CN104725492B - 一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1 - Google Patents

一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1，属于细菌表面抗原重组蛋白。其氨基酸序列如SEQ ID No.1所述，编码所述的表面抗原SurA1的核苷酸，其序列如SEQ ID No.2所述。本发明具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1，该蛋白对与人类肺上皮细胞A549表现出弱毒性，对小鼠感染鲍曼不动杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为鲍曼不动杆菌亚单位疫苗开发的候选抗原。

Description

一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1
技术领域
本发明涉及一种细菌表面抗原重组蛋白，该蛋白涉及疾病亚单位疫苗制备技术领域，同时该蛋白是一种对细胞具有毒力的蛋白。具体涉及一种鲍曼不动杆菌免疫保护性抗原的鉴定，蛋白基因的克隆以及它编码的重组蛋白在疫苗中的应用，同时该蛋白对人类肺上皮细胞A549具有毒性。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是一种重要的条件致病菌。近年来由于抗生素滥用，且其耐药性日益严重，已引起研究者的严重关注。A.baumannii主要引起呼吸道感染，也可引发败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等。A.baumannii在多种严酷环境中分布且可长期存活，对免疫缺陷患者威胁很大。
2011年吉林某鸡场发生一起由于饲料污染鲍曼不动杆菌导致60000多只雏鸡发病、3000多只雏鸡直接死亡的事件，造成严重的经济损失。先前这家公司先后发生3次类似事件，损失都很严重。我们课题组经过剖检、病理观察、病原分离、菌株形态观察和生理生化试验以及基因序列测定等手段，鉴定引起此次雏鸡死亡的病原为鲍曼不动杆菌(CCGGD2011)，并将分离的菌株通过回归实验，感染1周龄雏鸡和6-8周龄小鼠，获得了同样的感染致死能力(菌株保存于吉林大学人兽共患病研究所细菌病实验室)。CCGGD201101引起了雏鸡患病，最终引起大部分雏鸡死亡，表现出较强的致病性，这与常见的鲍曼不动杆菌不同，表现出毒力增强的现象。因为鲍曼不动杆菌耐药性日益严重，对于感染鲍曼不动杆菌后的治疗，常规抗生素可能无效，寻找其主要毒力因子，以此为基础，开发新型的免疫药物，将会对预防鲍曼不动杆菌感染发挥重大作用。
免疫保护性抗原通常是细菌重要的毒力相关因子，在细菌的粘附、侵袭等致病过程和宿主的免疫应答中发挥重要作用。许多鲍曼不动杆菌的表面蛋白已被鉴定为保护性抗原分子，然而由于这部分蛋白的生物学功能尚不清楚，其是否在A.baumannii的致病过程中发挥作用还需要进一步的研究。在致病过程中，病原菌的表面蛋白很有可能直接参与和宿主细胞相互作用。
发明内容
本发明提供一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1，用于制备鲍曼不动杆菌亚单位疫苗。
本发明采取的技术方案是：
一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所述。
编码所述的一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1的核苷酸，其序列如SEQ ID No.2所述。
包含所述的核苷酸的重组载体pET-28a-SurA1。
包含所述的重组载体的大肠杆菌工程菌株。
所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1，对于人类肺上皮细胞A549具有弱毒性,对小鼠具有免疫保护性。
所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1在制备鲍曼不动杆菌亚单位疫苗中的应用。
所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1在制备用于预防由鲍曼不动杆菌引起的疾病的药物中的应用。
一种包含所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1的疫苗组合物。
一种制备具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原的方法，所述方法包括以下步骤：
