min离心1min，去上清液，用150μL Solution I悬菌，加200μL Solution II轻轻倒置几次，冰上冷却；再加150μL SolutionIII混匀，冰上放置5min；4℃，12000r/min离心5min，将上清转移 至一新离心管中，加等体积1∶1的酚/氯仿混匀，4℃，12000r/min离心5min；将上清转移至一新离心管中，向离心液中加两倍体积的异丙醇混匀，4℃，12000r/min离心10min，弃上清，再加1mL70％乙醇，悬浮沉淀，4℃，12000r/min离心5min，弃上清，空转，吸干离心液，通风橱中干燥；向沉淀中加20μL 20ug/mLTE Rnase，37℃水浴1h。2μL质粒+1μL 6×凝胶加样缓冲液I，1％琼脂糖凝胶电泳，检测提取结果。
(7)、重组质粒双酶切鉴定
50μL酶切体系：纯化PET28a(+)(+)-IL-65μL，10×BufferTangoTM 10μL，NcoI 1.5μL，XhoI 1.5μL，ddH2O 32μL，37℃水浴1h。向酶切液中加10μL 6×凝胶加样缓冲液I，1％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。提取质粒，用NcoI和Xho I进行双酶切鉴定，切出预期540bp的片段，见图1-3，说明重组质粒PET28a(+)-IL-6正确连入。
(8)、重组质粒的诱导表达
取2μL经酶切鉴定好的重组质粒转入感受态细胞BL21(DE3)中，取50μL涂含67μg/mL Kana的LB固体培养基，培养过夜。次日挑取单克隆接种于3ml含有67μg/mL Kana的LB培养液，在37℃，220r/min下培养过夜。按1∶10的接种量接入2mL含20μg/mlkana的LB培养液培养2-3h，加4μL 0.1M IPTG诱导4h。取100μL培养液离心，弃上清，加100μL 2×SDS上样缓冲液混匀，水煮5min，样品进行SDS-PAGE电泳(5％浓缩胶，12％分离胶，配方见表1-1A，B)，考马斯亮蓝染色20min，用洗脱液洗脱过夜，凝胶显色仪成相。
表1-1A 5％浓缩胶配方
| ddH2O(mL) | 0.5M Tris-HCl PH 6.8(mL) | 40％Acrylamide：bis (mL) | 10％SDS (μL) | TEMED (μL) | 10APS (μL) | |
| 2mL 1mL | 1.280.64 | 0.5 0.25 | 0.22 0.11 | 20 10 | 2 1 | 5 2.5 |
表1-1B 12％分离胶配方
| ddH2O(mL) | 1.5M Tris-HCl PH 8.8(mL) | 40％Acrylamide：bis (mL) | 10％SDS (μL) | TEMED (μL) | 10APS (μL) |
[0101]
| 7.5mL 3.75mL | 3.27 1.63 | 1.88 0.94 | 2.25 1.13 | 75 37.5 | 5 2.5 | 25 12.5 |
将正确构建的重组质粒转入感受态BL21(DE3)中，诱导表达，SDS-PAGE电泳，在22KD处有特异条带蛋白表达，见图1-4，说明表达载体按照设计的方式正确表达，并且初步确定该载体可在BL21(DE3)中高量表达。并在其中选取表达量最高的菌作为原始菌种暂置4℃冰箱中保存备用。
实施例二：包涵体的提取及蛋白活性的检测
IL-6为构建好的BL21(DE3)PET28a(+)-IL-6表达菌，将其进行大量培养，提取包涵体，为随后的表达蛋白活性的测定提供基础。
(1)、包涵体的制备及纯化
取100μL原始菌种到5mL含67μg/mL Kana的LB培养液中，在37℃，220r/min下过夜培养，按1∶25接种量接种在50mL含20μg/ml Kana的LB培养基，37℃，220r/min培养2h后加500μL 0.1MIPTG诱导表达4h。6000r/min离心5min收集菌体，菌体用2mL PBS悬浮后分装两个1.5mLEP管离心，弃上清。加30mL溶液A将诱导后表达菌悬起，充分混匀，冰护下超声破碎，超声2s间隔2s，2min一个循环，共超声6个循环；然后垂直混合30min，4℃12000r/min离心10min，沉淀用30mL溶液B悬浮，垂直混合15min，4℃12000r/min离心10min，沉淀即为包涵体。沉淀用1mL不含尿素的溶液B和1mL 2×上样缓冲液混匀，水煮5min，SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE胶用冰冷的0.25M KCl染色5-10min，切下目标蛋白，碾碎，加等体积的水和不含尿素的溶液B，4℃放置过夜，低温离心取上清，即为洗脱的纯蛋白，用如上方法洗脱4次，SDS-PAGE电泳鉴定纯度和含量测定。
