CN111537712A - 惰性载体间接凝集试验检测系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了惰性载体间接凝集试验检测系统及其应用，所述间接凝集试验检测系统包括惰性载体菌S9和在其表面展呈表达和携带P抗原因子的复合体S9‑P。该惰性载体间接凝集试验检测系统仅携带P抗原因子，成分单一，特异性靶向，与鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染鸡的全血或血清在一定浓度条件下产生肉眼可见的阳性颗粒凝集反应，而与非鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染的不同背景鸡源血清、全血不出现非特异性交叉凝集反应。该S9‑P基于玻板凝集反应操作平台，操作简便，反应灵敏快速，凝集反应颗粒肉眼可见，结果清晰易判，在两分钟内完成测试和结果判定，该S9‑P适用于鸡群中鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染的靶向特异性检测，在鸡群的现场监测和诊断中具有很好的应用前景。

Description

惰性载体间接凝集试验检测系统及其应用

技术领域

本发明属于生物医学和免疫诊断检测技术领域，具体涉及惰性载体间接凝集试验检测系统。该间接凝集试验检测系统包括惰性载体沙门氏菌S9表达和携带单一抗原因子P建立的新型惰性载体间接凝集试验鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌检测系统S9-P。

背景技术

鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)感染引起鸡和火鸡等禽类的细菌性传染病，主要危害三周龄以内雏鸡，死亡率高，成年鸡感染后无明显症状，但可通过种蛋源垂直传播于后代雏鸡，是危害我国养鸡业的重要疾病，鸡伤寒沙门氏菌(Salmonellagallinarum)感染引起鸡和火鸡等禽类的细菌性传染病，也是危害我国养鸡业的重要疾病，我国已将鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌病列为二类动物疫病，鸡白痢也是世界动物卫生组织(OIE)规定为必须通报的动物疫病之一。鉴于这两种病原菌病原特性具有种源垂直传播的特征，集约化养鸡场一旦发生上述疫病会造成巨大的经济损失。鸡群一旦感染，药物难以清除和根治，而病原分离鉴定费时繁琐和耐药菌普遍存在，在临床工作中防治难度很大，因而对该疾病防控最根本的策略只有通过种鸡群的有效监测和根除净化，目前我国已将种鸡场沙门氏菌净化工作列入《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中。

事实上，鸡白痢、鸡伤寒感染检测方法众多，值得注意的是，基于血清学诊断方法中的平板凝集反应为经典的检测方法，由于其圈栏边鸡舍内鸡全血样品检测的便捷和实用性，同时考虑其廉价、时效性和现场规模化筛选检测适用性，具有无可比拟的诊断应用优势。其原理是细菌颗粒性诊断抗原结合相应的血清抗体后，当有电解质存在、温度适宜时，抗原颗粒和相应特异性抗体结合，出现相互凝集凝聚现象，形成凝集小块或颗粒，仅需通过肉眼就能现场观察和判定结果。我们将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。操作时将凝集诊断抗原与含有相应特异抗体的血清或全血各滴一滴于洁净的透明玻璃平板上，等体积轻轻混合后，室温下2分钟内观察和判定反应结果，如出现肉眼可见的颗粒状凝集现象，即为阳性凝集反应。凝集试验适用于病原感染的快速诊断，具有众多优点，如：简便快捷、不需要任何额外(实验室)仪器、成本低廉且可在圈栏边鸡舍内仅需一滴鸡血现场测试等。尽管该凝集抗原检测已经有多年的实践应用，但是在实际应用中也逐渐暴露出存在的局限性和技术瓶颈制约，如目前国内应用最广泛的商品化鸡白痢、鸡伤寒凝集抗原的检测诊断中，被报道存在多种非特异性交叉反应，由于全菌抗原的交叉非特异性因素导致假阳性率高；基于菌体O抗原固有的O不凝集性因素影响，各批次检测结果稳定性不佳和重复性不理想；此外，O抗原寡糖抗原性相对较弱，检测鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染鸡全血、血清凝集反应的敏感性瓶颈制约而导致漏检，也注意到该方法仅对成年鸡群(种鸡开产前16周龄)检测相对敏感，对雏鸡则可能存在较大的检测误差。前期研究数据中，专利申请发明人所在实验室使用传统的商品化凝集抗原，分两次在不同时间检测同一批来自某种鸡场200份血清时发现，两批的检测结果总符合率仅为81％，提示每批次检测结果并不稳定，前后一致性不佳。当与荷兰Bio Chek公司的沙门氏菌D群ELISA试剂盒对比检测结果时发现，检测结果总符合率仅为79.5％，阳性符合率(检出率或特异性)为75.2-79.4％，阴性符合率(敏感性)为79.5-85.5％。上述检测结果和比较分析表明，该商品化凝集抗原检测鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染血清、全血抗体时，敏感性、特异性、重复稳定性和结果准确性均有提升的空间和必要性，临床上迫切需要改进现有的凝集试验检测方法，旨在达到较为理想的检测水平。