构建包含含有SEQ ID No.2所述的核酸序列的重组表达载体；
将所述重组表达载体转到宿主菌中；
培养所述经转化的宿主菌并诱导其表达所述鲍曼不动杆菌免疫保护性抗原；
对所述经过诱导的宿主细胞分离和纯化所述鲍曼不动杆菌免疫保护性抗原。
所述的方法中，宿主细胞是大肠杆菌。
本发明通过荧光差异双向电泳技术对鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,A.baumannii)全组分进行蛋白表达差异分析。目的筛选出抗原性好，保护力强的抗原蛋白，同时筛选出毒力相关蛋白，以期为发展新型亚单位疫苗的研发及血清学诊断标记奠定坚实的基础。
本发明鉴定到具有免疫保护效果的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1蛋白，来源于鲍曼不动杆菌CCGGD201101，该菌是吉林大学人兽共患病研究所细菌病研究室于2011年在吉林省农安县某养鸡场病死雏鸡中分离，经过生理生化鉴定和16s rDNA测序鉴定证明CCGGD201101为鲍曼不动杆菌，在动物回归实验中证明CCGGD201101 对雏鸡、小鼠、大蜡螟均具有致病性。从CCGGD201101分离到的SurA1蛋白对小鼠感染鲍曼不动杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为鲍曼不动杆菌亚单位疫苗的候选抗原。
为了实现本发明目的，本发明首先分离鲍曼不动杆菌CCGGD201101的全组分蛋白和参考菌株ATCC17978的全组分蛋白，然后通过差异荧光双向电泳技术分离的到表达量差异蛋白。对表达量差异蛋白进行质谱鉴定，随后对SurA1蛋白的基因进行克隆、表达、纯化。使用感染鲍曼不动杆菌后康复小鼠的血清检测SurA1蛋白，发现重组SurA1蛋白可以与康复血清反应。使用人工重组的SurA1蛋白进行小鼠的免疫保护性实验，结果表明其具有一定的免疫保护作用。
本发明具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1，该蛋白对与人类肺上皮细胞A549表现出弱毒性，对小鼠感染鲍曼不动杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为鲍曼不动杆菌亚单位疫苗开发的候选抗原。
附图说明
图1(A)是编码SurA1蛋白的基因扩增图；
图1(B)是SurA1基因表达载体双酶切载体构建图；
图2是SurA1蛋白的表达及纯化图；
图3(A)是不同鲍曼不动杆菌感染小鼠康复血清中抗SurA1抗体滴度图；
图3(B)不同鲍曼不动杆菌感染小鼠康复血清中抗SurA1Western blot图；
图4是SurA1亚单位疫苗免疫后抗CCGGD2011O1感染研究；
图5是SurA1亚单位疫苗免疫后抗ATCC17978感染研究；
图6是SurA1免疫后小鼠细胞因子表达水平分析图；
图7是SurA1免疫后小鼠血清效价水平及产生抗体类型分析图；
图8是SurA1对人类A549细胞杀伤活性图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定于本发明。下述实施例中得实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买。
实施例1、细菌蛋白样品的制备
蛋白样品制备
取-80℃冰箱冻存鲍曼不动杆菌标准株ATCC19606和分离株CCGGD201101各 1mL，分别接种于200mL液体LB培养基中培养，37℃恒温180r/min培养7h。离心前称取50mL离心管重量并分别标记，4℃，10000r/min离心10min弃上清，并用灭菌水反复离心清洗两次弃上清，收集菌体称取总重量，并计算收集细菌重量。ATCC19606和CCGGD201101均加入10mL0.1mol/L Tris-Cl悬浮沉淀，再加入100uL蛋白酶抑制剂与100uL核酶混合物充分混匀。然后进行超声破碎，功率为200w，5s/次，每次间隔15s，各超声10min，整个过程冰上操作。4℃，10000×g离心20min取上清。
二、全组分蛋白样品的荧光差异双向电泳(DIGE)
蛋白样品的荧光标记
用BCA法进行蛋白定量，用精确pH试纸调节样品pH至8.5。每400pmol染料标记50ug蛋白。1uL染料工作液(400pmol/mL)加入50ug蛋白样品中混匀，离心，避光，冰浴30min；再加入1uL 10mmol/mL赖氨酸，避光，冰浴15min进行淬灭。Cy2标记ATCC19606和CCGGD201101各25μg蛋白混合物作为内标，Cy3标记50ug ATCC19606蛋白，Cy5标记50ug CCGGD201101蛋白，做两个重复，再将Cy3标记CCGGD201101蛋白，Cy5标记ATCC19606蛋白共三个重复同时进行凝胶电泳。