(2)、表达蛋白的ELISA鉴定
按照R&D公司产品说明书操作：用包被液将抗体200x稀释，每孔100μL稀释液包被ELISA板，用塑料膜封口，于4℃包被过夜；用PBST洗涤1次，去掉残液，每孔加150μL封闭液(含1％BSA的PBST液)在37℃封闭1h；用PBST洗涤2次，去掉残液，将纯化的表达蛋白分别按1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000倍稀释，及BSA作为阴性对照，每孔加100μL，室温放置2h；用PBST洗涤3次，去掉残液，将生物素标记的IL-6抗体200倍稀释后，每孔加100μL，室温 放置2h；用PBST洗涤3次，去掉残液，将辣根酶标记的亲和素稀释后，每孔加100μL，用塑料膜封口，室温放置30min；用PBST洗涤3次，去掉残液，每孔加100μL TMB，避光显色5-10min，然后加50μL 2M H2SO4终止反应，在450nm下测定反应液的0D值。
包涵体经电泳切胶和洗脱后，SDS-PAGE电泳结果得到纯度和浓度很高的目标蛋白，这也充分说明了IL-6是以包涵体形式来表达的，见图2-1。从图可以看出表达蛋白通过SDS-PAGE纯化，可以得到纯度和浓度很高的蛋白。用IL-6试剂盒鉴定表达蛋白，由图2-2可知该菌表达的蛋白为IL-6，并具有很高的免疫活性。同时制备IL-6的多克隆抗体，用IL-6蛋白(R&D产品)鉴定抗血清，结果见图3，证实抗血清为IL-6多克隆抗体，并具有很高的免疫活性。
实施例三：人sIL-6R原核表达质粒的构建及蛋白表达
用RT-PCR扩增的人sIL-6R片段与载体PET15b连接，转入宿主细胞，建立表达载体，见图4。
(1)、pET15b-sIL-6R重组质粒的构建
选择sIL-6R的胞外区片断设计相应引物，以人PBMC cDNA为模板，PCR方法扩增sIL-6R基因。其引物中分别引入酶切位点BamHI/XhoI，原核表达载体pET15b用BamHI/XhoI双酶切将其线性化后，与目的基因的酶切产物于16℃连接过夜，取5μL连接产物转入大肠杆菌DH5a中，接种含67μg/mL Amp的LB固体培养基中，37℃到置培养过夜。挑取单克隆至含67μg/mL Amp的LB培养基中，37℃，220r/min培养过夜，次日提取质粒进行酶切和测序鉴定。
(2)、pET15b-sIL-6R蛋白原核表达与鉴定
将构建好的重组质粒pET15b-sIL-6R转化到宿主菌BL21(DE3)(DE3)中，，取50μL涂含67μg/mL Amp的LB固体培养基，培养过夜。次日挑取单克隆接种于3ml含有67μg/mLAmp的LB培养液，在37℃，220r/min下培养过夜。按1∶10的接种量接入2mL含20μg/mlAmp的LB培养液培养2-3h，加IPTG(终浓度为1mmol/l)诱导4h。取100μL培养液离心，弃上清，加100μL 2×SDS上样缓冲液混匀，水煮5min，样品进行SDS-PAGE电泳(5％浓缩胶，12％分离胶，配方见表1-1A，B)，考马斯亮蓝染色20min，用洗脱液洗脱过夜，凝胶显色仪成相。
Western Blot检测重组pET15b-sIL-6R蛋白
电泳：根据考马斯亮蓝染色结果选择上样量，上3ul预染PRO-MARKER，进行SDS-PAGE电泳。
转膜：电泳后转至硝酸纤维素膜，冰护下电转膜维持330-350mA，2小时。
封闭：用10mL 5％脱脂牛奶(TBST稀释)封闭硝酸纤维素膜，摇床放置2-3小时，TBST洗涤3次，每次5分钟。
加一抗：加1∶200稀释兔抗IL-6R(TBST稀释)1.5ml，室温轻摇作用2h；TBST洗涤3次，每次5分钟
加二抗：加1∶3000稀释HRP-标记的羊抗兔IgG(TBST稀释)1.5mL，室温下摇床放置2-3小时，TBST洗涤3次，每次5分钟。
DAB显色：在新配制的二氨基联苯胺(DAB)和0.03％H2O2溶液中于室温下摇动至出现紫黄色条带，蒸馏水冲洗终止显色。