凝集抗原检测结果准确度有待提高的根本原因和关键环节在于：至今，临床净化工作通常会采用多年来(自上世纪50、60年代开始)一直使用的经典型全血平板凝集试验检测鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染(血清或全血抗体)，其检测局限在于凝集抗原由鸡白痢沙门氏菌参考株和(或)变异株组成，为不同菌株混合的全菌抗原。理论上说，这种存在于全菌中多成分的抗原的复合组分，很多成分可能会与肠杆菌同科、属、种，其他科属种细菌和其它成分包括异嗜抗原存在非特异性交叉反应，鉴于凝集抗原制备中需要较高的工作浓度和细菌数量(鸡白痢沙门氏菌凝集抗原浓度已达到10¹⁰cfu细菌数量级)，高抗原浓度引起的非特异性交叉反应弊端必然会影响甚至较为显著干扰监测、检测和诊断结果的准确性。该混合菌的全菌抗原成分复杂，菌体表面暴露抗原成分多样、不单一，许多细菌与鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌具有共同抗原或抗原性极为密切，包括大肠杆菌、微球菌和链球菌(尤其是革兰氏D群链球菌)可感染禽类，当感染种鸡后，与感染鸡群全血中存在的多种成分，理论上存在一定程度的交叉反应，导致了实际检测应用中出现的假阳性结果，事实上，还包括表皮葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌及某些种的亚利桑拉、普罗威登氏菌和枸橼酸菌等，在鸡群全血中存在的非特异性交叉反应可从少数几只鸡到30％-40％；同时考虑到菌体抗原O₁、O₉、O₁₂三种成分，其寡糖抗原性弱，其中O₁₂也存在3种变异株，即鸡白痢沙门氏菌中存在标准型、变异型和中间型，导致诊断抗原菌株与感染血清的特异反应针对和匹配性不强，考虑到菌体表面成分多种复杂，O抗原在菌体表面空间构象影响和展呈受限，导致该方法检测的敏感性不高，各批次检测结果中存在弱阳性和阴性检测结果中出现漏检等情况。该试验需要在种鸡产种蛋期间监测、检测，仅对成年鸡群检测才能获得有效检测数据和测试效果，对雏鸡则存在较大检测误差。值得注意和强调的是，感染种鸡体内全血中多种细胞、成分和多种免疫抗体可以与全菌抗原(非纯净抗原，菌体表面成分多种复杂)发生非特异性反应，携带非单因子成分的抗原也可能与多种、属细菌感染抗体存在交叉反应，实际应用中影响疫病净化效果和净化工作的推进，是制约鸡白痢沙门氏菌监测检测和进一步根除净化的关键因素！

据上所述和分析，可以共识到鸡白痢沙门氏菌感染种鸡根除净化的有效启动、进程进度和完成质量都依赖于净化关键技术。目前，面对该重要种源性疾病监测、检测和净化亟需一套简便、快速、廉价并且现场检测敏感、特异的检测技术和净化程序，鉴于种鸡场鸡白痢沙门氏菌净化根除工作顺利开展迫在眉睫，净化检测关键技术的建立和应用对养禽业的长足发展，禽蛋产品质量的安全保障，食品公共卫生和人类健康都十分必要。

从鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌中提取脂多糖作为抗原，也已发展了用于检测鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌的酶联免疫吸附试验(ELISA)，该项技术可用于在实验室规模化血清样本的感染抗体检测，在一定程度上克服上述经典平板凝集反应敏感性不高，包括在亚临床感染和免疫应答能力相对较弱的雏鸡感染体内抗体检出率不高。也有报道采用纯化的鞭毛蛋白、外膜蛋白、菌毛蛋白作为ELISA检测抗原，用于检测肠炎沙门氏菌感染鸡群，但与其他血清学试验一样，ELISA技术对其他沙门氏菌呈一定程度的阳性反应，也与肠肝菌科细菌尤其包括大肠杆菌可能呈阳性反应。同时鞭毛蛋白、外膜蛋白、菌毛蛋白的纯度要求高，这样才能使出现假阳性率少。

目前兽医临床上监测、检测并用于净化、根除鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染的经典型快速诊断技术即平板凝集试验的特异性、敏感性和检测结果准确性迫切需要有效提高和完善。因此，如果能利用鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌中存在的一种特有蛋白，不需要纯化制备，且能通过选择使用这种特有蛋白在惰性载体菌表面表达和携带，直接特异靶向鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染抗体，则确保凝集试验的特异性、敏感性和检测结果准确性，将具备巨大的应用前景。

发明内容

发明目的：针对惰性载体沙门氏菌S9不存在自凝现象，在工作浓度下的细菌数量与多种遗传背景的不同种鸡源全血不发生非特异性凝集反应，且该菌体表面能表达和携带单一抗原因子P，该抗原因子P存在并在鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌中表达，且抗原因子P特异靶向鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌感染全血抗体。基于该菌表面表达和携带单一抗原因子P建立的惰性载体间接凝集试验鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌检测系统S9-P，能提供一种新型惰性载体间接凝集试验鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌检测系统监测检测鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌感染全血抗体，该惰性载体间接凝集试验鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌检测系统操作简便，反应特异、敏感、快速，结果清晰易判，实施在圈栏旁鸡舍内采集一滴鸡血(5μL～10μL)，通过肉眼观察，现场2分钟内快速判定凝集反应结果，监测、检测鸡群中鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌感染，特异、敏感。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了惰性载体间接凝集试验检测系统，所述检测系统包括惰性载体菌S9和在其表面展呈表达和携带P抗原因子的复合体S9-P。

其中，所述检测系统是含有鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌p基因的惰性载体菌S9。

其中，所述检测系统是通过将鸡白痢沙门氏菌p基因与pBR322质粒连接后导入S9电转化感受态细胞中鉴定正确的菌株。

本发明内容还包括所述的惰性载体间接凝集试验检测系统的构建方法，包括以下步骤：

1)鸡白痢沙门氏菌中P抗原因子编码基因p的获得；

2)鸡白痢沙门氏菌中P抗原因子编码基因p与pBR322质粒的连接获得重组质粒；

3)重组质粒p-pBR322转化入S9电转化感受态细胞鉴定得到重组菌株即为惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P。

其中，所述步骤1)中的鸡白痢沙门氏菌中P抗原因子编码基因p的核苷酸序列是由NCBI公布的鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌全基因组序列设计。