双向电泳实验
(1)从-80℃冰箱取出标记蛋白，将标记Cy2、Cy3、Cy5三个样品混合，加入水化液至450uL，并加入1.4mg DTT和2.5uL IPG buffer充分混匀。
(2)将混合样品均匀加入到24cm胶条槽中，用镊子夹住IPG干胶条负极端胶面朝下，由正极端缓慢放入胶条槽中，胶面与水化液间不能产生气泡，加入1-2mL覆盖油于胶条上表面，盖上盖子。
SDS-PAGE垂直电泳
(1)灌胶：配制12.5％的聚丙烯酰胺凝胶250mL，放入超声波清洗器中除泡10min，再加入APS和TMED慢慢混匀。将配好的凝胶溶液对准灌胶模具中间凹槽滑坡面，缓慢倒入防止气泡产生，并用正丁醇封胶，室温凝胶6h。
(2)胶条平衡：取出等电聚焦后的IPG胶条垂直于滤纸上吸取覆盖油，将胶面朝上放入含1％DTT的平衡液的平衡管中，放在脱色摇床上缓慢震荡15min；取出胶条再放入含2.5％IAA的平衡液的平衡管中，缓慢震荡15min。
(3)装胶条：将凝胶玻璃板中的正丁醇倒掉，用蒸馏水清洗，并用滤纸将水吸干。胶板平放于实验台上，用镊子夹住平衡后的胶条两端，胶面朝上放在凝胶板上，用洁净薄尺将负极端推入，避免触碰胶面；将胶板直立沿负极端加入0.5％低熔点琼脂糖封胶，用薄尺向正极端推入，边加边推，防止胶面与胶条之间有气泡产生。
(4)电泳：将胶板放入电泳槽中并用遮光罩盖住进行垂直电泳。整个电泳过程均在20℃循环水浴下进行，设置电泳仪参数为600V，400mA，7h。当溴酚蓝移动到胶底部时电泳结束，取下胶板进行扫描分析。
凝胶图像扫描和分析
应用Typhoon FLA9500荧光扫描仪在473nm、532nm、635nm的激发波长下分别收集Cy2、Cy3、Cy5标记的成像。成像需先在1000μm出进行预扫描，然后使用100μm精度扫描。其中光电倍增管PMT的设置范围为250V-1000V，即三个通道中高丰度蛋白的Max Intensity值均在60000-90000之间。用DeCyder差异分析软件找出差异表达蛋白点，系统自动选择最多点的胶图为Master胶，并与另外两个胶图进行匹配。结果应用t检验分析其显著性，只有p＜0.05，蛋白表达量差异1.5倍以上才具有统计学意义。
差异蛋白点质谱分析
各取1mg蛋白进行普通双向电泳，具体方法常规双向电泳方法。用考马斯亮蓝染色液在摇床上染色2h；再用10％冰醋酸脱色液脱色，每隔1h换一次脱色液，直至背景变清晰；最后用蒸馏水清洗15min，反复清洗3次。比较制备胶与分析胶相匹配的差异蛋白点，用全自动斑点挖取系统挖取制备胶上的差异蛋白点，并放入装有灭菌水的EP管中送中国科学研上海生命科学研究院用串联飞行时间质谱仪(4800Plus MALDI-TOF/TOF TM Analyzer)进行质谱鉴定。质谱测试结果用Mascot2.2软件检索NCBI数据库，得到鉴定的蛋白质结果。
实施例2、SurA1蛋白的表达
一、A.baumannii总DNA的提取
将2ml A.baumannii CCGGD201101的过夜培养菌液12000rpm离心1min，弃上清，使用细菌总基因组DNA提取试剂盒(货号：索莱宝D1600-100)提取。
二、SurA1基因的制备
根据SurA1基因的核苷酸序列，设计引物如下：
上游引物:atggtaaaagattggattcccatc
下游引物:ctagtcttcaatgacgtgtaaacca
以A.baumannii的总基因组DNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增。
扩增体系：
Ex taq DNA聚合酶1μL
10x Ex Taq DNA聚合酶缓冲液5μL
dNTP Mix 0.4μL
基因组模板1μL
上游引物1μL
下游引物1μL
ddH2O 40.6μL
共50μL
PCR反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟30个循环，最后72℃延伸10分钟。基因扩增结果入图1(A)所示。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明所获得的序列为如序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA片段，其为编码鲍曼不动杆菌SurA1蛋白的基因。
三、重组表达载体的构建
1.将测序正确的PCR产物用双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。