实验结果为RT-PCR产物鉴定，得到预期的1017bp片段，见图4-1。提取质粒，用BamH I和Xho I进行双酶切鉴定，切出预期1017bp的片段，见图4-2，说明重组质粒PET15b-sIL-6R正确连入。将正确构建的重组质粒转入感受态BL21(DE3)中，诱导表达，SDS-PAGE电泳，在42KD处有特异条带蛋白表达，见图4-3，说明表达载体按照设计的方式正确表达，并且初步确定该载体可在BL21(DE3)中高量表达。并在其中选取表达量最高的菌作为原始菌种暂置4℃冰箱中保存备用。通过Western Blot检测在42Kd处得出目的片段，见图4-4，说明表达的蛋白为重组pET15b-sIL-6R蛋白。
实施例四；IL-6/sIL-6R结合的ELISA方法的建立
IL-6与其受体特异性结合形成具有生物学活性的IL-6/IL-6R/gP130六聚体，介导胞内信号转导，从而诱导靶基因的表达，以实现其生物学功能，本实验在体外用ELISA方法建立了IL-6/sIL-6R结合的分子模型。
IL-6、sIL-6R、IL-6抗体均由前面获得。
1.用包被液稀释sIL-6R至所需浓度，然后包被于96孔板内，100uL/孔，用透明胶封闭后放入4℃冰箱过夜。
2.PBST洗三次，再用1％BSA封闭，300uL/孔，37℃，1h。
3.用PBST洗三次，用1％BSA稀释IL-6至所设计的浓度梯度，100uL/孔，室温2h。
4.用PBST洗三次，用1％BSA稀释IL-6抗体至所设计的浓度，100uL/孔，37℃，1h。
5.用PBST洗三次，加酶标抗体(羊抗兔)，1∶10000稀释，100uL/孔，37℃，1h。
6.TMB显色。100uL/孔，10min。
7.终止反应。50uL/孔(2M H2SO4)。
8.置酶标仪上测波长450nm下的吸光值。
IL-6，sIL-6R，IL-6抗体的浓度，用PBST洗板的次数及温度和反应时间等均可影响IL-6/sIL-6R的特异性结合，对ELISA的实验结果产生影响。本实验通过改变IL-6，sIL-6R，IL-6抗体的浓度来摸索该模型的最佳优化条件。结果见下表和图5
| 包被IL-6R | 500X | 500X | 500X | 500X | 500X | 500X | 500X | 500X |
| IL-6 | N | N | N | N | 1000X | 1000X | 1000X | 1000X |
| IL-6抗体 | 2000X | 2000X | 6000X | 6000X | 2000X | 2000X | N | N |
| OD值 | 0.21169 | 0.11851 | 2.40083 | 0.07408 |
| 包被IL-6R | 500X | 500X | 500X | 500X | 500X | 500X | 500X | 500X |
| IL-6 | N | N | 1000X | 1000X | N | N | 1000X | 1000X |
| IL-6抗体 | 2000X | 2000X | 2000X | 2000X | 6000X | 6000X | N | N |
| HRP | 10000X | 10000X | 10000X | 10000X | 10000X | 10000X | 10000X | 10000X |
| OD值 | 0.21795 | 0.20543 | 2.38733 | 2.41433 | 0.12918 | 0.10784 | 0.07413 | 0.07403 |
| OD值(平均) | 0.21169 | 2.40083 | 0.11851 | 0.07408 |
ELISA最优条件：包被IL-6R 1∶500；IL-6 1∶1000；IL-6抗体1∶2000
实施例五：IL-6/sIL-6R结合的ELISA模型在药物筛选中的应用
1.用包被液稀释sIL-6R至所需浓度(1∶500)，然后包被于96孔板内，100uL/孔，用透明胶封闭后放入4℃冰箱过夜。
2.PBST洗三次，再用1％BSA封闭 300uL/孔，37℃，1h。
3.用PBST洗三次，50uL/孔化合物(用1％BSA in PBS稀释至所需浓度)+50ul/孔IL-6(用1％BSA稀释至1∶500) 阳性对照：50uL/孔IL-6(用1％BSA稀释至1∶500)+50 uL/孔1％BSA in PBS，阴性对照：100uL/孔 1％BSA in PBS。RT，2h。
4.用PBST洗三次，用1％BSA稀释IL-6抗体1∶2000，100uL/ 孔，37℃，1h。
5.用PBST洗三次，加酶标抗体(羊抗兔)，1∶10000稀释，100uL/孔，37℃，1h。
6.TMB显色。100uL/孔，10min。
7.终止反应。50uL/孔(2M H2SO4)。