其中，所述步骤1)中基因p的获得是以鸡白痢沙门氏菌CVCC526参考株为模板，通过设计特异性引物对进行PCR扩增得到目的基因p。

其中，所述特异性引物对为：

p-UP：5′-ATG AAA CGT TCA CTT ATT GCT GCT-3′

p-LO：5′-TTAA TCA GTT AAT ACC GTC ATC GTC AG-3′。

本发明内容还包括所述的惰性载体间接凝集试验检测系统在制备鸡相关病原感染检测用试剂或试剂盒中的应用。

本发明内容还包括所述的惰性载体间接凝集试验检测系统在制备鸡白痢沙门氏菌或鸡伤寒沙门氏菌感染检测用试剂或试剂盒中的应用。

本发明内容还包括一种鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述的惰性载体间接凝集试验鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌检测系统。

其中，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

其中，所述阳性对照可以为鸡白痢沙门氏菌标准株人工感染SPF制备得到的阳性血清；阴性对照为SPF鸡血清。

本发明的检测系统S9-P检测鸡群中鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌感染血清/全血抗体，所述的惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P是基于惰性载体菌S9表面表达和携带单一抗原因子P，该抗原因子P存在并在鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌中表达，其抗原因子P特异靶向鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染全血抗体。其中，该惰性载体菌S9保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.17340，保藏日期为2019年3月18日，分类命名为沙门氏菌(Salmonella sp.)，菌株代号S9。该菌株保藏证明参见申请号为2019104243698的专利申请。所述的惰性载体沙门氏菌从健康鸡群分离筛选得到，惰性载体沙门氏菌菌液不存在自凝现象，在工作浓度下的细菌数量(细菌浓度达到10¹⁰cfu细菌数量级)与不同遗传背景的多种鸡源血清/全血不发生非特异性凝集反应，鸡源血清/全血包括但不限于SPF鸡血清/全血、健康鸡血清/全血、多种细菌感染鸡阳性血清/全血、多种寄生虫感染鸡阳性血清/全血、多种病毒性感染鸡阳性血清/全血和各种品种鸡免疫血清/全血，其凝集反应结果都为阴性。

本发明涉及的制备用新型惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P，是利用分子生物学方法基于惰性载体菌S9构建的新型惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P，能在含氨苄青霉素(100μg/mL)抗生素的LB琼脂培养基中培养生长，培养方法如下：从保存的菌种中挑取单个菌落划线于氨苄抗性(100μg/mL)LB琼脂培养基中，培养温度为37℃，培养24h可形成灰白色圆形中等大小菌落。

本发明涉及的新型惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P，来自惰性载体间接凝集试验检测系统的菌株S9-P，用氨苄抗性(100μg/mL)LB液体培养基扩增培养一定浓度后收获，灭活细菌，调整菌液浓度，通过20％体积的特定比例混合蓝料(1份结晶紫：4份瑞士蓝)染色制备，通过测试玻板凝集试验验证新型惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P不存在自凝现象，S9-P与PBS磷酸盐缓冲液等多种电解质溶液不产生自凝现象，与不同遗传背景的多种非鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染的鸡源血清/全血不发生非特异性凝集反应，非鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染的鸡源血清/全血包括但不限于SPF鸡血清/全血、健康鸡血清/全血、多种非鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌细菌感染鸡阳性血清/全血，多种寄生虫感染鸡阳性血清/全血，多种病毒性感染鸡阳性血清/全血和各种品种鸡免疫血清/全血，S9-P与上述待检血清/全血等体积充分混匀后，两分钟之内不出现任何凝集反应颗粒。

当S9-P与实验室制备的鸡白痢沙门氏菌感染阳性抗体样本(血清或全血)，也包括来源第三方实验室和相关参考实验室提供的鸡白痢阳性血清/全血、鸡白痢沙门氏菌参考株人工感染SPF鸡制备免疫血清/全血和在三家不同种鸡场采集的经实验室诊断为鸡白痢沙门氏菌感染阳性血清/全血，S9-P与上述待检血清/全血等体积充分混匀后，在两分钟之内出现背景清晰的蓝色凝集颗粒，凝集反应阳性。

本发明涉及提供的新型惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P，通过检测圈栏边鸡舍内采集的鸡群血清/全血并比较验证发现：检测一滴鸡全血时，产生的凝集颗粒阳性反应迅速、结果清晰易判。与商品化鸡白痢沙门氏菌凝集抗原作同步平行检测：1)当以荷兰Biochek公司的ELISA试剂盒作为假定金标准参考方法比较时，惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P的检测符合率(0.62)，显著优于商品化凝集抗原的检测符合率(0.05-0.42)；2)当以鸡体内细菌分离作为假定金标准参考方法时，细菌分离鉴定的阳性检出率为22.5％(9/40)，商品化凝集抗原的阳性检出率为50％(20/40)，S9-P的阳性检出率为25％(10/40)，S9-P检测系统与细菌分离鉴定的结果和检出符合率更一致；3)当以Westernblot检测P因子靶向的抗体，对S9-P检测结果进行验证时，S9-P检测结果和Western blot检测P因子靶向抗体结果的符合率一致，为100％。

本发明所述的新型惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P，通过凝集试验应用于鸡群中鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染全血抗体的现场检测。在玻板凝集试验简易操作平台上，当新型惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P试剂(5μL～10μL)与圈栏旁鸡舍内鸡静脉采集的一滴鸡血(5μL～10μL)等体积充分混匀后，在白光背景下肉眼清晰可见阳性凝集反应颗粒，必须在两分钟之内快速判定结果，根据凝集阳性反应监测检测和判定筛选鸡为鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染。

有益效果：本发明发现并找到抗原因子P特异性存在鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌中，且其编码基因p在惰性载体菌S9表面表达和携带抗原因子P，建立特异靶向单一抗原因子的惰性载体鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌检测系统，以替代菌体表面成分多种复杂的全菌抗原作为间接凝集试验诊断抗原，在保留凝集反应结果直观，操作简便等众多优势的前提下，能精确和最大程度地完善提高间接凝集抗原反应的特异性和敏感性，替换原来的全血平板凝集反应检测的经典平台系统，提供病原感染(全血抗体)现场快速、特异、敏感监测诊断技术和方法。