2.将质粒pET28a(货号69864-3,Novagen)用双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。
3.将步骤1的酶切产物和步骤2的酶切产物进行连接，得到重组质粒。
4.将重组质粒进行测序。结果表明，在pET28a的双酶切位点之间插入了序列SEQID NO.2所示的编码鲍曼不动杆菌SurA1蛋白的基因，将该重组质粒命名为pET-28a-SurA1,载体构建结果入图1(B)所示。
四、工程菌的制备
用pET-28a-SurA1电击转化大肠杆菌BL21(DE3)后涂布于含有50μg/ml卡纳霉素的LB平板，37℃过夜培养，得到含有pET-28a-SurA1的重组菌，即为工程菌。
用pET28a代替pET28a-SurA1,转化大肠杆菌BL21(DE3),步骤同上，得到含有pET28a的重组菌，作为对照菌。
五、SurA1蛋白的制备和纯化
将以上制备的工程菌培养于含有50μg/ml卡纳霉素的LB培养基中，37℃培养4h；OD600＝0.8时，加入IPTG至终浓度0.8μM，转至37℃继续培养6～8h。
10000rpm,10分钟离心收集菌体，悬浮于PBS溶液中，于冰浴中超声破碎，之后10000rpm离心10分钟收集沉淀，将上清中加入5ml事先处理好的树脂，4℃振荡30分钟使树脂和蛋白充分结合，结合完毕，加入吸附柱中。待液体流尽，加入10ml PBS洗6次。加入10ml含有咪唑的PBS洗1次。加入10ml含有咪唑的PBS，收集洗脱液。
SDS-PAGE电泳显示纯化的SurA1蛋白的分子量为15kDa，基本符合理论推断。收集含有SurA1蛋白的组份，纯化结果如图2所示。
六、SurA1蛋白的免疫印迹鉴定
采用常规Western blot法鉴定康复血清与重组SurA1蛋白的免疫学反应。首先制备12％的聚丙烯酰胺凝胶，将SurA1蛋白上样进行SDS-PAGE；电泳结束后，把凝胶浸泡在电转液中平衡15min；剪裁比凝胶稍大的PVDF膜，放置于电转液浸泡至完全湿润；剪裁两张厚滤纸，上层滤纸稍小于凝胶，下层滤纸要稍微大于PVDF膜，并浸泡在电转液中完全湿润；按照滤纸-膜-胶-滤纸的顺序加到电极上，用玻璃棒赶走气泡，接通电源，15v恒压，转印30min。转印结束后取下PVDF膜，转入小自封袋中，加入5％脱脂奶，4℃封闭过夜，取出膜，用PBST洗3次，每次10分钟。然后加入5％脱脂奶，1：1000稀释一抗，37摄氏度孵育1h；取出膜，用PBST洗3次，每次10min；然后加入5％脱脂奶1：5000稀释二抗(HRP标记的羊抗鼠二抗)，37℃孵育1h；取出膜，用PBST再洗3次，每次10min；然后用ECL化学发光显色试剂盒显色，结果表明SurA1蛋白与预期的蛋白条带大小一致，免疫印记结果入图2所示。
不同时期康复血清对SurA1的免疫反应
我们选取感染CCGGD201101(1×105CFU)和ATCC17978(1×105CFU)后康复小鼠不同时期血清检测SurA1重组蛋白,所有收集的血清对SurA1均具有一定能够效价，效价检测结果入图3(A)所示。在康复后1周、2周、4周、6周、8周的血清在Western blot中均可以与SurA1重组蛋白反应，Western blot结果入图3(B)所示。
小鼠菌血症感染模型
为了确定SurA1蛋白的免疫保护效果，同时提高鲍曼不动杆菌的感染效率，我们采用腹腔注射鲍曼不动杆菌菌悬液法感染小鼠。鲍曼不动杆菌各个菌株(CCGGD201101,ATCC17978,3094)在37℃，220rpm/min的条件下，在LB培养基中培养16小时。离心去除培养基后，使用无菌生理盐水调整菌液浓度为1×108。采用Reed-Muench法，计算鲍曼不动杆菌各个菌株(CCGGD201101,ATCC17978)的对 Balb/C小鼠半数致死量(LD50),使用细菌悬液浓度为10-2-10-8CFU/ml，统计各个浓度感染小鼠死亡情况,计算各个菌株对小鼠的半数致死量(LD50)，确定各个菌株的半数致死量。根据半数致死量的计算结果，选择CCGGD201101菌株进行感染实验。攻毒后连续观察，记录各组死亡情况。按照寇氏公式计算LD50。公式如下：
LD50＝lg-1{Xm-i(P-Σ(3-Pm-Pn)/4)}
Xm:最大剂量组剂量的对数值
i：相邻两组剂量(d)对数值之差
p：各组动物死亡率之总和
P:各组动物死亡率，用小数表示
Pm：最高剂量组动物死亡率，用小数表示
Pn：最小剂量组动物死亡率，用小数表示
n:每组动物数
攻毒7天后，第5组死亡10只，第一组死亡两只。具体死亡率如下表1。
表1
通过寇氏公式计算得出LD50＝2.11±106CFU
SurA1蛋白亚单位疫苗应用研究