8.置酶标仪上测波长450nm下的吸光值。
先用ELISA模型对1、2、3、4、6、10等20多种药进行高通量筛选，结果见图6A，根据公式计算抑制率：抑制率％＝(阳性对照OD值-实验组0D值)*100/(阳性对照OD值-阴性对照组0D值)，与阳性对照比较，抑制率达到50％以上的药物具有抑制作用，作为候选药物。对效果比较明显的11、14、15、PL、TTB2、TTB5六种药做浓度梯度稀释，前三种药各稀释25、50、100、200倍，后三种各做1、2、4倍三种浓度稀释。结果图6B-1、6B-2。
Claims (3)
1.一种在体外用ELISA方法建立的人IL-6/sIL-6R结合的分子模型，其特征是：经过原核表达的人IL-6与其受体人sIL-6R特异性结合形成具有生物学活性的IL-6/sIL-6R复合物，所述分子模型的优化条件为：包被人sIL-6R 1∶500；人IL-61∶1000；人IL-6抗体1∶2000，分子模型的建立步骤为：
(1)、用包被液稀释人sIL-6R至所需浓度1∶500，然后包被于96孔板内，100uL/孔，用透明胶封闭后放入4℃冰箱过夜；
(2)、PBST洗三次，再用1％BSA封闭，300uL/孔，37℃，1小时；
(3)、用PBST洗三次，用1％BSA稀释人IL-6至所需浓度1∶1000，100uL/孔，室温2小时；
(4)、用PBST洗三次，用1％BSA稀释人IL-6抗体至所需浓度1∶2000，100uL/孔，37℃，1小时；
(5)、用PBST洗三次，加酶标羊抗兔抗体，1∶10000稀释，100uL/孔，37℃，1小时；
(6)、TMB显色，100uL/孔，10min；
(7)、终止反应，50uL/孔、2M H2SO4；
其中所述的原核表达的人IL-6是通过下述方法表达得到的：
(1)、用经过RT-PCR扩增的人IL-6cDNA片段与原核表达载体pET28a(+)连接，转入宿主细胞，建立表达载体；
(2)、将正确构建的重组质粒转入感受态BL21中进行诱导表达和SDS-PAGE电泳，选取表达量最高的菌作为原始菌种保存备用；
(3)、将原始菌种进行培养，提取包涵体；
其中所述的原核表达的人sIL-6R是通过下述方法表达得到的：
(1)、选择人sIL-6R的胞外区片段设计相应引物，以人PBMCcDNA为模板，PCR方法扩增sIL-6R基因，用经过RT-PCR扩增的人sIL-6R基因与原核表达载体PET15b连接，转入宿主细胞，建立表达载体；
(2)、将构建好的重组质粒pET15b-sIL-6R转化到宿主菌BL21中进行诱导表达和SDS-PAGE电泳，选取表达量最高的菌作为原始菌种保存备用；
(3)、将原始菌种进行培养和诱导，提取包涵体。
2.一种在体外用ELISA方法建立人IL-6/sIL-6R结合的分子模型的方法，将经过原核表达的人IL-6与其受体人sIL-6R特异性结合形成具有生物学活性的IL-6/sIL-6R复合物，其分子模型的优化条件为：包被人sIL-6R 1∶500；人IL-61∶1000；人IL-6抗体1∶2000；它包括以下步骤：
(1)、用包被液稀释人sIL-6R至所需浓度1∶500，然后包被于96孔板内，100uL/孔，用透明胶封闭后放入4℃冰箱过夜；
(2)、PBST洗三次，再用1％BSA封闭，300uL/孔，37℃，1小时；
(3)、用PBST洗三次，用1％BSA稀释人IL-6至所需浓度1∶1000，100uL/孔，室温2小时；
(4)、用PBST洗三次，用1％BSA稀释人IL-6抗体至所需浓度1∶2000，100uL/孔，37℃，1小时；
(5)、用PBST洗三次，加酶标羊抗兔抗体，1∶10000稀释，100uL/孔，37℃，1小时。
(6)、TMB显色，100uL/孔，10min；
(7)、终止反应，50uL/孔、2M H2SO4；
其中所述的原核表达的人IL-6是通过下述方法表达得到的：
(1)、用经过RT-PCR扩增的人IL-6cDNA片段与原核表达载体pET28a(+)连接，转入宿主细胞，建立表达载体；
(2)、将正确构建的重组质粒转入感受态BL21中进行诱导表达和SDS-PAGE电泳，选取表达量最高的菌作为原始菌种保存备用；
(3)、将原始菌种进行培养，提取包涵体；
其中所述的原核表达的人sIL-6R是通过下述方法表达得到的：
(1)、选择人sIL-6R的胞外区片段设计相应引物，以人PBMCcDNA为模板，PCR方法扩增sIL-6R基因，经过RT-PCR扩增的人sIL-6R基因与原核表达载体PET15b连接，转入宿主细胞，建立表达载体；