本发明涉及提供的新型惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P，基于申请人对惰性载体菌S9的发现和潜在研发前景，该惰性载体(菌)替代鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌全菌凝集诊断抗原，避免了多成分全菌抗原产生的非特异性交叉凝集反应。本发明发现并验证了抗原因子P存在并表达于鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌，使用基于惰性载体菌S9表面表达展呈和携带单一抗原因子P而构建新型惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P，特异性靶向鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染鸡全血抗体，实施在圈栏旁鸡舍内采集一滴鸡血(5μL～10uL)，仅通过肉眼观察、快速特异和现场监测鸡群中鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染。本发明创新性建立新型惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P，替代、有效改进和完善现有的多年来一直使用的鸡白痢沙门氏菌凝集抗原诊断试验，克服多年来(自上世纪50年代以来)传统、经典凝集试验的特异性和敏感性技术瓶颈制约，具有很好的潜在应用价值和市场前景。

附图说明

图1、编码鸡白痢沙门氏菌抗原因子P的完整基因(p基因)序列和比对示意图：其中CP012347.1、LK931482.1、CP006575.1和CP022963.1为NCBI GenBank基因数据库上传的不同鸡白痢沙门氏菌菌株的p基因序列。

图2：抗原因子P的主要亚单位编码基因(pA基因)的PCR扩增鉴定电泳图：其中泳道M为DL5000 Marker，泳道1为鸡白痢沙门氏菌分离株S.P 0-1；泳道2为鸡白痢沙门氏菌分离株S.P1-1，泳道3为鸡白痢沙门氏菌分离株S.P2-1，泳道4为鸡白痢沙门氏菌分离株S.P3-1，泳道5为鸡白痢沙门氏菌分离株S.P 4-1，泳道6为鸡白痢沙门氏菌分离株S.P5-1，泳道7为鸡白痢沙门氏菌参考株CVCC526，泳道8为鸡白痢沙门氏菌参考株CVCC535，泳道9为大肠杆菌APEC-XM，泳道10为大肠杆菌DH5α。

图3：抗原因子P的完整编码基因(p基因)的PCR扩增鉴定电泳图：其中泳道M为Trans 2K Plus II Marker，泳道1为p基因的PCR扩增产物p-PCR，模板DNA来自鸡白痢沙门氏菌参考株CVCC526。

图4：p基因的克隆和含p基因重组质粒19T-p酶切鉴定电泳图：其中泳道M_a为Trans2K Plus II Marker，泳道M_b为Trans 2K Plus Marker，泳道1～3为重组质粒19T-p NheI单酶切，泳道4～6为重组质粒19T-p BamHI单酶切，泳道8～10为重组质粒19T-p NheI和BamHI双酶切。

图5：p基因的克隆和含p基因重组质粒p-pBR322酶切鉴定电泳图：其中泳道M为Trans 15K Marker，泳道1为p-pBR322重组质粒，泳道2为p-pBR322NheI单酶切，泳道3为不含p基因的pBR322质粒，泳道4为含p基因重组质粒的重组表达菌液p-PCR结果，泳道5为含p基因重组质粒的p-PCR阳性对照。

图6：载体菌S9和表面表达鸡白痢沙门氏菌p基因的重组载体菌S9-P负染透射电镜观察图(Philips Tecnai 12透射电镜TEM，46000×)。

图7：惰性载体检测系统S9-P与鸡白痢沙门氏菌阳性血清凝集反应图象。

图8：惰性载体检测系统S9-P与鸡白痢沙门氏菌阳性全血凝集反应图象。

图9：惰性载体检测系统S9-P与商品化凝集抗原检测结果和对比图。区域1：为S9-P与阳性血清凝集反应；区域2：为S9-P与阴性血清对照凝集反应；区域3：为商品化凝集抗原与阳性血清凝集反应；区域4：为商品化凝集抗原与阴性血清对照凝集反应；区域5：为S9-P与现场采集的全血凝集反应；区域6：为商品化凝集抗原与现场采集的全血凝集反应。

图10：惰性载体检测系统S9-P检测的阳性血清IgG识别P抗原因子的Western blot图和惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P验证。S9-P检测结果阳性血清包括对照组为鸡白痢沙门氏菌人工感染SPF鸡血清，实验组1和实验组2来自临床种鸡血清(S9-P检测结果为阳性)；S9-P检测结果阴性血清包括对照组为SPF鸡血清，实验组1和实验组2来自临床种鸡血清(S9-P检测结果为阴性)。

图11：惰性载体检测系统S-9检测不同感染时间的SPF鸡结果。

具体实施方式

本发明中涉及的鸡白痢沙门氏菌参考株CVCC526、CVCC535购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，鸡白痢沙门氏菌分离株S.P0-1、S.P1-1、S.P2-1、S.P3-1、S.P4-1、S.P5-1、SP03来自临床发病鸡群，通过常规分离方法获取，鉴定为鸡白痢沙门氏菌并命名，不同的分离株有不同的名称，在申请人实验室保存，鸡伤寒沙门氏菌SG01为专利申请人实验室分离保存(见国家发明专利申请号201811491200.6)，禽大肠杆菌APEC-XM和大肠杆菌工程菌DH5α为本实验室保存。

本发明中涉及的羊抗鼠IgG-HRP、羊抗鸡lgG-HRP购自索莱宝科技有限公司；6×Loading Buffer、pfu高保真酶、Trans 2K Plus II Marker购于北京全式金生物技术有限公司；rTaq DNA聚合酶、限制性内切酶NheI、限制性内切酶BamHI购于TakaraBio公司；T4连接酶、PMD19-T simple vector购于美国Promega公司；2×Taq Master Mix(Dye Plus)购于南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。