取40mg SurA1蛋白加入40ml生理盐水中，之后按10mg/ml加入氢氧化铝佐剂，配置成SurA1亚单位疫苗。取40只小鼠，分为1个实验组和1个对照组，实验组1为SurA1疫苗免疫组，各个小鼠进行两次免疫，每次每只免疫100μL SurA1(1mg/ml)亚单位疫苗，免疫间隔2周。对照组为正常饲养对照组。在第二次免疫后第14天，各组小鼠腹腔感染1ml 3.5×108CFU/ml(100倍LD50)CCGGD201101菌悬液，感染12小时后，无菌环境处死小鼠，分离小鼠的脾、肾、肺和血清，分离的内脏组织制备组织匀浆，连续倍比稀释使用平板计数法计数，计算各个实验组中小鼠组织的携菌量。如图4所示，SurA1免疫组有70％以上存活率。
取40mg SurA1蛋白加入40ml生理盐水中，之后按10mg/ml加入氢氧化铝佐剂，配置成SurA1亚单位疫苗。取40只小鼠，分为1个实验组和1个对照组，实验组1为SurA1疫苗免疫组，各个小鼠进行两次免疫，每次每只免疫100μL SurA1(1mg/ml)亚单位疫苗，免疫间隔2周。对照组为正常饲养对照组。在第二次免疫后第14天，各组小鼠腹腔感染1ml 3.5×108CFU/ml(100倍LD50)ATCC17978菌悬液，感染12小时后，无菌环境处死小鼠，分离小鼠的脾、肾、肺和血清，分离的内脏组织制备组织匀浆，连续倍比稀释使用平板计数法计数，计算各个实验组中小鼠组织的携菌量。如图5所示，SurA1免疫组有70％以上存活率。
SurA1免疫后小鼠细胞因子表达水平研究
对分离的血清采用小鼠细胞炎性因子ELISA检测试剂盒检测不同实验组血清中前炎性因子因子的变化。血清抗体亚类及细胞因子表达水平入图6所示。
SurA1免疫小鼠血清抗体滴度及抗体亚类分析
ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度，同时检测小鼠血清的抗体亚类。具体方法如下：调整SurA1蛋白浓度至1μg/ml
1.制备A549细胞悬液：细胞计数
2.接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
3.37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4.加入20μg-200μg浓度的重组SurA1蛋白5.37℃培养箱中培养。
6.加入10ul CCK8，加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7.培养2小时。
8.测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450nm，参比波长650nm。
免疫小鼠血清抗体滴度及抗体亚类分析结果如图7所示。
SurA1蛋白毒力实验
将纯化后浓度为0.5mg/mL的SurA蛋白使用过滤除菌后,用无血清的DMEM进行倍比稀释后,加入已长满单层的A549细胞上,于5％C02环境下37℃培养24h,观察其细胞毒性,同时设无血清DMEM作阴性对照,BSA单臂作空白对照。使用MTT法检测细胞毒性，实验结果入图8所示。

Claims (7)

1.一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所述。
2.编码如权利要求1所述的一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1的核苷酸，其序列如SEQ ID No.2所述。
3.根据权利要求1所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1，对于人类肺上皮细胞A549具有弱毒性,对小鼠具有免疫保护性。
4.如权利要求1所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1在制备用于预防由鲍曼不动杆菌引起的疾病的药物中的应用。
5.一种包含权利要求1所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1的疫苗组合物。
6.一种制备具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原的方法，所述方法包括以下步骤：
构建包含含有SEQ ID No.2所述的核酸序列的重组表达载体；
将所述重组表达载体转到宿主菌中；
培养所述经转化的宿主菌并诱导其表达所述鲍曼不动杆菌免疫保护性抗原；
对所述经过诱导的宿主细胞分离和纯化所述鲍曼不动杆菌免疫保护性抗原。
7.根据权利要求6所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌。
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