(2)、将构建好的重组质粒pET15b-sIL-6R转化到宿主菌BL21中进行诱导表达和SDS-PAGE电泳，选取表达量最高的菌作为原始菌种保存备用；
(3)、将原始菌种进行培养和诱导，提取包涵体。
3.应用权利要求1所述的分子模型筛选能够阻断IL-6/sIL-6R结合的药物的方法，它包括以下步骤：用权利要求1中的分子模型对药物进行筛选，根据公式计算抑制率：抑制率％＝(阳性对照OD值-实验组OD值)*100/(阳性对照OD值-阴性对照组OD值)，与阳性对照比较，抑制率达到50％以上的药物具有抑制作用，作为候选药物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007100531424A CN101246160B (zh) | 2007-09-06 | 2007-09-06 | 在体外用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R结合的分子模型 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007100531424A CN101246160B (zh) | 2007-09-06 | 2007-09-06 | 在体外用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R结合的分子模型 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101246160A CN101246160A (zh) | 2008-08-20 |
| CN101246160B true CN101246160B (zh) | 2012-11-21 |
Family
ID=39946735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2007100531424A Expired - Fee Related CN101246160B (zh) | 2007-09-06 | 2007-09-06 | 在体外用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R结合的分子模型 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101246160B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102608332B (zh) * | 2012-03-22 | 2015-04-08 | 电子科技大学 | 一种草鱼白细胞介素10酶联免疫检测方法 |
| CN105954522B (zh) * | 2016-07-11 | 2019-03-08 | 中国科学院福建物质结构研究所 | 活性尿激酶受体的检测 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1174507A (zh) * | 1994-12-29 | 1998-02-25 | 中外制药株式会社 | 含有il-6拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂 |
| CN1538176A (zh) * | 1993-06-23 | 2004-10-20 | ����������ݶ��˾��������ѧ�о��� | 一种利用膜分子gp130激活细胞生理调节机制筛选的激素的拮抗剂和超拮抗剂 |
-
2007
- 2007-09-06 CN CN2007100531424A patent/CN101246160B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1538176A (zh) * | 1993-06-23 | 2004-10-20 | ����������ݶ��˾��������ѧ�о��� | 一种利用膜分子gp130激活细胞生理调节机制筛选的激素的拮抗剂和超拮抗剂 |