不同背景多种鸡源血清/全血为本课题组收集保存。

本发明中采用的沙门氏菌S9已经保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.17340，保藏日期为2019年3月18日，分类命名为沙门氏菌(Salmonella sp.)，菌株代号S9。实施例1鸡白痢沙门氏菌P抗原因子的鉴定与验证

通过NCBI上GenBank数据库查找已上传的鸡白痢沙门氏菌中P抗原因子编码基因P(表1)，使用DNAMAN Windows版软件对下载的p基因序列进行比对，结果显示在不同的鸡白痢沙门氏菌菌株中p基因序列高度保守(图1)。事实上，也与我们实验室分离鉴定和经DNA序列测定的多株鸡白痢沙门氏菌分离株p基因序列高度保守。

表1鸡白痢沙门氏菌序列信息

根据NCBI GenBank中鸡白痢沙门氏菌ATCC 9120株(NCBI登录号：CP012347.1)、鸡白痢沙门氏菌S44987_1株(NCBI登录号：LK931482.1)、鸡白痢沙门氏菌S06004株(NCBI登录号：CP006575.1)、鸡白痢沙门氏菌QJ-2D-Sa1株(NCBI登录号：CP022963.1)公布的基因组序列全长，使用oligo7软件设计PCR扩增引物，用核酸提取试剂盒提取鸡白痢沙门氏菌基因组DNA，包括参考株CVCC526、CVCC535，分离株S.P0-1、S.P1-1、S.P2-1、S.P3-1、S.P4-1、S.P5-1，同时增设禽大肠杆菌APEC-XM和大肠杆菌工程菌DH5α为阴性对照。基于p基因的PCR扩增结果显示在鸡白痢沙门氏菌菌株中均能扩增到预期的目的片段，而在阴性对照中未能扩增到目的片段(图2)。使用pfu高保真DNA聚合酶经PCR扩增获得靶向目的片段，南京擎科生物科技有限公司DNA测序结果和结果比对分析表明，p基因序列与报道一致，未有任何突变碱基，说明该基因在鸡白痢沙门氏菌菌种菌株内高度保守。

将鸡白痢沙门氏菌参考株CVCC526、CVCC535，实验室保存的鸡白痢沙门氏菌分离株S.P0-1、S.P1-1、S.P2-1、S.P3-1、S.P4-1、S.P5-1(这些分离株来自鸡白痢感染发病种鸡，在临床上常见一类感染疾病，通过常规的分离方法从鸡体内分离并鉴定为鸡白痢沙门氏菌，不同的分离株有不同的名称，与鸡白痢沙门氏菌参考株的特性一致)，禽大肠杆菌APEC-XM和大肠杆菌工程菌DH5α的培养液经10倍浓缩制样后进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转印至甲醇活化的PVDF膜上，依次加入小鼠抗P抗原因子的多抗IgG为一抗，1∶5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP为二抗，孵育，DAB底物显色，Western blot免疫印迹法结果显示，P抗原因子的目的条带表达在鸡白痢沙门氏菌鸡白痢沙门氏菌参考株CVCC526、CVCC535和分离株S.P0-1、S.P1-1、S.P2-1、S.P3-1、S.P4-1、S.P5-1中，而大肠杆菌APEC-XM和DH5α未显示目的条带，说明P抗原因子仅存在于鸡白痢沙门氏菌中。

实施例2惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P的构建

根据NCBI中鸡白痢沙门氏菌p基因全长片段，用Olige7软件设计扩增引物，分别在上下游引物的5’端加上NheI和BamHI酶切位点及保护性碱基，上下游引物分别为：

p-UP：5′-ATG AAA CGT TCA CTT ATT GCT GCT-3′

p-LO：5′-TTAA TCA GTT AAT ACC GTC ATC GTC AG-3′；

用煮沸法中制备CVCC526鸡白痢沙门氏菌模板，p-PCR体系：5×pfu DNA聚合酶buffer 10μL，dNTP 5μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板2μL，pfu高保真酶(2.5units/uL)2μL，去离子水27μL。PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 5min，30个循环，72℃ 10min。在上述PCR反应结束后，在体系中加rTaqDNA聚合酶(5U/μL)2.4μL，72℃20min加A尾。

PCR扩增产物中加入10μL 6×Loading buffer，用1％琼脂糖凝胶90V电泳1h，紫外凝胶成像仪照胶后切下目的条带，成功扩增出添加了NheI和BamHI两个酶切位点的p基因片段(图3)，说明书操作用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物，回收产物可于-20℃保存备用。

将上一步获得的加A尾的PCR产物与PMD19-T simple vector载体连接，10μL的连接体系如下：19T载体1μL，PCR回收产物4μL，solution I溶液5μL，将上述反应体系置于16℃金属浴连接过夜。

第二天将连接产物化学转化入DH5α感受态细胞中，操作如下：将DH5α感受态细胞置于冰上解冻，加10μL连接产物于感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻的时候加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴30min；42℃热激30s，立即置于冰上2min。加入250μL平衡至室温的LB，37℃ 200rpm孵育2h，4000rpm，1min弃上清，留少许上清(约100μL)重悬菌体，涂布于氨苄LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)37℃过夜。

P-PCR鉴定：过夜后观察氨苄LB固体培养基上细菌生长情况，挑取单菌落于氨苄液体LB(含100μg/mL氨苄青霉素)中摇菌，取2μL为模板进行菌液PCR鉴定，体系：2×rTaq DNA聚合酶mix 10μL，上游引物(p-UP)1μL，下游引物(p-LO)1μL，模板(菌液)2μL，去离子水6μL。反应条件如下：95℃10min；94℃1min，52℃1min，72℃1min，25个循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶90V电泳鉴定。

质粒酶切鉴定：使用试剂盒提取质粒，对质粒NheI单酶切，NheI和BamHI双酶切，之后电泳鉴定。NheI单酶切体系：M buffer 5μL，NheI 1μL，质粒30μL，去离子水14μL。双酶切体系：BglI buffer 5μL，NheI 1μL，BamHI 1μL质粒30μL，去离子水13μL。37℃水浴3h后1％琼脂糖凝胶90V电泳鉴定(图4)。

对于上步中p-PCR反应阳性，酶切质粒大小正确的重组菌用试剂盒提取质粒，分别对pBR322质粒和19T-p双酶切，电泳鉴定分别切下4361bp和4845bp处条带的胶块，用试剂盒回收，我们设计如下T4连接体系：10×buffer溶液1μ，pBR322回收产物2μL，p回收产物2μL，T4连接酶1μL，去离子水4μL。16℃金属浴过夜。

将上步连接过夜的p-pBR322质粒转化入S9电转化感受态细胞中，具体操作如下：

电转化感受态细胞的制备：挑取过夜生长的LB平板上的S9单菌落，接种到4mLLB液体培养基中，于37℃振摇3h～5h，观察细菌生长情况。将菌液1∶100接种到4mL液体LB培养基中，37℃振摇至OD_600nm到0.4～0.6后冰浴30min，冰浴后4℃4000rpm离心10min，弃去上清。加入预冷的10％甘油洗涤三次，最后用40μL重悬，可暂存于-20℃备用。

电转化操作：取2μLp-pBR322质粒与40μLS9电转化感受态细胞混合，将上述混合物加入0.1cm的BioRad电极杯中电击，电转后迅速将产物吸到1mLSOC培养基中，37℃振摇恢复4h后4000rpm 10min弃上清，留少许底部液体重悬涂氨苄平板，37℃培养过夜。

第二天观察细菌生长情况，可用p-PCR鉴定和质粒酶切鉴定(图5)，挑取鉴定含P因子正确构建的重组S9-P菌株单菌落，LB培养基扩增后，使用50％甘油与S9-P菌液1∶1等体积混合保存于-70℃。

实施例3惰性载体检测系统菌株表达P因子的验证

将菌株S9和重组菌株S9-P单菌落分别接种于LB和氨苄抗性LB琼脂培养基上，置37℃培养24h后挑取单菌落分别接种于LB和氨苄抗性LB液体培养基中，盲传两代后，吸取少量菌液分别接种于LB和氨苄抗性LB液体培养基中，静置培养37℃48h后，10000rpm离心2min，用灭菌PBS重悬沉淀，吸取少量上清液体，悬浮于铜网，并用磷钨酸负染5min，PhilipsTecnai 12透射电镜TEM观察拍摄和结果初步显示，S9表面似乎看不出P抗原因子成分，而惰性载体检测系统S9-P菌株表面出现并携带了一种抗原成分——P因子成分(图6)。

实施例4惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P的测试和验证

实施例2构建的表达P因子的菌株S9-P保存菌种中挑取适量划线于氨苄抗性(100μg/mL)LB琼脂平板培养基中，培养温度为37℃，24h可形成灰白色圆形中等大小菌落。挑单菌落接种于氨苄LB液体培养基37℃振摇培养16h～18h，上述种子菌液按1∶100转接到300mL氨苄LB液体培养基中37℃振摇扩增培养16h～18h后，培养物经4℃离心机8000rpm离心10min，0.4％甲醛生理盐水洗两次后重悬，置于4℃冰箱灭活24h后，再次离心和菌体重悬至0.25％甲醛生理盐水和适宜工作浓度，通过20％体积的特定比例混合蓝料(1份结晶紫：4份瑞士蓝)染色，制成惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P，置于4℃保存。

检测前将惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P用涡旋仪混匀，先用无菌PBS、生理盐水和SPF鸡血清进行凝集试验确保试剂无自凝和不出现非特异性凝集现象。在超净台内(20℃～25℃)取表面洁净普通玻板若干块，用微量移液器吸取一滴约10μL S9-P垂直滴于水平放置的玻板表面上。随后迅速滴加等量的待检血清。用灭菌枪头将试剂与血清充分混合均匀，涂布成直径1cm～2cm的片状后随即平稳摇动玻板，明确在2min内观察和判定试验结果。标准判定状况为室温下2min内，以S9-P与待检血清产生天蓝色凝集颗粒则凝集反应结果判定为阳性，否则判定为阴性(图7)。

测试结果显示，惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P与PBS、生理盐水电解质溶液不出现自凝现象，与不同背景的多种非鸡白痢沙门氏菌鸡源血清：包括SPF鸡血清、非鸡白痢沙门氏菌细菌性感染鸡阳性血清、鸡寄生虫感染阳性血清、鸡病毒性感染阳性血清，其检测的结果都为凝集反应阴性，而与不同来源的鸡白痢沙门氏菌感染阳性血清和免疫血清反应结果都为凝集反应阳性(表2)。

表2惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P与鸡源血清反应的测试结果

注：“-”表示阴性；“+”表示阳性

当检测全血时，将惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P用涡旋仪混匀，先用无菌PBS、生理盐水和SPF鸡血清分别进行凝集试验测试，确保试剂无自凝和不出现非特异性凝集现象。在室温条件下(20℃～25℃)取表面洁净普通玻板若干块，用微量移液器吸取一滴约10μL S9-P垂直滴于水平放置的玻板表面上。随后迅速滴加鸡场现场采集的全血(约10μL)或者抗凝血(约10μL)。用灭菌滴管将试剂与全血充分混合均匀，涂布成直径1cm～2cm的片状后随即平稳摇动玻板，明确在2min内必须观察和判定试验结果。标准判定状况为室温下2min内，以S9-P与待检血清产生蓝色凝集颗粒则反应结果判定为凝集反应阳性，否则判定为凝集反应阴性(图8)。

测试结果显示，惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P与PBS、生理盐水电解质溶液不出现自凝现象，与不同背景的多种非鸡白痢沙门氏菌感染鸡源全血、SPF鸡全血、非鸡白痢沙门氏菌细菌性感染鸡阳性全血、鸡寄生虫感染阳性全血、鸡病毒性感染阳性全血，其检测的结果都为凝集反应阴性，与不同来源的鸡白痢沙门氏菌感染阳性血清和免疫血清反应结果都为凝集反应阳性(表3)。

表3惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P与鸡源全血测试结果

注：“-”表示阴性；“+”表示阳性

实施例5惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P菌株的临床血清检测和验证

以荷兰Bio chek公司D群沙门氏菌ELISA检测试剂盒假定为“金标准参考”，同时使用国内商品化凝集抗原和惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P平行检测232份鸡临床采集血清，分别使用Kappa测验和ROC曲线比较上述三种方法中分别获得三组结果的一致性和差异性，检查结果显示惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P在凝集反应测试中，反应迅速、结果清晰易判，敏感性高和特异性稳定可靠，与假定金标准参考方法结果的符合率更好，AUC值更高和接近(表4)。

表4：S9-P检测232份临床血清性能的验证和比较

注：^aSEN：敏感性；^bSPE：特异性；^cTCR：总体符合率；^dPPV：阳性预测值；^eNPV：阴性预测值；AUC Vaule：ROC曲线下方的面积大小。

从某种鸡场随机挑选40只70日龄蛋鸡，分别编号1～40。无菌采集每一只鸡的各个脏器组织于单独的无菌小管中(预先加入无菌PBS，各脏器组织编号见表5)，分别使用两种优化程序进行沙门氏菌分离鉴定，程序一：将各个脏器组织和浸泡脏器组织的缓冲PBS液体100μL加入3mL SC(亚硒酸盐胱氨酸增菌液)增菌液中，过夜培养后取100μL培养SC菌液涂布于XLD(木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂)固体培养基。鉴于沙门氏菌在XLD上的菌落形态为粉红色，带或不带黑色中心(H₂S产生)，而大肠杆菌等可发酵乳糖和木糖的革兰氏阴性菌则因大量产酸而使pH值降低，使指示剂苯酚红变黄，我们首先挑取XLD上疑似粉红色单菌落，在麦康凯平板上划线培养。由于沙门氏菌不发酵乳糖，可与发酵乳糖产酸使中性红指示剂变红的大肠杆菌区分开来，过夜培养后再次在麦康凯平板上挑取无色或浅橙色单菌落于LB液体培养基中增菌培养，使用五对靶向鉴定不同沙门氏菌的特异性PCR引物(表6)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳和观察鉴定结果；程序二：将各个脏器组织和浸泡脏器组织的缓冲液100μL涂布于麦康凯平板培养基上，过夜培养后挑取疑似无色或浅橙色单菌落于XLD上划线分离培养，过夜培养后挑取疑似粉红色单菌落于LB液体培养基中，增菌培养后使用五对靶向鉴定不同沙门氏菌的引物(表6)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳和观察鉴定结果。

表5：采集脏器及编号列表

表6靶向鉴定不同沙门氏菌的的五对特异PCR引物

通过上述两种程序的检测方法对70日龄40只种鸡中鸡白痢沙门氏菌带菌状况进行了系统的分离鉴定，40只鸡中每一只鸡对应各脏器样本如果能分离出鸡白痢沙门氏菌，则判定为该鸡为鸡白痢沙门氏菌感染阳性。检测结果显示40只鸡中有9只鸡中分离出沙门氏菌，血清型都为鸡白痢沙门氏菌。试验中，同时使用商品化鸡白痢/鸡伤寒染色凝集抗原和惰性载体检测系统分别对每只鸡的血清进行了检测和对比分析，比对结果显示：①检出率方面，鸡白痢沙门氏菌细菌分离鉴定的结果中检出率为22.5％，商品化凝集抗原的检出率为50％，惰性载体检测系统S9-P的检出率为25％，惰性载体检测系统S9-P与细菌分离鉴定的结果检出符合率更好；②在细菌分离阴性样本，惰性载体检测系统S9-P检出4份阳性，分析考虑细菌分离鉴定过程中存在漏检的情况，也不排除使用抗菌素而导致分离漏检；③细菌分离阳性样本，惰性载体检测系统S9-P有3份为阴性，分析考虑少许数量的70日龄鸡在该年龄存在抗体效价偏低而导致检测漏检，也不排除在细菌感染的窗口期，没有产生超过检测限的抗体。

实施例6惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P现场鸡全血检测和比较分析

使用惰性载体检测系统S9-P对A种鸡群现场随机检测148份全血，现场待检鸡采集5μL～10μL全血与5μL～10μL不同凝集诊断抗原充分混合，在2min之内判定结果。S9-P结果为阳性89份(60.14％)，阴性59份(39.86％)，测试结果表明该A种鸡群鸡白痢沙门氏菌感染阳性率高。而使用商品化凝集抗原同时和同步平行检测了19份，在19份平行检测样本中，商品化凝集抗原测试阳性结果13份，S9-P测试阳性结果19份，全为阳性，我们注意到商品化凝集抗原为阴性的6份样本中，S9-P检出5份阳性。本次测试中，商品化凝集抗原检测全血样本时阳性结果呈现的凝集反应微弱(图9)，表现凝集颗粒都为较细小的颗粒，且出现凝集反应阳性的时间较长。而S9-P在检测时出现阳性反应迅速，且强阳性反应凝集颗粒为较大块的凝集颗粒，清晰易判(图9)。

实施例7 Western blot验证惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P检测结果

使用常规方法纯化提取S9-P菌株的P因子蛋白，分别纯化提取S9-P检测为阳性血清、阴性血清的IgG，以S9-P检测阳性血清、阴性血清IgG为一抗，羊抗鸡lgG-HRP为二抗进行Westernblot实验，同时设立鸡白痢阳性血清IgG和SPF鸡血清IgG为一抗对照。检测结果显示，S9-P检测的阳性血清IgG识别P抗原因子，而S9-P检测的阴性血清IgG不能识别P抗原因子，未见到目的条带(图10)。S9-P检测的阳性血清，包括对照组为鸡白痢沙门氏菌人工感染SPF鸡血清，实验组1和实验组2来自临床种鸡血清(S9-P检测为阳性)；S9-P检测的阴性血清，包括对照组为SPF鸡血清，实验组1和实验组2来自临床种鸡血清(S9-P检测为阴性)。

实施例8惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P菌株敏感性测试

使用鸡伤寒沙门氏菌SG01分别在5日龄、19日龄感染SPF鸡，使用鸡白痢沙门氏菌SP03感染34日龄SPF鸡，使用惰性检测系统S9-P菌株检测不同感染时间的SPF鸡。结果显示抗体增长符合一般规律：①5日龄SPF鸡人工感染鸡伤寒沙门氏菌，在第一周(第7天，12日龄鸡)测不出感染抗体；在第二周(第14天，19日龄鸡)开始，已能测出鸡群部分个体的感染抗体(阳性率5.88％，1/17)；②感染鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌后的第43天能全部测出感染鸡群个体的抗体；③未攻毒组SPF阳性率一直保持0％。

综上所述，本发明为一种新颖的惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P，其创新和优势体现在：现有的鸡白痢沙门氏菌商品化凝集抗原采用的是鸡白痢标准株(或/和变异株)全菌灭活制备凝集抗原，理论上和实践中都证明了这种凝集抗原存在交叉非特异凝集反应，敏感性不高，稳定性和重复性不佳的瓶颈制约。本发明涉及的新型惰性载体检测系统S9-P的研发基于前期筛选并验证与各种背景鸡血清无交叉凝集反应的惰性载体(菌)S9，避免了多成分全菌抗原造成的非特异性交叉凝集反应干扰。本发明同时发现并验证了抗原因子P仅存在表达于鸡白痢沙门氏菌种内且高度保守，首创性使用基于惰性载体(菌)S9菌体表面表达和携带单一抗原因子P，构建新型惰性载体检测系统S9-P，特异性靶向鸡白痢沙门氏菌感染全血或血清，能够实现圈栏旁鸡舍采集测试鸡一滴血(10μL左右)，通过肉眼观察和2分钟内现场快速判定凝集反应结果，监测、检测鸡群中鸡白痢沙门氏菌感染，特异、敏感。本发明创新性改进和最大完善现有凝集抗原抗体检测的多年来一直使用(自上世纪50年代以来)的传统、经典凝集试验的特异性和敏感性(不稳定、重复性不佳)技术瓶颈制约，具有很好的应用价值和市场前景。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 惰性载体间接凝集试验检测系统及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> p-UP(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaacgtt cacttattgc tgct 24

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> p-LO(Artificial Sequence)

<400> 2

ttaatcagtt aataccgtca tcgtcag 27

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> fimW上游引物(Artificial Sequence)

<400> 3

aacagtcact ttgagcatgg gtt 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> fimW下游引物(Artificial Sequence)

<400> 4

gagtgacttt gtctgctctt ca 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> glgC上游引物(Artificial Sequence)

<400> 5

cggtgtactg cccgctat 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> glgC下游引物(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgggcattg acgcaaa 17

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Spy下游引物(Artificial Sequence)

<400> 7

ccctgacagc cgttagatat t 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> speC下游引物(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgccctttt caaaacata 19

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> SdfⅠ上游引物(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtgttttat ctgatgcaag agg 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> SdfⅠ下游引物(Artificial Sequence)

<400> 10

tgaactacgt tcgttcttct gg 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Spy上游引物(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgttcactt tttacccctg aa 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Spy下游引物(Artificial Sequence)

<400> 12

ccctgacagc cgttagatat t 21

Claims (10)

1.惰性载体间接凝集试验检测系统，其特征在于，所述间接凝集试验检测系统包括惰性载体菌S9和在其表面展呈表达和携带P抗原因子的复合体S9-P。

2.根据权利要求1所述的惰性载体间接凝集试验检测系统，其特征在于，所述间接凝集试验检测系统是含有鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌p基因的惰性载体菌S9。

3.根据权利要求1或2所述的惰性载体间接凝集试验检测系统，其特征在于，所述检测系统是通过将鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌p基因与pBR322质粒连接后导入S9电转化感受态细胞中鉴定正确的菌株。

4.权利要求1~3任一项所述的惰性载体间接凝集试验检测系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌中P抗原因子编码基因p的获得；

2）鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌中P抗原因子编码基因p与pBR322质粒的连接获得重组质粒；

3）重组质粒p-pBR322转化入S9电转化感受态细胞鉴定得到重组菌株即为惰性载体间接凝集试验检测系统S9-P。

5.根据权利要求4所述的惰性载体间接凝集试验检测系统的构建方法，其特征在于，所述步骤1）中基因p的获得是以鸡白痢沙门氏菌CVCC526株参考株基因组DNA为模板，通过设计特异性引物对进行PCR扩增得到目的基因p。

6.根据权利要求5所述的惰性载体间接凝集试验检测系统的构建方法，其特征在于，所述特异性引物对为：

p-UP：5'-ATG AAA CGT TCA CTT ATT GCT GCT-3'

p-LO: 5'-TTA A TCA GTT AAT ACC GTC ATC GTC AG-3'。

7.权利要求1~3任一项所述的惰性载体间接凝集试验检测系统在制备抗原或抗体的间接凝集反应试剂或试剂盒或鸡相关病原感染检测用试剂或试剂盒中的应用。

8.权利要求1~3任一项所述的惰性载体间接凝集试验检测系统在制备鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌感染检测用试剂或试剂盒中的应用。

9.一种鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌感染检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1~3任一项所述的惰性载体间接凝集试验检测系统。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

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