| CN1174507A (zh) * | 1994-12-29 | 1998-02-25 | 中外制药株式会社 | 含有il-6拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 康晓平等.用于筛选人IL-6受体拮抗剂生物学活性的M1细胞模型的建立.《细胞与分子免疫学杂志》.2002,第18卷(第2期),172-174. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101246160A (zh) | 2008-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102735846A (zh) | 一种卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒及检测方法 | |
| CN107082809B (zh) | 靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体及其筛选方法 | |
| CN103787946A (zh) | 异细交链孢菌酮酸人工抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
| CN101246160B (zh) | 在体外用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R结合的分子模型 | |
| CN101402960B (zh) | 一种重组风疹病毒e1蛋白及其应用 | |
| CN103333248B (zh) | 一种cd25纳米抗体、其编码序列及应用 | |
| CN104356226A (zh) | 一种检测血浆免疫标志物-vegfr1自身抗体的抗原多肽及应用 | |
| CN102368070A (zh) | 检测人血浆中mr-1s含量的试剂盒及其制备方法 | |
| CN102676459B (zh) | 一种抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体及其制备方法 | |
| CN102020715B (zh) | 一种抗ⅲ型前胶原氨基末端肽单克隆抗体及其用途 | |
| CN101921337B (zh) | 间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用 | |
| WO2017107131A1 (zh) | Tp重组抗原及其制备方法和应用 | |
| CN107247146B (zh) | 高敏检测t细胞及功能的试剂盒、方法及其应用 | |
| KR101990858B1 (ko) | 흰반점 증후군바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| CN102221615A (zh) | 一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法 | |
| CN103555668B (zh) | 杂交瘤细胞株及其产生的抗Wnt5a单克隆抗体与应用 | |
| CN115246818A (zh) | 一种检测吡虫啉的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 | |
| CN105842440B (zh) | 人c‑反应蛋白荧光定量检测试纸卡 | |
| CN106929479A (zh) | 一株维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz‑4及其应用 | |
| CN104725492B (zh) | 一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1 | |
| CN104894073B (zh) | 杂交瘤细胞株Zj/2D8及其检测尼克酰胺‑N‑甲基化酶抗原的应用 | |
| CN101891814A (zh) | 抗骨桥蛋白opn单克隆抗体及其应用 | |
| CN104597241B (zh) | 一种检测天然多克隆抗癌抗体的组合物、试剂盒和方法 | |
| CN101514230A (zh) | Ard1的单克隆抗体及其应用 | |
| CN107024589A (zh) | 检测妊娠特异性糖蛋白3的方法、试剂盒及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121121 Termination date: 20140906 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |